ES2346412T3 - Genes biosinteticos para la produccion de insecticidas de tipo butenilespinosina. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSb, ATb, KRb, DHb y ACPb, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518 y 2621-2710 de la SEC ID Nº 3.

Description

Genes biosintéticos para la producción de insecticidas de tipo butenilespinosina.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona genes biosintéticos de butenilespinosina novedosos, vectores que incorporan los genes biosintéticos, estirpes de Saccharopolyspora transformadas con los genes biosintéticos, métodos de uso de estos genes para aumentar la producción de macrólidos insecticidas de tipo espinosina y métodos de uso de los genes o fragmentos de los mismos para cambiar los metabolitos preparados por estirpes productoras de espinosina de Saccharopolyspora spp.

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Antecedentes de la invención

Los compuestos de espinosina producidos de forma natural consisten en un sistema de anillo tricíclico 5,6,5 condensado con una lactona macrocíclica de 12 miembros, un azúcar neutro (ramnosa) y un aminoazúcar (forosamina) (véase Kirst et al. 1991). Si el aminoazúcar no está presente, los compuestos se han designado como pseudoagliconas, y si el azúcar neutro no está presente, entonces los compuestos se han designado como pseudoagliconas
inversas.

Las espinosinas A83543 se producen por la estirpe NRRL 18395 de Saccharopolyspora spinosa y derivados de la misma. Los miembros conocidos de la familia de espinosina A83543 y las estirpes que los producen se han dado a conocer en las patentes de EE.UU. nº 5.362.634, 5.202.242, 5.840.861, 5.539.089 y 5.767.253. Los compuestos se identifican por la referencia de una letra: espinosina A, B, etc. (véase Kirst et al., 1991). Se da la estructura de la espinosina A83543 A en la Tabla 1 a continuación en la presente memoria. Los compuestos de espinosina A83543 son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular las especies de Lepidoptera y Diptera, y tienen perfiles ambientales y toxicológicos favorables.

Se dan a conocer las secuencias de ADN de los genes que codifican las enzimas que dirigen la biosíntesis de la espinosina A83543 en la patente de EE.UU. nº 6.143.526, correspondiente al documento WO99/46387. Los genes clonados y marcos abiertos de lectura se designan como spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre.

Los genes biosintéticos de espinosina, excluyendo aquellos para la biosíntesis de ramnosa, específicamente los genes spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y spnS, están localizados de forma contigua en una región de aproximadamente 74 kb del cromosoma de S. spinosa. Se ha mostrado que los genes spnA, spnB, spnC, spnD y spnE eran similares a los genes responsables de la biosíntesis de policétidos, y la desestabilización de spnA, spnD o spnE eliminaba toda la producción de espinosina. La síntesis de espinosina A83543 implica también la formación de puente del núcleo de lactona, una actividad que es rara en productores de macrólido; se creía que los genes spnF, spnJ, spnL y spnM estaban implicados en esta etapa biosintética. Se ha notificado que los genes spnG, spnH, spnI y spnK están implicados en la adición y modificación de ramnosa y se ha notificado que los genes spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y spnS están implicados en la biosíntesis y adición del azúcar forosamina. Los genes requeridos para la biosíntesis de ramnosa no estaban localizados de forma contigua al resto de los genes biosintéticos de espinosina A83543. Se clonaron S. spinosa gtt y S. spinosa kre en un fragmento distinto, y se clonaron S. spinosa gdh y S. spinosa epi en otros fragmentos
distintos.

Se ha dado a conocer recientemente una segunda clase de espinosinas, las butenilespinosinas, producidas por un organismo novedoso, Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) o derivados del mismo, en los documentos WO 01/19840 y US 5.817.820. Se han definido más de 40 miembros de esta familia química. Los compuestos de butenilespinosina producidos por Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) son diferentes de los compuestos de la serie de espinosina A83543. La diferencia principal entre las dos clases de espinosinas es la sustitución de la cola de carbono unida al anillo macrocíclico en C-21. Las butenilespinosinas naturales están sustituidas con una cadena de 3-4 carbonos en C-21, preferiblemente butenilo, mientras que las espinosinas A83543 naturales están sustituidas con una cadena de 1-2 carbonos en C-21, preferiblemente etilo.

Los compuestos de butenilespinosina son útiles como reactivos en la producción de compuestos espinosoides modificados sintéticamente como se dan a conocer en el documento US 6.919.464. Más preferiblemente, los compuestos de butenilespinosina y sus derivados sintéticos son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular especies de Lepidoptera y Diptera.

Además del grupo butenilo en C-21, las butenilespinosinas exhiben una serie de diferencias con la serie de espinosina A83543. Se resume en la Tabla 1 un subconjunto de compuestos de butenilespinosina y factores que demuestran diversidad respecto a espinosinas A83543. Las butenilespinosinas se nombran en la Tabla 1 y se designan de aquí en adelante por los acrónimos estructurales "for-ram-I", "for-ram-II", "for-ram-III" y derivados de los mismos. En estos casos, I, II y III designan la estructura macrólida apropiadamente sustituida (I: R^{4}=R^{5}=H; II: R^{5} = CH_{3}, R^{4} = H o OH; III: R^{5} = H, R^{4} = OH), "for" representa el azúcar en C-17 (for = forosamina), y "ram" representa el azúcar en C-9 (ram = tri-O-metilramnosa). Se designa de aquí en adelante un segundo tipo de estructura macrólida que se produce por la estirpe NRRL 30141, de fórmula general (2) que tiene un anillo macrólido de 14 miembros, como IV y el compuesto totalmente glucosilado como "for-ram-IV". Los compuestos de butenilespinosina de fórmulas (1) y (2) son útiles para el control de arácnidos, nematodos e insectos, en particular especies de Lepidoptera y Diptera, y son bastante respetuosos con el medio ambiente y tienen un perfil toxicológico
atrayente.

Estas diferencias incluyen modificaciones extensas en la posición C-21, hidroxilación en la posición C-8 y sustitución por azúcares alternativos, incluyendo azúcares neutros, de la forosamina en C-17. Además, se ha dado a conocer anteriormente en la solicitud anteriormente mencionada un compuesto que posee un sistema de anillo tricíclico 5,6,6 condensado con un anillo macrocíclico de 14 miembros con forosamina y ramnosa unidas C-17 y C-9, respectivamente.

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TABLA 1

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1

2

\text{*}R^{3} es un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas (3a) a (3c)

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3

\newpage

\text{**}R9 es un grupo que tiene una de las siguientes fórmulas (9a) a (9i)

4

Los compuestos 1-21 en la Tabla I se producen por Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) y se dan a conocer en el documento WO 01/19840. Los compuestos 32823 se dan a conocer en el documento US 5.817.820.

A pesar de las diferencias entre las estructuras de las butenilespinosinas y las espinosinas A83543, puede deducirse que algunos de los genes biosintéticos serían similares. Sin embargo, como se detalla anteriormente, la Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) produce un amplio intervalo de factores y compuestos de butenilespinosina únicos que no se han observado en espinosinas A83543. Por lo tanto, este organismo debe poseer también enzimas biosintéticas novedosas que sean distintas de las enzimas biosintéticas de espinosina A83543 de S. spinosa. Específicamente, respecto a las espinosinas A83543, las enzimas biosintéticas de butenilespinosina de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) deben ser capaces de extender la cadena policétida en 2 carbonos (dando como resultado butenilo en lugar de etilo en C-21). Deben ser capaces también de sintetizar y unir aminoazúcares y azúcares neutros alternativos en C-17 e hidroxilar en C-8 y C-24. Además, la metilación de ramnosa debe ser diferente en Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) respecto a S. spinosa. Los mutantes bloqueados de S. spinosa que exhibían una metilación alterada de la ramnosa en espinosina A83543 (como se da a conocer en los documentos USP 5.202.242 y 5.840.861) producían típicamente derivados de ramnosa monodesmetilados de espinosinas A83543. Los derivados de ramnosa didesmetilados de espinosinas A83543 se detectaron sólo en presencia de inhibidores de metilasa como sinefungina. Los mutantes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) con metilación alterada de ramnosa producían derivados de ramnosa di- y tridesmetilados de butenilespinosinas en altas cantidades, en ausencia de inhibidores de metilasa.

Surge un reto en la producción de compuestos de butenilespinosina por el hecho de que se requiere un volumen de fermentación muy grande para producir una cantidad muy pequeña de butenilespinosinas. Un fragmento clonado de ADN que contenga uno o múltiples genes de enzimas biosintéticas de butenilespinosina posibilitaría la duplicación de genes para aumentar el rendimiento. Se ha conseguido un aumento de rendimiento de este tipo en fermentaciones de Streptomyces fradiae duplicando el gen que codifica una metiltransferasa limitante de la velocidad que convierte macrocina en tilosina (Baltz et al., 1997) y en S. spinosa duplicando los genes gtt y gdh (Baltz et al., 2000).

Los genes biosintéticos de butenilespinosina clonados proporcionan también un método para producir nuevos derivados de butenilespinosinas con un espectro diferente de actividad insecticida. Pueden sintetizarse intermedios específicos (o sus derivados naturales) mediante estirpes mutantes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) en las que se han desestabilizado ciertos genes que codifican enzimas para la biosíntesis de butenilespinosina usando métodos de ADN recombinante. Dicha estrategia se ha usado eficazmente para generar una estirpe de Saccharopolyspora erythraea productora de derivados novedosos de 6-desoxieritromicina (Weber y McAlpine, 1992). También los genes biosintéticos de butenilespinosina pueden expresarse en otros organismos, tales como S. spinosa, que producen compuestos similares. Cuando se expresan a partir del promotor de butenilespinosina nativo o un promotor heterólogo, estos genes producen nuevas moléculas híbridas con algunos de los rasgos estructurales únicos tanto de espinosinas como de butenilespinosinas.

Pueden sintetizarse también intermedios novedosos mediante estirpes mutantes de Saccharopolyspora sp.
LW107129 (NRRL 30141) o S. spinosa en las que partes de ciertos genes que codifican enzimas para la biosíntesis de butenilespinosina se han reemplazado por partes del mismo gen que se ha mutado específicamente in vitro, o con las correspondientes partes de genes de otros organismos. El gen híbrido producirá una proteína con funciones alteradas, que carece de una actividad o que efectúa una transformación enzimática novedosa. Se acumularía una nueva sustancia química tras la fermentación de la estirpe mutante. Dicha estrategia se ha usado para generar una estirpe de Saccharopolyspora erythraea productora de un derivado de anhidroeritromicina novedoso (Donadio et al., 1993).

