ES2346219T3 - Vectores plasmidicos de clonacion de adn y procedimiento para su uso. - Google Patents
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Abstract
Un vector de clonación plasmídico, en el que los elementos secuenciales codificados comprenden a)dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5', b)un sitio cebador oligonucleotídico, c)Un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, d)un sitio de restricción habitual único y no variable que permite la clonación de un módulo del vector lanzadera posterior al par de sitios de endonucleasas de anidación, e)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables, f)secuencias nucleotídicas aleatorias, g)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables, h)un sitio de endonucleasa de anidación único en una orientación directa, i)un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, j)un sitio cebador oligonucleotídico, k)un par de sitios BstX I únicos en orientaciones opuestas, en los que la región nucleotídica variable en el sitio de reconocimiento de BstXI está definido por nucleótidos idénticos a las colas no complementarias generadas por la ordenación de dos sitios de reconocimiento de endonucleasas de anidación idénticos dispuestos en orientación complementaria-inversa, l)un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientaciones opuestas que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, m)un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa, n)un par de sitios de restricción frecuentes únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, o)un sitio de endonucleasa de anidación único en orientación inversa, siendo el sitio de endonucleasa de anidación el mismo que el sitio de endonucleasa de anidación en una orientación directa, p)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables, q)secuencias nucleotídicas aleatorias, r)una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables, s)un sitio de restricción habitual único y no variable, t)un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, u)un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa, y v)tres sitios de restricción habituales únicos y no variables.
Description
Vectores plasmídicos de clonación de ADN y
procedimientos para su uso.
La presente invención se refiere al campo de los
vectores de clonación plasmídicos y al uso de vectores de clonación
plasmídicos para construir constructos de ADN o transgenes.
El fundamento de la biología molecular es la
tecnología de ADN recombinante, que en el presente documento se
puede resumir como la modificación y la propagación de ácidos
nucleicos con el propósito de estudiar la estructura y la función
de los ácidos nucleicos y sus productos proteicos.
Los genes individuales, las regiones reguladoras
génicas, las subpoblaciones de genes y, de hecho, los cromosomas
enteros dentro de los que están contenidos los anteriores, están
todos ellos compuestos por secuencias de nucleótidos bicatenarias
antiparalelas que convencionalmente se identifican por las iniciales
A, T, G y C. Estas secuencias de ADN, así como las secuencias de
ADNc derivadas de las moléculas de ARNm, pueden fragmentarse en
fragmentos distintos, aislarse e insertarse en un vector, tal como
un plásmido bacteriano, para estudiar los productos génicos. Un
plásmido es una pieza de ADN extracromosómico derivado originalmente
de bacterias y que se puede manipular y reintroducir en una
bacteria huésped con el propósito de estudiar o producir un
producto génico. El ADN de un plásmido es similar a todo el ADN
cromosómico en cuanto a que está compuesto por los mismos
nucleótidos A, T, G y C que codifican genes y regiones reguladoras
de los genes, no obstante, es una molécula relativamente pequeña
compuesta por menos de aproximadamente 30.000 pares de bases o 30
kilobases (kb). Además, los pares de bases nucleotídicos de un
plásmido bicatenario forma una molécula circular, lo que también
distingue al ADN del plásmido del ADN cromosómico.
Los plásmidos potencian el rápido intercambio de
material genético entre organismos bacterianos y permiten la
adaptación rápida a los cambios ambientales, tales como temperatura,
suministro de alimentos y otros retos. Cualquier plásmido adquirido
debe expresar un gen o genes que contribuyan a la supervivencia del
huésped o, de lo contrario, el organismo lo destruirá o desechará
dado que el mantenimiento de plásmidos innecesarios sería un uso
derrochador de los recursos. Una población clonal de células
contiene material genético idéntico, incluidos todos los plásmidos
que podría alojar. El uso de un vector de clonación plasmídico con
un inserto de ADN en tal población clonal de las células huésped
amplificará la cantidad disponible del ADN de interés. El ADN
clonado de este modo se puede aislar y recuperar para su posterior
manipulación en las etapas requeridas para construir un constructo
de ADN. Por tanto, se puede apreciar que los vectores de clonación
plasmídicos son herramientas útiles en el estudio de la función
génica.
Mientras que algunos elementos encontrados en
los plásmidos son naturales, otros se han producido mediante
ingeniería para potenciar la utilidad de los plásmidos como vectores
de ADN. Estos incluyen genes de resistencia a antibióticos o a
sustancias químicas y un sitio de clonación múltiple (MCS) entre
otros. Cada uno de estos elementos tiene un papel en la presente
invención, así como en la técnica anterior. La descripción del papel
que desempeña cada elemento destacará las limitaciones y demostrará
la utilidad de la presente invención.
Un gen de transmisión plasmídica particularmente
útil que puede adquirir un huésped es uno que conferiría
resistencia a antibióticos. En la práctica diaria de la tecnología
del ADN recombinante, los genes de resistencia a antibióticos se
explotan como elementos de selección positiva o negativa que
potencian preferentemente el cultivo y la amplificación del
plásmido deseado sobre los de los otros plásmidos.
Con el fin de que pueda ser mantenido por un
huésped bacteriano, un plásmido también debe contener un segmento
de secuencias que dirigen al huésped a duplicar el plásmido. Las
secuencias conocidas como el elemento origen de replicación (ORI)
dirigen al huésped para usar sus enzimas celulares para hacer copias
del plásmido. Cuando tal bacteria se divide, cada una de las
células hijas conservará una copia o copias de cualquiera de dichos
plásmidos. Ciertas cepas de la bacteria E. coli se han
derivado para maximizar esta duplicación de modo que se producen
más de 300 copias por bacteria. De este modo, se puede potenciar el
cultivo de un plásmido deseado.
Otro elemento esencial en cualquier vector de
clonación es una localización para la inserción de los materiales
genéticos de interés. Este es un elemento sintético que se ha
sometido a ingeniería dentro de plásmidos "salvajes", de modo
que se confiere utilidad como vector de clonación. Todo vector de
clonación plasmídico típico disponible comercialmente contiene al
menos una de estas regiones, conocida como sitio de clonación
múltiple (MCS). Un MCS normalmente comprende secuencias
nucleotídicas que pueden fragmentarse por la acción de una sola o de
una serie de enzimas endonucleasas de restricción (en lo sucesivo
denominadas "enzimas de restricción"), cada una de ellas tiene
una secuencia de reconocimiento y un patrón de escisión distintos.
Las denominadas secuencias de reconocimiento (que se denominan
"sitios" de la enzima de restricción) codificadas en la
molécula de ADN comprenden una secuencia palindrómica bicatenaria.
Para algunas enzimas de restricción, bastan con sólo
4-6 nucleótidos para proporcionar un sitio de
restricción, mientras que algunas enzimas de restricción requieren
una secuencia de 8 o más nucleótidos. Por ejemplo, la enzima EcoR1
reconoce la secuencia hexanucleotídica; ^{5'}
G-A-A-T-T-C
^{3'}, en la que 5' indica el extremo de la molécula conocido por
consenso como el extremo "anterior" y, asimismo, 3' indica el
extremo "posterior". La hebra complementaria de la secuencia de
reconocimiento sería su hebra antiparalela, ^{3'}
G-A-A-T-T-C-^{5'}.
