ES2345151T3 - Vector de virus adeno-asociado recombinante para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
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Abstract
Uso de un vector de virus adeno-asociado en la fabricación de un agente terapéutico para administración oral para expresar el péptido β-amiloide en células intestinales para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en el que el vector de virus adeno-asociado comprende ADN que codifica dicho péptido β-amiloide y ADN que codifica un péptido señal capaz de segregar extracelularmente dicho péptido β-amiloide, en una forma operativa.
Description
Vector de virus adeno-asociado
recombinante para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se refiere al uso de un
vector de virus adeno-asociado que expresa el
péptido A\beta para la fabricación de un agente terapéutico para
administración oral en el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por
placas seniles (neuríticas), ovillos neurofibrilares, y la
alteración y disminución en el número de células neurales en el
cerebro. En particular, se considera que el
\beta-amiloide depositado en las placas seniles
juega un papel fundamental en el desarrollo patológico de la
enfermedad de Alzheimer. El péptido
\beta-amiloide, el componente principal del
depósito \beta-amiloide, se produce por la
descomposición parcial de la proteína precursora de
\beta-amiloide (\betaAPP) mediante las
secretasas \beta y \gamma en las células neurales.
Recientemente, se ha dado a conocer que se había
suprimido la formación de placas seniles y se había reducido el
número de placas seniles existentes mediante la administración del
péptido A\beta junto con un adyuvante para la inmunización en
ratones transgénicos que tienen formas familiares de patología de
Alzheimer y sobreexpresan una proteína del precursor amiloide
humano (Schenk D., Barbour R., Dunn W. y col.: Nature:
173-177, 1999).
Como presuntos mecanismos de las reacciones
anteriormente mencionadas, se propones ahora tres teorías. Según la
primera teoría, el anticuerpo contra A\beta producido en el cuerpo
mediante la administración del péptido A\beta se une al A\beta
agregado en las placas seniles y la fagocitosis microglial del
producto resultante estimula el aclaramiento de las placas seniles.
El anticuerpo se une también al A\beta segregado y la fagocitosis
del producto resultante estimula la supresión de la citotoxicidad de
A\beta en las células neurales. Esto conduce al tratamiento de la
demencia y similar. Según la segunda teoría, el anticuerpo contra
A\beta producido mediante la administración del péptido A\beta
se une al A\beta reconociendo su aminoácido en el término N para
solubilizar el A\beta agregado o insolubilizado y suprimir
adicionalmente la agregación y deposición del A\beta segregado,
lo que da como resultado la reducción en la deposición amiloide.
Según la tercera teoría, la así denominada teoría "sink", el
anticuerpo contra A\beta no pasa a través de la barrera
hematoencefálica pero A\beta se difunde desde el sistema nervioso
central al sistema periférico reduciendo A\beta en la sangre
periférica y el tejido periférico.
Basándose en las teorías anteriormente
mencionadas, se ha intentado también el desarrollo de procedimientos
preventivos y terapéuticos para la enfermedad de Alzheimer con
vectores de virus. Se ha descrito, por ejemplo, que la
administración oral de un vector de adenovirus, en el que se
incorpora ADNc de A\betaa de ratones C57BL/6, permitió la
expresión de A\beta en los tejidos del tracto gastrointestinal
superior en los ratones y que el anticuerpo dirigido contra
A\beta en el suero de ratón inhibió la agregación del péptido
A\beta in vitro (Takeshi Tabira e Hideo Hara, Fiscal 2002
Welfare Science Research, "21 Ventury-Type Medical
Pioneering/Promoting Research (Field of Dementia), Publication
Report on Research Results" publicado por Incorporated
Foundation, Japan Foundation for Longevity Science (Choju Kagaku
Shinko Zaidan), Marzo de 2002, pp. 49-54). En este
informe, sin embargo, no se ha informado de ningún experimento
in vivo y no se ha confirmado el efecto terapéutico en
animales.
Además, se sabe que la citocina
TGF-\beta1 (factor \beta1 de crecimiento
transformante) estimula la producción de citocinas inflamatorias
(IL-1\beta
(interleucina-1\beta),
TNF-\alpha (factor \alpha de necrosis tumoral y
similares) en células endoteliales vasculares. Adicionalmente, se ha
informado recientemente de que TGF-\beta1
estimula cambios patológicos relacionados con la enfermedad de
Alzheimer tales como la deposición amiloide cerebrovascular y la
degeneración microvascular (Wyss-coray, T. y col.;
Chronic overproduction of transforming growth
factor-\beta-1 by astrocytes
promotes Alzheimer's disease-like microvascular
degeneration en transgenic mice: Am. J. Pathol. 156:
139-150, 2000).
Los agentes terapéuticos para la enfermedad de
Alzheimer han de suprimir la formación de placas seniles y la
deposición amiloide en el sistema nervioso central y al mismo tiempo
no deberían difundirse hacia otros órganos o producir efectos
secundarios tales como encefalitis por cuestiones relacionadas con
la seguridad. Sin embargo, no se ha informado hasta la fecha de
ningún agente terapéutico que cumpla estos requisitos que utilice
el antígeno A\beta.
Los inventores han encontrado ahora que la
deposición amiloide y la formación de placas seniles se reducen en
el cerebro por expresión del antígeno A\beta en células
intestinales que inducen la inmunidad humoral, induciendo de esta
manera la producción de anticuerpos contra este antígeno A\beta,
usando un virus adeno-asociado recombinante (VAAr).
Además, los inventores han encontrado también que no se encuentra
observación inflamatoria en el cerebro y otros órganos tales como
los riñones cuando se usa este virus adeno-asociado
recombinante. La presente invención se basa en estos hallazgos.
