ES2346216T3 - Derivados de quelidonina cuaternaria y de alcaloides, procedimiento para su preparacion y su uso en la preparacion de medicamentos. - Google Patents

Derivados de quelidonina cuaternaria y de alcaloides, procedimiento para su preparacion y su uso en la preparacion de medicamentos. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para la fabricación de un producto de reacción alcaloide que comprende al menos un derivado alcaloide distinto de la sanguinarina y del cloruro de N-metilprotopina, derivado que tiene un nitrógeno cuaternario, y el procedimiento que comprende: a) el suministro de una mezcla de reacción que comprende un disolvente orgánico, al menos un alcaloide presente en la hierba Chelidonium majus L. y que se selecciona del grupo constituido por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina y oxiquelidonina, y un agente alquilante, y la reacción de alquilación haciendo reaccionar el al menos un alcaloide con el agente alquilante en presencia del disolvente orgánico, para permitir la formación de al menos un derivado alcaloide que tiene un nitrógeno cuaternario; b) después de la terminación de la reacción, la sumisión de la mezcla de reacción resultante a al menos una etapa de lavado con un disolvente acuoso o agua, para eliminar los compuestos solubles en agua presentes en la mezcla de reacción; y c) la sumisión de la mezcla de reacción lavada a un tratamiento con un ácido fuerte en forma líquida o gaseosa, preferentemente con cloruro de hidrógeno gaseoso o una disolución de cloruro de hidrógeno, convirtiendo así al menos un derivado alcaloide cuaternario en una forma soluble en agua, particularmente una sal soluble en agua.

Description

Derivados de quelidonina cuaternaria y de alcaloides, procedimiento para su preparación y su uso en la preparación de medicamentos.
Campo de la invención
La presente invención se sitúa en el campo del desarrollo de fármacos y del cuidado sanitario y se refiere al alcaloide quelidonina y sus derivados en los que el nitrógeno de la molécula de quelidonina es un nitrógeno cuaternario. La invención se refiere adicionalmente a un procedimiento de fabricación de esos compuestos, a composiciones que contienen esos compuestos y sus aplicaciones para el tratamiento de diversas enfermedades y dolencias corporales.
Estado de la técnica
El alcaloide quelidonina y las composiciones que contienen quelidonina son conocidos en la materia, como lo son las aplicaciones terapéuticas de la quelidonina o algunos derivados de quelidonina en el tratamiento de diversas dolencias y enfermedades corporales, incluyendo disfunciones metabólicas y tumores.
Los documentos DE 2 028 330 y US 3 865 830 describen la preparación de aductos de tiofosforamida-isoquinolina haciendo reaccionar alcaloides seleccionados de Chelidonium majus L. con sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina en un disolvente orgánico.
Los documentos AT 354 644 y AT 377 988 describen procedimientos para la preparación de derivados fosforados de alcaloides por la reacción con compuestos carcinostáticos de fósforo, que se proporcionan en una forma soluble en agua mediante la conversión en sus sales. Una desventaja de los procedimientos descritos es que la conversión de los productos de reacción en una sal soluble en agua no es completa y la fracción predominante de los productos de reacción permanece insoluble en agua.
El documento US 5 981 512 describe el uso de las sustancias descritas en los documentos AT 377 988 y AT 354 644 para el tratamiento de daño por radiación.
Los compuestos descritos en dichas patentes tienen actividades citostáticas y carcinostáticas diferentes. Las mezclas de alcaloides, en particular de los alcaloides totales de Chelidonium majus L., han demostrado ser particularmente prometedoras a nivel terapéutico, cuya actividad farmacológica ha sido demostrada en diversos estudios sobre el tratamiento del cáncer. El reactivo sin reaccionar se retira de la mezcla de síntesis después de completarse la reacción. Puesto que el sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina (en lo sucesivo también denominado "tiotepa") es soluble en disolventes orgánicos, tales como benceno, éter o cloroformo, ha sido propuesto en los procedimientos de la técnica anterior para retirar de la mezcla de síntesis el sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina sin reaccionar, lavando los productos de reacción con éter.
Aunque los procedimientos de la técnica anterior previamente mencionados para la fabricación de derivados de quelidonina farmacológicamente activos tienen en común que requieren la purificación del producto final usando disolventes orgánicos inflamables, o incluso explosivos, ahora se ha encontrado que la purificación también se podría conseguir, incluso con mejores resultados, usando un disolvente acuoso.
En Zhao Y y col., Chinese Pharmaceutical Bulletin (Yaoxue Tongbao) 16 (1981) 7-10 y Database Chemical Abstracts (Online), Nº de acceso a la base de datos 1982:173909 se estudia un posible efecto farmacológico del cloruro de N-metilprotopina sobre pacientes que padecen malaria.
El alcaloide sanguinarina y sus sales son conocidos en la técnica por presentar un amplio espectro de actividades biológicas. Tanaka S y col., Planta Med 67 (2001) 108-113 describe un efecto antiinflamatorio del cloruro de sanguinarina.
Schmeller T y col., Phytochemistry 44 (1997) 257-266 describe una actividad bioquímica de la sanguinarina que media en la defensa química contra microorganismos, virus y herbívoros en plantas.
Walterova D y col., Journal of Medicinal Chemistry 24 (1981) 1100-1103 describe un efecto inhibitorio de la sanguinarina sobre la actividad enzimática de la actividad aminotransferasa de la alanina hepática.
Ishii H y col., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 33 (1985) 4139-4151 y Nakanishi T y col., Journal of Natural Products 62 (1999) 864-867 describen una actividad antitumoral de la sanguinarina.
Lombardini JB y col., Biochemical Pharmacology 51 (1996) 151-157 describe un efecto inhibitorio de la sanguinarina sobre la actividad enzimática de una quinasa mitocondrial en el corazón de ratas.
Ulrichova J y col., Toxicology Letters 125 (2001) 125-132 describe un efecto citotóxico de la sanguinarina sobre hepatocitos en cultivos celulares.
También se conoce en la técnica la preparación de diversos derivados alcaloides, diferentes de los derivados de quelidonina. Valpuesta M y col., Tetrahedron 58 (2002) 5053 - 5059 describe la síntesis de diversos derivados alcaloides -sales cis y trans de N-metil-1-metoxistilopinio- del alcaloide coulteropina, el alcaloide principal de Romneya coulteri, en disolventes orgánicos. Slavik J y col., Collection of Czechoslowak Chemical Commmunications 41 (1976) 285-289 describe el aislamiento de derivados alcaloides en forma de yoduros y percloratos a partir de las raíces de Argemone platyceras LINK et OTTO.
Schmidt E, Achiv der Pharmazie 231 (1893) 168-183 describe la preparación de metilyoduro de \gamma-homoquelidonina calentando la base pura con un exceso de yoduro de metilo y la recristalización del producto de reacción en alcohol.
Takao N y col., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21 (1973) 1096 - 1102 describe la preparación del yodometilato de 11-epicorinolina mediante la reacción del alcaloide 11-epicorinolina procedente de Corydalis incisa con yoduro de metilo en una mezcla de disolventes orgánicos y la recristalización del producto de reacción en la mezcla de disolventes orgánicos.