La biosíntesis de butenilespinosinas procede mediante la condensación y modificación por etapas de precursores de ácido carboxílico de 2 y 3 carbonos, generando un policétido lineal (Figura 1A) que se cicla y forma puente, produciendo la aglicona tetracíclica (Figura 1B). La pseudoaglicona (que contiene ramnosa tri-O-metilada) se forma a continuación, entonces se añade fororasamina di-N-metilada o un azúcar alternativo para completar la biosíntesis (Figura 1B). Se sintetizan de forma similar otros macrólidos tales como el antibiótico eritromicina, el antiparasitario avermectina y el inmunosupresor rapamicina. En las bacterias productoras de estos compuestos, se cataliza la biosíntesis de antibióticos por varias proteínas multifuncionales muy grandes de policétido sintasa de tipo I (PKS) (Donadio et al., 1991; Ikeda et al., 1999; Schwecke et al., 1995). Conjuntamente, los polipéptidos forman un complejo consistente en un módulo iniciador y varios módulos extensores, cada uno de los cuales añade un precursor de acil-CoA específico a una cadena policétida en crecimiento, y modifica el grupo \beta-ceto de manera específica (Figura 1A). Por lo tanto, la estructura de un policétido está determinada por la composición y el orden de los módulos en la PKS. Un módulo comprende varios dominios, cada uno de los cuales efectúa una función específica. El módulo iniciador consiste en un dominio de acil transferasa (AT) para la adición del grupo acilo del precursor a un dominio de proteína portadora de acilo (ACP). El módulo iniciador puede contener también un dominio de KSQ, que es muy similar a los dominios de \beta-cetosintasa (KS), pero se ha reemplazado una cisteína de sitio activo esencial por glutamina (Bisang, et al., 1999), así que la KSQ ya no tiene actividad condensadora. Los dominios de KSQ retienen la actividad descarboxilasa y determinan la especificidad del precursor del módulo de iniciación. Los módulos extensores contienen dominios de AT y ACP, junto con un dominio de \beta-cetosintasa (KS) intacto que añade la cadena policétida preexistente a la nueva acil-ACP mediante condensación descarboxilativa. Pueden estar presentes también dominios adicionales en cada módulo extensor para llevar a cabo modificaciones específicas de \beta-ceto: un dominio de \beta-cetorreductasa (KR) para reducir el grupo \beta-ceto a un grupo hidroxilo, un dominio de deshidratasa (DH) para retirar el grupo hidroxilo y dejar un doble enlace y un dominio de enoilrreductasa (ER) para reducir el doble enlace y dejar un carbono saturado. El último módulo extensor termina con un dominio de tioesterasa (TE) que libera el policétido de la enzima PKS en forma de una lactona macrocíclica. Las enzimas policétido sintasa están generalmente codificadas por 3-7 marcos de lectura abiertos grandes (Donadio et al., 1991; Ikeda et al., 1999; Schwecke et al., 1995). El ensamblaje de una policétido sintasa funcional requiere interacciones proteína-proteína específicas entre estas proteínas.

Los antibióticos macrólidos activos derivan de lactonas macrocíclicas mediante modificaciones adicionales tales como metilación y cambios del estado de reducción, y la adición de azúcares inhabituales. La mayoría de los genes requeridos para estas modificaciones, y para la síntesis y unión de los azúcares, están agrupados alrededor de los genes de PKS. Los genes que codifican las enzimas biosintéticas de desoxiazúcar son similares en los productores de antibióticos macrólidos tales como eritromicina y tilosina (Donadio et al., 1993; Merson-Davies y Cundliffe, 1994), y en los productores de polisacáridos extracelulares tales como los O-antígenos de Salmonella y Yersinia (Jiang et al., 1991; Trefzer et al., 1999). Todas estas síntesis implican la activación de glucosa mediante la adición de un difosfato nucleotídico, seguido por deshidratación, reducción y/o epimerización. El desoxiazúcar resultante podría experimentar una o más modificaciones adicionales tales como desoxigenación, transaminación y metilación. Los azúcares se incorporan a macrólidos mediante la acción de glucosiltransferasas específicas. Los genes implicados en la síntesis y unión de un azúcar pueden estar estrechamente agrupados, incluso transcribirse en forma de un solo operón, o pueden estar dispersados (Ikeda et al., 1999; Shen et al., 2000; Aguirrezabalaga et al., 1998).

Se usan los siguientes términos en la presente memoria como se definen a continuación:

a.a. - aminoácido

AmR - gen que confiere resistencia a apramicina.

ACP - dominio de proteína portadora de acilo.

AT - dominio de aciltransferasa.

Mutante bloqueado - estirpe mutante que bloquea la función de una enzima específica de una ruta biosintética de tal modo que se produce un precursor o producto paralelo.

pb - pares de bases.

bus - gen biosintético de butenilespinosina.

Butenilespinosina - un producto de fermentación estructuralmente distinto de las espinosinas A83543 (Tabla 1), dado a conocer en el documento WO 01/19840, o producto de fermentación de lactona macrocíclica similar producido por un microorganismo que utiliza todos o la mayoría de los genes de butenilespinosina.

Genes de butenilespinosina- las secuencias de ADN que codifican los productos requeridos para la biosíntesis de butenilespinosina, más específicamente los genes busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR y busS, como se describen a continuación en la presente memoria, o equivalentes funcionales de los mismos.

Clonación - el proceso de incorporación de un segmento de ADN a un vector de clonación de ADN recombinante y de transformación de una célula hospedadora con el ADN recombinante.

Sesgo de codón - la tendencia a usar un codón particular para especificar un aminoácido específico. En el caso de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141), la tendencia es a usar un codón que tiene citosina o guanina como tercera base.

Complementación - la restauración de una estirpe mutante a su fenotipo normal por un gen clonado.

Conjugación - un proceso en el que se transfiere material genético de una célula bacteriana a otra.

cos - la secuencia de extremo cohesivo del bacteriófago lambda.

Cósmido - un vector de clonación de ADN recombinante que es un plásmido que no sólo puede replicar en una célula hospedadora de la misma manera que un plásmido, sino que puede empaquetarse también en cabezas de
fago.

DH - dominio de deshidratasa.

ER - dominio de enoilrreductasa.

Gen - una secuencia de ADN que codifica un polipéptido.

Colección genómica - un conjunto de vectores de clonación de ADN recombinante en el que se han clonado segmentos de ADN que representan sustancialmente todas las secuencias de ADN en un organismo particular.

Homología - grado de similitud entre secuencias

Hibridación - el proceso de asociación de dos moléculas de ADN monocatenarias para formar una molécula de ADN bicatenaria que puede tener completamente apareadas las bases o no.

Empaquetado in vitro - encapsulación in vitro de ADN en proteína de cubierta para producir una partícula de tipo virus que puede introducir ADN en una célula hospedadora mediante infección

kb - kilopares de bases.

KR - dominio de \beta-cetorreductasa.

KS - dominio de cetosintasa.

Mutagénesis - creación de cambios en la secuencia de ADN. Pueden ser aleatorios u orientados, generados in vivo o in vitro. Las mutaciones pueden ser silenciosas, o pueden dar como resultado cambios en la secuencia aminoacídica del producto de traducción que alteran las propiedades de la proteína y producen un fenotipo mutante.

ORF - marco abierto de lectura.

ori - un origen de replicación (oriR) o de transferencia (oriT) de plásmido.

% de identidad - el valor de % de identidad dado por el programa BLAST cuando se comparan dos secuencias.

% de similitud - el valor de % de similitud dado por el programa BLAST cuando se comparan dos secuencias.

PCR - reacción en cadena de la polimerasa - un método para amplificar selectivamente una región de ADN.

PKS - policétido sintasa.

Promotor - una secuencia de ADN que dirige la iniciación de la transcripción.

Vector de clonación de ADN recombinante - cualquier agente de replicación o integración autónoma incluyendo, pero sin limitación, plásmidos, que comprenda una molécula de ADN a la que pueden haberse añadido o no una o más moléculas de ADN adicionales.

Metodología de ADN recombinante - tecnologías usadas para la creación, caracterización y modificación de segmentos de ADN clonados en vectores de ADN recombinantes.

Fragmento de restricción - cualquier molécula de ADN lineal generada mediante la acción de una o más enzimas de restricción.

Espinosina - un producto de fermentación también conocido como A83543, caracterizado típicamente por un sistema de anillo tricíclico 5,6,5, condensado con una lactona microcíclica de 12 miembros con una cadena de 1-2 carbonos en C-21, un azúcar neutro (ramnosa) y un aminoazúcar (forosamina), o un producto de fermentación de lactona macrocíclica similar producido por un microorganismo que utiliza todos o la mayoría de los genes de espinosina A83543.

Genes de espinosina - las secuencias de ADN que codifican los productos requeridos para la biosíntesis de espinosina A83543, más específicamente, los genes spnA, spnB, spnC, spnD, spnE, spnF, spnG, spnH, spnI, spnJ, spnK, spnL, spnM, spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR, spnS, S. spinosa gtt, S. spinosa gdh, S. spinosa epi y S. spinosa kre, como se describen a continuación en la presente memoria, o equivalentes funcionales de los mismos.

spn - gen biosintético de espinosina A83543.

Subclón - un vector de clonación con un inserto de ADN derivado de otro ADN de igual tamaño o mayor.

TE - dominio de tioesterasa.

Transconjugante - estirpe recombinante derivada de un acoplamiento de conjugación.

Breve descripción de las figuras

Las Fig. 1A y 1B son un diagrama que ilustra la ruta biosintética de butenilespinosina.

La Fig. 2 es un mapa que ilustra la disposición de los fragmentos HindIII, EcoRV y ScaI y los marcos abiertos de lectura en la región clonada de ADN de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) y la localización de los genes de butenilespinosina en el ADN clonado.

La Fig. 3 es un mapa de sitios de restricción y funcional del cósmido pOJ436.

La Fig. 4 es un diagrama que ilustra la ruta biosintética de 17-(4''-O-metiloleandrosa)butenilespinosina [Tabla 1; compuesto (11)].

