ES2345833T3

ES2345833T3 - Proteinas proteina-quinasa relacionadas con el estres y metodos de utilizacion en las plantas.

Info

Publication number: ES2345833T3
Application number: ES06023948T
Authority: ES
Inventors: Oswaldo Da Costa E Silva; Ruoying Chen; Hans J. Bohnert; Nocha Van Thielen; Rodrigo Sarria-Millan
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2010-10-04
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: WO2001077356A3; ATE355383T1; WO2001077311A2; US20070192908A1; US7259294B2; EP1783229A2; CA2767239A1; US6867351B2; US20040148658A1; EP1881073A3; US7858847B2; WO2002046442A3; US6710229B2; US20100011466A1; EP1335986A2; US7482510B2; US20090100540A1; US7166767B2; US7456337B2; DE60141547D1

Abstract

Una célula de planta de una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una casete de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y un promotor apropiado enlazado operativamente, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de las células de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

Description

Proteínas proteína-quinasa relacionadas con el estrés y métodos de utilización en las plantas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a células de plantas y plantas de monocotiledóneas o dicotiledóneas que comprenden un ácido nucleico que codifica CPK-2 que confiere tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula o planta, y a métodos correspondientes.

Técnica anterior

Los estados de estrés ambiental abiótico, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por calor y estrés por frío, son factores limitantes importantes del crecimiento y la productividad de las plantas. Las pérdidas de cosechas y las pérdidas de rendimiento de cosecha en cosechas importantes tales como arroz, maíz dulce (maíz común) y trigo causadas por estos estados de estrés representan un factor económico y político importante y contribuyen a la escasez de alimentos en muchos países subdesarrollados.

Las plantas se ven expuestas típicamente durante su ciclo vital a condiciones de contenido de agua ambiental reducido. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Adicionalmente, la mayoría de las plantas de cosecha son muy sensibles a concentraciones más altas de sal en el suelo. La exposición continua a sequía y contenido elevado de sal causan alteraciones importantes en el metabolismo de las plantas. Estos grandes cambios en el metabolismo conducen finalmente a la muerte celular y por consiguiente a pérdidas de rendimiento.

El desarrollo de plantas tolerantes al estrés es una estrategia que tiene el potencial de resolver o mediar al menos algunos de estos problemas. Sin embargo, las estrategias tradicionales de reproducción de las plantas para desarrollar nuevas líneas de plantas que exhiban resistencia (tolerancia) a estos tipos de estrés son relativamente lentas y requieren líneas resistentes específicas para cruzamiento con la línea deseada. Los recursos limitados de germoplasma para tolerancia al estrés e incompatibilidad en los cruzamientos entre especies de plantas remotamente emparentadas representan problemas importantes encontrados en la reproducción convencional. Adicionalmente, los procesos celulares que conducen a la tolerancia a la sequía, el frío y la sal en plantas modelo tolerantes a la sequía y/o la sal son de naturaleza compleja e implican mecanismos múltiples de adaptación celular y numerosos caminos metabólicos. Esta naturaleza multi-componente de la tolerancia al estrés no sólo ha hecho infructuosa en gran parte la reproducción orientada a la tolerancia, sino que ha limitado también la posibilidad de modificar por bioingeniería plantas tolerantes al estrés utilizando métodos biotecnológicos.

Los estados de estrés por sequía, frío y sal tienen un tema común importante para el crecimiento de las plantas, que es la disponibilidad de agua. Las plantas se ven expuestas durante todo su ciclo vital a condiciones de contenido de agua reducido en el medio ambiente. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse a sí mismas contra estas condiciones de desecación. No obstante, si la severidad y duración de las condiciones de sequía son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo de las plantas, el crecimiento y el rendimiento de la mayoría de las plantas de cosecha son profundos. Dado que un contenido elevado de sal en algunos suelos da como resultado menos agua disponible para captura por las células, su efecto es similar a los observados en condiciones de sequía. Adicionalmente, a temperaturas de helada, las células vegetales pierden agua como resultado de la formación de hielo que comienza en el apoplasto y sustrae agua del simplasto. Por regla general, los mecanismos de respuesta molecular de una planta a cada una de estas condiciones de estrés son comunes, y las proteína-quinasas juegan un papel esencial en estos mecanismos moleculares.

Las proteína-quinasas representan una super-familia y los miembros de esta familia catalizan la transferencia reversible de un grupo fosfato del ATP a las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina y tirosina en las proteínas diana. Las proteína-quinasas son elementos primarios en los procesos de señalización de las plantas y se ha informado que desempeñan papeles cruciales en la percepción y transducción de señales que permiten que una célula (y la planta) respondan a los estímulos ambientales. En particular, las proteína-quinasas receptoras (RPKs) representan un grupo de proteína-quinasas que activan un sistema complejo de caminos de señalización intracelulares en respuesta al ambiente extracelular (Van der Gear et al., 1994 Annu. Rev. Cell Biol. 10: 251-337). Las RPKs son proteínas transmembranales de un solo paso que contienen una secuencia señal amino-terminal, dominios extracelulares singulares para cada receptor, y un dominio citoplásmico de quinasa. La fijación de ligandos induce la homo- o hetero-dimerización de las RPKs, y la proximidad estrecha resultante de los dominios citoplásmicos da como resultado la activación de las quinasas por transfosforilación. Aunque las plantas tienen muchas proteínas similares a RPKs, no se ha identificado ligando alguno para estas quinasas semejantes a receptores (RLKs). La mayoría de las RLKs de las plantas que se han identificado pertenecen a la familia de las serina/treonina (Ser/Thr)-quinasas, y la mayor parte de ellas tienen repeticiones extracelulares ricas en leucina (Becraft, PW. 1998, Trends Plant Sci. 3: 384-388).

Otro tipo de proteína-quinasa es la proteína-quinasa dependiente de Ca+ (CDPK). Este tipo de quinasa tiene un dominio semejante a calmodulina en el término COOH, que permite la respuesta a señales de Ca+ directamente sin que esté presente calmodulina. Normalmente, las CDPKs son las proteína-quinasas Ser/Thr más predominantes encontradas en las plantas superiores. Aunque sus papeles fisiológicos siguen sin estar claros, las mismas son inducidas por frío, sequía y ácido abscísico (ABA) (Knight et al., 1991 Nature 352:524; Schroeder, JI y Thuleau, P., 1991 Plant Cell 3: 555; Bush, D.S., 1995 Annu. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 46: 95; Urao, T. et al., 1994 Mol. Gen. Genet. 244: 331).

Otro tipo de mecanismo de señalización implica miembros de la familia de las proteína-quinasas SNF1 serina/treonina conservadas. Estas quinasas juegan papeles esenciales en la señalización de glucosa y estrés de los eucariotas. Las quinasas semejantes a SNF1 de las plantas participan en el control de enzimas metabólicas fundamentales, que incluyen HMGR, nitrato-reductasa, sacarosa-sintasa, y sacarosa-fosfato-sintasa (SPS). Datos genéticos y bioquímicos indican que la regulación dependiente del azúcar de las quinasas SMF1 implica varios otros componentes sensoriales y de señalización en levaduras, plantas y animales.

Adicionalmente, miembros de la familia de las Proteína-Quinasas Activadas por Mitógenos (MAPK) han sido implicados en las acciones de numerosos estados de estrés ambiental en animales, levaduras y plantas. Se ha demostrado que tanto la actividad de las quinasas semejantes a MAPK como los niveles de mRNA de los componentes de las cascadas de MAPK aumentan en respuesta al estrés ambiental y a la transducción de señales hormonales de las plantas. Las quinasas MAP son componentes de cascadas secuenciales de quinasas, que son activadas por fosforilación de residuos treonina y tirosina por quinasas intermedias de tipo MAP-quinasa situadas aguas arriba (MAPKKs). Las MAPKKs son activadas en sí mismas por fosforilación de residuos serina y treonina por quinasas situadas aguas arriba (MAPKKKs). Cierto número de genes de MAP-quinasa han sido consignados en plantas superiores.

WO 98/26045 describe métodos para aumentar la tolerancia de una planta al estrés ambiental.

Urao, T. et al.; MGG (1994), 244, 4, pp. 331-340 describe dos genes que codifican enfermedades de proteínas dependientes de Ca^{2+} que son inducidas por estados de estrés debidos a sequía y concentraciones altas de sal en Arabidopsis thaliana.

Nishiyama, R., et al., Plant Cell Physiol. (1999), 40, 2, pp. 205-212 describe especies de mRNA que codifican proteína-quinasas dependientes de calcio que se expresan distintamente en los órganos sexuales de Marchantia polymorpha por remodelación alternativa.

Sumario de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones.

Esta invención satisface en parte la necesidad de identificar una nueva proteína-quinasa singular capaz de conferir tolerancia a la sequía a las plantas por sobre-expresión. La presente invención proporciona una célula de planta monocotiledónea o dicotiledónea transformada por un ácido nucleico codificante de una Proteína Proteína-Quinasa Relacionada con el Estrés (PKSRP), en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada a la sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula vegetal. A saber, en esta memoria se describe la proteína-quinasa siguiente: proteína-quinasa dependiente de calcio (CDPK-2) de Physcomitrella patens. De acuerdo con la invención, la PKSRP es afín a CDPK-2 como se define en SEQ ID NO:39 o SEQ ID NO:26.

El ácido nucleico y la proteína son de una Physcomitrella patens. La invención estipula que el estrés ambiental es sequía.

La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la planta es mejora genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PKSRP, en donde la planta es mejora genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

Se describe adicionalmente un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas, partes de plantas o semillas transgénicas descritas más adelante. La invención proporciona adicionalmente una PKSRP aislada como se describe más adelante. La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de PKSRP aislado, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP codifica una PKSRP como se describe más adelante.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico codificante de PKSRP como se describe más adelante, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. La invención proporciona adicionalmente una célula hospedadora que contiene el vector y una planta que contiene la célula hospedadora.

La invención proporciona adicionalmente un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprende: (a) transformar una célula vegetal con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de PKSRP, y (b) generar a partir de la célula vegetal una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. En realizaciones preferidas, la PKSRP y el ácido nucleico codificante de PKSRP son como se describe más adelante.

La presente invención proporciona adicionalmente un método de identificación de una nueva PKSRP, que comprende (a) generar una respuesta específica de anticuerpos para una PKSRP, o fragmento de la misma, como se describe más adelante; (b) cribar material supuesto de PKSRP con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una PKSRP potencialmente nueva; y (c) identificar a partir del material fijado una KSRP nueva en comparación con PKSRPs conocidas. Alternativamente, la hibridación con sondas de ácido nucleico como se describe más adelante puede utilizarse para identificar nuevos ácidos nucleicos de PKSRP.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de un ácido nucleico de PKSRP en la planta, en donde la PKSRP es como se describe más adelante. La invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que la tolerancia al estrés se aumente o se reduzca. Preferiblemente, se incrementa la tolerancia al estrés en una planta por aumento de la expresión de un ácido nucleico de PKSRP.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1(A-M) muestran las secuencias parciales de cDNA de CPK-2 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12) para comparación y CPK-2 (SEQ ID NO: 13) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 2(A-M) muestran las secuencias de longitud total de cDNA de CPK-2 (SEQ ID NO: 26), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) para comparación y CPK-2 (SEQ ID NO: 26) de Physcomitrella patens.

Las Figuras 3(A-M) muestran las secuencias de aminoácidos deducidas de CPK-2 (SEQ ID NO: 39), PK-7 (SEQ ID NO: 28), PK-8 (SEQ ID NO: 29), PK-9 (SEQ ID NO: 30), CK-1 (SEQ ID NO: 31), CK-2 (SEQ ID NO: 32), CK-3 (SEQ ID NO: 33), MPK-2 (SEQ ID NO: 34), MPK-3 (SEQ ID NO: 35), MPK-4 (SEQ ID NO: 36), MPK-5 (SEQ ID NO: 37), CPK-1 (SEQ ID NO: 38) para comparación y CPK-2 (SEQ ID NO: 39) de Physcomitrella patens.

La Figura 4 muestra un diagrama del vector de expresión de plantas pBPSSC022 que contiene el super-promotor que dirige la expresión de SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 para comparación y 26 ("Desired Gene"). Los componentes son: gen NPTII de resistencia a la kanamicina (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26: 8711-21, 1984), promotor AtAct2-i (An YQ et al., Plant J. 10: 107-121, 1996), terminador OCS3 (During K, Transgenic Res. 3: 138-140, 1994), terminador NOSpA (Jefferson et al., EMBO J 6: 3901-7, 1987).

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpPK-6 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpPK-7 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 7 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpPK-7 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 8 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpPK-9 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpPK-9 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCK-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCK-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 12 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCK-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 13 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCK-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 14 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpMPK-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 15 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpMPK-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 16 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpMPK-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 17 muestra los resultados de un ensayo de estrés por helada con plantas transgénicas que sobre-expresan PpMPK-3 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 18 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpMPK-4 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 19 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCK-5 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 20 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCPK-1 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (para comparación).

La Figura 21 muestra los resultados de un ensayo de estrés por sequía con plantas transgénicas que sobre-expresan PpCPK-2 y líneas de tipo salvaje de Arabidopsis. Las líneas transgénicas exhiben un fenotipo tolerante. Se muestran líneas transformantes individuales (inventiva).

Descripción detallada de la invención

La presente invención puede comprenderse más fácilmente por referencia a la descripción detallada que sigue de las realizaciones preferidas de la invención.

La presente invención proporciona una célula vegetal de una monocotiledónea o dicotiledónea transformada por un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta. La invención proporciona adicionalmente partes de plantas transgénicas y plantas transgénicas que contienen las células vegetales descritas en esta memoria. Se proporciona también una semilla de planta producida por una planta transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de PKSRP, y en donde la planta es mejora genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona adicionalmente una semilla producida por una planta transgénica que expresa una PKSRP, en donde la semilla contiene la PKSRP, y en donde la planta es mejora genética auténtica para tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. Se describe también un producto agrícola producido por cualquiera de las plantas, partes de plantas y semillas de plantas transgénicas descritas más adelante.

Como se utiliza en esta memoria, el término "variedad" se refiere a un grupo de plantas dentro de una especie que comparten caracteres constantes que las separan de la forma típica y de otras posibles variedades en dicha especie. Si bien posee al menos un rasgo distintivo, una variedad se caracteriza también por cierta variación entre los individuos comprendidos en la variedad, basada fundamentalmente en la segregación mendeliana de rasgos entre la progenie de generaciones sucesivas. Una variedad se considera "mejora genética auténtica" para un rasgo particular sí la misma es genéticamente homocigótica para dicho rasgo en tal grado que, cuando la variedad de mejora genética auténtica se auto-poliniza, no se observa una cantidad importante de segregación independiente del rasgo entre la progenie. En la presente invención, el rasgo procede de la expresión transgénica de una o más secuencias de DNA introducidas en una variedad de planta.

La presente invención describe por primera vez que la PKSRP CPK-2 de Physcomitrella patens es útil para aumentar la tolerancia de una planta al estrés ambiental. De acuerdo con ello, la presente invención proporciona una PKSRP aislada, a saber CPK-2 y homólogos de la misma. La PKSRP es la proteína proteína-quinasa-2 dependiente de calcio (CPK-2) como se define en SEQ ID NO: 39, y homólogos y ortólogos de la misma. A continuación se definen homólogos y ortólogos de las secuencias de aminoácidos.

