ES2345243T3 - Ensayos diagnosticos basados en sondas de acidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas. - Google Patents

Ensayos diagnosticos basados en sondas de acidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas. Download PDF

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Abstract

El uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por 10 nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo in vitro procariota o eucariota.

Description

Ensayos diagnósticos basados en sondas de ácidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas.
Campo técnico
La presente invención se refiere a la identificación de secuencias diana para su uso en ensayos de ácido nucleico para la detección e identificación de organismos procariotas y eucariotas.
Antecedentes en la técnica
El gen ssrA, que codifica un transcrito de ARN (ARNtm) pequeño, estable de alto número de copias, se encuentra en todas las bacterias y recientemente se ha identificado en cloroplastos y diatomeas. Tiene una doble función como una molécula de ARNt y de ARNm y está implicado en el rescate de los ARNm truncados que han perdido codones de terminación, facilitando la trans-traducción de péptidos truncados antes de la degradación de proteasa (Keiler, K.C. y col. (1996), Science, 271, 990-993). La exclusiva función de los ARNtm ha llevado a los investigadores a analizar la relación de la estructura secundaria de estas moléculas con su función. Estos estudios se han centrado en la conservación de la estructura secundaria de los ARNtm de diferentes microorganismos y en el significado evolutivo y la relevancia funcional de dicha conservación estructural. Los estudios se llevaron a cabo por Matveeva, O y col (1998), vol. 16, Nº. 13, 1374-1375 para investigar la unión de los oligonucleótidos a las moléculas de ARN usando ARNtm como un modelo de ARN que contiene la estructura secundaria. Los estudios también se llevaron a cabo por Williams y col (RNA (1996), 2:1306 - 1310) y Williams et al. (Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26. Nº: 1) en la estructura y función del ARNtm. Los estudios implicaron el alineamiento de las secuencias del gen del ARNtm y el análisis de la homología de secuencia y la estructura secundaria del ARNtm, así como la creación de una base de datos de 37 secuencias de ARNtm para comprender mejor la estructura del ARNtm y los aspectos inusuales de la trans-traducción. Los estudios no tenían como objetivo la identificación de los sitios del ARNtm con el objetivo de diseñar oligonucleótidos antisentido con fines terapéuticos.
El número de dianas/sondas de ácidos nucleicos para diagnósticos bacterianos está actualmente limitado. Como tal, la necesidad de identificar y caracterizar nuevas dianas de ADN y ARN con fines de diagnóstico ahora se ve como una prioridad. Secuencias diana de ácido nucleico para el desarrollo de sondas pueden ser por ejemplo, plásmidos, genes de ARN ribosomal, regiones intergénicas, genes que codifican los factores de virulencia o fragmentos de ADN genómicos aleatorios. Además, se han descrito varias moléculas de ARN que se usan como dianas para la detección basada en ARN por ejemplo, ARN ribosomal y RNasa P.
La base de cualquier ensayo de sondas basado en el ácido nucleico es el requisito para secuencias bien caracterizadas de ácido nucleico que están presentes en todos los procariotas y eucariotas bajo estudio. Para la detección fiable de un organismo procariota o eucariota, las sondas de ácido nucleico usadas deben ser altamente específicas (es decir, no reaccionar en cruzado con ácidos nucleicos de otros organismos) y altamente sensibles (es decir, la mayoría o todas las cepas del organismo a detectar deben reaccionar con la sonda). Por lo tanto, las secuencias diana preferidas estarían presentes en todas las cepas del organismo de que se trate. Estas secuencias tendrían variabilidad significativa de secuencia para permitir la diferenciación de la especie de que se trate de otra estrechamente relacionada con la especie pero, por otra parte, tendría suficiente conservación de secuencia para permitir la detección de todas las cepas de la especie en cuestión. En general, la identificación exacta de una secuencia de ácido nucleico, que podría constituir la base de un ensayo de sonda específico de ácido nucleico, es tediosa, difícil e incierta. Hasta la fecha existen escasas estrategias generales que facilitarían el desarrollo de sondas de ácido nucleico para una amplia diversidad de microorganismos. Las secuencias de ácido nucleico que se han identificado como dianas potencialmente útiles para el desarrollo de sondas son, por ejemplo, los genes de ARNr y la región intergénica 16S/23S del ARNr
La mayoría de los ensayos de sonda/diana de ácido nucleico se centran en el elevado número de copias de los ARN ribosomales (ARNr) y regiones espaciadoras 16S y 23S del ARNr (patente europea Nº: 0 395 292) de la célula bacteriana con fines de detección e identificación. Se han comercializado varios kits de diagnóstico bacteriano de éxito comercial basándose en estas sondas/dianas de ARNr para la detección de una diversidad de microorganismos. Estos incluyen una amplia variedad de kits de sonda comerciales basados en el gen 16S del ARNr comercializados por Genprobe Inc. San Diego California y en sondas de ADN basadas en la región espaciadora 16S/23S comercializados por Innogenetics N.V. Gante, Bélgica. Sin embargo, muchos de estos kits de diagnóstico tienen limitaciones, incluyendo la falta de sensibilidad debido al reducido número de copias de las secuencias diana y a la falta de especificidad debido a la identidad de secuencia entre organismos estrechamente relacionados en muchos casos.
Los procedimientos basados en ácido nucleico que podrían aplicarse directamente a muestras para dar una indicación de la viabilidad de cualquier microbio presente en ella serían de enorme trascendencia para aplicaciones en la alimentación, industriales, ambientales y médicas.
Una desventaja de los procedimientos basados en el ADN, es que no diferencian entre organismos vivos y muertos. Algunos estudios se han centrado sobre el uso del ARNr y ARNm como indicadores de viabilidad celular (Sheridan, G.E.C. y col (1998) Applied and Environmental Microbiology, 64, 1313-1318) Sin embargo, estas secuencias no son dianas satisfactorias ya que el ARNr y el ARNm pueden estar presentes en las células bacterianas hasta 48 horas después de la muerte de las células.
Con la llegada del formato de tipo micromatriz basado en ácido nucleico, que incorpora el control simultáneo de múltiples dianas de ácido nucleico, actualmente existe una clara necesidad para identificar y caracterizar nuevas secuencias de ácido nucleico para su uso como regiones de sondas y/o dianas para detectar e identificar células procariotas y eucariotas viables.
Descripción de la invención
La invención proporciona el uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para la detección e identificación de un organismo procariota y eucariota.
Por lo tanto, la invención tiene aplicación en relación con todos los organismos distintos a virus.
No se ha descrito ningún otro ensayo de sonda de ácido nucleico que use regiones del gen ssrA como una región diana para detectar e identificar especies de procariotas y eucariotas con las consiguientes ventajas.
De acuerdo con una realización de la invención, como una región diana universal puede usarse un fragmento de la molécula del gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 5' de la molécula de
ADN.
En una realización alternativa de la invención, un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 3' de la molécula de ADN puede usarse como una región diana univer-
sal.
En una realización adicional de la invención de un fragmento de la molécula de gen de ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
En otra realización más de la invención un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología puede usarse como una región diana para la generación de una sonda específica de género.
Como se describe en lo sucesivo en el presente documento las alineaciones de las secuencias de nucleótidos de las secuencias del gen ssrA de diferentes organismos muestran que las regiones 5' y 3' de estas moléculas demuestran un alto grado de homología y por lo tanto, son útiles como regiones diana universales. Los genes ssrA también demuestran un grado más significativo de variabilidad de secuencia de nucleótidos entre organismos estrechamente relacionados que cualquier otro ARN bacteriano de número de copias elevado. Estas regiones variables son dianas ideales en ensayos de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
La invención también proporciona el uso del ARNtm, un transcrito del ARN del gen ssrA, o un fragmento del mismo constituido al menos por diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico para la detección e identificación de un organismo procariota o eucariota.
De acuerdo con una realización de este aspecto de la invención, como una región diana universal puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 5' de la molécula de ARNtm.
De manera alternativa, como una región diana universal puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología desde el extremo 3' de la molécula de ARNtm como una región diana universal.