Breve descripción de la invención

Se clonaron los genes biosintéticos de butenilespinosina y los ORF relacionados y se determinó la secuencia de ADN de cada uno. Los genes y ORF clonados se designan a continuación en la presente memoria como busA, busB, busC, busD, busE, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, burN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII, ORF LIX, ORF RI, ORF RII y ORF RIII. Las funciones propuestas de los genes clonados en la biosíntesis de espinosina se identifican en la Fig. 1 y en la discusión a continuación en la presente memoria.

Según un primer aspecto, la invención proporciona un molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSb, ATb, KRb, DHb y ACPb, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518 y 2621-2710 de la SEC ID Nº 3. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 2992-4239, 4483-5508, 5538-6084, 6916-7554 y/o 7861-8130 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar además uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSi, ATi, ACPi, KS1, AT1, KR1 y ACP1, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 7-423, 528-853, 895-977, 2735-3160, 3241-3604, 3907-4086 y 4181-4262 de la SEC ID Nº 3. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 16-1269, 1582-2559, 2683-2931, 8203-9480, 9721-10812, 11719-12258 y/o 12541-12786 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar además uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 y ACP2, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 534-964, 990-1075, 1336-1681, 1685-1864 y 1953-2031 de la SEC ID Nº 4. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 13059-14321, 14658-15900, 16026-16283, 17064-18100, 18111-18650 y/o 18915-19151 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar además uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4 y ACP4, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 528-814, 1157-1335, 1422-1503, 1526-1949, 2063-2393, 2697-2875 y 2969-3049 de la SEC ID Nº 5. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 19553-20815, 21143-22000, 23021-23557, 23816-24061, 24128-25399, 25739-26731, 27641-28183 y/o 28457-28699 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar además uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 y ACP7, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-422, 537-864, 891-1076, 1382-1563, 1643-1724, 1746-2170, 2281-2611, 2914-3093, 3186-3267, 3289-3711, 3823-4151, 4342-4636 y 4723-4804 de la SEC ID Nº 6. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 29092-30357, 30700-31683, 31762-32319, 33235-33780, 34018-34263, 34327-35601, 35932-36924, 37831-38370, 38647-38892, 38956-40224, 40560-41544, 42115-42999 y/o 43258-43503 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar además uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 y TE10, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-424, 530-848, 885-1072, 1371-1554, 1650-1728, 1751-2175, 2289-2616, 2642-2775, 3131-3315, 3396-3474, 3508-3921, 4036-4366, 4389-4569, 4876-5054, 5148-5229 y 5278-5531 de la SEC ID Nº 7. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 43945-45216, 45532-46488, 46597-47160, 48055-48606, 48892-49083, 49195-50469, 50809-51792, 51868-52269, 53335-53889, 54130-54366, 54466-55707, 56050-57042, 57109-57651, 58570-59106, 59386-59631 y/o 59776-60537 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar un módulo de PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 6-977 de la SEC ID Nº 3 y/o un módulo de PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 998-2710 de la SEC ID Nº 3. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender las bases 16-2931 y/o 2992-8130 de la SEC ID Nº 1. La secuencia de ADN puede codificar también uno o más módulos de PKS de espinosina adicionales seleccionados del grupo consistente en los aminoácidos 2735-4262 de la SEC ID Nº 3, 1-2031 de la SEC ID Nº 4, 1-1503 de la SEC ID Nº 5, 1526-3049 de la SEC ID Nº 5, 1-1724 de la SEC ID Nº 6, 1746-3267 de la SEC ID Nº 6, 3289-4804 de la SEC ID Nº 6, 1-1728 de la SEC ID Nº 7, 1751-3474 de la SEC ID Nº 7 y 3508-5531 de la SEC ID Nº 7. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede comprender también las bases 8203-12786, 13059-19151, 19553-24061, 24128-28699, 29092-34263, 34327-38892, 38956-43503, 43945-49083, 49195-54366 y/o 54466-60537 de la SEC ID Nº 1.

La secuencia de ADN puede codificar una enzima biosintética de butenilespinosina que comprende una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la SEC ID Nº 3, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada. La secuencia de ADN puede comprender el gen busA descrito por las bases 1-13032 de la SEC ID Nº 1. La secuencia de ADN puede codificar una o más enzimas biosintéticas de butenilespinosina adicionales que comprenden, respectivamente, una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la seleccionada de las SEC ID Nº 4-7 y 8-29, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada. La secuencia de ADN puede comprender los genes busB, busC, busD, busE, ORF RI, ORFRII, ORF RIII, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII y/o ORF LIX, estando descritos dichos genes, respectivamente, por las bases 13059-19505, 19553-29053, 29092-43890, 43945-60636, 62090-63937, 65229-66602 y 68762-69676 de la SEC ID Nº 1 y 114-938, 1389-2558, 2601-3350, 3362-4546, 4684-6300, 6317-7507, 7555-8403, 8640-9569, 9671-10666, 10678-12135, 12867-14177, 14627-15967, 16008-17141, 17168-17914, 18523-19932, 19982-20488, 20539-21033, 21179-21922, 22674-23453, 23690-24886, 26180-26923 y 27646-28473 de la SEC ID Nº 2.

Según un segundo aspecto, la invención proporciona un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN según el primer aspecto.

Según un tercer aspecto, la invención proporciona una célula hospedadora transformada con un vector recombinante según el segundo aspecto.

Según un cuarto aspecto, la invención proporciona un proceso para preparar una butenilespinosina que comprende cultivar un microorganismo que tiene genes biosintéticos de butenilespinosina operativos en su genoma, a condición de que el genoma del organismo se haya modificado de modo que duplique copias de al menos una secuencia de ADN según el primer aspecto; o cultivar un microorganismo heterólogo que se haya transformado de modo que su genoma contenga un gen biosintético de butenilespinosina operativo que comprende una secuencia de ADN según el primer aspecto.

Descripción detallada de la invención

Como prerrequisito para la caracterización y utilización de genes de butenilespinosina, es necesario aislar y caracterizar los genes que codifican las enzimas implicadas en la biosíntesis de este agente para el control de insectos. El enfoque descrito en el siguiente ejemplo 1 implica la construcción de una colección de cósmidos genómicos y el posterior cribado mediante hibridación de ADN.

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Ejemplo 1

a. Aislamiento de ADN celular total de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141)

Se inoculó Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) en 100 ml de medio vegetativo (dextrosa 9,0 g/l, caldo de tripticasa de soja 30 g/l, extracto de levadura 3,0 g/l, sulfato de magnesio\cdot7 H_{2}O 2,0 g/l) en un matraz Erlenmeyer de 500 ml y se incubó agitando a 150 rpm durante 72 horas a 30ºC. Se centrifugó este cultivo durante 10 min a 3.000 rpm/4ºC para sedimentar las células. Se retiró el fluido sobrenadante y se lavó el sedimento celular con 20 ml de tampón TE (Tris/HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM pH 8,0). Se centrifugaron las células de nuevo a 3.000 rpm y se congeló el sedimento a 20ºC hasta que se descongeló para el aislamiento de ADN celular total.

Se aisló el ADN celular total de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) usando un kit de purificación de ADN genómico (Qiagen Inc., Valencia, CA). Se resuspendieron sedimentos celulares bacterianos congelados de 100 ml de cultivo en 11 ml de tampón B1 (Tris/HCl 50 mM, pH 8,0; EDTA 50 mM pH 8,0; 0,5% de Tween 20, 0,5% de Triton X-100) que contenía 11 \mul de disolución de ARNasa A Qiagen (100 mg/ml) con agitación con vórtex. Se añadieron a esta suspensión 300 \mul de una disolución madre de lisozima (100 mg/ml; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 500 \mul de una disolución madre de proteinasa K (50 mg/ml; Sigma Chemical Co.). Se mezcló la suspensión por agitación con vórtex y se incubó a 37ºC durante 30 min. Se añadieron 4 ml de tampón B2 (HCl de guanidina 3 M; 20% de Tween 20) a los lisados bacterianos y se mezclaron en la disolución mediante la inversión cuidadosa de los tubos. Se incubaron los lisados bacterianos a 50ºC durante 30 min. Se aisló el ADN celular total de los lisados bacterianos usando puntas Qiagen Genomic-tip 500/G según las instrucciones del fabricante. Se disolvió el ADN purificado resultante en 5 ml de tampón TE y se almacenó a 4ºC.

b. Construcción de una colección de cósmidos genómicos

Se digirió parcialmente ADN celular total aislado de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) con Sau3A I basándose en la sección 3.1.3 de Ausubel, et al. ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, NY). Se efectuaron reacciones a pequeña escala (40 \mug de ADN celular total en un volumen de reacción de 80 \mul) para determinar la relación de enzima a ADN celular total apropiada que daba como resultado la concentración máxima de fragmentos de ADN parcialmente digeridos en el intervalo de tamaño de 25-50 kb. Se calentaron las reacciones a 65ºC durante 15 min para inactivar la enzima Sau3A I y se analizaron alícuotas de las reacciones mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,3% para determinar la abundancia relativa de fragmentos de ADN parcialmente digeridos en el intervalo de tamaño deseado. Una vez se observó la relación de enzima a ADN celular total óptima, se aumentó el volumen de reacción para obtener cantidades suficientes de ADN celular total parcialmente digerido para uso como inserto de ADN en la construcción de colecciones de cósmidos. Era una reacción a escala típica 400 \mug de ADN celular total de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) incubados con 9 unidades de Sau3A I (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) durante 15 min a 37ºC en 800 \mul de volumen total de 1X tampón React 4 (suministrado 10X por el fabricante). Se calentó la reacción a 65ºC durante 20 min para inactivar la enzima. Se mezcló el ADN genómico parcialmente digerido con un volumen igual de disolución de fenol-cloroformo equilibrada (50:50; v/v) y se mezcló por inversión cuidadosa. Después de centrifugación a 14.000 x g durante 15 min, se retiró la fase acuosa y se mezcló con un volumen igual de una disolución de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1; v/v). Después de mezclar las dos fases mediante inversión cuidadosa, se centrifugó la disolución a 14.000 x g durante 15 min. Se retiró la fase acuosa a un tubo reciente y se añadieron 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2). Se añadieron dos volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo y se mezcló la disolución mediante inversión. Para ayudar a la precipitación del ADN, se dispusieron las muestras a -70ºC durante una noche. Se sedimentó el ADN precipitado mediante centrifugación a 14.000 x g durante 20 min. Se resuspendió el sedimento de ADN en 50 \mul de agua doblemente destilada y se almacenó a -20ºC.