Las PKSRPs de la presente invención se producen con preferencia por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína se somete a clonación en un vector de expresión (como se describe más adelante), se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora (como se describe más adelante) y se expresa la PKSRP en la célula hospedadora. La PKSRP puede aislarse luego de las células por un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas estándar de purificación de proteínas. Alternativamente a la expresión recombinante, un polipéptido o péptido PKSRP puede sintetizarse químicamente utilizando técnicas estándar de síntesis de péptidos. Además, la PKSRP nativa puede aislarse de células (v.g., Physcomitrella patens), por ejemplo utilizando un anticuerpo anti-PKSRP, que puede producirse por técnicas estándar utilizando una PKSRP o fragmento de la misma.

La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico codificante de PKSRP aislado. La presente invención incluye ácidos nucleicos codificantes de PKSRP que codifican PKSRP como se describe en esta memoria. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico codificante de PKSRPs es ácido nucleico de la proteína quinasa-2 (CPK-2) dependiente de calcio como se define en SEQ ID NO: 26 y homólogos y ortólogos del mismo. Homólogos y ortólogos de las secuencias de nucleótidos se definen más adelante. En una realización preferida, el ácido nucleico y la proteína se aíslan del género de plantas Physcomitrella. En otra realización preferida, el ácido nucleico y la proteína son de una planta Physcomitrella patens (P. patens).

Como se utiliza en esta memoria, el término "estrés ambiental" hace referencia a cualquier condición de crecimiento sub-óptima e incluye, pero sin carácter limitante, condiciones sub-óptimas asociadas con sequía.

Debe entenderse también que tal como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, "un" o "uno" puede significar uno o más, dependiendo del contexto en el que se utilice. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" puede significar que puede utilizarse al menos una célula.

Como se utilizan también en esta memoria, debe entenderse que los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" incluyen moléculas de DNA (v.g., cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (v.g., mRNA) y análogos del DNA o RNA generados utilizando análogos de nucleótidos. Este término abarca también secuencias no traducidas localizadas en ambos extremos 3' y 5' de la región codificante del gen: al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de secuencia aguas arriba del extremo 5' de la región codificante y al menos aproximadamente 200 nucleótidos de la secuencia aguas abajo del extremo 3' de la región codificante del gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero con preferencia es DNA bicatenario.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada sustancialmente de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Con preferencia, un ácido nucleico "aislado" está exento de algunas de las secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el DNA genómico del organismo del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de PKSRP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el DNA genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico (v.g., una célula de Physcomitrella patens). Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cDNA, puede estar exenta de algo del material celular restante con el que está asociada naturalmente, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, v.g. una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26, o una porción de la misma, puede aislarse utilizando técnicas estándar de biología molecular y la información de secuencias proporcionada en esta memoria. Por ejemplo, un cDNA de PKSRP de P. patens puede aislarse a partir de una biblioteca de P. patens utilizando la totalidad o una porción de la secuencia de SEQ ID NO: 13.

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca la totalidad o una porción de la secuencia SEQ ID NO: 13 puede aislarse por la reacción en cadena de la polimerasa utilizando iniciadores oligonucleotídicos diseñados sobre la base de esta secuencia. Por ejemplo, puede aislarse mRNA a partir de células vegetales (v.g., por el procedimiento de extracción con tiocianato de guanidinio de Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294-5299) y puede prepararse cDNA utilizando transcriptasa inversa (v.g., transcriptasa inversa de MLV de Moloney, disponible de Gibco/BRL, Bethesda, MD; o transcriptasa inversa de AMV, disponible de Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Pueden diseñarse iniciadores oligonucleotídicos sintéticos para amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa basándose en la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 13. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse utilizando cDNA o, alternativamente, DNA genómico, como molde e iniciadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas estándar de amplificación por PCR. La molécula de ácido nucleico así amplificada puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de DNA. Adicionalmente, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a una secuencia de nucleótidos de PKSRP por técnicas estándar de síntesis, v.g., utilizando un sintetizador automático de DNA.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26. Estos cDNA comprenden secuencias que codifican las PKSRPs (es decir, la "región codificante", indicada en la Tabla 1), así como secuencias 5' no traducidas y secuencias 3' no traducidas. Debe entenderse que SEQ ID NO: 26 comprende a la vez las regiones codificantes 5' y 3' no traducidas. Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden comprender solamente la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO: 26, o pueden contener fragmentos genómicos enteros aislados del DNA genómico. Una región codificante de estas secuencias se indica como "posición ORF". La presente invención incluye también ácidos nucleicos codificantes de PKSRP que codifican PKSRPs como se describen en esta memoria. Se prefiere un ácido nucleico codificante de PKSRP que codifica una PKSRP que es CPK-2 (SEQ ID NO:39).

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de la región codificante de la secuencia en SEQ ID NO: 26, por ejemplo, un fragmento que puede utilizarse como sonda o iniciador o un fragmento que codifica una porción biológicamente activa de una PKSRP. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la clonación de los genes PKSRP de P. patens permiten la generación de sondas e iniciadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de homólogos de PKSRP en otros tipos de células y organismos, así como homólogos de PKSRP de otros musgos y especies afines.

Las porciones de proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de PKSRP son con preferencia porciones biológicamente activas de una de las PKSRPs descritas en esta memoria. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "porción biológicamente activa de" una PKSRP tiene por objeto incluir una porción, v.g., un dominio/motivo, de una PKSRP que participa en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, tiene una actividad como se indica en la Tabla 1, o participa en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta. Para determinar si una PKSRP, o una porción biológicamente activa de la misma, puede participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o si la represión de una PKSRP da como resultado una tolerancia incrementada al estrés en una planta, puede realizarse un análisis de estrés de una planta que comprende la PKSRP. Métodos de análisis de este tipo son bien conocidos por los expertos en la técnica, como se detalla en el Ejemplo 7. De modo más específico, fragmentos de ácido nucleico que codifican porciones biológicamente activas de una PKSRP pueden prepararse por aislamiento de una porción de la secuencia SEQ ID NO: 39, que expresa la porción codificada de la PKSRP o el péptido (v.g., por expresión recombinante in vitro) y evaluación de la actividad de la porción codificada de la PKSRP o el péptido.

Se contemplan en la presente invención porciones biológicamente activas de una PKSRP, e incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de la secuencia de aminoácidos de una PKSRP, v.g., una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, o la secuencia de aminoácidos de una proteína homóloga a una PKSRP, que incluyen menos aminoácidos que una PKSRP de longitud total o la proteína de longitud total que es homóloga a una PKSRP, y exhiben al menos una actividad de una PKSRP. Típicamente, porciones biológicamente activas (v.g., péptidos que tienen, por ejemplo, una longitud de 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100, o más aminoácidos) comprenden un dominio o motivo que tiene al menos una actividad de PKSRP. Además, otras porciones biológicamente activas en las cuales están delecionadas otras regiones de la proteína, pueden prepararse por técnicas recombinantes y evaluarse respecto a una o más de las actividades descritas en esta memoria. Con preferencia, las porciones biológicamente activas de una PKSRP incluyen uno o más dominios/motivos seleccionados o porciones de los mismos que tienen actividad biológica.

La invención proporciona también proteínas PKSRP quiméricas o de fusión. Como se utiliza en esta memoria, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" PKSRP comprende un polipéptido de PKSRP enlazado operativamente a un polipéptido distinto de PKSRP. Un polipéptido de PKSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una PKSRP, mientras que un polipéptido distinto de PKSRP hace referencia a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la PKSRP, v.g., una proteína que es diferente de la PKSRP y se deriva del mismo organismo o de un organismo diferente. Dentro de la proteína de fusión, el término "enlazado operativamente" tiene por objeto indicar que el polipéptido PKSRP y el polipéptido distinto de PKSRP están fusionados uno a otro de tal manera que ambas secuencias cumplen la función propuesta atribuida a la secuencia utilizada. El polipéptido distinto de PKSRP puede fusionarse al término N o al término C del polipéptido PKSRP. Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-PKSRP en donde las secuencias de PKSRP están fusionadas al término C de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de PKSRPs recombinantes. En otra realización, la proteína de fusión es una PKSRP que contiene una secuencia señal heteróloga en su término N. En ciertas células hospedadoras (v.g., células hospedadoras de mamífero), la expresión y/o secreción de una PKSRP puede incrementarse por el uso de una secuencia señal heteróloga.

Con preferencia, una proteína PKSRP quimérica o de fusión de la invención se produce por técnicas estándar de DNA recombinante. Por ejemplo, fragmentos de DNA que codifican las secuencias polipeptídicas diferentes se ligan uno a otro en marco de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos con extremos romos o con extremos cohesivos para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión indeseable y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes puede llevarse a cabo utilizando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos de gen consecutivos que pueden reasociarse y re-amplificarse subsiguientemente para generar una secuencia de gen quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, compiladores Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Además, están disponibles comercialmente muchos vectores de expresión que codifican ya un resto de fusión (v.g., un polipéptido de GST). Un ácido nucleico codificante de PKSRP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de tal manera que el resto de fusión está enlazado en marco a la PKSRP.

Además de fragmentos y proteínas de fusión de las PKSRPs descritas en esta memoria, la presente invención incluye homólogos y análogos de PKSRPs existentes naturalmente y ácidos nucleicos codificantes de PKSRP en una planta. Los "homólogos" se definen en esta memoria como dos ácidos nucleicos o proteínas que tienen secuencias similares, u "homólogas", de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente. Los homólogos incluyen variantes alélicas, ortólogos, parálogos, agonistas y antagonistas de PKSRPs como se definen más adelante. El término "homólogo" abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de las secuencias de nucleótidos que se muestran en SEQ ID NO: 26 (y porciones de las mismas) debido a la degeneración del código genético y codifican por tanto la misma PKSRP que la codificada por la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26. Como se utiliza en esta memoria, una PKSRP "existente naturalmente" hace referencia a una secuencia de aminoácidos de PKSRP que existe en la naturaleza. Con preferencia, una PKSRP existente naturalmente comprende una secuencia de aminoácidos que es SEQ ID NO: 39.

Un agonista de la PKSRP puede retener sustancialmente las mismas, o un subconjunto, de las actividades biológicas de las PKSRP. Un antagonista de la PKSRP puede inhibir una o más de las actividades de la forma existente naturalmente de la PKSRP. Por ejemplo, el antagonista de PKSRP puede fijarse competitivamente a un miembro de aguas abajo o aguas arriba de la cascada metabólica de componentes de la membrana celular que incluye la PKSRP, o fijarse a una PKSRP que media el transporte de compuestos a través de tales membranas, previniendo de este modo que tenga lugar translocación.

Moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y análogos, ortólogos y parálogos de un cDNA de PKSRP pueden aislarse sobre la base de su identidad con los ácidos nucleicos de PKSRP de Physcomitrella patens descritos en esta memoria utilizando cDNAs de PKSRP, o una porción de los mismos, como sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándar de hibridación en condiciones de hibridación severas. En una realización alternativa, pueden identificarse homólogos de la PKSRP por cribado de bibliotecas combinatorias de mutantes, v.g., mutantes de truncación, de la PKSRP en cuanto a actividad agonista o antagonista de PKSRP. En una realización, se genera una biblioteca diversificada de variantes de PKSRP por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico y se codifica por una biblioteca diversificada de genes. Una biblioteca diversificada de variantes de PKSRP puede producirse mediante, por ejemplo, ligación enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de tal modo que una serie degenerada de secuencias potenciales de PKSRP puede expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como una serie de proteínas de fusión mayores (v.g., para presentación de fago) que contienen la serie de secuencias de PKSRP en ellas. Existe una diversidad de métodos que pueden utilizarse para producir bibliotecas de homólogos potenciales de PKSRP a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada puede realizarse en un sintetizador automático de DNA, y el gen sintético se liga luego a un vector de expresión apropiado. El uso de una serie degenerada de genes permite la provisión, en una sola mezcla, de la totalidad de las secuencias que codifican la serie deseada de secuencias potenciales de PKSRP. Métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, v.g., Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acids Res. 11: 477).

Adicionalmente, pueden utilizarse bibliotecas de fragmentos de las regiones codificantes de PKSRP para generar una población diversificada de fragmentos de PKSRP para cribado y selección subsiguiente de homólogos de una PKSRP. En una realización, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante por tratamiento de un fragmento de PCR bicatenario de una secuencia codificante de PKSRP con una nucleasa en condiciones en las cuales se produce mellado sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalización del DNA bicatenario, renaturalización del DNA para formar DNA bicatenario, lo que puede incluir pares sentido/antisentido de productos mellados diferentes, eliminación de porciones monocatenarias a partir de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1, y ligación de la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Por este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminales, C-terminales e internos de diversos tamaños de la PKSRP.

Se conocen en la técnica varios métodos para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para cribar bibliotecas de cDNA respecto a productos génicos que tengan una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para cribado rápido de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de homólogos de PKSRP. Las técnicas utilizadas más ampliamente, que son susceptibles de análisis de alta capacidad, para cribado de grandes bibliotecas de genes, incluyen típicamente clonación de la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformación de células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresión de los genes combinatorios en condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recurrente de conjunto (REM), una nueva técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, puede utilizarse en combinación con los ensayos de cribado para identificar homólogos de PKSRP (Arkin y Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811-7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327-331). En otra realización, pueden aprovecharse ensayos basados en células para analizar una biblioteca diversificada de PKSRP, utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Se proporciona adicionalmente un método de identificación de una nueva PKSRP, que comprende (a) generar una respuesta de anticuerpos específica para una PKSRP, o un fragmento de la misma, como se describe en esta memoria; (b) cribar material PKSRP supuesto con el anticuerpo, en donde la fijación específica del anticuerpo al material indica la presencia de una PKSRP potencialmente nueva; y (c) analizar el material fijado en comparación con PKSRP conocida, para determinar su novedad.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos (v.g., de la secuencia SEQ ID NO: 39 y una forma mutante de la misma), se alinean las secuencias para propósitos óptimos de comparación (v.g., pueden introducirse lagunas en la secuencia de una proteína o ácido nucleico para alineación óptima con la otra proteína o el otro ácido nucleico). Se comparan luego los residuos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia (v.g, de la secuencia SEQ ID NO: 39) está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la otra secuencia (v.g., una forma mutante de la secuencia del polipéptido de SEQ ID NO: 39), entonces las moléculas son homólogas en dicha posición (es decir, tal como se utiliza en esta memoria, "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El mismo tipo de comparación puede hacerse entre dos secuencias de ácido nucleico.

El porcentaje de homología entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = números de posiciones idénticas/números de posiciones totales x 100). Con preferencia, las secuencias de aminoácidos incluidas en la presente invención son aproximadamente al menos 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo más preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a una secuencia entera de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 39. En otra realización adicional, al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95%, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o más homólogas a una secuencia entera de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en SEQ ID NO: 26.

En otras realizaciones, la longitud preferible de comparación de secuencias para las proteínas es al menos 15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 residuos de aminoácido y muy preferiblemente al menos 35 residuos de aminoácido.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos que es 90-95%, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homóloga a una secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 26, o una porción de la misma. La longitud preferible de comparación de secuencias para ácidos nucleicos es al menos 75 nucleótidos, más preferiblemente al menos 100 nucleótidos y muy preferiblemente la longitud entera de la región codificante.

Es asimismo preferible que la molécula de ácido nucleico homóloga de la invención codifique una proteína o porción de la misma que incluye una secuencia de aminoácidos que es suficientemente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 39, de tal modo que la proteína o porción de la misma mantiene la misma o similar función que la secuencia de aminoácidos con la que se compara. Funciones de las secuencias de aminoácidos de PKSRP de la presente invención incluyen la capacidad de participar en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, para participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta Physcomitrella patens. Ejemplos de tales actividades se describen en la Tabla 1.

Además de los métodos arriba descritos, una determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido y no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877). Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403-410).

