ES2346572T3 - Inmunoensayo turbidimetrico para evaluar cistatina c humana. - Google Patents
Inmunoensayo turbidimetrico para evaluar cistatina c humana.Info
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Abstract
Un inmunoensayo turbidimétrico para evaluar Cistatina C humana en una muestra líquida corporal humana por medio de: (a) formar una mezcla de ensayo poniendo en contacto dicha muestra con un conjugado de nanopartículas-anticuerpos, que comprende nanopartículas adecuadas para medición turbidimétrica, en la que dichas nanopartículas están recubiertas con un recubrimiento de material proteináceo que comprende anticuerpos de Cistatina C anti-humana o fragmentos que se unen al antígeno de los mismos, para unirse a dicha Cistatina C, en la que dichas nanopartículas recubiertas tienen un diámetro medio en el intervalo de más de 58 nm hasta 200 nm, y (b) evaluar el contenido en Cistatina C humana midiendo el cambio en turbidez de dicha mezcla; en la que el recubrimiento es de tal forma que dichas nanopartículas están recubiertas con del 10% al 35% de anticuerpo que se une a Cistatina C humana por peso total del conjugado nanopartículas-anticuerpos.
Description
Inmunoensayo turbidimétrico para evaluar
Cistatina C humana.
La presente invención se refiere a un
inmunoensayo turbidimétrico mejorado para evaluar Cistatina C humana
en una muestra líquida del cuerpo humano haciendo uso de conjugados
de anticuerpos-nanopartículas específicos; un
procedimiento para la evaluación de la velocidad de filtración
glomerular de un paciente haciendo uso de dicho ensayo: kits de
reacción correspondientes; conjugados de
anticuerpos-nanopartículas mejorados y su uso para
el fin medico arriba mencionado.
La Cistatina C se descubrió y se caracterizó en
1981 por A. Grubb y H. Lovberg [Grubb A O, y col: Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 1982; 79]. La Cistatina C fue la primera proteína
descubierta de la que después se ha denominado la superfamilia de
proteínas cistatinas. La superfamilia de proteínas cistatinas es un
grupo de proteínas que inhibe enzimas de la cisteín proteasa.
Otras funciones biológicas de Cistatina C se están investigando en
la actualidad. Al contrario que otros miembros de la superfamilia de
la Cistatina, la Cistatina C está presente en todos los fluidos
corporales, aunque la composición total de Cistatinas diferentes
varía de fluido corporal a fluido corporal, y en diferentes
compartimentos [Abrahamson M, y col: J. Biol. Chem. 1986; 261:
11282]. En 1990, Abrahamsson y col. demostró que la Cistatina C se
produce a una velocidad estable y por todas (o casi todas) las
células nucleadas en el cuerpo humano,
siendo lo que se denomina una proteína "doméstica" [Abrahamson M, y col: Biochem. J. 1990; 268: 287-94].
siendo lo que se denomina una proteína "doméstica" [Abrahamson M, y col: Biochem. J. 1990; 268: 287-94].
La Cistatina C -con una masa molecular de 13 kD-
se filtra libremente a través de la membrana glomerular normal del
riñón, pero después se re-adsorbe y cataboliza en el
"túbulo proximal", el compartimiento de los riñones que
re-adsorbe la mayor parte de los péptidos y
proteínas más pequeñas que pasan la membrana glomerular. De esta
forma los riñones conservan estos materiales proteináceos para el
cuerpo y dificultan la perdida de la orina (Jacobsson B, y col:
Histopathology 1995; 26: 559-64.) [Heyms S B, y col:
Am. J. Clin. Nutr. 1983; 37: 478].
La creatinina, hasta ahora el marcador
normalmente usado para la velocidad de filtración glomerular (GFR),
es una molécula de bajo peso molecular producida en células
musculares. Por lo tanto, la velocidad de la formación y secreción
de creatinina esta muy unido a la masa muscular del cuerpo. Se sabe
bien que la masa muscular de un individuo en una población varía de
forma considerable. Con frecuencia, los ancianos tienen una masa
muscular baja en comparación con la masa corporal, también muchos
pacientes pierden masa muscular a medida que su enfermedad
progresa. Por lo general los niños tienen una masa muscular relativa
diferente en comparación con los adultos, y los hombres tienen por
término medio una masa muscular relativa superior que las mujeres.
Por lo tanto, cuando la concentración de creatinina en suero se usa
como marcador para la velocidad de filtración glomerular, el valor
de creatinina en suero se puede encontrar dentro del intervalo de
referencia incluso cuando se produce una reducción del 50% de la
velocidad de filtración glomerular. [Shemesh O, y col: Kidn. Int.
1985; 28: 830-8]. También la dieta influye de forma
significativa en el nivel en suero de creatinina, en especial una
dieta rica en proteínas [Perrone R D, y col: Clin. Chem. 1992; 38:
1933-53].
Las mediciones de creatinina en suero y plasma
no son "procedimientos convencionales de oro" fiables para
medir la velocidad de filtración glomerular. El uso de inyecciones
intravenosas de sustancias marcadas con isótopos como
Cr-51-EDTA o
Tc-99m-DTPA, o inyecciones de
agentes yodados como yohexol, ha ganado, por lo tanto, algo de
popularidad. Estos procedimientos son costosos, requieren mucho
tiempo y las inyecciones son necesarias, y con frecuencia tomar
muestras de sangre repetidas. En la publicación "Simple Cystatin
C-Based Prediction Equations for Glomerular
Filtration Rate Compared with the Modification of Diet in Renal
Disease Prediction Equation for Adults and the Scwartz and the
Counahan-Barratt Prediction Equations for
Children", de Grubb y col. en Clinical Chemistry 51:8,
1420-1431, se demostró que simples mediciones de
Cistatina C en sangre pueden reemplazar complicados procedimientos
para medir la velocidad de filtración glomerular.
Originalmente la medición de Cistatina C usaba
procedimientos bioquímicos clásicos, pero pronto se movió a
inmunoensayos turbidimétricos y nefelométricos. La compañía
Dade-Behring fue la primera en aplicar
procedimientos de mediciones nefelométricas. Véase también Coll, E
y col. Am. J. Kidney Disease 2000; 36, 2934. Los procedimientos
nefelométricos son muy fiables. La desventaja de los procedimientos
nefelométricos es que los propios instrumentos tienen una velocidad
de procesamiento bastante baja en comparación con espectrofotómetros
automáticos basados en la transmisión de la luz. Los nefelómetros
producidos por Dade Behring, típicamente el nefelómetro BNII y los
nefelómetros ProSpec, y Beckman Instruments, han entrado en el
mercado de forma sustancial, pero están mucho menos extendidos que
los instrumentos basados en mediciones de transmisión. Los
nefelómetros también tienen una transferencia de muestras mucho más
baja que los grandes instrumentos automáticos basados en mediciones
de transmisión.
H. Stone y col. en el artículo "Analytical
performance of a particle-enhanced nephelometric
immunoassay for serum Cystatin C using rate analysis", en
Clinical Chemistry Vol 8, pág. 1482-85, 2001,
presentaron un procedimiento nefelométrico de velocidad. Sin
embargo, los instrumentos nefelométricos tienen una capacidad
limitada para un gran número de muestras y el número de
instrumentos nefelométricos es limitado. Por lo tanto, se solicitó
moverse a instrumentos espectrofotométricos homogéneos de absorción,
ya que tales instrumentos son más abundantes y tienen una capacidad
superior.
Dako Cytomation, Dinamarca, ha sido pionera en
el campo de inmunoensayos turbidimétricos de Cistatina C. La
técnica se describe en los siguientes artículos: "Cystatin
C-The marker of choice for renal function
testing" de C. Schmidt en European Clinical Laboratory, 10 Feb.
2004. "New improved automated particle enhanced turbidimetric
immunoassay for quantitative determination of human Cystatin C in
serum and plasma" de C. Schmidt, C. Kjoller y K Gronkjaer, una
presentación descargada del sitio web de Dako Cytomation AS, julio
2005.
Sin embargo, las mediciones turbidimétricas se
alteran por medio de la turbidez en muestras, como se describe en
el artículo "Turbidity in immunoturbidimetric assays" de Dahr y
col., en Ann. Clin. Biochem. Vol 27, pág. 509, 1990. En el 29º
Congreso Nórdico de Química Clínica, Malmo, Suecia, 24 al 27 de
abril, 2004, A. Grubb presentó resultados en la interferencia de
triglicéridos en muestras de suero y plasma en los resultados de
mediciones de Cistatina C. por lo tanto todavía existe una necesidad
de mejorar el inmunoensayo turbidimétrico para la Cistatina C
humana.
Una alternativa a los sistemas de inmunoensayos
homogéneos serían los sistemas de inmunoensayo no homogéneos
basados en la separación. La ventaja de los sistemas de
inmunoensayos no homogéneos se caracteriza por una etapa de
separación con lavado durante la realización del ensayo. La ventaja
de estos sistemas es que, por medio del lavado, eliminan cualquier
sustancia que interfiere. Además, permite la eliminación de
anticuerpos no unidos y enzimas no unidas y otros restos
fluorescentes o de color o que proporcionen señales. Por lo general,
estos procedimientos no son competitivos, ya que la sustancia que
se va a medir, en lo sucesivo denominada analito, no tiene que
competir con análogos marcados para la unión a los anticuerpos. Este
aspecto, y el uso de las etapas de lavado, hacen posible usar
anticuerpos inmovilizados y anticuerpos marcados en exceso,
proporcionando una sensibilidad alta y normalmente un nivel elevado
de precisión, en especial si se usan anticuerpos de gran
calidad.
Existen numerosos libros de texto sobre sistemas
de inmunoensayo de fase sólida y otros no homogéneos. Los grandes
sistemas automáticos están disponibles en el mercado. Abbott
Diagnostic Division, EE.UU., comercializa reactivos para ImX, AxSYM
y otros instrumentos de inmunoensayos no homogéneos automáticos;
Roche Diagnostics, Alemania, comercializa reactivos para Elecsys y
otros sistemas de inmunoensayos no homogéneos; y existen otros
numerosos suministradores de reactivos y sistemas de inmunoensayos
no homogéneos. Un sistema de inmunoensayo no homogéneo todavía muy
popular es el denominado sistema de inmunoensayo de microtítulos.
Estos sistemas son lentos pero fiables y no muy costosos. La
bibliografía general sobre inmunoensayos proporciona mucha
información sobre estos sistemas, que son conocidos para los
expertos en la técnica.
La desventaja de los sistemas de inmunoensayos
no homogéneos es la falta de capacidad para una elevado número de
ensayos por unidad de tiempo, es decir por hora de tiempo de
procesamiento. Los procedimientos implican las etapas de separación
y lavado, que aunque automáticas, ocupan tiempo de procesamiento del
instrumento. Además, al estar implicadas las fases sólidas, se usan
con frecuencia fases sólidas o dispositivos especiales, que tienen
cierto precio de producción, aunque se produzcan en masa. En los
últimos años, la elevada transferencia y velocidad de la generación
resultante se han hecho cada vez más importantes, debido al cada vez
más creciente número de ensayos que realizar. Existe una demanda
para mover ensayos de tecnologías de inmunoensayos no homogéneos,
con frecuencia basados en fase sólida, a sistemas de inmunoensayos
homogéneos.
Los sistemas de inmunoensayos homogéneos tienen
una construcción simple y una capacidad de transferencia más
elevada. Los reactivos se mezclan, se incuban y se miden, durante o
después de la incubación. Se usan señales de criterio de valoración
o diferencias de señal entre puntos de tiempo diferentes o
mediciones cinéticas continuas. Las señales pueden ser mediciones
de fluorescencia, color u opacidad (turbidimetría). En particular,
los grandes instrumentos automáticos para las mediciones de color
y/o opacidad/turbidimetría han tenido mucho éxito. La compañía
Hitachi en Japón fue la primera en aplicar esta automatización a
gran escala, trabajando junto con Roche, pero también otros
numerosos fabricantes, entre los que se incluye Olympus y Bayer,
suministran tales instrumentos y reactivos. Estos instrumentos son
espectrofotómetros multi-pocillos automáticos que
miden la transmisión de la luz a través de una mezcla de la muestra
y reactivos a diferentes longitudes de onda en diferentes puntos de
tiempo. Como los inmunoensayos turbidimétricos de Cistatina C se
realizan en dichos instrumentos homogéneos de alta capacidad, esta
es otra razón por la que se solicitan ensayos turbidimétricos de
Cistatina C de alta calidad.