De acuerdo con una realización adicional de este aspecto de la invención, como una región diana puede usarse un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología en un ensayo de sonda de ácido nucleico para diferenciar entre especies.
La sonda de ácido nucleico (ADN o ARN) de acuerdo con la invención típicamente está constituida al menos por 10 nucleótidos del transcrito del gen ssrA y/o ARNtm o su secuencia complementaria y se usa en un ensayo de hibridación de sonda de ácido nucleico para un organismo procariota o eucariota. La hibridación de la sonda con su secuencia complementaria se revela típicamente marcando la sonda de ácido nucleico con un marcador radiactivo o no radiactivo (p. ej. colorimétrico o fluorimétrico).
En realizaciones preferidas dicho fragmento del gen ssrA o dicho fragmento del ARNtm puede usarse como base de un cebador que se usará en un procedimiento de amplificación.
De acuerdo con la invención, pueden usarse cebadores oligonucleotídicos universales dirigidos a las regiones 5' y 3' del gen de ssrA o a la secuencia de ARNtm para amplificar el gen ssrA o su ARNtm codificante a partir de una amplia diversidad de bacterias, facilitando la amplificación de un amplia variedad de organismos simultáneamente, al mismo tiempo que también permite la hibridación y la detección específica de la sonda de ácido nucleico.
Preferentemente, el producto del procedimiento de amplificación se usa como una región diana en un ensayo de sonda de ácido nucleico.
Además, preferentemente, como una sonda en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos se usa un transcrito de ADNc o una molécula de ARNtm.
Estos ensayos pueden llevarse a cabo in situ o in vitro.
La región diana como se define en el presente documento puede utilizarse como base de un ensayo para diferenciar entre organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos.
A diferencia del ARNr y del ARNm, que pueden estar presentes en las células bacterianas después de la muerte de las células, el ARNtm se degrada rápidamente en organismos muertos. Por lo tanto, el ARNtm puede ser una diana útil para diferenciar entre organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos, directamente por hibridación de sonda del ácido nucleico con ARN bacteriano aislado, o combinando la amplificación del ARN y la hibridación de sonda del ácido nucleico con el producto amplificado.
Preferiblemente, la región diana se usa en un formato de sonda múltiple para la detección a amplia escala y/o la identificación de organismos procariotas o eucariotas.
Una sonda del gen ssrA o una sonda del transcrito de ARNtm de acuerdo con la invención pueden unirse a un sistema de chip génico de micromatriz para la detección de alto rendimiento a gran escala y la identificación de organismos procariotas o eucariotas.
También puede usarse una región diana de acuerdo con la invención como una sonda en un ensayo para detectar organismos procariotas o eucariotas en una muestra material.
Dicha muestra material puede incluir muestras biológicas tales como muestras de tejido de las vías respiratorias, del tracto uro-genital o del tracto gastrointestinal, o fluidos corporales tales como sangre y fracciones de sangre, esputo o líquido cefalorraquídeo.
De acuerdo con la invención, también puede realizarse un ensayo en muestras de alimentos, muestras ambientales, incluyendo muestras de aire, agua, muestras marinas y procedentes de suelo y muestras procedentes de animales y plantas.
De acuerdo con la invención también puede usarse un fragmento del gen ssrA o del transcrito de ARNtm en un ensayo para obtener un perfil de ADN de un organismo procariota o eucariota y, por lo tanto, diferenciar entre cepas de la misma especie.
Los alineamientos de la secuencia de ácido nucleico han demostrado que la variación de la secuencia se produce en el gen ssrA y en el transcrito del ARNtm dentro de las especies individuales. Esta variación de secuencia intra-especies puede usarse para diferenciar entre cepas de la misma especie para epidemiología, seguimiento de agentes infecciosos por ejemplo, en brotes, o para estudios de población.
Otras aplicaciones de la invención incluyen el uso del gen ssrA, el transcrito de ARNtm o una secuencia de ADN complementaria correspondiente, o un fragmento de éstos, para diseñar un agente dirigido contra organismos infecciosos de procariotas o eucariotas con fines terapéuticos.
Estos agentes pueden incluir un ARNm antisentido u oligonucleótidos, ribozimas y péptidos antagónicos y son adecuados para su uso en cualquier tipo de afección médica.
Por lo tanto, la invención puede usarse para la detección de microorganismos viables sólo en muestras biológicas usando el ARNtm diana. Por lo tanto, durante y después de cualquier tratamiento con fármacos de agentes anti-infecciosos, el ARNtm diana puede usarse para controlar la eficacia de la terapia sobre esos agentes infecciosos específicos (por ejemplo, tratamientos antimicrobianos y/o antiparasitarios).
En una realización, la región diana se usa para controlar la eficacia de las terapias con fármacos contra agentes infecciosos.
En otra realización, la región diana se usa para controlar la viabilidad y el nivel de organismos que son beneficiosos para la salud en el tracto gastrointestinal.
Este aspecto de la invención se refiere, por ejemplo, a la introducción, en la flora intestinal, de organismos que son beneficiosos para la salud (probióticos) contenidos, por ejemplo, en el yogur u otros alimentos para mejorar la salud. Existe un interés y una necesidad de controlar continuamente la presencia y los niveles de estos organismos para garantizar su función continua en beneficio de la salud. La región del ARNtm puede usarse como una diana para detectar organismos viables, por ejemplo en las heces, con objeto de controlar la presencia de organismos que son beneficiosos para la salud.
En una realización adicional, el ensayo se usa para la cuantificación de organismos procariotas o eucariotas.
Cuando se usa la hibridación de sonda y/o la amplificación in vitro para detectar organismos en una muestra es posible determinar el número de organismos presentes, basándose en la intensidad de la señal. También pueden usarse procedimientos en tiempo real de amplificación in vitro para permitir la cuantificación de los organismos en una muestra. Por lo tanto, la capacidad para cuantificar el número de organismos en una muestra puede ser importante en situaciones clínicas para fines de tratamiento, por ejemplo para los tratamientos con antibióticos u otros o para controlar la eficacia del tratamiento.
Una aplicación aún más de la invención es el uso de una base de datos de secuencias de genes ssrA para identificar un organismo procariota o eucariota.