Danckwortt PW, Archiv der Pharmazie 250 (1912) 590-646 describe la preparación de yoduro de protopina mediante la reacción de protopina disuelta en acetona y un exceso de yoduro de metilo y la recristalización del producto de reacción en alcohol.
Manske RHF y col., Journal of the American Chemical Society 64 (1942) 1659-1661 describe la preparación de metosulfato de hunnemanina-O-etiléter a partir del alcaloide hunnemanina aislado de Hunnemannia fumariaefolia Sweet.
Redemann CE y col., Journal of the American Chemical Society 71 (1949) 1030-1034 describe la preparación de diversos derivados de alocriptopina, en el que el alcaloide alocriptopina se extrajo de Faraga coco y las reacciones se llevaron a cabo en un disolvente orgánico.
Zhang G-L y col., Phytochemistry 40 (1995) 299-305 describe la extracción y el análisis estructural del alcaloide cloruro de N-metilstilopio a partir de la planta medicinal china Dactylicapnos torulosa.
En cuanto a los derivados de la quelidonina, las preparaciones de la técnica anterior mencionadas previamente para diferentes derivados alcaloides no incluyen o sugieren una etapa de lavado con un disolvente acuoso.
Breve descripción de la invención
En un aspecto la invención se refiere a un nuevo procedimiento para la preparación de un producto de reacción de alcaloides, particularmente de quelidonina, oxiquelidonina o metoxiquelidonina, con agentes alquilantes adecuados, cuyo procedimiento supone al menos una etapa de lavado con un disolvente acuoso, preferentemente agua, después de haberse completado la reacción de alquilación.
El procedimiento también comprende una etapa de conversión de los derivados alcaloides en sales solubles en agua para la elaboración de preparaciones farmacéuticas inyectables de baja toxicidad y que tienen un amplio espectro de actividad terapéutica.
En otro aspecto la presente invención se refiere a productos de reacción solubles en agua, por ejemplo, que comprenden derivados de quelidonina, en los que el nitrógeno inicialmente terciario de la molécula alcaloide ha sido convertido en un nitrógeno cuaternario y en los que el cuarto ligando al nitrógeno cuaternario es un resto alquilo inferior, preferentemente un resto metilo o etilo o un resto metilo o etilo sustituido, tal como por ejemplo, un resto tiotepa. En una forma de realización preferida los derivados de quelidonina cuaternarios son de una naturaleza tal que se acumulan selectivamente en tejidos diana, particularmente tejidos cancerosos.
En otro aspecto la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen al menos uno de los derivados alcaloides cuaternarios, particularmente derivados de quelidonina cuaternaria, obtenibles en un procedimiento según la presente invención.
La invención se refiere adicionalmente al uso de los productos de reacción que comprenden derivados alcaloides cuaternarios como fármacos para su uso en aplicaciones terapéuticas, y al uso de dichos derivados para la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico de diversas enfermedades o dolencias corporales.
Formas de realización adicionales de la presente invención se exponen en las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
El procedimiento según la invención comprende la reacción de un alcaloide o una mezcla de alcaloides presentes en la hierba Chelidonium majus L. y seleccionado del grupo constituido por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, oxiquelidonina y metoxiquelidonina, en un disolvente orgánico con un agente alquilante, preferentemente con un agente alquilante que tenga por sí mismo actividad terapéutica, tal como por ejemplo, fosforamidas o derivados del ácido fosfórico citotóxicos que contienen al menos un grupo aziridina, y a continuación el lavado de los productos de reacción con agua. La etapa de lavado con agua o un disolvente acuoso equivalente, por ejemplo, una disolución salina suave, facilita, entre otros, la subsiguiente etapa de conversión de los productos de reacción poco solubles en agua o insolubles en agua, es decir, de los derivados alcaloides cuaternarios, en compuestos solubles en agua, por ejemplo, sales. Se prefiere que en caso de que el agente alquilante sea una sustancia citotóxica también sea soluble en agua o que al menos se descomponga tras el contacto con el agua en componentes solubles en agua, para permitir la retirada sustancial del agente alquilante sin reaccionar, o parte del mismo, de la mezcla de reacción mediante la etapa de lavado con agua.
La etapa de lavado con agua permite simplificar sustancialmente el proceso de fabricación puesto que ya no es necesario adoptar precauciones de seguridad complicadas debidas al riesgo de explosión de los disolventes orgánicos puros, por ejemplo, dimetiléter, haciendo así que el proceso se pueda llevar a cabo fácilmente a mayor escala. Además, los componentes solubles en agua no deseados presentes en la mezcla de reacción se separan de esta forma de los productos de reacción y se eliminan. Sorprendentemente, también se encontró que la etapa de lavado tiene un impacto positivo sobre la estructura y composición de los productos de reacción de forma que la eficacia de la subsiguiente etapa de conversión de los productos en una forma soluble en agua se incrementa hasta 10 a 15 veces comparado con un proceso en el que la etapa de lavado se lleva a cabo usando un disolvente orgánico puro, mejorando así notablemente el rendimiento del producto final deseado.
El presente procedimiento se puede usar, por ejemplo, para reacciones de alquilación de alcaloides con los compuestos carcinostáticos que contienen fósforo mencionados en la reivindicación 1 del documento AT 377 988, siendo particularmente adecuados los compuestos de fósforo mostrados en la Figura 3 de la presente solicitud, y más particularmente aquellos que tienen un grupo aziridina.
El término quelidonina como se usa en el presente documento se referirá asimismo a cualquiera de los miembros seleccionados del grupo constituido por quelidonina, oxiquelidonina y metoxiquelidonina, a menos que se indique otra cosa o a menos que de la descripción se infiera implícitamente otra cosa. Un disolvente orgánico adecuado según la presente invención es cualquier agente en el que son solubles los alcaloides previstos para la reacción. Los alcaloides, por ejemplo, se pueden disolver en un disolvente orgánico que facilite o contribuya a la reacción de alquilación tal como el disolvente seleccionado del grupo constituido por monoclorometano, diclorometano, triclorometano, monocloroetano, dicloroetano y tricloroetano.
La reacción de alquilación de los alcaloides tiene lugar a temperatura elevada, preferentemente en el punto de ebullición del disolvente.
El producto de reacción resultante se convierte en una forma soluble en agua después del lavado con agua. Esto se puede llevar a cabo según el procedimiento descrito en los documentos AT 377 988 y AT 354 644, por conversión en las sales solubles en agua, en particular en los clorhidratos, por ejemplo, pasándolo por un ácido fuerte en forma líquida o gaseosa tal como HCl gaseoso o añadiendo una disolución de HCl a la disolución orgánica del producto de reacción lavado, durante o tras lo cual los clorhidratos se precipitan. Parece ser que mediante este tratamiento ácido la mayoría del agente alquilante se separa de un compuesto de reacción intermedio formado entre los alcaloides y el agente alquilante, dejando atrás derivados del alcaloide modificados, en los que los átomos de nitrógeno inicialmente terciarios han sido convertidos en nitrógenos cuaternarios, en los que al nitrógeno cuaternario está unido como cuarto ligando un resto hidrógeno o un resto procedente del agente alquilante, el residuo que se selecciona preferentemente del grupo constituido por un resto metilo, etilo, y sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina, o de una parte de sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina. Para una mejor comprensión, la siguiente fórmula (I) ilustra un producto de reacción alcaloide cuaternario típico de la presente invención, ejemplificado con la quelidonina:
1
R1 = metilo, etilo, sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina, metilo-R2, etilo-R2, siendo R2 una parte del sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina.
