ES2345434T3 - Inmunizacion mediada por bacteriofagos. - Google Patents
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Abstract
Una formulación que comprende una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas específicas, y, por lo tanto, un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para usar en la provocación de una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico exógeno, en un organismo.
Description
Inmunización mediada por bacteriófagos.
La presente invención se refiere a formulaciones
que comprenden un bacteriófago modificado por ingeniería genética
para expresar una proteína/péptido inmunogénico, así como los usos
del bacteriófago modificado.
La vacunación genética es una nueva y
prometedora técnica en la que se usa ácido nucleico como el material
de vacuna (para una revisión véase Leitner y col. 2000. Vaccine 18:
765 - 777). Por el contrario, las vacunas tradicionales requieren
el uso de microbios patogénicos o sus componentes antigénicos. Hay
tres clases de vacunas "tradicionales": atenuadas, de virus
muertos/de subunidades y recombinantes. Las vacunas atenuadas son
microorganismos vivos con patogenicidad reducida y son por lo
general las vacunas más efectivas. No obstante, estas pueden
producir complicaciones si el agente de la vacuna crece
descontroladamente o revierte a una forma más patogénica. Las
vacunas de virus muertos o de subunidades requieren múltiples
inyecciones, con lo que aumenta el coste y se generan problemas
logísticos, y pueden contener microbios no completamente muertos.
Las vacunas recombinantes en las que un antígeno de un organismo
patogénico se modifica por ingeniería genética en un vector no
patogénico pueden ser efectivas pero las dificultades en la
consecución de la expresión del antígeno en una conformación nativa
limita con frecuencia la eficacia.
Para ser efectivas las vacunas necesitan
proporcionar una dosis suficiente de antígeno para periodos de
tiempo suficientemente prolongados para inducir una respuesta
secundaria (memoria). Esto representa un problema para las vacunas
tradicionales; las vacunas de ADN/ARN, no obstante, pueden producir
de forma efectiva copias de antígenos patogénicos durante
prolongados periodos de tiempo e inducir así respuestas de MHC de
clase I y II, como se observa con vacunas vivas. Sin embargo las
vacunas de ADN aún tienen que desarrollar todo su potencial. A
pesar de desencadenar una respuesta inmune humoral (anticuerpo)
medible, muchas vacunas de ADN muestran poca eficacia cuando se
exponen al organismo infectivo (Beard, CW & Mason, PW. 1998.
Nature Biotech. 16: 1325).
En la actualidad no está claro el mecanismo por
el que el ácido nucleico se introduce en células del huésped e
induce una respuesta inmune. La técnica más simple es administrar el
ADN como una inyección soluble, normalmente administrada por vía
intramuscular. Otras dos técnicas de uso común son la técnica de
"pistola génica", en la que se precipita ADN sobre partículas
de oro diminutas que son forzadas dentro de las células con una
corriente de helio, o transfección mediada por liposomas, en la que
se recubre ADN con lípido cargado positivamente para formar un
complejo que funde con la membrana de la célula huésped. Se cree que
las células que rodean el sitio de inmunización recogen el ADN,
expresan el(los) antígeno(s) codificado(s), y
son reconocidos como "extraños" por las células que presentan
antígeno (AP) del sistema inmune, que luego proceden a activar
células T y B desencadenando una respuesta inmune frente al
antígeno.
Las limitaciones parecerían ser: (1) la
expresión es relativamente ineficiente y no específica, expresándose
la mayor parte del ADN en células no AP; (2) la expresión de
antígenos extraños en células no AP conduciría eventualmente a la
muerte de esa célula debido a su reconocimiento como
"infectada" por parte del sistema inmune del huésped,
acortando así la respuesta inmune potencial; y (3) el ADN/ARN
desnudo es altamente sensible a la acción de nucleasas. Es probable
que la mayor parte del ácido nucleico usado para inmunización se
degrade poco después de la inmunización.
El documento WO 98/05344 describe un
procedimiento para la liberación de genes exógenos usando un vector
bacteriófago en el que el vector bacteriófago se ha visto
modificado para incluir en su superficie un ligando que se une a un
receptor en una célula diana. Por lo general se pretende que se usen
los vectores descritos para aplicaciones de terapia génica donde
los vectores se dirigen a tipos específicos de células. También se
hace mención al uso de los vectores bacteriófagos modificados para
liberar péptidos antigénicos.
El documento US 5.736.388 describe bacteriófagos
lamboides modificados para liberación de moléculas de ácido
nucleico en células eucarióticas en las que el bacteriófago se ha
visto modificado por incorporación de proteínas de fibra de cola
mutante o por incorporación de ligandos para receptores de células
eucarióticas.
El documento US 6.054.312 se refiere a
partículas de fago filamentosas que muestran un ligado en su
superficie, siendo el ligando una proteína de fusión con una
proteína de la cápsida del fago, conjugada de forma covalente con
partículas de fago, o complejada con partículas de fago
modificadas.
El documento WO 99/55720 también describe fagos
que se han modificado para mostrar externamente una proteína de
direccionamiento heteróloga para uso en liberación direccionada de
genes.
Sin embargo, las patentes/solicitudes de patente
anteriormente citadas describen todas ellas la modificación de la
superficie del fago, de modo que permita la liberación dirigida de
ácido nucleico a células específicas, por lo general para fines de
terapia génica.
De Berardinis y col (Nature Biotechnology 2000,
vol. 18 pág. 873) muestran la inducción de una respuesta de células
T fuerte por medio de bacteriofagos de ADN que muestran epitopes de
VIH incorporados en la proteína de envoltura principal.
Una serie de documentos (Ishiura, M. y col,
Molec. And Cell. Biol., páginas 607 - 616, 1982; Aujame, L. y col.,
Biotechniques, 28 páginas 1202 - 1213, 2000; Horst, J. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci., 72, páginas 3531 - 3535, 1975; Jkayama y Dery,
Molec. y Cell. Biol. 5, páginas 1136 - 1142, 1985; y Srivatsan, E. y
col, 38, páginas 227 - 234, 1984) se refieren al uso de fagos para
transfectar células de mamífero cultivadas y expresar proteínas en
su interior. Sin embargo, no hay sugerencia alguna de que se podrían
aplicar in vivo, o usarse en el desarrollo de vacunas.
Es un objeto de la presente invención solventar
y/o mitigar al menos una de las desventajas anteriormente
citadas.
En un primer aspecto la presente invención
proporciona una formulación como se define en la reivindicación
1.