La invención proporciona una diversidad de sondas para las regiones homólogas 5' y 3' y las regiones variables de las secuencias del gen ssrA y del ARNtm, derivándose las sondas de estas secuencias o de secuencias complementarias de estas. Las secuencias representativas son las siguientes:
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ssrA de Actinobacillus actinomycetemcomitans
1 
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ARNtm de Actinobacillus actinomycetemcomitans
2 
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Parcial, interna de ssrA de Aeromonas salmonicida
3
Parcial, interna de ARNtm de Aeromonas salmonicida
4
ssrA de Alcaligenes eutrophus
5 
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ARNtm de Alcaligenes eutrophus 
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6 
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ssrA de Aquifex aeolicus 
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7 
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ARNtm de Aquifex aeolicus
8 
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Parcial, interna de ssrA de Bacillus megaterium
9 
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Parcial, interna de ARNtm de Bacillus megaterium
10
ssrA de Bacillus subtilis 
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11 
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ARNtm de Bacillus subtilis 
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12
ssrA de Bordetella pertussis 
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13 
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ARNtm de Bordetella pertussis 
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14
ssrA de Borrelia burgdorferi 
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15 
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ARNtm de Borrelia burgdorferi 
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16 
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ssrA de Campylobacter jejuni 
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17 
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ARNtm de Campylobacter jejuni 
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18 
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ssrA de Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX) 
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19 
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ARNtm de Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX) 
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ssrA de Chlamydia trachomatis (neumonitis murina) 
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21 
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ARNtm de Chlamydia trachomatis (neumonitis murina) 
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22 
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ssrA de Chlorobium tepidum 
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23 
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ARNtm de Chlorobium tepidum 
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ssrA de Cyanophora paradoxa (alga)
25
ARNtm de Cyanophora paradoxa (alga)
26
Parcial 3' de ssrA de Clostridium acetobutylicumI
27
Parcial 3' de ARNtm de Clostridium acetobutylicum
28
ssrA de Deinococcus radiodurans
29
ARNtm de Deinococcus radiodurans
30
Parcial, interna de ssrA de Desulfovibrio desulfuricansI
31
Parcial, interna de ARNtm de Desulfovibrio desulfuricans
32 
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Parcial 3' de ssrA de Dichelobacter nodosus
33 
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Parcial 3' de ARNtm de Dichelobacter nodosusI
34
ssrA de Enterococcus faecalis 
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36 
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ARNtm de Enterococcus faecalis 
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37 
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ssrA de Escherichia coli 
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38 
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ARNtm de Escherichia coli 
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39 
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ssrA de Haemophilus influenzae
40
ARNtm de Haemophilus influenzae
41
Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (ATCC 43504)
42
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (ATCC 43504)
43
44 
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ssrA de Helicobacter pylori (cepa 26695)
45 
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ARNtm de Helicobacter pylori (cepa 26695)
46
47 
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Parcial, interna de ssrA de Klebsiella aerogenes (NCTC 9528) 
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48 
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Parcial, interna de ARNtm de Klebsiella aerogenes (NCTC 9528) 
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49 
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Parcial, interna de ssrA de Lactobacillus lactis (NCTC 662)
50 
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Parcial, interna de ARNtm de Lactobacillus lactis (NCTC 662)
51 
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Parcial, interna de ssrA de Legionella pneumophila
52
53
Parcial, interna de ARNtm de Legionella pneumophila
54
Parcial, interna de ssrA de Listeria grayi I
55
Parcial, interna de ARNtm de Listeria grayi
56
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua
57 
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Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua
58 
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Parcial, interna de ssrA de Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
59
Parcial, interna de ARNtm de Listeria monocytogenes (NCTC 7973) 
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Parcial, interna de ssrA de Listeria monocytogenes (NCTC 11994) 
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61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Listeria monocytogenes (NCTC 11994) 
\vskip1.000000\baselineskip
62
Parcial, interna de ssrA de Listeria murrayi
63
Parcial, interna de ARNtm de Listeria murrayi
64
Parcial, interna de ssrA de Listeria welshimeri
65
Parcial, interna de ARNtm de Listeria welshimeriI
66 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
67 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Marinobacter hydrocarbonoclasticus
68
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium avium
69 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium avium
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium bovis
71
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium bovis
72
ssrA de Mycobacterium leprae
73
ARNtm de Mycobacterium leprae
74
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium paratuberculosis
75
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium paratuberculosis
76
ssrA de Mycobacterium tuberculosis
77
ARNtm de Mycobacterium tuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
78 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Mycoplasma capricolum 
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\newpage
ARNtm de Mycoplasma capricolum 
\vskip1.000000\baselineskip
80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº:1) 
\vskip1.000000\baselineskip
81 
\newpage
ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº:1) 
\vskip1.000000\baselineskip
82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2) 
\vskip1.000000\baselineskip
83 
\newpage
Parcial, interna de ARNtm de Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2) 
\vskip1.000000\baselineskip
84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Mycoplasma pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Mycoplasma pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
86
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424) 
\vskip1.000000\baselineskip
88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424) 
\vskip1.000000\baselineskip
89
90 
\newpage
ssrA de Neisseria gonorrhoeae (FA 1090) 
\vskip1.000000\baselineskip
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Neisseria gonorrhoeae (FA 1090) 
\vskip1.000000\baselineskip
92
ssrA de Neisseria meningitidis 
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Neisseria meningitides 
\vskip1.000000\baselineskip
94 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Nostoc muscorum PCC7120 
\vskip1.000000\baselineskip
95
96 
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Nostoc muscorum PCC7120
97 
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de cloroplasto de Odontella sinensis (diatomea)
98
99
ARNtm de cloroplasto de Odontella sinensis (diatomea)
100
ssrA de cloroplasto de Porphyra purpureum (alga roja)
101
ARNtm de cloroplasto de Porphyra purpureum (alga roja)
102
ssrA de Porphyromonas gingivalis 
\vskip1.000000\baselineskip
103 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Porphyromonas gingivalis 
\vskip1.000000\baselineskip
104 
\newpage
Parcial, interna de ssrA de Proteus rettgeri (NCTC 10975)
105 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Proteus rettgeri (NCTC 10975)
106
107 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Pseudoalteromonas haloplanktoni
108 
\newpage
Parcial, interna de ARNtm de Pseudoalteromonas haloplanktoni 
\vskip1.000000\baselineskip
109 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Pseudomonas aeruginosa 
\vskip1.000000\baselineskip
110 
\newpage
ARNtm de Pseudomonas aeruginosa 
\vskip1.000000\baselineskip
111 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Salmonella typhimurium 
\vskip1.000000\baselineskip
112 
\newpage
ARNtm de Salmonella typhimurium 
\vskip1.000000\baselineskip
113 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Shewanella putrefaciens 
\vskip1.000000\baselineskip
114
115 
\newpage
ARNtm de Shewanella putrefaciens 
\vskip1.000000\baselineskip
116 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Staphylococcus aureus 
\vskip1.000000\baselineskip
117
118 
\newpage
ARNtm de Staphylococcus aureus 
\vskip1.000000\baselineskip
119 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Streptococcus gordonii 
\vskip1.000000\baselineskip
120 
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
ARNtm de Streptococcus gordonii
121
ssrA de Streptococcus mutans
122
ARNtm de Streptococcus mutans
123 
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
ssrA de Streptococcus pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
124 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Streptococcus pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
125
126 
\newpage
ssrA de Streptococcus pyogenes 
\vskip1.000000\baselineskip
127 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Streptococcus pyogenes 
\vskip1.000000\baselineskip
128
129 
\newpage
ssrA de Synechococcus sp. PCC6301 
\vskip1.000000\baselineskip
130 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Synechococcus sp. PCC6301 
\vskip1.000000\baselineskip
131
132 
\newpage
ssrA de Synechocystis sp. PCC6803 
\vskip1.000000\baselineskip
133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Synechocystis sp. PCC6803 
\vskip1.000000\baselineskip
134
ssrA de Thermotoga maritima 
\vskip1.000000\baselineskip
135 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Thermotoga maritima 
\vskip1.000000\baselineskip
136 
\newpage
ssrA de Thermus thermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
137 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Thermus thermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Treponema pallidum 
\vskip1.000000\baselineskip
139
140 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Treponema pallidum 
\vskip1.000000\baselineskip
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Vibrio cholerae 
\vskip1.000000\baselineskip
142
143 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Vibrio cholerae 
\vskip1.000000\baselineskip
144 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Yersinia pestis 
\vskip1.000000\baselineskip
145
ARNtm de Yersinia pestis
146 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Campylobacter fetus
147 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Campylobacter fetus
148
Parcial, interna de ssrA de Campylobacter coli (BM2509)