Las búsquedas de ácidos nucleicos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de ácido nucleico homólogas a las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la invención. Adicionalmente, las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las PKSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Millar (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4 a fin de obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las PKSRPs de la presente invención. Para obtener alineaciones que incluyen lagunas para fines de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers and Millar (CABIOS 1989). Dicho algoritmo está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) que forma parte del paquete de soporte lógico de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparación de secuencias de aminoácidos, pueden utilizarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Por último, puede determinarse también la homología entre secuencias de ácido nucleico utilizando métodos de hibridación conocidos por los expertos en la técnica. De acuerdo con ello, una molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que se hibrida, v.g. se hibrida en condiciones severas, a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26, o una porción de la misma. De modo más particular, una molécula de ácido nucleico aislada tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y se hibrida en condiciones severas a la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26. En otras realizaciones, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250 o más nucleótidos de longitud.

Como se utiliza en esta memoria, el término "se hibrida en condiciones severas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado en las cuales las secuencias de nucleótidos que tienen al menos una homología de 60% entre sí se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Con preferencia, las condiciones son tales que secuencias que son al menos aproximadamente 65%, de modo más preferible al menos aproximadamente 70%, y de modo todavía más preferible al menos aproximadamente 75% o más homólogas una a otra se mantienen típicamente hibridadas entre sí. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1-6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). Un ejemplo no limitante preferido de condiciones severas de hibridación son hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 X SSC, 0,1% SDS a 50-65ºC. Con preferencia, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que se hibrida en condiciones severas a una secuencia de SEQ ID NO: 26 corresponde a una molécula de ácido nucleico existente naturalmente. Como se utiliza en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "existente naturalmente" hace referencia a una molécula de RNA o DNA que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (v.g., codifica una proteína natural). En una realización, el ácido nucleico codifica una PKSRP de Physcomitrella patens existente naturalmente.

Utilizando los métodos arriba descritos, y otros conocidos por los expertos en la técnica, una persona con experiencia ordinaria en la técnica puede aislar homólogos de las PKSRPs que comprenden la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 39. Un subgrupo de estos homólogos son variantes alélicas. Como se utiliza en esta memoria, el término "variante alélica" hace referencia a una secuencia de nucleótidos que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una PKSRP y que existen dentro de una población natural (v.g., una especie o variedad de planta). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar típicamente como resultado una varianza de 1-5% en un ácido nucleico de PKSRP. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en cierto número de plantas diferentes, lo que puede realizarse fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético de PKSRP en dichas plantas. Cualquiera y la totalidad de dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes en una PKSRP que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una PKSRP, deben considerarse dentro del alcance de la invención.

Deben considerase comprendidas además dentro del alcance de la presente invención moléculas de ácido nucleico que codifican PKSRPs de la misma u otra especie tales como análogos, ortólogos y parálogos de PKSRP. Como se utiliza en esta memoria, el término "análogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no afines. Como se utiliza en esta memoria, el término "ortólogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos de especies diferentes, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican proteínas que tienen la misma o similares funciones. Como se utiliza también en esta memoria, el término "parálogos" hace referencia a dos ácidos nucleicos que están relacionados por duplicación en un mismo genoma. Los parálogos tienen usualmente funciones diferentes, pero estas funciones pueden ser afines (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278 (5338): 631-637). Análogos, ortólogos y parálogos de una PKSRP existente naturalmente pueden diferir de la PKSRP existente naturalmente por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambas cosas. Modificaciones posteriores a la traducción incluyen derivatización química de polipéptidos in vivo e in vitro, v.g. acetilación, carboxilación, fosforilación, o glicosilación, y tales modificaciones pueden ocurrir durante la síntesis o el procesamiento de los polipéptidos o después del tratamiento con enzimas modificantes aisladas. En particular, los ortólogos de la invención exhibirán generalmente al menos 80-85%, con más preferencia 90%, y muy preferiblemente 95%, 96%, 97%, 98% o incluso 99% de identidad u homología con la totalidad o una parte de una secuencia de aminoácidos de PKSRP existente naturalmente y exhibirán una función similar a una PKSRP. Los ortólogos de la presente invención son también con preferencia capaces de participar en la respuesta al estrés en las plantas. En una realización, los ortólogos de PKSRP mantienen la capacidad para participar en el metabolismo de los compuestos necesarios para la construcción de membranas celulares en Physcomitrella patens, o en el transporte de moléculas a través de estas membranas.

Además de las variantes existentes naturalmente de una secuencia de PKSRP que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios por mutación en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 26, conduciendo con ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de la PKSRP codificada, sin alterar la capacidad funcional de la PKSRP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en la secuencia SEQ ID NO: 26. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede estar alterado respecto de la secuencia de tipo salvaje de una de las PKSRPs sin alterar la actividad de dicha PKSRP, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad de la PKSRP. Otros residuos de aminoácidos, sin embargo (v.g., aquéllos que no están conservados o están sólo semi-conservados en el dominio que tiene actividad de PKSRP) pueden ser esenciales o no para la actividad y por consiguiente son probablemente susceptibles de alteración sin que se altere la actividad de la PKSRP.

De acuerdo con ello, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican PKSRPs que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad de la PKSRP. Tales PKSRPs difieren en secuencia de aminoácidos de la secuencia contenida en SEQ ID NO: 39, pero retienen al menos una de las actividades de PKSRP descritas en esta memoria. ID NO: 39 (sic). Con preferencia, la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico tiene una homología de al menos aproximadamente 70-80%, 80-90%, 90-95% con la secuencia SEQ ID NO: 39, y de modo más preferible una homología de al menos aproximadamente 96%, 97%, 98%, o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 39. Los homólogos de PKSRP preferidos de la presente invención son con preferencia capaces de participar en la respuesta de tolerancia al estrés en una planta, o más particularmente, participar en la transcripción de una proteína implicada en una respuesta de tolerancia al estrés en una planta de Physcomitrella patens, o tienen una o más actividades indicadas en la Tabla 1.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un homólogo de PKSRP a una secuencia de proteína de SEQ ID NO: 39 puede crearse por introducción de una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 26, de tal modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en la secuencia SEQ ID NO: 26 por técnicas estándar, tales como mutagénesis orientada y mutagénesis mediada por PCR. Con preferencia, se hacen sustituciones conservadoras de aminoácidos en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es una en la que el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar.

Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (v.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales apolares (v.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (v.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.g., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una PKSRP se reemplaza con preferencia con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de PKSRP, por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los mutantes que resultan pueden cribarse respecto a una actividad de PKSRP descrita en esta memoria para identificar mutantes que retienen actividad de PKSRP. Después de la mutagénesis de la secuencia de SEQ ID NO: 26, la proteína codificada puede expresarse recombinantemente y la actividad de la proteína puede determinarse por análisis de la tolerancia al estrés de una planta que expresa la proteína como se describe en el Ejemplo 7.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican la PKSRP arriba descrita, otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido respecto a las aquélla. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, v.g., complementaria a la cadena codificante de una molécula de cDNA bicatenario o complementaria a una secuencia de mRNA. De acuerdo con ello, un ácido nucleico antisentido puede estar unido por enlaces hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante de PKSRP entera, o sólo a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una PKSRP. El término "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (v.g., la región codificante entera de .... comprende los nucleótidos 1 a ....). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido para una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica una PKSRP. El término "región no codificante" se refiere a secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, a las que se hace referencia también como regiones 5' y 3' no traducidas).

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26, o una porción de la misma. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26 es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26, de tal modo que puede hibridarse a la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 26, formando con ello un dúplex estable.

Dadas las secuencias de las cadenas codificantes que codifican las PKSRPs de la invención descritas en esta memoria (v.g., la secuencia de SEQ ID NO: 26), pueden diseñarse ácidos nucleicos antisentido de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria para la región codificante entera de mRNA de PKSRP, pero con más preferencia es un oligonucleótido que es antisentido sólo para una porción de la región codificante o no codificante de mRNA de PKSRP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario para la región que rodea el sitio de comienzo de la traducción de mRNA de PKSRP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos.

Un ácido nucleico antisentido puede construirse utilizando reacciones de síntesis química y ligación enzimática que emplean procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (v.g., un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos existentes naturalmente o nucleótidos modificados de diversos modos diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, v.g., pueden utilizarse derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden utilizarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetil-aminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metil-guanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metil-adenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metil-citosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilamino-metiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxi-uracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual un ácido nucleico se ha subclonado en una orientación antisentido (es decir, el RNA transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido para un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la subsección siguiente).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a una célula o se generan in situ de tal modo que las mismas se hibridan con o se fijan a mRNA celular y/o DNA genómico codificante de una PKSRP para inhibir con ello la expresión de la proteína. v.g., por inhibición de la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede realizarse por complementariedad convencional de nucleótidos a fin de formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se fija a los dúplex de DNA, por interacciones específicas en la hendidura mayor de la doble hélice. La molécula antisentido puede modificarse de tal manera que se fije específicamente a un receptor o un antígeno expresado en una superficie celular seleccionada, v.g., por enlace de la molécula de ácido nucleico antisentido a un péptido o un anticuerpo que se fija a un receptor o antígeno de la superficie celular. La molécula de ácido nucleico antisentido puede suministrarse también a las células utilizando los vectores descritos en esta memoria. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos vectores en los cuales la molécula de ácido nucleico antisentido está puesta esencialmente bajo el control de un promotor fuerte procariota, viral, o eucariota (con inclusión de promotores vegetales).

En otra realización adicional, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en los cuales, contrariamente a las unidades \beta usuales, las cadenas corren paralelas una a otra (Gaultier et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metil-ribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al., 1987 FEBS Lett, 215: 327-330).

En otra realización adicional, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de RNA con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico monocatenario, tal como un mRNA, para el cual tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (v.g., las ribozimas con cabeza de martillo descritas en Haselhoff y Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591) pueden utilizarse para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de PKSRP a fin de inhibir con ello la traducción de mRNA de PKSRP. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico codificante de PKSRP puede diseñarse sobre la base de la secuencia de nucleótidos de un cDNA de PKSRP, como se describe en esta memoria (es decir, SEQ ID NO: 26), o sobre la base de una secuencia heteróloga que puede aislarse de acuerdo con los métodos expuestos en esta invención. Por ejemplo, puede construirse un derivado de un RNA IVS L-19 de Tetrahymena, en el cual la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos a escindir en un mRNA codificante de PKSRP. Véase, v.g., Cech et al. Patente U.S. No. 4.987.071 y Cech et al., Patente U.S. No. 5.116.742. Alternativamente, puede utilizarse mRNA de PKSRP para seleccionar un RNA catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de una agrupación de moléculas de RNA. Véase, v.g., Bartel, D. y Szostak, J.W., 1993, Science 261: 1411-1418.

Alternativamente, la expresión de genes de PKSRP puede inhibirse por direccionamiento de secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de una secuencia de nucleótidos de KPSRP (v.g., un promotor y/o intensificador de PKSRP) para formar estructuras de triple hélice que impiden la transcripción de un gen de PKSRP en células diana. Véase generalmente, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al., 1992 Ann N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J., 1992; Bioassays 14(12):807-15.

Además de los ácidos nucleicos y proteínas PKSRP arriba descritos, la presente invención abarca estos ácidos nucleicos y proteínas fijados a un resto. Estos restos incluyen, pero sin carácter limitante, restos de detección, restos de hibridación, restos de purificación, restos de suministro, restos de reacción, restos de fijación, etcétera. Un grupo típico de ácidos nucleicos que tienen restos unidos son sondas e iniciadores. Las sondas y los iniciadores comprenden típicamente un oligonucleótido sustancialmente aislado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones severas a al menos aproximadamente 12, con preferencia aproximadamente 25, de modo más preferible aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una cadena sentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 26, una secuencia antisentido de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 26, o mutantes de la misma existentes naturalmente. Iniciadores basados en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26 pueden utilizarse en reacciones PCR para clonar homólogos de PKSRP.

Puede utilizarse SEQ ID NO:26 en reacciones PCR para clonar homólogos de PKSRP. Sondas basadas en las secuencias de nucleótidos PKSRP pueden utilizarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican la misma proteína o proteínas homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende adicionalmente un grupo marcador unido a ella, v.g. el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden utilizarse como parte de un kit de test de marcadores genómicos para identificar células que expresan una PKSRP, tal como por medida de un nivel de un ácido nucleico codificante de PKSRP, en una muestra de células, v.g., por detección de los niveles de mRNA de PKSRP o determinación de si un gen de PKSRP genómico se ha mutado o ha sido delecionado.

En particular, un método útil para averiguar el nivel de transcripción del gen (un indicador de la cantidad de mRNA disponible para traducción al producto génico) consiste en realizar una transferencia Northern (para referencia, véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York). Esta información demuestra al menos parcialmente el grado de transcripción del gen transformado. El RNA celular total puede prepararse a partir de células, tejidos u órganos por varios métodos, todos ellos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito en Bormann, E.R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6:317-326. Para cribar la presencia o cantidad relativa de proteína traducida a partir de este mRNA, pueden emplearse técnicas estándar, tales como una transferencia Western. Estos métodos son bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: Nueva York).

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de PKSRP como se ha descrito arriba, en donde la expresión del vector en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora. Como se utiliza en esta memoria, el término "vector" hace referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", que hace referencia a un bucle circular de DNA bicatenario en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de DNA adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se han introducido (v.g. vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (v.g., vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de introducción en la célula hospedadora, y por consiguiente se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se han enlazado operativamente. A dichos vectores se hace referencia en esta memoria como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA recombinante se encuentran a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse intercambiablemente dado que el plásmido es la forma de vector utilizada más comúnmente. No obstante, la invención tiene por objeto incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.g., retrovirus deficientes en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), que desempeñan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las célula hospedadoras a utilizar para la expresión, lo que está enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. En un vector de expresión recombinante, debe entenderse que "enlazado operativamente" significa que la secuencia nucleotídica de interés está enlazada a la o las secuencias reguladoras de una manera que permite la expresión de la secuencia nucleotídica (v.g., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). El término "secuencia reguladora" tiene por objeto incluir promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (v.g., señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) o véase: Gruber and Crosby, en: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, compiladores Glick y Thompson, capítulo 7, 89-108, CRC Press, Boca Raton, Florida, con inclusión de las referencias citadas en dicho lugar. Secuencias reguladoras incluyen aquéllas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospedadoras y aquéllas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos únicamente en ciertas células hospedadoras o en ciertas condiciones. Será apreciado por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir con ello proteínas o péptidos, con inclusión de proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en esta memoria (v.g., PKSRPs, formas mutantes de PKSRPs, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresión de PKSRPs en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse genes de PKSRP en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura y otras células fúngicas (véase Romanos, M.A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel C.A.M.J.J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, en: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet, & L.L. Lasure, compiladores, p. 396-428; Academic Press: S. Diego; y van den Hondel, C.A.M.J.J., & Punt. P.J., 1991, Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, en: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., compiladores, p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), algas (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239-251), ciliados de los tipos: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, y Stylonychia, especialmente del género Stylonychia lemnae, con vectores siguiendo un método de transformación como el descrito en WO 98/01572 y células de plantas multicelulares (véase Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, capítulo 6/7, p. 71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Molec. Biol. 42:205-225 y las referencias citadas en dichos lugares) o células de mamífero. Células hospedadoras adecuadas se describen más detalladamente en Goeddel, Gene Expresión Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, Ca (1990). Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro,

\hbox{por ejemplo utilizando secuencias
reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.}

La expresión de proteínas en procariotas se lleva a cabo en la mayoría de los casos con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o distintas de las proteínas de fusión. Los vectores de fusión añaden cierto número de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, usualmente al término amino de la proteína recombinante, pero también al término C o se fusionan en regiones adecuadas en las proteínas. Tales vectores de fusión sirven típicamente para tres propósitos: 1) aumentar la expresión de una proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de una proteína recombinante; y 3) facilitar la purificación de una proteína recombinante por actuar como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento cognadas, incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith, D.B. y Johnson, K.S., 1988 Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia Piscataway, NJ) que fusionan glutatión-S-transferasa (GST), la proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana. En una realización, la secuencia codificante de la PKSRP se clona a un vector de expresión pGEX para crear un vector que codifica una proteína de fusión que comprende, desde el término N al término C, GST-sitio de escisión de trombina-proteína X. La proteína de fusión puede purificarse por cromatografía de afinidad utilizando resina glutatión-agarosa. La PKSRP recombinante no fusionada a GST puede recuperarse por escisión de la proteína de fusión con trombina.