Por tanto, el sitio de reconocimiento de doble cadena puede estar
representado dentro de la molécula bicatenaria más grande en la que
aparece como:
Como muchas otras enzimas de restricción, EcoR1
no fragmenta exactamente en el eje de la simetría de la díada, sino
en posiciones alejadas cuatro nucleótidos en las dos hebras de ADN
entre los nucleótidos indicados por una "/".
de modo que la molécula de ADN
bicatenaria se fragmenta y tiene la configuración resultante de
nucleótidos en los "extremos" recién
formados:
Esta fragmentación escalonada proporciona
fragmentos de ADN con términos 5' protruyentes. Dado que los pares
A-T y G-C se forman de modo
espontáneo cuando están cercanos, los extremos que protruyen como
estos se denominan extremos cohesivos o adhesivos. Uno cualquiera
de estos extremos puede formar puentes de hidrógeno con cualquier
otro extremo complementario fragmentado con la misma enzima de
restricción. Dado que cualquier ADN que contiene una secuencia de
reconocimiento específico se cortará del mismo modo que cualquier
otro ADN que contiene la misma secuencia, los extremos escindidos
serán complementarios. Por tanto, los extremos de cualquier molécula
de ADN cortada con la misma enzima de restricción "coinciden"
entre sí del mismo modo que piezas adyacentes de un puzzle
"coinciden", y pueden unirse enzimáticamente. Es esta propiedad
la que permite la formación de moléculas de ADN recombinantes y
permite la introducción de fragmentos de ADN extraño en los
plásmidos bacterianos o en cualquier otra molécula de ADN.
Otro principio general que se debe considerar al
construir moléculas de ADN recombinante es que todos los sitios de
restricción que se encuentren dentro de una molécula se cortarán con
una enzima de restricción concreta, no sólo el sitio de interés.
Cuanto más grande es una molécula de ADN, mayor es la probabilidad
de que vuelva a aparecer cualquier sitio de restricción. Suponiendo
que todos los sitios de restricción se distribuyen de forma
aleatoria a lo largo de una molécula de ADN aparecerá un sitio
tetranucleotídico, de media, una vez cada 4^{4} (es decir, 256)
nucleótidos, mientras que un sitio hexanucleotídico aparecerá una
vez dada 4^{6} (es decir, 4096) nucleótidos, y los sitios
octanucleotídicos aparecerán una vez dada 4^{8} (es decir,
114.688) nucleótidos. Por tanto, se puede apreciar con facilidad
que las secuencias de reconocimiento más cortas aparecerán con
frecuencia, mientras que las más largas aparecerán rara vez. Al
planificar la construcción de un transgen u otra molécula de ADN
recombinante, éste es un tema vital, ya que tal proyecto con
frecuencia requiere el ensamblaje de varias piezas de ADN de varios
tamaños. Cuanto más grandes son estas piezas, mayor es la
probabilidad de que los sitios que se desean usar aparezcan en
varias piezas de los componentes de ADN, lo que dificulta la
manipulación, como mucho.
En la presente memoria descriptiva, las enzimas
de restricción frecuentes se denominan enzimas de restricción
habituales y sus secuencias análogas se denominan sitios de
restricción habituales. Las enzimas de restricción con secuencias
análogas superiores a 6 nucleótidos se denominan enzimas de
restricción raras y sus sitios análogos sitios de restricción
raros. Por tanto, las designaciones "raros" y "habituales"
no se refieren a la abundancia o disponibilidad relativa de una
enzima de restricción concreta, sino a la frecuencia de aparición
de la secuencia de nucleótidos que constituyen su sitio de
reconocimiento análogo dentro de cualquier molécula de ADN o
fragmento aislado de una molécula de ADN o cualquier gen o su
secuencia de ADN.
Recientemente se ha aislado una segunda clase de
enzimas endonucleasas de restricción denominadas enzimas
endonucleasas de anidación (HE). Las enzimas HE tienen grandes
sitios de reconocimiento asimétricos (12-40 pares
de bases). Los sitios de reconocimiento de las HE son extremadamente
raros. Por ejemplo, el HE conocido como I-SceI
tiene un sitio de reconocimiento de 18 pb (5'...TAGGGATAACAGGGTAAT
...3'), que se ha previsto que sólo aparezca una vez cada 7 x
10^{10} pares de bases de secuencia aleatoria. Este índice de
aparición es equivalente a sólo un sitio en 20 genomas del tamaño
del de los mamíferos. La rara naturaleza de los sitios HE
incrementa considerablemente la probabilidad de que un ingeniero
genético pueda corta un producto transgénico final sin alterar la
integridad del transgen si los sitios HE estuvieran incluidos en
localizaciones adecuadas en un vector de clonación plasmídico.
Dado que una molécula de ADN de cualquier
organismo fuente se cortará de forma idéntica mediante su enzima de
restricción análoga, las piezas de ADN extraño de cualquier especie
se pueden cortar con una enzima de restricción, insertada en un
vector plasmídico bacteriano fragmentado con la misma enzima de
restricción un amplificado en una célula huésped adecuada. Por
ejemplo, un gen humano puede cortarse por 2 sitios con EcoR1,
aislarse el fragmento con los extremos EcoR1 y mezclarse con un
plásmido que también se cortó con EcoR1 en lo que se conoce
habitualmente como reacción de ligación o mezcla de ligación. En las
condiciones adecuadas en la mezcla de ligación, algunos de los
fragmentos génicos humanos aislados coincidirán con los extremos de
las moléculas de plásmido. Estos extremos recientemente unidos se
pueden unir y recircularizar enzimáticamente el plásmido, que ahora
contiene su nuevo inserto de ADN. Después, la mezcla de ligación se
introduce en E. coli u otro huésped adecuado, y los
plásmidos recién sometidos a ingeniería se amplificarán a medida que
la bacteria se divide. De este modo se puede obtener un número
relativamente grande de copias del gen humano y se puede
recolectar. Estas copias de genes se pueden manipular adicionalmente
con el propósito de investigación, análisis o producción de su
producto génico proteico.
La tecnología de ADN recombinante con frecuencia
se enmarca en la generación de los denominados "transgenes".
Los transgenes con frecuencia comprenden una variedad de materiales
genéticos que derivan de uno o más organismos donantes y se
introducen en un organismo huésped. Normalmente, un transgen se
construye usando un vector de clonación como el punto de partida o
"estructura" del proyecto y se planifica una serie de complejas
etapas de clonación para ensamblar el producto final dentro de
dicho vector. Los elementos de un transgen, que comprende
secuencias nucleotídicas, incluyen, entre otros 1) promotor
regulador y/o elementos de potenciación, 2) un gen que se expresará
como una molécula de ARNm, 3) elementos de ADN que proporcionan
estabilización del mensaje del ARNm, 4) secuencias nucleotídicas
que simulan regiones génicas intrónicas de mamífero, y 5) señales
para el procesamiento del ARNm, tal como la cola de
poli-A que se añade al extremo de los ARNm
naturales. En algunos casos, un diseño experimental puede requerir
la adición de señales de localización para proporcionar transporte
al producto génico a una localización subcelular concreta. Cada uno
de estos elementos es un fragmento de una molécula de ADN más
grande que se ha cortado de un genoma donante o, en algunos casos,
sintetizarse en un laboratorio. Cada pieza está ensamblada con las
otras en un orden preciso y orientación 5'-3' en un
vector de clonación plasmídico.