149 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Campylobacter coli (BM2509)
150
151 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de CamplyobacterI de aislado de pollo
152
Parcial, interna de ARNtm de Camplyobacter de aislado de pollo
153 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Clostridium perfringens
154 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Clostridium perfringens I
155
Parcial, interna de ssrA de Haemophilus ducreyi (NCTC 10945) 
\vskip1.000000\baselineskip
156
157 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Haemophilus ducreyi (NCTC 10945) 
\vskip1.000000\baselineskip
158 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº:1) 
\vskip1.000000\baselineskip
159
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 1)
160
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 2)
161
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 2)
162
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 3)
163
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (aislado alimenticio Nº: 3) 
\vskip1.000000\baselineskip
164 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Listeria innocua (ATCC 12210) 
\vskip1.000000\baselineskip
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Listeria innocua (ATCC 12210) 
\vskip1.000000\baselineskip
166
Parcial, interna de ssrA de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
167 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
168 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
169
Parcial, interna de ARNtm de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
170 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Salmonella enteritidis
171 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Salmonella enteritidis
172
Parcial, interna de ssrA de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
174 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
175
Parcial, interna de ARNtm de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181) 
\vskip1.000000\baselineskip
176 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Bordetella bronchiseptica 
\vskip1.000000\baselineskip
177 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Bordetella bronchiseptica 
\vskip1.000000\baselineskip
178 
\newpage
ssrA de Chlamydia pneumoniae (CWL029) 
\vskip1.000000\baselineskip
179 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Chlamydia pneumoniae (C WL029) 
\vskip1.000000\baselineskip
180 
\newpage
ssrA de Francisella tularensis 
\vskip1.000000\baselineskip
181 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Francisella tularensis 
\vskip1.000000\baselineskip
182 
\newpage
ssrA de Guillardia theta (plastidial) 
\vskip1.000000\baselineskip
183 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Guillardia theta (plastidial) 
\vskip1.000000\baselineskip
184 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ssrA de Thalassiosira Weissflogii (plastidial) 
\vskip1.000000\baselineskip
185
186 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
ARNtm de Thalassiosira Weissflogii (plastidial) 
\vskip1.000000\baselineskip
187 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (aislado clínico 1) 
\vskip1.000000\baselineskip
188
189 
\newpage
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (aislado clínico 1) 
\vskip1.000000\baselineskip
190 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Helicobacter pylori (aislado clínico 2) 
\vskip1.000000\baselineskip
191 
\newpage
Parcial, interna de ARNtm de Helicobacter pylori (aislado clínico 2)
192 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
193 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Listeria seeligeri (NCTC 11856)
194
195
Parcial, interna de ssrA de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
196 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Listeria ivanovii (NCTC 11846)
197 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium africanum (aislado clínico)
198
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium africanum (aislado clínico)
199 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium gordonae (aislado clínico)
200 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium gordonae (aislado clínico)
201
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium kansasii (aislado clínico)
202 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium kansasii (aislado clínico)
203 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium chelonae
204
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium chelonae
205 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium szulgai (ATCC 35 799)
206 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium szulgai (ATCC 35 799)
207
ssrA de Mycobacterium malmoense (aislado clínico)
208 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium malmoense (aislado clínico)
209 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium flavescens
210
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium flavescens
211 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium marinum
212 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium marinum
213
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium microti (aislado ambiental)
500 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium microti (aislado ambiental)
501 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium smegmatis (ATCC 10143)
214
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium smegmatis (ATCC 10143)
215 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium xenopi (aislado clínico)
216 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium xenopi (aislado clínico)
217
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium intracellulare (NCTC 10425)
218 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium intracellulare (NCTC 10425)
219 
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Mycobacterium scrofulaceum (NCTC 10803)
220
Parcial, interna de ARNtm de Mycobacterium scrofulaceum (NCTC 10803)
221 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Nocardia asteroides
222 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Nocardia asteroides
223
Parcial, interna de ssrA de Salmonella enteritidis
224 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Salmonella enteritidis
225 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
226
Parcial, interna de ARNtm de Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
227 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ssrA de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
228 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Parcial, interna de ARNtm de Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
229
De las secuencias anteriores, las SEC ID Nº: 47 a 62, 65 a 68, 71 y 72, 98 y 99, 159 a 168 y 176-217 son secuencias nuevas.
Las secuencias anteriormente mencionadas pueden usarse para formar una base de datos de secuencias del gen ssrA que pueden usarse para identificar una especie bacteriana, o para la generación de ensayos de diagnóstico de ácido nucleico.
Las sondas representativas identificadas de acuerdo con la invención son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Salmonella 1) Sonda específica de género
5'-CGAATCAGGCTAGTCTGGTAG-3' SEC ID Nº: 218
\vskip1.000000\baselineskip
Micobacteria 2) Sonda oligonucleotídica para la detección del complejo de la tuberculosis
TB01 5'-ACTCCTCGGACA (A/G) CCACAGCGA-3' SEC ID Nº: 219
\vskip1.000000\baselineskip
3) Sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M. avium y M. paratuberculosis
Sonda 1:
PAV1 - 5' - GTTGCAAATAGATAAGCGCC-3' SEC ID Nº: 220
Sonda 2:
PAV2 - 5' - TCCGTCAGCCCGGGAACGCC-3' SEC ID Nº: 221
\vskip1.000000\baselineskip
Listeria 4) Sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de las células
LVtm: 5' - TTTTGTTTTTCTTTGCCA - 3' SEC ID Nº: 222
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Escherichia coli 5) Sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de las células
Evtm: 5' - AGTTTTCGTCGTTTGCGA - 3' SEC ID Nº: 223
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Otros cebadores representativos de acuerdo con la invención son los siguientes:
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Micobacteria 1) Cebadores oligonucleotídicos degenerativos para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas
Cebador 5'
10SAAM3 - 5' - CAGGCAA (G/C) (A/T/C) GACCACCGTAA-3' SEC ID Nº: 224
Cebador 3'
10SAAM4 - 5' GGATCTCC(C/T)G(A/G)TC(A/T)C(A/G)CG(A/G)AC (A/T)A-3' SEC ID Nº: 225
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2) Cebadores oligonucleotídicos para la amplificación de M. avium y M. paratuberculosis
Cebador 5':
directoAP1-5'-TGCCGGTGCAGGCAACTG-3' SEC ID Nº: 226
Cebador 3':
inversoAP2 -5' - CACGCGAACAAGCCAGGA-3' SEC ID Nº: 227
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Breve descripción de los dibujos
En los dibujos adjuntos:
La figura 1 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de E. coli y V. cholerae;
La figura 2 es una fotografía de un gel de agarosa del ARN celular total, preparado de células de E. coli y V. cholerae.
La fig. 3 es una fotografía de un autorradiograma de hibridación de una sonda oligonucleotídica de V. cholerae con transcritos de ARNtm de E. coli y V. cholerae;
La fig. 4 es una fotografía de un gel de agarosa de los productos amplificados de cebadores universales de amplificación del gen ssrA universal procedente de un panel de organismos;
La fig. 5 es un alineamiento de clustal de las secuencias del gen ssrA de las especies de Listeria;
La fig. 6 es un alineamiento de clustal de las secuencias del gen ssrA/ARNtm de B. subtilus;
La fig. 7 es una fotografía de un gel de agarosa de los productos amplificados de cebadores de amplificación por PCR específicos del género Listeria procedente de un panel de organismos;
La fig. 8 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica específica del género Listeria hibridada con un panel de organismos como se prepara en el Ejemplo 4;
La figura 9 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica específica de la especie L. monocytogenes hibridada con un panel de organismos como se prepara en el Ejemplo 7;
La fig. 10 es una imagen escaneada por ordenador de una tira de membrana de nylon usada en la detección múltiple de sonda colorimétrica de secuencias deL gen ssrA de Listeria como se describe en Ejemplo 6.
La figura 11 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de C. trachomatis;
La fig. 12 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de H. pylori;
La fig. 13 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de M. genitalium;
La fig. 14 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de Neisseria gonorrhoeae;
La fig. 15 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de L. monocytogenes;
La fig. 16 es un alineamiento de clustal de secuencias del gen ssrA de cepas de L. monocytogenes y de la cepa L. innocua;
La fig. 17 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Evtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico del medio de células de E. coli;
La fig. 18 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Evtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico extremo de células de E. coli;
La fig. 19 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Lvtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico medio de células de L. monocytogenes;
La fig. 20 es una fotografía de un autorradiograma de una sonda oligonucleotídica de Listeria (Lvtm) hibridada con muestras de ARN total aislado después del tratamiento térmico extremo de células de L. monocytogenes; y
La figura 21 es una fotografía de un gel de agarosa de productos de ARNtm generados por RT-PCR a diversos momentos después del tratamiento térmico.
La invención se ilustrará adicionalmente por los siguientes ejemplos.
Modos para llevar a cabo la invención
Ejemplo 1
Examen de las secuencias primarias de nucleótidos de secuencias disponibles de ARNtm
Un alineamiento comparativo de las secuencias primarias de nucleótidos de secuencias disponibles de ARNtm usando el programa de alineamiento de ácido nucleico Clustal W demostró que las secuencias de ARNtm de procariotas muestran un grado más significativo de variabilidad y no homología de secuencias de nucleótidos que otros ARN bacterianos de alto número de copias, como se muestra en la Tabla 1.