A diferencia de las divulgaciones previas,
véanse por ejemplo los documentos WO 98/05344, US 5.736.388, US
6.054.312 y WO 99/55720, se tiene que apreciar que el bacteriófago
de superficie de la presente invención no se ha modificado para
comprender péptidos/proteínas exógenas (es decir péptidos/proteínas
no presentes normalmente) en la superficie del fago, diseñado para
dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos específicos
de células. Se debe entender por lo tanto que la superficie del
bacteriófago se puede modificar para comprender péptidos/proteínas
exógenas no diseñadas para dirigir el fago a receptores en la
superficie de tipos específicos de células.
Los presentes inventores han observado que el
bacteriófago que no se ha visto modificado para comprender péptidos
o ligandos de fijación de diana en la superficie de la partícula de
bacteriófago son recogidos por células AP. Así pues, se plantea que
el bacteriófago usado de acuerdo con la presente invención sea
reconocido como "extraño" y por lo tanto se procese de forma
habitual por parte de un sistema inmune del huésped. Además
modificando el genoma del bacteriófago para incluir ácido nucleico
exógeno capaz de codificar un péptido/proteína extraño, que se
trata se de un péptido/proteína normalmente no presente en un
huésped mamífero seleccionado, se desencadena una respuesta inmune
para esta proteína extraña. Por tanto, el ácido nucleico que
codifica el péptido/proteína extraño se expresa (en una célula que
presenta antígeno u alguna otra) y se presenta en la superficie de
la célula AP. Se tiene que observar que la respuesta inmune puede
ser una respuesta inmune humoral (es decir, de anticuerpo) y/o
respuesta inmune celular.
El ácido nucleico exógeno se refiere a un
polinucleótido de origen no natural que es capaz de ser expresado
en forma de un péptido o proteína heterólogo, que se trata de un
péptido o proteína que no se expresa normalmente o se expresa a
niveles biológicamente significativos en un bacteriófago de origen
natural. El péptido o proteína expresado se expresa a un nivel
suficiente para facilitar una respuesta inmune en un huésped al que
se ha presentado la vacuna.
Se debe apreciar que la presente invención se
puede aplicar a la preparación de una vacuna para prácticamente
cualquier enfermedad infecciosa, siempre que se pueda reforzar una
respuesta inmunoprotectora adecuada frente a una proteína o
proteínas de un agente infeccioso. Ejemplos de enfermedades
adecuadas incluyen vacunación directamente frente al agente que
provoca la enfermedad, o de forma alternativa, vacunación frente al
vector que porta la enfermedad. Tales agentes o vectores
infecciosos incluyen virus, bacterias, hongos, levadura, protozoos,
helmintos, insectos y encefalopatías espongiformes transmisibles. La
presente invención sería aplicable a enfermedades infecciosas tanto
de humanos como de animales. Son bien conocidas las listas de
enfermedades adecuadas por los especialistas en la técnica y se
encuentran ejemplos en el O.I.E. Manual of Standards and Diagnostic
Tests 3ª edición, OIE, París 1996, Topley & Wilson's Principles
of Bacteriology, Virology and Immnunity 8ª edición, Eds. Parker M.
T. y Collier L.H., volumen IV (índice), Edward Arnold, Londres 1990,
The Zoonoses: Infections Transmitted from Animals to Man. Bell J.
Cl y col., Edward Arnold, Londres 1988 y Parasitology: The Biology
of Animal Parasites 6ª ed. Noble E.R. y col., Lea & Febiger,
Filadelfia, 1989. Además, la presente invención se podría usar para
provocar una respuesta inmune frente a células cancerígenas por
medio de la expresión de un antígeno específico de células
cancerígenas como la proteína de la vacuna.
La presente invención proporciona por tanto un
modo de encapsulamiento de ácido nucleico exógeno, por ejemplo, ADN
dentro de una matriz estable con el fin de protegerlo, por ejemplo,
de nucleasas presentes por ejemplo en células. Las proteínas
"extrañas" en la superficie del bacteriófago permiten dirigir
la recaptación de ácido nucleico específicamente a células que
presentan antígeno (AP). Sin pretender unirse a teoría alguna se
espera que la partícula de bacteriófago sea reconocida como un
antígeno extraño. De este modo toda la partícula es recogida
directamente por las células que presentan antígeno del sistema
inmune del huésped, donde se elimina la envoltura proteica,
liberando el ADN que se puede mover dentro del núcleo y ser
expresado. Se cree que este procedimiento es eficiente debido a que
la expresión de ADN y la subsiguiente producción de polipéptido
deberían tener lugar solamente en células AP; la ruta óptima para
inducir una respuesta inmune.
Por lo general, el término "polipéptido" se
refiere a una cadena o secuencia de aminoácidos que muestran una
actividad antigénica y no se refiere a una longitud específica del
producto como tal. Si se requiere, el polipéptido se puede
modificar in vivo y/o in vitro, por ejemplo, mediante
glicosilación, amidación, carboxilación, fosforilación y/o escisión
post-translacional, entre otros, están comprendidos
de este modo péptidos, oligo-péptidos, proteínas y
proteínas de fusión. Naturalmente los especialistas en la técnica
apreciarán que un polipéptido modificado debería retener función
fisiológica, es decir, ser capaz de desencadenar una respuesta
inmune.
El bacteriófago para usar de acuerdo con la
presente invención comprende un promotor eucariótico y,
preferiblemente, otros reguladores de transcripción/traducción
apropiados tales como promotores, potenciadores, terminadores y/o
similares. De forma típica el promotor eucariótico puede ser CMV,
SV40, timidina quinasa, promotor RSV o similares. De forma
conveniente el promotor puede ser un promotor constitutivo. No
obstante se pueden usar también promotores controlables conocidos
por los especialistas en la técnica. Por ejemplo se pueden diseñar
construcciones que comprenden el ácido nucleico exógeno bajo control
de un promotor constitutivo y un promotor controlable. De esta
forma puede ser posible provocar la expresión de ácido nucleico
exógeno inicialmente por medio del promotor constitutivo y en
segundo lugar mediante expresión del promotor controlable. Esto
puede dar lugar a una respuesta inmune más fuerte.
