ES2346183T3 - Biotransformacion de compuestos biologicamente activos a partir de substancias quimicas de diferentes clases por medio de la enzima laccasa y peroxidasa de manganeso. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fabricación de sustancias biológicamente activas a partir de medicamentos, caracterizado por el hecho de que los medicamentos son antibióticos β-lactámicos y por que por el efecto de la enzima que forma radicales laccasa EC 1.10.3.2. (clasificación según la Nomenclatura internacional de enzimas (Enzym Nomenclature, Academic Press, Inc, 1992, pags. 24-154)) se pueden obtener productos de acoplamiento con enlaces heteromoleculares conteniendo moléculas aromáticas como compuestos con un espectro de actividad modificada que presentan un comportamiento de repartición modificado con la medida de que la molécula aromática que está sustituida es el benceno.
Description
Biotransformación de compuestos biológicamente
activos a partir de substancias químicas de diferentes clases por
medio de la enzima laccasa y peroxidasa de manganeso.
Se divulgan nuevos compuestos biológicamente
activos, el procedimiento para su fabricación y su utilización. De
los antibióticos y la quimioterapia se obtienen productos de
acoplamiento que presentan una eficacia antimicrobiana mejorada o
características de aplicación mejoradas en una biotransformación
catalizada con las enzimas laccasa.
Los antibióticos forman un grupo de compuestos,
heterólogo en cuanto a su estructura y efecto biológico, que
pertenecen a la terapéutica más aplicada en la medicina humana y
veterinaria así como en la protección fitosanitaria. A los
antibióticos pertenecen las sustancias formadas por microorganismos
así como los derivados formados de estos que pueden combatir
enfermedades infecciosas en caso de aplicación intrasomática. Además
de los antibióticos antibacterianos se descubrieron antibióticos con
tripanocidas antifúngicos, antivíricos así como con características
cancerostáticas. Por aplicación de antibióticos fabricados por vía
fermentativa en la quimioterapia del cáncer, la definición
originaria fue igualmente ampliada como por aplicación en la cría de
animales como sistema ergotrópico y en la protección fitosanitaria
como herbicidas, insecticidas, pesticidas, acaricidas, nematocidas,
molusquicidas (U. Gräfe: Biochemie der Antibiotika, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, New York, 1992). El
hallazgo de nuevas zonas de actividad celular para antibióticos y
sustancias bioactivas similares hasta hoy en día aún no está
terminado y conduce a nuevas posibilidades de aplicación en la
medicina humana y veterinaria así como por ejemplo en la protección
fitosanitaria.
La modificación extensiva parcialmente sintética
de antibióticos naturales existentes y la síntesis química total han
dado lugar finalmente a medicamentos que superan considerablemente
el potencial originario de las sustancias naturales. Finalmente
fueron localizados también sintéticos totales sin referencia a
productos microbianos, que han de equipararse a los antibióticos
clásicos en cuanto a su efecto sobre microorganismos y su mecanismo
de acción (U. Gräfe: Biochemie der Antibiotika, Spektrum
Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlín, New York, 1992).
En lo sucesivo se utiliza el concepto
antibióticos en este sentido general para sustancias biológicamente
activas con efectos selectivos en diferentes zonas de actividad de
microorganismos patógenos (bacterias, hongos, virus) y organismos
filogénicos superiores (p. ej. rickettsias, tripanosomas, células
tumorales o parásitos).
Los antibióticos con diferentes actividades
biológicas para diferentes campos de aplicación son modificados
continuamente por reacciones químicas, para adaptarlos a nuevas
tareas. Ningún otro grupo de antibióticos ha sufrido una
modificación semisintética tan amplia como los antibióticos
\beta-lactámicos. El descubrimiento del ácido
6-aminopenicilánico como cuerpo básico de las
penicilinas y el ácido 7-aminocefalosporánico como
cuerpo básico de las cefalosporinas introdujo una nueva etapa de la
modificación con la dirección de destino (meta) de derivados de
efecto optimizado, que hasta hoy en día no está terminada.
Las ventajas de las penicilinas y cefalosporinas
originariamente descubiertas, como la toxicidad muy escasa y el alto
efecto bactericida, fueron adaptadas a las exigencias aumentadas
mediante una modificación química continua. Las patentes
US-A-5,695,951 y
US-A5,939,299 divulgan métodos para clorurar el
derivado de cefalosporina cefalexina mediante una haloperoxidasa. Un
método para la introducción enzimática de halógenos utilizando
haloperoxidasas está descrito en
WO-A-OO/15771.
Estas modificaciones químicas y bioquímicas de
los antibióticos \beta-lactámicos sin embargo no
podían mantenerse al nivel del desarrollo de resistencia de los
microorganismos patógenos, de modo que actualmente numerosos
gérmenes, en particular los estafilococos multirresistentes, ya no
pueden ser medicados con los antibióticos
\beta-lactámicos actualmente disponibles.
Las laccasas (E.C. 1.10.3.2) son enzimas que
catalizan la oxidación de un substrato. Ellas se obtienen a partir
de microbios, plantas y animales. En la naturaleza las laccasas y
peroxidasas desempeñan un papel importante, p. ej. en la degradación
biológica de lignina, por eso pueden ser aisladas entre otras cosas
de los hongos de podredumbre blanca. Dichas enzimas ligninolíticas
son capaces de transformar oxidativamente diferentes contaminantes
ambientales (Jonas, U, Hammer, E, Schauer F., Bollag, J.- M.:
Biodegradation 1998; 8: 321-328; Bollag, J.-M.,
Shuttleworth, K.L., Anderson, D.H.: Appl Environ Microbiol 1988; 54:
3086-3091; Bumpus, J.A., Aust, S.D.: Bioessays 1986;
6: 166-170; Bumpus, J.A., Tien, M., Wright, D.A.:
Science 1985; 228: 143-147).