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TABLA 1
230
Estas regiones de no homología entre secuencias de ARNtm de diferentes bacterias se localizan en el centro de la molécula y el grado de no-homología de la secuencia de nucleótidos dentro de la molécula de ARNtm indica que podrían generarse sondas específicas de género así como de especie para diferenciar entre y/o detectar bacterias.
Los alineamientos de secuencias de nucleótidos habían demostrado previamente que las regiones flanqueantes 5' y 3' de las moléculas de ARNtm comparten un alto grado de homología tanto dentro de la especie como dentro del género. Esta observación indicó que podrían generarse cebadores oligonucleotídicos universales para amplificar el gen ssrA o su ARNtm codificante a partir de una amplia diversidad de bacterias.
Ahora los inventores han demostrado que estas regiones de homología y no homología dentro de la secuencia de nucleótidos de las moléculas de ARNtm de diferentes organismos pueden usarse como base para la identificación y detección de organismos a nivel molecular.
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Ejemplo 2
Desarrollo de una sonda específica de ARNtm de V. cholerae
Como se representa en la Figura 1, un alineamiento de las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ssrA de E. coli (SEC ID Nº: 37) y V. cholerae (SEC ID Nº: 127), muestra que estas dos especies bacterianas están filogenéticamente muy relacionadas. Sin embargo, son regiones de no homología entre las secuencias como se pone de manifiesto por la ausencia de asteriscos (en la figura). Se sintetizó una sonda oligonucleotídica, complementaria con la región variable de la secuencia de nucleótidos de ssrA de V. cholerae, subrayada en la figura 1.
La secuencia de la sonda específica del ARNtm de V. cholerae es
5'- AACGAATGGCTAACCTGAA-3' SEC ID Nº. 169
Se aisló ARN total de cultivos líquidos de E. coli y V. cholerae en la fase media exponencial y en la fase estacionaria del crecimiento. Se realizó la electroforesis de cantidades equivalentes del ARN total aislado en un gel de agarosa desnaturalizado con formaldehído y se realizó la transferencia sobre una membrana de nylon HYBOND-N como se muestra en la Figura 2, en la que los carriles 1-4 representan lo siguiente:
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502 
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Después, la transferencia de Northern resultante, se hibridó con la sonda específica del ARNtm de V. cholerae marcada en el extremo con \gammaP^{32}. Los resultados del experimento de hibridación mostrados en la Figura 3 demuestran la especificidad de la sonda ya que solo se detectaron los ARNtm de V. cholerae. Por otra parte, se observó un mayor grado de intensidad de la señal de hibridación con el aislado del ARNtm de V. cholerae procedente de cultivos durante la fase estacionaria del crecimiento, lo que indica que durante esta fase, está presente un mayor número de copias de la molécula de ARNtm en células de V. cholerae.
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Ejemplo 3
Generación de cebadores oligonucleotídicos universales de amplificación de ssrA/ARNtn para la caracterización de secuencias desconocidas del gen ssrA y del ARNtm
El alineamiento mediante Clustal W de todas las secuencias disponibles del gen ssrA y del ARNtm indicó que podrían diseñarse cebadores oligonucleotídicos degenerados para amplificar secuencias de nucleótidos del gen ssrA y del ARNtm para una amplia diversidad de organismos.
Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos degenerados para amplificar por PCR secuencias del gen ssrA procedentes de preparaciones de ADN genómico total de una amplia variedad de bacterias.
Las secuencias de los oligonucleótidos degenerados sintetizados son las siguientes:
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(a) tmU5': cebador para ampliación por PCR in vitro 5'
5'- GGG(A/C)(C/T)TACGG(A/T)TTCGAC- 3' SEC ID Nº: 170
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(b) tmU3': cebador para ampliación por PCR in vitro 3'
5'- GGGA(A/G)TCGAACC(A/G)(C/G)GTCC- 3' SEC ID Nº: 171
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Las posiciones de las bases degeneradas se indican entre paréntesis.
En un gel de agarosa, se realizó la electroforesis de los productos de las reacciones de PCR y en todos los casos se amplificó un producto PCR de 350 pares de bases (aprox.), como se muestra en la Figura 4, lo que demuestra la "universalidad" de los cebadores degenerados del ARNtm.
En la Figura 4 los carriles representan lo siguiente:
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231
Los cebadores universales amplifican el gen ssrA de bacterias Gram-positivas y Gram negativas, como se muestra en la Tabla 2.
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TABLA 2 
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232 
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Ejemplo 4
Aislamiento y caracterización de secuencias de nucleótidos bacterianas previamente desconocidas de ssrA/ARNtm
Se subclonaron los productos PCR amplificados procedentes de ADN genómico de especies de la bacteria Listeria y de la bacteria M. bovis, de la tabla 2, en un vector plasmidial de cola T con objeto de realizar la secuenciación del ADN. Para cada especie se seleccionaron tres clones recombinantes y se secuenciaron por el procedimiento de secuenciación di-desoxi. Para cada subclon, se determinó la secuencia de las dos hebras del ADN.
La secuencia de nucleótidos determinada para el gen ssrA M. bovis comparte homología del 100% con la secuencia del gen ssrA de Mycobacterium tuberculosis.
En la Fig. 5 se muestra un alineamiento mediante clustal W de las nuevas secuencias génicas de ssrA obtenidas para las especies de Listeria (SEC ID Nº: 51, 53, 55, 59 y 61). Este análisis indicó que para la bacteria Listeria pueden generarse sondas específicas de género y cebadores de amplificación oligonucleotídicos. Además, el alineamiento indicó también que puede generarse una sonda oligonucleotídica específica de especie que diferenciará L. monocytogenes de las otras especies de Listeria.
En la Figura 5 los cebadores oligonucleotídicos específicos de género propuestos, Ltm 1 y 2 de Ltm, están enmarcados, así como la sonda oligonucleotídica específica del género Listeria, LGtm. La secuencia de la sonda oligonucleotídica específica de la especie L. monocytogenes, LStm, está subrayada y en cursiva.
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Para ilustrar adicionalmente que la diana del ácido nucleico del gen ssrA/ARNtm es una diana adecuada para diagnósticos bacterianos, se llevó a cabo un alineamiento comparativo de la secuencia de nucleótidos del gen ssrA de L. monocytogenes (SEC ID Nº. 55) con la secuencia de nucleótidos del gen ssrA disponible de B. subtilis (SEC ID Nº. 11) (una bacteria filogenéticamente estrechamente relacionada con Listeria) como se muestra en la Figura 6. El análisis del alineamiento de secuencia mostró un porcentaje de homología de secuencia de nucleótidos del 41%, mientras que el alineamiento correspondiente del ARNr 16S presentó un porcentaje de homología de secuencia de nucleótidos del 87%, (datos no mostrados).
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Ejemplo 5
Generación y aplicación de cebadores de amplificación específicos de género del gen ssrA/ARNtm, sondas específicas de género y específicas de especie para la especie bacteriana Listeria
Usando el alineamiento de secuencias de nucleótidos del gen ssrA/ARNtm del género Listeria del Ejemplo 4, se analizaron las regiones de la secuencia de nucleótidos del gen ssrA/ARNtm para determinar su idoneidad para la generación de cebadores de amplificación específicos de género, y sondas oligonucleotídicas específicas de género y específicas de especie. En este análisis, las regiones que demostraron las mayores diferencias de secuencia para B. subtilis, se seleccionaron en el diseño de estas sondas y cebadores de amplificación.
Las secuencias de los oligonucleótidos sintetizados son las siguientes:
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(a) Ltm1: cebador de amplificación específico del género Listeria 5'
5' -AAAGCCAATAATAACTGG- 3' SEC ID Nº: 172
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(b) Ltm2: cebador de amplificación específico del género Listeria 3'
5' -CCAGAAATATCGGCACTT- 3' SEC ID Nº: 173
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(c) LGtm: sonda de hibridación específica del género Listeria
5' -GTGAGACCCTTACCGTAG- 3' SEC ID Nº: 174
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(d) LStm: sonda de hibridación específica de la especie L.
5' -TCTATTTAACCCCAGACG- 3' SEC ID Nº: 175
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Los cebadores de amplificación específicos de género Ltm1 y Ltm2 se usaron, en cada caso, como molde en una serie de reacciones de PCR con ADN genómico total de veinte cepas diferentes. Con estos cebadores, únicamente se amplificaron las secuencias del gen ssrA de las especies de Listeria (producto de 260 pares de bases) (Fig. 7 y Tabla 3) lo que demuestra que el gen ssrA/ARNtm es una diana adecuada para la amplificación in vitro específica de un género de bacteria. En ninguna otra especie bacteriana ensayada se observaron productos de amplificación, aunque se obtuvieron productos PCR del ADN de estas especies bacterianas usando los cebadores universales (tmU5' y tmU3') descritos en el ejemplo 2.
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En la Fig. 7 los carriles representan lo siguiente:
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233
TABLA 3
234 
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La sonda oligonucleotídica específica del género Listeria, LGtm, se hibridó con la transferencia de Southern representada en la figura 4. Se observaron señales positivas de hibridación sólo con especies de Listeria, como se muestra en la Fig. 8 y en la Tabla 4, lo que demuestra la utilidad de la secuencia de ARNtm como una diana en la detección de un género específico.
En la Fig. 8 los carriles representan lo siguiente:
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235
236 
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Se realizó la transferencia de Southern de los productos PCR generados usando la amplificación específica de género descrita en este ejemplo y se muestra en la Figura 7 y se hibridaron con la sonda oligonucleotídica específica de la especie L. monocytogenes. Se observó una señal de hibridación positiva con tres de las cuatro cepas tipificadas y el aislado clínico de L. monocytogenes como se muestra en la Figura 9 y en la Tabla 4.
En la Fig. 9 los carriles representan lo siguiente:
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237
238 
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TABLA 4
239
240
La cepa 4, una de las cepas tipificadas de L. monocytogenes, no pudo generar una señal positiva con esta sonda. La secuenciación de ADN del gen ssrA amplificado por PCR de esta cepa demostró que este contenía una región diana de sonda idéntica a L. innocua. Sin embargo, cabe señalar, que el gen ssrA de esta cepa contiene otras regiones en las que la secuencia es idéntica a la de la cepa de L. monocytogenes anteriormente caracterizada y que estas secuencias son diferentes a las secuencias de L. innocua., como se muestra en la Figura 15. Por lo tanto, puede sintetizarse un oligonucleótido específico de especie dirigido a una de estas regiones variables que reconocería cada tipo de cepa (aislada) dentro de la especie, por ejemplo L. monocytogenes. 
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Ejemplo 6
Detección por sonda colorimétrica múltiple de secuencias del gen ssrA de Listeria
LGTm (A), LStm (B) y una sonda oligonucleotídica de la SEC ID Nº: 228 de espaciador de ARNr 16S - 23S (C - 5' CATTAAACTTTAG-CAAGGAAGTG 3') de Campylobacter upsaliensis se unieron de manera irreversible a tiras de membrana de nylon y se hibridaron con el producto PCR amplificado de ssrA, usando los cebadores específicos de género, Ltm1 y Ltm2 ( Ltm1 se marcó con biotina en el extremo 5'), de L. monocytogenes (1-6), L. innocua (7-10), L. ivanovii (11), L. murrayi (12), L. seeligeri (13), L. welshmeri (14) y L. grayii (15). También se hibridaron los productos PCR amplificados de ssrA, usando tmU5' y tmU3' (tmU5' se marcó con biotina en el extremo 5'), con las tiras de la membrana de nylon de las bacterias Gram-positivas, B. subtilus, L. lactis, S. aureus, S. epidermis, E. faecalis, C. perfringins (16-21) y las bacterias Gram-negativas E. coli, S. enteritidis, P. Rettgeri, K. aerogenes (22-25). Como se muestra en la Fig. 10, después de la hibridación, el desarrollo del ensayo colorimétrico con biotina reveló lo siguiente: las Tiras 1-6 demuestran que el producto PCR amplificado de ssrA se origina de L. monocytogenes combinado con la confirmación de que el producto PCR amplificado es del género Listeria - A y B dan detección de color; las Tiras
7 - 15 demuestran que estos productos PCR se originan del género Listeria - solo A da detección de color; y las Tiras 16 - 25 demuestran que los productos PCR no son del género Listeria - no se detecta color. C es una sonda de control oligonucleotídica negativa y D es un control positivo del ensayo de detección colorimétrico para todas las muestras.
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Ejemplo 7
Uso de secuencias de ssrA/ARNtm para diferenciar entre especies de organismos
Los alineamientos mediante Clustal W como se muestra en las Figs. 11 (SEC ID Nº. 19 y 21), 12 (SEC ID Nº. 41 y 43), 13 (SEC ID Nº: 77 y 79), 14 (SEC ID Nº. 83 y 85), 15 y 16 (SEC ID Nº: 53, 55 y 57), indican que hay diferencias de nucleótidos dentro de las secuencias de ssrA/ARNtm de diferentes cepas de la misma bacteria. Esto sugiere que las secuencias de ssrA/ARNtm posiblemente podrían usarse para discriminar entre individuos y/o grupos de cepas dentro de una especie bacteriana. Esto puede tener aplicaciones útiles en epidemiología y análisis de población bacteriana.
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Ejemplo 8
Análisis de integridad del ARNtm después del tratamiento térmico medio y extremo de células bacterianas
Se trataron cultivos de E. coli y L. monocytogenes a 80ºC, durante 20 minutos en el caso de E. coli y 40 minutos en el caso de L. monocytogenes y a 120ºC durante 15 minutos (esterilizando en autoclave) después del crecimiento durante una noche y se ensayó su viabilidad a las 0 h, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h, h 24 y 48 horas después del tratamiento térmico. No se observó viabilidad en ningún período de tiempo ensayado. También se aisló ARN total en estos períodos de tiempo y se realizó la electroforesis en geles de agarosa al 1,2% desnaturalizantes y la transferencia de Northern. Cada transferencia se hibridó, en el caso de E. coli (Figs 17 y 18), con una sonda oligonucleotídica marcada radiactivamente Evtm y en el caso de L. monocytogenes (Figs 19 y 20) con una Lvtm radiomarcada. Con cada muestra ensayada no se detectó ningún transcrito de ARNtm, lo que demuestra que el transcrito de ARNtm se degrada después del tratamiento térmico. Los carriles representados con la anotación +ve son una muestra de ARN total de control positivo.
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Ejemplo 9
Uso del transcrito de ARNtm para diferenciar entre bacterias viables y no viables
Un cultivo de 100 ml de L. monocytogenes creció durante una noche en un cultivo líquido. Después del crecimiento, se llevaron a cabo diluciones en serie de las células y se determinó la viabilidad sembrando en placas de propagación sobre placas de agar nutritivo. Simultáneamente, se aisló ARN total de una alícuota de 1 ml de estas células. El resto de las células se calentó a 65ºC durante 20 minutos. Después, las células se eliminaron para el análisis de viabilidad y el aislamiento de ARN total. Se tomaron muestras para la viabilidad y el aislamiento de ARN en períodos de tiempo de 0 h, 2 h, h 6 y 24 horas después del tratamiento.
La siembra en placas de propagación sobre placas de agar nutritivo indicó que el tratamiento térmico exterminó células de L. monocytogenes, no observándose ninguna unidad formadora de colonias viable. Después, cada aislado de muestra de ARN se trató con DNasa para eliminar cualquier ADN contaminante y las muestras de ARN total (100 ng) se sometieron a amplificación PCR - Transcriptasa Inversa usando los cebadores oligonucleotídicos Ltm1 y Ltm2 específicos de ssrA/ARNtm del género Listeria. Las reacciones de amplificación de control negativo incluyeron cebadores, diana y Taq polimerasa, pero no transcriptasa inversa. Los resultados de las reacciones de amplificación se muestran en la Figura 12.