Un ejemplo de un bacteriófago adecuado es lambda
(\lambda). Actualmente el bacteriófago \lambda se usa como un
vector de clonación durante los procedimientos de manipulación de
ADN rutinarios. Para éstos, el ADN se purifica fuera de la
estructura del fago. Sin embargo, una partícula de fago \lambda
intacta cumple los criterios listados anteriormente; el ADN está
contenido dentro de una matriz proteica protectora que es reconocida
como un antígeno extraño por el sistema inmune del huésped. El fago
\lambda infecta normalmente la bacteria E. coli, y se cree
que su ADN es "inerte" en una célula eucariótica (es decir, no
será expresado). Sin embargo si se incorpora un promotor
eucariótico aguas arriba del gen de vacuna (o extraño) de interés,
entonces se debería producir la expresión de ese gen para
proporcionar un antígeno, es decir, proteína/péptido, si el ADN es
recogido por una célula de mamífero. Debido al uso extensivo como un
vector de clonación rutinario pueden existir variantes de
\lambda, incluyendo algunas con promotores eucarióticos fuertes
diseñados para dirigir la expresión en células de mamíferos.
Normalmente la sección revelante del vector \lambda se elimina
como ADN plásmido antes de manipulaciones genéticas posteriores: se
usará entonces ADN de plásmido muy purificado de un huésped de
E. coli para inmunización genética. Sin embargo, si se usa
para inmunización una partícula de fago \lambda intacta que
contiene un promotor eucariótico y el gen de vacuna (es decir,
exógeno) de interés, esta es recogida por células AP. Después de la
eliminación de la envoltura proteica se plantea que tenga lugar la
producción de antígeno directamente dentro de la célula AP y se
presente el antígeno en la superficie de las células AP de tal
forma que se induzca una respuesta inmune. En este caso sólo se
requiere el procedimiento de purificación más básico para producir
partículas de fago fácilmente para inmunización. Una ventaja
adicional de uso de \lambda en comparación con los vectores de
clonación de plásmido es que pueden contener tamaños de inserción
mucho mayores.
Otros bacteriófagos adecuados son fago p1, fagos
T (por ejemplo, T1 a T7), Mu, fd, o M13, así como también fago
filamentoso.
Los bacteriófagos preferidos para usar de
acuerdo con la presente invención tienen la capacidad de incorporar
ácido nucleico exógeno y promotores, potenciadores, terminadores
asociados y/o similares de entre aproximadamente 0,5 y 100
kilobases. Por ejemplo fagos lambda conocidos pueden contener entre
9 a 50 kilobases. De esta forma es posible expresar copias simples
o múltiples de un péptido/proteína o una pluralidad de
péptidos/proteínas.
De forma típica los bacteriófagos para usar de
acuerdo con la presente invención son abortivos para el crecimiento
lítico en la flora bacteriana natural del huésped mamífero
seleccionado. Se conocen muchas cepas de "laboratorio" de
fagos, por ejemplo, aquellas que sólo son capaces de infectar cepas
bacterianas de "laboratorio" de tipo no salvaje. Adicional o
alternativamente los bacteriófagos pueden ser abortivos para el
crecimiento lítico de la cepa bacteriana huésped in vitro, o
requieren fagos auxiliares para crecer in vitro. Por tanto
los bacteriófagos pueden contener, por ejemplo, una mutación ámbar,
una mutación sensible a la temperatura o similares.
Por lo general se proporcionan medios para
potenciar la expresión del ácido nucleico exógeno en las células
AP. Tales medios incluyen procedimientos para ayudar a minimizar la
degradación del ácido nucleico y/o direccional al núcleo. Ejemplos
de tales medios incluyen el uso de cloroquina u otros inhibidores de
catabolismo enzimático lisosomal/endosomal para minimizar la
degradación de ácido nucleico y/o el uso de señales de localización
nuclear para dirigir el ácido nucleico al núcleo.
La formulación puede comprender además una
fuente de la proteína que se va a expresar por parte del
bacteriófago. De esta forma un huésped puede desencadenar una
respuesta inmune primaria respecto a la proteína y después de esto
desencadenar una respuesta inmune adicional o sostenida debido a que
la proteína es expresada y se presenta en la superficie de una
célula AP.
En una realización adicional el fago se podría
modificar para expresar también la proteína antigénica en la
superficie de las partículas de fago, siempre que dicha proteína no
dirija los bacteriófagos a los receptores en la superficie de tipos
de células eucarióticas específicas. Por ejemplo, es posible usar
partículas de bacteriófago M13 intacto como un vehículo vector. Los
tamaños de inserción para M13 son considerablemente más pequeños
que para \lambda, pero el uso de tecnología de "Phage
Display" (exhibición de fagos) (Hawkins, RE y col. 1992, J. Mol.
Biol. 226:889) significa que la partícula de fago puede portar una
porción de antígeno extraño condensado con su proteína de
envoltura. Por tanto se puede preparar una construcción en la que el
gen de vacuna se encuentre bajo control de un promotor procariótico
(por ejemplo, promotor Lac Z) y de un promotor eucariótico (por
ejemplo, promotor CMV): en caso de crecimiento en un huésped E.
coli, el promotor procariótico dirigirá la expresión del
antígeno de la vacuna y permitirá su incorporación a la envoltura de
M13 como un conjugado proteico, que debería desencadenar una
respuesta primaria fuerte tras la vacunación. Después de esto, tras
la recaptación por parte de células AP, se liberará el ADN y el
promotor eucariótico dirigirá la expresión duradera del antígeno de
vacuna desde dentro de la célula AP, manteniendo una respuesta
secundaria fuerte.
El ácido nucleico exógeno puede codificar al
menos un polipéptido(s) adicional, tal como un polipéptido
capaz de aumentar la respuesta inmune. El polipéptido adicional
puede ser una proteína o polipéptido adyuvante, tal como una
citoquina que codifica, por ejemplo, una interferona tal como
interferona \gamma (\gammaIFN), IL-2,
IL-6, IL-7, IL-12,
CMCSF y/u otras citoquinas/quimioquinas. Adicionalmente se pueden
usar "epítopos auxiliares", tales como antígeno del núcleo de
HepB para activar células B y desencadenar respuestas fuertes de
células T. De forma alternativa o adicional se pueden usar señales
inmunoestimulantes tales como oligodinucleótidos CpG.