DE-A-197 26 241
divulga un sistema de multicomponentes ampliado para el tratamiento
de aguas residuales que puede contener entre otras cosas también
oxidoreductasas obtenidas a partir de hongos de podredumbre blanca.
Entre otras cosas puede emplearse también la laccasa en una
concentración de 0,001 a 1 U/ml para el tratamiento de aguas
residuales. El sistema de multicomponentes desarrollado para el
tratamiento de aguas residuales puede emplearse también para
síntesis orgánicas, p. ej. para la oxidación de alifatos insaturados
o para la oxidación de alcoholes para obtener aldehídos. Ha
resultado ventajoso según DE-A-24 02
452 efectuar oxidaciones mediadas por la laccasa en un sistema
bifásico de agua y un disolvente orgánico.
\global\parskip0.900000\baselineskip
US-A-5,389,356 y
US-A-5,468,628 describen métodos de
la oxidación o reducción selectiva, en la cual una peroxidasa sirve
de catalizador generando radicales libres. Este método p. ej. es
adecuado para degradar tetracloruro de carbono.
Además es conocido oxidar fenoles mediante la
laccasa o peroxidasa, teniendo las soluciones reactivas un efecto
antimicrobiano y pueden ser utilizadas en procesos industriales para
la desgerminación. Una aplicación especial de la oxidación
inofensiva con ayuda de tirosinasas y laccasas está descrita en
US-A 6,015,683. Por lo tanto con la ayuda de la
laccasa por intermediación se produce un reactivo colorante que
permite la verificación espectrofotométrica de acetaminofén en
soluciones acuosas.
En la fuerza de oxidación se basa también el
efecto antimicrobiano conocido de las laccasas en presencia de
oxígeno. Igualmente en una oxidación se basa la formación de
derivados de fenoxazinona antimicrobiana eficaz bajo la influencia
de laccasa. La laccasa y peroxidasa de manganeso se aprovechan de
manera económica para los más diversos propósitos. Ellas blanquean
el material que contiene lignina y se utilizan por eso en la
industria papelera. De WO-A 95/01426 es sabido que
los compuestos órgano-químicos, que consisten en al
menos dos anillos aromáticos, pueden reforzar la actividad de la
laccasa. Este refuerzo fue aprovechado para blanquear colorantes en
soluciones o lignina y materiales que contienen lignina.
En
US-A-4,478,683 es descrito impedir
el crecimiento de microorganismos en la depuración de aguas
residuales industrial por adición de laccasas y peroxidasas.
La laccasa y peroxidasa de manganeso fueron
utilizadas en pocos casos para efectuar un acoplamiento de
diferentes compuestos biológicos. Puesto que entonces se debe contar
preferiblemente con hacer frente a los grupos funcionales esenciales
para la eficacia, se puede esperar generalmente un empeoramiento de
la eficacia. Probablemente por este motivo, los ensayos para
utilizar la peroxidasa de manganeso y la laccasa para la
derivatización de antibióticos se limitan a pocos ejemplos. En los
ejemplos realizados hasta ahora no se logró el objetivo deseado de
un refuerzo del efecto antimicrobiano. Por ejemplo se utilizó la
laccasa para enlazar los antibióticos del grupo del ácido aureólico
con hidroquinonas (Anyanwutaku, I.O., Petrowski, R.J., Rosazza,
I.P.: Bioorg. Med. Chem. 1994; 2: 543-551). La
actividad biológica de las sustancias de partida se perdió en este
caso. Agematu et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 57 (8),
1387-1388 (1993) describen la transformación del
ácido
7-(4-hidroxifenilacetamido)-cefalosporínico
por una oxidación fenólica catalizada por la laccasa. También aquí
el producto de reacción era menos eficaz que la cefalosporina
originaria. Uemtsu et al. (jpn. Kokai Tokkyo JP 05,163,281)
emplean oxidasas para la oxidación de las cefalosporinas.
A partir del éster metílico de penicilina se
obtienen bajo ciertas condiciones y el efecto de laccasa 3 tipos de
dímeros diferentes, que son todos inactivos biológicamente (Agematu,
H., Tsuchida, T., Kominato, K., Shibamoto, N., Yoshioka, T.,
Nishida, H., Okamoto, R., Shin, T., Murano, S.: J. Antibiot. Tokyo.
1993; 46: 141-148). La síntesis enzimática de los
dímeros del fenol y de penicilina está resumida por Agemato
(Baiosainsu to Indasutori 1996, 54, 715-718).
Las enzimas utilizadas hasta ahora para la
modificación de antibióticos como haloperoxidasa tienen un espectro
del substrato limitado. La cloración mediada por las haloperoxidasas
solamente es aplicable en casos especiales.
Cuando los microorganismos están expuestos al
efecto permanente de la concentración de antibióticos subletal,
estos desarrollan resistencias a los antibióticos como parte
genética de su mecanismo de adaptación programado a condiciones
ambientales alternativas, es decir, ya no se inhiben por la
concentración inhibitoria mínima originaria de la respectiva
sustancia activa. Puesto, que el efecto de dosis subletales nunca se
puede evitar completamente, se desarrolla una resistencia contra
cualquier nueva sustancia activa antibiótica por parte de los
microorganismos patógenos. Las sustancias activas formadas bajo la
influencia de peroxidasas o laccasas con eficacia contra gérmenes
vueltos resistentes no han sido descritas hasta ahora.