El promotor de cualquier gen se puede aislar
como un fragmento de ADN y colocarse dentro de una molécula
sintética, tal como un plásmido, para dirigir la expresión de un
gen deseado, suponiendo que se pueden proporcionar las condiciones
necesarias para la estimulación del promotor de interés. Por
ejemplo, las secuencias promotoras del gen de la insulina se pueden
aislar, introducir en un vector de clonación plasmídico junto con un
gen indicador y usarse para estudiar las condiciones requeridas
para la expresión del gen de la insulina en un tipo celular
adecuado. Como alternativa, el promotor del gen de la insulina puede
unirse con la secuencia codificadora de la proteína de cualquier
gen de interés en un vector de clonación plasmídico y usarse para
dirigir la expresión del gen de interés en células que expresan
insulina, suponiendo que todos los elementos necesarios están
presentes dentro del transgen de ADN construido de este modo.
Un gen indicador es un componente
particularmente útil de algunos tipos de transgenes. Un gen
indicador comprende secuencias nucleotídicas que codifican una
proteína que se expresará bajo la dirección de un promotor concreto
de interés al que está unido en un transgen, lo que proporciona una
respuesta bioquímica medible de la actividad promotora.
Normalmente, un gen indicador es fácil de detectar o medir frente al
fondo de proteínas celulares endógenas. Genes indicadores de uso
habitual incluyen, entre otros, los de LacZ, proteína fluorescente
verde y luciferasa, y otros genes indicadores, muchos de los cuales
son bien conocidos para los expertos en la técnica.
En los genomas bacterianos no hay intrones, pero
se requieren para la formación adecuada de moléculas de ARNm en las
células de mamífero. Por tanto, cualquier constructo de ADN para
usar en sistemas de mamíferos debe tener al menos un intrón. Los
intrones pueden aislarse a partir de cualquier gen de mamífero e
insertarse en un constructo de ADN, junto con las señales de corte
y empalme adecuadas que permiten que las células de mamífero
escindan el intrón y realicen el corte y empalme de los extremos
restantes del ARNm.
Un elemento de estabilización del ARNm es una
secuencia de ADN que es reconocida por las proteínas de unión que
protegen a algunos ARNm de la degradación. La inclusión de un
elemento de estabilización de ARNm con frecuencia potenciará el
nivel de expresión génica con respecto al ARNm en algunos tipos de
células de mamífero y, por tanto, puede ser útil en algunos
constructos de ADN o transgenes. Un elemento de estabilización de
ARNm se puede aislar a partir de ADN o ARN natural o producirse de
forma sintética para su inclusión en un constructo de ADN.
Una señal de localización es una secuencia de
ADN que codifica una señal proteica para la ruta subcelular de una
proteína de interés. Por ejemplo, una señal de localización nuclear
dirigirá una proteína al núcleo; una señal de localización en la
membrana plasmática la dirigirá a la membrana plasmática, etc. Por
tanto, una señal de localización se puede incorporar en un
constructo de ADN para estimular la translocación de su producto
proteico a la localización subcelular deseada.
Una secuencia marcadora puede estar codificada
en un constructo de ADN de modo que el producto proteico tenga una
región única unida. Esta región única sirve como marcador proteico
que puede distinguirla de su homóloga endógena. Como alternativa,
puede servir como identificador que se puede detectar mediante una
amplia variedad de técnicas bien conocidas en la técnica,
incluidas, entre otras, RT-PCR, inmunohistoquímica o
hibridación in situ.
Con un transgen complejo, o con uno que incluya
regiones de ADN particularmente grandes, hay una mayor probabilidad
de que haya múltiples sitios de reconocimiento en estas piezas de
ADN. Recuérdese que las secuencias de reconocimiento que codifican
un sitio hexanucleotídico cualquiera aparecen cada 4096 pb. Si una
secuencia promotora tiene 3000 pb y un gen de interés de 1500 pb se
debe ensamblar en un vector de clonación de 3000 pb, es
estadísticamente muy probable que muchos sitios de 6 o menos
nucleótidos no sean útiles, ya que todos los sitios que se pueden
usar deben aparecer en sólo dos de las piezas. Además, los sitios
deben aparecer en las áreas adecuadas de las moléculas adecuadas
que se deben ensamblar. Además, la mayoría de los proyectos de
clonación necesitarán la adición de elementos de ADN adicionales,
de modo que se incrementa la complejidad de la molécula en
crecimiento y la probabilidad de repetición inoportuna de cualquier
sitio concreto. Dado que cualquier enzima de restricción cortará en
todos sus sitios en una molécula, si reaparece un sitio de enzima de
restricción se cortarán todos los sitios inoportunos junto con los
sitios deseados, lo que altera la integridad de la molécula. Por
tanto, cada etapa de clonación debe planearse cuidadosamente de
modo que no rompa la molécula en crecimiento al cortarla con una
enzima de restricción que ya se ha usado para incorporar un elemento
precedente. Y, por último, cuando un investigador desea introducir
un transgen completo en un organismo de mamífero, el constructo del
transgen completamente ensamblado con frecuencia debe linealizarse
en un sitio de restricción único en al menos un extremo del
transgen, de modo que se requiere otro sitio único más que no se
encuentra en ningún otro lugar en el constructo. Dado que la
mayoría de los constructos de ADN están diseñados para un propósito
sencillo, se ha prestado poca atención a cualquier modificación
futura que podría necesitar hacerse, lo que incrementa aún más la
dificultad para cambios experimentales futuros. Por ejemplo, Goderis
y col. (Plant Molecular Biology 50: 17-27, 2002) se
refiere a un conjunto de vectores realizado para la construcción de
vectores de transformación vegetales mediados por
Agrobacterium que contienen múltiples casetes de expresión
y/u otros elementos, tales como regiones de fijación a la matriz.
Este conjunto de vectores comprende un vector binario que tiene un
sitio de clonación múltiple constituido por 13 sitios de restricción
hexanucleotídicos, 6 sitios de restricción octanucleotídicos y 5
sitios para endonucleasas de anidación, y un conjunto de vectores
auxiliares que permiten el ensamblaje de los casetes de expresión
flanqueados por los sitios para las endonucleasas de anidación. Los
casetes de expresión unidos en los vectores auxiliares se pueden
transferir al vector binario.
Thomson y col. (In Vitro Cell. Dev.
Biol.-Plant 38: 537-542, 2002) da a conocer un
conjunto de vectores similar con el fin de construir grupos de
genes artificiales. Este conjunto de vectores también comprenden un
vector que tiene un sitio de clonación múltiple que consta de una
matriz de sitios de escisión para endonucleasas de anidación y una
serie de vectores lanzadera unidireccionales que contienen varias
combinaciones de sitios de restricción para endonucleasas de
anidación.
Además, Asselbergs y Rival (BioTechniques 20:
558-562, 1996) simplemente describen la creación de
un plásmido con un poliligador versátil en el que cuatro sitios
para meganucleasa están intercalados con los sitios que se escinden
mediante enzimas de restricción convencionales de tipo II de tal
modo que se generan extremos romos. Además, Lin y col. (PNAS, vol.
100, No. 10, 5962-5967, 2003) dan a conocer un
sistema de vectores para ensamblaje y transformación multigénicos.
Este sistema de vectores consta de un vector aceptor basado en un
cromosoma artificial competente para transformación (TAC) junto don
dos vectores donantes.
Tradicionalmente, el diseño y la construcción
del transgen consumen cantidades significativas de tiempo y energía
por varios motivos, incluidos los siguientes:
- 1.