Los sistemas de inmunoensayos más homogéneos
están basados en la mezcla de la muestra con soluciones de reactivos
que comprenden una concentración bien controlada del analito
marcado o análogo del analito, y anticuerpos que tienen afinidad
específica por el analito. Las moléculas del analito en la muestra
compiten con el analito marcado o análogo del analito, y se genera
una señal. La extensa bibliografía sobre inmunoensayos enseña el
uso de diferentes marcadores y análogos. Aquí debería apreciarse
que, hasta el momento, ha habido un éxito limitado en el uso de
procedimientos de inmunoensayos homogéneos para analitos con alto
peso molecular (masa molecular por encima de 4000) que generan
señales coloreadas. (Ha habido éxito en el uso de técnicas
fluorescentes, como por ejemplo ensayos de proximidad, pero no
existen muchos fluorómetros de alta transferencia automáticos
disponibles, y por lo tanto estas tecnologías no sirven para el fin
de la presente invención). La tecnología EMIT de Syva y la
tecnología CDEIA de Microgenics, ambas compañías situadas en
California, han tenido éxito con señales de color en inmunoensayos
homogéneos para analitos de baja masa molecular. Para los analitos
de alta masa molecular, las mediciones turbidimétricas potenciadas
por partículas han sido la tecnología de más éxito para los
espectrofotómetros multi-pocillos automáticos que
miden la transmisión de la luz a través de la mezcla de la muestra
y los reactivos. Por lo tanto los procedimientos turbidimétricos se
prefieren para analitos con peso molecular más elevado. Las
descripciones generales de procedimientos turbidimétricos se
encuentran en numerosos libros de texto sobre inmunoensayos.
¿Por qué son necesarias las mediciones de alta
precisión de Cistatina C? Desde la perspectiva de la biología, la
bibliografía sobre la biología de Cistatina C y creatinina, así como
del meta-análisis arriba indicado, señalan en la
dirección del uso de Cistatina C en lugar de creatinina, para
controlar y diagnosticar la velocidad de filtración glomerular
reducida. Sin embargo, aunque el argumento biológico está a favor de
usar Cistatina C, la ventaja biológica sólo tiene importancia si la
exactitud y precisión del análisis de Cistatina C son buenas. La
exactitud y precisión de las mediciones de creatinina son
excelentes, y la ventaja médica de analizar Cistatina C en lugar de
creatinina se pierde fácilmente si la exactitud y precisión de los
procedimientos de inmunoensayo de Cistatina C son demasiado
bajas.
Un problema que se va a resolver por medio de la
presente invención es proporcionar un inmunoensayo
inmuno-turbidimétrico de Cistatina C con exactitud
y/o precisión mejorada y/o menos interferencia a partir de lípidos y
hemoglobina en muestras experimentales si se compara con los
ensayos turbidimétricos correspondientes disponibles en el
mercado.
Otro inconveniente de la técnica anterior de
mediciones turbidimétricas de Cistatina C es la baja velocidad de
cambio en turbidimetría, que lleva a un tiempo de ensayo largo y/o
elevada imprecisión. Otro problema que se va a resolver por medio
de la presente invención es proporcionar, por lo tanto, mediciones
turbidimétricas más rápidas de Cistatina C.
Newman y col., 1995, Kidney Int. 47,
312-318 describen un inmunoensayo turbidimétrico
para evaluar la Cistatina C humana que comprende el uso de
nanopartículas con un diámetro de 77 nm recubiertas con
inmunoglobulina de conejo de Cistatina C
anti-humana, y sugieren el uso de anticuerpos
monoclonales en lugar de anticuerpos policlonales. Un reactivo de
partículas de anticuerpo optimizado contenía 0,5 mg de anticuerpo
policlonal por ml de partículas al 1%. Se sugieren las mediciones a
una longitud de onda de 340 nm.
Kyhse-Andersen, 1994, Clin.
Chem. 40 (10), 1921-1926 describe un procedimiento
turbidimétrico para determinar Cistatina C en suero por medio de la
aplicación de inmunopartículas de Cistatina C de 38 nm de diámetro
recubiertas con aproximadamente 32 moléculas de IgG por partícula.
La absorbancia se midió a 340 nm.
Finney y col., 1997, Clin. Chem. 43 (69),
1016-1022 describen un procedimiento
inmunonefelométrico de Cistatina C que comprende la medición a 340
nm y la aplicación de partículas de
clorometil-estireno de 80 nm recubiertas con
antisuero de conejo de Cistatina C anti-humana.
Lewis y col., 2001, Ann. Clin. Biochem. 38 (2),
111-114 describen un ensayo inmunoturbidimétrico
para Cistatina C realizado a 340 nm y a pH óptimo, PEG y parámetros
de volumen de la muestra.
Mussap y col., 1998, Clin. Cham. Lab. Med.
36(11), 859-865 describen un procedimiento
inmunonefelométrico para medición rutinaria de Cistatina C a 340 nm
y por medio de la aplicación de partículas de 80 nm recubiertas con
antisuero de conejo de Cistatina C anti-humana.
La Figura 1 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con la invención
frente al factor de dilución para el suero de diferentes pacientes
obtenido por regresión lineal.
La Figura 2 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con la invención
frente al factor de dilución para el suero de diferentes pacientes
obtenido por regresión de primer orden.
La Figura 3 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con la invención
frente al factor de dilución para el suero de diferentes pacientes
obtenido por regresión de segundo orden.
La Figura 4 muestra una representación gráfica
de DL (%) para el suero 1 del Ensayo del Ejemplo 4.
La Figura 5 muestra una representación gráfica
de DL (%) para el suero 3 del Ensayo del Ejemplo 4.
La Figura 6 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C frente al factor de dilución para
el suero de un paciente obtenido por regresión lineal.
La Figura 7 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C frente al factor de dilución para
el suero del paciente de la Figura 6 obtenido por regresión de
segundo orden.
La Figura 8 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C frente al factor de dilución para
el suero del paciente de la Figura 6 obtenido por regresión de
tercer orden.
La Figura 9 muestra la representación gráfica de
DL (%) para el suero A del Ensayo del Ejemplo 5.
La Figura 10 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con un
procedimiento de la técnica anterior frente al factor de dilución
para el suero de diferentes pacientes obtenido por regresión lineal
(técnica anterior).
La Figura 11 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con un
procedimiento de la técnica anterior frente al factor de dilución
para el suero de diferentes pacientes obtenido por regresión de
primer orden.
La Figura 12 muestra una representación gráfica
de valores medios de Cistatina C medidos de acuerdo con un
procedimiento de la técnica anterior frente al factor de dilución
para el suero de diferentes pacientes obtenido por regresión de
segundo orden.
La Figura 13 muestra una representación gráfica
de DL (%) para el suero 1 del Ensayo del Ejemplo 6 (técnica
anterior).
La Figura 14 muestra una representación gráfica
de DL (%) para el suero 2 del Ensayo del Ejemplo 6 (técnica
anterior).
La Figura 15 muestra una representación gráfica
de DL (%) para el suero 3 del Ensayo del Ejemplo 6 (técnica
anterior).
Las Figuras 16, 17 y 18 muestran los resultados
de investigar la correlación entre procedimientos de ensayo de
Cistatina C: por turbidimetría de acuerdo con la presente invención
y por nefelometría de acuerdo con la técnica anterior.
Los problemas anteriores relacionados con los
inmunoensayos turbidimétricos de la técnica anterior para la
medición de Cistatina C podrían, de manera sorprendente, resolverse
por medio de un procedimiento turbidimétrico como se define en las
reivindicaciones permitidas y explicadas en más detalle en las
partes subsiguientes de la descripción. Dicho procedimiento de la
invención particularmente hace uso de inmunoconjugados de
nanopartículas mejorados que permiten una medición de la Cistatina
C más rápida y/o más sensible y/o más fiable bajo condiciones
experimentales diferentes, como en particular, concentraciones
diferentes de Cistatina C, longitudes de onda de medidas
diferentes, tiempos de reacción diferentes y temperaturas
diferentes. Otras ventajas de la invención son evidentes a partir de
los experimentos adjuntos.
Por medio de ajustes meticulosos de
inmunopartículas y opcionalmente reactivos del ensayo, se podría
observar una señal turbidimétrica sorprendentemente más fuerte y
más rápida, y por consiguiente se podrían reducir interferencias y
se podría mejorar la linealidad sin perder precisión. También se
podría reducir el tiempo de ensayo.
Los presentes inventores observaron que, i.a.,
el tamaño de partícula debe equilibrarse meticulosamente. Las
partículas grandes crean una buena señal, sin embargo el fondo es
alto, y la capacidad de unión es baja, de tal forma que se deben
añadir un montón de partículas, creando una turbidez del fondo
incluso mas elevada. Los suministradores anteriores de ensayos,
como Dako Cytomation AS, números de producto LX002/EFG/CS/25.10.04,
S2361/EFG/KGR109.07.03 y X0974/EFG/SUM/09.09.04, no han conseguido
señales turbidimétricas buenas.
Una "muestra líquida corporal" como se usa
en el procedimiento del ensayo de acuerdo con la invención es una
muestra derivada de un mamífero, en particular un ser humano, y que
contiene Cistatina C, en particular Cistatina C humana. Se puede
usar cualquier muestra líquida que contenga Cistatina C. Dichas
muestras que se van a ensayar de acuerdo con la invención puede ser
cualquier fluido biológico o extracto de tejido que contenga
Cistatina C y se puede pre-tratar antes del ensayo.
Los ejemplos de muestras adecuadas son sangre, fracciones de sangre,
como suero y plasma, y sangre pre-tratada, como
sangre con EDTA o plasma con EDTA, plasma con citrato, plasma con
heparina o muestras de orina. Las muestras originalmente obtenidas o
fracciones de la misma se pueden modificar adicionalmente por medio
de procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo por
fraccionamiento o dilución. El fraccionamiento se puede realizar
para eliminar constituyentes que puedan alterar el ensayo. La
dilución se puede realizar mezclando la muestra original o fracción
con un líquido de la muestra adecuado, como un tampón adecuado, con
el fin de ajustar la concentración de los constituyentes, como por
ejemplo del analito. Tales muestras modificadas ilustran muestras
"derivadas de" la muestra fluida corporal original recogida o
aislada del cuerpo del mamífero.
Un "analito" que se va a ensayar de acuerdo
con la invención es Cistatina C, en particular Cistatina C humana,
como se forma por medio del cuerpo de un individuo sano o enfermo.
Aunque no es necesario, también puede ser posible usar en forma de
analito un derivado de Cistatina C o una mezcla de Cistatina C
natural y derivado(s) de Cistatina C. Los ejemplos no
limitantes de derivados de Cistatina C son compuestos de Cistatina C
que llevan un marcador detectable adecuado, como por ejemplo un
marcador radioactivo, metálico o cromóforo.
"Evaluar" o "evaluación" pretende
incluir tanto la determinación cuantitativa como cualitativa en el
sentido de obtener un valor absoluto para la cantidad o
concentración del analito, aquí Cistatina, presente en la muestra,
y también obtener un índice, relación, porcentaje, visual u otro
valor indicativo del nivel de analito en la muestra. La evaluación
puede ser directa o indirecta y, por supuesto, la especie química
realmente detectada no necesita ser el propio analito, pero puede
ser, por ejemplo, un derivado del mismo.
Los "inmunoensayos homogéneos" tienen, en
oposición a inmunoensayos no homogéneos, una construcción más simple
y una capacidad de transferencia más elevada. En particular, los
ensayos homogéneos no abarcan una etapa de
pre-tratamiento de la muestra en forma de etapa de
separación, por ejemplo aplicando la muestra en una matriz sólida,
como una columna de cromatografía, y separando el analito de partes
de los constituyentes originales de la muestra del complejo
original. Para un ensayo homogéneo, la muestra y los reactivos se
mezclan, se incuban y se miden, durante o después de la incubación.