El bacteriófago se puede administrar por
cualquier ruta adecuada, por ejemplo, por inyección y se puede
preparar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en
ampollas, o en recipientes para dosis múltiple. Los bacteriófagos
pueden estar presentes en formas tales como suspensiones, soluciones
o emulsiones en vehículos oleosos o preferiblemente acuosos. De
forma alternativa los bacteriófagos pueden estar en forma
liofilizada para reconstitución, en el momento de la liberación,
con un vehículo adecuado, tal como agua sin pirógenos estéril. De
esta forma se pueden añadir agentes estabilizantes, tales como
proteínas, azúcares, etc. cuando se liofilizan las partículas de
fago. Ambos líquidos así como también las formas liofilizadas que
son para reconstitución comprenderán agentes, preferiblemente
tampones, en cantidades necesarias para ajustar de forma adecuada el
pH de la solución inyectada. Para cualquier uso por vía parenteral,
de forma particular si la formación se tiene que administrar por
vía intravenosa, se debería controlar la concentración total de
solutos para preparar la preparación isotónica, hipotónica, o
ligeramente hipertónica. Se prefieren materiales no iónicos, tales
como azúcares, para ajustar la tonicidad, y se prefiere de forma
particular sacarosa. Cualquiera de estas formas puede comprender
además agentes de formulación adecuados, tales como almidón o
azúcar, glicerol o solución salina. Las composiciones pueden
contener por dosificación unitaria, ya sea líquida o sólida, del
0,1% al 99% de material bacteriófago.
En una presentación preferida, la formulación
para usar en forma de vacuna también puede comprender un adyuvante.
Los adyuvantes comprenden en general sustancias que refuerzan la
respuesta inmune del huésped de una forma no específica. En la
técnica se conocen una serie de adyuvantes diferentes. Ejemplos de
adyuvantes pueden incluir adyuvante completo de Freund, adyuvante
incompleto de Freund, liposomas, y niosomas como se describen, por
ejemplo, en el documento WO 90/11092, adyuvantes en emulsión basada
en aceite o agua-en-aceite minerales
o no minerales, citoquinas, secuencias de polinucleótidos no
estimulatorios cortas, por ejemplo, en ADN de plásmido que contiene
dinucleótidos CpG tales como los descritos por Sato Y. y col. (1996)
Science vol. 273 páginas 352 - 354; Krieg A.M. (1996) Trends in
Microbiol. 4, páginas 73 - 77.
El bacteriófago se puede asociar también con un
denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto o sustrato
al que se puede adherir el bacteriófago sin unirse de forma
covalente al mismo. Los compuestos "vehículo" típicos incluyen
partículas de oro, partículas de sílice tales como vidrio y
similares. Por tanto el bacteriófago para usar de acuerdo con la
invención se puede introducir en un organismo usando procedimientos
biolísticos tales como el procedimiento de bombardeo a alta
velocidad usando partículas de oro recubiertas como se describe en
la técnica (Williams R. S. y col. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU. 88 páginas 2726 - 2730; Fynan E. F. y col. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. volumen 90 páginas 11478 - 11482).
Además la vacuna puede comprender uno o varios
compuestos tensioactivos o emulsionantes adecuados, por ejemplo
Span o Tween.
El modo de administración de la vacuna para usar
de acuerdo con la invención puede ser cualquier vía adecuada que
libere una cantidad inmunoprotectora del virus de la invención al
sujeto. No obstante, la vacuna se administra preferiblemente por
vía parenteral por vía intramuscular o subcutánea a profundidad. Se
pueden emplear también, cuando sea conveniente, otros modos de
administración, tales como por vía mucosal (por ejemplo,
administración por vía rectal, oral, nasal o vaginal) o por otras
vías parenterales, es decir, por vía intradérmica, intranasal o
intravenosa. Se pueden desarrollar formulaciones para administración
por vía nasal y pueden comprender, por ejemplo, quitosán en forma
de adyuvante (Nat. Medicine 5(4) 387 - 92, 1999).
Se entenderá, no obstante, que el nivel de dosis
específico para cualquier organismo receptor determinado dependerá
de una variedad de factores que incluyen la edad, salud general y
sexo; el tiempo de administración; la vía de administración;
efectos sinérgicos con cualquier otro fármaco que se administre; y
el grado de protección que se busca. Por supuesto, la
administración se puede repetir a intervalos adecuados en caso
necesario.
La presente invención proporciona adicionalmente
el uso de una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13
o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender
péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago, diseñado
para dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de
células eucarióticas específicas, comprendiendo la partícula del
bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un
polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la
superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo
el control de un promotor eucariótico, para la preparación de un
medicamento para provocar una respuesta inmune profiláctica y/o
terapéutica contra el polipéptido exógeno expresado en un
organismo.
La presente invención proporciona adicionalmente
el uso de una partícula de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13
o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para comprender
péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago diseñado para
dirigir el fago a receptores en la superficie de tipos de células
eucarióticas específicas, comprendiendo la partícula del
bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno que codifica un
polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse en la
superficie de una célula que presenta antígeno de un organismo bajo
el control de un promotor eucariótico, para provocar una respuesta
inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido exógeno
expresado en un organismo.
La presente invención se describirá ahora
adicionalmente a modo de ejemplo y con referencia a las siguientes
figuras que muestran:
La figura 1 muestra las respuestas de
anticuerpos en ratones vacunados con la vacuna basada en
bacteriófagos de la presente invención, en comparación con
vacunación de ADN intramuscular convencional y un control;
La figura 2 muestra gráficos de curso temporal
que muestra respuestas ELISA de varias construcciones de hepatitis
administradas a ratones;
La figura 3 muestra la recaptación y expresión
de ADN extraño por medio de macrófagos in vitro;
La figura 4 muestra respuestas de anticuerpo
frente al antígeno MmmSc entero en ratones vacunados con genoteca
\lambda-MmmSC. Las respuestas de anticuerpo
totales frente MmmSC se sometieron a sonicación en extractos de
células enteras de ratones vacunados con genoteca de expresión de
MmmSC lambda (\lambdaMmmSC). Las respuestas se midieron con
ELISA. Las respuestas de cuatro ratones vacunados con \lambdaMmmSC
se muestran con líneas continuas. Una respuesta representativa de
un ratón de control se muestra con una línea de puntos.
Los tiempos de vacunación se muestran con las
flechas (día 0 y día 28);
La figura 5 muestra Inmunotransferencia (A) de
GFP purificado sondado con extracciones finales de ratones
inmunizados con \lambda-GFP (izquierda; 8
carriles, 1 por ratón), pEGFP-C1 de plásmido (medio;
6 carriles, 1 por ratón), y control positivo (conejo
anti-GFP). Los dos ratones restantes vacunados con
pEGFP-C1 se analizaron en una inmunotrasferencia
diferente y no revelaron una respuesta frente a GFP puro.