\newpage
Según esto, un objeto de la presente invención
es proporcionar el uso de un vector de virus
adeno-asociado en la fabricación de un agente
terapéutico para la administración oral para expresar el péptido
\beta amiloide en células intestinales para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer, en el que el vector de virus
adeno-asociado comprende un ADN que codifica dicho
péptido \beta amiloide y un ADN que codifica un péptido señal
capaz de segregar extracelularmente dicho péptido \beta amiloide,
en una forma operativa.
El vector de virus
adeno-asociado es capaz de expresar un fragmento de
péptido que contiene un emplazamiento de inducción de la inmunidad
humoral del péptido \beta amiloide y comprende un ADN que codifica
este fragmento de péptido de una forma operativa.
Adicionalmente, la invención proporciona una
composición farmacéutica para la administración oral para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, que comprende dicho
vector de virus adeno-asociado.
Con el uso del vector de virus
adeno-asociado recombinante, se puede inducir la
producción de anticuerpos sin inducir respuestas inmunes celulares
y se pueden suprimir la formación de placas seniles y la deposición
amiloide en el sistema nervioso central. Adicionalmente, con el uso
de este virus adeno-asociado recombinante, se puede
reducir la concentración de TGF-\beta1 en la
sangre y se pueden suprimir el progreso de la deposición amiloide
cerebrovascular y la degeneración microvascular cerebral. Además,
según el vector de virus adeno-asociado
recombinante, es posible un tratamiento muy seguro de la enfermedad
de Alzheimer sin producir efectos secundarios tales como
encefalitis y trastornos en el hígado.
la fig. 1 muestra la cantidad de producción del
anticuerpo dirigido contra A\beta en el suero de los ratones a
los cuales se administró oralmente A\beta1-43 que
expresaba el vector de virus adeno-asociado;
la fig. 2 muestra el efecto supresor del
anticuerpo dirigido contra A\beta en el suero de ratón sobre la
agregación de A\beta in vitro;
la fig. 3 muestra la reactividad de la
proliferación celular del anticuerpo dirigido contra A\beta de
células de bazo de los ratones tratados con el péptido
A\beta42;
la fig. 4 muestra las relaciones promedio del
área de acumulación de A\beta en las regiones del córtex del
lóbulo frontal, lóbulo parietal e hipocampo en los ratones a los
cuales se administró oralmente A\beta1-43 que
expresaba el vector de virus adeno-asociado;
la fig. 5 muestra las relaciones promedio del
área de acumulación de A\beta en las regiones del córtex del
lóbulo frontal, lóbulo parietal e hipocampo en los ratones a los
cuales se administró oralmente A\beta1-21 que
expresaba el vector de virus adeno-asociado;
la fig. 6 muestra la concentración de
TGF-\beta1 en el suero procedente de ratones a los
cuales se administró oralmente A\beta1-43 que
expresaba el vector de virus adeno-asociado.
Un vector de virus
adeno-asociado para uso según la presente invención
comprende un ADN que codifica un fragmento de péptido que contiene
un emplazamiento de inducción de la inmunidad humoral del péptido
\beta amiloide (péptido A\beta) en una forma operativa, por
tanto, se puede expresar dicho fragmento de péptido. La expresión
"en una forma operativa" usada en el presente documento
significa que el gen transferido (ADN) se inserta en el vector en
un modo en el que dicho gen se puede expresar bajo el control de los
elementos reguladores apropiados (es decir, promotores,
potenciadores, y terminadores de la transcripción).
Se puede especificar fácilmente el emplazamiento
de inducción de la inmunidad humoral del péptido A\beta por
cualquier persona experta en la técnica. Por ejemplo, el
emplazamiento de inducción de la inmunidad humoral anteriormente
mencionado está presente en la región de los restos de aminoácidos 4
a 10 del péptido A\beta (A\beta4-10). Según
esto, el fragmento de péptido del antígeno anteriormente mencionado
que se va a expresar por el vector de virus
adeno-asociado de la presente invención comprende
preferiblemente A\beta4-10.
Además, un ejemplo de la secuencia de
aminoácidos A\beta4-10 son los aminoácidos 4 a 10
en la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2.
Según esto, el fragmento de péptido del antígeno anteriormente
mencionado comprende preferiblemente los aminoácidos 4 a 10 en la
secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO:2. La
secuencia de nucleótidos del ADN que codifica esta secuencia de
aminoácidos no está particularmente limitada; por ejemplo, se
pueden usar los nucleótidos 10 a 30 en la secuencia de nucleótidos
que se muestra en la SEQ ID NO: 1. Según esto, el ADN que codifica
el fragmento de péptido del antígeno comprende preferiblemente los
nucleótidos 10 a 30 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en
la SEQ ID NO: 1.
Según una realización preferida de la presente
invención, el fragmento de péptido del antígeno anteriormente
mencionado comprende los aminoácidos 1 a 43 del péptido A\beta
(A\beta1-43). Un ejemplo de la secuencia de
aminoácidos de A\beta1-43 es la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2; según esto, el
fragmento de péptido del antígeno anteriormente mencionado comprende
preferiblemente la secuencia de aminoácidos que se muestra en la
SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos del ADN que codifica esta
secuencia de aminoácidos no está particularmente limitada; por
ejemplo, se puede usar la secuencia de nucleótidos que se muestra en
la SEQ ID NO: 1. Según esto, el ADN que codifica el fragmento de
péptido del antígeno anteriormente mencionado comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ
ID NO: 1.