Debido a la problemática de la resistencia
creciente existe ahora como antes una gran necesidad de
antibióticos, que no se cubre por las sustancias activas
correspondientes al estado de la técnica.
Esto rige particularmente para la utilización de
antibióticos en caso de enfermedades infecciosas clínicamente
difíciles de controlar. En caso de infecciones con gérmenes gram
positivos actualmente sólo son suficientemente eficaces los
antibióticos glicopéptidos. Los agentes patógenos gram positivos
como los estafilococos y enterococos desarrollan cada vez más una
resistencia múltiple. Pero también las enfermedades infecciosas
causadas por agentes patógenos gram negativos en el futuro ya no
podrán ser dominados clínicamente con seguridad. Igualmente en la
medicina veterinaria las enfermedades infecciosas de animales útiles
con estafilococos multirresistentes se vuelven cada vez más
amenazadoras. Por una transmisión posible de gérmenes vueltos
resistentes al ser humano amenaza un riesgo adicional.
La tarea basada en la invención consistía en
seguir desarrollando sustancias biológicamente activas mediante
biotransformación y haciéndolas utilizables como productos de
acoplamiento con otras sustancias activas antimicrobianas para una
utilización médica. La invención se basa particularmente en la tarea
de cubrir la necesidad de acción existente por el aumento del
desarrollo de resistencia de bacterias con respecto a los
antibióticos convencionales, particularmente en la terapia de
enfermedades infecciosas, en la medicina humana y veterinaria,
mediante el desarrollo de un procedimiento de biotransformación, con
el cual se pueden obtener sustancias activas desconocidas hasta
ahora a partir de las sustancias activas antimicrobianas
conocidas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Esta tarea se soluciona según la invención
mediante un procedimiento según las reivindicaciones.
Los substratos son preferiblemente antibióticos
\beta-lactámicos.
Según la invención pueden obtenerse compuestos a
partir de estas sustancias activas antimicrobianas por
transformación según un procedimiento conforme a las
reivindicaciones 1 a 5, los cuales están caracterizados por el hecho
de que se obtiene una eficacia no demostrable en las sustancias
iniciales, preferiblemente contra gérmenes multirresistentes. Los
compuestos que se pueden obtener por transformación según el
procedimiento conforme a la invención pueden ser caracterizados
además por el hecho de que la formación de resistencias por enlace
covalente de moléculas con diferente mecanismo de acción y
diferentes lugares de ataque moleculares. Se puede conseguir sin
embargo también según la invención, por introducción de componentes
hidrófilos y/o hidrófobos adicionales, una mejora de las
características de aplicación sin cambiar el espectro de acción.
Según la invención se emplean preferiblemente
enzimas que corresponden a la clasificación según la Nomenclatura
internacional de enzimas (Enzym Nomenclature, Academic Press, Inc,
1992, S. 24-154) E C 1.10.3.2. (Lacease).
Si se realiza el procedimiento según la
invención en una solución acuosa, ésta presenta preferiblemente un
valor pH de 2-8, preferiblemente en caso de un pH de
3-5, así como temperaturas entre 5ºC y 60ºC.
Como sintones polifuncionales entran en
consideración: los sintones de alquilo C1-C18;
alquenilo C1-C18; alquinilo C1-C18;
alcoxi C1-C18; oxicarbonilo C1-C18;
oxoalquilo C1-C18; alquilsulfanilo
C1-C18; alquilsulfonilo C1-C18;
sintones alquilimínicos C1-C18 o alquilamínicos. Se
prefieren según la invención las moléculas aromáticas siguientes:
los sintones aromáticos mono-, di- o policíclicos, respectivamente
dotados opcionalmente de uno o varios grupos funcionales o
sustituyentes del grupo de los halógenos; los sustituyentes tipo
sulfo-; sulfona; sulfamina; sulfanilo-; amino-; amido-; nitro-;
azo-; imino-; carboxi-; cianuro-; formil-; hidroxi-; halocarbonilo-;
carbamilo-; carbamidoil-; fosfona; fosfonilo; alquilo
C1-18; alquenilo C1-18; alquinilo
C1-18; alcoxi- C1-18; oxicarbonilo
C1-18; oxoalquilo C1-18;
alquilsulfanilo C1-18; alquilsulfonilo
C1-18;
alquilimino-C1-18 o alquilamino. Los
ejemplos para dichos compuestos son sin excluir otros, aminofenoles,
fenoles, así como derivados del ácido 2,5-benzoico
dihidroxilado. Además entran en consideración sin excluir otros
compuestos los siguientes: 3,4-dietoxianilina,
2-metoxi-p-fenilendiamina,
1
-amino-4-betametoxietil-aminobenceno,
(N-.beta.-metoxietil-p-fenilendiamina),
1-amino-4-bis)-(.beta.hidroxi-etil)-aminobenceno,
2-metil-1,3-diaminobenceno
(2,6-diaminotolueno),
2,4-diaminotolueno, ácido
1-amino-4-benceno-sulfónico,
ácido 4-aminobenceno
1-N-metil sulfónico,
1-metil-2-hidroxi-4-aminobenceno
(3-amino-o-cresol),
1-metoxi-2,4-diaminobenceno
(2,4-diaminoanisoles),
1-etoxi-2,3-diamino-benceno
(2,4-diaminofenetol),
1-beta-hidroxietiloxi-2,4-diamino-benceno
(2,4-diaminofenoxietanol),