Inmunotransferencia (B) frente a proteínas \lambda con sueros de
transcurso de 3 animales representativos vacunados con
\lambda-GFP (izquierda) o
pEGFP-C1 (derecha);
Las figuras 6A y 6B muestran macrófagos
peritoneales de ratón incubados con vacunas de ADN y sondados con
antisueros especificos: A, magnificación x 10; B, magnificación x
40: i) sin vacuna. Sondados con anti-GFP; ii)
incubados con \lambda B1 (gen pdh de MmmSC) y sondados con
IgG anti-MmmSC); iii) incubados con
\lambda-GFP y sondado con
anti-GFP; y iv) incubados con pEGFP de plásmido y
sondados con anti-EGFP; y
Figura 7: medición con ELISA de señal
anti-GFP de macrófagos incubados con \lambdaEGFP,
pEGFP-C1 o un control que no expresa \lambda
(\lambdaCI^{857}). Se realizaron tres ensayos distintos para
macrófagos incubados con \lambdaEGFP (1) ó
pEGFP-C1 (2) y se muestran los valores medios y
desviaciones convencionales de las señales
anti-GFP. Se realizaron dos ensayos separados para
los controles negativos, éstos se representan gráficamente de forma
individual. El ensayo (3) muestra la única señal de anticuerpo
secundario contra \lambdaEGFP, dicho ensayo (4) muestra la señal
no específica de los anticuerpos primario y secundario frente a las
proteínas del bacteriófago \lambda.
Se construyó una genoteca de expresión de fagos
por medio de la clonación de fragmentos
semi-aleatorios (Tsp509I: corta en AATT) del
genoma de la cepa F38 de Mycoplasma capricolum subespecie
capripneumoniae (Mccp) en el sitio EcoRI del vector de expresión
lambda ZAP exprés (realizado por Stratagene). Este fago contiene una
secuencia promotora del citomegalovirus, y un promotor LacZ de tal
forma que las inserciones se pueden expresar tanto en células
procarióticas como eucarióticas.
La "genoteca" del ensayo usada, basada en
ADN de micoplasma probablemente proporciones resultados más escasos
en comparación con construcciones más adecuadas, y los resultados
obtenidos se deberían interpretar a la luz de esto. Es muy probable
que una construcción de genoteca más adecuada dé respuestas
infinitamente mejores. El ADN de micoplasma es muy rico en AT (ADN
de Mccp con AT al 75%). Así pues, es probable que a una frecuencia
elevada se produzca la expresión aberrante de secuencias similares
al promotor rico en AT. Además, la utilización del codón de ADN de
micoplasma es inusual; el codón para triptófano es UGA, que es un
codón de "parada" para la mayor parte de otros organismos
procarióticos y eucarióticos. Por lo tanto, las proteínas que
contienen triptófano no se expresarán de forma apropiada.
Adicionalmente, el presente ejemplo está basado en una genoteca no
fraccionada entera. Ésta incluye regiones no codificantes
intergénicas. Además, sólo 1:6 de las inserciones estarán en la
orientación correcta para dar como resultado la expresión. Por todas
estas razones, está claro que la inmensa mayoría de las
construcciones en la genoteca dará como resultado la no expresión de
proteínas (antígeno) después de la vacunación de "ADN".
Los cultivos a gran escala de fago se cultivaron
en placas de agar-agar, se recolectaron y las
partículas del fago se purificaron y se concentraron por medio de
una combinación de precipitación con polietilenglicol y
ultracentrifugación (Sambrook J, y col. 1989, Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.). La
mitad de la suspensión del fago se usó directamente para inocular un
grupo de ratones (vacuna de ADN de "Fago"). Se extrajo ADN de
la otra mitad de la suspensión del fago y se usó para inocular un
segundo grupo de ratones (vacuna de ADN "desnudo").
Se inyectó a dieciséis ratones por vía
intramuscular con 25 \mul de fago que contiene la genoteca F38
clonada a 4x10^{11} partículas/ml mezclado con 25 \mul de
adyuvante montanida ISA 206. Una muestra de este inmunogén se
tituló y se sembró en placas sobre un césped de E. coli para
asegurar que la adición de montanida no ha dañado de ninguna forma
las partículas del fago. Se inyectó de forma similar un segundo
conjunto de dieciséis ratones con 0,5 \mug de ADN extraído
(equivalente a la cantidad de ADN contenido dentro de la inyección
del fago entera) en un volumen total de 50 \mul de tampón SM. El
ADN se purificó usando Wizard lambda preps (Promega). Se inyectó un
grupo de 8 ratones con fago C1857 purificado en la forma descrita
para la genoteca del fago. Este es también un fago lambda y se usó
en forma de control negativo.
Se extrajo sangre previamente a los ratones
antes de ser inoculados en el día 0. En el día 34 se proporcionó
una inyección de refuerzo idéntica. En el día 72 los ratones se
estimularon con micoplasma entero, antes de ser exsanguinados en el
día 83. Se tomaron muestras de sangre cada dos meses, hasta que el
experimento concluyó. Se analizó la sangre por medio de ELISA
frente a las células enteras de las cepas F38 de Mycoplasma
capricolum. Tanto en los grupos de control del fago (cI857)
negativo como de control de ADN, no se observó una respuesta
significativa hasta la inyección final que contenía células enteras.
Por el contrario, los ratones inoculados con la genoteca del fago
mostraron una respuesta positiva significativa antes de que se
proporcionara la inyección final (Figura 1). Además, se examinó la
cantidad relativa de los diferentes subtipos de inmunoglobulina
presente en la extracción de sangre final. Se descubrió que en los
ratones vacunados con la genoteca del fago, la concentración
relativa de IgG a IgM era significativamente superior (Figura 2).
Los niveles altos de IgG son indicativos de una respuesta
secundaria, mientras que IgM es indicativo de una respuesta
primaria.
\vskip1.000000\baselineskip
También se examinó la recaptación de partículas
del fago directamente por medio de células que presentan antígeno.