Sólo se observaron productos RT-PCR de ARNtm amplificados con la muestra de RNA no tratada con calor. Las muestras restantes no dieron ningún producto RT-PCR lo que indica que las moléculas de ARNtm en estas muestras pueden haberse degradado en las células tratadas con calor no viables.
En la Fig. 21 los carriles representan lo siguiente:
Carril A:
Marcador de peso molecular V;
Carril 1:
Amplificación del ARN por PCR (tratamiento de células sin calor) - Transcriptasa Inversa (RT), + Taq polimerasa (TP);
Carril 2:
RT-PCR del ARN (tratamiento de células sin calor), + RT, +TP;
Carril 3:
Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 0 después del tratamiento térmico), -RT, +TP;
Carril 4:
RT-PCR del ARN (a tiempo 0 después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 5:
Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 1 h después del tratamiento térmico), - RT, +TP;
Carril 6:
RT-PCR del ARN (a tiempo 1 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 7:
Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 2 h después del tratamiento térmico), - RT, +TP;
Carril 8:
RT-PCR del ARN (a tiempo 2 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 9:
Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 6 h después del tratamiento térmico), -RT, +TP;
Carril 10:
RT-PCR del ARN (a tiempo 6 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril 11:
Amplificación del ARN por PCR (a tiempo 24 h después del tratamiento térmico), -RT, +TP;
Carril 12:
RT-PCR del ARN (a tiempo 24 h después del tratamiento térmico), +RT, +TP;
Carril B:
Marcador de peso molecular V;
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<110> ENTERPRISE IRELAND (t/a BIORESEARCH IRELAND) y col
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<120> Ensayos de diagnóstico basados en sondas de ácidos nucleicos para organismos procariotas y eucariotas
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<130> P00-37-PCT
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/IE 99/00043
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<151> 14-05-1999
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 366
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<212> ADN
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<213> Actinobacillus actinomycetemcomitans 
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<400> 1
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\hskip0,8cm
241 
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<210> 2
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<211> 366
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<212> ARN
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<213> Actinobacillus actinomycetemcomitans 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
242 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 315
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<212> ADN
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<213> Aeromonas salmonicida 
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<400> 3
\hskip0,8cm
243 
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<210> 4
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<211> 315
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<212> ARN
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<213> Aeromonas salmonicida 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip0,8cm
244 
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<210> 5
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<211> 349
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<212> ADN
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<213> Alcaligenes eutrophus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip0,8cm
245 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 349
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<212> ARN
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<213> Alcaligenes eutrophus 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
246 
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<210> 7
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<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aquifex aeolicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
247 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Aquifex aeolicus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
248 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip0,8cm
249 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus megaterium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip0,8cm
250 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
251 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus subtilis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
252 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella pertussis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
253 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella pertussis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip0,8cm
254 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip0,8cm
255 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Borrelia burgdorferi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip0,8cm
256 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter jejuni 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip0,8cm
257 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 359
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter jejuni 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
258 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
259 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 420
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis (D/UW-3/CX)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
260 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis (neumonitis murina)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
261 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis (neumonitis murina)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
262 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlorobium tepidum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
263 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlorobium tepidum 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip0,8cm
264 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cyanophora paradoxa (alga) cyanelle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip0,8cm
265 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 294
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cyanophora paradoxa (alga) cyanelle
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip0,8cm
266 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium acetobutylicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip0,8cm
267 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium acetobutylicum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip0,8cm
268 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Deinococcus radiodurans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip0,8cm
269 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Deinococcus radiodurans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip0,8cm
270 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desulfovibrio desulfuricans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
271 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desulfovibrio desulfuricans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip0,8cm
272 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dichelobacter nodosus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip0,8cm
273 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Dichelobacter nodosus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip0,8cm
274 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecalis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
275 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterococcus faecalis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
276 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
277 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
278 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip0,8cm
279 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus influenzae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip0,8cm
280 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori (ATC 43504)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip0,8cm
281 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 340
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori (ATC 43504)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip0,8cm
282 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori (cepa 26695)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
283 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori (cepa 26695)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
284 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
285 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Klebsiella aerogenes (NCTC 9528)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip0,8cm
286 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus lactis (NCTC 662)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip0,8cm
287 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 316
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus lactis (NCTC 662)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip0,8cm
288 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
289 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Legionella pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
290 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria grayi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
291 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria grayi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
292 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip0,8cm
293 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip0,8cm
294 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip0,8cm
295 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 7973)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip0,8cm
296 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip0,8cm
297 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria monocytogenes (NCTC 11994)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip0,8cm
298 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria murrayi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip0,8cm
299 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria murrayi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip0,8cm
300 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria welshimeri 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip0,8cm
301 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria welshimeri 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip0,8cm
302 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Marinobacter hydrocarbonoclasticus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip0,8cm
303 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Marinobacter hydrocarbonoclasticus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip0,8cm
304 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium avium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip0,8cm
305 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium avium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip0,8cm
306 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium bovis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip0,8cm
307 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium bovis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip0,8cm
308 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium leprae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
309 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 369
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium leprae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
310 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
311 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip0,8cm
312 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium tuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip0,8cm
313 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium tuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip0,8cm
314 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma capricolum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip0,8cm
315 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma capricolum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip0,8cm
316 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip0,8cm
317 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 388
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip0,8cm
318 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip0,8cm
319 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 350
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma genitalium (ATTC 33530, Nº: 2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip0,8cm
320 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip0,8cm
321 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycoplasma pneumophila 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip0,8cm
322 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip0,8cm
323 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae (ATCC 19424)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip0,8cm
324 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\hskip0,8cm
325 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae (FA 1090)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip0,8cm
326 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
327 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
328 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 385
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nostoc muscorum PCC7120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
329 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 385
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nostoc muscorum PCC7120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
330 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Odontella sinensis (diatomea) cloroplasto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
331 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 371
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Odontella sinensis (diatomea) cloroplasto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
332 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Porphyra purpureum (alga roja) cloroplasto
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\hskip0,8cm
333 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 323
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Porphyra purpureum (alga roja) cloroplasto
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\hskip0,8cm
334 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Porphyromonas gingivalis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\hskip0,8cm
335 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Porphyromonas gingivalis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\hskip0,8cm
336 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteus rettgeri (NCTC 10975)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\hskip0,8cm
337 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteus rettgeri (NCTC 10975)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip0,8cm
338 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudoalteromonas haloplanktis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\hskip0,8cm
339 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudoalteromonas haloplanktis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\hskip0,8cm
340 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
341 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pseudomonas aeruginosa 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
342 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
343 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 363
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella typhimurium 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\hskip0,8cm
344 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shewanella putrefaciens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\hskip0,8cm
345 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 355
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Shewanella putrefaciens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\hskip0,8cm
346 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\hskip0,8cm
347 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 362
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus aureus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip0,8cm
348 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus gordonii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\hskip0,8cm
349 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus gordonii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip0,8cm
350 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mutans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\hskip0,8cm
351 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus mutans 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
352 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
353 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pneumoniae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
354 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\hskip0,8cm
355 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\hskip0,8cm
356 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus sp. PCC6301
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\hskip0,8cm
357 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechococcus sp. PCC6301
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\hskip0,8cm
358 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis PCC6803
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip0,8cm
359 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 399
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Synechocystis PCC6803
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip0,8cm
360 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermotoga maritima 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\hskip0,8cm
361 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 356
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermotoga maritima 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip0,8cm
362 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\hskip0,8cm