1,3-dihidroxi-2-metilbenceno
(2-metil resorcinol),
1,2,4-trihidroxibenceno),
1,2,4-trihidroxi-5-metilbenceno
(2,4,5-trihidroxitolueno),
2,3,5-trihidroxitolueno,
1,4-fenilendiamina,
2,5-diaminotolueno,
2-cloro-1,4-fenilendiamina,
2-aminofenol, 3-aminofenol,
4-aminofenol, 1,3-fenilendiamina,
1,2,3-bencenotriol (pirogalol),
1,3-bencenodiol (resorcinol),
1,2-bencenodiol (pirocatechol), ácido
2-hidroxicinámico, ácido
3-hidroxicinámico, ácido
4-hidroxicinámico, ácido
2,3-diaminobenzoico, ácido
2,4-diaminobenzoico, ácido
3,4-diaminobenzoico, ácido
3,5-diaminobenzoico,
metil-2,3-diaminobenzoato,
etil-2,3-diaminobenzoato,
isopropil-2,3-diaminobenzoato,
metil-2,4-diaminobenzoato,
etil-2,4-diaminobenzoato,
isopropil-2,4-diaminobenzoato,
metil-3,4-diaminobenzoato,
etil-3,4-diaminobenzoato,
isopropil-3,4-diaminobenzoato,
metil-3,5-diaminobenzoato,
etil-3,5-diaminobenzoato,
isopropil-3,5-diaminobenzoato, ácido
N,N-dietil-amida-3,4-diaminobenzoico,
ácido N,N-dipropil-amida
3,4-diaminobenzoico,
3,4-dihidroxibenzaldehido, ácido antranílico, ácido
4-aminobenzoico, etilhidroquinona, ácido mandélico,
o-nitrobenzaldehido, bencilimidazol, ácido
salicílico, ácido 3-aminosalicílico, ácido 4-
aminosalicílico, ácido 5-aminosalicílico,
metil-3-aminosalicilato,
metil-4-aminosalicilato,
metil-5-aminosalicilato,
etil-3-aminosalicilato,
etil-4-aminosalicilato,
etil-5-aminosalicilato,
propil-3-aminosalicilato,
propil-4-aminosalicilato,
propil-5-aminosalicilato, amida del
ácido salicílico 4-aminotiofenol,
4-hidroxitiofenol,
N,N-dimetil-1,4-fenilendiamina,
N,N-dietil-1,4-fenilendiamina,
N-fenil-1,2-fenilendiamina,
1,2-fenilendiamina, 2-nitroanilina,
3-nitroanilina, 2-cloroanilina
3-cloroanilina, 3-cloroanilina,
4-cloroanilina,
4-aminoacetanilida.
En el procedimiento según la invención se puede
lograr una variación del valor pH óptimo utilizando laccasas
recombinantes.
La reacción de acoplamiento según la invención
puede tener lugar en su caso en presencia de al menos un mediador
del grupo de hidroxilaminas y/o ácidos hidroxámicos y en su caso de
un mediador del grupo de amidas.
Eventualmente los productos de reacción se
pueden estabilizar después de la terminación de la reacción.
Se divulgan también compuestos que pueden
obtenerse a partir de sustancias activas de diferentes clases por
una biotransformación según la invención.
Los compuestos biológicamente activos divulgados
pueden ser utilizados en la medicina humana y veterinaria así como
en la protección fitosanitaria como sustancia activa única o en
forma de preparados combinados.
Los compuestos biológicamente activos divulgados
pueden ser utilizados particularmente en la lucha contra
enfermedades infecciosas, preferiblemente como remedio con efecto
antimicrobiano y antiviral para la aplicación local y/o sistémica,
en caso de enfermedades infecciosas con gérmenes gram positivos o
gram negativos, como antimicótico para la aplicación local y/o
sistémica y como citostático en la medicina humana y
veterinaria.
También están divulgados los medicamentos que
contienen uno o varios de los compuestos divulgados.
Los compuestos obtenidos después de la
biotransformación pueden ser empleados solos así como en combinación
entre sí.
Por la introducción de componentes hidrófilos
y/o hidrófobos adicionales se puede lograr según la invención una
mejora de las características de aplicación del compuesto de
partida. Los compuestos divulgados pueden emplearse particularmente
como agentes tensioactivos límite.
Los compuestos divulgados que pueden ser
obtenidos a partir de sustancias activas antimicrobianas por
transformación según el procedimiento conforme a la invención,
muestran ventajosamente una eficacia no demostrable en las
sustancias de partida, preferiblemente contra gérmenes
multirresistentes.
Los compuestos divulgados que pueden ser
obtenidos a partir de sustancias activas antimicrobianas por
transformación según el procedimiento conforme a la invención
dificultan la creación de resistencias por el enlace covalente de
moléculas con diferente mecanismo de acción y diferentes lugares de
ataque moleculares logrado por la influencia de enzimas que forman
radicales.
Sobre la base de una reacción de acoplamiento
catalizada por las laccasas así como por enzimas que forman
radicales similares a la laccasa es accesible según la invención un
procedimiento de la biotransformación generalmente aplicable, con el
cual pueden ser enlazadas las diferentes sustancias biológicamente
activas que, como el grupo funcional, contienen grupos amínicos o
hidroxílicos, de manera que se logre una mejora de la actividad
biológica y/o una mejora de las características de aplicación. Las
etapas características esenciales para la fabricación de los nuevos
compuestos son las oxidaciones de un solo electrón enzimáticamente
catalizadas, una formación enzimáticamente catalizada del radical
superóxido o una formación enzimáticamente catalizada del radical
arilo.