En este caso, no se usó la genoteca Mccp \lambda entera. En su
lugar, se recogió un clon del fago que proporcionó una respuesta
positiva buena frente a antisuero Mccp de conejo policlonal cuando
se sembró en placas de E. coli (se indujo la expresión de la
proteína usando IPTG). El clon se amplificó y se purificó. También
se extrajo ADN de este fago como se ha descrito previamente. Las
muestras de partículas del fago enteras y de ADN de este clon se
añadieron a cultivos de macrófagos peritoneales de ratón. Para
extraer el macrófago, se inyectaron a dos ratones por vía
intraperitoneal con 2 ml de medio tioglicolato. 5 días después los
ratones se mataron y la cavidad peritoneal se lavó con 2 ml de
solución salina tamponada con magnesio/calcio libre de Hanks
(HB-SS). Estas células extraídas se sedimentaron y
se lavaron dos veces en HBSS y se llevó a cabo un recuento viable
en presencia de azul triptano. Se incubaron 10^{6} macrófagos a
37ºC en RPMI 1 ml que contiene suero fetal bovino al 10% (FBS)
durante 2 horas en placas de microtítulos de 24 pocillos para
permitir su adherencia. El sobrenadante que contiene células no
adherentes se eliminó y se añadió medio recién preparado. 10^{8}
partículas de fago de este clon particular se añadieron a un pocillo
y se extrajo 50 ng de ADN de este clon y se añadió a medio recién
preparado y se cultivó durante toda la noche a 37ºC. El fago que no
contenía inserciones y el ADN extraído de este fago "sin
inserciones" se usaron en forma de controles negativos.
Después de la incubación, los macrófagos se
colocaron a 4ºC para separarse de la placa de microtítulos, antes
de recolectarse y lavarse en HBSS. 10^{5} células se estiraron
después sobre un portaobjetos de vidrio y se llevó a cabo una
cito-tinción usando antisuero Mccp de conejo
policlonal. Se usó una fracción de IgG purificado. Este antisuero
no se purificó adicionalmente (es decir, era un antisuero
polivalente activado contra Mccp entero, y de este modo reconoce un
intervalo amplio de proteínas de Mccp y otros contaminantes. Como
tal, la relación señal a ruido probablemente sea mucho menor de lo
que se espera para un suero monovalente o un anticuerpo monoclonal
activado contra el clon particular según el ensayo). Se usó un
anticuerpo biotinilado secundario (inmunoglobulina entera de cabra
anti-conejo) junto con un sistema basado en DAB
avidina/biotina/peroxidasa para visualizar la proteína
expresada.
Aunque se observaron grandes antecedentes
(probablemente debido al uso de un anticuerpo primario policlonal
no específico, y el uso de un anticuerpo secundario activado contra
inmunoglobulina de conejo entera en lugar de fracción de IgG) se
observó una tinción mas intensa, específica, en los cultivos
celulares inyectados con fago que contiene inserciones cuando se
compara con los controles negativos (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó una genoteca de expresión diferente,
y se examinaron las condiciones de vacunación modificadas. Se
construyó una genoteca de expresión de fago por medio de la
clonación de fragmentos semi-aleatorios
(Tsp509I: corta en AATT) del genoma de la cepa T_{1}44 del
biotipo de colonia pequeña de Mycoplasma mycoides subespecie
mycoides (MmmSC) en el sitio EcoRI del vector de expresión lambda
ZAP. El sistema del vector, clonación y procedimiento de
purificación del fago seguidos fueron similares a los descritos en
el Ejemplo 1, salvo algunas diferencias en el procedimiento
ocurridas durante la fase de vacunación (vía de administración,
presencia de adyuvante, programa de inmunización). Se analizaron
diez ratones por grupo (cepa BALB/C, libre de patógenos
específicos, edad 10 - 12 semanas). Se inyectaron los ratones por
vía subcutánea (sin adyuvante) con fago 50 \mul que contenía la
genoteca de MmmSC a 1,7 x 10^{11} partículas por ml. Los ratones
de control no se inyectaron. Se extrajo sangre de los ratones
previamente antes de vacunarse en el día 0. En el día 28 se
proporcionó una inyección de refuerzo idéntica. Se tomaron muestras
de sangre en los días 0, 21 y 42. Se analizó la sangre extraída por
medio de ELISA frente a extractos de célula entera sonicada de la
cepa T_{1}44 de MmmSC. Ninguno de los 10 ratones de control (no
inmunizados) mostró una respuesta inmune. Dos de los diez ratones
inmunizados con la genoteca de expresión de MmmSC entera mostraron
una respuesta inmune significativa, mientras que otros dos
mostraron una respuesta de nivel inferior (Figura 4).
Se usó una construcción de ADN que expresa un
antígeno específico (proteína verde fluorescente [abreviado en
inglés, GFP]) para vacunar ratones y se midió la respuesta inmune.
El antígeno de la vacuna se presentó en el sistema inmune bien en
forma de pEGFP-C1 de ADN de plásmido purificado (ADN
"desnudo") o bien en forma de una vacuna de GFP de
bacteriófago (\lambda-GFP). Se construyó
X-GFP a partir de pEGFP-C1 de
plásmido (Clonetech, catálogo nº 6084-1) y NM459
(obtenido de Noreen Murray). NM459 es un derivado de cl^{857} nin
de la construcción XII del fago de: Murray y Murray (1974).
Manipulation and restriction targets in phage \lambda to form
chromosomes for DNA fragments. Nature, 251 páginas 476 - 481.
El AND de pEGFP-C1 se digirió
con EcoRI y la enzima se inactivó por calor antes de la extracción
con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y precipitación con
etanol. El ADN de NM459 también se extrajo y digirió con EcoRI.
Después la enzima de restricción se inactivó por calor y el
fragmento se desfosforiló (con fosfatasa alcalina de intestino de
ternero) para evitar la auto-ligación durante los
pasos subsiguientes. Esta enzima también se inactivó por calor y el
ADN se extrajo con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y se
precipitó el etanol. Después, estos fragmentos se ligaron y el ADN
clonado se empaquetó in vitro usando un sistema de
empaquetamiento de ADN Promega Packagene Lambda (Cat. nº K3154).
Después del empaquetamiento, se recogieron 6
clones de placas agar LB. Estas se amplificaron, se extrajo ADN y
se digirió con EcoRI para confirmar la presencia de la inserción.
Después, uno de estos clones se amplificó en una escala más grande
y se concentraron depósitos preparados para la vacunación de
ratones.