El vector usado para la construcción de la colección de cósmidos era pOJ436 (Figura 3) que contenía el gen de resistencia a apramicina para selección. Para minimizar el religamiento del ADN de vector de cósmido consigo mismo, se desfosforiló ADN de pOJ436 digerido con BamH I incubando el ADN digerido con 20 unidades de fosfatasa alcalina de gamba (Roche/Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) durante 2 h a 37ºC en un volumen total de 1,2 ml de tampón 1X SAP (suministrado como 10X por el fabricante). Se ligó ADN genómico digerido con Sau3A I en el sitio BamH I desfosforilado de pOJ436 y usando una relación 5:1 de inserto parcialmente digerido a ADN de vector. Para esta reacción, se incubaron inserto y ADN de vector con 20 unidades de ADN ligasa T4 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA) durante una noche a 16ºC en 1X tampón de ADN ligasa T4 (suministrado como 10X por el fabricante). Se empaquetaron las mezclas de ligamiento usando Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene, La Jolla, CA) y se titularon los fagos recombinantes usando células de Escherichia coli de estirpe DH5\alpha-MRC^{+} (Gibco BRL), como se describe por las instrucciones del fabricante. Se extendieron alícuotas (20-40 \mul) del fago recombinante y del cultivo de células hospedadoras sobre agar LB (triptona Bacto 10 g/l, NaCl 10 g/l, extracto de levadura Bacto 5 g/l, agar Bacto 15 g/l; Difco Laboratories) que contenía apramicina (100 mg/l; Sigma Chemical Co.) y se incubó durante una noche a 37ºC. Para construir placas maestras de las colecciones de cósmidos para almacenamiento en congelador, se recogieron colonias individuales con palillos de dientes estériles y se inocularon en pocillos individuales de placas de micropocillos estériles de 96 pocillos que contenían 250 \mul de caldo Terrific (medio TB: triptona Bacto 12 g/l, extracto de levadura Bacto 24 g/l, 0,4% v/v de glicerol, KH_{2}PO_{4} 17 mM, K_{2}HPO_{4} 72 mM) suplementado con apramicina 100 mg/l y se incubó sin agitación durante una noche a 37ºC. Para generar placas de copia a partir de las placas maestras, se usó un replicador de microplacas de 96 pocillos (V & P Scientific, Inc., San Diego, CA) para inocular una placa de micropocillos estéril de 96 pocillos que contenía 250 \mul de medio TB que contenía apramicina 100 mg/l. Se incubaron las placas de copia sin agitación a 37ºC durante una noche.

Para las placas maestra y de copia, se añadió una disolución de dimetilsulfóxido al 7% (v/v) a las placas y se mezclaron los cultivos usando una pipeta multicanal. Se dispusieron las placas a -70ºC para almacenamiento.

Se evaluó el tamaño medio de inserto de los cósmidos recombinantes seleccionados aislando ADN de cósmido usando el kit de purificación de ácidos nucleicos NucleoSpin (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) y digiriendo el ADN recuperado con 20 unidades de la enzima de restricción Eco RI (New England BioLabs) durante 1 h a 37ºC. Se analizó el ADN restringido mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,0%. Se visualizaron los fragmentos de ADN con luz UV después de tinción con bromuro de etidio al 0,5% (Sigma Chemical Co.) y se estimó el tamaño relativo de los fragmentos mediante comparación con una escala de ADN de 1 kb (Gibco BRL). El tamaño de inserto de las colecciones de cósmidos estaba en el intervalo de 20 kb-40 kb.

c. Cribado de colecciones de cósmidos e identificación de cósmidos que contienen genes biosintéticos de butenilespinosina

Se inocularon representantes de cada clon de cósmido de E. coli usando un replicador de microplaca de 96 pocillos (V & P Scientific, Inc.) por duplicado sobre membranas de unión a ácido nucleico Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Se colocaron las membranas sobre placas de agar LB suplementadas con apramicina 100 mg/l y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se procesaron las membranas según los protocolos del fabricante. Se dispusieron las membranas inoculadas por el lado de la colonia sobre un papel de filtro 3MM (Whatman, Clifton, NJ) saturado con NaOH 0,5 N durante 1 minuto. Se transfirieron los filtros a papel de filtro 3MM saturado con Tris-HCl 1 M, pH 7,6 durante 1 minuto para desnaturalizar el ADN. Se neutralizaron las membranas mediante transferencia a un papel de filtro 3MM saturado con Tris-HCl 1 M, pH 7,6/NaCl 1,5 M durante 1 minuto. Se efectuó el lavado final en una disolución de Tris-HCl 1 M, pH 7,6/NaCl 1,5 M, retirando los desechos de colonia restantes de las membranas. Se reticuló el ADN con la membrana con 1200 \mujulios usando un UV Stratalinker 1800 (Stratagene).

Se cribó en la colección de bacterias recombinantes así preparada la homología con cualquiera de las tres sondas de ADN radiomarcadas basadas en los genes spn de S. spinosa (Baltz et al., 2000; Tabla 2). Se usaron pares de oligonucleótidos para amplificar regiones nucleotídicas específicas de la agrupación génica biosintética spn mediante reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Se sintetizaron cebadores oligonucleotídicos usando un sintetizador de ADN/ARN 394 (Applied Biosystems/PerkinElmer, Foster City, CA) y se enumeran en la Tabla 2. Se efectuaron las reacciones PCR usando el kit de ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) según los protocolos del fabricante. Se amplificaron los fragmentos de ADN en un ciclador térmico de ADN de 48 muestras (Perkin Elmer Cetus) en las siguientes condiciones de ciclo: 1) 94ºC, 1 min.; 55ºC, 2 min.; 72ºC, 3 min.; 25 ciclos 2) 72ºC, 10 min.; 1 ciclo. Se analizaron los productos amplificados usando electroforesis en gel de agarosa al 0,1% y se extrajeron del gel las bandas correspondientes al tamaño apropiado utilizando el kit de extracción de gel Qiagen II (Qiagen Inc.) como se expone según las instrucciones del fabricante.

TABLA 2

5

Se incubaron las membranas a 65ºC durante 3 horas antes de la adición de sonda radiomarcada en 300 ml de disolución de prehibridación consistente en 6X SSC (NaCl 52,59 g/l, citrato de sodio 24,66 g/l, pH ajustado a 7,0 con NaOH 10 N), dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS), 10X disolución de Denhardt (Ficoll 50 mg/l [tipo 400, Pharmacia], polivinilpirrolidona 5,0 mg/l, seroalbúmina bovina 5,0 mg/l), esperma de salmón desnaturalizado 100 \mug/ml.

Se ajustó la concentración de fragmentos de ADN a 25 ng para todas las sondas, se desnaturalizaron durante 10 minutos en un baño de agua a ebullición y se marcaron con cebador aleatorio con 50 \muCi de [\alpha^{32}P]dCTP, 3000 Ci/mmol, usando 4 \mul de mezcla de reacción High Prime (Boehringer Mannheim) según el protocolo del fabricante. Se efectuó la separación de los nucleótidos no incorporados de las sondas de ADN radiomarcadas usando columnas NucTrap Push (Stratagene) y se desnaturalizaron durante 10 minutos en un baño de agua a ebullición antes de la adición a membranas de prehibridación. Se añadieron aproximadamente 2,0 x 10^{7} cpm a las membranas para todas las hibridaciones de ADN. Las condiciones de hibridación para todas las sondas fueron de 16 horas en baño de agua a 65ºC con agitación.

Se decantaron las disoluciones de hibridación que contenían las sondas radiomarcadas spnF, spnS, and spnE (TE) y se lavó cada conjunto de membranas en condiciones de rigor medio: 1) 15 min., temperatura ambiente en 300 ml de 3X SSC/0,5% de SDS; 2) 30 min., 65ºC agitación en 300 ml de 3X SSC/0,5% de SDS reciente; 3) 30 min., temperatura ambiente en 300 ml de 1X SSC/0,5% de SDS. Se cribaron las membranas con la sonda radiomarcada derivada de la secuencia del cósmido 9D3 de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) en condiciones rigurosas: 1) 30 min., 65ºC agitación en 300 ml de 1X SSC/0,5% de SDS reciente; 2) 30 min., 65ºC agitación en 300 ml de 0,33X SSC/0,5% de SDS reciente; 3) 30 min., 65ºC agitación en 300 ml de 0,1X SSC/0,5% de SDS reciente. Se monitorizaron los filtros usando un contador Geiger-Mueller manual para determinar si la detección isotópica de fondo era mínima. Se montaron las membranas sobre papel de filtro 3MM y se cubrieron con película plástica y se expusieron a película de rayos X. Se dejaron exponer las membranas a la película durante 24-72 horas a -70ºC antes del revelado.

Se caracterizaron adicionalmente los clones de cósmido presuntamente positivos mediante análisis por digestión con endonucleasa de restricción y secuenciación terminal del vector de cósmido. Se aisló ADN de cósmido usando el kit de purificación de ácido nucleico NucleoSpin (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), y se digirió con 20 unidades de la enzima de restricción Eco RI (New England BioLabs) durante 1 h a 37ºC. Se sometió a electroforesis el ADN restringido en un gel de agarosa al 1,0%. Se visualizaron los fragmentos de ADN con luz UV después de tinción con bromuro de etidio al 0,5% y se estimó el tamaño relativo de los fragmentos mediante comparación con una escala de ADN de 1 kb. Adicionalmente, se obtuvo la secuencia nucleotídica de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) de las conexiones cósmido/vector mediante secuenciación cíclica fluorescente según los métodos de Burgett y Rosteck (1994). Las reacciones de secuenciación consistían en 3 \mul (2 \mug de ADN de cósmido purificado) de molde, 1 \mul de cebador universal (4 pmol) o cebador inverso (4 pmol), 8 \mul de mezcla de reacción Big Dye®, 1 \mul de DMSO, 7 ml de H_{2}O en condiciones de ciclador térmico: 96ºC, 30 s; 50ºC, 15 s; 60ºC, 4 min; 25 ciclos con un secuenciador 377 ABI Prism^{TM} (Applied Biosystems, Inc.).