A partir de un análisis elemental de uno de los productos de reacción precipitados según la presente invención (véase Ejemplo 3) parece -sin estar limitado por la teoría- que al menos una parte del agente alquilante o de los compuestos de descomposición del agente alquilante, obtenidos mediante el tratamiento ácido de la mezcla de reacción después de la terminación de la alquilación, por ejemplo, reacción de cuaternización, pueden estar absorbidos hasta un cierto grado en los cristales del precipitado o están fuertemente unidos a los cristales de alguna forma, dificultando así la purificación del precipitado mediante el lavado con disolventes orgánicos tales como éter y diclorometano. No obstante, se puede probar que el producto de reacción aún es completamente funcional incluso en presencia de esas sustancias acompañantes.
La sal soluble en agua del producto de reacción es adecuada para la aplicación en disoluciones para inyección.
En una forma de realización de la invención, la reacción se lleva a cabo con sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina (Nº CAS 52-24-4), que también se conoce en la farmacopea como tiotepa. Sinónimos adicionales son ledertepa, Onco tiotepa, TESPA, tespamina, tiofosfamida, tio-TEPA, tiotrietilenfosforamida, tifosilo, sulfuro de triaziridinilfosfina, N,N',N''-tri-1,2-etandiilfosforotioina triamida; N,N',N''-tri-1,2-etandiiltiofosforamida, tri-(etilenimino)tiofosforamida; N,N',N''-trietilentiofosforamida, trietilentiofosforotriamida, m-trietilentiofosforamida, sulfuro de m-tris(aziridin-1-il)fosfina, trietilentiofosforamida, sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina, tris(etilenimino)tiofosfato, TSPA y WR 45312.
En una forma de realización adicional de la invención, un extracto de alcaloides, opcionalmente los alcaloides totales de Chelidonium majus L., en un disolvente orgánico, se hace reaccionar con sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina (tiotepa) y el producto de reacción resultante, opcionalmente presente como una mezcla de compuestos, se lava a continuación al menos una vez con agua. Puesto que el tiotepa se descompone en agua, el residuo de tiotepa sin convertir presente en exceso después de la reacción se puede eliminar de la fase orgánica mediante esta medida. Preferentemente, la disolución orgánica que contiene el producto de reacción intermedio, es decir, el compuesto formado entre el agente alquilante y el alcaloide, se lava varias veces y cada vez se satura con agua. De forma particularmente preferida, el lavado se repite hasta que el exceso de tiotepa altamente tóxico haya sido completamente eliminado del producto de reacción.
Además, algunos alcaloides tóxicos solubles en agua que contribuyen a reacciones adversas en aplicaciones médicas y que incluso pueden provocar cirrosis hepática se eliminan con la fase acuosa de la mezcla de síntesis o se reducen sus concentraciones. Por medio del test de Ames, se demostró que el producto de reacción de esta forma de realización, preparado según la invención, no es mutágeno.
Cuando se parte de un extracto de alcaloides totales de Chelidonium majus L. el producto de reacción final es una mezcla de alcaloides que comprenden productos de reacción de tiotepa con alcaloides de mayor peso molecular, y productos de degradación de tiotepa. Como resultado del proceso de síntesis, las solubilidades de los alcaloides varían. El producto de reacción consiste en una mezcla del 60 al 70% aproximadamente de alcaloides de Chelidonium sin reaccionar con el 30 al 40% aproximadamente de productos de reacción de sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina.
Los alcaloides terciarios representan la porción principal de los componentes de partida de un extracto de alcaloides obtenido de Chelidonium majus L.. Por ejemplo, los siguientes alcaloides terciarios pueden estar contenidos como componentes de partida en la mezcla de síntesis: quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, \alpha-homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, quelidimerina, oxiquelidonina y metoxiquelidonina.
Después de la terminación de la reacción de alquilación, los alcaloides cuaternarios sin reaccionar (por ejemplo, berberina) se eliminan sustancialmente de la mezcla de reacción mediante la etapa de lavado con agua, mientras que los alcaloides insolubles en agua sin reaccionar y los productos de reacción alcaloides alquilados permanecen en el disolvente orgánico. Dependiendo de la naturaleza del disolvente orgánico y/o del agente alquilante usado para la reacción de alquilación, el producto de reacción intermedio resultante puede comprender compuestos unidos a tiotepa, en los que una molécula de tiotepa está unida a una, dos o tres moléculas de quelidonina, oxiquelidonina o metoxiquelidonina. Además, puede comprender derivados alcaloides alquilados, en los que una molécula alcaloide, por ejemplo una molécula de quelidonina, oxiquelidonina o metoxiquelidonina, está unida en su nitrógeno cuaternario a un resto alquilo lineal de cadena corta, particularmente a un grupo metilo o etilo. Aún pueden estar presentes otros compuestos de reacción alquilados en la mezcla de reacción después de la terminación de la reacción de alquilación.
El producto de reacción obtenido de la reacción de los alcaloides totales de Chelidonium majus L. con tiotepa según la presente invención muestra un mejor espectro de actividades terapéuticas que el producto de reacción obtenido en un proceso análogo en el que la etapa de lavado se ha llevado a cabo con un disolvente orgánico, por ejemplo, dietiléter. Al menos parte de los compuestos presentes en el producto de reacción de la presente invención, particularmente los derivados de quelidonina cuaternarios, se acumulan selectivamente en los tejidos cancerosos y destruyen las células cancerígenas mediante apoptosis pero -en contraste con la mayoría de agentes citostáticos conocidos- sin atacar también a células sanas. Esto da como resultado una buena tolerancia a una terapia con esta preparación y su adecuación general para uso terapéutico, e incluso profiláctico, en individuos con un riesgo más elevado de desarrollar cáncer debido a, por ejemplo, disposición hereditaria. Es sencillo de manejar y no tiene reacciones adversas significativas en dosis terapéuticas.
El producto de reacción obtenido a partir de la reacción de los alcaloides totales de Chelidonium majus L. con tiotepa presenta actividad biológica en la regulación del metabolismo y es adecuado para la prevención y terapia de enfermedades metabólicas, tales como osteoporosis, pero también enfermedades reumáticas, alergias, infecciones víricas, epilepsia, esclerosis múltiple, cicatrices, tumores cutáneos, heridas postoperatorias y daño por radiación.
Se puede usar un extracto de las raíces secas de Chelidonium majus L. como material de partida para la síntesis. Las raíces tienen un contenido en alcaloides más alto que las hojas o el tallo.
Sorprendentemente, más recientemente se ha encontrado que cuando se parte de quelidonina, oxiquelidonina o metoxiquelidonina disponible comercialmente como única fuente de alcaloide, el producto de reacción resultante según el procedimiento de la presente invención (véase por ejemplo, el Ejemplo 3, a continuación) presenta unas cualidades y actividades terapéuticas que son al menos comparables con aquéllas del producto de reacción resultante de la reacción de alquilación de alcaloides de Chelidonium total según el Ejemplo 1.