Se usan señales de criterio de valoración o diferencias de señal
entre puntos de tiempo diferentes o mediciones cinéticas
continuas.
Un inmunoensayo o medición turbidimétrico
"potenciado por partículas" está basado en "propiedades de
dispersión de la luz" asociadas a las nanopartículas o
inmunoconjugados de nanopartículas como se usa de acuerdo con la
invención. Por lo general, dichas nanopartículas son aproximadamente
esféricas, preferiblemente con una distribución estrecha de tamaño.
El tamaño de dichas partículas se expresa normalmente a través de
su diámetro medio. De acuerdo con las leyes bien conocidas de la
dispersión de la luz, dichas propiedades de dispersión de la luz
pueden estar influidas por el tamaño de las partículas, y/o la
relación del índice refractario de la partícula al del medio. Las
propiedades de dispersión de la luz débiles pueden ser el resultado
de un tamaño de partícula pequeño, y/o una relación baja del índice
refractario de la partícula al del medio (véase también la ley de la
dispersión de la luz de Rayleigh).
El tamaño y/o la relación del índice refractario
de las nanopartículas son de tal forma que pueden producir la
dispersión de la luz en la longitud de onda usada para la detección
de inmunoconjugados de nanopartículas aglutinados. Por lo general se
elige que dicho tamaño sea más pequeño que dicha longitud de onda de
detección.
La "longitud de onda de detección" como se
usa de acuerdo con la presente invención para medir el cambio de
turbidez en la muestra es por lo general de 300 nm a 1200 nm,
preferiblemente de 400 a 700 nm en particular de 500 a 600 nm.
La "exactitud" de un procedimiento
analítico de la presente invención, es la capacidad del
procedimiento para determinar de forma exacta la concentración de
Cistatina C en una muestra, en comparación con la concentración
cuando se determina por medio de un procedimiento de referencia
incluso más fiable.
La "precisión" de un procedimiento
analítico de la presente invención, es la variación de los
resultados cuando la concentración de Cistatina C en una muestra se
determina de forma repetida.
Una "consistencia" de un ensayo de acuerdo
con la presente invención es la capacidad del procedimiento para
tolerar variaciones y sustancias que interfieren en las condiciones
del ensayo sin influir en el valor resultante de la determinación de
la concentración de Cistatina C.
Una "proteína inerte" como se usa en el
contexto de la invención, es una proteína de cualquier origen (por
ejemplo, mamífero humano o no humano, microbiano) que no altera el
procedimiento del ensayo de la invención; en particular no debería
tener afinidad sustancialmente o no detectable por la Cistatina C
que se va a analizar y/o por los anticuerpos como se usa en el
procedimiento del ensayo de la invención.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
un inmunoensayo turbidimétrico potenciado por partículas para
evaluar Cistatina C huma en una muestra líquida corporal humana o
una muestra derivada de ésta, por medio de
(a) formar una mezcla de ensayo poniendo en
contacto dicha muestra o una dilución de la misma con un conjugado
de nanopartículas-anticuerpos (o inmunoconjugado de
nanopartículas), que comprende nanopartículas adecuadas para
medición turbidimétrica, en la que dichas nanopartículas están
recubiertas con un recubrimiento de material proteináceo que
comprende anticuerpos de Cistatina C anti-humana o
fragmentos que se unen al antígeno de los mismos, para unirse a
dicha Cistatina C, en la que dichas nanopartículas recubiertas
tienen un diámetro medio en el intervalo de más de 58 nm hasta 200
nm, y
(b) evaluar el contenido en Cistatina C humana
midiendo el cambio en turbidez de dicha mezcla; en la que el
recubrimiento es de tal forma que dichas nanopartículas están
recubiertas con del 10% al 35% de anticuerpo que se une a Cistatina
C humana por peso total del conjugado
nanopartículas-anticuerpos.
Una realización adicional de la invención se
refiere a un inmunoensayo turbidimétrico para evaluar Cistatina C
humana en una muestra líquida corporal humana por medio de:
(a) formar una mezcla de ensayo poniendo en
contacto dicha muestra con un conjugado de
nanopartículas-anticuerpos, que comprende
nanopartículas adecuadas para medición turbidimétrica, en la que
dichas nanopartículas están recubiertas con un recubrimiento de
material proteináceo que comprende anticuerpos de Cistatina C
anti-humana aviar o fragmentos que se unen al
antígeno de los mismos, para unirse a dicha Cistatina C, en la que
dichas nanopartículas recubiertas tienen un diámetro medio en el
intervalo de más de 58 nm hasta 200 nm, y
(b) evaluar el contenido en Cistatina C humana
midiendo el cambio en turbidez de dicha mezcla.
Preferiblemente, dichos anticuerpos comprenden
anticuerpos policlonales no humanos, no roedores contra Cistatina C
humana; en particular dichos anticuerpos policlonales comprenden
anticuerpos aviares contra Cistatina C humana.
En una realización adicional preferencia, al
menos el 25% en peso de dichos anticuerpos policlonales o fragmentos
de los mismos se ha obtenido por medio de purificación por afinidad
con Cistatina C humana. Por medio de la purificación por afinidad
se aumenta la proporción de esos anticuerpos que se unen a Cistatina
C humana. Además, adicionalmente por medio de la purificación con
afinidad puede ser posible enriquecer anticuerpos que se unen a
Cistatina C humana con afinidad más alta (o avidez) que aquellos
anticuerpos que se han eliminado de la mezcla.
Por ejemplo, un anticuerpo adecuado como se usa
de acuerdo con la invención puede tener una afinidad o avidez por
la Cistatina C humana que corresponde a (o es sustancialmente
idéntica a) la afinidad o avidez de un anticuerpo aviar (por
ejemplo policlonal) que se puede obtener por medio de purificación
por afinidad de anticuerpo aviar a través de la unión de antisuero
con Cistatina C anti-humana aviar a Cistatina C
humana inmovilizada en una fase sólida y, preferiblemente después
de lavar por ejemplo con solución salina tamponada con fosfato,
eluyendo anticuerpos unidos con tampón citrato, de una molaridad en
el intervalo de 0,05 M a 0,2 M, ó 0,08 M a 0,12 M, en particular
aproximadamente 0,1 M; y un pH en el intervalo de aproximadamente 3
a 3,5, ó 3,1 a 3,3, en particular aproximadamente 3,2 (como por
ejemplo se explica en más detalle en la parte experimental
subsiguiente).
En una realización adicional dichos anticuerpos
comprenden (a) anticuerpos monoclonales que se unen a un solo
epitope de Cistatina C humana o (b) un conjunto de dos o más
especies de anticuerpos monoclonales, en el que cada especie de
anticuerpo monoclonal se une a un epitope diferente de Cistatina C
humana o dos o más especies se unen a epitopes idénticos con fuerza
de unión diferente (afinidad o avidez).
Dichos anticuerpos monoclonales son de origen
humano o no humano (por ejemplo de origen de roedor, oveja, cabra,
pájaro o conejo).
Las nanopartículas recubiertas, como se usa de
acuerdo con la invención, preferiblemente tienen un diámetro medio
de más de 58 nm, en particular un diámetro medio en el intervalo de
59 a 160, 60 a 140, 70 a 120, 75 a 110, 80 a 105, ó 90 a 95 nm.
Preferiblemente, están recubiertas con una capa de anticuerpos. En
particular dicha capa se puede considerar una monocapa con un
espesor de aproximadamente 5 nm. La capa puede ser "completa"
(partículas saturadas con anticuerpos) o, más preferiblemente
"incompleta" (es decir, se usan menos anticuerpos de los que
podría proporcionar la capacidad de unión de la partícula).
En una realización adicional preferida, dichas
nanopartículas recubiertas se recubren de forma incompleta con
aproximadamente del 5% al 35%, en particular del 10% al 30% ó del
15% al 25% de anticuerpo aviar o del 10% al 30% ó del 15% al 25% de
anticuerpo en general por peso total del conjugado de
nanopartículas-anticuerpos.
En una realización adicional preferida, las
nanopartículas se recubren con una mezcla de anticuerpo y proteína
inerte, preferiblemente hidrófila. Por ejemplo del 20% al 90%, y más
preferido del 35% al 80%, e incluso más preferido del 40% al 70% de
la proteína total unida a la superficie de las nanopartículas está
constituido por el anticuerpo anti-Cistatina C.
Dichas partículas preferiblemente llevan anticuerpos en una cantidad
que es menor que la cantidad de anticuerpos que en teoría se pueden
unir a las partículas de acuerdo con la capacidad de unión de
dichas partículas no recubiertas. Al mismo tiempo, las áreas de la
superficie de la partícula no recubierta por moléculas de anticuerpo
están saturadas con proteína inerte, preferiblemente hidrófila.
En una realización preferida, dichas
nanopartículas originales, no recubiertas, están hechas
esencialmente de látex, poliestireno, cloruro de polivinilo, resina
epoxy, cloruro de polivinilideno, metacrilato de
poli-alfa-naftilo,
polivinilnaftaleno, y copolímeros correspondientes de los mismos.
Otros materiales de partículas adecuados están disponibles en la
técnica y un lector experto, guiado por la enseñanza de la
invención, estará en posición de hacer una selección apropiada.
De acuerdo con una realización adicional del
procedimiento reivindicado, el cambio de turbidez se mide a través
del cambio en la absorbancia de luz de dicha mezcla del ensayo a una
longitud de onda en el intervalo entre 500 y 600 nm,
preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 10 a 50 grados
Celsius, y preferiblemente después de un periodo de 30 a 600
segundos, como por ejemplo 40, 120, 260 ó 600 segundos de tiempo de
reacción.
La presente invención también proporciona
procedimientos de inmunoensayo turbidimétrico para medir Cistatina
C en una muestra líquida corporal o una muestra derivada de un
líquido corporal, caracterizado por formar una mezcla del ensayo
poniendo en contacto dicha muestra líquida que contienen Cistatina
C, o una muestra derivada de un liquido de contiene Cistatina C o
una dilución de una muestra que contiene Cistatina C, con
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
anti-Cistatina C monoclonales o policlonales unidos
a nanopartículas, para unirse a dicha, y evaluar el contenido de
Cistatina C midiendo el cambio en la turbidez de la mezcla, y
además la turbidez se caracteriza por un cambio en la absorbancia de
luz de dicha mezcla del ensayo de una longitud de onda dada, si la
mezcla se mantiene durante un periodo de tiempo dado a una
temperatura dada después de formar dicha mezcla con nanopartículas
recubiertas de cierto tamaño mínimo, como se indica en la Tabla A
siguiente.
A modo de ejemplo, las velocidades más altas del
cambio de absorbancia son aproximadamente 4 veces, preferiblemente
aproximadamente 2 ó 3 veces más altas que los niveles más altos
arriba mencionados, como se observa para cada una de las afecciones
dadas de la prueba.
A modo de ejemplo, se pueden obtener los
siguientes valores:
37 grados Celsius, 260 segundos, diámetro medio
92 nm;
32 grados Celsius, 600 segundos, diámetro medio
92 nm;
Un procedimiento adicional preferido de acuerdo
con la invención se caracteriza por que, cuando se construye una
curva de correlación contra procedimientos nefelométricos, se
obtiene un valor de ordenada en el origen de menos de 0,15 mg/l,
preferiblemente menos de 0,1 e incluso más preferido menos de 0,05
mg/l de Cistatina para el procedimiento turbidimétrico para un
valor correspondiente de 0 mg/l de Cistatina C, como se obtiene por
medio del procedimiento nefelométrico.
Un procedimiento adicional preferido de acuerdo
con la invención se caracteriza por que, cuando se construye una
curva de correlación contra procedimientos de inmunoensayo no
homogéneos, se obtiene un valor de ordenada en el origen de menos
de 0,25 mg/l, preferiblemente menos de 0,15 e incluso más preferido
menos de 0,5 mg/l de Cistatina para un valor correspondiente de 0
mg/l de Cistatina C.