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles adecuados que no son de fusión incluyen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California, (1990) 60-89). La expresión de genes diana a partir del vector pTrc está basada en la transcripción de RNA-polimerasa del hospedador por un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana a partir del vector pET-11d está basada en la transcripción de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una RNA-polimerasa viral co-expresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174 (DE3) a partir de un profago \lambda residente que aloja un gen de T7 gn1 bajo el control de transcripción del promotor lacUV5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes consiste en expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad deteriorada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia consiste en alterar la secuencia del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de tal modo que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en la bacteria seleccionada para expresión, tales como C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración en las secuencias de ácido nucleico de la invención puede llevarse a cabo por técnicas estándar de síntesis de DNA.

En otra realización, el vector de expresión de PKSRP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., 1977 Embo J. 6:229-234, pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982 Cell 30:939-943), pJRY88 (Schultz et al. 1987 Gene 54:113-123), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vectores y métodos para la construcción de vectores apropiados para uso en otros hongos, tales como los hongos filamentosos, incluyen los detallados en: van den Hondel C.A.M.J.J. & Punt. P.J. (1991): "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi", en: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., compiladores., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

En otra realización, las PKSRPs de la invención se expresan en células vegetales de plantas superiores (v.g., las espermatofitas, tales como plantas de cosecha). Ejemplos de vectores de expresión en plantas incluyen los detallados en: Becker, D., Kemper E., Schell, J. y Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en: Transgenic Plants, vol. 1, Engineering and Utilization, compiladores: Kung y R. Wu, Academic Press, 1993; p. 15-38.

Una casete de expresión en plantas contiene con preferencia secuencias reguladoras capaces de impulsar la expresión génica en células vegetales y enlazadas operativamente de tal modo que cada secuencia puede desempeñar su función, por ejemplo, terminación de la transcripción por señales de poliadenilación. Señales de poliadenilación preferidas son las procedentes de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tales como el gen 3 conocido como octopina-sintasa del plásmido Ti pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3:835) o equivalentes funcionales del mismo, pero también son adecuados otros terminadores funcionalmente activos en plantas.

Dado que la expresión de genes vegetales no se limita en muchos casos a niveles de transcripción, una casete de expresión en plantas contiene con preferencia otras secuencias enlazadas operativamente como mejoradores de la traducción tales como la secuencia superimpulsora ("overdrive") que contiene la secuencia conductora 5' no traducida del virus del mosaico del tabaco que mejora la relación de proteína por RNA (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).

La expresión de genes de plantas tiene que estar enlazada operativamente a un promotor apropiado que confiere la expresión génica de una manera oportuna, específica de la célula o del tejido. Se prefieren promotores que impulsan expresión constitutiva (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8:2195-2202) al igual que los derivados de virus de plantas tales como el CAMV 35S (Franck et al., 1980 Cell 21:285-294), el CaMV 19S (véase también la Patente U.S. No. 5352605 y la solicitud PCT No. WO 8402913) o promotores de plantas tales como los de la subunidad pequeña de Rubisco descrita en la Patente U.S. No. 4962028.

Otras secuencias preferidas para uso en casetes de expresión de genes vegetales son secuencias de direccionamiento necesarias para dirigir el producto génico en su compartimiento celular apropiado (para revisión, véase Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15 (4):285-423 y las referencias citadas en dicho lugar) tales como la vacuola, el núcleo, todos los tipos de plástidos tales como amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, el espacio extracelular, la mitocondria, el retículo endoplasmático, cuerpos aceitosos, peroxisomas y otros compartimientos de las células vegetales.

La expresión de genes vegetales puede ser facilitada también por un promotor inducible (para revisión véase Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Promotores químicamente inducibles son especialmente adecuados si se quiere que la expresión génica ocurra de una manera específica en el tiempo. Ejemplos de tales promotores son un promotor inducible por ácido salicílico (Solicitud PCT No. WO 95/19443), un promotor inducible por tetraciclina (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397-404) y un promotor inducible por etanol (solicitud PCT No. WO 93/21334).

Asimismo, promotores adecuados que responden a condiciones de estrés biótico o abiótico son aquéllos tales como el promotor del gen PRP1 inducible por patógenos (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22:361-366), el promotor hsp80 del tomate inducible por calor (Patente U.S. No. 5187267), el promotor de \alpha-amilasa de la patata inducible por frío (solicitud PCT No. WO 96/12814) o el promotor pinII inducible por lesiones (Patente Europea No. 375091). Para otros ejemplos de promotores inducibles por sequía, frío y sal, tal como el promotor RD29A, véase Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 236:331-340).

Se prefieren especialmente aquellos promotores que confieren expresión génica en tejidos y órganos específicos, tales como células de guarda y las células de los pelos radiculares. Promotores adecuados incluyen el promotor del gen napin de la colza (Patente U.S. No. 5608152), el promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol. Gen. Genet. 225 (3):459-67), el promotor oleosina de Arabidopsis (solicitud PCT No. WO 98/45461), el promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5504200), el promotor Bce4 de Brassica (solicitud PCT No. WO 91/13980) o el promotor B4 de legumina (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2 (2):233-9) así como promotores que confieren expresión específica de semillas en plantas monocotiledóneas como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, etcétera. Promotores adecuados dignos de mención son el promotor del gen lpt2 o lpt1 de la cebada (solicitud PCT No. WO 95/15389 y solicitud PCT No. WO 95/23230) o los descritos en la solicitud PCT No. WO 99/16890 (promotores del gen hordeína de la cebada, el gen glutelina del arroz, el gen orizina del arroz, el gen prolamina del arroz, el gen gliadina del trigo, el gen glutelina del trigo, el gen zeína del maíz, el gel glutelina de la avena, el gen kasirina del sorgo y el gen secalina del centeno).

Son también especialmente adecuados promotores que confieren expresión génica específica de plástidos, dado que los plástidos son el compartimiento en el que tiene lugar la biosíntesis de los lípidos. Promotores adecuados son el promotor de RNA-polimerasa viral descrito en la solicitud PCT No. WO 95/16783 y la solicitud PCT No. WO 97/06250, y el promotor clpP de Arabidopsis descrito en la solicitud PCT No. WO 99/46394.

La invención proporciona adicionalmente un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de DNA de PKSRP de la invención clonada en el vector de expresión en orientación antisentido. Es decir, la molécula de DNA está enlazada operativamente a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (por transcripción de la molécula de DNA) de una molécula de RNA que es antisentido para un mRNA de PKSRP. Pueden seleccionarse secuencias reguladoras enlazadas operativamente a una molécula de ácido nucleico clonada en orientación antisentido, que dirigen la expresión continua de la molécula de RNA antisentido en una diversidad de tipos de células. Por ejemplo, pueden seleccionarse promotores y/o intensificadores virales, o secuencias reguladoras que dirigen la expresión constitutiva directa, específica de tejido o específica del tipo de célula de RNA antisentido. El vector de expresión antisentido puede encontrarse en la forma de un plásmido recombinante, fagémido o virus atenuado en donde los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia. La actividad de la región reguladora puede estar determinada por el tipo de célula en el que se introduce el vector. Para una exposición de la regulación de la expresión génica utilizando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 y Mol et al., 1990 FEBS Letters 268:427-430.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedadoras en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se utilizan en esta memoria de modo intercambiable. Debe entenderse que dichos términos se refieren no sólo a la célula particular de que se trata, sino que se aplican también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula originaria, pero se incluye todavía dentro del alcance del término como se utiliza en esta memoria.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, una PKSRP puede expresarse en células bacterianas tales como C. glutamicum, células de insecto, células fúngicas, o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS), algas, ciliados, células de plantas, hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Otras células hospedadoras adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica.

El DNA vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por técnicas convencionales de transformación o transfección. Tal como se utilizan en esta memoria, los términos "transformación", "transfección", "conjugación" y "transducción" tienen por objeto hacer referencia a una diversidad de métodos reconocidos en la técnica para introducir ácido nucleico extraño (v.g., DNA) en una célula hospedadora, con inclusión de co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, competencia natural, transferencia mediada por productos químicos y electroporación. Métodos adecuados para transformación o transfección de células hospedadoras que incluyen células vegetales pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) y otros manuales de laboratorio tales como Methods in Molecular Biology, 1995, vol. 44, Agrobacterium protocols, compiladores: Gartland y Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Dado que la tolerancia al estrés biótico y abiótico es un rasgo general que se desea sea heredado en una gran diversidad de plantas tales como maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza y canola, mandioca, pimiento, girasol y tagetes, plantas solanáceas tales como patata, tabaco, berenjena, y tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, plantas arbustivas (café, cacao, té), especies de Sálix, árboles (palma de aceite, cocotero), hierbas perennes y cosechas forrajeras, estas plantas de cosecha son también plantas diana preferidas para ingeniería genética como una realización adicional de la presente invención.

En particular, la invención proporciona un método de producción de una planta transgénica con un ácido nucleico codificante de PKSRP, en donde la expresión del o de los ácidos nucleicos en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés en comparación con una variedad de tipo salvaje en la planta que comprende: (a) transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de PKSRP, y (b) generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La invención proporciona también un método de incrementar la expresión de un gen de interés en una célula hospedadora en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora, en donde el gen de interés se transcribe en respuesta a una PKSRP, que comprende: (a) transformar la célula hospedadora con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de PKSRP, y (b) expresar la PKSRP en la célula hospedadora, aumentado con ello la expresión del gen transcrito en respuesta a la PKSRP, en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

Para dicha transformación de plantas, pueden utilizarse vectores binarios tales como pBinAR (Höfgen y Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). La construcción de los vectores binarios puede realizarse por ligación del cDNA en orientación sentido o antisentido en el T-DNA. En posición 5' respecto al cDNA, un promotor de planta activa la transcripción del cDNA. Una secuencia de poliadenilación está localizada en posición 3-prima respecto al cDNA. La expresión específica de tejidos puede conseguirse utilizando un promotor específico de tejido. Por ejemplo, la expresión específica de semilla puede conseguirse por clonación del promotor napin o LeB4 o USP en posición 5' respecto al cDNA. Asimismo, puede utilizarse cualquier otro elemento promotor específico de semilla. Para expresión constitutiva en la planta entera, puede utilizarse el promotor CaMV 35S. La proteína expresada puede direccionarse a un compartimiento celular utilizando un péptido señal, por ejemplo para plástidos, la mitocondria o el retículo endoplasmático (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15):285-423). El péptido señal se clona en posición 5' en marco al cDNA para archivar la localización subcelular de la proteína de fusión. Adicionalmente, promotores que son sensibles a estados de estrés abiótico tales como el promotor RD29A de Arabidopsis, pueden utilizarse con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria. Un experto en la técnica reconocerá que el promotor utilizado debería estar enlazado operativamente al ácido nucleico de tal modo que el promotor cause la transcripción del ácido nucleico, lo que da como resultado la síntesis de un mRNA que codifica un polipéptido. Alternativamente, el RNA puede ser un RNA antisentido para uso a fines de influir en la expresión subsiguiente del mismo u otro gen o genes.

Métodos alternativos de transfección incluyen la transferencia directa de DNA a flores en desarrollo por electroporación o transferencia de genes mediada por Agrobacterium. La transfección de plantas mediada por Agrobacterium puede realizarse utilizando por ejemplo la cepa GV3101 (pMP90) (Koncz y Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) o LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. La transformación puede realizarse por técnicas estándar de transformación y regeneración (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. y Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2ª edición, - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. - 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Por ejemplo, la colza puede transformarse por transformación de los cotiledones o del hipocótilo (Moloney et al., 1989 Plant Cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91:694-701). El uso de antibióticos para la selección de Agrobacterium y de plantas depende del vector binario y la cepa de Agrobacterium utilizados para la transformación. La selección de la colza se realiza normalmente utilizando kanamicina como marcador de plantas seleccionable. La transferencia de genes mediada por Agrobacterium al lino puede realizarse utilizando, por ejemplo, una técnica descrita por Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Adicionalmente, la transformación de la soja puede realizarse utilizando por ejemplo una técnica descrita en la Patente Europea No. 0424047, la Patente U.S. No. 5.322.783, la Patente Europea No. 0397687, la Patente U.S. No. 5.376.543 o la Patente U.S. No. 5.169.770. La transformación del maíz puede realizarse por bombardeo de partículas, captura de DNA mediada por polietilenglicol o por la técnica de fibras de carburo de silicio. (Véase, por ejemplo, Freeling y Walbot "The Maize Handbook" Springer Verlag: Nueva York (1993), ISBN 3-540-97826-7). Un ejemplo específico de transformación de maíz se encuentra en la Patente U.S. No. 5.990.387 y un

\hbox{ejemplo específico  de
transformación de trigo puede encontrarse en la solicitud PCT No. WO
93/07256.}

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede utilizarse para producir (es decir, expresar) una PKSRP. De acuerdo con ello, la invención proporciona adicionalmente métodos para producir PKSRPs utilizando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica una PKSRP, o en cuyo genoma se ha introducido un gen que codifica una PKSRP de tipo salvaje o alterada) en un medio adecuado hasta que se produce la PKSRP. En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar PKSRPs del medio o la célula hospedadora.

Otro aspecto de la invención se refiere a PKSRPs aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas. Una proteína o porción biológicamente activa de la misma "aislada" o "purificada" está exenta de algo del material celular cuando se produce por técnicas de DNA recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La frase "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de PKSRP en las cuales la proteína está separada de una parte de los componentes celulares de las células en las cuales se produce la misma natural o recombinantemente. En una realización, la frase "sustancialmente exenta de material celular" incluye preparaciones de una PKSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de material distinto de PKSRP (a lo que se hace referencia también en esta memoria como una "proteína contaminante"), de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de material distinto de PKSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de material distinto de PKSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de material distinto de PKSRP.

Cuando la PKSRP o porción biológicamente activa de ella se produce recombinantemente, la misma está de modo preferible sustancialmente exenta también de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, de modo más preferible menos de aproximadamente 10%, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína. La frase "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de PKSRP en las cuales la proteína está separada de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la frase "sustancialmente exenta de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de una PKSRP que tienen menos de aproximadamente 30% (referido a peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de PKSRP, de modo más preferible menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de PKSRP, de modo todavía más preferible menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de PKSRP, y de modo muy preferible menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de PKSRP. En realizaciones preferidas, las proteínas aisladas, o porciones biológicamente activas de las mismas, carecen de proteínas contaminantes del mismo organismo del que se deriva la PKSRP. Típicamente, tales proteínas se producen por expresión recombinante de, por ejemplo, una PKSRP de Physcomitrella patens en plantas distintas de Physcomitrella patens o microorganismos tales como C. glutamicum, ciliados, algas u hongos.

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteínas, proteínas de fusión, iniciadores, vectores, y células hospedadoras descritas en esta memoria pueden utilizarse en uno o más de los métodos siguientes: identificación de Physcomitrella patens y organismos afines; mapeado de genomas de organismos afines a Physcomitrella patens; identificación y localización de secuencias de interés de Physcomitrella patens; estudios de evolución; determinación de regiones de PKSRP requeridas para función; modulación de la actividad de una PKSRP; modulación del metabolismo de una o más funciones celulares; modulación del transporte transmembranal de uno o más compuestos; y modulación de la resistencia al estrés.