Sorprendentemente se consideró que por estas
transformaciones enzimáticamente catalizadas serán disponibles
sustancias activas con una actividad biológica claramente superior a
las sustancias iniciales. Para estas etapas de reacción
enzimáticamente catalizadas es necesaria la presencia de
particularmente la laccasa según la invención. A este respecto se
entienden bajo laccasas particularmente las enzimas resumidas en la
clasificación EC 1. 10.3.2. Las laccasas son obtenidas
preferiblemente a partir de hongos de las especies Pycnoporus,
Trametes, Coriolus, Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus,
Rhizoctonia, Aspergillus, Neurospora, Podospora, Phlebia o
Myceliophtora o por vía biológica.
Con el procedimiento según la invención pueden
ser enlazadas las sustancias activas de diferentes clases de
sustancias químicas. Las sustancias activas que deben ser compuestas
presentan ventajosamente efectos biológicos con diferentes puntos de
ataque. Sin embargo es también posible con el procedimiento según la
invención componer una sustancia activa biológicamente activa con
una sustancia sin efecto propio antimicrobiano, para mejorar las
características de aplicación, p. ej. el comportamiento de
distribución. Por la influencia según la invención de la laccasa
sobre sustancias activas antimicrobianas de partida se obtienen
nuevos compuestos biológicamente activos que presentan
características de aplicación mejoradas. Era completamente
sorprendente que particularmente los antibióticos
\beta-lactámicos como las penicilinas, las
cefalosporinas y las carbapenemas puedan ser transformadas con el
procedimiento según la invención manteniendo la eficacia
antimicrobiana. Especialmente ventajoso es componer
\beta-lactam por una reacción catalizada por la
laccasa con sustancias activas quinoides e hidroquinoides. Las
nuevas sustancias activas obtenibles por biotransformación según la
invención muestran una eficacia antimicrobiana incluso contra
gérmenes multirresistentes. Con ello se crean las condiciones para
una aplicación de las nuevas sustancias activas en la medicina
humana y veterinaria para la lucha contra enfermedades infecciosas.
Las nuevas sustancias activas obtenibles con el procedimiento según
la invención pueden aplicarse tanto de manera local como también
sistémica solas así como en forma de preparados combinados.
\vskip1.000000\baselineskip
El cultivo de los hongos filamentosos se realizó
en primer lugar sobre agar oblicuo (agar de malta) a una temperatura
de 30ºC durante 7 días y luego durante 7 días sobre placas de agar
de malta a una temperatura de 30ºC. Tres piezas de agar de malta de
un tamaño de aprox. 1 cm^{2}, bien cubiertas fueron recortadas a
continuación con una espátula estéril de una cultura de placa de
agar y transferidas a un matraz de Erlenmeyer de 300 ml con 60 ml
BSM. Este precultivo fue incubado a una temperatura de 30ºC durante
7 días como cultivo estático.
\global\parskip0.870000\baselineskip
El micelio formado en el precultivo de glucosa
de los hongos filamentosos fue homogeneizado tres veces durante 10
seg. con ayuda de un aparato Ultra-Turrax con 17000
r.p.m. 2,5 ml del producto homogeneizado fueron
sobre-inoculados para los experimentos en un matraz
de Erlenmeyer de 100-ml con 25 ml BSM. El matraz y
el fluido fueron esterilizados por separado, para evitar pérdidas de
fluidos durante la esterilización por calor en el autoclave. Antes
de la inoculación se llenó el fluido en el matraz. Estas fórmulas
fueron suplementadas con una solución de Tween 80 al 0,05%. Los
matraces fueron cultivados en un incubador agitador con 158 r.p.m. y
a una temperatura de 30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la secreción reforzada de las enzimas
ligninolíticas en cultivos de T. versicolor y Pycnoporus
cinnabarinus se utilizó alcohol veratrílico. Puesto que este
compuesto y sus metabolitos tienen un efecto perturbador en
experimentos de incubación posteriores con filtrado de cultivo, su
segregación se realizó con Q-sefarosa. Para ello, 1
ml de la matriz de intercambiador de aniones fue equilibrado tres
veces con 100 ml de un tampón de histidina. A continuación, la
Q-sefarosa equilibrada fue agitada lentamente con 80
ml de un cultivo filtrado sobre un agitador magnético a temperatura
ambiente. Luego el sobrante acuoso fue filtrado de la
Q-sefarosa mediante un filtro de fibra de vidrio
GF-6, la matriz con respectivamente 10 ml de un
tampón de histidina fue lavado 20 veces y la proteína fue eluida con
15 ml de un tampón de sal común-histidina.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la comparación de los experimentos con el
filtrado de cultivo se debería trabajar con la misma actividad
enzimática en las fórmulas de incubación. Para eso era necesario
limitar los excesos de cultivo purificados y diluirlos
correspondientemente para los metabolismos. La concentración se
realizó por ultrafiltración con microconcentradores
Centricon-30 y Centriprep-30 en una
centrífuga de refrigeración con 3000 r.p.m. y una temperatura de 4ºC
durante 60 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los metabolismos con filtrado de cultivo
era necesario desalar una muestra de proteínas limpiada y limitada.
Sobre una columna de Sephadex G-25 superfino fueron
aplicados 2,5 ml de la muestra y eluidos con 3,7 ml de un tampón de
histidina.