Un procedimiento adicional preferido de acuerdo
con la invención se caracteriza por tener una interferencia de 15
mmol/litro de triglicéridos en la muestra experimental de menos del
6%, preferiblemente menos del 4% o incluso más preferido menos del
2% sobre el valor medido de Cistatina C a un nivel de 1,2 mg de
Cistatina C por litro.
Un procedimiento adicional preferido de acuerdo
con la invención se caracteriza por tener una desviación de
linealidad por debajo del 5%, preferiblemente por debajo del 4% o
más preferido por debajo del 3% en un intervalo de medición de 1,32
a 7,5 mg de Cistatina C por litro, y/o una desviación de linealidad
por debajo del 15%, preferiblemente por debajo del 11% e incluso
más preferido por debajo del 7% en la región de medición del
intervalo de medición de 0,75 a 1,32 mg de Cistatina C por
litro.
Un procedimiento adicional preferido de acuerdo
con la invención se caracteriza por determinar la concentración de
Cistatina C de una muestra midiendo la velocidad inicial del aumento
de la absorbancia, (a) registrando directamente en el momento de la
mezcla, o (b) registrando brevemente después de mezclar en
combinación con una extrapolación hacia atrás a la absorbancia de
aumento inicial, o (c) midiendo la diferencia de absorbancia entre
dos o más momentos de tiempo menos de 1 minuto después de mezclar la
muestra y los reactivos.
Un aspecto adicional de la invención proporciona
un procedimiento para la evaluación de la velocidad de filtración
glomerular de un mamífero, comprendiendo dicho procedimiento la
evaluación turbidimétrica de Cistatina C humana de acuerdo con un
procedimiento como se define anteriormente. Dicho procedimiento se
puede aplicar en particular durante el diagnóstico o terapia de
disfunciones renales (como fallo o insuficiencia renal) o
enfermedades o afecciones asociadas a éstas.
Todavía otro aspecto de la invención se refiere
a un kit de reactivos o kit de partes, o conjunto de reactivos para
la realización del procedimiento como se define anteriormente, que
comprende (a) partículas, que comprenden inmunopartículas de
anti-Cistatina C como se define anteriormente en
forma seca o suspendida, (b) un tampón de ensayo en forma seca o
disuelta, y, de forma opcional, (c) mezcla(s) de calibrador y
mezcla(s) de control cada una en forma seca o disuelta o
suspendida.
Preferiblemente, la partícula y el tampón de
ensayo se proporcionan en combinación con forma seca o
suspendida.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, a
continuación se proporcionan conjugados de
nanopartículas-anticuerpos de acuerdo con la
definición anterior y la descripción más detallada.
La presente invención se refiere al uso de tales
conjugados de nanopartículas-anticuerpos en un
inmunoensayo para la evaluación de Cistatina C humana o en un
procedimiento de diagnóstico para la evaluación de la velocidad de
filtración glomerular de un mamífero.
Finalmente, la presente invención se refiere al
uso de tales conjugados de
nanopartículas-anticuerpos en un inmunoensayo para
la evaluación de Cistatina C humana o en un procedimiento de
diagnóstico para la evaluación de disfunción renal, como por ejemplo
fallo o insuficiencia renal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos policlonales de Cistatina c
anti-humana se pueden preparar por medio de
procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como los
descritos por ejemplo por Chase, M. W., 1967, en "Methods of
Immunology and Immunochemistry", ed. Williams, A. y col., M. W.,
pág. 197-209, Academic Press, Nueva York. En
resumen, animales de una especie adecuada (por ejemplo conejos,
cabras, u ovejas, o, preferiblemente, especies aviares, en
particular aves de corral, como gallinas) se inmunizan de forma
repetida con antígeno purificado en un adyuvante apropiado, por
ejemplo adyuvante completo o incompleto de Freund. Después de la
inmunización se extrae sangre de los animales y los anticuerpos
policlonales se purifican por medio de procedimientos tales como
por ejemplo precipitación de sulfato de amonio o cloruro de amonio,
cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía por
inmunoafinidad, y/o cromatografía por afinidad.
\newpage
Para conseguir una señal turbidimétrica
suficiente, se prefieren los anticuerpos de alta avidez. Como los
anticuerpos policlonales comprenden muchas moléculas de anticuerpos
diferentes, no se puede calcular una constante de afinidad, sin
embargo, se obtuvo avidez y afinidad elevadas por medio de técnicas
de anticuerpos policlonales convencionales. Se usaron anticuerpos
de conejo obtenidos por procedimientos convencionales, sin embargo,
se obtuvieron resultados incluso mejores con anticuerpos de oveja.
Se obtuvieron resultados incluso mucho mejores con anticuerpos de
aves. Los anticuerpos aviares pueden ser de acuerdo con los
procedimientos descritos en Larsson A, Baaloew R-M,
Lindahl T, y Forsberg P-O en Poultry Science 72:
1807-1812, 1993. Se contempla que siendo las aves
genéticamente más distintas que los humanos, son capaces de generar
anticuerpos hacia Cistatina C humana que tienen una avidez más alta
que los anticuerpos policlonales de mamíferos.
Los anticuerpos policlonales aviares se obtienen
de forma rutinaria a partir de yema de huevo (y por lo tanto se
denominan IgYs). Sin embargo, la yema de huevo contiene grandes
cantidades de lípidos lo que hace que su uso adicional sea
problemático. IgY se puede aislar de yema de huevo usando sulfato de
amonio por etapas (por ejemplo del 25% al 40%) y precipitación de
polietilenglicol (PEG). Para la purificación adicional, también se
pueden emplear kits de purificación de IgY comerciales que se pueden
obtener de Gallus Immunotech Inc, Cary, EE.UU., o el kit de
purificación de IgY Eggcellent Chicken, que se puede obtener de
Pierce, Rockford, EE.UU. teniendo en cuenta las instrucciones del
fabricante.
Además, la avidez de los anticuerpos
policlonales se puede aumentar adicionalmente por medio del uso de
anticuerpos que se purificaron por medio del uso de procedimientos
de purificación por afinidad con antígenos, por ejemplo de acuerdo
con la enseñanza en "Affinity Purification of Proteins"
descargada de www.piercenet.com (abril 2006) e incorporada mediante
referencia. A continuación se describe en más detalle la
purificación por afinidad.
La avidez aumentada se observó en particular
cuando el 20% de los anticuerpos usados se habían purificado por
afinidad con antígeno, incluso se observó más aumento cuando el 50%
de los anticuerpos se habían purificado por afinidad con antígeno e
incluso más cuando más del 75%, como del 75% al 100% de los
anticuerpos se habían obtenido por medio de procedimientos de
purificación por afinidad con antígenos.
Para la purificación por afinidad de anticuerpos
policlonales de Cistatina C anti-humana aviar se
tiene que preparar una columna de afinidad de Cistatina C humana
adecuada. La Cistatina C humana purificada se fija por medio de un
protocolo convencional a soportes sólidos adecuados, como por
ejemplo son Sepharose o Affi-gel, se activa de
forma covalente el antígeno al soporte (los soportes sólidos
activados adecuados están disponibles por ejemplo en Pierce,
Rockford, EE.UU.). Después se prepara una columna de afinidad a
partir de dicha resina que lleva antígenos.
La purificación por afinidad exitosa de
anticuerpos depende de la presentación eficaz de los epitopes
relevantes en el antígeno a sitios de unión del anticuerpo. Si el
antígeno es pequeño y se inmoviliza directamente a una superficie
de soporte sólido por medio de múltiples enlaces químicos, los
epitopes importantes pueden estar bloqueados o con impedimento
estérico, prohibiendo la unión eficaz del anticuerpo. Por lo tanto,
es mejor inmovilizar antígenos usando un único grupo funcional (por
ejemplo, sulfidrilo en una sola cisteína terminal en un péptido) y
usar un soporte activado cuyos grupos de reacción se produzcan en
brazos espaciadores que tienen varios átomos de longitud. Para
antígenos más grandes, en especial aquellos con múltiples sitios de
inmovilización, la longitud del brazo espaciador adquiere menos
importancia ya que el propio antígeno sirve de espaciador eficaz
entre la matriz del soporte y el epitope.
Normalmente existe una pequeña variación entre
las condiciones típicas de unión y elución para la purificación por
afinidad de anticuerpos, ya que en el núcleo de cada procedimiento
está la afinidad de un anticuerpo por su antígeno respectivo. Como
los anticuerpos están diseñados para reconocer y unir antígenos
fuertemente en condiciones fisiológicas, la mayor parte de los
procedimientos de purificación usan condiciones de unión que imitan
el pH fisiológico y la fuerza iónica. Los tampones de unión más
comunes son solución salina tamponada con fosfato (PBS) y solución
salina tamponada con Tris (TBS) a pH 7,2 y NaCl 1,5 M (los paquetes
de tampones premezclados están disponibles, por ejemplo, de Pierce,
Rockford, EE.UU.). Una vez que el anticuerpo se ha unido a un
antígeno inmovilizado, el tampón de unión adicional se usa para
lavar material no unido del soporte. Para minimizar la unión no
específica, el tampón de lavado puede contener sal o detergente
adicional para interrumpir cualquier interacción débil.
Los anticuerpos purificados específicos se
eluyen a partir de una resina de afinidad por medio de la alteración
del pH y/o fuerza iónica del tampón (los tampones de elución
comunes están disponibles por ejemplo de Pierce, Rockford, EE.UU.).
Los anticuerpos, en general, son proteínas flexibles que toleran un
intervalo de pH de 2,5 a 11,5 con pérdida mínima de actividad, y
ésta es con diferencia la estrategia de elución más común. En
algunos casos la interacción anticuerpo-antígeno no
se interrumpe de forma eficaz por los cambios de pH o se daña con el
pH, requiriendo que se emplee una estrategia alternativa.
A continuación se proporciona un ejemplo de
protocolo de purificación por afinidad:
Etapa 1: Lavar la columna (\sim1 ml de lecho
de resina) para eliminar la proteína residual antes de cada uso
usando 10 volúmenes de columna de la siguiente secuencia de
tampones:
glicina 0,2 M, pH 2,8, -10 ml
NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5, NaCl 0,5 M -10 ml
Repetir el ciclo con los tampones anteriores dos
veces. Después equilibrar la columna en tampón TTBS (NaCl 0,3 M,
Tris/CI 20 mM, pH 7,8, Tween-20 al 0,1% (v/v) y
NaN_{3} al 0,01%) que contiene NaCl ajustado a 0,5 M.
Etapa 2: Añadir alícuota de 10 ml de la
preparación del anticuerpo en bruto, 1 ml de 10 x TTBS y 0,55 ml de
NaCl 4 M. Centrifugar la mezcla hasta eliminar cualquier
precipitado.
Etapa 3: Absorber el anticuerpo por lotes por
medio de la transferencia de la resina de afinidad al tubo (un tubo
de 15 ml) con el suero. Incubar en la habitación fría. De forma
alternativa, se puede aplicar el suero a la columna usando una
velocidad de flujo lenta. De forma manual se obtienen las fracciones
recogidas. Recoger la fase que pasa a través de la columna y volver
a aplicarla por segunda vez usando una velocidad de flujo lenta.
Etapa 4: Lavar la columna exhaustivamente con
0,5 M TTBS+NaCl hasta que A_{280} es menos de 0,02. Recoger
fracciones de 10 ml de los lavados y comprobar A_{280} de las
fracciones.
Etapa 5: Eluir el anticuerpo usando glicina 0,2
M, pH 2,8, que contiene NaN_{3} al 0,02%. Eluir usando alícuotas
de 1 ml de tampón. Recoger fracciones en 1,5 ml de tubo de
microcentrífuga que contiene 50 ml de Tris 1 M, pH 8,5. Esto
neutraliza el tampón de elución ácida poco después de que se eluya
la proteína. Recoger al menos 10 fracciones. Por lo general esto es
suficiente para eliminar el anticuerpo. Leer A_{280} de cada
fracción usando un blanco apropiado (es decir, 1 ml de tampón
glicina más 50 ml de Tris 1 M).