El musgo Physcomitrella patens presenta un miembro de los musgos. El mismo es afín a otros musgos tales como Ceratodon purpureus que es capaz de crecer en ausencia de luz. Musgos tales como Ceratodon y Physcomitrella comparten un alto grado de homología en la secuencia de DNA y el nivel de polipéptidos, lo que permite el uso de cribado heterólogo de moléculas de DNA con sondas procedentes de otros musgos u organismos, haciendo posible con ello la derivación de una secuencia de consenso adecuada para el cribado heteróloga o la anotación y predicción funcional de funciones génicas en terceras especies. La posibilidad de identificar tales funciones puede tener por tanto gran importancia, v.g., la predicción de la especificidad de sustrato de las enzimas. Adicionalmente, estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como puntos de referencia para el mapeado de genomas de musgos, o de genomas de organismos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la invención tienen una diversidad de usos. De modo muy importante, las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de la presente invención pueden utilizarse para transformar plantas, induciendo con ello tolerancia al estrés tal como sequía, salinidad alta y frío. La presente invención proporciona por tanto una planta transgénica transformada por un ácido nucleico (codificante o antisentido) de PKSRP, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta. La planta transgénica puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. La invención estipula adicionalmente que la planta transgénica puede seleccionarse de maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, cocotero, hierbas perennes y cosechas forrajeras, por ejemplo.

En particular, la presente invención describe el uso de la expresión de CPK-2 de Physcomitrella patens para producir por bioingeniería plantas tolerantes a la sequía, tolerantes a la sal y/o tolerantes al frío. Esta estrategia se ha demostrado en esta memoria para Arabidopsis thaliana, colza/canola, soja, maíz y trigo, pero su aplicación no está restringida a estas plantas. De acuerdo con ello, la invención proporciona una planta monocotiledónea o dicotiledónea que contiene una PKSRP, a saber CPK-2 (SEQ ID NO: 39), en donde el estrés ambiental es sequía, sal incrementada o temperatura incrementada o reducida.

La presente invención proporciona también métodos de modificación de la tolerancia al estrés de una planta que comprenden modificar la expresión de una PKSRP en la planta. La invención estipula que este método puede realizarse de tal modo que la tolerancia al estrés se aumenta o se reduce. En particular, la presente invención proporciona métodos de producción de una planta transgénica que tiene una tolerancia incrementada al estrés en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta que comprenden aumentar la expresión de una PKSRP en una planta.

Los métodos de aumento de la expresión de PKSRPs pueden utilizarse en casos en que la planta es transgénica o no transgénica. En los casos en que la planta es transgénica, la planta puede transformarse con un vector que contiene cualquiera de los ácidos nucleicos codificantes de PKSRP descritos anteriormente, o bien puede transformarse la planta con un promotor que dirige la expresión de PKSRP nativa en la planta, por ejemplo. La invención estipula que dicho promotor puede ser específico de un tejido. Adicionalmente, dicho promotor puede estar regulado evolutivamente. De modo alternativo, las plantas no transgénicas pueden tener expresión de PKSRP nativa modificada por inducción de un promotor nativo.

La expresión de CPK-2 (SEQ ID NO: 26) en plantas diana puede realizarse por, pero sin carácter limitante, uno de los ejemplos siguientes: (a) promotor constitutivo, (b) promotor inducible por estrés, (c) promotor inducido por productos químicos, y (d) sobre-expresión de un promotor modificado por bioingeniería con, por ejemplo, factores de transcripción derivados de dedos de cinc (Greisman y Pabo, 1997 Science 275: 657). El último caso implica la identificación de los homólogos de CPK-2 (SEQ ID NO: 39) en la planta diana así como de su promotor. Los factores de transcripción recombinantes que contienen dedos de cinc se modifican por bioingeniería para interaccionar específicamente con el homólogo de CPK-2 (SEQ ID NO: 39), activándose la transcripción del gen correspondiente.

Además de introducir las secuencias de ácido nucleico de PKSRP en plantas transgénicas, estas secuencias pueden utilizarse también para identificar un organismo como Physcomitrella patens o un pariente próximo del mismo. Asimismo, aquéllas pueden utilizarse para identificar la presencia de Physcomitrella patens o un pariente del mismo en una población mixta de microorganismos. La invención proporciona las secuencias de ácido nucleico de cierto número de genes de Physcomitrella patens; por sondeo del DNA genómico extraído de un cultivo de una población singular o mixta de microorganismos en condiciones severas con una sonda que abarque una región de un gen de Physcomitrella patens que es exclusivo de este organismo, puede averiguarse si dicho organismo está presente.

Adicionalmente, las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden servir como marcadores para regiones específicas del genoma. Esto tiene utilidad no sólo en el mapeado del genoma, sino también en estudios funcionales de las proteínas de Physcomitrella patens. Por ejemplo, para identificar la región del genoma a la cual se fija una proteína particular de fijación de DNA de Physcomitrella patens, podría digerirse el genoma de Physcomitrella patens, e incubarse los fragmentos con la proteína de fijación de DNA. Aquellos fragmentos que fijan la proteína pueden sondarse adicionalmente con las moléculas de ácido nucleico de la invención, con preferencia con marcadores fácilmente detectables. La fijación de una molécula de ácido nucleico de este tipo al fragmento del genoma permite la localización del fragmento al mapa genómico de Physcomitrella patens, y, cuando se realiza múltiples veces con diferentes enzimas, facilita una determinación rápida de la secuencia de ácido nucleico a la que se fija la proteína. Además, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser suficientemente homólogas a las secuencias de especies afines, con lo que estas moléculas de ácido nucleico pueden servir como marcadores para la construcción de un mapa genómico en musgos afines.

Las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la invención son también útiles para estudios evolutivos y estructurales de proteínas. Los procesos metabólicos y de transporte en los cuales participan las moléculas de la invención son utilizados por una gran diversidad de células procariotas y eucariotas; por comparación de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención con aquéllas que codifican enzimas similares de otros organismos, puede estimarse la afinidad evolutiva de los organismos. Análogamente, una comparación de este tipo permite una estimación de cuáles son las regiones de la secuencia que se conservan y cuáles no lo son, lo que puede ayudar a la determinación de aquellas regiones de la proteína que son esenciales para el funcionamiento de la enzima. Este tipo de determinación es valioso para estudios de ingeniería de proteínas y puede proporcionar una indicación de lo que puede tolerar la proteína en términos de mutagénesis sin perder su función.

La manipulación de las moléculas de ácido nucleico de PKSRP de la invención puede dar como resultado la producción de PKSRPs que tienen diferencias funcionales de la PKSRP de tipo salvaje. Estas proteínas pueden estar mejoradas en eficiencia o actividad, pueden estar presentes en la célula en mayores números que lo que es usual, o pueden verse reducidas en eficiencia o actividad.

Existen varios mecanismos por los cuales la alteración de una PKSRP de la invención puede afectar directamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés. En el caso de plantas que expresan PKSRPs, el transporte incrementado puede conducir a un reparto mejorado de sal y/o solutos en los tejidos y órganos de la planta. Por aumento del número o la actividad de las moléculas transportadoras que exportan moléculas iónicas desde la célula, puede ser posible afectar a la tolerancia de la célula a la sal.

El efecto de la modificación genética en plantas, C. glutamicum, hongos, algas, o ciliados sobre la tolerancia al estrés puede evaluarse por cultivo del microorganismo o planta modificado en condiciones inadecuadas y analizar luego las características de crecimiento y/o metabolismo de la planta. Tales métodos de análisis son bien conocidos por un experto en la técnica, e incluyen peso seco, peso húmedo, síntesis de proteínas, síntesis de carbohidratos, síntesis de lípidos, tasas de evapotranspiración, rendimiento de la planta en general y/o de la cosecha, floración, reproducción, producción de semillas, crecimiento de raíces, tasas de respiración, tasas de fotosíntesis, etc. (Aplicaciones de HPLC en Bioquímica, en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, vol. 3, capítulo III: Recuperación y purificación de productos, páginas 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. y Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. y Henry, J.D., 1988 Biochemical Separations, en: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. B3, capítulo 11, páginas 1-27, VCH: Weinheim; y Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).

Por ejemplo, vectores de expresión en levadura que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en Saccharomyces cerevisiae utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y temperatura. Análogamente, vectores de expresión de plantas que comprenden los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, o fragmentos de los mismos, pueden construirse y transformarse en una célula de planta apropiada tal como Arabidopsis, soja, colza, maíz, trigo, Medicago truncatula, etc., utilizando protocolos estándar. Las células transgénicas resultantes y/o las plantas derivadas de ellas pueden ensayarse luego en cuanto a fallo o alteración de su tolerancia al estrés por sequía, sal y temperatura.

La modificación por bioingeniería de uno o más genes de PKSRP de la invención puede dar también como resultado PKSRPs que tengan actividades alteradas que afectan indirectamente a la respuesta al estrés y/o la tolerancia al estrés de algas, plantas, ciliados u hongos u otros microorganismos como C. glutamicum. Por ejemplo, los procesos bioquímicos normales del metabolismo dan como resultado la producción de una diversidad de productos (v.g., peróxido de hidrógeno y otras especies de oxígeno reactivas) que pueden interferir activamente con estos mismos procesos metabólicos (por ejemplo, se sabe que el peroxinitrito nitra las cadenas laterales de la tirosina, desactivando con ello algunas enzimas que tienen tirosina en el sitio activo (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226-235). Si bien estos productos son excretados típicamente, las células pueden alterarse genéticamente para transportar más productos que lo que es típico para una célula de tipo salvaje. Por optimización de la actividad de una o más PKSRPs de la invención que están involucradas en la exportación de moléculas específicas, tales como moléculas de sal, puede ser posible mejorar la tolerancia de la célula al estrés.

Adicionalmente, las secuencias descritas en esta memoria, o fragmentos de las mismas, pueden utilizarse para generar mutaciones de silenciación ("knock-out") en los genomas de diversos organismos, tales como bacterias, células de mamífero, células de levadura, y células vegetales (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39-48). Las células silenciadas resultantes pueden evaluarse luego en cuanto a su aptitud o capacidad para tolerar diversas condiciones de estrés, su respuesta a diversas condiciones de estrés, y el efecto sobre el fenotipo y/o el genotipo de la mutación. Para otros métodos de desactivación de genes véase la Patente U.S. No. 6.004.804 "Non-Chimeric Mutational Vectors", y Puttaraju et al., 1999, "Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy", Nature Biotechnology 17: 246-252.

Las estrategias de mutagénesis mencionadas anteriormente para PKSRPs que dan como resultado una resistencia incrementada al estrés no deben entenderse como limitantes; variaciones en estas estrategias serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica. Utilizando tales estrategias, e incorporando los mecanismos descritos en esta memoria, las moléculas de ácido nucleico y proteína de la invención pueden utilizarse para generar algas, ciliados, plantas, hongos u otros microorganismos tales como C. glutamicum que expresan moléculas de ácido nucleico y proteínas PKSRP mutadas tales que se mejora la tolerancia al estrés.

Se describen anticuerpos que se fijan específicamente a una PKSRP, o una porción de la misma, tal como es codificada por un ácido nucleico descrito en esta memoria. Pueden producirse anticuerpos por muchos métodos bien conocidos (véase, v.g. Harlow and Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1988)). Resumidamente, un antígeno purificado puede inyectarse en un animal en una cantidad y en intervalos suficientes para provocar una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos pueden purificarse directamente, o pueden obtenerse células de bazo del animal. Las células pueden fusionarse luego con una línea de células inmortales e cribarse en cuanto a secreción de anticuerpos. Los anticuerpos pueden utilizarse para cribar bibliotecas de clones de ácido nucleico respecto a células que secretan el antígeno. Aquellos clones que dan resultado positivo pueden secuenciarse luego. (Véase, por ejemplo, Kelly et al., 1992, Bio/Technology 10: 163-167; Bebbington et al., 1992, Bio/Technology 10: 169-175).

Las expresiones "se fija selectivamente" y "se fija específicamente" con el polipéptido hacen referencia a una reacción de fijación que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otras entidades biológicas. Así, en condiciones de inmunoensayo diseñadas, los anticuerpos especificados fijados a una proteína particular no se fijan en una cantidad importante a otras proteínas presentes en la muestra. La fijación selectiva de un anticuerpo en tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteína particular. Pueden utilizarse una diversidad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que se fijan selectivamente con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar anticuerpos selectivamente inmunorreactivos con una proteína. Véase Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, (1988), para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que podrían utilizarse para determinar fijación selectiva.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de diversos hospedadores. Una descripción de técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales puede encontrarse en Stites et al., compiladores, "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 4ª Edición) y las referencias citadas en dicho lugar, y en Harlow and Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, 1988).

Ejemplos

La presente invención se ilustra por ácidos nucleicos y proteínas afines a CPK-2 como se muestra en SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 39, respectivamente. Todas las restantes secuencias de ácido nucleico y aminoácidos se presentan únicamente para comparación.

Ejemplo 1

Crecimiento de cultivos de Physcomitrella patens

Para este estudio, se utilizaron plantas de la especie Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. procedentes de la colección de la sección de estudios genéticos de la Universidad de Hamburgo.

Las mismas proceden de la cepa 16/14 recogida por H.L.K. Whitehouse en Gransden Wood, Huntingdonshire (Inglaterra), que fue subcultivada a partir de una espora por Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446). La proliferación de las plantas se efectuó por medio de esporas y por regeneración de los gametofitos. El protonema se desarrolló a partir de la espora haploide como un cloronema rico en cloroplastos y caulonema pobre en cloroplastos, sobre el cual se formaron yemas al cabo de aproximadamente 12 días. Éstas crecieron para dar gametóforos que llevaban anteridios y arquegonios. Después de la fertilización, se obtuvo el esporofito diploide con una seta corta y la cápsula de esporas, en la cual maduraron las meiosporas.

El cultivo se realizó en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 25ºC y una intensidad de luz de 55 micromoles^{-lm2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y un cambio luz/oscuridad de 16/8 horas. El musgo se modificó en cultivo líquido utilizando medio de Knop de acuerdo con Reski y Abel (1985; Planta 165: 354-358) o se cultivó en medio Knop sólido utilizando agar oxoide al 1% (Unipath, Basingstoke, Inglaterra). Los protonemas utilizados para aislamiento de RNA y DNA se cultivaron en cultivos líquidos aireados. Los protonemas se trituraron cada 9 días y se transfirieron a medio de cultivo fresco.

Ejemplo 2

Aislamiento de DNA total a partir de plantas

Los detalles para el aislamiento del DNA total se refieren al tratamiento de 1 gramo de peso fresco de material de planta. Los materiales utilizados incluyen los tampones siguientes: tampón CTAB: 2% (p/v) de bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (CTAB); Tris HCl 100 mM de pH 8,0; NaCl 1,4M; EDTA 20 mM; tampón de N-laurilsarcosina: 10% (p/v) de N-laurilsarcosina; Tris HCl 100 mM de pH 8,0; EDTA 20 mM.