Los excipientes farmacéuticos habituales, en particular para disoluciones, por ejemplo disoluciones para inyección o infusión, o para ungüentos, compresas o bases suspensorias, son adecuados para fármacos que contienen los productos de reacción preparados según la invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra un diagrama de la HPLC con una composición de alcaloides totales característica de las raíces de Chelidonium majus L.
La Figura 2 muestra la huella dactilar de la HPLC de una preparación según el Ejemplo 1.
La Figura 3 muestra derivados de fósforo seleccionados adecuados como reactivos.
La Figura 4 muestra un espectro de resonancia magnética nuclear del producto de reacción U-KRS.
La Figura 5 muestra un espectro UV del producto de reacción U-KRS.
La Figura 6 muestra un espectro UV del clorhidrato de quelidonina.
La Figura 7 muestra una primera sección de un espectro de masas del producto de reacción U-KRS.
La Figura 8 muestra una segunda sección de un espectro de masas del producto de reacción U-KRS a una resolución más alta.
La Figura 9 muestra un espectro de masas de clorhidrato de quelidonina.
Los siguientes ejemplos se exponen para ilustrar la invención en profundidad.
Ejemplo 1 A) Extracción de los alcaloides
a. 25 g de una mezcla de sales alcaloides se suspendieron en agua y se transfirieron a un embudo de decantación. Después de la adición de 100 ml de diclorometano, el embudo de decantación se agitó. A continuación la fase orgánica se separó y se filtró a una botella de vidrio.
b. Se añadió NaOH 1 N (pH 8-9) a la fase acuosa hasta que se produjo turbidez. Después de la adición de 100 ml de diclorometano, la mezcla se agitó. A continuación la fase orgánica se separó y se combinó con la fase de diclorometano procedente de la etapa a. Este proceso se repitió, por ejemplo, 3 veces. Las fases orgánicas se filtraron y se combinaron.
c. La fase acuosa se ajustó a un pH de 10 añadiendo NaOH. Después de la adición de diclorometano, la mezcla se agitó. A continuación la fase orgánica se separó, se filtró y se mezcló con las otras fases orgánicas. La fase acuosa ahora se ajusta a un pH de 13 con NaOH y se repite la extracción con diclorometano.
d. Las fases orgánicas combinadas se evaporaron para dar un material oleoso pardo.
B) Reacción con sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina
El residuo alcaloide se disolvió en diclorometano, y se añadió sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina. La mezcla se llevó a temperatura de reflujo a 80ºC durante 2 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se clarificó. A continuación se llevó a cabo la filtración y el filtrado se lavó varias veces, por ejemplo, 3 veces o más, con 250 ml de agua en un embudo de decantación.
C) Reacción con HCl
La disolución de lavado se transfirió a un vaso de precipitados de vidrio, se agitó y se saturó con HCl gaseoso, precipitando un complejo de clorhidrato. El producto precipitado se filtró y se lavó con dietiléter, se secó y a continuación se disolvió en agua.
En ratas, se determinó un valor de DL_{50} de 485 mg/kg a partir del producto de reacción según el Ejemplo 1. Los estudios en ratones y ratas mostraron que el producto según la invención modula la regulación hormonal del timo e induce la síntesis de sustancias que tienen actividad de tipo timosina en animales en los que se ha extraído el timo. Este efecto depende de la dosis. La preparación incrementa el número de linfocitos T en la sangre periférica hasta un 50% (4,04 \pm 0,43 x 10^{9}/l antes del tratamiento, 6,24 \pm 0,73 x 10^{9}/l después del tratamiento), modula la respuesta inmunitaria humoral a antígenos que penetran y la actividad de los linfocitos asesinos naturales de las células del bazo (198,20 \pm 17,69% comparado con 71,50 \pm 9,10% en el grupo control) e incrementa el potencial de liberación de interferón de los corpúsculos de los glóbulos blancos en experimentos con animales. Los resultados de los experimentos con animales se confirmaron mediante observaciones clínicas. Así, la mejora de los parámetros inmunitarios también se observó en pacientes con cáncer.
Para aplicaciones profilácticas e inmunológicas se pueden usar dosis de 5 mg aproximadamente de la preparación del Ejemplo 1 por 70 kg de peso corporal. Para el tratamiento del cáncer, preferentemente se administran 5 mg de la preparación por 20 kg de peso corporal.
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Ejemplo 2 Huellas dactilares de la HPLC
La determinación se llevó a cabo mediante cromatografía de fase inversa de pares iónicos en modo gradiente y con mediciones espectrales usando un detector DAD a 285 nm. Al mismo tiempo, se prepararon cromatogramas usando alcaloides de referencia. Además, se llevó a cabo un análisis HPLC-MSD, que mostraba que no había picos aparte de aquellos de los alcaloides. Los diagramas de la HPLC de las Figuras 1 y 2 se obtuvieron en base a los siguientes datos experimentales:
Parámetros cromatográficos:
Columna: LiChrospher 60 RP Select B, 5 \mum, 125 x 24 mm ID
Eluyente: A) 200 ml (acetonitrilo) + 800 ml (agua) + 1,5 g (ácido hexanosulfónico) + 0,3 ml (85% de ácido fosfórico)
B) 900 ml (acetonitrilo) + 100 ml (agua) + 1,5 g (ácido hexanosulfónico) + 0,3 ml (85% de ácido fosfórico)
Gradiente: 5 min isocráticamente al 100% de A;
hasta el 40% de B en 24 min
hasta el 100% de B en 1 min
5 min al 100% de B;
5 min de equilibrado con el 100% de A
Detección: luz UV a 285 nm
Velocidad de flujo del eluido: 1 ml/min, detención después de 35 min.
Volumen inyectado: 10 \mul
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Preparación de la muestra:
Extracto antes de la reacción (Figura 1): 25 mg de alcaloides se disolvieron en 40 ml de metanol mediante ultrasonidos, se completaron hasta 50 ml y se filtraron a través de un filtro de membrana.
Producto de reacción (Figura 2): El producto de reacción se convirtió en la sal de clorhidrato, se disolvió en agua a una concentración de 1 mg/ml y se ajustó a un pH entre 2,5 y 6,5.
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Ejemplo 3
Quelidonina purificada disponible comercialmente (Sigma) se sometió a una reacción con sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina (tiotepa) según las condiciones descritas en el Ejemplo 1. Después de la terminación de la reacción de alquilación, de la subsiguiente etapa de lavado y de la etapa de conversión usando HCl gaseoso, el producto final se procesó adicionalmente de la manera siguiente:
340 g del producto de reacción soluble en agua tratado con HCl se disolvieron en agua y se concentraron próximos a saturación y se dejaron reposar en un refrigerador a 8ºC. Después de algunas horas, se produjo la precipitación espontánea y se recogieron 264 mg de precipitado (en lo sucesivo denominado U-KRS). El precipitado comprendía cristales higroscópicos ligeramente amarillentos que tienen un punto de fusión bastante estrecho de 205-207ºC (que indica un producto bastante bien cristalizado) y que presentan una fluorescencia de luz azul tras la irradiación con luz UV a 366 nm. También eran visibles trazas de bandas fluorescentes amarillas, naranjas y rojas. El producto no se movió cuando se sometió a cromatografía de capa fina sino que permaneció en la posición de partida (R_{f} = 0), excepto para las trazas, que al menos se movieron para dar una R_{f} > 0,1. A partir del espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) (Figura 4) es claro que el U-KRS contiene anillos aromáticos comparables a aquéllos contenidos en la molécula de quelidonina. El espectro UV (Figura 5) presenta una absorción máxima a 148, 155, 160, 205, 230 y 282 nm, muy similar al espectro UV de la quelidonina (Figura 6), de la que difiere solamente en que el pico a 230 nm del U-KRS se encuentra a 240 nm en la quelidonina. Esto indica que el nitrógeno en el U-KRS es cuaternario, mientras que en la quelidonina es terciario.