Etapa 6: Reunir las fracciones apropiadas.
Conseguir un A_{280} de las reserves y almacenar los anticuerpos a
4ºC o considerar la congelación (-70ºC) en alícuotas en presencia de
glicerol al 50%.
Etapa 7: Lavar la columna por medio de lavado
exhaustivo con el tampón de 0,2 M glicina, pH 2,8, seguido de
TTBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos policlonales son con frecuencia
más preferidos que los anticuerpos monoclonales en ensayos
turbidimétricos potenciados por partículas. Los anticuerpos
policlonales son inherentemente reactivos a muchos epitopes
diferentes en los antígenos (o analitos) (contrario a monoclonales),
y por lo tanto más fácil de crear uniones entrecruzadas y retículos
entre las moléculas de antígenos per se, y entre los
antígenos y las partículas a las que se inmovilizan los
anticuerpos. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales
generalmente se unen a un tipo de epitopes solamente, lo que hace
más difícil formar uniones entrecruzadas y retículos. Con
frecuencia la industria del diagnóstico prefiere, sin embargo, el
uso de anticuerpos monoclonales, ya que son más fáciles de
normalizar y de controlar la calidad a un patrón predefinido, en
especial sobre la vida de un producto de muchos años Por lo tanto,
existen buenos ejemplos sobre el uso de anticuerpos monoclonales
para inmunoensayos turbidimétricos potenciados por partículas, en
especial cuando existen características antigénicas que favorecen
el uso de anticuerpos monoclonales. Eda y col. en "Development of
a New Microparticle-Enhanced Turbidimetric Assay
for C-reactive protein With Superior features in
Analytical Sensitivity and Dynamic range", J. Clin. Lab.
Analysis, 12: 137-144 (1998) describe el uso de dos
anticuerpos monoclonales diferentes y dos micro partículas
diferentes. CRP es especialmente favorable para el uso de
monoclonales, ya que la molécula CRP es un pentámero de subunidades
idénticas, y por lo tanto lleva cinco replicados de todos los
epitopes (Pepys M B y col., Adv. Immunol. 34:
141-212 (1983)), lo que hace mucho más fácil el uso
de anticuerpos monoclonales. Sin embargo, con las proteínas
monoméricas y más pequeñas como Cistatina C, se pueden usar cócteles
de diferentes anticuerpos monoclonales en realizaciones especiales
de las presentes invenciones. Los cócteles de anticuerpos
monoclonales diferentes, en especial cuando están compuestos por
muchos anticuerpos monoclonales diferentes con elevada afinidad a
Cistatina C, darán como resultado buenas realizaciones de la
presente invención de inmunoensayos de Cistatina C.
Los anticuerpos monoclonales de Cistatina C
anti-humana también se pueden preparar por medio de
procedimientos bien conocidos en la técnica, como por ejemplo los
descritos por G. Köhler y col., 1975, Nature 256, 495, G. Galfre y
col., 1981, Meth. Enzymol. 73, 3-46, o R. Kennet,
1980, en: "Hybridomas: a new dimension in biological
analysis", ed. R. Kennet y col., Plenum press, Nueva York y
Londres. Las células del bazo o células de sangre periférica de
ratones o ratas inmunizadas se condensan con una línea celular de
mieloma, usando por ejemplo el procedimiento de condensación con
polietileno. Después de la condensación, las células se cultivan en
condiciones adecuadas, por ejemplo sobre placas de cultivo y se
realiza una selección de células correctamente condensadas usando
por ejemplo el procedimiento de selección de
hipoxantina/aminopterina/timidina (abreviadamente en inglés HAT).
Las líneas celulares que producen anticuerpos se identifican por
medio de procedimientos tales como EIA, RIA o ensayos de
aglutinación. Después de la identificación de la línea celular que
produce anticuerpos, las células se subclonan de forma repetida,
como por ejemplo por medio del procedimiento de dilución limitada,
para garantizar que la nueva línea celular que se cultiva procede de
una sola célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos quiméricos de Cistatina C
anti-humana se pueden obtener por medio de
procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como el descrito
por G. L. Boulianne y col., 1984, Nature 312,
643-645. El procedimiento se puede describir
brevemente como sigue. El ADN del sitio de unión al antígeno de un
anticuerpo monoclonal de una especie o partes de la misma se
transfieren al ADN del marco del anticuerpo de otro anticuerpo de
una especie diferente. Esta nueva construcción se clona en un
vector de expresión, que se transfiere al sistema de expresión
correspondiente para producir el anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los Anticuerpos recombinantes de Cistatina C
anti-humana se pueden obtener sin usar vehículos
animales por medio de procedimientos conocidos en la técnica, tales
como los descritos por G. Winter y col., 1991, Nature, 349, 293 o
J. S. Huston y col., 1988, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 85, 5879.
Dichos procedimientos implican las siguientes etapas: introducción
de AND (ADNc o AND sintético) que codifica un anticuerpo o
fragmentos de los mismos en una célula hospedadora, por ejemplo,
E. coli, hongos, levadura, células eucarióticas o vegetales,
selección de anticuerpos con la especificidad y afinidad deseadas y
expresar el anticuerpo o fragmentos del mismo en el sistema de
expresión correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los fragmentos Fab, Fab', y F(ab')_{2}
de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales de cualquier
especie (incluyendo anticuerpos quiméricos y/o anticuerpos
recombinantes) se pueden preparar por medio de procedimientos bien
conocidos en la técnica, tales como los descritos por ejemplo por A.
Nissonoffet y col., 1960, Arch Biochem Biophys, 89, 230, o R. P.
Porter, 1959, Biochem J, 73, 119, o E. Harlow y col., 1988, en
"Antibodies-A Laboratory Manual",
626-631, Cold Spring Harbour Press, Nueva York,
EE.UU.
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se usan anticuerpos monoclonales o
fragmentos de los mismos como agentes de unión, la selección de
anticuerpos diferente, en particular, reactividad alta o baja, se
puede realizar de forma conveniente recubriendo cada uno de los
anticuerpos monoclonales por separado con nanopartículas del mismo
material y tamaño por medio de técnicas de recubrimiento
convencionales, seguido de mezclar los reactivos de nanopartículas
en una relación dada, por ejemplo 1/1 v/v, de una forma permutativa
con el analito. Después de generar curvas de calibración del
reactivo de nanopartículas bajo las mismas condiciones, las
pendientes de las curvas de calibración resultantes para
concentraciones bajas de analito, proporciona una primera indicación
de la reactividad de los agentes de unión inmunológica.
Cuando se usan anticuerpos policlonales como
agentes de unión, se puede llevar a cabo la preparación de
anticuerpos policlonales de alta y baja reactividad de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica, introduciendo los
anticuerpos policlonales en una columna de cromatografía por
afinidad, que lleva el analito antigénico unido de forma covalente
a la matriz del gel. Con un gradiente de tampón de elución, las
fracciones de anticuerpos policlonales con baja reactividad eluirán
en primer lugar de la columna, seguido de fracciones con reactividad
cada vez más alta. (Véase S. Yamamoto y col., 1993, "Veterinary
Immunology and Immunopathology" 36, 257-264,
Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam). La reactividad de las
fracciones se puede comprobar después con un instrumento BIAcore o
recubriéndolos de forma independiente con nanopartículas del mismo
tamaño y material y generando las curvas de calibración
correspondientes.
La selección de anticuerpos se puede realizar
por medio del procedimiento arriba mencionado de recubrirlos con
nanopartículas seguido de un análisis de límite de detección o una
determinación de su afinidad funcional, como se describe
anteriormente. En caso apropiado, las mezclas de anticuerpos
diferentes de Cistatina C anti-humana que difieren
con respecto a su afinidad/avidez frente a Cistatina C humana se
pueden usar para preparar conjugados de
nanopartículas-anticuerpos de la presente invención.
Las relaciones de mezcla adecuadas se pueden determinar por parte
de un experto de la técnica por medio de una serie limitada de
experimentos.
Los anticuerpos adecuados de Cistatina C
anti-humana también se encuentran disponibles en el
mercado a partir de fuentes diferentes. Por ejemplo, HyTest,
Finlandia, ofrece un conjunto de anticuerpos de Cistatina C
anti-humana de afinidad alta que reconoce
diferentes epitopes del antígeno. Estos anticuerpos se preparan de
forma convencional por medio de la inmunización de ratones Balb/c
con Cistatina C purificada a partir de orina humana y de la
producción de hibridomas por medio de la condensación con la línea
celular del hibridoma Sp2/0. Los anticuerpos producidos por los
clones seleccionados se purificaron por medio de cromatografía de
afinidad con proteína A. Los siguientes mAb están disponibles en la
actualidad de HyTest: Cyst10, Cyst13, Cyst16, Cyst18, Cyst19,
Cyst23, Cyst24, y Cyst28. Otros suministradores de anticuerpos mono
o policlonales de Cistatina C anti-humana
disponibles en el mercado son: Fusion, Irlanda del Norte; BioVendor,
República Checa, AB Location, Alemania; Advanced Immunichemical,
EE.UU.; Abcam, R.U.; Axxora, R.U.; Biodesign, EE.UU.; R&D
Systems, EE.UU.; AbD Serotec, Noruega; Strategic Biosolutions,
EE.UU. Todos los anticuerpos de Cistatina C
anti-humana de dichas Fuentes pueden, en principio,
usarse solos o en combinación para realizar la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El material para preparar las nanopartículas de
la invención puede ser cualquier material natural o sintético,
orgánico, inorgánico, polimérico, no polimérico, adecuado para
generar y realizar ensayos de dispersión de la luz potenciados por
partículas. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, selenio,
carbono, oro, nitruros de carbono, silicio o germanio, por ejemplo,
Si_{3}N_{4}; óxidos de hierro, titanio o silicio, por ejemplo
TiO_{2} ó SiO_{2}; y materiales poliméricos tales como, por
ejemplo, látex, poliestireno, cloruro de polivinilo, resinas epoxy,
cloruro de polivinilideno, metacrilato de
poli-alfa-naftilo,
polivinilnaftaleno, o copolímeros de los mismos, en particular
copolímeros de estireno y un compuesto etilénicamente insaturado
copolimerizable, por ejemplo copolímeros de
estireno-metacrilato. También son adecuadas las
partículas hechas de materiales poliméricos, así como partículas
con recubrimiento central que están constituidas por un núcleo
interior polimerizado a partir de estireno y un recubrimiento
exterior formado por copolimerización a partir de estireno con un
compuesto etilénicamente insaturado copolimerizable, como se
describe por ejemplo en la patente de EE.UU. nº. 4.210.723.
Las partículas poliméricas adecuadas para
conjugación se pueden comprar en Bangs Particles Inc. o Interfacial
Dynamics Inc, Merck SA, Francia, u otras fuentes adecuadas. Las
partículas se pueden activar para unirse a anticuerpos de acuerdo
con numerosos procedimientos, una enseñanza minuciosa de dicha
química de acoplamiento se puede encontrar, por ejemplo, en
TechNote 205, Rev. 003, por ejemplo marzo, 2002, "Covalent
Coupling" que se puede descargar del sitio web de Bangs
Laboratories, Inc. Por ejemplo, el acoplamiento se puede conseguir
por medio de partículas que llevan en la superficie grupos
carboxilo, amino, hidroxilo, hidracida o clorometilo. La molécula
que se acopla se puede hacer reaccionar directamente con dichos
grupos o por medio de un enlace adecuado, como por ejemplo
carbodiimidas, glutaraldehído, o bromuro de cianógeno.
El recubrimiento de las partículas de acuerdo
con esta invención preferiblemente tiene que comprender anticuerpos
con afinidades altas a Cistatina C, en combinación con un núcleo de
nanopartículas de cierto tamaño para generar una señal
turbidimétrica suficiente. De forma típica las nanopartículas que
comprenden el recubrimiento de material proteináceo están entre 58
y 200 nm, más preferido entre 65 y 150 nm, e incluso más preferido
entre 80 y 135 nm.