Se identificaron 8 clones de cósmido como de hibridación positiva con las sondas de S. spinosa spnS, spnF y spnE (TE). El cósmido 8H3 era uno de los dos clones que hibridaban con ambas sondas spnS y spnF. El cósmido 9D3 era uno de los tres clones que hibridaban sólo con la sonda spnF. El cósmido 10C1 era uno de los tres clones que hibridaban sólo con la sonda spnE (TE). El cósmido 9F4 se identificó a partir de la colección genómica mediante hibridación con un fragmento de PCR radiomarcado derivado directamente de la secuencia de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) elucidada mediante secuenciación nucleotídica de los extremos de cósmido/vector del cósmido 9D3 (bases 297477-30163 en la SEC ID Nº 1). Se sintetizaron dos cebadores basándose en la secuencia de ADN del cósmido 9D3 (SEC ID Nº 39 y SEC ID Nº 40). Se amplificó un fragmento de ADN de 416 pb a partir de ADN genómico de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) usando estos cebadores como se detalla anteriormente y se usaron para hibridación.

Se determinaron las secuencias completas de los cósmidos 8H3, 9D3, 9F4 y 10C1 mediante el método de secuenciación cíclica fluorescente de fragmentos de ADN aleatorios clonados en el fago M13 (SeqWright, Houston, TX). Los insertos en los cósmidos 8H3 y 9D3 se superponían, los insertos en los cósmidos 9D3 y 9F4 se superponían y el inserto en 9F4 y 10C1 se superponía. Véase la Fig. 2. Conjuntamente, los cuatro insertos de cósmido cubrían aproximadamente 111 kb de secuencia única (SEC ID Nº 1 y 2). La SEC ID Nº 1 incluye el codón de inicio de busA y todo el ADN 3' de éste (véase la Fig. 2.). La SEC ID Nº 2 empieza la base anterior al codón de inicio de busA e incluye todo el ADN 5' de esa base. La siguiente Tabla 3 identifica las porciones de SEC ID Nº 1 y SEC ID Nº 2 incluidas en cada uno de los cuatro insertos.

TABLA 3

6

La Fig. 2 da una representación gráfica de la relación de los cuatro insertos con las 110 kb de la secuencia.

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Genes de PKS

La SEC ID Nº 1 incluye una región central de aproximadamente 60 kb con notable homología con el ADN que codifica las policétido sintasas de productores de macrólidos conocidos (Donadio et al., 1991; McDaniel y Katz., 2001; Dehoff et al., 1997). La región de ADN de PKS de butenilespinosina consiste en 5 ORF con codones de terminación en fase al final de los dominios de ACP, similares a los ORF de PKS en las otras bacterias productoras de macrólidos. Los cinco genes de PKS de butenilespinosina están dispuestos cabeza con cola (véase la Fig. 2) sin funciones no PKS intermedias tales como el elemento de inserción encontrado entre los genes de PKS de eritromicina AI y AII (Donadio et al., 1993). Los genes de PKS se designan busA, busB, busC, busD y busE. La secuencia nucleotídica para cada uno de los cinco genes de PKS de espinosina, y los correspondientes polipéptidos, se identifican en la siguiente
Tabla 4:

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TABLA 4

7

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busA codifica el módulo iniciador (SEC ID Nº 1, bases 1-2931), el módulo extensor b (SEC ID Nº 1, bases 2992-8130) y el módulo extensor 1 (SEC ID Nº 1, bases 8205-13032). La secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia aminoacídica para cada uno de los dominios funcionales en el módulo iniciador y los módulos extensores b y 1 se identifican en la siguiente Tabla 5:

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TABLA 5

8

9

busB codifica el módulo extensor 2 (SEC ID Nº 1, bases 13059-19505). La secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia aminoacídica para cada uno de los dominios funcionales en el módulo extensor 2 se identifican en la siguiente Tabla 6:

TABLA 6

10

busC codifica el módulo extensor 3 (SEC ID Nº 1, bases 19553-24061) y el módulo extensor 4 (SEC ID Nº 1, bases 24128-29053). La secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia aminoacídica para cada uno de los dominios funcionales en los módulos extensores 3 y 4 se identifican en la siguiente Tabla 7:

TABLA 7

11

busD codifica el módulo extensor 5 (SEC ID Nº 1, bases 29092-34263), el módulo extensor 6 (SEC ID Nº 1, bases 34327-38892) y el módulo extensor 7 (SEC ID Nº 1, bases 38956-43503). La secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia aminoacídica para cada uno de los dominios funcionales en los módulos extensores 5, 6 y 7 se identifican en la siguiente Tabla 8:

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TABLA 8

13

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spnE codifica el módulo extensor 8 (SEC ID Nº 1, bases 43945-49083), el módulo extensor 9 (SEC ID Nº 1, bases 49195-54366) y el módulo extensor 10 (SEC ID Nº 1, bases 54466-60707). La secuencia nucleotídica y la correspondiente secuencia aminoacídica para cada uno de los dominios funcionales en los módulos extensores 8, 9 y 10 se identifican en la siguiente Tabla 9:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9

14

Los límites y funciones de los 55 dominios identificados en las Tablas 7-11 anteriores se predicen basándose en las similitudes con las secuencias aminoacídicas conservadas de los dominios de otras policétido sintasas, particularmente la policétido sintasa de eritromicina (Donadio et al., 1992). Como la PKS de espinosina A83543, la PKS de bus tiene un dominio de KSQ en el extremo amino del módulo iniciador. Este dominio de KSQ no puede funcionar como \beta-cetosintasa porque contiene un residuo de glutamina en el aminoácido 172 en lugar de la cisteína requerida para la actividad \beta-cetosintasa (Siggard-Andersen, 1993). Se ha notificado que los dominios de KSQ funcionan descarboxilando malonil-ACP y que son factores de iniciación de cadena (Bisang, et al., 1999). Los otros dominios de PKS de butenilespinosina son funcionales. Ninguno de ellos tiene las características de secuencia de los dominios inactivos encontrados en los genes de PKS de eritromicina y rapamicina (Donadio et al., 1991; Aparicio et al.,
1996).

Aunque busB-E son comparables en tamaño a spnB-E, busA es 5.244 pb mayor que spnA. Las primeras 4.245 pb y las últimas 3.486 pb de busA tienen una alta similitud con spnA. Sin embargo, las bases 4246-9548 no tienen contrapartidas en el gen spnA. Esta región de 5 kb codifica un módulo adicional con 5 dominios funcionales: KSb, ATb, DHb, KRb y ACPb. Estas funciones, junto con el dominio de iniciación precedente, son responsables de la biosíntesis de la cadena lateral de butenilo, característica de las butenilespinosinas respecto a las espinosinas A83543. Se ha mostrado que los genes de PKS de bus clonados busB, busC, busD y busE son similares a los genes de PKS de espinosina A83543 análogos spnB, spnC, spnD y spnE (Tabla 10) (Baltz et al., 2000).

15

Las proteínas que efectúan reacciones similares en la biosíntesis de espinosinas comparten un 87-93% de identidad aminoacídica y los genes están en el intervalo de 93-94% de identidad de secuencia de ADN. Ha de observarse que las enzimas PKS de spn SpnB-E y las enzimas PKS de bus similares BusB-E deben mantener una especificidad de sustrato distinta puesto que, aunque las reacciones efectuadas por las enzimas son idénticas, los policétidos de sustrato son diferentes. Además, la agregación de las 5 enzimas PKS en una PKS funcional requiere interacciones proteína-proteína específicas. Los residuos implicados en este reconocimiento molecular entre subunidades son desconocidos y pueden no estar conservados entre S. spinosa y Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL
30141).

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Genes adyacentes a la PKS responsables de modificaciones adicionales

En el ADN cadena arriba de los genes de PKS (clonados en el cósmido 8H3) había 22 marcos abiertos de lectura (ORF), consistentes cada uno en al menos 100 codones, partiendo de ATG o GTG y terminando con TAA, TAG o TGA, y teniendo el sesgo de codón esperado de regiones de codificación de proteína en un organismo cuyo ADN contiene un alto porcentaje de residuos de guanina y citosina (Bibb et al., 1984). Estos 22 ORF se representaron gráficamente en la Fig. 2. Basándose en evidencias que se discutirán a continuación en la presente memoria, 14 de los ORF se han designado como genes biosintéticos de butenilespinosina, a saber: busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR y busS (marcados F a S en la Fig. 2). En la siguiente Tabla 11, se identifican la secuencia de ADN y la secuencia aminoacídica del correspondiente polipéptido para cada uno de estos genes, así como para los ORF encontrados inmediatamente cadena abajo de spnS (ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII y ORF LIX en el cósmido 8H3). Se identifican también en la Tabla 11 las secuencias nucleotídicas de ORF RI, ORF RII y ORFRIII cadena abajo de los genes de PKS (en el cósmido 2C10), y las secuencias aminoacídicas correspondientes a ellos.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 11

16

Para asignar funciones a los polipéptidos identificados en la Tabla 11, se utilizaron cuatro series de evidencias: similitud con secuencias de función similar, similitud con genes biosintéticos de espinosina A83543, resultados de experimentos de desestabilización génica orientada y resultados de experimentos de bioconversión.

Las secuencias aminoacídicas de los polipéptidos predichos se compararon con las secuencias depositadas en las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI, Washington, DC), usando el algoritmo BLAST para determinar en qué medida están relacionadas con proteínas conocidas. Las búsquedas BLAST de las bases de datos del NCBI se repitieron periódicamente también para obtener nuevas perspectivas de homologías adicionales. La Tabla 12 da las coincidencias significativas de una búsqueda BLAST básica el 18 de febrero de 2001:

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TABLA 12

18

19

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Los marcos abiertos de lectura bus se compararon directamente con la secuencia de genes biosintéticos de espinosina A83543 (número de acceso AY007564). El alto grado de similitud tanto en la secuencia de ADN como de proteína indicaba que los genes efectuaban funciones similares en la biosíntesis de espinosinas. La Tabla 13 da comparaciones de similitud entre los genes bus y spn.