Los ratones eran de la cepa C57, de 8 a 10
semanas de edad, 8 ratones por grupo. El grupo 1 se inyectó por vía
intramuscular en el día 0 y día 14 con 1 \mug de ADN de plásmido
(pEGFP-C1) en 0,1 ml de tampón T.E. El grupo 2
inyectó por vía intramuscular en el día 0 y día 14 con 50 \mul de
\lambda-GFP a 10^{11} partículas por ml. Se
extrajo sangre de los ratones en el día 0 (antes de la vacunación),
día 14 (antes de la segunda vacunación), y día 28. Las extracciones
de sangre se analizaron por medio de inmunotransferencia para
detectar una respuesta inmune de tamaño específico frente a GFP
recombinante, obtenido de Clontech, Cat. nº 8360 - 2 (Figura 5A) o
proteínas del bacteriófago \lambda (Figura 5B). Dos de 8 ratones
vacunados con \lambda-GFP mostraron una respuesta
inmune fuerte frente a GFP en el día 28 (Figura 5A). Otro ratón
mostró una respuesta en el día 14 que se perdió en el día 28 (los
datos no se muestran); es posible que las muestras del día 14 y del
día 28 para este ratón se mezclaran. Del grupo vacunado con
pEGFP-C1 de plásmido, sólo 1 animal mostró una
respuesta frente a GFP. La señal era mucho más débil que la señal
vista desde los dos animales positivos que se habían vacunado con
\lambda-EGFP. Todos los ratones vacunados con
\lambda-EGFP mostraron una respuesta inmune
fuerte frente a las proteínas del bacteriófago \lambda en los días
14 y 28, mientras que ninguno de los ratones vacunados con
pEGFP-C1 de plásmido mostraron una respuesta (Figura
5B. Sólo se muestran las extracciones de sangre de algunos
animales, ya que se observaron resultados idénticos con todos los
animales de ambos grupos).
También se examinó la recaptación de partículas
del fago directamente por medio de células que presentan antígeno.
También se analizó pEGFP-C1 de plásmido como
control. Para este experimento también se analizaron
\lambda-GFP (descrito en el Ejemplo 3) y otra
construcción, AB1. \lambdaB1 se aisló de la genoteca de expresión
de MmmSC \lambda descrita en el Ejemplo 3. \lambdaB1 contenía
el gen piruvato deshidrogenasa (pdh) de MmmSC (que codifica una
proteína de 55kD) y otros diversos marcos de lectura abiertos no
identificados. Cuando se escindió este clon en forma de plásmido y
se transformó en Escherichia coli, se identificaron dos
proteínas cuando estos extractos de células se procesaron en geles
de SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa y se
sondaron con antisuero hiperinmune de conejo activado contra MmmSC.
Los pesos moleculares de estas dos proteínas eran 55kD y 29kD, y no
se observó que usaran extractos de Escherichia coli de
control (que contienen solamente el plásmido, sin la inserción de
pdh), o cuando los extractos que contienen pdh -
plásmido de Escherichia coli se sondaron con antisuero de
conejo de control.
Las muestras de ADN de plásmido y las partículas
del fago entero de estos clones se añadieron a cultivos de
macrófagos peritoneales de ratón. Para extraer los macrófagos, se
inyectaron dos ratones por vía intraperitoneal con 2 ml de medio de
tioglicolato. Cinco días después los ratones se mataron y se lavó la
cavidad peritoneal con 2 ml de solución salina tamponada con
magnesio/calcio libre de Hanks (HBSS). Estas células extraídas se
sedimentaron y se lavaron dos veces en HBSS y se llevó a cabo un
recuento viable en presencia de azul triptano. Se incubaron
10^{6} macrófagos a 37ºC en 1 ml de RPMI libre de suero durante 2
horas en placas de microtítulos de 24 pocillos para permitir su
adherencia. El sobrenadante que contiene células no adherentes se
eliminó, las células adherentes se lavaron dos veces en PBS a 37ºC,
y se añadió RPMI 1 ml que contiene suero fetal bovino (FBS) al 10%.
10^{9} partículas de fago de clones \lambda-GFP
y \lambdaB1 se añadieron a pocillos individuales, o
alternativamente, se añadió 100 ng de pEGFP-C1 de
plásmido purificado en tampón T.E. Las células se recubrieron con
medio recién preparado y se cultivaron durante toda la noche a
37ºC.
Después de la incubación los macrófagos se
colocaron a 4ºC durante 1 hora para permitir que se separaran de la
placa de microtítulos antes de que se recolectaran y se lavaran en
HBSS. Después se estiraron 5 x 10^{5} células sobre un
portaobjetos de vidrio y se llevó a cabo una
cito-tinción usando o bien antisuero MmmSC de
conejo policlonal, dilución 1: 1000 en PBS (fracción IgG
purificada), o bien antisuero GFP de conejo policlonal, dilución 1:
5000 (obtenido de Invitrogen, Cat. nº R970 - 01). Ni el antisuero se
purificó con afinidad contra GFP ni el producto del gen pdh
de MmmSC, y por lo tanto se puede esperar que se proporcione un
fondo relativamente alto. Se usó un anticuerpo biotinilado
secundario (inmunoglobulina entera de cabra
anti-conejo) junto con un sistema basado en DAB
avidina/biotina/peroxidasa para visualizar la proteína
expresada.
Aunque se observaron algunas señales de fondo
(probablemente debido al uso de anticuerpo primario policlonal no
específico, y el uso de un anticuerpo secundario activado contra la
inmunoglobulina de conejo entera en lugar de fracción de IgG), se
observó una tinción mas intensa, específica, en los cultivos
celulares inyectados con fago que contiene inserciones (GFP y B1)
cuando se compara con los controles (Figura 6A en magnificación x
10, y Figura 6B, magnificación x 40). Esta tinción fue más notable
con placas de color debido a la diferencia de la señal entre la
tinción marrón específica del sistema peroxidasa/DAB visto con una
señal positiva, en comparación con la tinción violeta general de
los macrófagos. Para confirmar que la tinción no se debía al
antisuero que se une a las partículas del bacteriófago lambda o ADN
de pEGFP-C1 que se añadieron a los macrófagos antes
de la visualizacion, se dirigió el siguiente experimento. Las
partículas del fago (10^{9}) o ADN de plásmido
pEGFP-C1 (500 ng) se depositaron en un filtro de
nitrocelulosa, y se incubaron con el mismo antisuero primario y
secundario usado en los experimentos mostrados en las Figuras 6A y
6B. Cuando se desarrolla usando el mismo procedimiento, no se ve
ninguna tinción, indicando que cualquier señal observada en estas
figuras no se puede deber a la unión no específica del antisuero a
bien el bacteriófago \lambda o ADN de plásmido.