En una realización particular de la invención,
el diámetro medio de las partículas no recubiertas es
aproximadamente 80 nm. Usando estas partículas, después del
recubrimiento tienen de forma típica de 90 nm a 100 nm nanómetros
de diámetro. Como regla general, una monocapa de anticuerpos tiene
aproximadamente 5 nm de espesor, de tal forma que se considera que
dichas partículas llevan una monocapa de anticuerpos.
Estas partículas tendrán un rendimiento bueno
cuando del 5% al 35% del peso total en seco de las partículas
conjugadas está constituido por anticuerpos, mejor rendimiento del
10% al 30%, y rendimiento óptimo cuando del 15% al 25% del peso
total en seco de las partículas conjugadas está constituido por
anticuerpos.
Si se usan partículas ligeramente más grandes,
estos valores de porcentaje óptimo disminuyen. A modo de ejemplo,
si se usan 95 nm de partículas en bruto, de forma típica acabarán
teniendo 110 nm de diámetro medio si se recubren. Entonces, los
porcentajes correspondientes son del 4% al 32%, del 8% al 26%, y,
para rendimiento óptimo, del 12% al 22% (porcentaje del peso total
en seco de las partículas conjugadas constituidas por anticuerpos).
Sin embargo, con estas partículas ligeramente más grandes (en el
sentido de partículas con más peso) se tienen que usar más
partículas en el ensayo para tener capacidad de unión suficiente
para crear una curva de calibración sin un aplanamiento de la curva
en una concentración más alta de Cistatina C (la curva de
calibración del ensayo debe tener un buen intervalo dinámico de
hasta más de 8 \mug de Cistatina C por \mul de muestra), lo que
lleva a un fondo de absorción mucho más elevado (partículas más
grandes y más partículas), y una relación de señal a ruido más
baja.
Por otra parte, las partículas más pequeñas
tendrán un porcentaje de anticuerpos óptimo más alto en las
inmunopartículas recubiertas. Por ejemplo, si se usan partículas no
recubiertas de un tamaño de 70 nm, el diámetro medio de las
partículas recubiertas es de forma típica 80 nm, y una proporción
del 18% al 30% de anticuerpos del peso total en seco de las
partículas conjugadas dará como resultado porcentajes óptimos, y
menos óptimas son las proporciones del 12% al 36%, e incluso menos
óptimas son las proporciones del 4% al 42% de anticuerpos. Sin
embargo, con estas partículas ligeramente más pequeñas, se tienen
que usar menos partículas (en el sentido de partículas con menos
peso) en el ensayo para crear una curva de calibración
suficientemente inclinada en concentraciones más bajas, es decir,
por debajo de 1 \mug de Cistatina C por \mul de la muestra, y la
señal será más baja y también más vulnerable al ruido de fondo.
En base a la explicación anterior el lector
experto será capaz de proporcionar, guiado por la enseñanza de la
presente invención, preparaciones de inmunopartículas óptimas para
diferentes condiciones de ensayo.
El recubrimiento de los anticuerpos de Cistatina
C anti-humana con las nanopartículas se puede
realizar de forma adsorbente o covalente de acuerdo con los
procedimientos bien conocidos en la técnica, que reúnen las
propiedades del material usado.
De acuerdo con una realización preferida, las
mezclas de una o más proteínas inertes hidrófilas con los
anticuerpos anti-Cistatina C deberían estar
presentes durante la conjugación/unión de los anticuerpos a las
nanopartículas. Los inventores han observado de forma sorprendente
que se obtienen resultados óptimos con partículas hidrófilas con
una capacidad de unión alta cuando los anticuerpos se conjugan a las
partículas junto con proteínas hidrófilas que tienen valores de pl
cercanos al pH de la conjugación. Se obtuvieron mejores resultados
cuando estaban presentes transferrina y albúmina bovina durante la
conjugación. Sin embargo, también se pueden mezclar otras proteínas
inertes con los anticuerpos durante la conjugación. Los ejemplos no
limitantes para tales proteínas inertes, hidrófilas, son
hemocianina de lapa, haptoglobina y otras proteínas solubles
residuales, sin afinidad por los anticuerpos ni por la Cistatina
C.
Durante el proceso de acoplamiento las
condiciones son o deberían ser, o si es necesario deberían adaptarse
a ser, de tal forma que los anticuerpos son más reactivos con el
material del núcleo de las nanopartículas que la proteína inerte de
tal forma que se unirán de forma más o menos cuantitativa al núcleo.
Las porciones reactivas residuales de la superficie de
nanopartículas estarán bloqueadas por la proteína inerte.
Los presentes inventores observaron, como regla
general, que en una primera etapa las partes hidrófobas de los
anticuerpos parecen unirse físicamente a las partículas, y así la
molécula entera se administra a los grupos reactivos, como por
ejemplo, clorometilo, en la superficie de las partículas, que se
hace reaccionar después con los grupos correspondientes, como por
ejemplo amina, de la molécula de la proteína. Debido a esta
absorción física, las moléculas grandes de anticuerpos compiten de
manera sorprendente bien con las proteínas hidrófilas, inertes, más
pequeñas, como albúmina y transferrina. Sin embargo, como se usan
menos anticuerpos que la capacidad de unión de las partículas, las
proteínas inertes, como albúminas y transferrinas, se hacen
reaccionar con lo que se deje reaccionar en la superficie de las
partículas y después se obtienen las partículas de la presente
invención, que tienen una buena superficie hidrófila y una buena
capacidad de unión a los anticuerpos al mismo tiempo, y una
proporción apropiada de material de nanopartículas que puede generar
una buena señal.
La adaptación de condiciones adecuadas a cada
variante del procedimiento de recubrimiento es, guiado por la
enseñanza que se proporciona en la presente memoria descriptiva, una
rutina para el experto en la materia.
Por ejemplo, para acoplar un pH se puede elegir
media unidad por encima del pl del anticuerpo cuando se usan
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales tienen un pl
bastante diverso, y por eso con los anticuerpos policlonales se usa
preferiblemente pH de 8,8.
En una realización preferida, en base al
contenido total de proteínas de la mezcla de la reacción de
acoplamiento, aproximadamente del 3% al 70% en peso, o incluso más
preferido del 5% al 40% en peso de la proteína presente durante la
conjugación debería estar constituido por los anticuerpos anti
Cistatina C.
Como los anticuerpos tienen, según se ha
explicado anteriormente, una velocidad de unión a las partículas
más alta que las proteínas inertes hidrófilas, la relación de
proteína de anticuerpo a proteína total unida a la superficie de
las partículas será mucho más alta; por ejemplo del 20% al 90%, y
más preferido del 35% al 80%, e incluso más preferido 40% al 70% de
la proteína total unida a la superficie de las partículas están
constituidas por los anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un
inmunoensayo turbidimétrico de Cistatina C con una relación señal a
ruido mucho más fuerte que en la técnica anterior. Se obtiene una
señal de agregación sorprendentemente alta eligiendo partículas
grandes con recubrimiento de proteínas y núcleo, preferiblemente de
un cierto tamaño mínimo, en combinación con anticuerpos purificados
por afinidad con antígeno. Se obtuvo una señal turbidimétrica fuerte
debido a un efecto sinérgico sorprendente entre el índice
refractario de las partículas en comparación con el tampón de
ensayo, y la alta afinidad (o avidez) de los anticuerpos altamente
purificados. La señal turbidimétrica fuerte llevó a una
consistencia más alta para interferir sustancias, por ejemplo
triglicéridos, y una linealidad mejor que en la técnica anterior de
inmunoensayos turbidimétricos de Cistatina C.
El factor crítico de un inmunoensayo homogéneo
es la señal generada por unidad de masa por volumen de mezcla de
ensayo. La mezcla de ensayo es la mezcla obtenida cuando se han
añadido todos los reactivos y la muestra. Por ejemplo, si se va a
analizar una muestra de 3 \mul, y dicha muestra contiene 1 mg/l de
Cistatina C, y el volumen final después de mezclar todos los
reactivos y muestra es 300 \mul, la concentración de Cistatina C
en la mezcla de ensayo final es 10 \mug/l. Si la concentración del
analito en la muestra es baja, esto se puede compensar con
frecuencia usando una muestra más grande en comparación con el
volumen de la mezcla de ensayo, por ejemplo aumentando la muestra a
6 \mul en un volumen de la mezcla de ensayo de 300 \mul.
Existen diversos obstáculos para aumentar el volumen de la muestra.
En primer lugar, la concentración de todas las sustancias
interferentes que podrían estar en la muestra se aumenta en la
mezcla de ensayo. En segundo lugar, aumenta la necesidad de los
anticuerpos de superar el efecto gancho crítico (es decir, curva
dosis/respuesta con pendiente negativa), lo que a su vez, aumenta
los costes de anticuerpos del ensayo de forma correspondiente.
Por lo tanto, existe una necesidad de obtener
ensayos con consistencia y fuerza de señal buena a una concentración
baja de la mezcla de ensayo del analito y un correspondiente
volumen bajo de la muestra. El aumento del volumen de la muestra en
inmunoensayos homogéneos lleva a ensayos con más interferencias y
más costosos.
La presente invención proporciona un aumento
sorprendente en la fuerza de la señal, consistencia y linealidad de
los inmunoensayos turbidimétricos de Cistatina C. La presente
invención también tiene menos interferencia de lípidos tales como
triglicéridos. Se consiguió después comprender las insuficiencias de
la técnica anterior, estando basada en una fuerza de la señal
demasiado baja en la señal turbidimétrica por unidad de masa de
analito y proporciona un procedimiento con mejor precisión,
linealidad y menos interferencia que los procedimientos
turbidimétricos de la técnica anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la presente invención se
proporcionan procedimientos de inmunoensayos turbidimétricos
mejorados para medir Cistatina C en una muestra líquida corporal o
una muestra derivada de un líquido corporal, que están
caracterizados por:
Formar una mezcla de ensayo poniendo en contacto
dicha muestra líquida que contiene Cistatina C, o una muestra
derivada de un líquido que contiene Cistatina C o una dilución de
una muestra que contiene Cistatina C, con anticuerpos, o fragmentos
de anticuerpos, policlonales anti-Cistatina C unidos
a nanopartículas, para unir dicha Cistatina C, y
evaluar el contenido en Cistatina C midiendo el
cambio en turbidez de la mezcla, y la turbidez se caracteriza
adicionalmente por una cambio en la absorbancia de luz dicha mezcla
de una longitud de onda 546 nm de
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 75 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla, y el procedimiento
se caracteriza adicionalmente porque el diámetro medio de dichos
conjugados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, policlonales
anti-Cistatina C unidos a nanopartículas es más de
58 nm.
Esto es especialmente beneficioso porque una
longitud de onda de 546 nm y 37º Celsius es un modo de procesamiento
típico para muchos analizadores de química clínica automáticos
grandes, como los instrumentos Hitachi, Cobas y Modular de Roche,
Olympus y muchos otros.
La presente invención proporciona adicionalmente
un procedimiento mejorado, caracterizado por un cambio en la
absorbancia de la luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda
de 546 nm de
más de 25 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 55 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 125 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla, lo cual que es
beneficioso por la misma razón.
Y además, la presente invención proporciona un
procedimiento, caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 546 nm de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 85 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 190 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla, lo cual que es
beneficioso por la misma razón.
Varios instrumentos espectrofotométricos
analíticos funcionan a longitudes de onda más bajas. Por lo tanto,
la presente invención proporciona un procedimiento caracterizado por
un cambio en la absorbancia de la luz de dicha mezcla que tiene una
longitud de onda de 505 nm de
más de 20 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 50 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 90 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 505 nm de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 75 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 150 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 505 nm de
más de 40 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 100 unidades/cm de mAb a una
concentración de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo, o de
más de 250 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
Otros instrumentos espectrofotométricos
analíticos funcionan a longitudes de onda más altas.
Por lo tanto, la presente invención también
proporciona un procedimiento caracterizado por un cambio en la
absorbancia de la luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda
de 570 nm de
más de 10 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 80 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 570 nm de
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 45 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 100 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 570 nm de
más de 20 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 55 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 125 unidades/cm de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla.