Se pueden inferir detalles analíticos adicionales a partir de los espectrogramas de masas presentados en la Figura 7 y Figura 8 (U-KRS) y Figura 9 (quelidonina), y del resultado de un análisis elemental del U-KRS que revela la siguiente composición de materia (Tabla 1):
TABLA 1 Composición elemental del U-KRS en % de masa total
2
Los siguientes ejemplos muestran diversas aplicaciones del compuesto U-KRS que resulta del procedimiento descrito en el Ejemplo 3.
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Ejemplo 4 Inhibición selectiva del crecimiento celular in vitro por el fármaco antitumoral U-KRS Materiales y procedimientos
Se llevó a cabo un cultivo celular en botellas de Roux a 37-37,5ºC en una atmósfera humidificada que contiene el 8% de CO_{2}. Los cultivos confluentes se despegaron mediante una disolución del 0,01% de tripsina y el 0,2% de EDTA en tampón fosfato salino (PBS) y se separaron en una relación que abarca entre 1:5 y 1:25.
Se aislaron células endoteliales humanas procedentes de las venas umbilicales mediante tratamiento con colagenasa. El medio de cultivo para las células endoteliales era M 199 suplementado con el 15% de suero fetal bovino inactivado térmicamente, 200 \mug/ml de factor de crecimiento de células endoteliales y 90 \mug/ml de heparina.
Microscopía de fluorescencia
Las células se crecieron en placas de 35 mm y se incubaron con 100 \mug/ml de U-KRS durante 30-60 min. El medio de cultivo se aspiró, y las células se lavaron dos veces con PBS. Se montaron cubreobjetos sobre las células y la fluorescencia se excitó usando un microscopio de barrido de láser confocal equipado con una fuente láser de argón. La luz emitida se detectó en un canal fotomultiplicador. Las señales se visualizaron en un monitor de video usando el software de procesamiento de imágenes MRC 600.
Resultados
1. En un intervalo de 20-40 \mug/ml de U-KRS se midió una inhibición del 55% aproximadamente del crecimiento celular con células endoteliales. Esta concentración mató la línea celular de osteosarcoma humano. Híbridos de los dos tipos celulares mostraron prácticamente la misma sensibilidad que células normales.
2. Debido a su autofluorescencia el U-KRS se puede detectar intracelularmente. Un microscopio de barrido de láser mostró una elevada captación de U-KRS en células malignas.
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Ejemplo 5 U-KRS como agente anticancerígeno-consumo de oxígeno Materiales y procedimientos
Experimentos in vivo en ratones. De dos a cinco animales control fueron inyectados intraperitonealmente con 50 \mul de una suspensión del tumor de ascitis de ratón de Ehrlich que tenían 8 días de edad, recién recogida de un animal donante totalmente adulto. El grupo control no se volvió a tratar. El grupo de prueba fue inyectado con 10 mg de U-KRS/kg de peso del animal en la zona abdominal inmediatamente después de la implantación del tumor.
Resultados
Los ratones implantados con el tumor de ascitis, después de la administración intraperitoneal o después de la administración subcutánea de U-KRS, presentaron un tiempo de supervivencia más prolongado que los animales implantados que no volvieron a ser tratados.
La medición del consumo de oxígeno de una suspensión tumoral de ascitis por medio de un electrodo in vitro produjo un breve incremento en el consumo después de la adición del U-KRS, seguido no obstante por un descenso rápido diferente de aquél de la suspensión control no mezclada con U-KRS.
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Ejemplo 6 Modificación de la acción anti-nociceptiva de la morfina mediante U-KRS en roedores Materiales y procedimientos
Animales: Los experimentos se llevaron a cabo sobre ratones macho Albino Swiss y ratas macho Wistar.
Tratamiento: El U-KRS se administró intraperitonealmente en dosis que empiezan en los 20 mg/kg para ratones y 25 mg/kg para ratas.
Procedimientos experimentales: En cada experimento los cuatro grupos de animales fueron inyectados con 1) placebo, 2) morfina, 3) U-KRS, 4) U-KRS y morfina.
Resultados
Los resultados indicaban que la administración simultánea de U-KRS y morfina modificaba la acción del fármaco analgésico narcótico. Producían una acción anti-nociceptiva en la prueba del coletazo en ratas, evidente en forma de un incremento en el tiempo de latencia.
Los presentes resultados muestran que el U-KRS administrado simultáneamente con morfina varía la susceptibilidad de animales experimentales a la reacción nociceptiva en las pruebas descritas. Los presentes resultados sugieren que el U-KRS puede interactuar con fármacos analgésicos que se usan en el tratamiento del cáncer.
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Ejemplo 7 Inducción de la muerte celular bimodal en células malignas mediante el derivado de U-KRS Materiales y procedimientos
Se usó la línea celular de eritroleucemia K562, y U-KRS producido en una forma cristalizada pura y disuelto en agua a una concentración de 1,2 mg/ml.
El contenido en ADN de células K562 expuestas a diversas concentraciones de U-KRS se analizó usando yoduro de propidio y citometría de flujo.
Resultados
Los resultados de este estudio muestran que el U-KRS induce programas de muerte celular bimodal, la primera de las cuales, la apoptosis, está mediada por canales de K^{+} dependientes de Ca^{2+} sensibles a quinidina; la segunda modalidad, la muerte celular con ampollas, está mediada por la prevención de la formación de microtúbulos e induce así poliploidía.
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Ejemplo 8 Influencia del U-KRS sobre el ADN, ARN y la síntesis de proteínas en células malignas Materiales y procedimientos
Timidina marcada con ^{3}H, 0,5 \muCi en 20 \mul de medio; uridina, 0,5 \muCi en 20 \mul de medio y leucina, 1,0 \muCi en 20 \mul de medio se pusieron durante 2-4 h en cuatro pocillos con diferentes concentraciones de U-KRS. Antes de eso, las líneas celulares, hepatocitos de cobaya, hepatocitos C1L, células de la amígdala humana, linfomas murinos, mielomas murinos, células de Yoshida, dos cepas de HeLa, EsB-, EB, linfomas, ZAC/1, P815 se crecieron durante 24 horas a 37ºC en placas de microtitulación de 96 pocillos.
Las células WiDr se incubaron con un esquema algo diferente durante 6 y 24 horas a concentraciones de U-KRS de 1, 4, 8 y 14 \mug/ml de U-KRS.