El material de planta se trituró bajo nitrógeno líquido en un mortero para dar un polvo fino y se transfirió a vasos Eppendorf de 2 ml. El material de planta congelado se cubrió luego con una capa de 1 ml de tampón de descomposición (1 ml de tampón CTAB, 100 \mul de tampón de N-laurilsarcosina, 20 \mul de \beta-mercaptoetanol y 10 \mul de solución de proteinasa K, 10 mg/ml) y se incubó a 60ºC durante 1 hora con agitación continua mediante sacudidas. El homogeneizado obtenido se distribuyó en dos vasos Eppendorf (de 2 ml) y se extrajo dos veces por agitación mediante sacudidas con el mismo volumen de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para la separación de fases, se efectuó una centrifugación a 8000 x g y a la temperatura ambiente durante 15 minutos en cada caso. El DNA se precipitó luego a -70ºC durante 30 minutos utilizando isopropanol enfriado con hielo. El DNA precipitado se sedimentó a 4ºC y 10.000 g durante 30 minutos y se resuspendió en 180 \mul de tampón TE (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Para purificación ulterior, el DNA se trató con NaCl (concentración final 1,2M) y se precipitó de nuevo a -70º durante 30 minutos utilizando dos veces el volumen de etanol absoluto. Después de un paso de lavado con etanol al 70%, el DNA se secó y se recogió subsiguientemente en 50 \mul de H_{2}O + RNAsa (concentración final 50 mg/ml). El DNA se disolvió durante una noche a 4ºC y se efectuó subsiguientemente la digestión con RNAsa a 37ºC durante 1 hora. El almacenamiento del DNA tuvo lugar a 4ºC.

Ejemplo 3

Aislamiento de RNA total y RNA poli-(A)^{+} y construcción de una biblioteca de cDNA de Physcomitrella patens

Para el cribado de los materiales transcritos, se aislaron tanto RNA total como RNA poli(A)^{+}. El RNA total se obtuvo a partir de protonemas de tipo salvaje de 9 días siguiendo el método GTC (Reski et al., 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352-359). El RNA poli(A)^{+} se aisló utilizando DynaBeads® (Dynal, Oslo, Noruega) siguiendo las instrucciones del protocolo de los fabricantes. Después de determinar la concentración del RNA o del RNA poli(A)^{+}, el RNA se precipitó por adición de 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M de pH 4,6 y 2 volúmenes de etanol, y se guardó a -70ºC.

Para construcción de la biblioteca de cDNA, se realizó la síntesis de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina (Roche, Mannheim, Alemania) e iniciadores oligo-d(T), y la síntesis de la segunda cadena por incubación con DNA-polimerasa I, enzima Klenow y digestión con RNAsaH a 12ºC (2 horas), 16ºC (1 hora), y 22ºC (1 hora). La reacción se paró por incubación a 65ºC (10 minutos) y se transfirió subsiguientemente a hielo. Las moléculas de DNA bicatenario se hicieron romas con DNA-polimerasa T4 (Roche, Mannheim) a 37ºC (30 minutos). Los nucleótidos se separaron por extracción con fenol/cloroformo y columnas rotativas Sephadex G50. Se ligaron adaptadores EcoRI (Pharmacia, Freiburg, Alemania) a los extremos del cDNA por medio de DNA-ligasa T4 (Roche, 12ºC, una noche) y se fosforilaron por incubación con polinucleótido-quinasa (Roche, 37ºC, 30 minutos). Esta mezcla se sometió a separación en un gel de agarosa de punto de fusión bajo. Las moléculas de DNA mayores que 300 pares de bases se eluyeron del gel, se extrajeron con fenol, se concentraron en columnas Elutip-D (Schleicher and Schuell, Dassel, Alemania) y se ligaron a ramas vectoras, después de lo cual se empaquetaron en fagos lambda ZAPII o fagos lambda ZAP-Express utilizando el Kit Gigapack Gold (Stratagene, Amsterdam, Países Bajos) utilizando material y siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4

Secuenciación y anotación de la función de ESTs de Physcomitrella patens

Se utilizaron bibliotecas de cDNA como se describe en el Ejemplo 3 para secuenciación del DNA de acuerdo con métodos estándar, y en particular, por el método de terminación de cadenas utilizando el Kit ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Alemania). La secuenciación aleatoria se llevó a cabo subsiguientemente a la recuperación preparativa de plásmido a partir de bibliotecas de cDNA por escisión másica in vivo, retransformación, y extensión subsiguiente de DH10B sobre placas de agar (detalles de material y protocolo de Stratagene, Amsterdam, Países Bajos). Se preparó DNA plasmídico a partir de cultivos de E. coli desarrollados durante una noche, que crecían en medio de Caldo Luria que contenía ampicilina (véase Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) en un robot de preparación de DNA Qiagene (Qiagen, Hilden) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se utilizaron iniciadores de secuenciación con las secuencias de nucleótidos siguientes:

1

Las secuencias se procesaron y anotaron utilizando el paquete de soporte lógico EST-MAX proporcionado comercialmente por Bio-Max (Munich, Alemania). El programa incorpora prácticamente todos los métodos bioinformáticos importantes para caracterización funcional y estructural de secuencias de proteínas. Para referencia se remite al sitio de la web en pedant.mips.biochem.mpg.de. Los algoritmos más importantes incorporados en EST-MAX son: FASTA: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Pearson W.R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FAST and FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., y Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR: High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27:329-335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680; TMAP: Transmembrane region prediction from multiply aligned sequences. Persson, B. and Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237:182-192; ALOM2: Transmembrane region prediction from single sequences. Klein, P., Kanehisa, M., and DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Version 2 by Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detection of PROSITE protein sequence pattems. Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A.M., Smith I.E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919-921; BLIMPS: Similarity searches against a database of ungapped blocks. J.C. Wallace and Hemicoff S., (1992); PATMAT: A searching and extraction program for sequence, pattern and block queries and databases, CABIOS 8:249-254. Written by Bill Alford.

Ejemplo 5

Identificación de ORFs de Physcomitrella patens correspondientes a CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2

Los cDNAs parciales de Physcomitrella patens (ESTs) que se muestran en la Tabla 1 siguiente se identificaron en el programa de secuenciación EST de Physcomitrella patens utilizando el programa EST-MAX por análisis BLAST. Los Números de Identificación de Secuencia correspondientes a estas ESTs son como sigue: CPK-2 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12) y CPK-2 (SEQ ID NO: 13; inventiva).

TABLA 1

2

TABLA 2 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpPK-6 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap: penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

3

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpPK-7 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

4

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpPK-8 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna:10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

5

TABLA 5 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpPK-9 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

6

TABLA 6 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCK-1 (para comparación y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

7

TABLA 7 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCK-2 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

8

TABLA 8 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCK-3 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpMPK-2 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

10

TABLA 10 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpMPK-3 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

11

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 11 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpMPK-4 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

12

TABLA 12 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpMPK-5 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

13

TABLA 13 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCPK-1 (para comparación) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 14 Grado de Identidad y Semejanza de Aminoácidos de PpCPK-2 (inventiva) y Otras Proteínas Homólogas (se utilizó el programa GCG Gap; penalidad por laguna: 10; penalidad por extensión de laguna: 0,1; matriz de registro: blosum62)

15

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6

Clonación del cDNA de longitud total de Physcomitrella patens codificante de CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2

Para aislar los clones codificantes de CPK-2 (SEQ ID NO: 26), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) y CPK-2 inventivo (SEQ ID NO: 26) a partir de Physcomitrella patens, se crearon bibliotecas de cDNA con el kit de Amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories) siguiendo instrucciones del fabricante. Se utilizó como molde RNA total aislado como se describe en el Ejemplo 3. Los cultivos se trataron antes del aislamiento del RNA como sigue: Estrés por Sal: 2, 6, 12, 24, 48 horas con medio complementado con NaCl 1-M; Estrés por Frío: 4ºC durante los mismos tiempos que en el caso de la sal; Estrés por Sequía: los cultivos se incubaron sobre papel de filtro seco durante los mismos tiempos que en el caso de la sal.

\vskip1.000000\baselineskip

Protocolo 5' RACE

Se utilizaron las secuencias EST CPK-2 (SEQ ID NO: 1), PK-7 (SEQ ID NO: 2), PK-8 (SEQ ID NO: 3), PK-9 (SEQ ID NO: 4), CK-1 (SEQ ID NO: 5), CK-2 (SEQ ID NO: 6), CK-3 (SEQ ID NO: 7), MPK-2 (SEQ ID NO: 8), MPK-3 (SEQ ID NO: 9), MPK-4 (SEQ ID NO: 10), MPK-5 (SEQ ID NO: 11), CPK-1 (SEQ ID NO: 12) y CPK-2 inventivo (SEQ ID NO: 13) identificadas por la búsqueda en bases de datos como se describe en el Ejemplo 4, para diseñar oligos para RACE (véase Tabla 15). Las secuencias extendidas para estos genes se obtuvieron por realización de Amplificación Rápida de la reacción en cadena de la polimerasa en los Extremos de cDNA (RACE PCR) utilizando el kit PCR Advantage 2 (Clontech Laboratories) y el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech Laboratories) utilizando un Termociclador Biometra T3 siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias obtenidas a partir de las reacciones RACE, correspondían a regiones codificantes de longitud total de CC-2 y CC-3 y se utilizaron para diseñar oligos para clonación de longitud total de los genes respectivos (véase amplificación de longitud total a continuación).

\vskip1.000000\baselineskip

Amplificación de Longitud Total

Clones de longitud total correspondientes a CPK-2 (SEQ ID NO: 26), PK-7 (SEQ ID NO: 15), PK-8 (SEQ ID NO: 16), PK-9 (SEQ ID NO: 17), CK-1 (SEQ ID NO: 18), CK-2 (SEQ ID NO: 19), CK-3 (SEQ ID NO: 20), MPK-2 (SEQ ID NO: 21), MPK-3 (SEQ ID NO: 22), MPK-4 (SEQ ID NO: 23), MPK-5 (SEQ ID NO: 24), CPK-1 (SEQ ID NO: 25) y CPK-2 inventivo (SEQ ID NO: 26) se obtuvieron por realización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con iniciadores específicos de genes (véase Tabla 15) y la EST original como molde. Las condiciones para la reacción fueron condiciones estándar con DNA-polimerasa PWO (Roche). La PCR se realizó de acuerdo con condiciones estándar y con protocolos del fabricante (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., Termociclador Biometra T3). Los parámetros para la reacción fueron: 5 minutos a 94ºC seguidos por cinco ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC y 1,5 minutos a 72ºC. Esto fue seguido por 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 1,5 minutos a
72ºC.

Los fragmentos amplificados se extrajeron de gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) y se ligaron en el vector TOPO pCR2.1 (Invitrogen) siguiendo instrucciones del fabricante. Los vectores recombinantes se transformaron en células Top10 (Invitrogen) utilizando condiciones estándar (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y). Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 100 \mug/ml de carbenicilina, 0,8 mg de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactosido) y 0,8 mg de IPTG (isopropiltio-\beta-D-galactosido) desarrollado durante una noche a 37ºC. Se seleccionaron las colonias blancas y se utilizaron para inocular 3 ml de LB líquido que contenía 100 \mug/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se extrajo el DNA plasmídico utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo instrucciones del fabricante. Los análisis de clones subsiguientes y el mapeado de restricción se realizaron de acuerdo con técnicas estándar de biología molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 15 Esquema e iniciadores utilizados para clonación de clones de longitud total

16

17

18

19

20

Ejemplo 7

Modificación por bioingeniería de plantas de Arabidopsis tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo Construcción del vector binario: kanamicina

El constructo plasmídico pACGH101 se digirió con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). Esto dio como resultado un fragmento de vector con el promotor de Arabidopsis Actin 2 con un intrón interno y el terminador OCS3. Los iniciadores para la amplificación por PCR del gen NPTII se diseñaron como sigue:

21

El gen NPTII de 0,9 kilobases se amplificó por PCR a partir de DNA del plásmido 2301 de pCambia [94ºC 60 s, {94ºC 60 s, 61ºC (-0,1ºC por ciclo) 60 s, 72ºC 2 min} x 25 ciclos, 72ºC 10 min en máquina de Gradiente T Biometra], y se purificó por medio del kit de Extracción de PCR Qiaquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El DNA de la PCR se subclonó luego en el vector pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (constructo NPT-Topo). Estas ligaciones se transformaron en células Top10 (Invitrogen) y se dejaron crecer sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el estuche Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) y se secuenció en ambas direcciones 5' y 3' utilizando condiciones estándar. El análisis subsiguiente de los datos de secuencia utilizando el soporte lógico VectorNTI reveló la ausencia de errores de PCR presentes en la secuencia del gen
NPTII.

El constructo NPT-Topo se digirió luego con PstI (Roche) y FseI (NEB) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El fragmento de 0,9 kilobases se purificó en gel de agarosa y se extrajo por medio del kit de extracción de DNA Qiaex II (Qiagen). El fragmento de inserción Pst/Fse de NPT-Topo y el fragmento vector Pst/Fse de pACGH101 se ligaron luego utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. La ligación se transformó luego en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar, creando el constructo pBPSsc019. Se seleccionaron las colonias sobre placas LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Estas colonias se utilizaron luego para inocular 2 ml de medio LB con 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se recuperó utilizando el kit Qiaprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

El constructo pBPSSC019 se digirió con KpnI y BsaI (Roche) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento se purificó por medio de gel de agarosa y se extrajo luego mediante el kit de extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con sus instrucciones, dando como resultado una casete Act-NPT de 3 kilobases, que incluía el promotor Actin 2 de Arabidopsis con intrón interno, el gen NPTII y el terminador OCS3.

El vector pBPSJH001 se digirió con SpeI y ApaI (Roche) y se rellenó para hacer romos los extremos con enzima Klenow y dNTPs (Roche) 0,1 mM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto produjo un fragmento vector de 10,1 kilobases menos la casete de Gentamicina, que se recircularizó por autoligación con DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformó en células Top10 (Invitrogen) en condiciones estándar. Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El plásmido recircularizado se digirió luego nuevamente con KpnI (Roche) y se extrajo del gel de agarosa por medio del kit de Extracción de DNA Qiaex II (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

La inserción Act-NPT cortada con Kpn y el vector recircularizado pBPSJH001 cortado con Kpn se ligaron luego uno a otro utilizando DNA-ligasa T4 (Roche) y se transformaron en células Top10 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El constructo resultante, pBPSsc022, contenía ahora el Promotor Super, el gen GUS, el terminador NOS, y la casete Act-NPT. Las células transformadas se seleccionaron sobre agar LB que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. Se utilizaron luego las colonias para inocular 2 ml de LB líquido que contenía 50 \mug/ml de sulfato de kanamicina y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC. El DNA plasmídico se extrajo utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la confirmación del éxito de la ligación por medio de productos de digestión con restricción, el DNA plasmídico pBPSsc022 se propagó ulteriormente y se recuperó utilizando el Kit Plasmid Midiprep (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

\vskip1.000000\baselineskip

Subclonación de CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo en el vector binario

Los fragmentos que contenían las diferentes proteína-quinasas de Physcomitrella patens se subclonaron a partir de los vectores recombinantes PCR2.1 TOPO por doble digestión con enzimas de restricción (véase la Tabla 16) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El fragmento de la subsecuencia se escindió del gel de agarosa con un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se ligó en los vectores binarios pGMSG, se escindió con XmaI y EcI 136II y se desfosforiló antes de la ligación. El pGMSG recombinante resultante contenía el factor de transcripción correspondiente en la orientación de sentido bajo el super-promotor constitutivo.

TABLA 16 A continuación se indican los nombres de los diversos constructos de los factores de transcripción de Physcomitrella patens utilizados para transformación de plantas

22

\vskip1.000000\baselineskip

Transformación de Agrobacterium

Los vectores recombinantes se transformaron en Agrobacterium tumefaciens C58C1 y PMP90 de acuerdo con condiciones estándar (Hoefgen y Willmitzer, 1990).

\vskip1.000000\baselineskip

Transformación de plantas

Se cultivaron y transformaron Arabidopsis thaliana ecotipo C24 de acuerdo con condiciones estándar (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris, 316: 1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856-1860).