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TABLA 13

20

A pesar del alto grado de similitud de ADN y aminoácido entre algunos genes bus y spn, ha de observarse que algunos de los productos génicos bus catalizan reacciones notablemente diferentes en la biosíntesis de butenilespinosina respecto a espinosinas A83543. Estas diferencias se manifiestan en los distintos compuestos de butenilespinosina que se han aislado de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141). Todas las espinosinas A83543 naturales dadas a conocer están sustituidas en C-17 con forosamina o un isómero de forosamina específico (Kirst, et al., 1992). Las butenilespinosinas, por otro lado, están también sustituidas en C-17 con un intervalo más amplio de isómeros de forosamina, así como azúcares neutros como amicetosa, O-metilglucosa y O-metiloleandrosa. Esta diversidad de glucosilación en C-17 respecto a las espinosinas A83543 requiere enzimas biosintéticas para preparar los azúcares y una glucosiltransferasa capaz de catalizar estas glucosilaciones. Estos azúcares podrían sintetizarse por genes de sintasa específicos localizados cerca de los genes bus o en otro lugar del cromosoma, o pueden sintetizarse mediante la especificidad de sustrato alternativa de los genes biosintéticos de butenilespinosina enumerados. La amicetosa podría producirse por genes fuera de la agrupación génica bus o puede ser un intermedio en la biosíntesis de forosamina (Fig. 4). La metiloleandrosa podría producirse como subproducto de la biosíntesis de forosamina y ramnosa O-metiltransferasas (busH, busI y busK). Este azúcar podría sintetizarse a partir de NDP-4-ceto-2,6-desoxi-D-glucosa, que es un intermedio en la biosíntesis de forosamina. Por lo tanto, la cetorreducción y O-metilación de este precursor por los genes dados a conocer y otros genes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) podrían conducir a la biosíntesis de derivados de espinosina que contienen metiloleandrosa (Fig. 4).

Además, 9 genes enumerados en la Tabla 13 interaccionan directamente con la aglicona o PSA de butenilespinosina (busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM y busP). La aglicona y el sustrato PSA de estos genes es distinto de la aglicona y PSA de la espinosina A83543. Por lo tanto, estos genes tienen especificidad de sustrato distinta respecto a su contrapartida spn enumerada en la Tabla 13.

Varios análogos de butenilespinosina producidos por Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) están hidroxilados en C-8 o C-24 (Tabla 2). Los macrólidos pueden hidroxilarse después de la síntesis por P-450 monooxigenasas como en la hidroxilación en C-6 de la biosíntesis de eritromicina (Weber y McAlpine, 1992). El ORF LVII es altamente similar a las P-450 monooxigenasas y él o una monooxigenasa codificada en otro lugar del cromosoma de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) puede ser responsable de las hidroxilaciones en C-8 o C-24 de butenilespinosinas. Como alternativa, pueden incorporarse precursores hidroxilados tales como glicolato o glicerol durante la síntesis de policétido como en leucomicina (Omura et al., 1983). Se ha notificado que el dominio de AT específico de la adición de glicolato en el productor de nidamicina (nid AT6) es similar a los dominios de AT específicos de metilmalonil-CoA de los genes de PKS de eritromicina y rapamicina (Katz et al., 2000). El módulo 7 de PKS es responsable de la adición de los carbonos 8 y 9 del policétido de butenilespinosina, sin embargo, el dominio AT7 de bus no tiene las mismas secuencias específicas de metilmalonil-CoA que nid AT6. Hay secuencias únicas en AT7 de bus respecto a otros dominios de AT y nid AT6 que podrían ser responsables de la especificidad de glicolato. Los genes biosintéticos de butenilespinosina responsables de estas modificaciones son únicos respecto a las espinosinas A83543, puesto que no se producen dichas espinosinas hidroxiladas por S. spinosa.

Además, la especificidad de la metilación de ramnosa se altera en Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) respecto a S. spinosa. Los mutantes de S. spinosa que exhibían una metilación alterada de la ramnosa en espinosina A83543, como se da a conocer en las patentes de EE.UU. 5.202.242 y 5.840.861, producían típicamente derivados de ramnosa monodesmetilados de espinosinas A83543. Los derivados de ramnosa didesmetilados de espinosinas A83543 se detectaron sólo en presencia de inhibidores de metiltransferasa como sinefungina. Los mutantes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) que alteraban la metilación de ramnosa (Hahn et al., 2001), producían derivados de ramnosa di- y tridesmetilados de butenilespinosinas en altas cantidades en ausencia de inhibidores de metiltransferasa.

Para estudios de complementación, se conjugaron cósmidos que contenían ADN de bus de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) en estirpes mutantes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) en las que la síntesis de butenilespinosina estaba alterada. (Se dan detalles en el siguiente ejemplo 4). Se ensayó entonces en los transconjugantes su capacidad de convertir los productos de mutantes bloqueados en otras espinosinas. El mutante usado era 30141.8, que producía 3'-O-desmetilramnosa-butenilespinosina (3-ODM) y factores relacionados. Los transcojugantes 30141.8/8H3 producían butenilespinosinas en lugar de 3-ODM, así que los genes responsables de la metilación en la posición 3' de ramnosa deben estar presentes en el cósmido 8H3.

En desestabilizaciones génicas orientadas, se generaron fragmentos internos mediante amplificación por PCR de los ADN de cósmido, y se clonaron en un plásmido. Se conjugaron los plásmidos resultantes en Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) y se aislaron y fermentaron los transconjugantes resistentes a apramicina. La base de los experimentos de desestabilización es que cuando un plásmido que porta un fragmento génico interno se integra, da como resultado dos copias incompletas del resultado génico biosintético, eliminando así la función enzimática. Se analizan los productos de fermentación para determinar cuáles butenilespinosinas se acumulan. La desestabilización del gen busO conduce a la acumulación de PSA de butenilespinosina, indicando que busO es necesario para la síntesis o adición de forosamina (véase el Ejemplo 5). Los compuestos que contienen azúcares en C-17 que no se sintetizan usando los genes biosintéticos de forosamina pueden acumularse también en mutantes busO.

Las conclusiones extraídas de las búsquedas BLAST, los experimentos de desestabilización génica y los estudios de bioconversión se discutirán ahora con más detalle gen a gen.

Se determinó que los 14 genes cadena arriba de PKS estaban implicados en la biosíntesis de butenilespinosina debido a su alta similitud con los genes spnF-S de S. spinosa (Tabla 13) y debido a que las búsquedas BLAST mostraron que estos genes tenían una notable similitud con enzimas conocidas por codificar funciones necesarias para la biosíntesis de butenilespinosinas.

busF, busJ, busL, busM

Los genes busF, busJ, busL y busM muestran una alta similitud con spnF, spnJ, spnL y spnM. Estos genes de espinosina A83543 se ha notificado que están implicados en la generación de la aglicona a partir del presunto producto de lactona monocíclico de los genes de PKS. El producto del gen busF tiene un 91% de identidad aminoacídica con spnF, igualmente el producto génico de busL tiene un 94% de identidad aminoacídica con spnL. Se ha notificado que ambos productos génicos de spnF y spnL son metiltransferasas y las 4 proteínas tienen una alta similitud con enzimas de Streptomyces que son conocidas por estar implicadas en la formación de un enlace carbono-carbono. La proteína busJ tenía un 83% de identidad aminoacídica con spnJ, que se ha notificado que es una oxidorreductasa. Tanto busJ como spnJ son altamente similares a dnrW, que es conocido por estar implicado en la formación de un enlace C-C en la biosíntesis de daunorubicina. El producto génico de busM era un 96% idéntico a spnM. Los productos génicos tanto de busM como de spnM son altamente similares a una nueva clase de lipasas secretadas de Candida albicans. Los papeles de busF y busL como metiltransferasas, de busJ como oxidasa y de busM como lipasa son consistentes con los papeles notificados de los genes spnF, spnL, spnJ y spnM en la formación de puentes de carbono-carbono.

busG, busH, busI, busK

BusG, busH, busI y busK tenían una alta similitud con los genes spnG, spnH, spnI y spnK de S. spinosa. Se ha notificado que estos genes están implicados en la adición de ramnosa a la aglicona de espinosina A83543 y posterior metilación. El gen busG tiene un 90% de similitud con spnG y era altamente similar a varios genes implicados en la adición de azúcar a antibióticos derivados de policétido (Tabla 11). Los productos génicos de busH, busI y busK mostraron una alta similitud aminoacídica con los productos génicos de spnH (97%), spnI (92%) y spnK (88%), respectivamente, que se ha notificado que están implicados en la metilación de ramnosa en la biosíntesis de espinosina. Los tres genes tenían una alta similitud aminoacídica con los genes tylE (busI y busK) y tylF (busH) de Streptomyces fradiae, que se ha mostrado experimentalmente que son macarocina O-metiltransferasas (Bate y Cundliffe, 1999).

busN, busO, busP, busQ, busR, busS

SpnN, spnO, busP, busQ, busR y busS tenían una alta similitud con los genes spnN, spnO, spnP, spnQ, spnR y spnS de S. spinosa (Tabla 12). Se ha notificado que estos genes están implicados en la biosíntesis o adición del azúcar forosamina. La similitud de busP con otras glucosiltransferasas (Tabla 11) indica que codifica la forosamiltransferasa de butenilespinosina. El alto grado de similitud entre busO y la 2,3-deshidratasa urdS (Tabla 11; Hoffmeister et al., 2000) indica que está implicado en la etapa de 2'-desoxigenación de la síntesis de forosamina. La similitud entre el producto génico de busQ y la 3,4-deshidratasa urdQ (S. fradiae; Hoffmeister et al., 2000), indica que está implicado en la etapa de 3'-deshidratación de la síntesis de forosamina. busR tenía hasta un 40% de identidad con un grupo de proteínas que se ha propuesto que funcionan como desoxiazúcar transaminasas (Thorson et al., 1993), indicando que busR está implicado en la etapa de 4'-aminación de la síntesis de forosamina. Finalmente, busS era altamente similar a un grupo de aminometilasas, indicando que busS está implicado en la metilación del grupo 4'-amino de la forosamina. Por lo tanto, busN, busO, busP, busQ, busR y busS están implicados en la producción del resto forosamina de butenilespinosinas.