Resultados
Las evaluaciones fluorométricas muestran una afinidad más fuerte del U-KRS a elementos del núcleo de la célula cancerígena que a otras áreas de la célula cancerígena. Los fenómenos de fluorescencia pueden mostrar claramente la fuerte afinidad y la fuerte y rápida afinidad ejercida por el U-KRS en áreas tumorales y de metástasis. No se observan efectos tóxicos en células normales tratadas en dosis que son un 100% inhibidoras del crecimiento para líneas de células cancerígenas probadas hasta la fecha.
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Ejemplo 9 Influencia del U-KRS sobre xenoinjertos humanos Material y procedimiento
Se tomaron células tumorales procedentes de xenoinjertos tumorales humanos y se trasplantaron de manera seriada en ratones desnudos. Estas células se usaron en un ensayo in vitro de formación de colonias. Las células tumorales se incubaron de manera continuada durante al menos una semana con diversas concentraciones del fármaco U-KRS. Esto se realizó con seis tipos diferentes, y la formación de colonias se puntuó para cada tumor. Los efectos del fármaco se presentaron como porcentaje de T/C (Test/Control).
Resultados
Muchos tipos de tumores diferentes son sensibles al U-KRS que se correlaciona con la variedad probada por el U-KRS. Ahí, los efectos tumoricidas parecen depender de la capacidad de regeneración del aparato inmunitario, cuya estimulación y modulación se puede conseguir mediante el U-KRS.
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Ejemplo 10 Influencia del U-KRS sobre líneas celulares malignas humanas Materiales y procedimientos
Se usaron cuatro líneas celulares malignas diferentes: 1) sarcoma de ratón; 2) carcinoma mamario femenino; 3) carcinoma de colon humano; 4) melanoma humano.
Los derivados de U-KRS y PP9AA02 se añadieron al medio de cultivo.
Después de irradiar, se pusieron 200 células en placa por platina y se incubaron durante una semana, y a continuación se tiñeron y se contaron.
Resultados
Los resultados aquí presentados indican que los derivados de U-KRS y PP9AA02 actúan sinérgicamente sobre líneas celulares malignas humanas como sustancias citotóxicas.
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Ejemplo 11 Detención inducida en G2/M y apoptosis en líneas celulares de carcinoma epidermoide humano mediante el U-KRS Materiales y procedimientos
Se aislaron queratinocitos humanos primarios a partir de especímenes de piel de neonato. Las películas epidérmicas se tripsinizaron y se recogió una única suspensión celular por centrifugación.
Resultados
El U-KRS inhibe la progresión del ciclo celular de una manera que depende de la dosis.
El tratamiento con el U-KRS afecta a la distribución del ciclo celular e induce la apoptosis en células A431 y ME180.
La expresión de las ciclinas, de las CDKs y del inhibidor de CDK p27 varía después del tratamiento con U-KRS.
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Ejemplo 12 Efecto anti-metastático del U-KRS y su influencia sobre el oxígeno y el metabolismo energético de ratones con melanoma B-16 Materiales y procedimientos
El experimento se llevó a cabo sobre ratones macho 133 C57B/6. Se trasplantó el melanoma metastatizante B-16 al músculo de la corva derecha de cada ratón. El 10º día después del trasplante del tumor, los animales se dividieron en dos grupos. Al primer grupo se le administró U-KRS en el seno venoso del ojo en una dosis de 1 mg/kg en el volumen de 0,05 ml: 5 inyecciones una vez en dos días. Al segundo grupo se le administró disolución fisiológica estéril en el seno venoso en el mismo régimen.
Resultados
El estudio demostró que un día después de la primera inyección intravenosa de U-KRS los índices del régimen de oxígeno en el tejido muscular aumentaron de manera notable. La tasa de nivel de pO_{2} se incrementó hasta el máximo durante la inhalación de oxígeno y la tasa de pO_{2} descendió desde el máximo al nivel inicial después del cese de la inhalación. En animales del grupo experimental también mejoraron ciertos índices de la fosforilación oxidativa de la mitocondria hepática un día después de la administración de la preparación. Es sabido que durante la progresión del proceso maligno, el oxígeno y el metabolismo se inhiben. En ratones a los que se les administraron 5 inyecciones de U-KRS esa inhibición es menos pronunciada. En los animales del grupo control el nivel de retención de oxígeno en tejido muscular y la tasa de suministro de O_{2} en él eran estadísticamente superiores. Generalizando los datos obtenidos es posible concluir que el U-KRS en ratones con melanoma B-16 mejora el suministro de oxígeno a tejidos, así como inhibe el efecto destructivo del proceso maligno sobre los procesos bioenergéticos del organismo.
Los siguientes Ejemplos ilustran las propiedades inmunomoduladoras y reguladoras del metabolismo del U-KRS, haciendo del U-KRS particularmente adecuado para el tratamiento terapéutico de reacciones alérgicas, enfermedades víricas (VIH, hepatitis A, B y C, E. coli, gripe), osteoporosis, poliartritis, psoriasis, y otras enfermedades o dolencias corporales.
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Ejemplo 13 Aumento de la actividad tumoricida de los macrófagos por el U-KRS Materiales y procedimientos
Ratones BALB/c se mantuvieron por acoplamientos hermano/hermana en el laboratorio. El tumor D1 DMBA/3 se trasplantó de manera rutinaria en BALB/c mediante inyección subcutánea. El tumor se hizo evidente cinco días después de la implantación.
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El tratamiento in vivo con U-KRS se inició cinco días después de la implantación subcutánea del tumor. Se emplearon tres vías de administración, es decir, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. Los tres grupos experimentales, de al menos 10 ratones cada uno, recibieron 5,0 \mul de U-KRS en 0,15 ml de PBS. Esta dosificación se seleccionó en base a experimentos preliminares.
Resultados
La velocidad de crecimiento del tumor en ratones tratados se redujo significativamente. Los ratones que habían recibido U-KRS no mostraron ningún efecto secundario deletéreo relacionado con el fármaco.
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Ejemplo 14 Efectos in vitro del U-KRS sobre el fenotipo de linfocitos humanos normales Materiales y procedimientos
El estudio se llevó a cabo sobre linfocitos aislados procedentes de sangre periférica de 10 voluntarios sanos. Las células se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque. La viabilidad de las células se determinó mediante tinción con azul de tripano al 0,1%, y se encontró que era del 95%.
Se cuantificó la subpoblación de linfocitos mediante inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales contra células T totales, células T ayudantes y células T supresoras. Posteriormente, las células se trataron con fragmentos de IgG de conejo F/ab/2 anti-ratón conjugado a FITC, se lavó en PBS y se montó sobre platinas usando polivinilalcohol y glicerol. En las preparaciones control, se usó PBS y suero de ratón normal en lugar de anticuerpos monoclonales.
Resultados
El presente estudio que indica la posibilidad de una influencia directa del U-KRS sobre subpoblaciones de células T confirmó las observaciones previas de que el U-KRS podría ser un buen inmunoestimulador de la inmunidad celular en pacientes con cáncer.
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Ejemplo 15 Propiedades mitógenas del U-KRS sobre monocitos sanguíneos periféricos humanos Materiales y procedimientos
Células mononucleares sanguíneas periféricas. La sangre se diluyó con un volumen igual de PBS que contiene EDTA 1 mM, pH 7,5, y se separó por capas en Histopaque 1077. Los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 30 min. Las capas interfaciales que contienen los linfocitos se recogieron y se lavaron tres veces con medio de cultivo de tejidos RPMI.