Según otra realización preferida de la presente
invención, el fragmento de péptido del antígeno anteriormente
mencionado comprende los aminoácidos 1 a 21 del péptido A\beta
(A\beta1-21). Un ejemplo de la secuencia de
aminoácidos de A\beta1-21 es la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4; según esto, el
fragmento de péptido del antígeno anteriormente mencionado comprende
preferiblemente la secuencia de aminoácidos que se muestra en la
SEQ ID NO: 4. La secuencia de nucleótidos del ADN que codifica esta
secuencia de aminoácidos no está particularmente limitada; por
ejemplo, se puede usar la secuencia de nucleótidos que se muestra en
la SEQ ID NO: 3. Según esto, el ADN que codifica el fragmento de
péptido del antígeno anteriormente mencionado comprende
preferiblemente la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ
ID NO: 3.
Las secuencias de aminoácidos de
A\beta1-43 y A\beta-21
anteriormente mencionadas no solo contienen un emplazamiento de
inducción de la inmunidad humoral sino también una secuencia de
reconocimiento del receptor de las células T; sin embargo, estos
fragmentos de péptido del antígeno inducen principalmente la
producción de anticuerpos e inducen fuertemente las respuestas
inmunes cuando se expresan en el sistema inmune de la mucosa
intestinal por el vector de virus adeno-asociado de
la presente invención.
Con el fin de presentar eficazmente el fragmento
de péptido del antígeno anteriormente mencionado expresado por el
vector de virus adeno-asociado en forma de antígeno,
dicho fragmento de péptido del antígeno se segrega en el exterior
de las células infectadas después de expresarse en el interior de
las células. Según esto, el vector de virus
adeno-asociado comprende un ADN que codifica un
péptido señal que permite que se exprese el fragmento de péptido
del antígeno anteriormente mencionado que se va a segregar
extracelularmente, en una forma operativa. La expresión
"comprender de forma operativa" según se usa en el presente
documento significa que el péptido señal anteriormente mencionado
se expresa junto con el fragmento de péptido del antígeno
anteriormente mencionado al mismo tiempo que se segrega
extracelularmente dicho fragmento de péptido del antígeno expresado
mediante dicho péptido señal. El procedimiento para integrar el ADN
que codifica el péptido señal anteriormente mencionado en el vector
de virus adeno-asociado de una forma operativa puede
ser cualquier procedimiento conocido por las personas expertas en
la técnica, un gen de fusión en el que se fusionan dos ADN de tal
manera que se expresa el péptido señal con su término N unido a
dicho fragmento de péptido del antígeno.
El péptido señal anteriormente mencionado puede
ser cualquiera conocido por las personas expertas en la técnica;
sin embargo, se usa preferiblemente el péptido señal localizado en
el término N de la proteína del precursor amiloide (APP). Un
ejemplo de la secuencia de aminoácidos del péptido señal de APP es
la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 6;
según esto, el péptido señal anteriormente mencionado que se va a
expresar por el vector de virus adeno-asociado
comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos que se muestra
en la SEQ ID NO: 6. La secuencia de nucleótidos del ADN que
codifica esta secuencia de aminoácidos no está particularmente
limitada; se puede usar, por ejemplo, la secuencia que se muestra en
la SEQ ID NO: 5. Según esto, el ADN que codifica el péptido señal
anteriormente mencionado comprende preferiblemente la secuencia de
nucleótidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5.
Según una realización preferida de la presente
invención, el vector de virus adeno-asociado
comprende el ADN que codifica una proteína fusionada en la que el
péptido señal de APP está unido al término N de
A\beta1-43. Un ejemplo de la secuencia de
aminoácidos de esta proteína fusionada es la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8 y un ejemplo de la
secuencia de nucleótidos del ADN que codifica ésta son los
nucleótidos 9 a 191 en la secuencia de nucleótidos que se muestra
en la SEQ ID NO: 7.
Según otra realización preferida de la presente
invención, el vector de virus adeno-asociado
comprende el ADN que codifica una proteína fusionada en la que el
péptido señal de APP está unido en el término N de
A\beta1-21. Un ejemplo de la secuencia de
aminoácidos de esta proteína fusionada es la secuencia de
aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10 y un ejemplo de la
secuencia de nucleótidos del ADN que codifica ésta son los
nucleótido 17 a 133 en la secuencia de nucleótidos que se muestra en
la SEQ ID NO: 9.
Adicionalmente, el vector de virus
adeno-asociado puede contener elementos reguladores,
tales como promotores, potenciadores y terminadores, para expresar
eficazmente el ADN diana y, si es necesario, se pueden insertar en
el mismo codones de inicio de la traducción y codones de detención
de la traducción.
El vector de virus
adeno-asociado para uso según la presente invención
se puede preparar mediante un procedimiento normalizado conocido en
la técnica. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Nº
5.858.351 y las referencias citadas en la misma describen diversos
virus adeno-asociados recombinantes adecuados para
el uso en la terapia génica y los procedimientos para construir y
multiplicar estos vectores (por ejemplo, Kotin (1994) Human Gene
Therapy 5: 793-801 o Berns "Parvoviridae and their
Replication" Fundamental Virology, la segunda edición compilada
por Fields y Knipe).
Según un procedimiento preferido para construir
un vector de virus adeno-asociado, en primer lugar,
se mantienen las ITR en ambos extremos del virus
adeno-asociado natural y se inserta un gen de
interés entre ellas para construir un plásmido (plásmido del vector
del VAA). Por otra parte, se preparan un plásmido que expresa el
gen Rap (un gen que codifica la proteína de iniciación de la
replicación) y el gen Cap (un gen que codifica una proteína de la
cápsida del virus) y un plásmido que expresa los genes E2A, E4 y VA
del adenovirus. A continuación, estos tres tipos de plásmidos se
transfectan simultáneamente en células empaquetadas que expresan el
gen E1, tales como las células HEK293, y a continuación se cultivan
las células resultantes. De esta manera, se pueden producir
partículas de vector de virus adeno-asociado que
tienen una elevada infectividad en células de mamíferos. Se puede
llevar a cabo fácilmente este procedimiento usando un kit
comercialmente disponible tal como el
AAV-Helper-Free System
(Stratagene).