El eluado de proteínas obtenido fue almacenado a
una temperatura de -20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con ácido
6-aminopenicilano (1 mM) en un tampón de acetato de
sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa (975 nmol/2
mi/min; obtenido a partir de Trametes versicolor) durante 35
min. a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de
transmisión se agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la
reelaboración la solución de reacción es extraída mediante una fase
sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con acetato
de etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la
eliminación del disolvente se depura con una cromatografía líquida
de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 6-aminopenicilánico con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz. El rendimiento del
producto de acoplamiento es de 66%.
El análisis del compuesto obtenido mediante
métodos espectrométricos de masas resultó una masa de 411.
En la suma de los resultados respecto al
análisis de estructura ha de adoptarse la siguiente estructura para
el producto de acoplamiento obtenido:
Fig.: Estructura propuesta para el producto de
acoplamiento cruzado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación-equimolar con ácido
7-aminocefalosporínico (1 mM) en un tampón de
acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa
(975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Pycnoporus
cinnabarinus) durante 35 min. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente se
depura con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 7-aminocefalosporínico con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
68%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con ácido
7-aminodesacetoxicefalosporínico (1 mM) en un tampón
de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa
(975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Trametes versicolor)
durante 40 min a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad
de transmisión se agita la solución de reacción a 100 r.p.m. Para la
reelaboración la solución de reacción es extraída mediante la fase
sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con acetato
de etilo. El residuo restante después de la eliminación del
disolvente es depurado con una cromatografía líquida de alta
resolución.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 7-aminodesacetoxicefalosporínico
con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
73%.
El análisis del compuesto obtenido mediante
métodos espectrométricos de masas dio como resultado una masa de
409. Los resultados de los análisis espectroscópicos de resonancia
nuclear se resumen en la tabla siguiente. Para la comparación de las
señales ^{1}H-NMR ha sido examinado también la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida.
Las mediciones se efectuaron en el disolvente
DMSO-d6 con el estándar interno TMS con un ARX 300
(Bruker, Karlsruhe).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En la suma de los resultados respecto al
análisis de estructura ha de adoptarse el producto de acoplamiento
obtenido para la estructura siguiente:
Fig.: Estructura propuesta para el producto de
acoplamiento cruzado.
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con amoxicilina (1 mM) en
un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de
una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Trametes
versicolor) durante 50 min. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente se
depura con una cromatografía de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del antibiótico
amoxicilina con
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
55%.
El análisis del compuesto obtenido mediante
métodos espectrométricos de masas resultó una masa de 560. Los
resultados de los análisis espectroscópicos de resonancia nuclear se
resumen en la tabla siguiente. Para la comparación de las señales
^{1}H-NMR fueron examinados también la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
(véase la tabla en el ejemplo 3) y la amoxicilina. Las mediciones se
realizaron en el disolvente CD_{3}OD con el estándar interno TMS
con un ARX 300 (Bruker, Karlsruhe).
\vskip1.000000\baselineskip
En la suma de los resultados respecto al
análisis de estructura ha de adoptarse el producto de acoplamiento
obtenido para la estructura siguiente:
Fig.: Estructura propuesta para el producto de
acoplamiento cruzado.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con ampicilina (1 mM) en un
tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una
laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Trametes
versicolor) durante 50 min. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente es
depurado con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del antibiótico
ampicilina con
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
75%.
El análisis del compuesto obtenido mediante
métodos espectométricos de masas dio como resultado una masa de
544.
En la suma de los resultados respecto al
análisis de estructura ha de adoptarse la estructura siguiente para
el producto de acoplamiento obtenido:
Fig.: Estructura propuesta para el producto de
acoplamiento cruzado.
\vskip1.000000\baselineskip
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con
p-aminobencenosulfonamida (1 mM) en un tampón de
acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa
(975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Pycnoporus
cinnabarinus) durante 30 min. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente se
depura con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento de la sustancia
biológicamente activa de p-aminobencenosulfonamida
con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
74%.
\vskip1.000000\baselineskip
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en la relación equimolar con ácido
4-amino-2-hidroxibenzoico
(1 mM) en un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la
influencia de una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido p. ej. a
partir de Trametes versicolor o Pycnoporus
cinnabarinus) durante 50 min. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente se
depura con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del ácido
4-amino-2-hidroxibenzoico
con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
73%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en la relación
equimolar con ácido 6-aminopenicilánico (1 mM) en un
tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una
laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Pycnoporus
cinnabarinus) durante 1 h. a temperatura ambiente. Para
favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante se depura después de la eliminación del
disolvente con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 6-aminopenicilánico con el éster
metílico de ácido 2,5-dihidroxibenzoico conduce a un
compuesto antimicrobiano eficaz con alta actividad hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
66%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en la relación
equimolar con ácido 7-aminocefalosporínico (1 mM) en
un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de
una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de p. ej.
Trametes versicolor) durante 1 h. a temperatura ambiente.
Para favorecer la velocidad de transmisión se agita la solución de
reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración la solución de
reacción es extraída mediante una fase sólida de octadecano. La
elución del producto se realiza con acetato de etilo o acetonitrilo.
El residuo restante después de la eliminación del disolvente se
depura con una cromatografía líquida de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 7-aminocefalosporínico con el
éster metílico de ácido 2,5-dihidroxibenzoico
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
63%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en relación
equimolar con ácido 7-aminodesacetoxicefalosporínico
(1 mM) en un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la
influencia de una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de
Pycnoporus cinnabarinus) durante 1 h. a temperatura ambiente.