Resultados
Se encontró que incluso un corto periodo de pre-tratamiento de la célula con U-KRS tenía un potente efecto sinérgico sobre la mitogénesis de la PHA que da como resultado unos índices de estimulación celular significativamente superiores que aquellos de la PHA sola. Además, se encontró que un corto periodo de tratamiento con la PHA de las células es casi imperativo para que el U-KRS ejerza sus efectos mitógenos.
Este estudio muestra un incremento significativo en los linfocitos circulantes en pacientes en fases avanzadas de malignidades tratadas con el U-KRS.
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Ejemplo 16 Modulación de la actividad citolítica de células efectoras inmunitarias e inhibición del crecimiento tumoral in vivo mediante el U-KRS Materiales y procedimientos
Células tumorales: líneas celulares de mastocitoma P815 y AKIL de leucemia AKR se mantuvieron en medio DMEM suplementado con el 9,0% de suero fetal bovino que contiene penicilina y estreptomicina.
\newpage
Resultados
El presente estudio in vitro demuestra que el U-KRS es un modificador eficaz de la respuesta biológica que aumenta, hasta 48 veces, la actividad lítica de linfocitos esplénicos obtenidos de ratones aloinmunizados. Las actividades líticas de células de bazo tratadas con IL-2 y linfocitos de exudado peritoneal también se incrementaron significativamente con la adición de U-KRS al medio de ensayo de lisis mediada por células.
Los resultados, tomados junto con el hecho de que el U-KRS también aumenta la actividad citolítica de los linfocitos esplénicos, indican que el efecto terapéutico del U-KRS observado in vivo está mediado por la estimulación de la actividad citolítica de células efectoras inmunitarias.
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Ejemplo 17 Influencia del U-KRS sobre los parámetros sanguíneos inmunológicos in vitro e in vivo Materiales y procedimientos
Se usaron 96 ratas Wistar para este estudio. La edad inicial era de 16 semanas tanto para ratas macho como hembras.
El U-KRS y la PHA se probaron en una prueba de Htimidina sobre linfocitos T para evaluar el índice de estimulación en dosis de entre 0,01 y 20 \mug/ml.
Resultados
El U-KRS estimula subgrupos de sistemas hematopoyéticos e inmunológicos diferentes. En este experimento se induce reticulocitosis como posible signo de estimulación de ciertas células madres o de activación general del sistema eritropoyético. Puesto que no se pueden demostrar cambios en las cuentas de leucocitos absolutos, se puede postular que mediante la acción del U-KRS sólo se producen en este experimento propiedades moduladoras potentes, por ejemplo, una deslocalización de los diferentes subgrupos.
In vitro se observó una estimulación comparable a aquella conseguida en estos experimentos, incluyendo la apoptosis en células cancerígenas.
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Ejemplo 18 Efecto inhibitorio del U-KRS sobre la antigenicidad de la ovoalbúmina y la respuesta del anticuerpo IgE anti-ovoalbúmina en ratones Materiales y procedimientos
Se probó la capacidad del U-KRS para inhibir la sensibilización inducida por ovoalbúmina en ratones BALB/c y F1 (BALB/c x C57BI/6J). El U-KRS se introdujo en los ratones en una mezcla con el antígeno (ovoalbúmina) y el adyuvante (alum) inhibió la sensibilización de los ratones, reflejado en la menor respuesta del anticuerpo IgE anti-OA y redujo la liberación de histamina inducida por el antígeno desde mastocitos aislados de las cavidades peritoneales de ratones sensibilizados. El efecto del U-KRS sobre la antigenicidad de la ovoalbúmina (OA) en anafilaxis se probó en una reacción anafiláctica cutánea pasiva (PCA) heteróloga en ratas.
Resultados
Los resultados muestran que la OA preparada en la mezcla con el U-KRS tenía una capacidad reducida de reaccionar con anticuerpos IgE anti-OA generados contra OA nativa en ratones y fijados sobre la superficie de mastocitos de rata en reacciones PCA heterólogas. Los resultados sugieren que el pretratamiento de U-KRS con OA puede afectar a sus propiedades antigénicas y a la capacidad de reaccionar con anticuerpos IgE anti-OA generados contra las moléculas IgE nativas.
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Ejemplo 19 Efecto del tratamiento con U-KRS sobre osteoporosis temprana Materiales y procedimientos
El U-KRS se administró intraperitonealmente en una dosis de 30 mg/kg cada dos días durante seis meses a ratas hembra con osteoporosis temprana inducida por ovariectomía. La administración del U-KRS se inició el segundo día después de la operación quirúrgica. Al final del tratamiento de larga duración con U-KRS cada rata se sometió a pruebas para la resistencia de ambos húmeros y se midieron algunos parámetros del fémur de la rata.
Resultados
Los resultados muestran que el descenso en la resistencia mecánica de los huesos huméricos y algunos cambios en el fémur provocados por la ovariectomía se evitaron mediante el tratamiento de seis meses con U-KRS.
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Ejemplo 20 Influencia de la preparación de U-KRS sobre el virus de la gripe y la bacteria E. coli y S. aureus Materiales y procedimientos
Se cultivaron virus de la gripe de la cepa APRB/HON1/34 sobre embriones de gallina de 10 días de edad.
Se empleó la bacteria E. coli procedente de material clínico habitual y la cepa 209P de S. aureus. Preparación de U-KRS de la serie 290614.
Resultados
Este estudio confirma la existencia de una acción anti-infecciosa de la preparación de U-KRS en el macroorganismo infectado. Esta influencia se ejerce a través de la estimulación de algunos elementos del sistema inmunitario del hospedador debido a una destrucción secundaria de microorganismos o de células infectadas por estos microorganismos.
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Ejemplo 21 Actividad biológica del U-KRS con respecto al virus de la gripe Materiales y procedimientos
Virus de tipo A, cultivo de Port-Chalmers 1/73, variedad antigénica H3N2. El virus se inyectó a 1, 10 y 100 EID_{50} por embrión. El U-KRS se disolvió de novo en solución de Hanks.
Resultados
Se confirmó que el U-KRS tiene una actividad obstructiva tras el desarrollo del proceso infeccioso.
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Ejemplo 22 Acción del U-KRS sobre los efectos de la irradiación Materiales y procedimientos
Ratones macho CBA/J de 16/20 g de peso corporal.
Se llevó a cabo la irradiación de corta duración del cuerpo completo de ratones con rayos gamma a dosis que abarcan entre 6,0 Gy y 7,5 Gy. Se llevó a cabo la irradiación de larga duración con la dosis acumulativa de 8,75 Gy usando el dispositivo CEGO.
El U-KRS se administró intraperitonealmente a dosis de 0,1, 1,4 y 12 mg/kg de peso corporal.
Resultados
La capacidad del U-KRS para modificar los efectos de la irradiación se estudió en ratones CBA/J usando una dosificación del fármaco de entre 0,1 y 12 mg/kg. Se encontró que el U-KRS incrementa la tasa de supervivencia de ratones en un 50-60% a dosis de irradiación entre 5,00 y 7 Gy sin ningún efecto a la dosis de 7,5 Gy. La variación de la dosificación del fármaco no influyó en el resultado de la radiación.