- Hay una amplia variedad de enzimas de restricción y de HE disponibles que generarán una serie de extremos, no obstante, la mayoría de ellos no son compatibles entre sí. Muchas enzimas de restricción, como la EcoR1, generan fragmentos de ADN con extremos 5' cohesivos protruyentes o "colas"; otras (p. ej., Pst1) generan fragmentos con colas protruyentes en 3', mientras que otras más (p. ej., Ball) fragmentan por el eje de simetría para producir fragmentos con extremos romos. Algunas de éstos serán compatibles con los extremos formados mediante escisión con otras enzimas de restricción y HE, pero la mayoría de los útiles no lo serán. Los extremos que se pueden generar con el aislamiento de cada aislamiento de fragmento de ADN deben considerarse cuidadosamente en el diseño de un constructo de ADN.
- 2.
- Los fragmentos de ADN necesarios para ensamblar un constructo de ADN o transgen deben aislarse primero de sus genomas fuente, introducirse en vectores de clonación plasmídicos y amplificarse para obtener cantidades útiles. La etapa se puede realizar usando cualquier número de vectores de clonación disponibles comercialmente o alterados de forma individual. Cada uno de los vectores de clonación plasmídicos diferentes disponibles comercialmente se desarrollaron, en su mayor parte, de forma independiente y, por tanto, contienen diferentes secuencias y sitios de restricción para los fragmentos de ADN de los genes o elementos génicos de interés. Por tanto, los genes deben ajustarse individualmente para adaptar cada uno de estos vectores según sea necesario para cualquier conjunto dado de experimentos. Con frecuencia se necesitará alterar adicionalmente los mismos fragmentos de ADN con frecuencia para los experimentos posteriores o su clonación en otras combinaciones para nuevos constructos de ADN o transgenes. Dado que cada constructo de ADN o transgen está fabricado a medida para una aplicación concreta sin pensar o conocer cómo se usará a continuación, con frecuencia se debe "retroajustar" para las aplicaciones siguientes.
- 3.
- Además, la secuencia de ADN de cualquier gen o elemento genético dado varía y puede contener sitios de restricción internos que la convierten en incompatible con los vectores disponibles en la actualidad, de modo que se complica la manipulación. Esto es especialmente cierto cuando se ensamblan varios fragmentos de ADN en un único constructo de ADN o transgen.
Por tanto, existe la necesidad de un sistema que
permita al usuario ensamblar rápidamente una serie de fragmentos de
ADN en una molécula, a pesar de la redundancia de los sitios de
restricción encontrados en los extremos y dentro de los fragmentos
de ADN. Dicho sistema podría también proporcionar un simple medio
para alterar rápidamente los extremos de los fragmentos de modo que
a ellos se añaden otras secuencias de restricción. La inclusión de
pares únicos u opuestos de sitios de restricción para HE potenciaría
la probabilidad de tener sitios únicos para la clonación. Un
sistema que también permitiría la fácil sustitución o eliminación de
uno o más de los fragmentos añadiría un nivel de versatilidad
actualmente disponible a los usuarios. Por tanto, un "sistema
modular" que permita insertar o eliminar fragmentos de ADN dentro
o fuera de las regiones "casete" flanqueadas por sitios de
restricción raros dentro del vector de clonación sería especialmente
útil y bienvenido al campo de la tecnología de ADN
recombinante.
La presente invención se refiere a un vector de
clonación plasmídico, en el que los elementos secuencias que
codifican una estructura molecular comprenden: Dos sitios de
restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio
de inserción en 5', un sitio cebador oligonucleotídico, un par de
sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta
flanqueando secuencias nucleotídicas aleatorias, un sitio de
restricción habitual único y no variable que permite la clonación
de un módulo de vector lanzadera posteriormente al par de sitios de
endonucleasas de anidación únicos, una agrupación fija de sitios de
restricción raros no variables, secuencias nucleotídicas
aleatorias, una agrupación fija de sitios de restricción raros no
variables, un sitio de endonucleasa de anidación único en una
orientación directa, un par de sitios de restricción habituales no
variables y únicos que flanquean secuencias nucleotídicas
aleatorias, un sitio cebador oligonucleotídico, un par de sitios
BstX I único en orientaciones opuestas (en los que la región
nucleotídica variable en el sitio de reconocimiento de BstX I está
definida por nucleótidos idénticos a las colas no complementarias
generadas por la ordenación de dos sitios de reconocimiento de
endonucleasas de anidación idénticos dispuestos en orientación
complementaria inversa, un par de sitios de endonucleasas de
anidación únicos en orientaciones opuestas que flanquean secuencias
nucleotídicas aleatorias; un sitio cebador oligonucleotídico en
orientación inversa, un par de sitios de restricción habituales
únicos u no variables que flanquean secuencias nucleotídicas
aleatorias, un sitio de endonucleasas de anidación único en
orientación inversa, en el que el sitio de endonucleasas de
anidación es el mismo que el sitio de endonucleasas de anidación en
orientación directa, una agrupación fija de sitios de restricción
raros no variables, secuencias nucleotídicas aleatorias, una
agrupación fija de sitios de restricción raros no variables, un
sitio de restricción habitual único y no variable, un par de sitios
de endonucleasa de anidación únicos en orientación opuesta que
flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias, un sitio cebador
oligonucleotídico en orientación inversa y tres sitios de
restricción habituales únicos y no variables.
La Figura 1 es un mapa lineal del concepto
modular de la invención.
La Figura 2 es un mapa del plásmido de
acoplamiento no reivindicado.
La Figura 3 es un mapa de restricción lineal que
ilustra un ejemplo de sitios de enzimas de restricción que se
pueden incluir en el MCS del plásmido de acoplamiento no
reivindicado.
La Figura 4 es un mapa del plásmido de
acoplamiento primario.
La Figura 5 es un mapa de restricción lineal que
ilustra un ejemplo de sitios de enzimas de restricción que se
pueden incluir en el MCS del plásmido de acoplamiento primario.
La Figura 6 es un mapa del plásmido vector
lanzadera P no reivindicado (SVP).
La Figura 7 es un mapa del sitio de restricción
lineal que ilustra un ejemplo de sitios de enzimas de restricción
que se pueden incluir en el MCS del SVP no reivindicado.
La Figura 8 es un mapa del plásmido vector
lanzadera E no reivindicado (SVE).
La Figura 9 es un mapa del sitio de restricción
lineal que ilustra un ejemplo de sitios de enzimas de restricción
que se pueden incluir en el MCS del SVE no reivindicado.
La Figura 10 es un mapa del vector lanzadera 3'
no reivindicado (SV3).
La Figura 11 es un mapa del sitio de restricción
lineal que ilustra un ejemplo de sitios de enzimas de restricción
que se pueden incluir en el MCS del SV3 no reivindicado.
La SEC ID 01 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un MCS del plásmido de acoplamiento PE3 no
reivindicado.
La SEC ID 02 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un plásmido de acoplamiento PE3 no
reivindicado.
La SEC ID 03 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un MCS del plásmido de acoplamiento primario.
La SEC ID 04 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un plásmido de acoplamiento primario.
La SEC ID 05 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un MCS del plásmido SVP no reivindicado. MCS.
La SEC ID 06 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un plásmido SVP no reivindicado.
La SEC ID 07 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un MCS del plásmido SVE no reivindicado.
La SEC ID 08 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un plásmido SVE no reivindicado.