\vskip1.000000\baselineskip

Cribado de las Plantas Transformadas

Se esterilizaron semillas T1 de acuerdo con protocolos estándar (Xiong et al., 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159-170). Las semillas se extendieron sobre medio 1/2 Murashige y Skoog (MS) (Sigma-Aldrich) de pH 5,7 con KOH, agar al 0,6% y se complementaron con 1% de sacarosa, 0,5 g/l de ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES) (Sigma-Aldrich), 50 \mug/ml de kanamicina (Sigma-Aldrich), 500 \mug/ml de carbenicilina (Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich). Las semillas se vernalizaron en las placas durante cuatro días a 4ºC. Las semillas se dejaron germinar en una cámara climatizada a una temperatura del aire de 22ºC y con una intensidad luminosa de 40 micromoles^{-1m2} (luz blanca; tubo fluorescente Philips TL 65W/25) y ciclo diurno de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Las plantas de semillero transformadas se seleccionaron después de 14 días y se transfirieron a medio 1/2 MS de pH 5,7 con placas de agar al 0,6% en KOH complementadas con 0,6% de agar, 1% de sacarosa, 0,5 g/l de MES (Sigma-Aldrich) y 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich) y se dejó que se recuperaran durante cinco-siete
días.

\vskip1.000000\baselineskip

Cribado de la Tolerancia a la Sequía

Las plantas de semillero T1 se transfirieron a papel de filtro seco estéril en una cápsula Petri y se dejaron desecar durante 2 horas a 80% RH (humedad relativa) en un Armario de Cultivo Percieval MLR-350H, micromoles^{-1m2} (luz blanca, tubo fluorescente Philips TL 65W/25). Se redujo luego la RH a 60% y se desecaron ulteriormente las plantas de semillero durante 8 horas. Se retiraron luego las plantas de semillero y se pusieron sobre placas de agar 0,6% MS 1/2 complementadas con 2 \mug/ml de benomil (Sigma-Aldrich) y 0,5 g/l de MES (Sigma-Aldrich), y se registraron después de 5 días.

En condiciones de estrés por sequía, las plantas PpPK-6 que sobreexpresaban Arabidopsis thaliana exhibían una tasa de supervivencia de 95% (20 supervivientes de 21 plantas estresadas) al cribado de estrés; PpPK-8, 40% (2 supervivientes de 5 plantas estresadas), PpPK-9, 78% (38 supervivientes de 49 plantas estresadas), PpCK-1, 50% (5 supervivientes de 10 plantas estresadas), PpCK-2, 52% (16 supervivientes de 31 plantas estresadas), PpCK-3, 60% (3 supervivientes de 5 plantas estresadas), PpMPK-2, 100% (52 supervivientes de 52 plantas estresadas), PpMPK-3, 98% (44 supervivientes de 45 plantas estresadas), PpMPK-4, 92% (11 supervivientes de 12 plantas estresadas), PpMPK-5, 100% (9 supervivientes de 9 plantas estresadas), PpCPK-1, 60% (12 supervivientes de 20 plantas estresadas), PpCPK-2, 89% (17 supervivientes de 19 plantas estresadas), mientras que el control sin transformar presentaba solamente una tasa de supervivencia de 11% (1 superviviente de 9 plantas estresadas). Es de notar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 17 Sumario de los tests de estrés por sequía

23

\vskip1.000000\baselineskip

Cribado de Tolerancia a la Helada (para comparación)

Se llevaron plantas de semillero a cápsulas Petri que contenían 1/2 MS agar al 0,6% complementado con 2% de sacarosa y 2 \mug/ml de benomil. Después de 4 días, las plantas de semillero se incubaron a 4ºC durante 1 hora y se cubrieron luego con hielo en virutas. Se pusieron luego las plantas de semillero en una Cámara Ambiental Environmental Specialist ES2000 y se incubaron durante 3,5 horas comenzando a -1,0ºC, con disminución de la temperatura a -1ºC por hora. Las plantas de semillero se incubaron luego a -5,0ºC durante 24 horas y se dejaron descongelar luego a 5ºC durante 12 horas. El agua se separó por vertido y las plantas de semillero se registraron al cabo de 5
días.

En condiciones de estrés por helada, las plantas PPK-7 que sobreexpresaban Arabidopsis thaliana presentaban una tasa de supervivencia de 73% (8 supervivientes de 11 plantas estresadas) al cribado de estrés; PpPK-9, 100% (45 supervivientes de 45 plantas estresadas), PpCK-1, 100% (14 supervivientes de 14 plantas estresadas), PpMPK-2, 68% (36 supervivientes de 53 plantas estresadas), PpMPK-3, 92% (24 supervivientes de 26 plantas estresadas), PpCPK-2, 64% (7 supervivientes de 11 plantas estresadas), mientras que el control sin transformar exhibía solamente una tasa de supervivencia de 2% (1 supervivientes de 48 plantas estresadas). Es de notar que los análisis de estas líneas transgénicas se realizaron con plantas T1, y por consiguiente, los resultados serán mejores cuando se encuentre un expresante homocigótico fuerte.

TABLA 18 Sumario de los tests de estrés por helada (comparación)

24

\vskip1.000000\baselineskip

Cribado de tolerancia a la sal (para comparación)

Se transfirieron plantas de semillero a papel de filtro impregnado en ½ MS y se pusieron sobre ½ MS con agar al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil la noche anterior al cribado de tolerancia a la sal. Para el cribado de tolerancia a la sal, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó a pilas de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 50 mM, en una cápsula Petri. Al cabo de 2 horas, el papel de filtro con las plantas de semillero se llevó a tiras de papel de filtro estéril, impregnadas en NaCl 200 mM en una cápsula Petri. Al cabo de 10 horas, las plantas de semillero se llevaron a cápsulas Petri que contenían ½ MS con agar al 0,6% complementado con 2 \mug/ml de benomil. Las plantas de semillero se registraron después de 5 días.

Las plantas transgénicas se criban respecto a su tolerancia mejorada a la sal, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8

Detección de los transgenes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo en las líneas transgénicas de Arabidopsis

Una hoja de una planta de Arabidopsis de tipo salvaje y una planta transgénica de Arabidopsis se homogeneizaron en 250 \mul de tampón de bromuro de hexadeciltrimetil-amonio (CTAB) (2% CTAB, NaCl 1,4 M, EDTA 8 mM y Tris 20 mM, pH 8,0) y 1 \mul de \beta-mercaptoetanol. Las muestras se incubaron a 60-65ºC durante 30 minutos y se añadieron luego 250 \mul de cloroformo a cada muestra. Las muestras se agitaron enérgicamente durante 3 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 18.000 x g. Se retiró el sobrenadante de cada muestra y se añadieron 150 \mul de isopropanol. Las muestras se incubaron a la temperatura ambiente durante 15 minutos, y se centrifugaron durante 10 minutos a 18.000 x g. Cada pelet se lavó con 70% de etanol, se secó, y se resuspendió en 20 \mul de TE. Se utilizaron 4 \mul de la suspensión anterior en una reacción PCR de 20 \mul utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche Molecular Biochemicals) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El plásmido del vector binario con cada gen clonado en el mismo se utilizó como control positivo, y como control negativo se utilizó el DNA genómico C24 de tipo salvaje en las reacciones PCR. Se analizaron 10 \mul de la reacción PCR en gel de 0,8% agarosa-bromuro de etidio.

\vskip1.000000\baselineskip

PpPk-6: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

25

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,8 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpPK-7: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

Los iniciadores se utilizaron en la primera tanda de reacciones con el programa siguiente: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se generó un fragmento de 1,1 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas T1.

\vskip1.000000\baselineskip

PpPK-8: Los iniciadores utilizados en las reacciones fueron:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,6 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpPK-9: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,4 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpCK-1: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,7 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpCK-2: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,9 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\newpage

PpCK-3: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 1,2 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpMPK-2: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

PpMPK-3: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,2 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpMPK-4: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

PpMPK-5: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\newpage

PpCPK-1: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

El programa PCR fue como sigue: 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 62ºC y 4 minutos a 72ºC, seguido por 10 minutos a 72ºC. Se produjo un fragmento de 2,3 kb a partir del control positivo y las plantas transgénicas.

\vskip1.000000\baselineskip

PpCPK-2: Los iniciadores utilizados en las reacciones son:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

Los transgenes se amplificaron con éxito a partir de las líneas transgénicas T1, pero no del tipo salvaje C24. Este resultado indica que las plantas transgénicas T1 contienen al menos una copia de los transgenes. No había indicación alguna de la existencia de genes idénticos o muy similares en el control de Arabidopsis thaliana sin 564transformar que pudo amplificarse por este método.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9

Detección del mRNA de los transgenes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo en líneas transgénicas de Arabidopsis

La expresión de los transgenes se detectó utilizando RT-PCR. El RNA total se aisló a partir de plantas tratadas por estrés utilizando un procedimiento adaptado de (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362). Se recogieron muestras de hojas (50-100 mg) y se molieron hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido. El tejido molido se resuspendió en 500 \mul de una mezcla 1:1 mantenida a 80ºC de fenol a tampón de extracción (LiCl 100 mM, Tris 100 mM de pH 8, EDTA 10 mM, 1% SDS), seguido por agitación tumultuosa breve para mezclar. Después de la adición de 250 \mul de cloroformo, cada muestra se agitó brevemente de modo tumultuoso. Se centrifugaron luego las muestras durante 5 minutos a 12.000 x g. La fase acuosa superior se llevó a un tubo Eppendorf nuevo. El RNA se precipitó por adición de una décima parte de su volumen de acetato de sodio 3M y 2 volúmenes de etanol al 95%. Las muestras se mezclaron por inversión y se dejaron en hielo durante 30 minutos. El RNA se redujo a un pelet por centrifugación a 12.000 x g durante 10 minutos. Se retiró el sobrenadante y los pelets se secaron brevemente al aire. Los pelets de la muestra de RNA se resuspendieron en 10 \mul de agua tratada con DEPC. Para separar el DNA contaminante de las muestras, se trató cada una con DNasa exenta de RNasa (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se sintetizó cDNA a partir del RNA total utilizando el kit de síntesis de cDNA de la primera cadena (Boehringer Mannheim) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La amplificación por PCR de un fragmento de gen específico del cDNA sintetizado se realizó utilizando DNA-polimerasa Taq (Roche) e iniciadores específicos del gen (véase Tabla 15 para los iniciadores) en la reacción siguiente: 1X tampón PCR, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,2 \muM de cada iniciador, 0,2 \muM de dNTPs, 1 unidad de polimerasa, 5 \mul de cDNA de la reacción de síntesis. La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todo momento. Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio, y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-One
(Bio-Rad).

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugerían fuertemente que su producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en la línea transgénica. Por otra parte, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7. Esto respalda sólidamente la afirmación de los inventores de que la tolerancia al estrés observada es debida al transgén
introducido.

38

39

La amplificación se realizó en las condiciones siguientes: desnaturalización, 95ºC, 1 minuto; reasociación, 62ºC, 30 segundos; extensión, 72ºC, 1 minuto, 35 ciclos; extensión, 72ºC, 5 minutos; mantenimiento, 4ºC, en todo momento. Los productos PCR se corrieron sobre un gel de agarosa al 1%, se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV utilizando el sistema de documentación de gel Quantity-one (Bio-Rad).

La expresión de los transgenes se detectó en la línea transgénica T1. Estos resultados indicaban que los transgenes se expresan en las líneas transgénicas y sugieren fuertemente que su producto génico mejoraba la tolerancia de las plantas al estrés en las líneas transgénicas. De acuerdo con la afirmación anterior, no pudo detectarse por este método expresión alguna de genes endógenos idénticos o muy similares. Estos resultados están de acuerdo con los datos del Ejemplo 7.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10

Modificación por ingeniería genética de plantas de soja tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo

Se utilizaron los constructos pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012,
pBPSYyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar soja como se describe a continuación.

Se esterilizaron en la superficie semillas de soja con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, las semillas se lavaron cuatro veces con agua destilada y se dejaron sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 6 a 39 horas. Se desprendieron las cubiertas de las semillas, y se apartaron los cotiledones del eje del embrión. Se examinó el eje del embrión para asegurarse de que la región meristemática no estaba deteriorada. Los ejes del embrión escindidos se recogieron en una cápsula Petri estéril semi-abierta y se secaron al aire hasta un contenido de humedad menor que 20% (peso fresco) en una cápsula Petri sellada hasta su utilización posterior.

Se preparó un cultivo de Agrobacterium tumefaciens a partir de una sola colonia en medio sólido LB más antibióticos apropiados (v.g. 100 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/l de kanamicina) seguido por cultivo de la colonia simple en medio LB líquido hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8. A continuación, el cultivo de bacterias se redujo a un pelet a 7000 rpm durante 7 minutos a la temperatura ambiente, y se resuspendió en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) complementado con acetosiringona 100 \muM. Los cultivos bacterianos se incubaron en este medio de pre-inducción durante 2 horas a la temperatura ambiente antes de su utilización. Los ejes de los embriones de las semillas cigóticas de soja con aproximadamente 15% de contenido de humedad se embebieron durante 2 horas a la temperatura ambiente con el cultivo de la suspensión de Agrobacterium pre-inducida. Los embriones se retiraron del cultivo de imbibición y se transfirieron a cápsulas Petri que contenían medio MS sólido complementado con 2% de sacarosa y se incubaron durante 2 días, en la oscuridad a la temperatura ambiente. Alternativamente, los embriones se pusieron sobre papel de filtro estéril húmedo (medio MS líquido) en una cápsula Petri y se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente. Después de este periodo, los embriones se transfirieron a medio MS sólido o líquido complementado con 500 mg/l de carbenicilina o 300 mg/ml de cefotaximo para matar las agrobacterias. El medio líquido se utilizó para humedecer el papel de filtro estéril. Los embriones se incubaron durante 4 semanas a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} y fotoperiodo de 12 horas. Una vez que las plantas de semillero produjeron raíces, se transfirieron las mismas a suelo Metromix estéril. El medio de las plantas in vitro se eliminó por lavado antes de transferir las plantas al suelo. Las plantas se mantuvieron bajo una cubierta de plástico durante una semana para favorecer el proceso de aclimatación. Las plantas se transfirieron luego a una sala de crecimiento donde se incubaron a 25ºC, bajo 150 \mumol m^{-2}s^{-1} de intensidad luminosa y fotoperiodo de 12 horas durante aproximadamente 80 días.

Las plantas transgénicas se cribaron luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de cribado descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11

Manipulación por ingeniería genética de plantas de colza/canola tolerantes al estrés por sobreexpresión de los genes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo

Se utilizaron los constructos pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012,
pBPSYyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar colza/canola como se describe a continuación.

El método de transformación de plantas descrito en esta memoria es aplicable también a Brassica y otras cosechas. Las semillas de canola se esterilizan en la superficie con etanol al 70% durante 4 minutos a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas, seguido por 20% (v/v) de Clorox complementado con 0,05% (v/v) de Tween durante 20 minutos, a la temperatura ambiente con agitación continua mediante sacudidas. A continuación, se lavan las semillas cuatro veces con agua destilada y se ponen sobre papel de filtro estéril húmedo en una cápsula Petri a la temperatura ambiente durante 18 horas. A continuación, se retiran las cubiertas de las semillas y se secan al aire las semillas durante una noche en una cápsula Petri estéril semi-abierta. Durante este periodo, las semillas pierden aproximadamente 85% de su contenido de agua. Se guardan luego las semillas a la temperatura ambiente en una cápsula Petri sellada hasta su uso ulterior. Los constructos de DNA y la imbibición de los embriones son como se describe en el Ejemplo 10. Las muestras de las plantas transgénicas primarias (T0) se analizan por PCR para confirmar la presencia de T-DNA. Estos resultados se confirman por hibridación Southern en la cual el DNA se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nailon cargada positivamente (Roche Diagnostics). Se utiliza el Kit de Síntesis de Sondas PCR DIG (Roche Diagnostics) para preparar una sonda marcada con digoxigenina por PCR, y se utiliza de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las plantas transgénicas se criban luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de cribado descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12

Modificación por bioingeniería de plantas de maíz tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo

Se utilizaron los constructos pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012,
pBPSYyw034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar maíz como se describe a continuación.