El resultado principal del presente estudio es el hallazgo de que el U-KRS es capaz de modificar los efectos de la irradiación cuando se aplica tanto en regímenes profilácticos como curativos.
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Ejemplo 23 Efectos del U-KRS contra la radiación ionizante Materiales y procedimientos
Líneas celulares de carcinoma de mama, adenocarcinomas colorrectales, glioblastoma y adenocarcinomas de páncreas. Preparación del U-KRS.
El efecto del U-KRS sobre la supervivencia celular se probó a una concentración que abarca desde 0,2 \mug/ml. Los tiempos de exposición fueron de 1, 3 y 24 h, tras las cuales las células se lavaron con tampón fosfato salino y se añadió medio fresco.
Resultados
El tratamiento con U-KRS dio como resultado una reducción diferencial en la supervivencia de células clonogénicas que depende del tiempo y de la dosis. Las cuatro líneas celulares tumorales humanas mostraron diferentes sensibilidades hacia el U-KRS con una reducción de la supervivencia clonogénica de hasta 100 veces superior comparada con fibroblastos humanos para una incubación de 24 horas.

Claims (24)

1. Un procedimiento para la fabricación de un producto de reacción alcaloide que comprende al menos un derivado alcaloide distinto de la sanguinarina y del cloruro de N-metilprotopina, derivado que tiene un nitrógeno cuaternario, y el procedimiento que comprende:
a) el suministro de una mezcla de reacción que comprende un disolvente orgánico, al menos un alcaloide presente en la hierba Chelidonium majus L. y que se selecciona del grupo constituido por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina y oxiquelidonina, y un agente alquilante, y la reacción de alquilación haciendo reaccionar el al menos un alcaloide con el agente alquilante en presencia del disolvente orgánico, para permitir la formación de al menos un derivado alcaloide que tiene un nitrógeno cuaternario;
b) después de la terminación de la reacción, la sumisión de la mezcla de reacción resultante a al menos una etapa de lavado con un disolvente acuoso o agua, para eliminar los compuestos solubles en agua presentes en la mezcla de reacción; y
c) la sumisión de la mezcla de reacción lavada a un tratamiento con un ácido fuerte en forma líquida o gaseosa, preferentemente con cloruro de hidrógeno gaseoso o una disolución de cloruro de hidrógeno, convirtiendo así al menos un derivado alcaloide cuaternario en una forma soluble en agua, particularmente una sal soluble en agua.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que en la etapa c) un producto de reacción precipita durante o después del tratamiento con el ácido, tras lo cual el precipitado se separa del disolvente orgánico, y opcionalmente se somete a una purificación complementaria usando disolventes orgánicos.
3. El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la reacción de alquilación se lleva a cabo a temperatura elevada, en particular, al punto de ebullición del disolvente.
4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa como fuente de alcaloides una mezcla de varios o todos los alcaloides de Chelidonium majus L. del grupo constituido por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina y oxiquelidonina.
5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la quelidonina, oxiquelidonina, o metoxiquelidonina se aplican como única fuente de alcaloides.
6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el agente alquilante es un agente fisiológicamente activo, preferentemente un agente citotóxico.
7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el agente alquilante es soluble en agua o se descompone en componentes solubles en agua tras el contacto con el agua.
8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el disolvente orgánico se selecciona del grupo constituido por monoclorometano, diclorometano, triclorometano, monocloroetano, dicloroetano y tricloroetano.
9. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el agente alquilante es sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina (CAS 52-24-4).
10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho derivado alcaloide tiene un átomo de nitrógeno cuaternario al cual, está unido en forma de cuarto ligando, un resto hidrógeno o un resto que procede del agente alquilante, el residuo que se selecciona preferentemente del grupo constituido por un resto metilo, etilo y sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina.
11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho derivado alcaloide tiene un átomo de nitrógeno cuaternario, y como cuarto ligando de dicho nitrógeno, un producto de descomposición formado debido al tratamiento con el ácido.
12. Un producto de reacción alcaloide que comprende al menos un derivado alcaloide distinto de la sanguinarina y del cloruro de N-metilprotopina, el derivado que tiene un nitrógeno cuaternario y el alcaloide que se selecciona entre los alcaloides quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina y oxiquelidonina, presentes en la hierba Chelidonium majus L., para su uso como fármaco o medicamento.
13. El producto de reacción alcaloide según la reivindicación 12, que se puede obtener en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
14. El producto de reacción alcaloide según la reivindicación 13, obtenido mediante la reacción de uno o más alcaloides con un agente alquilante, en el que en el derivado un nitrógeno inicialmente terciario está presente en forma cuaternaria al cual, como cuarto ligando, está unido un resto hidrógeno o un resto que procede del agente alquilante, el residuo que se selecciona preferentemente del grupo constituido por un resto metilo, etilo y sulfuro de tris(1-aziridinil)fosfina.
15. El producto de reacción alcaloide según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que al menos un derivado alcaloide está presente en forma de sal soluble en agua, preferentemente en forma de clorhidrato.
16. El producto de reacción alcaloide según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la quelidonina, oxiquelidonina, o metoxiquelidonina están presentes como única fuente de alcaloides.
17. El producto de reacción alcaloide según una cualquiera de las reivindicaciones 13 al 16, en el que el producto comprende adicionalmente al menos un compuesto seleccionado del grupo constituido por alcaloides terciarios sin reaccionar, agentes alquilantes sin reaccionar, y productos de descomposición del agente alquilante.
18. Un derivado de quelidonina, en el que la quelidonina de origen natural está presente en forma cuaternizada según la siguiente fórmula (I),
3
en la que como cuarto ligando R1 al nitrógeno cuaternario, está presente un hidrógeno o un resto metilo o etilo, para su uso como fármaco o medicamento.
19. El derivado quelidonina de la reivindicación 18 en forma soluble en agua, preferentemente en forma de sal con un ácido fuerte, lo más preferentemente en forma de clorhidrato.
20. Uso del producto de reacción alcaloide reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17 en la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o dolencia corporal seleccionada del grupo constituido por infecciones víricas, cáncer, disfunción inmunológica, disfunción metabólica y daño por radiación.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que la enfermedad se selecciona del grupo constituido por alergias, osteoporosis, tumores cutáneos, infecciones por el virus de la gripe, enfermedades reumáticas, cicatrices, heridas postoperatorias, epilepsia y esclerosis múltiple.
22. Uso según la reivindicación 20 ó 21, en el que el único alcaloide es la quelidonina.
23. Uso del derivado de quelidonina reivindicado en la reivindicación 18 ó 19 en la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad o dolencia corporal seleccionada del grupo constituido por infecciones víricas, cáncer, disfunción inmunológica, disfunción metabólica y daño por radiación.
24. Uso según la reivindicación 23, en el que la enfermedad se selecciona del grupo constituido por alergias, osteoporosis, tumores cutáneos, infecciones por el virus de la gripe, enfermedades reumáticas, cicatrices, heridas postoperatorias, epilepsia y esclerosis múltiple.
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