El vector de virus
adeno-asociado se puede usar para tratar la
enfermedad de Alzheimer en mamíferos Según esto, según la presente
invención, se proporciona el uso de un vector de virus
adeno-asociado para la fabricación de un agente
terapéutico para la administración oral para expresar el péptido
\beta amiloide en células intestinales para el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer, en el que el vector de virus
adeno-asociado comprende un ADN que codifica dicho
péptido \beta amiloide y un ADN que codifica un péptido señal
capaz de segregar extracelularmente dicho péptido \beta amiloide,
en forma operativa. Se proporciona además una composición
farmacéutica que comprende el vector de virus
adeno-asociado que se define en el presente
documento, para la administración oral para expresar el péptido
\beta amiloide en células intestinales par uso en el tratamiento
de la enfermedad de Alzheimer. Los sujetos que se van a tratar
pueden ser mamíferos tales como roedores, caninos, gatos, ganado y
primates, preferiblemente seres humanos.
Un procedimiento para administrar el vector de
virus adeno-asociado puede ser un procedimiento que
se puede usar en el campo de la terapia génica, tal como la
inyección intraperitoneal, inyección intratraqueal, inyección
intrabronquial e instilación intrabronquial directa, inyección
subcutánea, administración transcutánea, infusión intraarterial, e
inyección intravenosa (véase Flotte y Carter, Gene Therapy 2:
357-362 (1995)). Además, los virus
adeno-asociados se administran ventajosamente
oralmente debido a que no son atacados fácilmente por el jugo
gástrico y debido a que los sujetos pueden llevar a cabo la
administración por sí mismos.
La cantidad del vector de virus
adeno-asociado que se va a administrar puede ser
cualquier cantidad terapéuticamente eficaz y dicha cantidad se
puede determinar fácilmente por las personas expertas en la técnica
de la terapia génica. Además, la dosificación se ajusta
preferiblemente según la gravedad de las dolencias patológicas,
sexo, edad, peso corporal y hábitos del sujeto, y similares; sin
embargo, dicha dosificación se ajusta apropiadamente por un médico
o un veterinario. Por ejemplo, la cantidad del vector de virus
adeno-asociado para la administración oral es
normalmente de 0,5 x 10^{11} a 2,0 x 10^{12} del genoma
vírico/kg de peso corporal, preferiblemente de 1,0 x 10^{11} a
1,0 x 10^{12} del genoma vírico/kg de peso corporal, más
preferiblemente de 1,0 x 10^{11} a 5,0 x 10^{11} del genoma
vírico/kg de peso corporal. El vector de virus
adeno-asociado es farmacéuticamente seguro en
intervalo comprendido por las dosificaciones anteriormente
mencionadas. La unidad "genoma vírico" según se usa en el
presente documento representa el número de moléculas del genoma del
virus adeno-asociado (número de partículas víricas)
y las personas expertas en la técnica saben que representa la
cantidad de vectores de virus adeno-asociados. Se
puede determinar el valor diluyendo una disolución de virus
adeno-asociado purificado para llevar a cabo la
hibridación por transferencia de mancha y comparar su intensidad de
señal con la del ADN del plásmido que tiene un número especificado
de moléculas.
El vector de virus
adeno-asociado para uso según la presente invención
mantiene su actividad terapéutica contra la enfermedad de Alzheimer
durante un periodo relativamente largo de tiempo una vez
administrado a un sujeto. En particular, cuando se administra
oralmente en la cantidad anteriormente mencionada, el antígeno se
presenta en las células epiteliales intestinales durante al menos 6
meses y se ha confirmado la inducción de la producción de
anticuerpos dirigidos contra este antígeno. A la luz de estos
hallazgos, cualquier persona experta en la técnica puede planificar
un programa de dosificación apropiado.
El vector de virus
adeno-asociado para uso según la presente invención
se puede administrar a un sujeto en forma de una composición
farmacéutica que lo contenga. Según esto, según la presente
invención, se proporciona una composición farmacéutica para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer mediante administración
oral que comprende el vector de virus asociado descrito en el
presente documento.
La composición farmacéutica para uso según la
presente invención se puede producir mediante un procedimiento
conocido en la técnica dependiendo de su ruta de administración y la
forma de dosificación. Se pueden usar, por ejemplo, formas de
dosificación tales como cápsulas y disoluciones para una composición
farmacéutica para administración oral. Según esto, la composición
farmacéutica puede contener vehículos, agentes diluyentes,
conservantes, y similares, farmacéuticamente aceptables en formas de
dosificación individuales.
La presente invención se ilustra adicionalmente
en detalle mediante los siguientes ejemplos que no se pretende que
limiten el alcance de la invención. Los ratones usados en los
siguientes ejemplos de ensayo son ratones transgénicos APP, un
modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer (Tg2576, Taconic,
Clínica Mayo).
Se amplificó el ADNc del
amiloide-\beta1-43
(A\beta1-43) mediante la PCR usando el gen de la
proteína del precursor amiloide humano (APP) como una plantilla y
los siguientes cebadores. La disolución de la reacción de la PCR
contenía tampón TAPS (25 mM, pH 9,3), KCl (50 mM), MgCl_{2} (2
mM), 2-mercaptoetanol (1 mM), dNTP (100 \muM),
plantilla de ADN (50-100 ng), y los cebadores (0,2
\muM cada uno). Se llevó a cabo la reacción térmica de la PCR
durante 30 ciclos, consistiendo cada ciclo de 30 segundos a 94ºC, 1
minuto a 68ºC, y 3 minutos a 72ºC.