Para favorecer la velocidad de transmisión se agita la
solución-de reacción con 100 r.p.m. Para la
reelaboración la solución de reacción es extraída mediante la fase
sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con acetato
de etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la
eliminación del disolvente se depura con una cromatografía líquida
de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento de ácidos y ésteres
2,5-dihidroxibenzoicos con mit ácido
7-aminodesacetoxicefalosporínico conduce a un
compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora desconocido. El
rendimiento del producto de acoplamiento es de 71%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en relación
equimolar con amoxicilina (1 mM) en un tampón de acetato de sodio
(pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa (975 nmol/2 mi/min;
obtenido a partir de Trametes versicolor) durante 45 min. a
temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de transmisión se
agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración
la solución de reacción es extraída mediante la fase sólida de
octadecano. La elución del producto se realiza con acetato de etilo
o acetonitrilo. El residuo restante después de la eliminación del
disolvente se depura con una cromatografía líquida de alta
resolución.
Resultado: un acoplamiento del antibiótico
amoxicilina con el éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico conduce a un compuesto
antimicrobiano eficaz hasta ahora desconocido. El rendimiento del
producto de acoplamiento es de 66%.
En la suma de los resultados para el análisis de
estructura ha de suponerse el producto de acoplamiento obtenido para
la estructura siguiente:
Fig.: Estructura propuesta para el producto de
acoplamiento cruzado.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en relación
equimolar con ampicilina (1 mM) en un tampón de acetato de sodio (pH
5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa (975 nmol/2 ml/min;
obtenido a partir de Trametes versicolor) durante 45 min a
temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de transmisión se
agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración
la solución de reacción es extraída mediante una fase sólida de
octadecano. La elución del producto se realiza con acetato de etilo
o acetonitrilo. El residuo restante después de la eliminación del
disolvente se depura con una cromatografía líquida de alta
resolución.
Resultado: un acoplamiento del antibiótico
ampicilina con el éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico conduce a un compuesto
antimicrobiano eficaz hasta ahora desconocido. El rendimiento del
producto de acoplamiento es de 56%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en relación
equimolar con p-aminobencenosulfonamida (1 mM) en un
tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una
laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de por ejemplo
Trametes versicolor o Pycnoporus cinnabarinus) durante
45 min a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de
transmisión se agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la
reelaboración la solución de reacción es extraída mediante una fase
sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con acetato
de etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la
eliminación del disolvente se depura con una cromatografía líquida
de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del antibiótico
p-aminobencenosulfonamida con el éster metílico del
ácido 2,5-dihidroxibenzoico conduce a un compuesto
antimicrobiano eficaz hasta ahora desconocido. El rendimiento del
producto de acoplamiento es de 66%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El éster metílico del ácido
2,5-dihidroxibenzoico es transformado en la relación
equimolar con ácido
4-amino-2-hidroxibenzoico
(1 mM) en un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la
influencia de una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de
p. ej. Trametes versicolor o Pycnoporus cinnabarinus)
durante 45 min. a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad
de transmisión se agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para
la reelaboración la solución de reacción es extraída mediante una
fase sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con
acetato de etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la
eliminación del disolvente se depura con una cromatografía líquida
de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento de ácido
4-amino-2-hidroxibenzoico
con el éster metílico de ácido 2,5-dihidroxibenzoico
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora desconocido
El rendimiento del producto de acoplamiento es de 63%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
El ácido
3(3,4-dihidroxifenil)-propiónico
es transformado la relación equimolar con ácido
6-aminopenicilánico (1 mM) en un tampón de acetato
de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una laccasa (975
nmol/2 ml/min; obtenido a partir de Pycnoporus cinnabarinus)
durante 2 h. a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de
transmisión se agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la
reelaboración la solución de reacción es extraída mediante una fase
sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con acetato
de etilo o acetonitrilo.
Resultado: un acoplamiento del cuerpo básico de
antibióticos ácido 6-aminopenicilánico con el ácido
hidrocafeico conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz con alta
actividad hasta ahora desconocido.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en relación equimolar con
3-mercapto-1,2,4-triazol
(1 mM) en un tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la
influencia de una laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de
p. ej. Trametes versicolor o Pycnoporus cinnabarinus)
durante 50 min. a temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad
de transmisión se agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para
la reelaboración la solución de reacción es extraída mediante una
fase sólida de octadecano. La elución del producto se realiza con
acetato de etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la
eliminación del disolvente se depura con una cromatografía líquida
de alta resolución.
Resultado: un acoplamiento del
3-mercapto-1,2,4-triazol
con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a un compuesto antimicrobiano eficaz hasta ahora
desconocido. El rendimiento del producto de acoplamiento es de
45%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la fabricación de la solución
enzimática se realizó según el ejemplo 1.
La
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
es transformada en relación equimolar con ácido
2-mercapto-nicotínico (1 mM) en un
tampón de acetato de sodio (pH 5, 0,02 M) bajo la influencia de una
laccasa (975 nmol/2 ml/min; obtenido a partir de p. ej. Trametes
versicolor o Pycnoporus cinnabarinus) durante 50 min. a
temperatura ambiente. Para favorecer la velocidad de transmisión se
agita la solución de reacción con 100 r.p.m. Para la reelaboración
la solución de reacción es extraída mediante una fase sólida de
octadecano. La elución de los productos se realiza con acetato de
etilo o acetonitrilo. El residuo restante después de la eliminación
del disolvente se depura con una cromatografía líquida de alta
resolución.