También se examinó la recaptación de partículas
del fago y expresión de la vacuna directamente por medio de células
que presentan antígeno usando un sistema ELISA cuantitativo. Para
este experimento se analizaron h-GFP (descrito en
los Ejemplos 4 y 5) y pEGFP-C1 de plásmido. También
se analizó una construcción convencional que no expresa el
bacteriófago \lambda en forma de control negativo
(\lambda-cl^{857}). Los macrófagos (como se
describe en el Ejemplo 4) se eliminaron del nitrógeno líquido, se
lavaron dos veces en medio de RPMI libre de suero/antibiótico, se
volvieron a suspender en el mismo medio y se añadieron 10^{6}
células por pocillo a los pocillos de una placa de cultivo de 96
pocillos. Después los macrófagos se incubaron a 37ºC durante dos
horas para permitir que las células se unieran, antes de eliminar el
medio y se añadió 100 \mul de RPMI recién preparado (que contenía
suero fetal de ternero + antibióticos al 10%) a cada pocillo. Se
añadió 10^{9} fago (o \lambdaEGFP o control negativo
\lambda-cl^{857}) o 50 ng de ADN de pEGFP por
pocillo de ensayo. Después se incubó la placa de ensayo a 37ºC
durante toda la noche con CO_{2} al 5%.
Después de la incubación los pocillos se lavaron
cuatro veces en PBS, y la producción de antígenos se midió por
medio de ELISA usando un sistema de detección de biotina/avidina ABC
de Vector labs (Cat. nº PK-6200). El antisuero
primario era anti-GFP de conejo (Invitrogen). El
anticuerpo secundario unido se cuantificó usando comprimidos de
diclorhidrato de o-fenilendiamina de SIGMA (Cat. nº
P-9187). Los resultados se leyeron en las placas de
cultivo a 492 nm y se muestran en la Figura 7. El valor medio de
ELISA observado para los macrófagos proporcionados \lambda EGFP
era 2,03 \pm 0,25, significativamente superior al observado para
los macrófagos proporcionados pEGFP-C1 (valor medio
1,54 \pm 0,08, p <0,05). El valor observado con
pEGFP-C1 obviamente no era superior al observado
con los dos ensayos de control negativo, aunque como éstos solamente
se llevaron a cabo por duplicado no se puede realizar una
comparación estadística.
Claims (20)
1. Una formulación que comprende una partícula
de bacteriófago lambda, P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya
superficie no se ha modificado para comprender péptidos/proteínas
exógenos en la superficie del fago, diseñado para dirigir el fago a
receptores en la superficie de tipos de células eucarióticas
específicas, y, por lo tanto, un vehículo farmacéuticamente
aceptable, comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula
de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz
de expresarse y presentarse en la superficie de una célula que
presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor
eucariótico, para usar en la provocación de una respuesta inmune
profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido codificado por
la molécula de ácido nucleico exógeno, en un organismo.
2. La formulación de acuerdo con la
reivindicación 1 para su uso como una vacuna.
3. La formulación de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2 que es capaz de provocar una respuesta inmune
celular y/o humoral.
4. La formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 2 ó 3 para usar en la vacunación contra un
virus, bacterias, hongos, levadura, protozoos, helmintos, insectos o
encefalopatías espongiformes transmisibles.
5. La formulación de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para usar en la provocación de una
respuesta inmune contra una célula cancerígena por medio de la
expresión de un antígeno específico de células cancerígenas.
6. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el bacteriófago comprende
reguladores de transcripción y/o traducción para facilitar la
expresión del polipéptido.
7. La formulación de acuerdo con la
reivindicación 6 que comprende un promotor eucariótico, tal como
CMV, SV40, timidina quinasa o promotor RSV.
8. La formulación de acuerdo con la
reivindicación 6 que comprende el ácido nucleico exógeno bajo
control de un promotor constitutivo y un promotor controlable.
9. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el bacteriófago es capaz de
expresar copias simples o múltiples de un péptido o una pluralidad
de polipéptidos.
10. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el bacteriófago es abortivo
para el crecimiento lítico en la flora bacteriana natural del
huésped mamífero seleccionado.
11. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente que además comprende inhibidores de
catabolismo enzimático lisosomal/endosomal y/o señales de
localización nuclear.
12. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente que además comprende una cantidad del
polipéptido que es expresado por el bacteriófago.
13. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el bacteriófago se ha modificado
para expresar un polipéptido en la superficie de la partícula del
fago, no estando diseñado dicho polipéptido para dirigir el fago a
los receptores en la superficie de los tipos de células eucarióticas
específicas.
14. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el ácido nucleico exógeno
también codifica un polipéptido capaz de aumentar la respuesta
inmune.
15. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente que además comprende un adyuvante.
16. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente en la que el bacteriófago está asociado a
un vehículo.
17. La formulación de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente para usar en la profilaxis y/o tratamiento
de una enfermedad en un humano o animal.
18. Uso de una partícula de bacteriófago lambda,
P1, T, Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha
modificado para comprender péptidos/proteínas exógenos en la
superficie del fago diseñado para dirigir el fago a receptores en
la superficie de tipos de células eucarióticas específicas,
comprendiendo la partícula del bacteriófago una molécula de ácido
nucleico exógeno que codifica un polipéptido que es capaz de
expresarse y presentarse en la superficie de una célula que
presenta antígeno de un organismo bajo el control de un promotor
eucariótico, para la preparación de un medicamento para provocar una
respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica contra el polipéptido
exógeno expresado en un organismo.
19. Una partícula de bacteriófago lambda, P1, T,
Mu, fd, M13 o filamentoso, cuya superficie no se ha modificado para
comprender péptidos/proteínas exógenos en la superficie del fago,
diseñado para dirigir el fago a receptores en la superficie de
tipos de células eucarióticas específicas, comprendiendo la
partícula del bacteriófago una molécula de ácido nucleico exógeno
que codifica un polipéptido que es capaz de expresarse y presentarse
en la superficie de una célula que presenta antígeno de un
organismo bajo el control de un promotor eucariótico, para usar en
la provocación de una respuesta inmune profiláctica y/o terapéutica
contra el polipéptido exógeno expresado codificado en un
organismo.
20. Uso de una partícula de bacteriófago de
acuerdo con las reivindicaciones 18 ó 19 en la que la respuesta
inmune es para vacunar el organismo.
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