Directo:
5'-GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA-3'
(SEQ ID NO: 11), e
\vskip1.000000\baselineskip
Inverso:
5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'
(SEQ ID NO: 12, que tiene un emplazamiento AflII en el extremo
3').
\vskip1.000000\baselineskip
El adaptador para la señal de secreción de APP,
la primera secuencia señal en el término N (SEQ ID NO: 10), se
construyó tratando los dos oligonucleótidos siguientes durante 3
minutos a 90º C seguido por hibridación a temperatura ambiente.
De sentido directo:
5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTT-3'
(SEQ ID NO: 13)
(SEQ ID NO: 13)
\vskip1.000000\baselineskip
De sentido contrario:
5'-AGCGCCCGAGCCGTCCAGGCGGCCAGCAGGAGCAGTGCCAAACCGGGCAGCATTCTAGACC-3'
(SEQ ID NO: 14)
(SEQ ID NO: 14)
\vskip1.000000\baselineskip
El adaptador de la señal de secreción de APP
(que tiene un resto T que sobresale en el extremo 3' de la cadena
de sentido directo) y el ADNc de A\beta1-43
amplificado mediante la PCR (que tiene un resto A que sobresale en
el extremo 3' de la cadena de sentido contrario) se unieron
conjuntamente, y se llevó a cabo la PCR usando el ADN resultante
como plantilla y los siguientes cebadores para construir un gen de
fusión, la secuencia señal de APP + el ADNc de
A\beta1-43 (SEQ ID NO: 7, que tiene un
emplazamiento de reconocimiento XbaI en los nucleótidos 3 a 8 en
esta secuencia), en el que la secuencia señal de APP se une en el
extremo 5' del ADNc de A\beta1-43. La disolución
de reacción de la PCR contenía tampón TAPS (25 mM, pH 9,3), KCl (50
mM), MgCl_{2} (2 mM), 2-mercaptoetanol (1 mM),
dNTP (100 \muM), plantilla de ADN (50-100 ng), y
los cebadores (0,2 \muM cada uno). Se llevó a cabo la reacción
térmica de la PCR durante 30 ciclos, consistiendo cada ciclo de 30
segundos a 94ºC, 1 minuto a 68ºC, y 3 minutos a 72ºC.
Directo:
5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3'
(SEQ ID NO: 15, que tiene un emplazamiento XbaI en el extremo
5')
\vskip1.000000\baselineskip
Inverso:
5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'
(SEQ ID NO: 12, que tiene un emplazamiento AflII en el extremo
5').
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que se requiere ADN que tenga una
longitud apropiada (4-4,5 kpb) para obtener
eficazmente el empaquetamiento del ADN del virus
adeno-asociado, el fragmento
PvuII-SaiL del ADN del plásmido pBR322 se unió a la
secuencia señal de APP + el ADNc de A\beta1-43
(XbaI-AflII/enromado) como un ADN "de relleno"
no funcional y a continuación se unió en el vector de virus
adeno-asociado estándar (pXXUF1) en el emplazamiento
XbaI-SalI.
Además, de la misma manera que en el Ejemplo 1,
se transfectaron génicamente en células HEK293 tres tipos de
vectores, es decir, el pXXUF1 recombinante anteriormente mencionado,
un plásmido Rep/Cap estándar y el plásmido E2A/E4/VA, mediante el
procedimiento del fosfato de calcio y las células HEK293 resultantes
se cultivaron en gran volumen, tras lo cual, las partículas de
virus se purificaron a partir del lisado celular mediante
ultracentrifugación con CsCl para obtener el vector de virus
adeno-asociado que tiene la secuencia señal de APP
+ el ADNc de A\beta1-43.
\vskip1.000000\baselineskip
Se unieron la secuencia señal de APP + el ADNc
de A\beta1-43
(XbaI-AflII/enromado) en el plásmido pBluescript
(XbaI-SmaI). Se llevó a cabo la PCR usando este como
plantilla y los siguientes cebadores.
Directo:
5'-TGGCGGCCGCTCTAGAATG-3' (SEQ ID
NO: 16, que tiene un emplazamiento NotI en el extremo 5')
\vskip1.000000\baselineskip
Inverso:
5'-CACATCTTAAGCAAAGAACACC-3' (SEQ ID
NO: 17)
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la PCR de la secuencia señal de
APP + el ADNc de A\beta1-21 (SEQ ID NO:9) que
tenían un emplazamiento de restricción NotI en los nucleótidos
3-10 y un emplazamiento de restricción XbaI en los
nucleótidos 11-16 en esta secuencia) se sometieron
al tratamiento de NotI-AflII/enromado y los
productos resultantes se unieron en pXXUF1
(NotI-SalI) conjuntamente con el fragmento pBR322
PvuII-SalI "de relleno" anteriormente
mencionado.
Adicionalmente, de la misma manera que en el
Ejemplo 1, se obtuvo el vector de virus
adeno-asociado que tenía la secuencia señal de APP
+ el ADNc de A\beta1-21.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo comparativo
1
Como control, se construyó un virus
adeno-asociado (GFPrAAV) que expresaba GFP (proteína
fluorescente verde).