La SEC ID 09 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un MCS del plásmido SV3 no reivindicado.
La SEC ID 10 es un ejemplo de una secuencia
nucleotídica para un plásmido SV3 no reivindicado.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "vector de clonación" y "vector de clonación
plasmídico" se usan de forma intercambiable para hacer referencia
a una molécula de ADN circular que contiene, como mínimo, un origen
de replicación, un medio para la selección positiva de las células
huésped que alojan el plásmido, tal como un gen de resistencia a
antibióticos; y un sitio de clonación múltiple.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "Origen de Replicación" (ORI) se refiere a
secuencias nucleotídicas que dirigen la replicación o duplicación
de un plásmido dentro de una célula huésped.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "Sitio de clonación múltiple" hace referencia a
secuencias nucleotídicas que comprenden sitios de restricción con el
propósito de clonar fragmentos de ADN en un vector de clonación
plasmídico.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "clonación" se refiere al procedimiento de ligar
una molécula de ADN en un plásmido y transferirla a una célula
huésped adecuada para su duplicación durante la propagación del
huésped.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "constructo de ADN" se refiere a una molécula de
ADN sintetizada mediante etapas consecutivas de clonación dentro de
un vector de clonación plasmídico y normalmente se usa para dirigir
la expresión génica en cualquier célula huésped adecuada, tal como
células cultivadas in vitro o un ratón transgénico in
vivo. También se puede hacer referencia a un transgen usado para
fabricar dicho ratón como un constructo de ADN, especialmente
durante el periodo de tiempo cuando se diseña y sintetiza el
transgen.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "vector lanzadera" se refiere a un vector de
clonación plasmídica especializado usado en la invención para
fabricar una molécula intermedia que modifique los extremos de un
fragmento de ADN.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "plásmido de acoplamiento" se refiere a un vector
de clonación plasmídico especializado usado en la invención para
ensamblar fragmentos de ADN en un constructo de ADN.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "endonucleasa de restricción" o "enzima de
restricción" se refieren a un miembro o miembros de una
clasificación de moléculas catalíticas que se unen a una secuencia
análoga de ADN y escinden la molécula de ADN en una localización
precisa dentro de dicha secuencia.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "secuencia análoga" o "secuencias análogas"
se refieren a la serie mínima de nucleótidos requerida para que una
enzima de restricción se una a, y escinda, una molécula de ADN o
gen.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "fragmento de ADN" se refiere a cualquier molécula
de ADN aislada, incluidos, entre otros, una secuencia codificadora
de proteínas, un gen indicador, un promotor, un potenciador, un
intrón, un exón, una cola de poli-A, un sitio de
clonación múltiple, una señal de localización nuclear o una señal
de estabilización de ARNm, o cualquier otra molécula de ADN natural
o sintética. Como alternativa, un fragmento de ADN puede tener un
origen completamente sintético, producido in vitro. Además,
un fragmento de ADN puede comprender cualquier combinación de
fragmentos aislados naturales o sintéticos.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
los términos "promotor génico" o "promotor" (P) se
refieren a una secuencia nucleotídica requerida para la expresión
de un gen.
\newpage
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "región potenciadora" se refiere a una secuencia
nucleotídica que no se requiere para la expresión de un gen diana
pero que incrementará el nivel de expresión génica en las
condiciones adecuadas.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "indicador" se refiere a una secuencia nucleotídica
que codifica una proteína útil para monitorizar la actividad de un
promotor de interés concreto.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "dominio de modificación de cromatina" (CMD) se
refiere a secuencias nucleotídicas que interaccionan con una
variedad de proteínas asociadas con mantener y/o alterar la
estructura de la cromatina.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "cola de poliA" se refiere a una secuencia de
nucleótidos de adenina (A) que normalmente se encuentran en el
extremo de moléculas de AD'' mensajero (ARNm). Una señal de cola de
poliA se incorpora en los extremos 3' de los constructos de ADN o
transgenes para facilitar la expresión del gen de interés.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "intrón" se refiere a las secuencias nucleotídicas
de una región no codificadora de proteínas de un gen que se
encuentra entre dos regiones codificadoras de proteínas o
exones.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "región no traducida" (UTR) se refiere a secuencias
nucleotídicas que abarcan la región no codificadora de proteínas de
una molécula de ARNm. Estas regiones no traducidas pueden residir
en el extremo 5' (5' UTR) o el extremo 3' (3' UTR) de una molécula
de ARNm.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "elemento de estabilización del ARNm" se refiere a
una secuencia de ADN que es reconocida por las proteínas de unión
que se piensa que protegen a algunos ARNm de la degradación.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "señal de localización" (LOC) se refiere a
secuencias nucleotídicas que codifican una señal para la ruta
subcelular de una proteína de interés.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "secuencia marcadora" (TAG) se refiere a secuencias
nucleotídicas que codifican una región proteica única que permite su
detección o, en algunos casos, que se distinga de cualquier
homóloga endógena.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "sitio cebador" se refiere a secuencias
nucleotídicas que sirven como moldes de ADN sobre los que los
oligonucleótidos de ADN monocatenario se pueden hibridar con el fin
de iniciar secuenciación de ADN, amplificación por PCR y/o
transcripción de ARN.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "gen selector de la expresión génica en el huésped"
(GEH-S) se refiere a un elemento genético que puede
conferir resistencia o toxicidad a las células u organismos cuando
se tratan con un antibiótico o sustancia química adecuado.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "brazo de recombinación" se refiere a secuencias
nucleotídicas que facilitan la recombinación homóloga entre ADN
transgénico y ADN genómico. El éxito de la recombinación requiere
la presencia de un brazo de recombinación izquierdo (LRA) y un brazo
de recombinación derecho (RRA) que flanquean una región de ADN
transgénico que se va a incorporar en un genoma huésped mediante
recombinación homóloga.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "pUC19" se refiere a un vector de clonación
plasmídico bien conocido para los expertos en la técnica y se puede
encontrar en la base de datos NCBI Genbank con el número de
registro L09137.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "secuencias nucleotídicas aleatorias" se refiere a
cualquier combinación de secuencias nucleotídicas que no duplican
secuencias que codifican otros elementos especificados como
componentes de la misma molécula.
Como se usa en la presente memoria descriptiva,
el término "único" se refiere a cualquier sitio de endonucleasa
de restricción o de endonucleasa de anidación que no se encuentran
en ningún otro lugar dentro de una molécula de ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención es un grupo de vectores de
clonación optimizados para reducir la cantidad de manipulación
necesaria con frecuencia para ensamblar una variedad de fragmentos
de ADN en un constructo de ADN o transgen de novo. El vector
primario, en la presente memoria descriptiva denominado plásmido de
acoplamiento, contiene un sitio de clonación múltiple (MCS) con 3
grupos de sitios de restricción raros y de HE dispuestos en un
patrón lineal. Esta disposición define una arquitectura molecular
que permite al usuario ensamblar múltiples insertos en un único
constructo de transgen sin alterar la integridad de los elementos de
ADN ya incorporados en el plásmido de acoplamiento en etapas de
clonación previas.
Dos sitios de reconocimiento para al menos tres
endonucleasas de anidación están colocados en orientación opuesta
para flanquear tres regiones modulares con el fin de crear un sitio
aceptor de casete génico que no puede autohibridar. Dado que los
sitios de endonucleasas de anidación son asimétricos y no
palindrómicos, es posible generar colas cohesivas protruyentes en
3' no complementarias introduciendo dos sitios de reconocimiento
para endonucleasas de anidación en orientación opuesta. Por tanto,
la HE I-Scel corta su sitio de reconocimiento
análogo indicado por
"/".