Por tanto, los 19 genes de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) pueden asignarse a papeles en la biosíntesis de butenilespinosina: 5 genes de PKS para producir una lactona macrocíclica, 4 genes para modificar ésta a aglicona, 4 genes para añadir y metilar la ramnosa y 6 genes para sintetizar y añadir la forosamina. La ruta biosintética hipotética se resume en las Fig. 1A y 1B.

Utilidad

Hay muchos usos para el ADN de butenilespinosina de Saccharopolyspora sp. clonado. Los genes clonados pueden usarse para mejorar los rendimientos de butenilespinosinas y para producir nuevas butenilespinosinas. Pueden obtenerse rendimientos mejorados integrando en el genoma de una estirpe productora de butenilespinosina particular una copia por duplicado de uno o más genes biosintéticos de butenilespinosina. En el caso extremo en que la ruta biosintética esté bloqueada en una estirpe mutante particular debido a la falta de una enzima necesaria, la producción de las espinosinas deseadas puede restaurarse mediante la integración de una copia del gen necesario.

Pueden producirse compuestos novedosos usando fragmentos del ADN clonado para desestabilizar etapas de la biosíntesis de butenilespinosinas. Dicha desestabilización puede conducir a la acumulación de precursores o productos "paralelos" (los derivados procesados naturalmente de los precursores). Las espinosinas modificadas producidas desestabilizando genes pueden ser agentes de control de insectos ellas mismas, o servir como sustratos para una modificación química adicional, creando nuevas espinosinas semisintéticas con propiedades y espectros de actividad únicos. Una desestabilización del gen busO da como resultado la acumulación de PSA de butenilespinosina. La PSA de butenilespinosina es útil como material de partida para la síntesis de análogos de espinosina que contienen grupos novedosos en C-17.

Pueden producirse también butenilespinosinas novedosas mediante transferencia de uno o más genes bus clonados, o una parte de los mismos, a un hospedador heterólogo. Estos genes pueden proporcionar funciones enzimáticas no presentes en el hospedador receptor. Dichos genes podrían proporcionar azúcares alternativos, modificar los azúcares existentes o carbonos de aglicona, permitir la unión de azúcares alternativos a una aglicona o alterar la estructura de bases de la aglicona misma. Los compuestos producidos por transferencia de los genes bus clonados en un hospedador heterólogo pueden ser agentes de control de insectos por sí mismos, o servir como sustratos para modificación química adicional, creando nuevas espinosinas semisintéticas con propiedades y espectros de actividad únicos. Puede transferirse ADN de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) de los cósmidos 8H3 y 9D3 a S. spinosa, productor de espinosinas A83543, y los transconjungantes producen espinosinas novedosas.

Pueden producirse también butenilespinosinas novedosas mediante la mutagénesis de los genes clonados y la sustitución de los genes mutados por sus contrapartidas no mutadas en un organismo productor de butenilespinosina. La mutagénesis puede implicar, por ejemplo: 1) deleción o inactivación de un dominio de KR, DH o ER de modo que se bloquee una o más de estas funciones y la estirpe produzca una espinosina que tenga un núcleo de lactona con un doble enlace, un grupo hidroxilo o un grupo ceto que no está presente en el núcleo de espinosina A (véase Donadio et al., 1993); 2) reemplazo de un dominio de AT de modo que se incorpore un ácido carboxílico diferente al núcleo de lactona (véase Ruan et al., 1997); 3) adición de un dominio de KR, DH o ER a un módulo de PKS existente de modo que la estirpe produzca una espinosina que tenga un núcleo de lactona con un enlace saturado, grupo hidroxilo o doble enlace que no esté presente en el núcleo de espinosina A (MacDaniel y Katz, 2001); o 4) adición o sustracción de un módulo de PKS completo de

\hbox{modo que el
núcleo de lactona cíclico  tenga un número mayor o menor de átomos
de carbono.}

El ADN de la región de agrupación génica de butenilespinosina puede usarse como sonda de hibridación para identificar secuencias homólogas. Por tanto, el ADN clonado aquí podría usarse para localizar plásmidos adicionales de colecciones génicas de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) que se superponen con la región descrita aquí pero que contienen también ADN anteriormente no clonado de regiones adyacentes del genoma de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141). También, las comparaciones de los genes bus de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) con los genes spn de S. spinosa conduce a la identificación de regiones de secuencia conservada que son distintas de los genes biosintéticos no productores de espinosina tales como los genes biosintéticos de eritromicina, rapamicina, tilosina y otros. Estas sondas génicas específicas de espinosina, así como el ADN de la región aquí clonada, pueden usarse para identificar secuencias no idénticas pero similares en otros organismos. Las sondas de hibridación son normalmente de al menos aproximadamente 20 bases de longitud y están marcadas para permitir la detección.

Las estirpes modificadas proporcionadas por la invención pueden cultivarse para proporcionar espinosinas usando protocolos convencionales tales como los dados a conocer en la patente de EE.UU. nº 5.362.634. Los ejemplos anteriores no son limitantes y no han de considerarse como limitaciones de la invención.

Ejemplo 2

Método de CL/EM para el análisis en el caldo de fermentación de metabolitos de butenilespinosina

El siguiente método utiliza la separación por HPLC con espectrometría con electropulverización (ESI) para monitorizar la fermentación de productos de fórmula (1) y otros componentes. Dicho sistema se usó también para determinar los pesos moleculares de los factores purificados, mediante deducción a partir de los iones de aducto de electropulverización. Estos datos se resumen en la tabla 15.

Se añade un volumen de etanol desnaturalizado igual al del caldo de fermentación. Se agita la mezcla durante 1 hora, se centrifuga entonces y se filtra (0,22 \mum de tamaño de poro) para retirar el desecho celular bruto. Se microcentrifuga una alícuota de 1 ml y se analiza

\hbox{entonces el extracto
clarificado mediante el siguiente  sistema de
CL-EM:}

Sistema de HPLC: Columna de fase estacionaria: Columna de 250 x 4,6-mm, gel de sílice de base desactivada de 5 \mum C8 (Hypersil-C8-BDS). Fase móvil: Gradiente lineal de acetato de amonio 10 mM-metanol-acetonitrilo resumido a continuación:

TABLA 14

22

en el que el disolvente A es acetato de amonio 10 mM y el disolvente B es metanol-acetonitrilo (1:1);

Caudal: 1 ml/min; dividido después del detector de UV de tal modo que la relación de EM:desecho sea de aproximadamente 5:95;

Detección: ESI positiva adquirida en modos de voltaje de cono bajo y alto

Tiempos de retención de CL característicos e iones de espectrometría de masas como se resumen en la Tabla 15.

TABLA 15

23

24

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Ejemplo 3

Preparación de metabolitos de butenilespinosina mediante fermentación

Se producen metabolitos de fórmula (1) mediante cultivo de la estirpe deseada de Saccharopolyspora elegida de una de las siguientes estirpes NRRL 30141, NRRL 30421, o derivados de las mismas, en un medio de fermentación como se describe a continuación. Se descongelaron 1,8 ml de un medio de cultivo vegetativo congelado, se inoculó en 25 ml de medio vegetativo en un matraz Erlenmeyer de 125 ml con deflectores y creció a 30ºC agitándose a 150 rpm durante 72-96 horas.

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TABLA 16

25

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Fermentación en matraz agitado

Se usaron 12 ml de semilla madura de la primera etapa para inocular 50 ml de medio de fermentación en un matraz de fermentación Erlenmeyer de 500 ml con deflectores.

TABLA 17

26

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Se mantuvo la fermentación a 30ºC, 200 rpm (50 mm de carrera) durante 7-12 días. El caldo de fermentación maduro puede extraerse con un disolvente adecuado y recuperarse los metabolitos mediante separación cromatográfica, como se da a conocer en el ejemplo 1.

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Ejemplo 4

Complementación del defecto de metilación de ramnosa en la estirpe NRRL 30421 por el cósmido 8H3

La estirpe NRRL 30421 es un mutante de Saccharopolyspora sp. NRRL 30141 que es incapaz de metilar completamente la ramnosa en butenilespinosinas. La estirpe NRRL 30421 acumula el compuesto 4 y otras butenilespinosinas que carecen de O-metilación en la posición 3' de la ramnosa (3'-ODM). Este defecto de metilación se supone que es el resultado de una mutación en una de las O-metiltransferasas codificadas por los genes busH, busI o busK. Todos estos genes están presentes en el cósmido 8H3 (Figura 2)

Se transfirió el cósmido 8H3 (Figura 3) desde Escherichia coli ATCC 47055 a la estirpe NRRL 30421 mediante transferencia de conjugación (Matsushima et al., (1994)). Se fermentaron dos aislamientos independientes transformados con el cósmido 8H3 como en el ejemplo 2 y se analizó la producción de compuesto 1 y de compuesto 4 como se ejemplifica en el ejemplo 1.

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TABLA 18

27

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Aunque la NRRL 30421 producía predominantemente el compuesto 4, las estirpes de NRRL 30421 que contenían el cósmido 8H3 producían principalmente el compuesto 1 [Tabla 18]. La producción de los compuestos 1 y 4 en NRRL 30421 que contenía el cósmido 8H3 es similar al cultivo no mutante NRRL 30141 (Tabla 18). Por lo tanto, se ha demostrado que la transformación con el cósmido 8H3 es capaz de superar un defecto de metilación en la estirpe NRRL 30421 para restaurar la producción potenciada del compuesto 1.

\newpage

Ejemplo 5

Acumulación de precursor de butenilespinosina y producto paralelo causado por la desestabilización de busO

Se inactivó el gen busO mediante integración de un fragmento interno clonado del gen busO. Se usó un par de oligonucleótidos (el primero correspondiente a las bases 11882-11861 en la SEC ID Nº 2 y el segundo correspondiente a las bases 10970-10993 en la SEC ID Nº 2) para amplificar una región de 912 pb interna al gen busO de 1.457 pb correspondiente a las bases 10970-11882 de la SEC ID Nº 2. La transformación de Saccharopolyspora sp. LW107129 (NRRL 30141) con un plásmido que contiene el fragmento daría como resultado la duplicación parcial del gen busO, suministrando dos copias truncadas del gen que flanquean el plásmido y el gen de resistencia a
antibiótico.