La transformación de maíz (Zea mays L.) se realiza por el método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotech. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que lleva vectores "super-binarios", y las plantas transgénicas se recuperan por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación comprendida entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se criban luego respecto a su tolerancia mejorada a la sequía, la sal y/o el frío de acuerdo con el método de cribado descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia al estrés.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13

Modificación por bioingeniería de plantas de trigo tolerantes al estrés por sobre-expresión de los genes CPK-2, PK-7, PK-8, PK-9, CK-1, CK-2, CK-3, MPK-2, MPK-3, MPK-4, MPK-5, CPK-1 y CPK-2 inventivo

Se utilizaron los constructos pBPSJyw022, pBPSJyw012, pBPSJYW030, pBPSERG010, pBPSSY012, pBPSYyw-034, pBPSSY011, pBPSSY016, pBPSJyw014, pBPSJyw025, pBPSERG009, pBPSERG019 y pBPSJyw008 para transformar trigo como se describe a continuación.

La transformación del trigo se realiza por el método descrito por Ishida et al. 1996. Nature Biotech. 14745-50. Los embriones inmaduros se co-cultivan con Agrobacterium tumefaciens que lleva vectores "super-binarios", y se recuperan plantas transgénicas por organogénesis. Este procedimiento proporciona una eficiencia de transformación entre 2,5% y 20%. Las plantas transgénicas se criban luego respecto a su tolerancia mejorada al estrés de acuerdo con el método de cribado descrito en el Ejemplo 7, demostrando que la expresión de los transgenes confiere tolerancia a la sequía.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14

Identificación de Genes Homólogos y Heterólogos

Pueden utilizarse secuencias de genes para identificar genes homólogos o heterólogos a partir de cDNA o bibliotecas genómicas. Los genes homólogos (v.g., clones de cDNA de longitud total) pueden aislarse por hibridación de ácido nucleico utilizando por ejemplo bibliotecas de cDNA. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, se extienden en placas 100.000 hasta 1.000.000 de bacteriófagos recombinantes y se transfieren a membranas de nailon. Después de desnaturalización con álcali, se inmoviliza el DNA en la membrana mediante, v.g., reticulación por UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de alta severidad. En solución acuosa, la hibridación y el lavado se realizan a una concentración iónica de NaCl 1M y una temperatura de 68ºC. Las sondas de hibridación se generan mediante, v.g., marcación por transcripción radiactiva de la mella (^{32}P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania). Las señales se detectan por autorradiografía.

Los genes parcialmente homólogos o heterólogos que son afines pero no idénticos pueden identificarse de manera análoga al procedimiento arriba descrito utilizando condiciones de hibridación y lavado a baja severidad. Para la hibridación acuosa, la concentración iónica se mantiene normalmente a NaCl 1M mientras que la temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42ºC.

El aislamiento de secuencias génicas con homologías (o identidad/similitud de secuencias) únicamente en un dominio diferenciado de (por ejemplo 10-20 aminoácidos) puede llevarse a cabo utilizando sondas oligonucleotídicas sintéticas radiomarcadas. Los oligonucleótidos radiomarcados se preparan por fosforilación del extremo 5-prima de dos oligonucleótidos complementarios con polinucleótido-quinasa T4. Los oligonucleótidos complementarios se reasocian y se ligan para formar concatémeros. Los concatémeros bicatenarios se someten luego a radiomarcación mediante, por ejemplo, transcripción de la mella. La hibridación se realiza normalmente en condiciones de severidad baja utilizando concentraciones altas de oligonucleótidos.

Solución de hibridación de oligonucleótidos:

: 6 x SSC

: Fosfato de sodio 0,01M

: EDTA 1 mM (pH 8)

: 0,5% de SDS

: 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado

: 0,1% de leche desnatada desecada.

Durante la hibridación, la temperatura se reduce gradualmente a 5-10ºC por debajo del valor Tm estimado de los oligonucleótidos o hasta la temperatura ambiente seguido por pasos de lavado y autorradiografía. El lavado se realiza con severidad baja tal como 3 pasos de lavado utilizando 4 x SSC. Detalles adicionales han sido descritos por Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15

Identificación de Genes Homólogos por Cribado de Bibliotecas de Expresión con Anticuerpos

Pueden utilizarse clones de c-DNA para producir proteína recombinante por ejemplo en E. coli (v.g. sistema pQE QIAexpress de Qiagen). Las proteínas recombinantes se purifican luego normalmente por afinidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). Las proteínas recombinantes se utilizan luego para producir anticuerpos específicos, por ejemplo utilizando técnicas estándar para inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican por afinidad utilizando una columna Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante como ha sido descrito por Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257-262. El anticuerpo puede utilizarse luego para cribar bibliotecas de expresión de cDNA a fin de identificar genes homólogos o heterólogos por un cribado inmunológico (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16

Mutagénesis in vivo

La mutagénesis in vivo de microorganismos puede realizarse por paso de DNA plasmídico (u otro vector) a través de E. coli u otros microorganismos (v.g., Bacillus spp., o levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae) que están deteriorados en sus capacidades para mantener la integridad de su información genética. Las cepas mutantes típicas tienen mutaciones en los genes para el sistema de reparación de DNA (v.g., mutHLS, mutD, mutT, etc.; para referencia, véase Rupp, W.D. (1996) DNA Repair Mechanisms, en: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington). Tales cepas son bien conocidas por los expertos en la técnica. El uso de dichas cepas se ilustra, por ejemplo, en Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34. La transferencia de moléculas de DNA mutadas a plantas se realiza con preferencia después de selección y ensayo en microorganismos. Se generan plantas transgénicas de acuerdo con diversos ejemplos comprendidos en la sección de ejemplos de este documento.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17

Análisis in Vitro de la Función de los Genes de Physcomitrella en Organismos Transgénicos

La determinación de las actividades y parámetros cinéticos de las enzimas está bien establecida en la técnica. Los experimentos para determinar la actividad de cualquier enzima dada alterada tienen que adaptarse a la actividad específica de la enzima de tipo salvaje, lo que está perfectamente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Revisiones acerca de enzimas en general, así como detalles específicos concernientes a la estructura, cinética, principios, métodos, aplicaciones y ejemplos para la determinación de muchas actividades enzimáticas pueden encontrarse, por ejemplo, en las referencias siguientes: Dixon, M., and Webb, E.C., (1979) Enzymes. Longmans: Londres; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: Nueva York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3rd ed. Academic Press: Nueva York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheirn; and Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.

La actividad de las proteínas que se fijan a DNA puede medirse por varios métodos bien establecidos, tales como los ensayos de desplazamiento de bandas de DNA (denominados también ensayos de retardación en gel). El efecto de tales proteínas sobre la expresión de otras moléculas puede medirse utilizando ensayos de genes informadores (tales como el descrito en Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 y las referencias citadas en dicho lugar). Los sistemas de ensayo de genes informadores son bien conocidos y están bien establecidos para aplicaciones en células tanto pro- como eucariotas, utilizando enzimas tales como \beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde, y varias otras.

La determinación de la actividad de las proteínas de transporte de membrana puede realizarse de acuerdo con técnicas tales como las descritas en Gennis R.B. Pores, Channels and Transporters, en Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85-137, 199-234 y 270-322, Springer: Heidelberg (1989).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18

Purificación del Producto Deseado a partir de Organismos Transformados

La recuperación del producto deseado a partir de material de plantas (es decir, Physcomitrella patens o Arabidopsis thaliana), hongos, algas, ciliados, células de C. glutamicum, u otras células bacterianas transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria, o el sobrenadante de los cultivos arriba descritos puede realizarse por diversos métodos bien conocidos en la técnica. Si el producto deseado no es secretado por las células, puede recogerse del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y las células pueden lisarse por técnicas estándar, tales como fuerza mecánica o tratamiento por ultrasonidos. Los órganos de las plantas pueden separarse mecánicamente de otros tejidos u órganos. Después de la homogeneización, se separan por centrifugación los residuos celulares, y la fracción sobrenadante que contiene las proteínas solubles se retiene para purificación ulterior del compuesto deseado. Si el producto es secretado por las células deseadas, entonces las células se separan del cultivo por centrifugación a baja velocidad, y la fracción sobrenadante se retiene para purificación ulterior.

La fracción sobrenadante de cualquier método de purificación se somete a cromatografía con una resina adecuada, en la cual la molécula deseada es retenida sobre una resina cromatográfica mientras que muchas de las impurezas contenidas en la muestra no lo son, o donde las impurezas son retenidas por la resina mientras que la muestra no lo es. Dichos pasos de cromatografía pueden repetirse en caso necesario, utilizando las mismas o diferentes resinas cromatográficas. Un experto en la técnica estaría perfectamente versado en la selección de resinas cromatográficas apropiadas y en su aplicación más eficaz para la purificación de una molécula particular. El producto purificado puede concentrarse por filtración o ultrafiltración, y guardarse a una temperatura a la cual se maximiza la estabilidad del producto.

Existe una extensa serie de métodos de purificación conocidos en la técnica y el método precedente de purificación no debe interpretarse como limitante. Tales métodos de purificación se describen, por ejemplo, en Bailey, J.E. & Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: Nueva York (1986). Adicionalmente, la identidad y pureza de los compuestos aislados pueden cribarse por métodos estándar en la técnica. Éstos incluyen cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), métodos espectroscópicos, métodos de tinción, cromatografía en capa delgada, NIRS, ensayo enzimático, o microbiológicamente. Dichos métodos de análisis han sido revisados en: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11:27-32; and Schmidt et al, 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 and p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17.

<110> BASF PLANT SCIENCE GMBH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> PROTEÍNAS PROTEÍNA-QUNASA RELACIONADAS CON EL ESTRÉS Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN EN LAS PLANTAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 16313-0036

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US01/11435

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-04-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/196,001

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-04-07

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 695

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (636)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (680)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 512

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip0,8cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 651

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (608)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 710

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (54)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1271

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (619)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip0,8cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1910

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 720

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (58)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (612)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 953

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 683

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (603)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (610)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip0,8cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1156

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (923)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1143)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip0,8cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 629

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip0,8cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 514

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip0,8cm

54

\hskip0,8cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1387

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1385)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> a, t, c, g, otra o desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip0,8cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2784

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip0,8cm

57

\hskip0,8cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1088

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

59

\hskip0,8cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1627

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1441

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

62

\hskip0,8cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1736

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1900

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1217

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip0,8cm

66

\hskip0,8cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1718

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip0,8cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2177

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip0,8cm

69

\hskip0,8cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1731

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

71

\hskip0,8cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip0,8cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

74

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2230

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

76

\hskip0,8cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 749

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

78

\hskip0,8cm

79

\hskip0,8cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

81

\hskip0,8cm

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

83

\hskip0,8cm

84

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

85

\hskip0,8cm

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

87

\hskip0,8cm

88

\hskip0,8cm

89

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

90

\hskip0,8cm

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

92

\hskip0,8cm

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

94

\hskip0,8cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

96

\hskip0,8cm

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

98

\hskip0,8cm

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

100

\hskip0,8cm

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

102

\hskip0,8cm

103

\hskip0,8cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 549

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Physcomitrella patens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

105

\hskip0,8cm

106

\hskip0,8cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1005

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1007

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1008

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1009

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1010

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1011

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1012

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1013

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1014

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1015

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1016

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1017

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1018

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1019

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1020

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1021

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1022

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1023

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1024

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1025

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1026

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1027

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1028

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1029

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1030

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1031

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1032

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1033

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1034

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1035

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1036

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1037

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1038

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1039

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1040

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1041

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1042

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1043

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1044

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1045

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1046

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1047

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1048

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1049

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1050

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1051

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1052

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1053

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1054

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1055

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1056

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1057

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1058

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1059

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1060

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1061

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1062

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1063

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1064

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1065

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1066

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1067

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1068

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1069

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1070

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1071

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1072

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1073

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1074

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1075

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1076

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1077

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1078

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1079

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1080

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1081

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1082

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1083

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1084

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1085

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1086

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1087

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

1088

Claims

1. Una célula de planta de una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una casete de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde la PKSRP se selecciona de un grupo constituido por un polipéptido como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y un promotor apropiado enlazado operativamente, en donde la expresión del ácido nucleico en la célula de la planta da como resultado una tolerancia incrementada de las células de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

2. La célula de la planta de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por el ácido nucleico codificante de PKSRP como se define en SEQ ID NO: 26 y un ácido nucleico codificante de PKSRP que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

3. La célula de la planta de la reivindicación 1, en donde la planta se selecciona del grupo constituido por maíz, trigo, centeno, avena, trigo híbrido, arroz, cebada, soja, cacahuete, algodón, colza, canola, mandioca, pimiento, girasol, tagetes, plantas solanáceas, patata, tabaco, berenjena, tomate, especies de Vicia, guisante, alfalfa, café, cacao, té, especies de Sálix, palma de aceite, coco, césped perenne y cosechas forrajeras.

4. Una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Una semilla producida por una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que comprende una célula de planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la semilla contiene el ácido nucleico codificante de PKSRP y en donde la semilla es progenie auténtica para una tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula de la planta.

6. Uso de una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea de acuerdo con la reivindicación 4 o una semilla de acuerdo con la reivindicación 5 para la fabricación de un producto agrícola.

7. Una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP) en donde la PKSRP se selecciona del grupo constituido por proteína-quinasa-2 dependiente del calcio (CPK-2) como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39, y en donde la expresión del ácido nucleico en una planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

8. Un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por CPK-2 como se define en SEQ ID NO: 26 y una secuencia que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

9. Un vector de expresión recombinante aislado que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora da como resultado una tolerancia incrementada de la célula hospedadora al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la célula hospedadora.

10. Un método de producción de una planta transgénica que es una monocotiledónea o una dicotiledónea que contiene un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP), en donde la expresión del ácido nucleico en la planta da como resultado una tolerancia incrementada de la planta al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta, que comprende:

(a): transformar una célula de la planta con un vector de expresión que comprende el ácido nucleico, y

(b): generar a partir de la célula de la planta una planta transgénica con una tolerancia incrementada al estrés por sequía en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta,

en donde la PKSRP se selecciona del grupo constituido por proteína-quinasa-2 dependiente del calcio (CPK-2) como se define en SEQ ID NO: 39 y un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID NO: 39.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el ácido nucleico codificante de PKSRP se selecciona del grupo constituido por el ácido nucleico codificante de PKSRP como se define en SEQ ID NO: 26 y un ácido nucleico codificante de PKSRP que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26.

\newpage

12. Un método de aumentar la tolerancia al estrés por sequía de una planta que comprende

(a): transformar una planta con un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico codificante de una proteína proteína-quinasa relacionada con el estrés (PKSRP) como se define en SEQ ID NO: 26 o que tiene al menos 80-90% de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 26, y

(b): expresar el ácido nucleico de PKSRP en la planta,

en donde la tolerancia de la planta al estrés por sequía está incrementada en comparación con una variedad de tipo salvaje de la planta.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en donde la planta se transforma con un promotor que dirige la expresión de la PKSRP, en donde el promotor está enlazado operativamente al ácido nucleico codificante de PKSRP a expresar.

14. El método de la reivindicación 13, en donde el promotor se selecciona del grupo constituido por un promotor específico de tejido y un promotor regulado por el desarrollo.