Resultado: un acoplamiento del ácido
2-mercapto-nicotínico con la
2,5-dihidroxi-N-(2-hidroxietil)-benzamida
conduce a compuestos antimicrobianos eficaces hasta ahora
desconocidos. El rendimiento de productos de acoplamiento es de
55%.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: se realizó la prueba de difusión de
agar según Burkhardt (Burkhardt, Fr (editor) Diagnóstico
microbiológico. Georg-Thieme Verlag Stuttgart, Nueva
York 1992, pag. 724). Las sustancias de prueba se aplican en
concentraciones escalonadas sobre plaquetas de prueba
Sensl-Disc (Becton Dickinson Microbiology Systems,
Cockeysville, USA). Para el Test de prueba fueron utilizados
Mueller-Hinton II-Agar en placas de
Petri Stacker (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville,
USA). Como cepa de prueba fueron seleccionados la cepa S.
aureus ATCC 6538. La siembra de esta cepa de prueba se eligió de
manera que después de una incubación de 16-20 h. se
desarrollan colonias individuales densas pero no confluyentes. Tras
el secado de los caldos de cultivo inoculados se ponen como máximo 6
plaquetas de prueba con una ligera presión sobre la superficie de
agar. Transcurridas unas 18 + 2 h. de incubación a 36ºC se miden los
halos de inhibición. Para la garantía de calidad interna se comprobó
el método con S. aureus ATCC 25923.
Resultados: las sustancias activas obtenibles
por biotransformación según la invención son eficaces
antibacteriales (tab. 1). La máxima eficacia antimicrobiana se
observa en los productos de acoplamiento según el ejemplo 4, 9 y
10.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la prueba se realizó en un test de
difusión de agar según la método descrita en el ejemplo 13. Como
germen de prueba se utilizó la cepa de referencia multirresistente
S. aureus "cepa del norte de Alemania" (Smith Kline
Beecham).
Resultados: los productos de acoplamiento
sorprendentemente son también parcialmente altamente eficaces contra
gérmenes multirresistentes (Tab. 2). La eficacia de las sustancias
de partida se supera claramente (Tab. 4)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología: la prueba se realizó en el test de
difusión de agar según el método descrito en el ejemplo 13. Como
germen de prueba se utilizó la cepa 99847 S. epidermidis
coagulasa negativo multirresistente aislada del material del
paciente.
Resultados: también contra los estafilococos
coagulasa negativa difícilmente combatibles, que desempeñan un papel
p. ej. en la colonización de materiales de catéter y pertenecen por
eso a los gérmenes nosocomiales problemáticos, son eficaces los
productos de acoplamiento según la invención. La eficacia de las
sustancias de partida se supera claramente (Tab. 4)
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Para el aumento de la estabilidad del producto
de acoplamiento cruzado de una fórmula equimolar de amoxicilina y
éster metílico de ácido 2,5-dihidroxibenzoico,
preparado según el ejemplo 10, se desarrolló un método de extracción
especial en fases sólidas de octadecano. A tal objeto, la fase
sólida se activó mediante metanol y se equilibró con agua destilada.
A continuación fueron aplicados x ml de la fórmula de acoplamiento
cruzado acuoso aplicada y después del ligamiento de los compuestos
durante 20 min se secaron en la corriente de aire. Sigue una etapa
de lavado con una mezcla de 10% de metanol/90% de agua destilada. La
elución del producto de acoplamiento cruzado se realizó
igual-
mente con 100% de acetonitrilo desgasificado. El extracto obtenido de esta manera se almacenó en oscuridad a 4ºC.
mente con 100% de acetonitrilo desgasificado. El extracto obtenido de esta manera se almacenó en oscuridad a 4ºC.
Resultado: El producto de acoplamiento es
estable dentro del período de observación de 21 d.
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solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información
del lector y no forma parte del documento de patente europea. La
misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin
embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u
omisiones.
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Georg-Thieme Verlag 1992. 724- [0109]
Claims (5)
1. Procedimiento de fabricación de sustancias
biológicamente activas a partir de medicamentos,
caracterizado por el hecho de que los medicamentos son
antibióticos \beta-lactámicos y por que por el
efecto de la enzima que forma radicales laccasa EC 1.10.3.2.
(clasificación según la Nomenclatura internacional de enzimas (Enzym
Nomenclature, Academic Press, Inc, 1992, pags.
24-154)) se pueden obtener productos de acoplamiento
con enlaces heteromoleculares conteniendo moléculas aromáticas como
compuestos con un espectro de actividad modificada que presentan un
comportamiento de repartición modificado con la medida de que la
molécula aromática que está sustituida es el benceno.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el cual los productos de acoplamiento son obtenidos en una solución
acuosa con un valor pH de 2 a 8 a temperaturas comprendidas entre
5ºC y 60ºC.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 y/o
2, en el cual la molécula aromática está dotada opcionalmente de uno
o varios grupos funcionales o sustituyentes del grupo de los
halógenos; los sustituyentes tipo sulfo-; tipo sulfona; sulfamino;
sulfanilo; amino; amido; nitro; azo; imino; carboxilo; ciano;
formil; halocarbonilo; carbamilo; carbamidoil; fosfona; fosfonilo;
alquilo C1-18; alquenilo C1-18;
alquinilo C1-18; alcoxi C1-18;
oxicarbonilo C1-18; oxoalquilo
C1-18; alquilsulfanilo C1-18;
alquilsulfonilo C1-18; alquilimino
C1-18 o alquilamino.
4. Procedimiento según al menos una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que la
reacción de acoplamiento tiene lugar en presencia de al menos un
mediador del grupo de hidroxilaminas y/o ácidos hidroxámicos y en su
caso un mediador del grupo de los amidas.
5. Procedimiento según la reivindicación 1 a 4,
caracterizado por el hecho de que los productos de reacción
están estabilizados una vez terminada la reacción.
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