Se generó el fragmento de PCR de busO interno de 912 pb con los cebadores de SEC ID Nº 33 y 34 usando PCR FailSafe^{TM}(Epicenter) y se clonó en pCRII según las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se digirió el plásmido resultante con EcoRI y se clonó el fragmento de busO en el sitio EcoRI de pOJ260 (Figura 3). Se conjugó el plásmido resultante de Escherichia coli ATCC 47055 en un derivado de Saccharopolyspora sp. NRRL 30121 mediante transferencia de conjugación (Matsushima et al., (1994)). Se fermentaron 6 exconjugantes resistentes a apramicina independientes como en el ejemplo 2 y se analizó la producción del compuesto 1 y de otros derivados de espinosina como en el ejemplo 1.

La estirpe original, NRRL 30141, producía altos niveles de compuesto 1 y bajos niveles de pseudoaglicona (PSA; compuesto 13). Producía también una pequeña cantidad de compuesto 9 [Tabla 19]. El compuesto 1 no podía detectarse en ninguno de los seis mutantes de busO, indicando que se requiere busO para la biosíntesis de butenilespinosina completa. Además, aumentaron los niveles de PSA en los seis mutantes de busO, como sería predecible por una deficiencia en el suministro de forosamina. Los niveles del compuesto 9 que tiene un azúcar distinto de forosamina en C-17 aumentaron también en los mutantes de busO.

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TABLA 19

28

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Referencias

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<110> Hahn, Donald

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Jackson, Jim

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Bullard, Brian

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Gustafson, Gary

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Waldron, Clive

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Mitchell, Jon

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<120> Genes Biosintéticos para la producción de insecticidas de tipo butenilespinosina

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<130> 51609

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<140>

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<141>

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<150> US 60/280,175

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<151> 01-03-2001

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<160> 40

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 75236

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<212> ADN

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 1

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30

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31

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32

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33

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<210> 2

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<211> 36538

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<212> ADN

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 2

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73

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<210> 3

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<211> 4344

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<212> PRT

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 2149

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<212> PRT

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 3167

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<212> PRT

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 5

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<210> 6

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<211> 4933

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<212> PRT

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 6

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146

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<210> 7

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<211> 5564

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<212> PRT

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 275

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 8

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<210> 9

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<400> 9

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<210> 10

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<210> 12

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<211> 539

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<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 397

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<212> PRT

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<400> 13

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175

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176

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

177

\hskip0,8cm

178

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip0,8cm

179

\hskip0,8cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

181

\hskip0,8cm

182

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 486

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

183

\hskip0,8cm

184

\hskip0,8cm

185

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

186

\hskip0,8cm

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 447

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

188

\hskip0,8cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

190

\hskip0,8cm

191

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

192

\hskip0,8cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

194

\hskip0,8cm

195

\hskip0,8cm

196

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip0,8cm

197

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

199

\hskip0,8cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

201

\hskip0,8cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 399

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

203

\hskip0,8cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip0,8cm

205

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip0,8cm

206

\hskip0,8cm

207

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 616

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip0,8cm

208

\hskip0,8cm

209

\hskip0,8cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

211

\hskip0,8cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

213

\hskip0,8cm

214

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgccgaata cgcgaaggtc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccaggaagg tattccgcgc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgacaacgc gatccagatc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgtcgtg ggcatatttc tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcccgatgcc tggattcatt g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora spinosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtccatcat cgagaagtgg tc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL 30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtacgtggc gatcag

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Saccharopolyspora sp. NRRL 30141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtccaagttt cggttgcgtt c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (23)

1. Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de ADN que codifica uno o más dominios de PKS de butenilespinosina seleccionados de KSb, ATb, KRb, DHb y ACPb, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 998-1413, 1495-1836, 1846-2028, 2306-2518 y 2621-2710 de la SEC ID Nº 3.

2. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 2992-4239, 4483-5508, 5538-6084, 6916-7554 y/o 7861-8130 de la SEC ID Nº 1.

3. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1 ó 2, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios PKS de butenilespinosina seleccionados de KSi, ATi, ACPi, KS1, AT1, KR1 y ACP1, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 7-423, 528-853, 895-977, 2735-3160, 3241-3604, 3907-4086 y 4181-4262 de la SEC ID Nº 3.

4. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 3, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 16-1269, 1582-2559, 2683-2931, 8203-9480, 9721-10812, 11719-12258 y/o 12541-12786 de la SEC ID Nº 1.

5. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS2, AT2, DH2, ER2, KR2 y ACP2,estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 534-964, 990-1075, 1336-1681, 1685-1864 y 1953-2031 de la SEC ID Nº 4.

6. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 5, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 13059-14321, 14658-15900, 16026-16283, 17064-18100 y/o 18111-18650 de la SEC ID Nº 1.

7. La molécula de ADN aislada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS3, AT3, KR3, ACP3, KS4, AT4, KR4 y ACP4, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-421, 528-814, 1157-1335, 1422-1503, 1526-1949, 2063-2393, 2697-2875 y 2969-3049 de la SEC ID Nº 5.

8. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 7, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 19553-20815, 21143-22000, 23021-23557, 23816-24061, 24128-25399, 25739-26731, 27641-28183 y/o 28457-28699 de la SEC ID Nº 1.

9. La molécula de ADN aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS5, AT5, DH5, KR5, ACP5, KS6, AT6, KR6, ACP6, KS7, AT7, KR7 y ACP7, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-422, 537-864, 891-1076, 1382-1563, 1643-1724, 1746-2170, 2281-2611, 2914-3093, 3186-3267, 3289-3711, 3823-4151, 4342-4636 y 4723-4804 de la SEC ID Nº 6.

10. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 9, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 29092-30357, 30700-31683, 31762-32319, 33235-33780, 34018-34263, 34327-35601, 35932-36924, 37831-38370, 38647-38892, 38956-40224, 40560-41544, 42115-42999 y/o 43258-43503 de la SEC ID Nº 1.

11. La molécula de ADN aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, codificando además la secuencia de ADN uno o más dominios de PKS de espinosina seleccionados de KS8, AT8, DH8, KR8, ACP8, KS9, AT9, DH9, KR9, ACP9, KS10, AT10, DH10, KR10, ACP10 y TE10, estando descritos dichos dominios, respectivamente, por los aminoácidos 1-424, 530-848, 885-1072, 1371-1554, 1650-1728, 1751-2175, 2289-2616, 2642-2775, 3131-3315, 3396-3474, 3508-3921, 4036-4366, 4389-4569, 4876-5054, 5148-5229 y 5278-5531 de la SEC ID Nº 7.

12. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 11, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 43945-45216, 45532-46488, 46597-47160, 48055-48606, 48892-49083, 49195-50469, 50809-51792, 51868-52269, 53335-53889, 54130-54366, 54466-55707, 56050-57042, 57109-57651, 58570-59106, 59386-59631 y/o 59776-60537 de la SEC ID Nº 1.

13. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN codifica un módulo PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 6-977 de la SEC ID Nº 3 y/o un módulo PKS de espinosina que comprende los aminoácidos 998-2710 de la SEC ID Nº 3

14. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 13, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 16-2931 y/o 2992-8130 de la SEC ID Nº 1.

15. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 13 ó 14, en la que la secuencia de ADN codifica uno o más módulos PKS de espinosina adicionales seleccionados del grupo consistente en los aminoácidos 2735-4262 de la SEC ID Nº 3, 1-2031 de la SEC ID Nº 4, 1-1503 de la SEC ID Nº 5, 1526-3049 de la SEC ID Nº 5, 1-1724 de la SEC ID Nº 6, 1746-3267 de la SEC ID Nº 6, 3289-4804 de la SEC ID Nº 6, 1-1728 de la SEC ID Nº 7, 1751-3474 de la SEC ID Nº 7 y 3508-5531 de la SEC ID Nº 7.

16. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 15, en la que la secuencia de ADN comprende las bases 8203-12786, 13059-19151, 19553-24061, 24128-28699, 29092-34263, 34327-38892, 38956-43503, 43945-49083, 49195-54366 y/o 54466-60537 de la SEC ID Nº 1.

17. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADN codifica una enzima biosintética de butenilespinosina que comprende una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la SEC ID Nº 3, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada.

18. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 17, en la que la secuencia de ADN comprende el gen busA descrito por las bases 1-13032 de la SEC ID Nº 1.

19. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 17 ó 18, en la que la secuencia de ADN codifica una o más enzimas biosintéticas de butenilespinosinas adicionales que comprenden, respectivamente, una secuencia aminoacídica al menos un 98% idéntica a la seleccionada de las SEC ID Nº 4-7 y 8-29, a condición de que si la secuencia es menos de 100% idéntica a la secuencia seleccionada, entonces las diferencias no afecten sustancialmente a las propiedades funcionales de la enzima codificada.

20. La molécula de ADN aislada de la reivindicación 19, en la que la secuencia de ADN comprende los genes busB, busC, busD, busE, ORF RI, ORFRII, ORF RIII, busF, busG, busH, busI, busJ, busK, busL, busM, busN, busO, busP, busQ, busR, busS, ORF LI, ORF LII, ORF LIII, ORF LIV, ORF LVI, ORF LVII, ORF LVIII y/o ORF LIX, estando descritos dichos genes, respectivamente, por las bases 13059-19505, 19553-29053, 29092-43890, 43945-60636, 62090-63937, 65229-66602 y 68762-69676 de la SEC ID Nº 1 y 114-938, 1389-2558, 2601-3350, 3362-4546, 4684-6300, 6317-7507, 7555-8403, 8640-9569, 9671-10666, 10678-12135, 12867-14177, 14627-15967, 16008-17141, 17168-17914, 18523-19932, 19982-20488, 20539-21033, 21179-21922, 22674-23453, 23690-24886, 26180-26923 y 27646-28473 de la SEC ID Nº 2.

21. Un vector de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1-20.

22. Una célula hospedadora transformada con un vector recombinante de la reivindicación 21.

23. Un proceso para preparar una butenilespinosina que comprende:

cultivar un microorganismo que tiene genes biosintéticos de butenilespinosina operativos en su genoma, a condición de que el genoma del organismo se haya modificado de modo que estén presentes copias por duplicado de al menos una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20; o

cultivar un microorganismo heterólogo que se haya transformado de modo que su genoma contenga un gen biosintético de butenilespinosina operativo que comprenda una secuencia de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.