"/".
La colocación inversa de un segundo sitio dentro
de un MCS generaría dos colas protruyentes cohesivas no
complementarias:
Esto es particularmente útil cuando es necesario
subclonar transgenes más grandes en un vector. Debido al tamaño del
inserto, es termodinámicamente más favorable que un vector se
autohibride en lugar de aceptar un inserto grande. La presencia de
colas no complementarias generadas por esta colocación de sitios de
restricción proporciona fuerzas químicas que contrarrestan la
inclinación termodinámica para la autoligación.
La naturaleza asimétrica de la mayoría de las
colas protruyentes de HE también crea una potente herramienta de
clonación cuando se usa en combinación con el sitio de la enzima de
restricción BstX I (5' CCANNNNN/NTGG 3'). El dominio de secuencia
neutra de BstX I se puede usar para generar extremos cohesivos
compatibles para dos colas protruyentes para HE inversas, mientras
impide la autohibridación.
Los vectores lanzadera no reivindicados
contienen sitios de clonación múltiple con sitios de restricción
habituales flanqueados por sitios de restricción raros y/o de HE.
Los vectores lanzadera están diseñados para clonar fragmentos de
ADN en los sitios de restricción habituales entre los sitios raros.
Los fragmentos clonados puede liberarse posteriormente mediante
escisión por el sitio o sitios de restricción raros o de HE e
incorporarse en el plásmido de acoplamiento usando el mismo sitio o
sitios de restricción raros o de HE encontrados en los vectores
lanzadera.
Por tanto, al contrario que los vectores de
clonación convencionales, el diseño del MCS permite insertar
"casetes" o módulos de fragmentos de ADN en las regiones
modulares del plásmido de acoplamiento. Asimismo, cada uno se puede
eliminar con facilidad usando las mismas enzimas de restricción
raras y/o de HE y sustituirse con cualquier otro fragmento de ADN
de interés. Esta característica permite que el usuario cambie la
dirección de un proyecto experimentar rápida y fácilmente sin tener
que reconstruir todo el constructo de ADN. Por tanto, los vectores
de clonación plasmídicos de la presente invención permiten que el
usuario clone un fragmento de ADN en un vector intermedio usando
sitios de restricción habituales, creando un módulo aceptor de
casetes y, después, transferir dicho fragmento al punto modular
deseado en el constructo final mediante los sitios de restricción
raros. Además, permite futuras alteraciones en la molécula para
sustituir módulos individuales en el plásmido de acoplamiento con
otros módulos casete. Las descripciones siguientes destacan las
distinciones de la presente invención en comparación con la técnica
anterior.
Los componentes individuales de un transgen (el
potenciador del promotor P, la proteína expresada E y/o la región
reguladora en 3' 3) se pueden ensamblar como módulos transferidos
desde vectores lanzadera al plásmido estación de acoplamiento PE3.
Si se necesitan mayores órdenes de complejidad, los transgenes
ensamblados, u otras secuencias nucleotídicas, pueden transferirse
a un plásmido de acoplamiento primario. Cada uno de los cinco tipos
de vectores de clonación plasmídicos se explicará con más detalla
para proporcionar conocimientos de los componentes incorporados en
cada uno, comenzando con el plásmido estación de acoplamiento PE3 no
reivindicado más complejo y el plásmido de acoplamiento
primario.
El plásmido de acoplamiento PE3 no reivindicado
(Figura 2) comprende una estructura de PUC19 con las modificaciones
siguientes, en las que las secuencias se numeran de acuerdo con el
archivo de secuencias del pUC19 Genbank, número de registro
L09137:
- 1.
- En el plásmido de acoplamiento sólo se usan las secuencias de 806 a 2617 (Afl3-Aat2),
- 2.
- El sitio BspH1 en 1729 en el pUC19 está mutado de TCATGA a GCATGA
- 3.
- El sitio Acl1 en 1493 en el pUC19 está mutado de AACGTT a AACGCT
- 4.
- El sitio Acl1 en 1120 en el pUC19 está mutado de AACGTT a CACGCT,
- 5.
- El sitio Ahd1 en pUC19 está mutado de GACNNNNNGTC a CACNNNNNGTC,
- 6.
- Las secuencias que codifican BspH1/I-Ppo 1/BspH1 se insertan en el único sitio restante BspH1 en el Puc19 tras la etapa de mutación 2 en la lista anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
El sitio de clonación múltiple (MCS) en el
plásmido de acoplamiento PE3 no reivindicado (Figura 3) comprende
los siguientes elementos secuenciales, en el orden enumerado:
- 1.
- Tres sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, Aat II, Blp I y EcoO109 I),
- 2.
- Un sitio cebador de T7.
- 3.
- Un sitio único para HE (por ejemplo, I-SceI (orientación directa)),
- 4.
- Un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor del dominio de modificación de cromatina (RNAS-CMD-1) (por ejemplo, Kpn I y Avr II),
- 5.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' del módulo promotor (por ejemplo, AsiS I y SgrA I),
- 6.
- Secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor de promotor/intrón (RNAS-P),
- 7.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la unión compartida entre la porción 3' del módulo promotor/intrón y la porción 5' del módulo de expresión (por ejemplo, PacI, AscI y MluI),
- 8.
- Secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor de promotor/intrón (RNAS-P),
- 9.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la unión de la porción 3' del módulo de expresión y la porción 5' del módulo regulador en 3' (por ejemplo, SnaB I, Not I y Sal I),
- 10.
- Secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor del dominio regulador en 3' (RNAS-3),
- 11.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo regulador 3' (por ejemplo, Swa I, Rsr II y BsiW I),
- 12.
- Un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean una secuencia nucleotídicas aleatoria de ADN que puede servir como módulo aceptor del dominio de modificación de cromatina (RNAS-CMD-2) (por ejemplo, Xho I y Nhe I),
- 13.
- Un sitio único de HE en orientación inversa que es idéntico al del punto 3, en lo que antecede,
- 14.
- Un sitio cebador de T3 en orientación inversa, y
- 15.
- Cuatro sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 3' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, BspE I, Pme I, Sap I y BspH I).
El plásmido de acoplamiento primario (Figura 4)
se puede usar para ensamblar dos transgenes completados que se
construyen primero en los plásmidos de estación de acoplamiento PE3
no reivindicados, o dos brazos de homología necesarios para
construir un transgen dirigido al gen, o para introducir dos tipos
de elementos de selección positiva o negativa. El sitio de
clonación múltiple (MCS) en el plásmido de acoplamiento primario
(Figura 5) comprende los siguientes elementos secuenciales, en el
orden enumerado:
- 1.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, Aat II, y Blp I),
- 2.
- Un sitio cebador de M13 Rev.,
- 3.
- Un par de sitios únicos de HE en orientación opuesta que flanquean una secuencia nucleotídica aleatoria de ADN que puede servir como módulo aceptor del gen selector en la expresión del genoma del huésped (RNAS-GEH-S1) (por ejemplo, PI-SceI (orientación directa) y PI-SceI (orientación inversa)),
- 4.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación de un módulo del vector lanzadera posterior al par de HE (por ejemplo, Eco0109I),
- 5.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' de un módulo del brazo de recombinación izquierdo (por ejemplo, SgrA I y AsiS I),
- 6.
- Secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor del brazo de recombinación izquierdo (RNAS-LRA),
- 7.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo aceptor del brazo de recombinación izquierdo (por ejemplo, PacI, MluI, y AscI),
- 8.
- Un sitio único para HE (por ejemplo, I-Ceu I (orientación directa)),
- 9.
- Un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean una secuencia nucleotídica aleatoria de ADN que puede servir como módulo aceptor del dominio de modificación de cromatina (RNAS-CMD-1) (por ejemplo, Kpn I y Avr II),
- 10.
- Un sitio cebador de T7,
- 11.
- Un par de sitios BstX I únicos en orientación opuesta (en los que la región nucleotídica variable en el sitio de reconocimiento de BstX I está definido por nucleótidos idénticos a las colas no complementarias generadas mediante la ordenación de dos sitios de reconocimiento de HE idénticos dispuestos en orientación complementaria-inversa; por ejemplo, PI-SceI (orientación directa) y PI-SceI (orientación inversa)) que flanquean una secuencia nucleotídica aleatoria de ADN que puede servir como un módulo aceptor del transgen completo (RNAS-PE3-),
- 12.
- Un par de sitios únicos de HE en orientación opuesta que flanquean una secuencia nucleotídica aleatoria de ADN que puede servir como un módulo aceptor del transgen complejo (RNAS-PE3-2) (por ejemplo, I-SceI (orientación directa) y I-SceI (orientación inversa)),
- 13.
- Un sitio cebador de T3 en orientación inversa,
- 14.
- Un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean una secuencia nucleotídicas aleatoria de ADN que puede servir como módulo aceptor del dominio de modificación de cromatina (RNAS-CMD-2) (por ejemplo, Xho I y Nhe I),
- 15.
- Un sitio único de HE en orientación inversa que es idéntico al del punto 8, en lo que antecede,
- 16.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' de un módulo del brazo de recombinación derecho (por ejemplo SnaB I, Sal I y Not I),
- 17.
- Secuencias nucleotídicas aleatorias que pueden servir como módulo aceptor del brazo de recombinación derecho (RNAS-RRA),
- 18.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo aceptor del brazo de recombinación derecho' (por ejemplo, Rsr II, Swa I y BsiW I),
- 19.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación de un módulo del vector lanzadera antes del par de HE (por ejemplo, BspE I),
\newpage
- 20.
- Un par de sitios únicos de HE en orientación opuesta que flanquean una secuencia nucleotídica aleatoria de ADN que puede servir como módulo aceptor del gen selector en la expresión del genoma del huésped (RNAS-GEH-S2) (por ejemplo, PI-Psp I (orientación directa) y PI-Psp I (orientación inversa)),
- 21.
- Un sitio cebador directo de M13 colocado en orientación inversa,
- 22.
- Tres sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 3' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, Pme I, Sap I y BspH I).
Tres vectores de clonación plasmídicos no
reivindicados de la invención se conocen como vectores lanzadera.
Los vectores lanzadera no reivindicados, como el PE3 no reivindicado
y los plásmidos de acoplamiento primarios reivindicados, también se
construyen a partir de una estructura de pUC19. Como PE3 no
reivindicado y los plásmidos de acoplamiento primarios
reivindicados, cada vector lanzadera no reivindicado tiene las
mismas modificaciones en la estructura de pUC19 indicadas como de 1
a 6, en lo que antecede. Los vectores lanzadera (SV) individuales
no reivindicados se identifican como promotor/intrón (P) del vector
lanzadera, expresión (E) del vector lanzadera y regulador en 3' (3)
del vector lanzadera: en lo sucesivo SVP, SVE y SV3,
respectivamente. Cada uno se describe más a fondo a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
SVP es un vector de clonación plasmídico que se
puede usar para preparar secuencias promotoras e intrones para
ensamblar dentro de un constructo de transgen (Figura 6). Un ejemplo
de un plásmido SVP puede comprender los siguientes elementos
secuenciales:
- 1.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, AatII, y BlpI),
- 2.
- Un sitio cebador de T7,
- 3.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera posterior al sitio cebador de T7 (por ejemplo, Eco0109I),
- 4.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' del módulo promotor (por ejemplo, AsiSI y SgrAI),
- 5.
- Un MCS variable que comprende cualquier agrupación de sitios de restricción habituales o raros que son únicos del vector lanzadera (por ejemplo, la serie de sitios de restricción ilustrada en la Figura 7),
- 6.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo promotor (por ejemplo, PacI, AscI y MluI),
- 7.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera anterior al sitio cebador de T3 (por ejemplo, BspEI),
- 8.
- Un sitio cebador de T3 en orientación inversa, y
- 9.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 3' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, PmeI y SapI),
\vskip1.000000\baselineskip
Este es un vector de clonación plasmídico que se
puede usar para preparar secuencias que van a ser expresadas en el
transgen para ensamblar dentro de un constructo de transgen (Figura
8). Un ejemplo de un plásmido SVE puede comprender los siguientes
elementos secuenciales en el MCS (Figura 9), en el orden
enumerado:
- 1.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, AatII, y Blp \I),
- 2.
- Un sitio cebador de T7,
- 3.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera posterior al sitio cebador de T7 (por ejemplo, Eco0109\I),
- 4.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' del módulo de expresión (por ejemplo, PacI, AscI y MluI),
- 5.
- Un MCS variable constituido por cualquier agrupación de sitios de restricción habituales o raros que son únicos del vector lanzadera (por ejemplo, la serie de sitios de restricción ilustrada en la Figura 9),
- 6.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo de expresión (por ejemplo, SnaBI, NotI y SalI),
- 7.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera anterior al sitio cebador de T3 (por ejemplo, BspEI),
- 8.
- Un sitio cebador de T3 en orientación inversa, y
- 9.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 3' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, PmeI y SapI),
\vskip1.000000\baselineskip
Este es un vector de clonación plasmídico que se
puede usar para preparar secuencias reguladoras en 3' para
ensamblar dentro de un constructo de transgen (Figura 10). Un
ejemplo de un plásmido SV3 puede comprender los siguientes
elementos en el MCS (Figura 11), en el orden enumerado:
- 1.
- Dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, AatII, y BlpI),
- 2.
- Un sitio cebador de T7,
- 3.
- Un sitio de restricción habitual único y ni variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera posterior al cebador de T7 (por ejemplo, Eco0109I),
- 4.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 5' del módulo regulador 3' (por ejemplo, SnaBI, NotI y SalI),
- 5.
- Un MCS variable constituido por cualquier agrupación de sitios de restricción habituales o raros que son únicos del vector lanzadera (por ejemplo, la serie de sitios de restricción ilustrada en la Figura 11),
- 6.
- Una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables que definen la porción 3' del módulo regulador (por ejemplo, SwaI, RsrII y BsiWI),
- 7.
- Un sitio de restricción no raro único y no variable que permite la clonación eficiente de un módulo del vector lanzadera anterior al sitio cebador de T3 (por ejemplo, BspEI),
- 8.
- Un sitio cebador de T3 en orientación inversa, y
- 9.
- Dos sitios de restricción no raros únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 3' para el vector pUC19 mutado descrito en lo que antecede (por ejemplo, PmeI y SapI).