Existen diversos instrumentos de química clínica
que funcionan a una temperatura inferior a 37º Celsius. Por lo
tanto, la presente invención proporciona un procedimiento
caracterizado por un cambio en la absorbancia de la luz de dicha
mezcla que tiene una longitud de onda de 546 nm de
más de 12 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 25 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 70 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 32º Celsius
durante 600 segundos después de formar la mezcla.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Existe una gran demanda de un procedimiento de
ensayo más rápido y más eficaz, con el fin de aumentar la capacidad
de automatismos de química clínica. Si un ensayo funciona más
rápido, se pueden realizar más ensayos por unidad de tiempo. En
especial si se construyen los instrumentos en modo cinético, un
aumento en la señal fuerte y rápida después de empezar el ensayo es
beneficioso. Por lo tanto, la presente invención proporciona un
procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 546 nm de
más de 8 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 20 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 50 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 120 segundos después de formar la mezcla.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 546 nm de
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 75 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 120 segundos después de formar la mezcla.
Además, la presente invención proporciona un
procedimiento caracterizado por un cambio en la absorbancia de la
luz de dicha mezcla que tiene una longitud de onda de 546 nm de
más de 4 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 7 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 40 segundos después de formar la mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se explica anteriormente, el tamaño de
partículas de las nanopartículas usadas en el ensayo se debe
equilibrar meticulosamente. Las partículas grandes crean una buena
señal, sin embargo el fondo es alto y la capacidad de unión es baja,
de tal forma que se tienen que añadir muchas partículas, creando una
turbidez de fondo alto. Presumiblemente por esta razón principal,
los suministradores anteriores de ensayos, como Dako Cytomation AS,
no han conseguido señales turbidimétricas buenas.
Cuando se siguen las instrucciones que se
proporcionan en el prospecto de Dako Cytomation AS, números de
producto LX002/EFG1CS/25.10.04, S2361/EFG1KGR/09.07.03 y
X0974/EFG/SUM/09.09.04 y en el artículo de Schmidt, Kjoller y
Gronkjaer citados anteriormente, esto dio como resultado un
procedimiento de inmunoensayo turbidimétrico para la Cistatina C,
caracterizado por, a una longitud de onda de 546 nm a 37º Celsius en
260 segundos, un cambio en la absorbancia de
simplemente 9 unidades de mAb a una
concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
simplemente 24 unidades de mAb a una
concentración de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo, y
simplemente 50 unidades de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo.
Estos resultados estaban muy por debajo de los
resultados observados para la presente invención (véase lo
anterior).
Cuando se intenta usar un tiempo de ensayo más
corto (dirigido a lecturas cinéticas), 120 segundos dieron como
resultado un cambio en la absorbancia de
simplemente 6 unidades de mAb a una
concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
simplemente 15 unidades de mAb a una
concentración de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo, y
simplemente 24 unidades de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
que fueron resultados mucho más bajos que los
obtenidos para la presente invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Además, cuando se intenta usar un tiempo de
ensayo incluso más corto (dirigido a lecturas cinéticas), 40
segundos dieron como resultado un cambio en la absorbancia de
simplemente 3 unidades de mAb a una
concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
simplemente 6 unidades de mAb a una
concentración de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo, y
simplemente 9 unidades de mAb a una
concentración de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de
ensayo,
que fueron resultados mucho más bajos que los
obtenidos para la presente invención.
El tiempo de ensayo anterior se define como el
tiempo a partir de la adición de suspensión de inmunopartículas a la
mezcla de reactivos del ensayo y la muestra. Todos los volúmenes y
secuencias eran de conformidad con la información de productor. Las
concentraciones de Cistatina C se han determinado usando
procedimientos de referencia nefelométrica ProSpec de
Dade-Behring EE.UU., número de producto OQNM13 N
Latex Cystatin C.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la presente
invención, se mezcla un tampón de ensayo con una muestra y una
suspensión de inmunopartículas, y la turbidez de la mezcla o la
suspensión resultante se controla por medio de un fotómetro,
preferiblemente un fotómetro registrador, y además preferiblemente
un espectrofotómetro registrador. Una secuencia preferida de etapa
es: mezclar la muestra en el tampón de ensayo, dejar la mezcla que
se disuelva completamente y se estabilice, y después añadir la
mezcla de inmunopartículas. La presente invención también se puede
realizar mezclando el tampón de ensayo y la suspensión de
inmunopartículas en primer lugar, y después añadiendo y mezclando
la mezcla. Se deberían aplicar procedimientos de mezclado óptimos
(seleccionados entre los procedimientos bien conocidos en la
técnica), que se pueden determinar por medio de un número limitado
de pre-experimentos.
Cuando se usa un fotómetro registrador, la
velocidad inicial del aumento de la turbidez se puede determinar, o
por medio de la determinación de la concentración en Cistatina C de
una muestra midiendo la velocidad inicial del aumento de la
absorbancia, o por medio del registro directo en el momento de la
mezcla, o por medio del registro poco después de la mezcla
combinado con una extrapolación hacia atrás a la absorbancia del
aumento inicial, o midiendo la diferencia de absorbancia entre dos
o más momentos de tiempo de menos de 1 minuto después de la mezcla
de la muestra y los reactivos.
Estas mediciones o mediciones combinadas se
pueden correlacionar o comparar con los resultados correspondientes
con calibradores de concentración de Cistatina C conocida, y de este
modo se puede calcular la concentración de muestras desconocidas.
Estas formas para registrar los valores de absorbancia y para
computar los resultados son muy conocidas para otras numerosas
sustancias que se miden por parte del experto en la técnica de
química clínica. Por supuesto, la señal muy buena derivada de la
presente invención hace que dichas mediciones y cálculos sean mucho
más consistentes y precisos, en especial cuando se obtienen buenas
señales poco después de mezclar la muestra y los reactivos, como se
describe anteriormente.
Existen varias mezclas de tampón de ensayo que
se pueden usar, con diferentes clases de sustancias de tampón, con
diferentes clases de detergentes y/o diferentes clases de polímeros
y/o sales añadidas al tampón.
Se puede usar tampón TRIS, tampón fosfato,
tampón borato y otras sustancias de tampón, como MOPS, PIPES, HEPES,
y no son cruciales para la presente invención, siempre que el
ensayo pueda mantener un pH bien regulado de la mezcla del ensayo
final, independiente del pH y la capacidad de tamponamiento de la
muestra añadida. De forma típica, el tampón se añade en una
proporción molar final de aproximadamente 5 mM a 0,2 M ó 10 mM a 0,1
M. El pH se ajusta en el intervalo de 6 a 8, en particular de 6,5 a
7,5.
Además, se pueden usar varios detergentes,
siempre que sean capaces de disolver cualquier contenido en lípidos
de la muestra añadida, y no interfieran demasiado fuertemente en la
reacción de anticuerpos con Cistatina C introducida con la muestra.
Los triglicéridos, colesteroles y un intervalo de lipoproteínas son
ejemplos de sustancias interferentes en ensayos turbidimétricos, ya
que los lípidos forman micro gotas y micelas que proporcionan
señales interferentes. Tween 20, Triton X-100 y
desoxicolatos son ejemplos de detergentes adecuados. Medir la
Cistatina C en muestras que contienen lípidos es un gran desafío, y
necesita una buena solubilidad de los lípidos, pero todavía más
importante, una señal fuerte que invalide cualquier interferencia
menor. Los detergentes se añaden de forma típica en una proporción
final del 0,01% al 0,5%, o del 0,1% al 0,3%, cada una en peso de la
mezcla de la reacción final.
Los polímeros más extensamente usados son los
polietilenglicoles de diferentes tamaños moleculares (en particular
de aproximadamente 6.000 a 8.000), pero también se pueden usar
dextranos y otros polímeros. Los polímeros tienen la desventaja de
que, cuando la concentración es demasiado elevada, crean una
precipitación no específica de las otras sustancias introducidas
cuando la muestra experimental se mezcla en la mezcla del ensayo.
Por otra parte, dichos polímeros aumentan la señal al mismo tiempo.
Sin embargo, tienden a reducir la capacidad de unión total de las
inmunopartículas. Los polímeros se añaden de forma típica en una
proporción total de aproximadamente el 0,05% al 0,5% ó del 0,1% al
0,3%, cada una en peso de la mezcla de la reacción final.
Las sales adecuadas para adaptar la fuerza
iónica son por ejemplo haluros de metales alcalinos, en particular,
cloruro sódico, añadido en una concentración de 1 a 100 mM a 100 mM,
ó 5 mM a 50 mM.
Otros constituyentes adecuados que pueden estar
presentes en la mezcla de ensayo pueden ser:
aminoácidos, como glicina, añadidos en
concentraciones finales de aproximadamente 1 mM a 50 mM ó 5 mM a 20
mM;
proteínas, como albúmina, añadidas en
proporciones finales de 0,1 g/l a 5 g/l ó de 0,5 g/l a 2 g/l;
agentes antimicrobianos, como azida de sodio, añadidos en
proporciones finales de 0,1 g/l a 10 g/l ó de 1 g/l a 5 g/l ;
calibradores o sustancias de control: Éstos son
de forma típica soluciones que comprenden concentraciones conocidas
de Cistatina C disuelta en una sustancia tampón, de forma típica un
tampón fosfato o tampón TRIS, opcionalmente con algún material
proteináceo, comprendiendo opcionalmente suero humano o animal hasta
un volumen del 100% (si el 100% del volumen es suero, entonces no
hay espacio ni hace falta la solución tamponada).
Además, se puede usar uno o más reactivos en una
forma seca, opcionalmente liofilizada. Los anticuerpos conjugados a
las nanopartículas se pueden usar en forma seca, por ejemplo en
forma de gránulos, y disolverse antes de usar, o se puede disolver
en el reactivo del tampón de ensayo o en la mezcla de la reacción.
Se pueden añadir uno o más de los componentes en el tampón de la
reacción en forma seca antes o durante la realización del ensayo,
de igual modo también los calibradores. Incluso las muestras se
pueden proporcionar en forma seca o liofilizada, y añadir a la
mezcla de la reacción en forma seca, o disolviéndose antes de su
uso.
En análisis de química clínica, es práctica
convencional el uso de curvas convencionales a efectos de
calibración. Así pues, en la realización del procedimiento de esta
invención, se pueden usar muestras de contenido en Cistatina
conocidas en lugar de muestras clínicas para construir una curva
convencional para la respuesta / señal que se va a medir y el
contenido en Cistatina C de las muestras no conocidas se puede
calcular después por medio de la interpolación a partir de la curva
convencional.
La concentración total de inmunoconjugados de
nanopartículas en la mezcla se seleccionará de acuerdo con
procedimientos bien conocidos en la técnica de inmunoensayos de
dispersión de la luz potenciado por partículas, de tal forma que
los valores de absorbancia que se derivan de dichas nanopartículas
no influyen en medidas exactas y precisas, pero la concentración en
micropartículas es lo suficientemente alta para conseguir el
desarrollo de la señal. La cantidad está influida, por supuesto,
por diferentes parámetros, como el volumen de la muestra fluida
corporal o la muestra derivada de éste, así como el contenido en
Cistatina C.
Como parámetros típicos no limitantes de un
ensayo se pueden mencionar los siguientes:
Un volumen de muestra típico es de 1\mul a 20
\mul, como por ejemplo de 2 \mul a 10 \mul, o en particular 3
\mul.
Un volumen típico de inmunopartículas es de 10
\mul a 100 \mul ó de 20 \mul a 60 \mul, ó en particular 40
\mul. Dichas inmunopartículas se pueden proporcionar en forma de
una suspensión de 0,5 a 10 ó de 1 a 5, típicamente aproximadamente
de 2 a 3, en particular 2,26 mg de partículas por ml de solución de
tampón. El tampón puede tener un pH en el intervalo de 6 a 9, como
por ejemplo de 7 a 8,5, típicamente aproximadamente pH 8,4. Dicha
solución de tampón puede contener además de la sustancia de tampón
otros ingredientes como por ejemplo aminoácidos, sales, proteínas
inertes y emulgentes o solubilizantes como se define anteriormente.