Ensayo
1
Se unieron la secuencia señal de APP + el ADNc
de A\beta1-43 en el vector de expresión pXXUF1 y
el producto resultante se transfectó en células HEK293 usando
lipofectamina 2000 (Invitrogen) durante 48 horas, tras lo cual el
sobrenadante del cultivo y el lisado celular se extrajeron y se
sometieron individualmente a inmunoprecipitación con el anticuerpo
dirigido contra A\beta (4G8) y a continuación a electroforesis
mediante SDS-PAGE. A continuación, se transfirieron
las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y a continuación se
intentó la detección de la proteína A\beta usando el anticuerpo
dirigido contra A\beta. Como resultado, se confirmó que A\beta
se segregaba extracelularmente formando oligómeros y que se producía
una gran cantidad de proteína monomérica a partir del péptido
A\beta de 4 kDa en el interior de las células.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
2
Se administró oralmente el vector de virus
adeno-asociado del Ejemplo 1 (5 x 10^{11} del
genoma vírico) solamente una vez a un ratón de 15 semanas de edad.
Se tomaron muestras de suero procedentes de este ratón 1 mes, 4
meses, y 6 meses después de la administración.
Se recubrió el péptido
A\beta1-42 (5 mg/ml) sobre cada pocillo de una
placa de 96 pocillos (Nunc, MaxiSorp) y se bloqueó con leche
desnatada/tampón TBS-T al 5%, tras lo cual, se
añadió el suero de ratón muestreado anteriormente (a un dilución de
500 veces) y se llevó a cabo la detección con un anticuerpo dirigido
contra la IgG de ratón marcado con peroxidasa. Se evaluó el título
del anticuerpo midiendo la absorbancia óptica con un lector de
ELISA.
En la Figura 1 se muestran los resultados.
El título del anticuerpo en el suero alcanzó
principalmente un nivel punta un mes después de la administración
oral y se observó la producción continua de anticuerpos hasta los 6
meses.
\newpage
Ensayo
3
Se ajustó la concentración del péptido
A\beta1-40 a 120 mM y se llevó a cabo la
incubación a 37ºC. Después de 24 horas, se observó el comienzo de
la agregación de A\beta. Se añadió el suero de ratón a este
agregado de A\beta a relaciones de 1:10 y 1.20 (vol:vol) y se
llevó a cabo la incubación a 37ºC durante una semana. Se midió si
el suero de ratón inhibía la unión/agregación de
A\beta1-40 añadiendo tioflavina T 2 mM usando un
espectrómetro de fluorescencia (excitación a 445 nm; emisión a 490
nm). En la Figura 2 se muestran los resultados.
El suero de ratón muestreado a los 6 meses
después de la administración del vector de virus
adeno-asociado como en el Ejemplo de Ensayo 1
inhibió significativamente la agregación/unión de
A\beta1-40 in vitro en comparación con el
suero de ratón control.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
4
Se extrajeron el corazón, pulmón, bazo, hígado,
tracto gastrointestinal superior, y riñón de un ratón de 28 semanas
después de la administración oral del vector de virus
adeno-asociado del Ejemplo 1, y se homogeneizó cada
tejido en una disolución de Tris, tras lo cual, se sometieron los
homogenados a proteólisis con proteinasa K y tratamiento con
fenol/cloroformo para purificar el ADN. A continuación, se
construyeron los siguientes cebadores a partir de una secuencia del
nucleótido en el extremo 5' de la región del promotor del vector de
virus adeno-asociado (pXXUF1) y una secuencia del
nucleótido en el extremo 3' del vector para llevar a cabo la PCR.
La disolución de la reacción de la PCR contenía tampón TAPS (25 mM,
pH 9,3), KCl (50 mM), MgCl_{2} (2 mM),
2-mercaptoetanol (1 mM), dNTP (100 \muM),
plantilla de ADN (50-100 ng), y los cebadores (0,2
\muM cada uno). Se llevó a cabo la reacción térmica durante 30
ciclos, consistiendo cada ciclo de 1 minuto a 94ºC, 20 segundos a
68ºC, y 1 minuto a 72ºC. Se sometieron los productos de la PCR a
electroforesis en gel de agarosa al 2% y se tiñeron con bromuro de
etidio.
Directo:
5'-AGTGAACCGTCAGATCGC-3' (SEQ ID NO:
18)
\vskip1.000000\baselineskip
Inverso:
5'-CGGTATCAGCTCACTCAA-3' (SEQ ID NO:
19)
\vskip1.000000\baselineskip
La banda de 500 pb que representaba el producto
de la PCR de interés se reconoció únicamente con el tejido
procedente del tracto gastrointestinal superior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
5
Se aislaron células de bazo procedentes de un
ratón de 28 semanas tras la administración oral del vector de virus
adeno-asociado del Ejemplo 1, y se colocaron sobre
una placa de 96 pocillos (5 x 10^{4} células por pocillo) y se
incubaron durante 48 horas en disoluciones de cultivo con el péptido
A\beta1-42 añadido a diversas concentraciones.
Tras la finalización del cultivo celular, se añadió una sal de
tetrazolio (WST-1). Debido a que la sal de
tetrazolio se transformó en un colorante de formazán mediante la
succinato-tetrazolio reductasa mitocondrial, que es
activa únicamente en células viables, se evaluó la respuesta a la
proliferación celular midiendo la absorbancia óptica de la
disolución de colorante usando un lector de ELISA. En la Figura 3
se muestran los resultados.
Las células de bazo del ratón al que se había
proporcionado administración oral del vector de virus
adeno-asociado del Ejemplo 1 mostraron una baja
respuesta de proliferación celular independientemente de la
concentración del péptido A\beta1-42.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
6
Se obtuvieron muestras de tejido procedentes de
ratones a los que se había proporcionado mediante administración
oral el virus adeno-asociado del Ejemplo 1
(denominados a partir de ahora en el presente documento como
"grupo de tratamiento") y procedente de ratones no tratados
emparejados por edad (denominados a partir de ahora en el presente
documento como "grupo control") 6 meses después de la
administración (a los 10 meses de edad) y se llevó a cabo el
siguiente experimento usando secciones congeladas del tejido. Con el
fin de detectar la proteína A\beta, las placas seniles y las del
mismo tipo en el tejido, se trató el tejido con ácido fórmico al
70% y se inactivó la peroxidasa endógena con H_{2}O_{2} al 5%.
Tras reaccionar con el anticuerpo dirigido contra A\beta (4G8 a
una dilución de 1000 veces) o el anticuerpo de conejo dirigido
contra A\beta40 (a una dilución de 1000 veces), se añadió el
segundo anticuerpo marcado con peroxidasa y se llevó a cabo la
tinción DAB.
En el grupo control, se desarrolló la deposición
amiloide con la edad; se observó deposición ligera en el cerebro a
los 6 meses de edad, mientras que la deposición amiloide llegó a ser
prominente, también se reconoció la formación de placa senil, y se
observó también deposición amiloide ocasionalmente en células
neurales a los 10 meses de edad.
Por otra parte, en el grupo de tratamiento, se
reconoció la expresión de la proteína A\beta en las células
epiteliales del tracto gastrointestinal superior tras la disección 6
meses después de la administración (a los 10 meses de edad). La
disección del cerebro 6 meses después de la administración mostró
que la deposición amiloide se redujo aparentemente y las placas
seniles se redujeron drásticamente en comparación con el grupo
control. En la Tabla 1 se muestra el resultado del recuento de
placas amiloides en la sección sagital del cerebro 6 meses después
de la administración.
\vskip1.000000\baselineskip
- \text{*}
- Ratones: a los 10 meses de edad.
\vskip1.000000\baselineskip
El número promedio de placas amiloides fue de 76
en el grupo control, mientras que fue de 8 en el grupo tratado
reduciéndose en aproximadamente un 90%. La deposición amiloide en el
interior de las células neurales observada ocasionalmente en el
grupo control se reconoció con fuerza en el grupo tratado.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
7
De la misma manera que en el Ejemplo de Ensayo
6, se obtuvieron muestras de tejido procedentes del grupo de
tratamiento y del grupo control 6 meses después de la administración
(a los 10 meses de edad) y se llevó a cabo el siguiente experimento
usando secciones congeladas del tejido. Las secciones congeladas se
tiñeron usando anticuerpos tales como el anticuerpo dirigido contra
CD4, anticuerpo dirigido contra CD86, anticuerpo dirigido contra
CD11b, anticuerpo dirigido contra GFAP (astrocitos), y anticuerpo
dirigido contra Iba-1 (microglia) mediante el
procedimiento ABC para confirmar la presencia o ausencia de
infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central. En la
Tabla 2 se muestran los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se tiñó el tejido cerebral individualmente con
el marcador CD4 de las células T y la molécula CD86 de activación
de las células T, lo que dio como resultado reacciones negativas en
el grupo control y el grupo de tratamiento. Fue también negativa
para el marcador CD11b de macrófagos periféricos. Se reconoció una
diferencia entre los dos grupos para el marcador GFAP de los
astrocitos. Se reconoció un aumento en el número de microglias
activadas (Iba-1 positivo) en el lóbulo frontal y
el lóbulo temporal en el grupo de tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
8
Se obtuvieron muestras de tejido procedentes de
ratones que recibieron la administración oral del virus
adeno-asociado del Ejemplo 2 (denominado a partir
de ahora en el presente documento como "grupo 2 de
tratamiento") y el grupo control 6 meses después de la
administración (a los 10 meses de edad) y se usaron secciones
congeladas del tejido para llevar a cabo la tinción DAB de la misma
manera que en el Ejemplo de Ensayo 6.
El análisis del cerebro 6 meses después de la
administración (a los 10 meses de edad) desveló que la deposición
amiloide había disminuido claramente y que se redujo drásticamente
el número de placas seniles en el grupo 2 de tratamiento en
comparación con el grupo control.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
9
Se dispusieron tres grupos constituidos cada uno
por 4 ratones y se les proporcionó la administración oral del virus
adeno-asociado del Ejemplo 1 (5,0 x 10^{11} del
genoma vírico/ratón) una vez a las 15 semanas de edad (denominado a
partir de ahora en el presente documento como "grupo A"), a las
30 semanas de edad (denominado a partir de hora en el presente
documento como "grupo B" o a las 45 semanas de edad (denominado
a partir de ahora en el presente documento como "grupo C"),
respectivamente. Además, se dispuso el grupo control constituido
por 6 ratones y se le proporcionó la administración oral de PBS (0,1
ml/ratón) a las 15 semanas de edad. A continuación, los animales de
cada grupo se diseccionaron a los 12 y 13 meses de edad (52 a 56
semanas de edad) para obtener secciones de tejido cerebral
individualmente procedentes de las regiones del córtex del lóbulo
frontal, del lóbulo temporal, y del hipocampo. Estas secciones de
tejido se tiñeron de la misma manera que en el Ejemplo de Ensayo 6
y se observaron usando una cámara 3CCD conectada a un microscopio
para medir el área de acumulación de A\beta en las regiones
individuales. Se calculó la relación del área de acumulación de
A\beta en cada emplazamiento individual de medida. En la Figura 4
se muestran los resultados.
En el grupo control, la relación promedio del
área de acumulación de A\beta anteriormente mencionada en las
tres regiones de medida en el cerebro fue de 2,64 \pm 1,46%. Por
otra parte, las relaciones fueron de 0,55 \pm 0,50% en el grupo A
administrado a las 15 semanas de edad, 0,48 \pm 0,35% en el grupo
B administrado a las 30 semanas de edad, y de 0,46 \pm 0,27% en
el grupo C administrado a las 45 semanas de edad, respectivamente,
y todas fueron significativamente inferiores en comparación con la
del grupo control (análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y el
test de la t de Student, p < 0,001).
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo
10
Se dispusieron tres grupos constituidos cada uno
por 4 ratones y se les proporcionó la administración oral del virus
adeno-asociado del Ejemplo 2 (5,0 x 10^{11} del
genoma vírico/ratón) una vez a las 15 semanas de edad (denominado
en el presente documento como "grupo D"), a las 30 semanas de
edad (denominado en el presente documento como "grupo E") o a
las 45 semanas de edad (denominado en el presente documento como
"grupo F"). A continuación, se trataron los grupos
individuales de la misma manera que en el Ejemplo de Ensayo 9 y se
calculó la relación del área de acumulación de A\beta con el
emplazamiento de medida individual. En la Figura 5 se muestran los
resultados.
Las relaciones del área de acumulación de
A\beta anteriormente mencionadas fueron de 0,39 \pm 0,27% en el
grupo D administrado a las 15 semanas de edad, 0,45 \pm 0,20% en
el grupo E administrado a las 30 semanas de edad, y de 0,37 \pm
0,20% en el grupo F administrado a las 45 semanas de edad,
respectivamente, y todas fueron significativamente inferiores en
comparación con la del grupo control que se muestra en el Ejemplo
de Ensayo 9 (análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y el test de
la t de Student, p < 0,001).
\newpage
Ensayo
11
Se tomaron muestras de sangre procedentes de los
ratones de cada grupo tras la disección en los Ejemplos de Ensayo 9
y 10 para obtener el suero. Se midió la concentración de
TGF-\beta1 en el suero de ratón mediante el
procedimiento ELISA usando un kit de inmunoensayo de
TGF-\beta1 Quantikine de Ratón/Rata/Porcino (R
& D Systems). En la Figura 6 se muestran los resultados.
La concentración de TGF-\beta
en el suero de ratón fue de 111,6 \pm 40,0 pg/ml en el grupo
control. Por otra parte, la concentración fue de 80,5 \pm 12,9
pg/ml en el grupo A, 76,0 \pm 6,3 pg/ml en el grupo B, y de 74,3
\pm 21,0 pg/ml en el grupo C, respectivamente, en el Ejemplo de
Ensayo 9; los valores en todos los grupos fueron significativamente
inferiores en comparación con el del grupo control (análisis de la
varianza de una vía (ANOVA) y el test de la t de Student, p <
0,001).
Adicionalmente, la concentración fue de 99,4
\pm 21,2 pg/ml en el grupo C, 80,2 \pm 17,2 pg/ml en el grupo
D, y 72,9 \pm 15,8 pg/ml en el grupo E, respectivamente, en el
Ejemplo de Ensayo 10; los valores en todos los grupos fueron
significativamente inferiores en comparación con el del grupo
control (análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y el test de la
t de Student, p < 0,001).
<110> National Center for Geriatrics and
Gerontology National Institute of Biomedical Innovation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vector de virus
adeno-asociado recombinante para el tratamiento de
la Enfermedad de Alzheimer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REG/G27266EP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2003/169714
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
13-06-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 2003-371103
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-10-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(129)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(54)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> emplazamiento de reconocimiento Xba
I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(191)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(62)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción Sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> construcción de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> emplazamiento de reconocimiento Not
I
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> emplazamiento de reconocimiento Xba
I
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(133)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sig_peptide
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)..(70)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
\hskip1cm
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Construcción Sintética
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<400> 10
\hskip1cm
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<210> 11
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcagaat tccgacatga ctcagga
\hfill27
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcttaagtc gctatgacaa caccgccc
\hfill28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Adaptador de la Secuencia Señal
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
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<211> 61
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<212> ADN
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Adaptador de la Secuencia Señal
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
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<210> 15
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 15
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctagaat gctgcccggt ttggcac
\hfill27
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<210> 16
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskiptggcggccgc tctagaatg
\hfill19
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<210> 17
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 17
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacatcttaa gcaaagaaca cc
\hfill22
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<210> 18
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<400> 18
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\hskip-.1em\dddseqskipagtgaaccgt cagatcgc
\hfill18
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<210> 19
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 19
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtatcagc tcactcaa
\hfill18
Claims (11)
1. Uso de un vector de virus
adeno-asociado en la fabricación de un agente
terapéutico para administración oral para expresar el péptido
\beta-amiloide en células intestinales para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, en el que el vector de
virus adeno-asociado comprende ADN que codifica
dicho péptido \beta-amiloide y ADN que codifica
un péptido señal capaz de segregar extracelularmente dicho péptido
\beta-amiloide, en una forma operativa.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho péptido \beta-amiloide comprende los
aminoácidos 4 a 10 de la secuencia de aminoácidos que se muestra en
SEQ ID NO: 2.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que
el ADN que codifica dicho péptido \beta-amiloide
comprende los nucleótidos 10 a 30 de la secuencia de nucleótidos
que se muestra en SEQ ID NO: 1.
4. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho péptido \beta-amiloide comprende la
secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 2.
5. El uso según la reivindicación 1, en el que
el ADN que codifica dicho péptido \beta-amiloide
comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:
1.
6. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho péptido \beta-amiloide comprende la
secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 4.
7. El uso según la reivindicación 1, en el que
el ADN que codifica dicho péptido \beta-amiloide
comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO:
3.
8. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho péptido señal es un péptido
señal de la proteína del precursor amiloide.
9. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho péptido señal comprende la
secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 6.
10. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el ADN que codifica dicho péptido
señal comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ
ID NO: 5.
11. Una composición farmacéutica que comprende
el vector de virus adeno-asociado que se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para la administración
oral para expresar el péptido \beta-amiloide en
células intestinales para uso en el tratamiento de la enfermedad de
Alzheimer.
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