363 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thermus thermophilus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\hskip0,8cm
364 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Treponema pallidum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\hskip0,8cm
365 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Treponema pallidum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\hskip0,8cm
366 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vibrio cholerae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\hskip0,8cm
367 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 367
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Vibrio cholerae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\hskip0,8cm
368 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Yersinia pestis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\hskip0,8cm
369 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Yersinia pestis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\hskip0,8cm
370 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter fetus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\hskip0,8cm
371 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter fetus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\hskip0,8cm
372 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter coli (BM2509)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\hskip0,8cm
373 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Campylobacter coli (BM2509)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\hskip0,8cm
374 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de organismo desconocido: Campylobacter aislado de pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\hskip0,8cm
375 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 311
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de organismo desconocido: Campylobacter aislado de pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\hskip0,8cm
376 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium perfringens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\hskip0,8cm
377 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Clostridium perfringens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\hskip0,8cm
378 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus ducreyi (NCTC 10945)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\hskip0,8cm
379 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 331
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Haemophilus ducreyi (NCTC 10945)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\hskip0,8cm
380 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
381 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
382 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
383 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
384 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\hskip0,8cm
385 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (aislado de alimento Nº:3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\hskip0,8cm
386 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (ATCC 12210)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\hskip0,8cm
387 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria innocua (ATCC 12210)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\hskip0,8cm
388 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\hskip0,8cm
389 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\hskip0,8cm
390 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\hskip0,8cm
391 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\hskip0,8cm
392 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enteritidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\hskip0,8cm
393 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enteritidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\hskip0,8cm
394 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\hskip0,8cm
395 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\hskip0,8cm
396 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
397 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
398 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella bronchiseptica 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
399 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bordetella bronchiseptica 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
400 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae (CWL029)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
401 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 426
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia pneumoniae (CWL029)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
402 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Francisella tularensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
403 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 421
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Francisella tularensis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
404 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Guillardia theta (plastidial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
405 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 330
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Guillardia theta (plastidial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
406 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
407 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Thalassiosira Weissflogii (plastidial)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
408 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda específica de ARNtm de V. cholerae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aacgaatggc taacctgaa 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 5' universal de amplificación in vitro ssrA/ARNtm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggmytacgg wttcgac 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 3' universal de amplificación in vitro ssrA/ARNtm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggartcgaa ccrsgtcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 5' de amplificación PCR específico del género Listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaagccaata ataactgg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador 3' de amplificación específico del género Listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccagaaatat cggcactt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de hibridación específica del género Listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgagaccct taccgtag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda de hibridación específica para la especie Listeria monocytogenes 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctatttaac cccagacg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
409 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
410 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
411 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Helicobacter pylori 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\hskip0,8cm
412 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\hskip0,8cm
413 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria seeligeri (NCTC 11856)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\hskip0,8cm
414 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\hskip0,8cm
415 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Listeria ivanovii (NCTC 11846)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\hskip0,8cm
416 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium africanum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\hskip0,8cm
417 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium africanum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\hskip0,8cm
418 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium gordonae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\hskip0,8cm
419 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium gordonae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\hskip0,8cm
420 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium kansasii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
421 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium kansasii 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\hskip0,8cm
422 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium chelonae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\hskip0,8cm
423 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium chelonae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
424 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium szulgai 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
425 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium szulgai 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
426 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium malmoense 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\hskip0,8cm
427 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium malmoense 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\hskip0,8cm
428 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium flavescens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\hskip0,8cm
429 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium flavescens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\hskip0,8cm
430 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium marinum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\hskip0,8cm
431 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium marinum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\hskip0,8cm
432 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium microti 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\hskip0,8cm
433 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 319
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium microti 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\hskip0,8cm
434 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium smegmatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\hskip0,8cm
435 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium smegmatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\hskip0,8cm
436 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium xenopi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\hskip0,8cm
437 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium xenopi 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\hskip0,8cm
438 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> AND
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium intracellulare 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\hskip0,8cm
439 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium intracellulare 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\hskip0,8cm
440 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium scrofulaceum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\hskip0,8cm
441 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 320
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mycobacterium scrofulaceum 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\hskip0,8cm
442 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardia asteroides 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\hskip0,8cm
443 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 325
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Nocardia asteroides 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\hskip0,8cm
444 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enteritidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\hskip0,8cm
445 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 314
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Salmonella enteritidis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\hskip0,8cm
446 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
447 
\hskip0,9cm
448 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 313
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Staphylococcus epidermidis (NCTC 11047)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
449 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
450 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 302
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus agalactiae (NCTC 8181)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
451 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Sonda específica del género Salmonella
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgaatcaggc tagtctggta g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda oligonucleotídica para la detección del complejo de la tuberculosis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actcctcggg acarccacag cga 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M. avium y M. paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgcaaata gataagcgcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sondas oligonucleotídicas para la detección de secuencias de M. avium y M. paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccgtcagcc cgggaacgcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de células de Listeria.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttttgttttt ctttgcca 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: sonda oligonucleotídica usada en la determinación de la integridad del ARNtm después del tratamiento de exterminio térmico de células de Escherichia coli 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agttttcgtc gtttgcga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador oligonucleotídico degenerativo para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggcaashg accaccgtaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: Cebadores oligonucleotídicos degenerativos para la amplificación de todas las secuencias micobacterianas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggatctccyg rtcwcrcgra 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la amplificación de las secuencias de M. avium y M. paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgccggtgca ggcaactg 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la amplificación de las secuencias de M. avium y M. paratuberculosis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacgcgaaca agccagga 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador oligonucleotídico para la detección de las secuencias del gen ssrA de Listeria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cattaaactt tagcaaggaa gtg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (23)

1. El uso del gen ssrA o un fragmento del mismo constituido al menos por 10 nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo in vitro procariota o eucariota.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de alta homología del extremo 5' de la molécula de ADN se usa como una región diana universal.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de alta homología del extremo 3' de la molécula de ADN se usa como una región diana universal.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para diferenciar entre especies.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un fragmento de la molécula del gen ssrA correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana para la generación de una sonda específica de un
género.
6. El uso de ARNtm, de un transcrito de ARN del gen ssrA, o de un fragmento del mismo constituido al menos por diez nucleótidos como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para la detección e identificación de un organismo procariota o eucariota.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología del extremo 5' de la molécula de ARNtm se utiliza como una región diana universal.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de alta homología en el extremo 3' de la molécula de ARNtm se utiliza como una región diana universal.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda para diferenciar entre especies.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que un fragmento de una molécula de ARNtm correspondiente a una región de baja homología se usa como una región diana para la generación de una sonda específica de un género.
11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fragmento del gen ssrA o dicho fragmento de ARNtm se usa como base de un cebador para usar en un procedimiento de amplificación.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el producto del procedimiento de amplificación se usa como región diana en un ensayo de ácidos nucleicos por sonda.
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 - 12, en el que un transcrito de ADNc de una molécula de ARNtm se utiliza como una sonda en un ensayo de hibridación de ácidos nucleicos.
14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como base de un ensayo para diferenciar organismos procariotas o eucariotas, vivos y muertos.
15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa en un formato de sondas múltiples para la detección y/o identificación a gran escala de organismos procariotas o eucariotas.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en el que una sonda del gen ssrA o una sonda de un transcrito de ARNtm está unida a un sistema de microplaca de genes de micromatriz para la detección e identificación a gran escala a alto rendimiento de organismos procariotas o eucariotas.
17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región diana se usa como una sonda en un ensayo para detectar organismos procariotas o eucariotas en una muestra de materia.
18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que un fragmento del gen ssrA o del transcrito de ARNtm se usa en un ensayo para obtener un perfil de ADN de un sistema procariota o eucariota y, por lo tanto, diferenciar entre cepas de la misma especie.
19. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que gen ssrA, el transcrito de ARNtm o una secuencia de ADN complementaria de este, o un fragmento del mismo, se usa para diseñar un agente dirigido contra organismos infecciosos procariotas o eucariotas para propósitos terapéuticos.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la región diana se usa para controlar la eficacia de las terapias con fármacos contra agentes infecciosos.
21. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la región diana se usa para controlar la viabilidad y el nivel de organismos beneficiosos para la salud en el tracto gastrointestinal.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el ensayo se usa para la cuantificación de organismos procariotas o eucariotas.
23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 11-13, en el que, para identificar un organismo procariota o eucariota, se usa una base de datos de las secuencias del gen ssrA.
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