Una mezcla típica de tales ingredientes y tampón comprende tampón
borato 10 mM, glicina 10 mM, NaCl 15 mM, con Tween 20 al 0,25% y 1
g/l de albúmina.
Un volumen de ensayo total típico es de 100
\mul a 1000 \mul, ó de 200 \mul a 500 \mul, ó de 250 \mul
a 300 \mul o en particular aproximadamente 280 \mul.
Los diferentes instrumentos funcionan con
volúmenes totales diferentes, de tal forma que el 30% ó el 60% de
estos volúmenes ó el 150% ó el 300% de estos volúmenes son típicos
para otros instrumentos. La relación entre el volumen de la muestra
y el volumen de inmunopartículas puede ser algo entre 1/100 a 2/3,
más preferido de 2/100 a 1/3, e incluso más preferido de 1/40 a
1/5.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento del ensayo de la presente
invención se puede usar para la diagnosis y control de afecciones
patológicas o potencialmente patológicas que está relacionadas con o
se manifiestan en el contenido en Cistatina C de fluidos o tejidos
corporales. Éstas incluyen en particular la velocidad de filtración
glomerular (abreviadamente en ingles, GFR, como medida para la
función renal) de un mamífero o afecciones patológicas que afectan
dicha velocidad de filtración.
El procedimiento reivindicado se puede usar para
determinar la GFR en niños; o la GFR de pacientes con atrofia
muscular; para supervisar los efectos de terapia de cáncer en la
función renal; para supervisar el transplante renal y terapia
inmunosupresora; para supervisar la velocidad de filtración renal en
diabetes; o para detectar y tratar eclampsia; y para encontrar la
dosificación correcta de fármacos en caso de que la administración
de fármacos esté asociada a una disminución de la GFR que puede dar
como resultado una acumulación de fármacos no deseada en el
cuerpo.
El procedimiento de ensayo también se puede usar
para la evaluación de los efectos de productos farmacéuticos en
dicha velocidad de filtración.
Un lector experto de la presente invención puede
ser consciente de otras aplicaciones potenciales.
En otro aspecto la invención proporciona un
producto analítico, opcionalmente en formato de kit o kit de partes,
para usar en el ensayo de Cistatina C en una muestra, comprendiendo
dicho producto: al menos un tipo de inmunoconjugados de
nanopartículas como se describe anteriormente en forma seca o
suspendida, y opcionalmente uno o más constituyentes adicionales,
como se define en la presente memoria descriptiva, como por ejemplo,
un tampón de ensayo adecuado y, opcionalmente solución(es) de
calibrador y solución(es) de control.
La presente invención también proporciona un
conjunto de reactivos para la realización del inmunoensayo de
acuerdo con esta invención. El conjunto de reactivos está
caracterizado por comprender inmunopartículas
anti-Cistatina C, un tampón de ensayo adecuado y,
opcionalmente solución(es) de calibrador y
solución(es) de control. De forma opcional, la suspensión de
partículas y el tampón de ensayo se suministran en forma de reactivo
combinado.
La presente invención también proporciona un
conjunto de reactivos para la realización del inmunoensayo de
acuerdo con esta invención. El conjunto de reactivos está
caracterizado por comprender inmunopartículas
anti-Cistatina C, un tampón de ensayo adecuado y,
opcionalmente solución(es) de calibrador y
solución(es) de control. De forma opcional, la suspensión de
partículas y el tampón de ensayo se suministran en forma de reactivo
combinado.
De manera opcional, también pueden estar
presentes los medios para la evaluación de la señal como esquemas
calculadores que permiten correlacionar directamente la
concentración de Cistatina C observada con el parámetro de la
GFR.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de síntesis
1
Se puede usar el siguiente protocolo de
inmunización para la generación de anticuerpos policlonales IgY
contra Cistatina C humana:
Se usan de dos a cuatro gallinas para cada
experimento de inmunización. Se recogen un par de huevos antes de
que comience la inmunización. Los IgY purificados de estos huevos
servirán de IgY de control. 100 \mug de Cistatina C humana muy
purificada (purificada a partir de orina de pacientes con
proteinuria tubular) en tampón fosfato se emulsionó con adyuvante
completo de Freund y se inyectó en el músculo del pecho de las
gallinas. La inyección se repitió cada 4 semanas. 10 semanas
después del comienzo de las inyecciones se recogieron los huevos.
Se aisló la yema del huevo de los huevos, y la fracción IgY de la
yema de huevo se aisló por precipitación de cloruro de amonio, en
una forma convencional de acuerdo con los procedimientos de la
técnica anterior de aislamiento de anticuerpos del huevo (véase por
ejemplo Larsson A, Baaloew R-M, Lindahl T, y
Forsberg P-O en Poultry Science 72:
1807-1812, 1993).
\vskip1.000000\baselineskip
10 mg de Cistatina C humana muy purificada se
inmovilizó en una columna HITRAP NHS-Active HP de
Amersham Pharmacia Biotech, siguiendo el modo de empleo del
prospecto de la columna.
La fracción IgY aislada se diluyó a 2 mg/ml en
solución salina tamponada con fosfato. 200 ml de esta solución de
IgY se pasó a través de la columna, seguido de 50 ml solución salina
tamponada con fosfato sin IgY. Los anticuerpos con afinidad
específica para la Cistatina C inmovilizada se eluyeron con 35 ml de
tampón citrato 0,1 molar pH=3,2. Los anticuerpos específicos de
anti-Cistatina C eluidos se dializaron contra
solución salina tamponada con fosfato y se concentraron a 3 mg/ml
usando un dispositivo de filtración por centrifugación Amicon
Centircon con peso molecular límite de 30.000 Dalton.
\newpage
Ejemplo de síntesis
2
La preparación de anticuerpos monoclonales de
Cistatina C anti-humana se puede realizar como
sigue, haciendo uso de los procedimientos bien conocidos en la
técnica, descritos por ejemplo por Harlow y col., 1988, Sección 6
de "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press,
Nueva York, EE.UU. El PSA humano se aisló a partir de plasma seminal
humano, como se describe en Sensabaugh y col., 1990, J. Urology 144,
1523.
Se inmunizaron ratones en intervalos regulares
con 4 inyecciones de 50 \mug de Cistatina C humana en RAS
(sistema adyuvante de RIBI). Cuatro meses después de la primera
inyección los linfocitos aislados del bazo de los ratones
inmunizados se condensaron con la línea celular del mieloma
SP2/0-Ag14 usando el procedimiento de
polietilenglicol como se describe en G. Galfre y col., 1981, Methods
in Enzymology, 73, 3-46.
Se identificaron los hibridomas que secretan un
anticuerpo contra Cistatina C por medio del siguiente ELISA de
selección: se recubrieron placas de microtítulos con inmunoglobulina
de de conejo con Cistatina C anti-humana; la
Cistatina C unida a esta fase sólida se incubó con los sobrenadantes
de cultivos de hibridomas. Se detectó el anticuerpo monoclonal unido
a la Cistatina C usando un conjugado de peroxidasa inmunoglobulina
anti-ratón.
Se pueden aislar varios cientos de hibridomas,
que secretan anticuerpos contra epitopes diferentes de Cistatina C.
Después, los anticuerpos monoclonales correspondientes se purifican
por afinidad y se pueden caracterizar en más detalle.
Se realizó la unión de epitopes y se determinó
la reactividad relativa de los anticuerpos en lo que se refiere a
sus constantes de disociación aparente, usando la tecnología de
biosensor BIAcore (Pharmacia, Suecia). Esta última está basada en
la técnica de resonancia de plasmón superficial (véase J. L. Daiss y
col., 1994. en "Methods: A Companion to Methods in Enzymology"
6, 143-156, Academic Press Inc., NY, EE.UU.) y
permite controlar la cinética y la estoquimetría de reacciones
biomoleculares.
Comenzando a partir de los sobrenadantes del
cultivo celular, los anticuerpos monoclonales se unieron a la
superficie del biosensor a través de anticuerpo policlonal de conejo
anti-ratón Fc. Se controló la asociación y
disociación de la Cistatina C del antígeno a los anticuerpos
monoclonales. Los datos se pueden analizar usando el software de
evaluación BIA inherente, basado en el modelo de equilibrio simple
A+B=AB (L. G. Fagerstam y col., 1992, Journal of Chromatography,
597, 397-410). Los anticuerpos obtenidos se pueden
comparar después con respecto a sus respectivas constantes de
disociación aparente. Los anticuerpos adecuados o combinaciones de
los mismos se pueden usar después para preparar las inmunopartículas
de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de síntesis
3
\newpage
Con el fin de tener más señal de las partículas
poliméricas por mg de anticuerpo, se adaptó el pH del tampón de
acoplamiento en una forma especifica al pl de los anticuerpos que se
van a acoplar. Además, los anticuerpos se diluyeron con
albúmina/transferrina antes del acoplamiento (véase a continuación).
Para acoplar un pH, se eligió media unidad por encima del pl del
anticuerpo cuando se usaron anticuerpos monoclonales. Los
anticuerpos policlonales tienen un pl bastante diverso, y por eso
con los anticuerpos policlonales se usó un pH de 8,8. El pH elegido
se obtuvo mezclando los tampones PBS y borato anteriormente
mencionados.
El siguiente procedimiento convencional resume
un procedimiento simple de una sola etapa para la unión por medio de
la adsorción física de anticuerpos a clorometilo. El protocolo es
para 1 \mum de látex de clorometilo al 1% en sólidos. Esta
reacción se puede aumentar o reducir fácilmente para ajustar las
necesidades individuales. Por ejemplo, si se usa un tamaño de
partículas diferente, entonces las cantidades de anticuerpo (Ab) se
pueden calcular a partir de:
Peso del Ab =
(Peso del Ab para 1 \mum de partícula) / (diámetro de partícula en
\mum)
\vskip1.000000\baselineskip
1. Tomar en pipeta 2,5 ml (40 mg/ml) de
microesferas de látex de clorometilo y diluir con tampón MES 10
ml.
2. Centrifugar la mezcla para sedimentar las
partículas; aproximadamente 3.000g durante aproximadamente
20 min.
20 min.
3. Eliminar el sobrenadante y
re-dispersar el sedimento en tampón MES 10 ml.
4. Centrifugar otra vez y eliminar el
sobrenadante de las partículas.
5. Volver a suspender el sedimento en tampón MES
5 ml, asegurándose de suspender completamente las partículas de
microesferas.
Ahora la suspensión de látex está
aproximadamente al 2% en sólidos (es decir, aproximadamente 20
mg/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
1. A una solución de 5 ml de 1,5 mg de
anticuerpos, 3,75 mg de albúmina y 7 mg de transferrina bovina en
tampón PBS/borato ajustado al pH apropiado (véase arriba) se añade 5
ml del látex. Esto es menos de lo que podría requerir una monocapa
de anticuerpos. Los anticuerpos son más reactivos con el látex que
con la transferrina y albúmina, y se unen de forma más o menos
cuantitativa al látex, y el resto de la superficie del látex se
satura con albúmina y/o transferrina. Esta mezcla también asegura
contra la agregación y buena hidrofilidad de las partículas. También
otras proteínas inertes se pueden mezclar con los anticuerpos
durante la conjugación, como hemocianina de lapa, haptoglobina y
otras proteínas solubles en agua, sin afinidad alguna ni por los
anticuerpos ni por la Cistatina C.
2. Incubar la mezcla de látex/proteína mezclando
suavemente a temperatura ambiente durante toda la noche.
3. Centrifugar para separar las partículas de
látex marcadas con proteínas de las proteínas no unidas.
4. Eliminar y retener el sobrenadante para la
determinación de proteínas. En esta etapa, se puede reservar el
sobrenadante y realizar una determinación de proteínas. Se puede
sustraer cualquier proteína residual en el sobrenadante de la
cantidad original añadida. El resto se recubre con las partículas.
El único procedimiento para la determinación de proteínas compatible
con microesferas de látex es el kit de determinación de proteínas
Micro BCA de Pierce.
5. Volver a suspender el sedimento en PBS 10
ml.
6. