ES2345328T3

ES2345328T3 - Columna sol-gel fotopolimerizada de fase unida y metodos asociados.

Info

Publication number: ES2345328T3
Application number: ES02768529T
Authority: ES
Inventors: Richard N. Zare; Maria T. Dulay; Joselito P. Quirino; Bryson D. Bennett
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2001-08-13
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2010-09-21
Anticipated expiration: 2022-08-13
Also published as: US20030062309A1; ATE465795T1; US6884346B2; US6866785B2; ATE432117T1; AU2002326633A1; DE60236165D1; US20030062308A1; DE60232468D1

Abstract

Una columna de separación que comprende: un canal de separación y un medio de separación en el canal y que comprende una matriz porosa, matriz que tiene un soporte y una fase estacionaria, incluyendo el soporte un fotopolímero orgánico de metal e incluyendo la fase estacionaria una fase unida mediante enlaces covalentes a partículas de soporte o una pared interna de la columna.

Description

Columna sol-gel fotopolimerizada de fase unida y métodos asociados.

La invención se refiere en general a una columna de separación y, en particular, a una columna sol-gel fotopolimerizada de fase unida.

Se ha considerado que la electrocromatografía capilar (CEC, por sus siglas en inglés) es una técnica de separación analítica muy prometedora que combina la eficacia de la electroforesis capilar de zona (CZE, por sus siglas en inglés) con la selectividad de la cromatografía líquida. Aunque la CEC se ha aplicado en muchas áreas diferentes, la preparación de columnas empaquetadas y la baja sensibilidad de detección siguen siendo retos de esta técnica. Las columnas capilares que contienen pequeños empaquetamientos de sílice han sido los pilares principales de la CEC. Una desventaja de las columnas empaquetadas es la fabricación de fritas porosas de tamaños de poro, longitudes y altas estabilidades mecánicas, controladas. En respuesta a los problemas de fabricación de fritas, se están desarrollando columnas capilares tubulares abiertas funcionalizadas superficialmente y capilares monolíticos como variantes de columnas capilares empaquetadas. Las columnas capilares monolíticas han recibido mucha atención debido a las ventajas ofrecidas en el control de la permeabilidad y la carga superficial.

Un reto mayor en las técnicas CEC es la detección de muestras que contienen analitos a bajas concentraciones. La ausencia de sensibilidad a baja concentración proviene del pequeño volumen de muestra y la pequeña longitud de paso óptico para la detección on-line. Con frecuencia son necesarios esquemas de preparación de las muestras dedicados que enriquezcan los analitos diana antes de la inyección de la muestra para obtener la sensibilidad necesaria para muchos analizadores en la realidad. Esquemas tales como extracción disolvente-disolvente y extracción en fase sólida son con frecuencia bastante tediosos y exigen mucho tiempo.

Una alternativa a estos esquemas es la preconcentración on-line. En cromatografía de gases, este objetivo se satisface haciendo pasar una corriente gaseosa por una columna fría que se calienta con posterioridad. En cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés), este procedimiento se realiza normalmente por HPLC con gradiente en que los analitos se reconvierten en la columna mucho más enérgicamente para el primer disolvente que para los sucesivos. La preconcentración on-line también ha disfrutado de algún éxito en separaciones electroforéticas. Por ejemplo, en electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés), éstas incluyen isotacoforesis, apilamiento de muestra, barrido y el uso de una unión dinámica de pH. En CZE, F. E. P. Mikkers, F. M. Everaerts, P. E. M. Verheggen, J. Chromatogr. 169 (1.979), págs. 1-10 y R. L. Chien, D. S. Burgi, Anal. Chem. 64 (1.992) págs. 489A-496A demostraron que los cambios de resistencia por campo eléctrico entre las zonas de disolución de la muestra y el fondo se pueden concentrar en especies cargadas (es decir, pila). En cromatografía electrocinética, J. P. Quirino, S. Terabe, Science, 282 (1.998) págs. 465-68 y J. P. Quirino, S. Terabe, Anal. Chem. 71(8) (1.999) págs. 1.638-44 han demostrado que las micelas pueden actuar concentrando especies neutras y cargadas (es decir,
barrido).

En CEC se ha indicado el uso de columnas empaquetadas con partículas (por ej., octadecil-sílices, que concentran efectos similares a los de la cromatografía líquida de alta resolución con gradiente. Estos efectos analizados se consiguieron usando: (1) elución con gradiente por etapas, (2) preparación de la muestra en un disolvente no eluyente o (3) inyección de un tapón de agua después de la inyección de la muestra. En M. R. Taylor, P. Teale, D. Westwood, D. Perrett, Anal. Chem. 69 (1.997) págs. 2.554-58 los inventores fueron los primeros en indicar el uso de un gradiente por etapas para la preconcentración de muestras esteroideas en 1.997. En D. A. Stead, R. G. Reid, R. B. Taylor, J. Chromatogr. A 798 (1.998) págs. 259-67 los inventores consiguieron un aumento de 17 veces la sensibilidad de detección de una mezcla de esteroides por preconcentración usando una matriz de muestra no eluyente. Y. Zhang, J. Zhu, L. Zhang, W. Zhang, Anal. Chem. 72 (2.000) págs. 5.744-47 también usaron un disolvente no eluyente para la preconcentración de benzoína y mefenitoína por un factor de 134 y 219, respectivamente. En C. M. Yang, Z. El Rassi, Electrophoresis 20 (1.999) págs. 2.337-42 los inventores indicaron la preconcentración de una muestra dilatada de pesticidas usando un pequeño tapón de agua inyectado después de un tapón grande de muestra. En M. J. Hilhorst, G. W. Somsen, G. J. de Jong, Chromatographia 53 (2.001) págs. 190-96 los inventores demostraron la preconcentración de esteroides estructuralmente relacionados usando una matriz no eluyente y elución con gradiente por etapas. Se indicó una ganancia en sensibilidad de 7 a 9 veces. De manera similar, en T. Tegeler, Z. El Rassi, Anal. Chem. 73(14) (2.001) págs. 3.365-72 los inventores indicaron recientemente la preconcentración de analitos en una mezcla de insecticidas de carbamato usando una combinación de una matriz no eluyente y elución con gradiente por etapas. La máxima longitud del tapón de muestra permisible fue 20 cm y se consigue un aumento en la sensibilidad de 500 veces para carbofurano. Zhang y colaboradores consiguieron un aumento adicional en la sensibilidad de detección mediante la combinación de inyección de muestra que aumenta el campo con elución con gradiente de disolvente. Demostraron un aumento de 17.000 veces en la altura de pico para un analito cargado positivamente,
propateneno.

Es deseable proporcionar una columna de separación con características mejoradas y que sea fácil de hacer.

Según la invención una columna de separación comprende un canal de separación y un medio de separación en el canal. El medio comprende una matriz porosa y la matriz porosa tiene un soporte y una fase estacionaria. El soporte incluye un polímero orgánico de metal y la fase estacionaria incluye una fase unida mediante enlaces covalentes a partículas de soporte o una pared interior del canal. El polímero puede ser un fotopolímero. En la realización preferida, la matriz porosa no contiene partículas cromatográficas. La matriz porosa se puede usar para preconcentrar y separar analitos sin partículas cromatográficas. La columna de separación permite la concentración y separación de mayores volúmenes de analito que una columna de separación con partículas cromatográficas.

La invención también se dirige a un método para preparar un testigo. En el método se proporciona una columna de separación y se introduce una mezcla fotopolimerizable en la columna de separación. La mezcla incluye al menos un compuesto orgánico de metal. La mezcla se irradia para formar una matriz porosa, sólida, por polimerización fotoiniciada, formado de ese modo un soporte en la columna. Se introduce un reactivo de acoplamiento en la columna y se forma de ese modo una matriz porosa de fase unida en la columna. En la realización preferida, la matriz porosa es sin fritas y no contiene partículas cromatográficas. La preparación de un medio de separación sin fritas sin partículas cromatográficas es más simple que preparar un medio de separación con una frita o partículas cromatográficas. La matriz porosa se puede usar para preconcentrar y separar analitos.

La ruta fotoquímica para la preparación de la matriz porosa presenta muchas ventajas: (1) corto tiempo de preparación, (2) control del tamaño de poro, (3) control sobre la disposición y longitud de la matriz porosa, (4) alta resistencia mecánica y (5) evitación de altas temperaturas que lleven a agrietamiento. Una ventaja de una fase unida es la capacidad para cambiar una serie de condiciones en separaciones cromatográficas.

Se proporciona un método de separación de una muestra de analitos. Se proporciona en la columna de separación incluyendo un canal de separación y un medio de separación en el canal. El medio comprende una matriz porosa y comprendiendo la matriz porosa un soporte y una fase estacionaria. El soporte incluye un polímero orgánico de metal, tal como un fotopolímero y la fase estacionaria incluye una fase unida mediante enlaces covalentes a partículas de soporte o una pared interior de la columna. En la realización preferida, la matriz porosa no contiene partículas cromatográficas. Se introduce una muestra de analitos soportada en una disolución por la columna. El medio concentra los analitos en la columna. Se hace que una disolución fluya por la columna, separando y eluyendo de ese modo los analitos. El medio preconcentra y separa los analitos. Además del efecto ejercido por el medio, se puede aumentar además la preconcentración mediante un gradiente de disolventes o apilamiento de muestra.

Las características anteriores y otras características y aspectos de la presente invención serán más evidentes a partir de la lectura de la siguiente descripción detallada de realizaciones de las mismas, junto con los dibujos adjuntos, en que:

La Fig. 1 es una vista longitudinal esquemática de una columna de separación, según una realización de la presente invención;

Las Figs. 2A y 2B son dos electrocromatogramas representativos que muestran una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención para (a) una columna y (b) otra columna, usando realizaciones de la presente invención;

La Fig. 3 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

Las Figs. 4A y 4B son micrografías SEM de realizaciones de la presente invención;

Las Figs. 5A y 5B son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención para diferentes analitos usando realizaciones de la presente invención;

La Fig. 6 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 7 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 8 (cuadros a, b y c) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 9 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 10 es una representación gráfica que muestra una representación gráfica del logaritmo de la relación de altura de pico frente al porcentaje de agua en una muestra usando una realización de la presente invención;

La Fig. 11 (cuadros a, b y c) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

Las Figs. 12A, 12B y 12C son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 13 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 14 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 15 (cuadros a, b, c, d, e y f) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 16 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 17 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

Las Figs. 18A y 18B son micrografías SEM de realizaciones de la presente invención;

La Fig. 19 (cuadros a, b, c, d, e y f) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando realizaciones de la presente invención;

La Fig. 20 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 21 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención;

La Fig. 22 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención y

La Fig. 23 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención.

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Para simplicidad de descripción, como símbolos de referencia se usan para similar o partes similares en esta solicitud.

La Fig. 1 es una vista en sección transversal longitudinal de una columna de separación, según una realización de la presente invención. La columna 11 de separación incluye un canal 13 de separación en el tubo 12 y un medio 15 de separación en el canal 13. La columna 11 de separación puede ser un capilar o un fragmento plano y el canal 13 de separación puede incluir una ventana de detección. El medio 15 de separación cubre al menos una sección del canal 13. El medio 15 es homogéneo y preferiblemente no tiene fritas o partículas cromatográficas. El medio 15 puede estar unido a una pared 17 del canal del canal 13. Preferiblemente, el medio 15 puede estar unido mediante enlaces covalentes a la pared 17 del canal.

El tubo 12 puede tener muchas secciones transversales diferentes, tales como una sección transversal circular. Alternativamente, el tubo 12 puede tener una sección transversal alargada. Estas y otras secciones transversales son posibles para el tubo 12 y están dentro del alcance de la invención. El tubo 12 puede ser un capilar redondo hecho típicamente de sílice fundida. El diámetro interno (d. i.) del capilar puede ser de aproximadamente 14 \mum a aproximadamente 1.000 \mum, preferiblemente de aproximadamente 75 \mum a aproximadamente 500 \mum. El tubo 12 puede ser un fragmento plano o un espacio confinado, tal como una columna confinada por dos láminas.

El medio 15 incluye matriz porosa y la matriz porosa incluye un soporte y una fase estacionaria. El soporte incluye un polímero orgánico de metal, tal como un fotopolímero y la fase estacionaria incluye una fase unida. Un precursor del polímero puede ser un alcóxido de metal, tal como un silano. El metal puede ser aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tántalo, estaño, titanio, vanadio, cinc o circonio. El precursor puede incluir un grupo fotoactivo, tal como metacrilato. En una realización, el precursor puede ser metacrilato de trimetoxisilipropilo, también conocido como metacriloxipropiltrimetoxisilano.

Se pueden usar monómeros funcionalizados o derivatizados diferentes para preparar una matriz porosa con diferentes propiedades físicas, tales como tamaño de poro, densidad de carga del polímero e hidrofobicidad. El control de las formas y tamaños de poro por el uso de diferentes porógenos puede dar como resultado una matriz porosa con una amplia distribución de tamaños de poro (es decir, gradiente de tamaño de poro). Una matriz porosa con un gradiente de tamaño de poro puede funcionar como "clasificador de moléculas" en electroforesis capilar y electrocromatografía capilar. La matriz porosa puede separar una mezcla de moléculas grandes cuyas estructuras de tamaño o químicas (por ej., fragmentos de ADN) pueden diferir. Además, las columna 11 de separación se pueden diseñar para cromatografías de fase inversa, de exclusión por tamaños, de afinidad, de intercambio iónico, etc.

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Una matriz porosa puede ser una matriz porosa de fase mixta preparada a partir de una mezcla de monómeros. Por ejemplo, los monómeros pueden incluir metacriloxipropiltrimetoxisilano, bis(trietoxisilil)etano y bis(trietoxisilil)octano. La matriz porosa de fase mixta puede presentar diferentes propiedades, tales como hidrofobicidad.

También se pueden cambiar las propiedades de la matriz porosa por el uso de una fase unida. Una fase unida es una fase estacionaria que está unida mediante enlaces covalentes a las partículas de soporte o la pared interior de los tubos de la columna. Por ejemplo, la fase unida puede incluir un grupo funcional unido a una superficie del polímero orgánico de metal. El grupo funcional puede ser cualquier grupo funcional, tal como un grupo hidrófobo o hidrófilo, un grupo cargado o no cargado o un grupo orgánico o inorgánico. El grupo funcional puede modificar las propiedades de la matriz porosa, tal como la hidrofobicidad, la carga, el factor de retención, el tipo de interacción o la quiralidad de la matriz porosa. Se puede usar la matriz porosa de fase unida en cromatografía de fase normal, fase inversa, intercambio iónico, afinidad, interacción hidrófoba, exclusión por tamaños o quiral.

Una fase unida puede aumentar la resolución de una separación de analitos y puede desactivar en cierto grado la superficie del polímero. La desactivación disminuye la actividad superficial causada por la carga negativa existente a partir de la ionización de los grupos hidroxilo libres. La matriz porosa de fase unida puede soportar después flujo electroosmótico (EOF, por sus siglas en inglés) en la columna.

La matriz porosa de fase unida presenta una afinidad por los analitos y se puede usar para preconcentrar y separar una muestra de analitos. La afinidad por un analito se puede describir por el factor de retención, k, del analito. El factor de retención, k, es igual a

1

El factor de retención, k, también puede expresarse como

2

donde t_{R} es el tiempo de migración del analito y t_{O} es el tiempo de migración de un analito "no retenido". El factor de retención se ve afectado por la naturaleza del disolvente, la naturaleza del analito, la longitud de la columna, la permeabilidad de la matriz porosa, la hidrofobicidad de la matriz porosa, el grupo funcional unido al polímero orgánico de metal y la morfología detallada de la matriz porosa.

La columna 11 de separación puede usarse para trabajo analítico o semipreparativo. La separación de analitos en las cantidades de submiligramo a miligramo puede llegar a ser posible con preconcentración en columnas 11 de separación. Por ejemplo, se pueden inyectar más de aproximadamente 100 nl de la disolución de muestra en concentraciones de analito en los niveles de mM, en la columna, sin evidencia significativa de sobrecarga.

Se proporciona un método para preparar un testigo en la columna 11 de separación. Se proporciona una columna de separación. La columna de separación puede ser un capilar redondo hecho típicamente de sílice fundida. El diámetro interno (d. i.) del capilar puede ser de aproximadamente 10 \mum a aproximadamente 1.000 \mum, preferiblemente de aproximadamente 75 \mum a aproximadamente 500 \mum.

Se introduce una mezcla que incluye un compuesto orgánico de metal en la columna de separación. La mezcla forma una matriz porosa, sólida, mediante polimerización fotoiniciada. La mezcla puede comprender un monómero orgánico de metal, un porógeno y un fotoiniciador. El monómero orgánico de metal puede ser un alcóxido de metal, tal como un silano o una mezcla de alcóxidos de metal. El metal puede ser aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tántalo, estaño, titanio, vanadio, cinc o circonio. El alcóxido de metal puede incluir un grupo fotoactivo, tal como metacrilato. En una realización, el precursor puede ser metacrilato de trimetoxisilipropilo, también conocido como metacriloxipropiltrimetoxisilano. En otra realización, el precursor puede ser una mezcla de metacriloxipropiltrimetoxisilano y otro precursor, tal como bis(trietoxisilil)etano o bis(trietoxisilil)octano.

Se puede añadir el monómero orgánico de metal a un catalizador ácido o básico para la hidrólisis del precursor. El catalizador convierte los grupos alcoxi en grupos hidroxilo. Por ejemplo, un silano puede experimentar la siguiente reacción de hidrólisis para formar un silano totalmente hidrolizado:

(3)Si(OR)_{4} + 4 H_{2}O \rightarrow Si(OH)_{4} + 4ROH

La reacción de hidrólisis puede detenerse en un silano parcialmente hidrolizado, Si(OR)_{4-n}(OH)_{n}. El monómero orgánico de metal y el catalizador se pueden agitar desde aproximadamente cero minutos a aproximadamente veinticuatro horas.

Se puede mezclar un porógeno o una mezcla de porógenos con el monómero orgánico de metal y el catalizador y se puede agitar la mezcla durante aproximadamente cero minutos a aproximadamente veinticuatro horas. Durante este tiempo, el monómero orgánico de metal puede experimentar una reacción de condensación para formar dímeros, trímeros y otros oligómeros. Por ejemplo, un silano parcialmente hidrolizado puede experimentar la siguiente reacción de condensación:

(4)2(RO)_{3}SiOH \rightarrow (RO)_{3}Si-O-Si(OR)_{3} + H_{2}O

Se pueden formar oligómeros más grandes aumentando la temperatura de la reacción.

El porógeno proporciona un patrón molecular para formar poros en la matriz. Por ejemplo, el porógeno puede ser un disolvente, tal como tolueno o una mezcla 1:1 de hexano y tolueno, un polímero o una sal inorgánica, tal como polvo de cloruro de sodio o sulfato de sodio. El porógeno polimérico puede ser poli(metacrilato de metilo) o poliestireno, como indica D. Horak, J. Labsky, J. Pilar, M. Bleha, Z. Pelzbauer, F. Svec, Polymer 34(16) (1.993) págs. 3.481-89. El porógeno se puede seleccionar de manera controlable para formar poros en la matriz 15. La porosidad de la matriz se puede controlar por el tipo de compuesto químico (es decir, porógeno) usado y su volumen o concentración en la disolución de la reacción. Por ejemplo, se puede seleccionar una relación molar o en volumen de monómero a porógeno para formar poros en la mezcla. Ajustando la relación molar del monómero y porógeno, se pueden controlar las propiedades físicas (por ej., tamaños de poro) de la matriz.

El fotoiniciador o un grupo fotoactivo, tal como metacrilato, en el monómero absorbe luz para catalizar la polimerización del compuesto orgánico de metal. En una realización, el fotoiniciador puede ser Irgacure 1800, disponible en Ciba Geigy, Tarrytown, Nueva York.

Si la columna de separación tiene un recubrimiento externo que no es transparente a la fuente de luz, el recubrimiento se retira primero para hacer una ventana de irradiación. La longitud del recubrimiento determinará la longitud de la matriz porosa formada en la columna de separación.

La mezcla se introduce en la columna de separación. Por ejemplo, se puede hacer fluir la mezcla por la columna de separación usando una jeringa. Se pueden sellar los extremos de la columna de separación.

La mezcla se irradia, formándose de ese modo un medio de separación homogéneo en la columna de separación. Por ejemplo, la columna de separación se puede exponer a radiación durante un corto periodo de tiempo, tal como aproximadamente cinco minutos. La longitud de onda de la radiación depende del tipo de fotoiniciador o grupo fotoactivo usado en la reacción. La radiación puede incluir luz visible o ultravioleta. Por ejemplo, se puede usar radiación de 365 nm para el fotoiniciador Irgacure 1800. Se puede fotopolimerizar el grupo fotoactivo metacrilato a una longitud de onda de 300 nm o 365 nm, como indica C. Yu, F. Svec, J. M. J. Frechet, Electrophoresis 21(1) (2.000) págs. 120-27 y H.-G. Woo, L.-Y. Hong, S.-Y. Kim, S.-H. Park, S.-J. Song, H.-S. Ham, Bull. Korean Chem. Soc. 16 (1.995) págs. 1.056-59, respectivamente.

Una reacción fotoquímica tiene lugar cuando se expone la mezcla a radiación. El fotoiniciador o grupo fotoactivo en el monómero absorbe la luz para catalizar la polimerización del compuesto orgánico de metal.

La ruta fotoquímica a la preparación de una matriz porosa presenta muchas ventajas: (1) corto tiempo de preparación, (2) control del tamaño de poro, (3) control de la disposición y longitud de la matriz porosa, (4) alta resistencia mecánica y (5) evitación de altas temperaturas que lleven al agrietamiento.

El medio de separación preferiblemente no tiene fritas o partículas cromatográficas, así que la preparación del medio de separación es más fácil de lo que es la preparación de un medio de separación convencional con fritas o partículas cromatográficas.

Opcionalmente, se puede introducir un disolvente orgánico en la columna de separación. Por ejemplo, el disolvente orgánico puede ser etanol. Se puede limpiar la matriz porosa por lavado de cualquier material no reaccionado, el porógeno y el fotoiniciador usando un disolvente orgánico. Se puede hacer fluir el disolvente por la columna de separación usando una jeringa u otro medio.

Se introduce un reactivo de acoplamiento en la columna para formar una matriz porosa de fase unida. El reactivo de acoplamiento puede presentar monofuncionalidad, difuncionalidad o trifuncionalidad. El reactivo de acoplamiento puede ser un reactivo de acoplamiento orgánico, tal como un aromático halogenado o un haluro de acilo. Por ejemplo, el cianuro de sodio y cloruro de amonio pueden reaccionar con una cetona sobre el polímero orgánico de metal o un compuesto aromático halogenado o un haluro de acilo pueden experimentar una reacción de condensación. El reactivo de acoplamiento puede incluir un grupo funcional y un metal. El metal puede ser aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tántalo, estaño, titanio, vanadio, cinc y circonio. Por ejemplo, un reactivo de acoplamiento de silano puede ser un organoclorosilano, un organoalcoxisilano, un organoaminosilano u otros silanos reactivos. El reactivo de acoplamiento de silano se puede usar para derivatizar un grupo hidroxilo superficial del polímero orgánico de metal con un grupo funcional. Por ejemplo, el polímero orgánico de metal y un reactivo de acoplamiento de silano, tal como un organoclorosilano, incluyendo un grupo funcional, R', puede experimentar la siguiente reacción para formar una matriz porosa de fase unida:

(5)(RO)_{3}Si-O-Si(OR)_{2}(OH) + SiCl R' \rightarrow (RO)_{3}Si-O-Si(OR)_{2}-O-Si R' + HCl

No se requiere que se aumente la temperatura para aumentar la velocidad de reacción; se puede realizar la reacción a temperatura ambiente. El tiempo para la reacción varía, dependiendo del grupo funcional. Por ejemplo, el tiempo de reacción aumentado puede dar como resultado la desaparición de fases para grupos funcionales más grandes. La desaparición de fases puede tener lugar cuando los grupos funcionales se encuentren demasiado próximos entre sí y se apantallan entre sí, disminuyendo de ese modo el número de grupos activos en la superficie.

Opcionalmente, se puede introducir un disolvente orgánico en la columna incluyendo la matriz porosa de fase unida. Por ejemplo, el disolvente orgánico puede ser tolueno, piridinio o trietilamina. Todo reactivo de acoplamiento de silano no reaccionado y subproductos de la reacción, tales como ácido clorhídrico o un alcohol, se pueden retirar de la matriz porosa de fase unida introduciendo el disolvente orgánico en la columna. Se puede hacer fluir el disolvente por la columna de separación usando una jeringa u otro medio.

Se puede acondicionar la columna de separación con una disolución de separación antes de usar la columna para separación. Una disolución de separación puede comprender un tampón, tal como acetato de amonio acuoso y un disolvente de elución, tal como acetonitrilo.

Se proporciona un método para separar una muestra de analitos. Se introduce una muestra de analitos en una disolución de muestra por una columna 11 de separación. Los analitos incluyen especies neutras, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos, alquilbencenos, alquil fenil cetonas y esteroides y especies cargadas, tales como péptidos. La disolución de la muestra puede comprender un tampón, tal como acetato de amonio acuoso y un disolvente de elución, tal como acetonitrilo.

La columna 11 de separación incluye un canal 13 de separación y un medio 15 de separación homogéneo en el canal 13. La columna 11 de separación puede ser un capilar o estructura plana. El medio 15 de separación preferiblemente no tiene fritas o partículas cromatográficas. El uso de un medio de separación homogéneo es ventajoso debido a que, en algunas aplicaciones, el uso de partículas cromatográficas (es decir, fase de separación no homogénea) introduce un ensanchamiento no deseado (es decir, falta de resolución). El medio 15 de separación puede incluir posiblemente dos secciones que contengan sustancialmente la misma fase estacionaria, homogénea, porosa y se pueden separar las dos secciones mediante otra sección, tal como un testigo con un tamaño de poro o carga superficial diferente. Preferiblemente, el medio 15 de separación es continuo.

El medio 15 de separación incluye una matriz porosa y la matriz porosa incluye un soporte y una fase estacionaria. El soporte incluye un fotopolímero orgánico de metal y la fase estacionaria incluye una fase unida. El medio 15 de separación concentra los analitos en la columna. La muestra se puede introducir aplicando una presión o un voltaje a la columna 11. Por ejemplo, la presión puede ser 3,4 kPa o 138 kPa (0,5 psi o 20 psi) durante un periodo de tiempo, tal como dos a 1.920 segundos o se puede aplicar una resistencia al campo de aproximadamente 40 V/cm durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, se puede inyectar una longitud del tapón de inyección mayor que aproximadamente dos centímetros en la columna 11.

El analito se concentra por la columna 11. La extensión de la preconcentración depende puramente del factor de retención, el valor k. El factor de retención se ve afectado por la naturaleza del disolvente, la naturaleza del analito y la morfología detallada del medio de separación. Además, el caudal apenas influyó en la extensión de la preconcentración.

La naturaleza altamente porosa de la matriz porosa da como resultado una alta velocidad de transferencia de masas para el analito, que facilita el efecto de preconcentración. Las altas velocidades de transferencia de masas surgen de la accesibilidad mejorada de los analitos a los sitios de unión de la estructura porosa. Debido a las altas velocidades de transferencia de masas, las cinéticas de la interacción analito-matriz porosa (es decir, el reparto del analito entre las fases móvil y estacionaria) no es la etapa limitante de la velocidad en la separación. La alta velocidad de transferencia de masas distingue este método de separación de formas previas de separaciones cromatográficas. Con este método de separación, debido a la alta velocidad de transferencia de masas, es posible inyectar y concentrar volúmenes mayores de disolución de muestra que en columnas que contienen materiales cromatográficos normales.

El efecto de preconcentración total es directamente proporcional al factor de retención, conduciendo mayores longitudes del tapón de inyección (por ej., mayores que aproximadamente 25 mm) a extenso ensanchamiento de pico de los analitos con valores de k bajos. Este comportamiento implica una longitud máxima de tapón de muestra para cada analito antes de que llegue a estar comprometida la forma del pico. Se puede modificar el factor de retención cambiando la fase unida.

Una ventaja principal de la preconcentración on-line es que disminuye el límite de detección para un analito dado. Otra ventaja es que se puede usar la preconcentración para limpiar los analitos de posibles especies interferentes encontradas en la matriz de muestra.

Se hace que una disolución de separación fluya por la columna 11, separando y eluyendo de ese modo los analitos. Se puede hacer que la disolución de separación fluya mediante la aplicación de un voltaje o una presión a la columna 11. Por ejemplo, la presión puede ser 3,4 kPa o 138 kPa (0,5 psi o 20 psi) durante un periodo de tiempo, tal como dos a 1.920 segundos o se puede aplicar una resistencia al campo de 300 V/cm durante un periodo de tiempo. La disolución de separación puede comprender un tampón, tal como acetato de amonio acuoso y un disolvente de elución, tal como acetonitrilo. En una realización, la disolución de separación es la misma que la disolución de muestra.

La matriz porosa de fase unida actúa extrayendo los analitos de la disolución así como proporcionando la fase estacionaria para separación cromatográfica de los analitos. Es esta combinación extractor-separador lo que proporciona tal poder a este método. Por ejemplo, se pueden cargar tapones de disolución de muestra de más de aproximadamente dos centímetros, en el capilar y concentrar usando una disolución de separación que sea la misma que la disolución de muestra.

En una realización, los analitos se pueden separar realizando cromatografía de fase normal, de fase inversa, de intercambio iónico, de afinidad, de interacción hidrófoba, de exclusión por tamaños o quiral.

En otra realización, además del efecto ejercido por la matriz porosa, se puede usar un gradiente de disolventes para aumentar más la preconcentración de los analitos. En esta realización, se puede disolver la muestra en una disolución con una concentración mayor de un tampón (por ej., agua) que en la disolución de separación. La mayor concentración del tampón en la disolución de muestra aumenta la afinidad de la muestra a la fase estacionaria. Cuando se usa un gradiente de disolventes, la longitud del tapón puede ser mayor que la longitud de la columna. Por ejemplo, la inyección de un tapón de 91,2 cm, que era más de tres veces la longitud total del capilar, fue posible con sólo una pérdida minoritaria de resolución. Las mejoras en las alturas de pico obtenidas en condiciones de gradiente pueden ser mayores que cien veces.

Para analitos neutros, existen dos propuestas para el uso de gradientes en la matriz porosa. La primera propuesta es aumentar la relación de disolvente orgánico entre la disolución de separación y la disolución de muestra. La segunda propuesta es aumentar el factor de retención k en la separación por aumento del porcentaje de agua en la disolución de separación mientras se mantiene un porcentaje razonable de disolvente orgánico entre la disolución de separación y la disolución de muestra. El análisis es más rápido con la primera propuesta, mientras la resolución es mejor con la segunda.

En otra realización de la presente invención, además del efecto ejercido por la matriz porosa, se puede usar apilamiento de muestra para aumentar más la preconcentración de los analitos. El apilamiento de la muestra la concentración de analitos cargados cuando los analitos pasan el límite de concentración que separa las regiones de alta y baja resistencia al campo eléctrico. La zona de campo eléctrico alto es una disolución de la muestra de menor conductividad que contiene más del disolvente de elución, mientras que la región de campo eléctrico bajo es una disolución de separación de mayor conductividad. El disolvente de elución, tal como acetonitrilo, presenta una conductividad menor que el tampón, tal como acetato de amonio acuoso. Así, una concentración mayor del disolvente de elución da como resultado una disminución de la conductividad de la matriz de muestra.

La columna de separación se prepara con la disolución de separación. Cuando se introducen los analitos en la columna de separación y se aplica un voltaje, los analitos en la disolución de muestra en la entrada de la columna se aceleran rápidamente hacia la disolución de separación (menor resistencia al campo eléctrico) ya en la columna, donde al cruzar el límite entre la disolución de muestra y la disolución de separación, se retardan y se apilan en zonas estrechas en la interfase.

El apilamiento de muestra se produce básicamente por el cambio en la velocidad electroforética en el límite de concentración. La velocidad electroforética es el producto de la movilidad electroforética y la resistencia al campo eléctrico. La concentración tiene lugar (apilamiento de la muestra) cuando disminuye la velocidad electroforética en el límite de concentración. También se explica el apilamiento de muestra usando los fundamentos de la isotacoforesis y las reglas de Kohlrausch.

Hay dos propuestas para realizar apilamiento de muestra en una matriz porosa. La primera propuesta es aumentar el porcentaje de disolvente orgánico, tal como acetonitrilo. La segunda es disminuir la concentración del componente tampón en la disolución de muestra. Aumentar el porcentaje de acetonitrilo u otro disolvente orgánico adecuado es especialmente útil para muestras reales que contengan alta concentración de sales. Desalar, por ejemplo por diálisis, no es por lo tanto necesario hacer una disolución de menor conductividad para inyección. El uso de disolventes orgánicos también es útil para muestras biológicas cuando la desproteinización es parte de la preparación de la muestra.

La invención se describe con más detalle mediante los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se presentan exclusivamente con el fin de ilustrar y describir más la presente invención y no se debe interpretar que limiten la invención.

Ejemplo 1

Materiales y Productos químicos. Se adquirieron capilares de sílice fundida (75 \mum de d. i. x 365 \mum de d. e.) en Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona. Se adquirió metacriloxipropiltrimetoxisilano (MPTMS) en Gelest, Tullytown, Pennsilvania y Sigma-Aldrich, Milwaukee, Wisconsin y se usó sin purificación. Se adquirieron tolueno, fenantreno, pireno, alquilbencenos, alquil fenil cetonas y esteroides de grado HPLC en Sigma-Aldrich, Milwaukee, Wisconsin. Se recibió Irgacure 1800 de Ciba, Tanytown, Nueva York.

Instrumentación. Se usó un instrumento de electroforesis capilar P/ACE 2.000 de Beckman con un detector de absorbancia UV para realizar todos los experimentos CEC. Un reticulador UV XL-1500, disponible en Spectronics Corp., Westbury, Nueva York, equipado con seis tubos de lámpara ultravioleta de 15 W de predominantemente longitud de onda 365 nm para irradiar las disoluciones de reacción. Se realizaron análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) en un microscopio de barrido electrónico Philips SEM 505, disponible en Eindhoven, Países Bajos.

Procedimiento de Polimerización. Se preparó la disolución madre de monómero justo antes del uso por adición de 375 \mul de MPTMS a 100 \mul de HCl 0,12 N. Se agitó esta disolución a temperatura ambiente durante aproximadamente treinta minutos para proporcionar una disolución monofásica, clara. Se añadió una cantidad apropiada de tolueno (porógeno) a la disolución madre de monómero, como se muestra a continuación en la Tabla 1.

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TABLA 1

3

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El fotoiniciador, Irgacure 1800, se añadió primero al tolueno como el 5% del peso total de la tolueno/disolución madre de monómero. Esta disolución de fotoiniciador se añadió después a la cantidad correspondiente de disolución madre de monómero y se agitó durante treinta minutos temperatura ambiente para proporcionar una disolución monofásica, amarilla. Para minimizar la evaporación de tolueno, se preparó la disolución en un vial con una tapa de polisilicona por la que se insertó el capilar durante el llenado con la disolución.

Se retiró una tira de 15 cm del recubrimiento de poliimida en un capilar de 30 cm de largo usando una cuchilla dispuesta a 45º para la superficie capilar. La estabilidad mecánica del capilar fue destacadamente buena a pesar de la eliminación de una tira de recubrimiento de poliimida. La luz de irradiación entró en el capilar sólo por esta tira de 15 cm. No se formó testigo en el capilar donde permaneció intacto el recubrimiento de poliimida ("máscara").

Usando una jeringa desechable de 0,5 ml, se descargaron aproximadamente 0,2 ml de la disolución de reacción por el capilar para humedecer cuidadosamente la superficie de la pared antes de llenar el capilar con la disolución. Esto dio como resultado la unión del testigo a la pared del capilar. No fue necesario un pretratamiento especial de la pared del capilar para unir el testigo a la pared. Se irradiaron los capilares llenos (9 x 10^{5} mJ/cm^{2}) en un reticulador UV usando luz de 365 nm, durante cinco minutos, para formar la matriz porosa.

Después de irradiación, se lavaron los capilares con etanol usando una jeringa portátil para retirar los reactivos no reaccionados o porógenos. Debido a que los testigos eran altamente permeables, no se requirieron altas presiones para conducir líquido por los capilares. Una vez que se retiraron los reactivos no reaccionados, el testigo se volvió opaco y se pudo ver claramente por el capilar sin la ayuda de un microscopio. La homogeneidad de la matriz porosa se confirmó a un aumento X100. La separación por combustión del recubrimiento de poliimida inmediatamente después de la sección de testigo con ácido sulfúrico fumante hizo una ventana de detección.

Una vez fabricada, se instaló con éxito el capilar en el cartucho sin ningún daño. Se acondicionó el capilar con el tapón de separación durante aproximadamente cinco minutos usando una jeringa y un tornillo portátil. Una vez en el instrumento, se acondicionó más el capilar por enjuague a presión [138 kPa (20 psi)] con el tampón de separación o por acondicionamiento de manera electrocinética a 5 kV o 10 kV durante treinta minutos.

Caracterización. Se usó SEM para estudiar la morfología de la columna de separación. Se seccionó cuidadosamente un capilar para exponer el testigo. Los trozos seccionados de capilar se pulverizaron con oro previamente a los análisis SEM.

Separación de Analito. Los analitos se prepararon en la fase móvil para evitar efectos de gradiente durante los experimentos CEC. La fase móvil se preparó de diversas relaciones (v/v) de acetato de amonio 50 mM, agua y acetonitrilo. Se usó una nueva disolución de muestra para cada inyección para mantener la misma concentración de acetonitrilo en la disolución de muestra y la fase móvil.

La Fig. 2A es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención para la columna B. La separación se realizó con una disolución de acetato de amonio 50 mM/agua/acetronitrilo (1/3/6). La disolución de muestra se inyectó a una presión de 3,4 kPa (0,5 psi), durante tres segundos y se realizó la separación con un voltaje aplicado de 1 kV a una temperatura de 20ºC y se detectó a 214 nm. El orden de elución de la separación fue: (1) tiourea, (2) tetrahidrofurano, (3) naftaleno, (4) fenantreno, (5) fluoranteno, (6) pireno, (7) 1,2-benzantraceno y (8) 1,2,5,6-bienzantraceno.

La Fig. 2B es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención para la columna D. La separación se realizó con una disolución de acetato de amonio 50 mM/agua/acetronitrilo (1/4/5). La disolución de muestra se inyectó a una presión de 3,4 kPa (0,5 psi) durante tres segundos y se realizó la separación con un voltaje aplicado de 15 kV a una temperatura de 20ºC y se detectó a 200 nm. El orden de elución de la separación fue: (1) benceno, (2) tolueno, (3) etilenbenceno, (4) propilbenceno, (5) butilbenceno y (6) hexilbenceno.

El orden de elución de la columna fue similar al de la cromatografía de fase inversa con el peso molecular más grande o más analitos hidrófobos eluyendo más tarde que los analitos de menor peso molecular o más hidrófilos. La elución de los analitos en las dos figuras tuvo lugar en menos de siete minutos. La formación de burbujas no fue un problema durante los experimentos CEC, para los cuales las corrientes de funcionamiento típicas fueron entre 3 y
10 \muA.

Para una columna D capilar, típica, se consiguen eficacias de hasta 100.000 placas/m para tiourea, un compuesto menos retenido. Se observaron pequeñas variaciones en los tiempos de elución para tiourea [RSD (desviación estándar relativa, por sus siglas en inglés) 0,65%], naftaleno (RSD 1,10%), fenantreno (RSD 1,14%) y pireno (RSD 1,14%) durante un periodo de tres días (n=33).

La Fig. 3 es un electrocromatograma representativo que muestra una representación gráfica de absorbancia frente a tiempo de retención para la columna D. La separación se realizó con una disolución de acetato de amonio 50 mM/agua/acetronitrilo (1/3/6). La disolución de muestra se inyectó a una presión de 3,4 kPa (0,5 psi) durante tres segundos y se realizó la separación con un voltaje aplicado de 1 kV a una temperatura de 20ºC y se detectó a 214 nm. Se separó una muestra de tiourea, naftaleno, fenantreno y pireno en 110 minutos a una presión aplicada de sólo 138 kPa (20 psi) (el límite máximo del instrumento). La cola del pico más extensa fue para el pireno debido a su fuerte interacción con la matriz porosa y no se observó cola para la tiourea, que presenta poca retención en la columna.

La Fig. 4A es una micrografía de barrido electrónico de la sección transversal de un fotopolímero orgánico de metal formado con 80% (v/v) de tolueno (capilar B) en una columna capilar de 75 \mum de d. i. La micrografía mostró una red de interconexión de estructuras esféricas de 1 \mum por las cuales se intercalaron macroporos de tamaño micrómetro (tan grandes como 5 \mum).

La Fig. 4B es una micrografía de barrido electrónico de la sección transversal de un fotopolímero orgánico de metal formado con 50% (v/v) de tolueno en una columna capilar de 75 \mum de d. i. A diferencia de la matriz porosa mostrada en la Fig. 4A, la estructura mostrada en la Fig. 4B fue un fotopolímero denso con macroporos de 2 \mum o menos de diámetro. Por consiguiente, la matriz en la Fig. 4B era menos permeable y tuvo lugar una contrapresión significativa. No se pudo conducir líquido por la columna a presiones cerca de 1.380 kPa (200 psi).

Se determinó la permeabilidad de una matriz porosa por la velocidad lineal de la matriz porosa, que es proporcional a la permeabilidad como se describe en la ley de Darcy. La permeabilidad de una matriz porosa como función del tamaño de macroporo dependía mucho del volumen y el tipo de porógeno usado para preparar el fotopolímero. Para una columna hecha con 90% (v/v) de tolueno (columna A), la velocidad lineal es 12,3 cm/min y una columna del 80% (v/v) (columna B) tenía una velocidad lineal de 3,3 cm/min, mientras una columna hecha con 73% (v/v) de tolueno (columna D) tenía una velocidad lineal de 0,6 cm/min. Estos datos de velocidad lineal sugirieron que los macroporos disminuían al disminuir la concentración de porógeno. Este comportamiento fue consistente con lo que se indica en la bibliografía.

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Ejemplo 2

Se preparó la columna de separación como se describió en el Ejemplo 1. Se usó una mezcla de hexano/tolueno 1:1 para el porógeno. La columna de separación tenía una realización de separación similar a la de una columna de separación hecha con tolueno/disolución de reacción 80/20. Se obtuvo una eficacia de columna de 68.000 placas/m (RSD 7,0%, n=5) para la tiourea y una velocidad de flujo electroosmótico (EOF, por sus siglas en inglés) de
3,7 cm/min.

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Ejemplo 3

Se agitó una mezcla de 375 \mul de MPTMS y 100 \mul de ácido clorhídrico 0,12 M durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se combinaron 27 partes de esta mezcla con 73 partes de tolueno para proporcionar 200 \mul de la disolución final. Se añadió 5% en peso de la disolución final del fotoiniciador Irgacure 1.800 y se agitó la disolución sol-gel resultante durante cinco minutos antes de su uso. Se llenó un capilar de sílice fundida de 75 \mum de d. i. x 365 \mum de d. e. con la disolución sol-gel y se expuso la columna de separación a luz UV en un Spectrolinker XI-1500 a 365 nm para afectar a la fotopolimerización. La extensión de la polimerización de la matriz porosa se controló retirando una tira de 15 cm del recubrimiento de poliimida del capilar previamente a la irradiación durante cinco minutos. Se descargaron los reactivos no reaccionados con etanol. La longitud total del capilar fue 25,6 cm (18,8 cm desde la entrada a la ventana del detector). Se acondicionó la columna resultante con la disolución de separación previamente a su uso.

Todos los experimentos de electroforesis se realizaron con un Beckman P/ACE 2.000. Se termostatizaron los capilares a 20ºC. Se hicieron inyecciones usando presión (es decir, 3,4 kPa y 138 kPa (0,5 psi y 20 psi) o voltaje (1 kV a 10 kV) y se varió la duración de dos segundos a 1.920 segundos. La detección se hizo a 214 ó 254 nm. Se realizaron análisis de los datos con GRAMS/32 versión 4.02, disponible en Galactic Industries Corporation, Salem, New Hampshire.

Las Figs. 5A y 5B son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las figuras ilustran un aumento en la sensibilidad de detección con un aumento en la longitud del tapón inyectado en la separación CEC de una mezcla que contiene la molécula pequeña, tiourea, tres hidrocarburos aromáticos policíclicos (los PAH) y ocho alquil fenil cetonas. Para eliminar los efectos del gradiente de disolvente, se preparó la muestra en la disolución de separación. Las disoluciones de muestra y de separación fueron acetato de amonio 50 mM/agua/acetonitrilo (1/4/S). En la Fig. 5A, las longitudes de los tapones fueron 0,1 mm, 6,8 mm, 13,7 mm, 27,4 mm y 34,2 mm. La longitud del tapón de 0,1 mm fue para una presión aplicada de 3,4 kPa (0,5 psi), mientras todas las demás longitudes del tapón fueron para una presión aplicada de 138 kPa (20 psi). El voltaje aplicado para la separación fue 20 kV y se midió la absorbancia a 214 nm. El orden de elución de la columna fue: (I) tiourea 12,5 \muM, (2) naftaleno 51,0 \muM, (3) fenantreno 1,0 \muM y (4) pireno 123 \muM.

En la Fig. 5B, la columna se preparó de la misma manera que la columna como se describió antes, excepto que la columna se modificó posteriormente por flujo continuo de (3,3,3-trifluoropropil)triclorosilano durante treinta minutos a temperatura ambiente y seguido por enjuague con tolueno. Las longitudes de los tapones fueron 0,7 m; 7,2 mm; 10,7 mm; 17,9 mm y 28,6 mm. El voltaje aplicado fue 15 kV y se midió la absorbancia a 254 nm. El orden de elución de la columna fue: (1) tiourea 5 \muM, (2) acetofenona, (3) propiofenona, (4) butirofenona, (5) valerofenona, (6) hexanofenona, (7) heptanofenona, (8) octanofenona y (9) decanofenona. La concentración de cada una de las alquil fenil cetonas fue 0,1 \mug/ml en la disolución de separación.

Para la mezcla PAH ilustrada en la Fig. 5A, apenas eran visibles los picos con la inyección típica de una longitud de tapón de 0,1 mm, pero las alturas de los picos aumentaron con el aumento de la longitud del tapón de 6,8 a 34,2 mm. Así, la columna de separación, una realización de la presente invención, permitió la inyección de una longitud de tapón mayor que permite una columna de separación típica. Similarmente, para la mezcla de alquil fenil cetona ilustrada en la Fig. 5B, las alturas de los picos aumentaron con el aumento de la longitud del tapón de 0,7 mm a 57,3 mm. A medida que aumentaba la longitud del tapón, los cuatro picos mostraron un ensanchamiento aumentado pero los picos de elución posteriores eran más simétricos en un pequeño grado que los anteriores. Este comportamiento es al revés de lo que se observa en separaciones cromatográficas típicas en que los picos de elución posteriores eran menos simétricos que los anteriores debido a efectos de dispersión. Estos resultados sugieren que los analitos se acumulan en la entrada de la matriz porosa durante la inyección, localizándose las especies más retentivas más eficazmente que las menos retentivas.

En la Fig. 5A, la mejora en las alturas de los picos para una inyección de 27,4 mm comparado con una inyección típica de 0,1 mm es 50, 125 y 127 veces para naftaleno, fenantreno y pireno, respectivamente. La disolución de muestra en la inyección de 27,4 mm es una dilución de la muestra de 10 veces en la inyección típica de 0,1 mm.

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Ejemplo 4

La columna de separación se preparó como se describió en el Ejemplo 3. La disolución de muestra y de separación fue acetato de amonio 50 mM/agua/acetonitrilo (1/3/6). La muestras se inyectaron a 1 kV. El voltaje aplicado fue 15 kV y la absorbancia se detectó a 214 nm. La Fig. 6 es un electrocromatograma representativo de una representación gráfica que muestra absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Se inyectó 39,0 mM de naftaleno en la disolución de separación durante cinco segundos, como se representa por la señal a y se inyectó una 3,9 mM de naftaleno en la disolución de separación durante ochenta y cinco segundos, como se representa mediante la señal b. Las áreas corregidas de los picos (área del pico/tiempo de migración) para ambos electrocromatogramas estuvieron próximas entre sí controlando el tiempo de inyección de la dilución de la muestra diez veces. Las áreas corregidas de los picos del electroferograma en las líneas a y b son 0,0023 (%RSD = 0,02%, n=3) y 0,0025 (%RSD = 0,00, n=3) unidades arbitrarias/min, respectivamente. Esta comparación se hizo de manera que la cantidad de moléculas de naftaleno inyectadas para cada barrido fuera la misma.

Se demostró la preconcentración por la altura de pico ligeramente mayor para la inyección mayor de muestra diluida y casi las mismas anchuras de pico corregidas (anchura de pico/tiempo de migración) para ambos experimentos, a pesar de la diferente concentración de la muestra. Las alturas de los picos de los electrocromatogramas en las señales a y b fueron 0,0869 (%RSD = 0,36%, n=3) y 0,0937 (%RSD = 0,06%, n=3) unidades arbitrarias, respectivamente. Las anchuras de los picos de los electrocromatogramas en las señales a y b fueron 0,0253 (%RSD = 0,07%, n=3) y 0,0249 (%RSD = 0,01%, n=3) unidades arbitrarias/min, respectivamente. El desplazamiento en el tiempo de migración en la línea b fue producido por el tiempo de inyección más largo, que hizo el centro del tapón de la muestra más próximo a la ventana del detector.

Ejemplo 5

Se agitó una mezcla de 575 \mul de MPTMS y 100 \mul de ácido clorhídrico 0,12 M durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se combinaron 20 partes de esta mezcla con 80 partes de tolueno para proporcionar 200 \mul de la disolución final. Se añadió el fotoiniciador como 10% del volumen total de la disolución final y se agitó la disolución sol-gel resultante durante cinco minutos antes de su uso. Se preparó la columna de separación como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. se descargaron los reactivos no reaccionados con tolueno. Se modificó la superficie de la matriz porosa mediante el flujo continuo de pentafluorofeniltriclorosilano por el capilar durante cuarenta y cinco minutos a temperatura ambiente y seguido por enjuague con tolueno.

La Fig. 7 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención. La disolución de separación fue ácido fosfórico 50 mM/agua/acetonitrilo (1/5/4). El voltaje aplicado fue 15 kV y la absorbancia se detectó a 214 nm. La Fig. 7 (cuadro a) muestra una inyección de 3,4 kPa (0,5 psi) a longitud de tapón de péptidos de ensayo de 0,1 mm y la Fig. 7 (cuadro b) muestra una inyección a 3,4 kPa (0,5 psi) a una longitud de tapón de péptidos de ensayo de 12 mm. Los péptidos de ensayo, que eran analitos cargados, fueron (1) bradykinina, (2) angiotensina II, (3) tripéptido I, (4) tripéptido II y (5) metionina encefalina. La concentración de los péptidos fue 16,7 \mug/ml. Las velocidades dirigidas al cátodo de los péptidos fueron dictadas por efectos de flujo tanto electroforético como electroosmótico. Los péptidos presentaron una carga positiva neta al pH de la disolución de separación (pH=2). La mejora en las alturas de los picos para la inyección más larga comparado con una inyección típica de longitud de tapón de 0,1 mm es 21, 19, 16, 18 y 22 veces para bradykinina, angiotensina II, tripéptido I, tripéptido II y metionina encefalina, respectivamente. Este resultado demuestra la utilidad de este método para analitos cargados.

Ejemplo 6

La columna de separación se preparó como en el Ejemplo 3. La Fig. 8 (cuadros a, b y c) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente a tiempo de retención usando una realización de la presente invención. La Fig. 8 muestra un análisis de una muestra de orina, adicionada con hidrocortisona 0,1 mM (pico 1), progesterona 0,3 mM (pico 2) y cortisona 0,2 mM (pico 3). Se mezclaron cuatro partes de orina adicionada o no adicionada con seis partes de acetonitrilo y se centrifugó para retirar las proteínas. Una parte de cada sobrenadante se mezcló con una parte de acetato de amonio 50 mM/agua/acetonitrilo (1/7/2) antes de la inyección. La Fig. 8 (cuadro a) muestra una longitud de tapón de inyección de 0,1 mm y la Fig. 8 (cuadro b) muestra una longitud de tapón de inyección de 21,4 mm. La Fig. 8 (cuadro c) representa una longitud de tapón de inyección de 21,4 mm de muestra para ensayo en blanco de orina. La disolución de separación consistía en acetato de amonio 50 mM/agua/acetonitrilo (1/5/4). El voltaje aplicado para la separación fue 17 kV y se midió la absorbancia a 254 nm. Después de la precipitación de proteínas con acetonitrilo, se detectaron y se cuantificaron estos esteroides con una inyección de 21,4 mm de la disolución de muestra, pero se detectaron débilmente con una inyección típica de 0,1 mm. Una comparación entre el barrido de la muestra para ensayo en blanco y el barrido adicionado mostró que la matriz de muestra, que aún contenía otras biomoléculas, no interfería significativamente con análisis de esteroides en la columna de separación. Este resultado demuestra la utilidad de la técnica para análisis de biofluidos.

Ejemplo 7

La columna de separación se preparó como se describió en el Ejemplo 3. La Fig. 9 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Se inyectaron longitudes de tapón de muestra de 1,1 cm. La disolución de separación fue acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% y las disoluciones de muestra fueron acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% (cuadro a), acetonitrilo al 50% (cuadro b), acetonitrilo al 40% (cuadro c), acetonitrilo al 30% (cuadro d) y acetonitrilo al 20% (cuadro e). El voltaje aplicado para la separación fue 15 kV y la absorbancia se detectó a 254 nm. El orden de elución fue: (1) tiourea, (2) acetofenona, (3) propiofenona, (4) butirofenona, (5) valerofenona, (6) hexanofenona, (7) heptanofenona, (8) octanofenona y (9) decanofenona. La concentración de cada analito fue 2 nl/ml.

Los factores de retención, k, obtenidos para acetofenona (pico 2), propiofenona (pico 3), butirofenona (pico 4), valerofenona (pico 5), hexanofenona (pico 6), heptanofenona (pico 7), octanofenona (pico 8) y decanofenona (pico 9) fueron 0,18; 0,25; 0,32; 0,41; 0,53; 0,67; 0,85 y 1,33, respectivamente. En este estudio, se usó tiourea (pico 1) como el soluto neutro esencialmente no retenido para la determinación de k. El valor de k y el tiempo de migración siguen el aumento en la longitud de la cadena alquílica. En general, las formas del pico y la resolución mejoraron cuando se aumentó la concentración de agua de 40% a 50%, 60%, 70% y 80%, como ponen de manifiesto los cuadros a, b, c, d y e, respectivamente.

Ejemplo 8

Las condiciones de experimentación fueron las mismas que en el Ejemplo 7. La Fig. 10 es una representación gráfica de una representación gráfica que muestra el logaritmo de la relación de altura de pico (altura de pico obtenida desde una concentración de agua mayor en la matriz de muestra dividido por la altura de pico obtenida de una matriz de muestra similar a la de la disolución de separación) frente al porcentaje de agua en la matriz de muestra. Los datos indicaron que existe un límite al cual se pueden mejorar las alturas de pico por aumento de la concentración del tampón en la matriz de muestra. Se mejoró la preconcentración debido a la atracción mejorada de los analitos a la matriz porosa. Cuando el valor para el logaritmo de la relación de altura de pico fue menor que 1, aproximadamente 1 o mayor que 1 hubo una disminución, no cambio, o aumento, respectivamente, en la altura de pico comparado con una inyección similar usando la disolución de separación como la matriz de muestra. Para todos los APK de ensayo, las alturas de pico mejoraron cuando se aumentó la concentración de agua de 40% a 50% y de 50% a 60%. Las alturas de pico no mejoraron cuando se aumentó el porcentaje de agua de 60% a 70% o más, excepto para los dos analitos de menor k (acetofenona y propiofenona) cuando se aumentó el porcentaje de agua de 60% a 70%. Las alturas de pico empeoraron para los analitos de mayor k (heptanofenona, octanofenona y decanofenona) en la matriz de agua al 80%. La razón para la disminución en las alturas de pico es la disminución en la solubilidad de los analitos de k alta en la matriz de muestra altamente acuosa. Las áreas de pico corregidas, que es una medida de la cantidad de muestra cargada para la octanofenona y la decanofenona es 10% a 60% menor en la matriz de agua al 80% comparado con las otras matrices de muestra usadas. Para evitar problemas de solubilidad, los APK de ensayo en experimentos subsiguientes se prepararon en matrices con al menos 30% de acetonitrilo.

Ejemplo 9

La columna de separación se preparó como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. La Fig. 11 (cuadros a, b y c) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. La disolución de separación es acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60%. Las longitudes del tapón fueron 0,2 cm para una disolución de muestra de acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% (cuadro a); 2,74 cm para la misma disolución de muestra se usó en el cuadro a (cuadro b) y 2,74 cm para una disolución de muestra de acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 30% (cuadro c). Otras condiciones e identificación de picos son las mismas que en el Ejemplo 7.

La condición de gradiente, como se muestra en la Fig. 11 (cuadro c), mostró resolución y formas de los picos mejoradas. Las mejoras en las alturas de pico bajo la condición de gradiente ilustrada en la Fig. 11 (cuadro c) fueron 36, 35, 38, 41, 42, 38, 32 y 24 veces para la acetofenona, propiofenona, butirofenona, valerofenona, hexanofenona, heptanofenona, octanofenona y decanofenona, respectivamente. Las %RSD (n=5) de las alturas de pico medidas variaron de 0,9% a 2,5%. Las %RSD (n =5) de tiempo de migración variaron de 0,3% a 0,5%. El procedimiento es, por lo tanto, reproducible en una única columna.

Ejemplo 10

Las Figs. 12A, 12B y 12C son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las longitudes del tapón fueron 2,74 cm para la disolución de muestra de acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 40% (Fig. 12A), 2,74 cm para la disolución de muestra de acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 30% (Fig. 12B) y 5,48 cm para una disolución de muestra igual que en la Fig. 12B (Fig. 12C). Las disoluciones de separación fueron acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% (Fig. 12A) y acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 50% (Figs. 12B y 12C). Otras condiciones e identificación de picos son las mismas que en el Ejemplo 7.

Los valores de k fueron mayores en la Fig. 12B que en la Fig. 12A debido al alto porcentaje de agua en la disolución de separación. Las moléculas de analito estaban más unidas a la fase PSG a altos porcentajes de agua. La constante de distribución K (número de moles de soluto en la fase PSG dividido por el número de moles de soluto en la disolución de separación), que es directamente proporcional a k aumenta al aumentar la concentración de agua en la disolución de separación. En la Fig. 12B, los valores de k para la acetofenona, propiofenona, butirofenona, valerofenona, hexanofenona, heptanofenona, octanofenona y decanofenona fueron 0,29; 0,47; 0,65; 0,92; 1,28; 1,76; 2,37 y 4,25, respectivamente. Para mantener el efecto de gradiente constante, se mantuvo la relación de porcentaje de disolvente orgánico entre la disolución de separación y la matriz de muestra en el mismo valor para las Figs. 12A y 12B. Por razones aún desconocidas, el resultado en la Fig. 12B muestra que para los analitos con valores de k inferiores (acetofenona y propiofenona) hubo ligeros aumentos en las alturas de pico comparado con la Fig. 12A. Para los demás solutos del ensayo, hay algunas disminuciones en las alturas de pico.

La Fig. 12C ilustra lo que ocurre para un tapón de inyección mayor de 5,48 cm y un porcentaje mayor de agua en la disolución de separación. Las mejoras en las alturas de pico fueron 31, 33, 55, 44, 44, 37, 29 y 19 veces para la acetofenona, propiofenona, butirofenona, valerofenona, hexanofenona, heptanofenona, octanofenona y decanofenona, respectivamente. Como en la Fig. 11 (cuadro c), las mejoras en las alturas de pico no siguen k, a diferencia de en condiciones de no gradiente. Las mejoras en las alturas de pico fueron comparables a las obtenidas con un porcentaje mayor de disolvente orgánico entre la disolución de separación y la matriz de muestra (Fig. 11, cuadro c). Obsérvese que el tapón de inyección es dos veces más pequeño en la Fig. 11 (cuadro c) que en la Fig. 12C.

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Ejemplo 11

La Fig. 13 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las longitudes del tapón fueron 0,22 mm (cuadro a) y 19,5 cm (cuadro b). La disolución de separación fue acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60%. Las disoluciones de muestra fueron: acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% (cuadro a) y acetonitrilo al 36% (cuadro b). Las concentraciones de muestra fueron 11 a 53 \mug/ml (cuadro a) y 1,1 a 5,3 \mug/ml (cuadro b). El voltaje aplicado fue 30 kV y la absorbancia se detectó a 214 nm. El orden de elución fue tiourea (pico 1), naftaleno (pico 2), fenantreno (pico 3), pireno (pico 4) y benc(e)acefenantileno (pico 5).

Un gradiente de disolvente mejoró la detección de cuatro PAH, como se muestra en la Fig. 13 (cuadro b). Se usó un alto porcentaje de acetonitrilo (60%) en la disolución de separación, una longitud más corta de PSG (10 cm) y una alta resistencia al campo eléctrico (781,3 V/cm) para tiempos de análisis más rápidos. La Fig. 13 (cuadro a) es una inyección típica de 0,22 mm de muestra preparada en la disolución de separación. La Fig. 13 (cuadro b) es una inyección de 19,5 cm usando un gradiente donde la muestra está en una matriz de acetonitrilo al 36%, que proporciona un alto porcentaje de disolvente orgánico entre la disolución de muestra y la disolución de separación. Longitudes de tapón mayores que 19,5 cm producen ensanchamiento del pico del naftaleno. Es interesante observar que la longitud de inyección es mayor que la longitud desde la entrada a la ventana del detector (18,8 cm). La zona de elución más rápida de la tiourea se observa en realidad durante la inyección de la muestra. La zona de la tiourea está por lo tanto en la ventana de detección al principio del voltaje de separación.

Las mejoras en las alturas de pico para el naftaleno (pico 2), fenantreno (pico 3), pireno (pico 4) y benc(e)acefenantileno (pico 5) son 346, 437, 409 y 315 veces, respectivamente. Las concentraciones de muestra en la Fig. 13 (cuadro b) fueron 10 veces menores que en la Fig. 13 (cuadro a). Para el naftaleno, fenantreno y pireno, los valores indicados anteriormente fueron 6,9; 3,5 y 3,2 veces mejores de lo indicado previamente bajo condiciones de no gradiente, respectivamente.

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Ejemplo 12

La Fig. 14 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las longitudes del tapón fueron 0,23 mm (cuadro a), 7,6 cm (cuadro b), 22,8 cm (cuadro c), 45,6 cm (cuadro d) y 91,2 cm (cuadro e). La disolución de separación fue acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60%. Las disoluciones de muestra fueron acetato de amonio 5 mM en acetonitrilo al 60% (cuadro a) y acetonitrilo al 40% (cuadros b, c, d y e). Las concentraciones de muestra fueron 9 a 50 \mug/ml (cuadro a), 0,9 a 5 \mug/ml (cuadros b, c, d y e). El voltaje aplicado fue 22 kV y se detectó la absorbancia a 254 nm. El orden de elución fue tiourea (pico 1), decanofenona (pico 2) y pireno (pico 3).

Las alturas de pico de la decanofenona (pico 2) y pireno (pico 3) aumentó con el aumento de las longitudes del tapón. Se aumentó la inyección desde 0,23 mm (cuadro a) a 7,6 cm (cuadro b), 22,8 cm (cuadro c), 45,6 cm (cuadro d) y 91,2 cm (cuadro e), que corresponde a 0,1%, 30%, 89%, 178% y 356% de la longitud capilar total. La alta porosidad o la baja resistencia al flujo de la matriz porosa hizo posible introducir longitudes aumentadas de la disolución de muestra de una manera bastante menos costosa. Aún es posible la inyección mayor que 91,2 cm. No se realiza, sin embargo, debido a la pérdida de resolución, como se observa en la Fig. 14 (cuadro e). Se cree que el electrocromatograma en el cuadro d o e es la primera demostración en CEC que muestra inyecciones de muestra mayores que la longitud total del capilar. El volumen de muestra inyectado también fue mayor que 1 \mul. Una comparación de las alturas de pico obtenidas en los cuadros a y e sugiere mejoras en las alturas de pico de 1.118 veces y 1.104 veces para la decanofenona y el pireno, respectivamente. Estos valores son las mejoras de sensibilidad indicadas más altas para analitos neutros usando una técnica de preconcentración on-line simple en CEC. La fuerte interacción de los analitos a la matriz porosa y las características de transferencia de masa rápida inherente de la matriz porosa permitió la observación de dichos fuertes efectos de la preconcentración.

Se han hecho separaciones exitosas con PSG en capilares de 250 \mum de d. i. (datos no mostrados). Este trabajo abre la posibilidad de realizar separaciones semipreparativas que impliquen inyecciones de tapón grandes. Los volúmenes de inyección en el intervalo de \mul se podían hacer fácilmente.

Ejemplo 13

La Fig. 15 (cuadros a, b, c, d, e y f) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las longitudes del tapón fueron 0,1 mm (cuadro a) y 1,8 cm (cuadros b, c, d, e y f). Se hicieron inyecciones usando presión en las que la longitud de la inyección se fija a 1,8 cm. Las disoluciones de muestra fueron las mismas que la disolución de separación (cuadros a y b), ácido fosfórico 10 mM en acetonitrilo al 20% (cuadro c), ácido fosfórico 10 mM en acetonitrilo al 70% (cuadro d), ácido fosfórico 50 mM en acetonitrilo al 40% (cuadro e), ácido fosfórico 0,05 mM en acetonitrilo al 40% (cuadro f). La disolución de separación fue ácido fosfórico 10 mM en acetonitrilo al 40%. Las concentraciones de péptido fueron 16,7 \mug/ml cada una, el voltaje aplicado fue 12 kV y la detección de la absorción fue a 214 nm. El orden de elución fue bradykinina (pico 1), angiotensina II (pico 2), tripéptido I (pico 3), tripéptido II (pico 4) y metionina encefalina (pico 5).

Aunque se esperaba que las formas de los picos serían mejores bajo una condición de gradiente (Fig. 15, cuadro c) cuando se compara con uno de no gradiente (Fig. 15, cuadro b), las formas de los picos resultantes fueron mejores usando una concentración mayor de acetonitrilo en la matriz de muestra (Fig. 15, cuadro d). Se observaron mejores formas de los picos en la Fig. 15 (cuadro d) resultantes del apilamiento de muestra. No se observa el efecto de ensanchamiento de usar una concentración mayor del disolvente de elución en la disolución de muestra (efecto de gradiente inverso debido a mayor concentración de disolvente de elución) debido a que los péptidos catiónicos migran inmediatamente al tampón de separación una vez aplicado el voltaje, así las zonas de los péptidos ya están en la disolución de separación antes de alcanzar la matriz porosa. El apilamiento de muestra también se muestra en la Fig. 15 (cuadro f), donde la muestra se prepara en una matriz que tiene una menor concentración de componente de tampón y un porcentaje similar de acetonitrilo comparado con la disolución de separación.

Se observan formas de pico no deseables en la Fig. 15 (cuadro c) resultado del desapilamiento. El desapilamiento es el ensanchamiento de analitos cargados cuando los analitos pasan el límite de concentración que separa las regiones de baja y alta resistencia al campo eléctrico. La zona de campo eléctrico bajo es la matriz de muestra de alta conductividad que contiene más agua. El desapilamiento también se muestra en la Fig. 15 (cuadro e) donde la muestra se prepara en una matriz que tiene una mayor concentración de componente tampón y un porcentaje de acetonitrilo similar comparado con la disolución de separación.

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Ejemplo 14

La Fig. 16 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Las inyecciones fueron 0,1 mm usando presión de 3,4 kPa (0,5 psi) (cuadro a) y 15 s a 5 kV (cuadro b). Las disoluciones de muestra fueron ácido fosfórico 10 mM en acetonitrilo al 40% (cuadro a) y ácido fosfórico 0,5 \muM en acetonitrilo al 40% (cuadro b). Las concentraciones de péptido fueron 16,7 \mug/ml cada una (cuadro a) y 167 ng/ml cada una (cuadro b). El voltaje de separación fue 12 kV. Otras condiciones son iguales que en el Ejemplo 13.

Los analitos en la Fig. 16 (cuadro b) fueron cien veces menos concentrados que los de la Fig. 16 (cuadro a). Las mejoras en las alturas de pico para la bradykinina (pico 1), angiotensina II (pico 2), tripéptido I (pico 3), tripéptido II (pico 4) y metionina encefalina (pico 5) fueron 1.040, 820, 810, 950 y 711 veces, respectivamente. Para el procedimiento de preconcentración, las %RSD (n=5) de las alturas de pico variaron desde 6,2% a 16,2% mientras las %RSD (n=5) de tiempo de migración variaron desde 0,7% a 1,5%.

La reproducibilidad de las alturas de pico se debería mejorar con el uso de un patrón interno.

Se realizó inyección de la muestra mejorada con el campo por disolución de la muestra en una matriz de baja conductividad (ácido fosfórico 0,5 \muM en acetonitrilo al 40%), seguido por inyección usando voltaje con el electrodo negativo en el extremo del detector. A medida que se aplicó el voltaje, la matriz de muestra de baja conductividad entró en el capilar debido a flujo electroosmótico (EOF) mientras los péptidos catiónicos entraban en la columna debido a flujo tanto EOF como electroforético. Sólo se introdujo un tapón muy pequeño de matriz de muestra debido a que el bajo pH de la disolución de separación disminuye mucho el EOF, que evita la disociación de grupos silanol en las paredes capilares. Realmente se detectó un soluto neutro no retenido (tiourea) después de 30 minutos.

El campo eléctrico en la zona de la matriz de muestra introducido en la columna fue mucho mayor que la zona de separación. Este efecto causó la alta velocidad electroforética del los péptidos catiónicos que entraban en el capilar. La alta velocidad electroforética del analito hizo que se tuviera que introducir una gran cantidad de péptidos, a diferencia de inyección hidrodinámica, el volumen de muestra cargado limitó la cantidad de muestra introducida. La alta velocidad electroforética del analito también produjo la concentración o preconcentración de péptidos en el límite de concentración entre la matriz de muestra y la disolución de separación (apilamiento de la muestra). La introducción de un tapón de agua antes de la inyección electrocinética, que se sugiere que es útil en el apilamiento de muestra con inyección electrocinética, no mejoró las alturas de pico debido a la dirección similar del EOF y las velocidades electroforéticas del analito. La matriz de muestra de baja conductividad que entró en el capilar también mantuvo la mejora del campo eléctrico en el extremo de entrada del capilar durante la inyección.

Con las condiciones en la Fig. 16, se encontró que el tiempo de inyección electrocinética óptimo a 5 kV era 15 s. Inyecciones mayores llevaron a ensanchamiento de los picos. Después de la inyección, se aplicó el voltaje de separación con la misma polaridad que en la inyección (electrodo negativo en el lado del detector). Los analitos se movieron al cátodo y con posterioridad se preconcentraron de nuevo basándose en su retención en la columna PSG. Se consideró el método selectivo para cationes debido a que los cationes se introdujeron en su mayoría en el capilar. Las especies neutras inyectadas migradas después del marcador neutro y los cationes no retenidos debido a que la EOF fue muy lenta. Al pH usado, todos los analitos estaban o cargados positivamente o neutros. La aplicabilidad de la técnica a otras muestras catiónicas también es posible.

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Ejemplo 15

La Tabla 2 enumera los tipos y volúmenes de reactivos usados para preparar diferentes disoluciones madre de precursor donde la relación del catalizador ácido al precursor, metacriloxipropiltrietoxisilano, se varió o donde se hizo reaccionar el precursor con un co-precursor (para formar un testigo PSG de fase mixta).

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TABLA 2

4

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Cambiar la concentración del precursor en la disolución de reacción o usar un co-precursor para la formación de fases mixtas modificó la naturaleza química del testigo PSG principal. Los testigos PSG, PSG-A y PSG-J, preparados a partir de las disoluciones A y J, respectivamente, difieren sólo en el volumen de precursor usado en la reacción, conteniendo J un volumen mayor del precursor que A. Un volumen mayor del precursor en la reacción debería dar como resultado un testigo más denso en la columna capilar. El testigo PSG, PSG-K, se preparó con el precursor y bis(trietoxisilil)etano como co-precursor. Los testigos PSG, PSG-M y PSG-P, se prepararon con el precursor y diferentes cantidades de bis(trietoxisilil)octano como co-precursor. Los co-precursores se hidrolizan y se condensan con el precursor para formar disoluciones híbridas (fases mixtas).

Para las disoluciones A y J, se añadió el volumen apropiado del precursor a 100 \mul del catalizador ácido (MCl 0,12 M) y se agitó la disolución resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad). Para las disoluciones K, M y P, se añadió el volumen apropiado del precursor a 100 \mul de HCl 0,12 M seguido de la adición de la cantidad apropiada de bis(trietoxisilil)etano; se agitó la disolución resultante durante 15 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad). Todas estas disoluciones se usaron dentro de dos horas de su preparación.

Se siguió un procedimiento similar en la preparación de disoluciones madre de tolueno/precursor con el fotoiniciador añadido. La cantidad de fotoiniciador añadida a la disoluciones madre de tolueno/precursor fue 10 mg de fotoiniciador para cada 100 \mul de la disoluciones madre de tolueno/precursor.

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Se preparó y se acondicionó el capilar de la misma manera que se describió anteriormente. El acondicionamiento de la columna capilar PSG fue el mismo que anteriormente.

Se determinaron los factores de separación de los testigos para dos mezclas de ensayo de alquil fenil cetonas (las APK) e hidrocarburos aromáticos policíclicos (los PAH) (ambos por sus siglas en inglés). El factor de separación es una medida de la capacidad de separación del analito de un sistema cromatográfico. El factor de separación, \alpha, se da por k_{2}/k_{1}, donde k es el factor de retención para un analito particular y k_{2} y k_{1} son los valores de k para analitos adyacentes. Se determinó el factor de retención k=(t_{R}-t_{o})/t_{o} de la manera usual, donde t_{R} es el tiempo de retención del analito y t_{o} es el tiempo de retención de un marcador no retenido para el que se usó tiourea. La Tabla 3 enumera el factor de separación de cada testigo PSG para naftaleno y pireno.

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TABLA 3

5

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Los valores para \alpha variaron desde 2,43 para PSG-K a 2,76 para PSG-P siendo el factor de separación para PSG-P ligeramente mayor que el de los otros testigos. Los factores de separación mayores que 1 indicaron separación exitosa de los analitos.

La Figura 17 (cuadros a, b, c, d y e) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Se separó una mezcla de tiourea (T), naftaleno (N), fenantreno (F) y pireno (Pi) en PSG-A (Figura 17, cuadro a), PSG-K (Figura 17, cuadro b), PSG-J (Figura 17, cuadro c), PSG-M (Figura 17, cuadro d) y PSG-P (Figura 17, cuadro e). En todos los casos se resolvieron bien los picos de los diferentes analitos.

La resolución se determinó a partir de la expresión:

50

donde N es la eficacia (número de platos teóricos), \alpha es el factor de separación y k el factor de retención para un analito particular. PSG-A presenta la resolución más baja de 2,43 para el naftaleno y pireno mientras PSG-J presenta una resolución de 4,35 para los dos mismos analitos. El mayor volumen del precursor usado en la preparación de PSG-J cuando se compara con PSG-A dio como resultado hidrofobicidad mejorada del testigo. Los factores de retención para naftaleno y pireno en PSG-J fueron 0,31 y 0,79, respectivamente y estos valores reflejaron el aumento en la hidrofobicidad del testigo. Estos valores representan aumentos de 55% y 54%, respectivamente.

El uso del co-precursor, bis(trietoxisilil)octano en PSG-M y bis(trietoxisilil)etano en PSG-K y PSG-P dio como resultado resolución para naftaleno y pireno de 4,37, 4,09 y 9,03, respectivamente, que es un aumento de hasta 73% cuando se compara con la resolución de PSG-A principal (Rs = 2,43). Los factores de retención para naftaleno (0,23) y pireno (0,56) fueron ambos 60% mayores para estos tres testigos que para PSG-A.

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Ejemplo 16

La columna de separación se preparó como se describió anteriormente en el ejemplo 15 para el testigo PSG-J. Para una matriz porosa con una longitud de 15 cm, los factores de retención para el naftaleno y pireno, k_{N} y k_{Pi}, respectivamente, fueron 0,31 y 0,79, respectivamente, para una matriz porosa hecha con 80% de tolueno. Para una matriz porosa similar con una longitud de 10 cm, k_{N} y k_{Pi} fueron 0,10 y 0,24, respectivamente. Hubo una relación lineal entre la longitud y k_{N} (r = 0,991) y k_{Pi} (r = 0,991). Los factores de separación para matrices porosas de 15 cm, 10 cm y 5 cm fueron 2,55; 2,52 y 2,40, respectivamente. Así, para la longitud de testigo más corta, se mantuvo un factor de separación alto, mientras que los tiempos de elución para los analitos se redujeron significativamente. La disminución de la longitud de la matriz porosa en una columna capilar llevó a una disminución en los tiempos de elución de los analitos de ensayo. La disminución de esta longitud tuvo un efecto de disminución de los factores de retención del naftaleno y el pireno.