Aunque la presente invención da a conocer
procedimientos para construir transgenes en vectores de clonación
plasmídicos, se pueden usar procedimientos similares para construir
transgenes en moléculas más grandes de ADN extracromosómico, tales
como cósmidos o cromosomas artificiales, incluidos cromosomas
artificiales bacterianos (BAC). La amplia variedad de elementos
transgénicos que se pueden incorporar en los vectores de clonación
plasmídicos también permiten transferir los productos finales del
transgen a una amplia variedad de organismos huésped con poca o
ninguna manipulación adicional.
Como ejemplo del procedimiento de practicar la
presente invención se puede construir un transgen que contiene
estos elementos:
- 1.
- Secuencias nucleotídicas del promotor humano para la proteína tensioactivo C (SP-C),
- 2.
- Secuencias que codifican el producto proteico del gen de ratón del receptor beta c del factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GMR\betaC)
- 3.
- Secuencias intrón de la betaglobina de conejo, y
- 4.
- Señal poli-A de SV40.
Las secuencias de SP-C contienen
sitios BamH1 internos y se pueden liberar de su plásmido parental
únicamente con Not1 y EcoR1. El GMR\betac tiene un sitio Not1
interno y se puede cortar de su plásmido parental con BamH1 y Xho1.
Las secuencias intrones de la betaglobina de conejo se pueden cortar
de su plásmido parental con EcoR1. La cola poli-A
de SV-40 se puede cortar de su plásmido parental con
Xho1 y Sac1. Dada la redundancia de varios sitios de restricción,
ninguno de los plásmidos parentales se puede usar para ensamblar
todos los fragmentos necesarios.
Las etapas usadas para construir el transgen
deseado en el plásmido de acoplamiento PE3 no reivindicado son las
siguientes:
- 1.
- Dado que Not1 y PspOMI generan extremos cohesivos compatibles, las secuencias promotoras SP-C humanas se escinden con Not1 y EcoR1 y se clonan en los sitios de PspOM1 y EcoR1 del vector lanzadera P. El producto de esta reacción se denomina pSVP-SPC.
- 2.
- Tras las etapas de propagación y recuperación bien conocidas por los expertos en la técnica, las secuencias intrónicas de la betaglobina de conejo se clonan en el sitio EcoR1 de pSVP-SPC. La orientación del intrón en el constructo intermedio resultante se verifica mediante secuenciación del producto, denominado pSVP-SPC-r\betaG.
- 3.
- El promotor y el intrón se escinden y aíslan como un fragmento contiguo de pSVP-SPC-r\betaG usando AsiS1 y Asc1. Simultáneamente, el plásmido de acoplamiento PE3 se corta con AsiS1 y Asc1 en preparación de la ligación con el segmento promotor/intrón. El fragmento promotor/intrón se liga en el plásmido de acoplamiento, se propaga y se recupera.
- 4.
- Se introduce el sitio Xho1 del fragmento GMR\betac para crear un extreme 3' romo usando técnicas bien conocidas para los expertos en la técnica. Después se clona en el sitio BamH1 y el sitio Pvu2 con extremos romos de pSVP-SPC-r\betaG. El plásmido resultante (pDP-SPC-GMR\betac-r\betaG) se propagó y recuperó.
- 5.
- La etapa de clonación final es la adición de la cola de poli-A de SV-40. El fragmento poli-A del SV40 se corta con Xho1 y Sac1, como también el vector receptor pDS1-SPC-GMR\betac-rb\betaG. Ambas piezas de ADN se purifican en gel y se recuperan. Se prepara una mezcla de ligación con una proporción molar de 10:1 entre poli-A de SV-40 y pDS1-SPC- GMR\betac-r\betaG. Los productos de ligación se propagan y recolectan. El plásmido nuevo pDS1-SPC- GMR\betac-r\betaG-pA contiene todos los elementos requeridos para el transgen, incluido un sitio de restricción único en el extremo 3' con el que todo el plásmido pDS1-SPC- GMR\betac-r\betaG-pA se puede linealizar para la transfección en células eucarióticas o microinyección en el pronúcleo de un huevo fertilizado.
<110> Genomatix, Ltd
\hskip1cmGenomatix, Ltd
\hskip1cmReed, Thomas D.
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<110> Intrexon Corporation
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<120> Vectores plasmídicos de clonación de
ADN y procedimientos para su uso
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<130>
28569-508-EP1
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<140> EP 04751078.9
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<141> 04/05/2004
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<150> 10/682,764
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2003-10-09
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<170> PatentIn versión 3.3
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PE3
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<222> (1163)..(1182)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1240)..(1489)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1628
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MCS de plásmido de acoplamiento
primario
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (114)..(363)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (427)..(446)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (546)..(795)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (826)..(1075)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1179)..(1198)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1256)..(1505)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "n" es a, c, g o t
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2092
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido SVP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MCS del plásmido SVP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2097
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido SVE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\hskip0,9cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MCS del plásmido SVE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2096
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido SV3
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\newpage
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MCS de plásmido SV3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (4)
1. Un vector de clonación plasmídico, en el que
los elementos secuenciales codificados comprenden
- a)
- dos sitios de restricción habituales únicos y no variables que definen un sitio de inserción en 5',
- b)
- un sitio cebador oligonucleotídico,
- c)
- Un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,
- d)
- un sitio de restricción habitual único y no variable que permite la clonación de un módulo del vector lanzadera posterior al par de sitios de endonucleasas de anidación,
- e)
- una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,
- f)
- secuencias nucleotídicas aleatorias,
- g)
- una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,
- h)
- un sitio de endonucleasa de anidación único en una orientación directa,
- i)
- un par de sitios de restricción habituales únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,
- j)
- un sitio cebador oligonucleotídico,
- k)
- un par de sitios BstX I únicos en orientaciones opuestas, en los que la región nucleotídica variable en el sitio de reconocimiento de BstXI está definido por nucleótidos idénticos a las colas no complementarias generadas por la ordenación de dos sitios de reconocimiento de endonucleasas de anidación idénticos dispuestos en orientación complementaria-inversa,
- l)
- un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientaciones opuestas que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,
- m)
- un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa,
- n)
- un par de sitios de restricción frecuentes únicos y no variables que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,
- o)
- un sitio de endonucleasa de anidación único en orientación inversa, siendo el sitio de endonucleasa de anidación el mismo que el sitio de endonucleasa de anidación en una orientación directa,
- p)
- una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,
- q)
- secuencias nucleotídicas aleatorias,
- r)
- una agrupación fija de sitios de restricción raros no variables,
- s)
- un sitio de restricción habitual único y no variable,
- t)
- un par de sitios de endonucleasas de anidación únicos en orientación opuesta que flanquean secuencias nucleotídicas aleatorias,
- u)
- un sitio cebador oligonucleotídico en orientación inversa, y
- v)
- tres sitios de restricción habituales únicos y no variables.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El vector de clonación plasmídico de la
reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos
secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos
transgenes discretos, de modo que las secuencias nucleotídicas
introducidas de este modo sustituyen las secuencias nucleotídicas
aleatorias.
3. El vector de clonación plasmídico de la
reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos
secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos
regiones discretas de secuencias nucleotídicas tales como las
necesarias para inducir la recombinación homóloga de un transgen
para alcanzar la mutación dirigida de un gen.
4. El vector de clonación plasmídico de la
reivindicación 1, en el que la estructura modular de los elementos
secuenciales está ordenada para permitir la introducción de dos
elementos distintos de selección positiva o negati-
va.
va.
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