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Ejemplo 17

La columna de separación se preparó como se describió anteriormente en el Ejemplo 15. Para PSG-A hecha con tolueno al 80%, k_{N} fue 0,14 y k_{Pi} es 0,36, mientras k_{N} fue 0,30 y k_{Pi} fue 0,74 para PSG-A hecha con tolueno al 73%. Los factores de separación para PSG-A hecha con tolueno al 80% y tolueno al 73% fueron 2,57 (%RSD 0,1) y 2,47 (%RSD 0,1), respectivamente. El valor de k aumentó por 53% y 51% para el naftaleno y pireno cuando se usó tolueno al 73% en la preparación de los testigos.

Se observó una tendencia similar para PSG-J donde k_{N} fue 0,31 y k_{Pi} fue 0,79 para un testigo hecho con tolueno al 80%. Los valores de k_{N} (0,49) y k_{Pi} (1,23) aumentaron por 37% y 36% cuando disminuyó la concentración de tolueno desde 80% a 73%. Los factores de separación de PSG-J hecha con tolueno al 80% y tolueno 73% fueron 2,55 y 2,51, respectivamente.

La resolución para el naftaleno y pireno difirió significativamente cuando se comparan los testigos PSG hechos con tolueno al 80% y 73%. Cuando disminuyó el tamaño de poro, que se produjo aproximadamente usando menores volúmenes de tolueno, la superficie PSG aumentó con un aumento resultante en la retención y resolución en las mismas condiciones de disolución de separación. Así, la permeabilidad de la matriz porosa afecta a la retención de los analitos.

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Ejemplo 18

El monómero, metacriloxipropiltrimetoxisilano (MPTMOS) y los reactivos de acoplamiento de silano, pentafluorofenildimetilclorosilano (PFPDM), pentafluorofeniltrietoxisilano (PFP), 3,3,3-trifluoropropiltriclorosilano (C_{3}F_{3}), n-octadimetilclorosilano (C_{8}), (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil) dimetilclorosilano (CF_{13}) y n-propilaminotrietoxisilano (NH_{2}), se adquirieron en Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI) o Gelest (Tullytown, PA) y se usaron como se adquirieron. El fotoiniciador, Irgacure 1800, fue donado por Ciba (Tarrytown, NY). Todos los disolventes fueron de grado espectroscópico de Sigma-Aldrich. Los capilares de sílice fundida de un diámetro interno de 75 \mum x 365 \mum de diámetro externo se adquirieron en Polymicro Technologies (Phoenix, AZ). La tiourea, alquil fenil cetonas, naftaleno, fenantreno, pireno, nucleósidos, taxol, derivados de taxol y los péptidos se adquirieron en Sigma-Aldrich y se usaron como se adquirieron.

Todos los electrocromatogramas se obtuvieron usando un instrumento de electroforesis capilar (CE) Beckman P/ACE 2000 equipado con un detector de absorbancia UV (Beckman Coutler, Inc. Fullerton, CA). Se usó un Spectrolinker XL-1500 equipado con seis bombillas de mercurio de baja presión de 365 nm (Spectronics Corp., Westbury, NY) en las reacciones de fotopolimerización. Se usó un microscopio de barrido electrónico (SEM) Philips Modelo 505 para analizar la estructura física de las matrices porosas en las columnas capilares. Para ese fin cada columna se recubrió con un espesor de 10 nm de oro/paladio usando un Pulverizador en Frío/Unidad de grabado Denton Vacuum, LLC Desk II y accesorio de evaporación de carbono (Moorestown, NJ).

El polímero orgánico de metal se preparó con una disolución madre de monómero de 575 \mul de MPTMOS y 100 \mul de HCl 0,12 M que se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se preparó una disolución de precursor de tolueno 80/20 (v/v) se preparó mezclando 60 \mul de la disolución madre de monómero con 30 mg del fotoiniciador disuelto en 240 \mul de tolueno. Se agitó la disolución resultante a temperatura ambiente y en la oscuridad durante 5 minutos. Se preparó una columna capilar con una tira de 5 ó 10 cm de poliimida retirada de su exterior. La longitud total del capilar fue 25,6 cm (18,8 cm desde la entrada a la ventana del detector). La ventana del detector, que estaba colocada después de la matriz porosa, se creó por separación por combustión de la poliimida con ácido sulfúrico fumante.

Se preparó la fase unida sobre un polímero orgánico de metal 80/20 en una columna que se enjuagó con tolueno previamente a la reacción de silanización. Se trató después la columna enjuagada con el reactivo de acoplamiento de silano mediante flujo continuo de una disolución neta del reactivo con una jeringa en un tornillo portátil. Se permitió que el reactivo reaccionara con la superficie del polímero durante 15, 30, 60, 70 y 90 minutos a temperatura ambiente. Se retiró todo reactivo de acoplamiento de silano no reaccionado de la matriz porosa de fase unida por descarga con tolueno usando una jeringa. Se prepararon las siguientes matrices porosas de fase unida por este procedimiento: PSG-PFP, PSG-PFPDM, PSG-C_{8}, PSG-C_{3}F_{3}, PSG-CF_{13} y PSG-NH_{2}.

Se instaló cuidadosamente una columna capilar PSG en un cartucho P/ACE. Aunque la columna está sin un recubrimiento completo de poliimida, aún conserva buena resistencia mecánica. Se tiene cuidado, sin embargo, en la manipulación de estos capilares para evitar la rotura durante la instalación en el cartucho capilar. Una vez en el cartucho, se acondicionó primero el capilar con la disolución de separación usando una jeringa. Se enjuagó la columna en el instrumento CE durante aproximadamente 2 minutos a 138 kPa (20 psi), seguido de acondicionamiento electrocinético a 5 kV durante 10 minutos. Se termostatizaron las columnas a 20ºC.

Las Figures 18a y 18b son imágenes electromicrográficas de barrido transversal de una matriz porosa principal (es decir, no derivatizada) (Figura 18a) y una matriz porosa de fase unida C_{8} (Figura 18b). Estas imágenes transversales de las columnas capilares revelaron una red porosa de estructuras de formas esféricas y casi esféricas de interconexión de 1 \mum de diámetro. Ambas estructuras son casi idénticas (al aumento usado) conteniendo la matriz porosa de fase unida algunas áreas de mayor densidad del testigo.

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Ejemplo 19

La matriz porosa de fase unida se preparó como se describió anteriormente en el Ejemplo 18. Se preparó la disolución de muestra de alquil fenil cetona con acetofenona 1,42 \muM, propiofenona 25 \muM, butirofenona 15 \muM, valerofenona 20 \muM, hexanofenona 5,5 \muM, heptanofenona 16,5 \muM, octanofenona 15,3 \muM y decanofenona 3,5 \muM en una disolución de acetato de amonio 50 mM (pH 6,5)/agua/acetonitrilo (1/3/6). Usar un volumen menor de acetonitrilo dio como resultado una disminución de la solubilidad de la muestra. La disolución de separación fue acetato de amonio 50 mM (pH 6,5)/agua/acetonitrilo 1/5/4. La inyección fue a 1 kV durante 5 segundos y el voltaje de separación fue
20 kV.

La Figura 19 (cuadros a, b, c, d, e y f) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando realizaciones de la presente invención. Los electrocromatogramas son de la separación de tiourea y alquil fenil cetonas en columnas capilares PSG de matriz porosa no derivatizada (cuadro a) y matrices porosas derivatizadas con C_{3}F_{3} (cuadro b), CF_{13} (cuadro c), PFP (cuadro d), C_{8} (cuadro e) y PFPDM (cuadro f). Los picos son tiourea (pico T), acetofenona (pico 1), propiofenona (pico 2), butirofenona (pico 3), valerofenona (pico 4), hexanofenona (pico 5), heptanofenona (pico 6), octanofenona (pico 7) y decanofenona (pico 8).

Una comparación de las cinco columnas PSG de fase unida, es decir PSG-C_{3}F_{3} (cuadro b), PSG-CF_{13} (cuadro c), PSG-PFP (cuadro d), PSG-C_{8} (cuadro e) y PSG-PFPDM (cuadro f), con la columna PSG principal (cuadro a) reveló resolución aumentada de los analitos de ensayo, en particular para los más hidrófobos, teniendo lugar la mejora más grande para PSG-PFPDM. La resolución se determinó a partir de la expresión:

100

donde N es la eficacia (número de platos teóricos), \alpha es el factor de separación y k el factor de retención para un analito particular. El factor de separación \alpha se proporciona por k_{2}/k_{1}. El factor de retención k = (t_{R} - t_{o})/t_{o} se determinó de la manera habitual, donde t_{R} es el tiempo de retención del analito y t_{o} es el tiempo de retención de un marcador no retenido (para el que usamos tiourea). Las resoluciones para la acetofenona (pico 1) y hexanofenona (pico 5) fueron 2,02; 2,15; 2,64; 3,13 y 3,71 para PSG-C_{3}F_{3}, PSG-CF_{13}, PSG-PFP, PSG-C_{8} y PSG-PFPDM, respectivamente. Esta realización fue un aumento de hasta 50% de la PSG principal (R_{s} = 1,86). En todos los casos, las alquil fenil cetonas eluyeron en el orden de hidrofobicidad creciente: acetofenona (pico 1), propiofenona (pico 2), butirofenona (pico 3), valerofenona (pico 4), hexanofenona (pico 5), heptanofenona (pico 6), octanofenona (pico 7) y decanofenona (pico 8). Todas las alquil fenil cetonas eluyeron de la columnas capilares PSG de fase unida en 30 minutos a resistencias al campo relativamente altas (> 1.000 V/cm). La resolución más baja de las alquil fenil cetonas se observó para la columna PSG principal (cuadro a), mientras la resolución más alta de las alquil fenil cetonas se consiguió en PSG-PFPDM con octanofenona, eluyendo después de 13 minutos (cuadro f) y eluyendo la decanofenona (no mostrado) después de 25 minutos.

Se ha indicado que las fases unidas fluoradas interactúan con compuestos aromáticos a base de interacciones electrostáticas entre los electrones \pi de los anillos aromáticos y los pares de electrones solitarios (en el orbital 2p) en el átomo de flúor de la fase unida. Este comportamiento no fue el caso para las fases unidas fluoradas, PFP y PFPDM. La separación de las alquil fenil cetonas fue producida por la hidrofobicidad creciente de los compuestos a medida que aumenta el número de carbonos del grupo funcional alquílico. El orden de elución siguió este aumento en la hidrofobicidad para estos compuestos.

PSG-C_{8} mostró buena resolución para las alquil fenil cetonas y tiempos de análisis más cortos para las ocho alquil fenil cetonas eluyendo la decanofenona en 20 minutos (cuadro e). PSG-C_{8} combinó alta resolución con tiempos de elución rápidos para las alquil fenil cetonas y tuvo un EOF de 1,76 x 10^{-4} cm^{2}/Vs, que fue 15% mayor que los valores de EOF para las matrices porosas de fase unida, pero igual que el de la matriz porosa no derivatizada.

No observamos burbujas o secado de las columnas PSG, incluso a las altas resistencias al campo empleadas en la separación de las alquil fenil cetonas. La matrices porosas de fase unida fueron más estables para condiciones altamente ácidas (pH 2-4) que la matriz porosa no derivatizada. Una representación gráfica de la corriente frente a la resistencia al campo para cada una de las matrices porosas de fase unida fue lineal (datos no mostrados). Esta linealidad sugiere la ausencia de calentamiento Joule, que puede llevar a ensanchamiento de los picos. En cada una de las separaciones, la eficacia de las alquil fenil cetonas disminuyó con los valores crecientes de k. Los efectos difusionales que causaban los analitos para separar por elución lentamente la matriz porosa puede explicar las bajas eficacias. Se puede conseguir mayor resolución con una matriz porosa de fase unida con una longitud de 15 cm, pero a costa de tiempos de elución mayores. Existió una relación lineal entre la longitud de la matriz porosa y k. Los factores de separación para las matrices porosas de fase unida de longitudes 15, 10, y 5 cm fueron 2,55; 2,52 y 2,40, respectivamente.

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Ejemplo 20

La Tabla 4 presenta el efecto del tiempo de reacción de silanización sobre el factor de retención k, el factor de separación \alpha y la resolución R_{s} de PSG-C_{8} para acetofenona (1) y hexanofenona (5) en un testigo PSG-C_{8} de 5 cm.

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TABLA 4

6

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Los factores de separación aumentaron como una función del tiempo de reacción hasta 60 minutos, difiriendo los factores de separación durante 0 y 15 minutos sólo ligeramente. Factores de separación mayores que uno indicaban la separación exitosa de los analitos. Con tiempos de reacción mayores de 70 y 90 minutos, los factores de separación disminuyeron. Se observó la misma tendencia en la resolución de la acetofenona y hexanofenona para tiempos de reacción crecientes. La resolución de los dos analitos aumentó linealmente con el tiempo de reacción (r = 0,974) en el intervalo de 0 a 60 minutos. La reproducibilidad columna-a-columna (n=3 ó 4) para columnas PSG de fase unida preparadas con tiempos de reacción de 15, 30 y 60 minutos, fue mejor que RSD 3%. La resolución disminuyó para tiempos de reacción de 70 y 90 minutos.

La desaparición de la fase unida puede explicar la disminución de la resolución para tiempos de reacción de 70 y 90 minutos. A medida que aumentaba el tiempo de reacción de silanización, se permitió que se uniera más n-octildimetilsilano a los grupos hidroxilo del polímero orgánico de metal, aumentando de ese modo el número de grupos n-octildimetilo en la superficie del polímero. Cuanto más la fase unida se unía sobre la superficie del polímero, más próximos estaban entre sí los ligandos. El hecho de que los valores de k_{1} y k_{5} aumentaran por 17% y 58%, respectivamente, desde un tiempo de reacción de 0 a 60 minutos, indicó que la superficie polimérica se estaba haciendo más hidrófoba, es decir, más retentiva para las alquil fenil cetonas.

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Ejemplo 21

La Figura 20 (cuadros a y b) son electrocromatogramas representativos que muestran representaciones gráficas de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Los electrocromatogramas son de la separación de cinco a siete alquil fenil cetonas en un testigo PSG-C_{8} de 5 cm, durante 30 min (cuadro a) y 90 min (cuadro b). Las condiciones de separación e identidades de los picos son las mismas que en el Ejemplo 19.

La Figura 20 ilustra el efecto de tiempo de reacción de 0 minutos (Figura 20, cuadro a) y tiempo de reacción de 60 minutos (Figura 20, cuadro b) para un testigo PSG-C_{8} en la separación de una mezcla de alquil fenil cetona. Los valores de k para la decanofenona, con una cadena de 10 átomos de carbono, fueron extremadamente grandes. Para un tiempo de reacción de 30-minutos k fue 23,0, mientras para un tiempo de reacción de 60 minutos k es 28,6, un aumento del 20%. No se realizaron mediciones de carga para evaluar el revestimiento superficial de la fase unida en la matriz porosa, pero se puede deducir de los datos cromatográficos que debería ser un revestimiento mayor de la fase unida en la matriz porosa, en particular para los tiempos de reacción de 15-60 minutos y por lo tanto un número creciente de sitios cromatográficos para la separación de los compuestos de ensayo.

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Ejemplo 22

La mezcla de muestras de nucleósido consistió en inosina, uridina, guanosina, y citidina en concentraciones de 1 mg/ml cada una en agua. La disolución de separación fue fosfato 50 mM (pH 8)/agua/acetonitrilo (0,5/3,5/6). La longitud del tapón de inyección fue 0,1 mm y el voltaje aplicado fue -15 kV.

Se preparó un testigo PSG-NH_{2} de 10 cm como se describió anteriormente en el Ejemplo 18. Se derivatizó una matriz porosa de 10 cm de largo con n-propilaminotrietoxisilano. El testigo resultante, PSG-NH_{2}, tenía una fase unida a amina (pH 9-10) que se cargó positivamente en nuestras condiciones experimentales. Se permitió la carga positiva para la inversión del EOF. Aunque los materiales cromatográficos con una funcionalidad de grupo amino habían encontraron alguna aplicación en fase normal y cromatografía de intercambio iónico, PSG-NH_{2} en nuestras condiciones se comportó como un material de fase inversa. Las alquil fenil cetonas eluyeron en el mismo orden (datos no mostrados) cuando se compara con las otras matrices porosas de fase unida descritas anteriormente.

La Figura 21 es una electrocromatografía representativa que muestra una representación gráfica de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Los picos son de cuatro nucleósidos, inosina (pico 1), uridina (pico 2), guanosina (pico 3) y citidina (pico 4). La Figura 21 muestra la separación de la mezcla de los cuatro nucleósidos con EOF invertido. La separación de esta mezcla no fue posible en electroforesis capilar de zona en la misma disolución de separación.

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Ejemplo 23

Se preparó un testigo PSG-PFP de 15 cm como se describió anteriormente en el Ejemplo 18. Se usaron péptidos de cadena corta, angiotensina I, bradykinina, angiotensina II, gly-gly-gly, val-tyr-val y metionina encefalina, como analitos catiónicos. La concentración de cada uno de los péptidos fue 16 \mug/ml. La disolución de separación fue acetato de amonio 50 mM (pH 4,3)/agua/acetonitrilo (1/4/5). La inyección fue durante 30 s a 3,4 kPa (0,5 psi) y el voltaje aplicado fue 10 kV.

La Figura 22 es una electrocromatografía representativa que muestra una representación gráfica de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Los picos fueron para la separación de cinco péptidos catiónicos, angiotensina I (pico 1), bradykinina (pico 2), angiotensina II (pico 3), gly-gly-gly (pico 4), val-tyr-val (pico 5) y metionina encefalina (pico 6). La Figura 22 demuestra la utilidad de una columna PSG-PFPDM para la separación de cuatro péptidos cargados positivamente, que se consiguió en menos de 15 minutos. Los péptidos catiónicos de la columna eluyeron a pesar de la naturaleza aniónica del testigo. La fase unida esencialmente creó una capa sobre el testigo para apantallar la carga negativa de los grupos hidroxilo ionizados de los péptidos. Así, se han disminuido las interacciones de la carga entre los péptidos catiónicos y el testigo aniónico.

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Ejemplo 24

Se preparó un testigo PSG-C_{3}F_{c} de 15 cm como se describió anteriormente en el Ejemplo 18. Se preparó cada uno de taxol, baccatin III y acetilbaccatin como disoluciones de 1 mg/ml en acetonitrilo. La disolución de separación fue acetato de amonio 50 mM (pH 6,5)/agua/acetonitrilo (1/4/5). La inyección fue durante 5 s a 3,4 kPa (0,5 psi) y el voltaje aplicado fue 10 kV.

La Figura 23 es una electrocromatografía representativa que muestra una representación gráfica de absorbancia frente al tiempo de retención usando una realización de la presente invención. Los picos son baccatin III (pico 1), taxol (pico 2) y acetilbaccatin (pico 3). Figura 23 ilustra la completa separación de esta mezcla, que se consigue en 8 minutos. Esta separación demuestra el potencial de una columna PSG de fase unida para el análisis de fármacos farmacéuticos.

Claims

1. Una columna de separación que comprende:

un canal de separación y

un medio de separación en el canal y que comprende una matriz porosa, matriz que tiene un soporte y una fase estacionaria, incluyendo el soporte un fotopolímero orgánico de metal e incluyendo la fase estacionaria una fase unida mediante enlaces covalentes a partículas de soporte o una pared interna de la columna.

2. La columna de la reivindicación 1, en la que el medio de separación es sin frita.

3. La columna de la reivindicación 1, en la que la fase estacionaria comprende un grupo funcional orgánico.

4. La columna de la reivindicación 1, en la que el canal de separación presenta una pared del canal y el medio está unido a la pared del canal y satisface al menos una sección del canal.

5. La columna de la reivindicación 1, en la que la matriz porosa es homogénea y no contiene partículas cromatográficas.

6. La columna de la reivindicación 1, en la que un precursor del fotopolímero comprende un alcóxido de metal.

7. La columna de la reivindicación 6, en la que el alcóxido de metal comprende un material seleccionado de: aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tántalo, estaño, titanio, vanadio, cinc y circonio.

8. La columna de la reivindicación 6, en la que el alcóxido de metal comprende al menos un grupo fotoactivo.

9. La columna de la reivindicación 1, en la que la matriz porosa tiene una afinidad por un analito.

10. La columna de la reivindicación 1, en la que el medio de separación comprende una fase homogénea.

11. La columna de la reivindicación 1, en la que el canal de separación es un canal de separación capilar o una estructura plana.

12. Un método para preparar un testigo en una columna de separación, que comprende:

proporcionar una columna de separación;

introducir una mezcla fotopolimerizable en la columna, incluyendo la mezcla fotopolimerizable al menos un compuesto orgánico de metal;

irradiar la mezcla para formar una matriz porosa, sólida, mediante polimerización fotoiniciada, formando de ese modo un soporte en la columna e

introducir un reactivo de acoplamiento en la columna, formando de ese modo una matriz porosa de fase unida en la columna.

13. El método según la reivindicación 12, en el que la mezcla fotopolimerizable comprende además al menos un material fotoactivo seleccionado de un grupo fotoactivo unido al compuesto orgánico de metal y un fotoiniciador.

14. El método según la reivindicación 12, en el que la introducción de un reactivo de acoplamiento comprende introducir un reactivo de acoplamiento que comprende un grupo funcional y un metal.

15. El método según la reivindicación 14, en el que el metal se selecciona de: aluminio, bario, antimonio, calcio, cromo, cobre, erbio, germanio, hierro, plomo, litio, fósforo, potasio, silicio, tántalo, estaño, titanio, vanadio, cinc y circonio.

16. El método según la reivindicación 12, en el que la introducción de un reactivo de acoplamiento comprende introducir un reactivo de acoplamiento orgánico.

17. El método según la reivindicación 12, en el que la introducción de un reactivo de acoplamiento comprende introducir un reactivo seleccionado del grupo que consiste en organoclorosilano, organoalcoxisilano y organoaminosilano.

18. El método según la reivindicación 12, en el que la introducción de un reactivo de acoplamiento comprende introducir un reactivo con monofuncionalidad, difuncionalidad o trifuncionalidad.

19. El método según la reivindicación 12, que comprende además introducir un disolvente orgánico en la columna incluyendo la matriz porosa de fase unida.

20. El método según la reivindicación 12, en el que la matriz porosa no contiene partículas cromatográficas.

21. El método según la reivindicación 12, en el que el medio de separación es sin frita.

22. El método según la reivindicación 12, en el que al menos dicho compuesto orgánico de metal comprende un material seleccionado de al menos un monómero orgánico de metal y/o al menos un oligómero orgánico de metal y la mezcla fotopolimerizable comprende además al menos un porógeno.

23. El método según la reivindicación 22, en el que el porógeno se selecciona de manera controlable para formar poros en la matriz.

24. El método según la reivindicación 22, que comprende además seleccionar una relación molar de monómero a porógeno, en la que el monómero asociado con la relación comprende al menos dicho monómero orgánico de metal y/o al menos un monómero precursor orgánico de metal a al menos dicho oligómero orgánico de metal.

25. El método según la reivindicación 12, en el que la irradiación comprende irradiar la mezcla con luz visible o ultravioleta.

26. El método según la reivindicación 12, que comprende además introducir un disolvente orgánico en la columna, incluyendo la columna la matriz porosa, sólida.

27. El método según la reivindicación 12, en el que la proporción comprende proporcionar un capilar o una estructura plana.

28. Un método de separación de una muestra de analitos, que comprende:

proporcionar una columna de separación que comprende un canal de separación y un medio de separación en el canal que comprende una matriz porosa, matriz porosa que comprende un soporte y una fase estacionaria, incluyendo el soporte un fotopolímero orgánico de metal e incluyendo la fase estacionaria una fase unida mediante enlaces covalentes a partículas de soporte o una pared interior de la columna;

introducir una muestra de analitos soportada en una disolución por la columna, en la que el medio concentra los analitos en la columna y

hacer que fluya una disolución por la columna, separando y eluyendo de ese modo los analitos.

29. El método según la reivindicación 28, en el que la introducción comprende aplicar un voltaje o una presión a la columna.

30. El método según la reivindicación 28, en el que la introducción comprende introducir una muestra de analitos soportada en una primera disolución por la columna, y la producción comprende hacer que fluya una segunda disolución por la columna, en la que la primera disolución es la misma disolución que la segunda disolución.

31. El método según la reivindicación 28, en el que la introducción comprende introducir una muestra de analitos soportada en una primera disolución por la columna, en la que la primera disolución comprende un disolvente de elución y la producción comprende hacer que fluya una segunda disolución por la columna, en la que la segunda disolución comprende el disolvente de elución y una concentración del disolvente de elución en la primera disolución es menor que una concentración del disolvente de elución en la segunda disolución.

32. El método según la reivindicación 31, en el que la introducción comprende introducir una muestra de analitos con una longitud de tapón de inyección mayor que una longitud de la columna.

33. El método según la reivindicación 28, en el que la introducción comprende producir apilamiento de muestra.

34. El método según la reivindicación 28, en el que la proporción comprende proporcionar un medio de separación que comprende una matriz porosa sin partículas cromatográficas.

35. El método según la reivindicación 28, en el que la proporción comprende proporcionar una columna de separación que comprende un capilar o una estructura plana.

36. El método según la reivindicación 28, en la que la proporción comprende proporcionar un medio de separación sin frita.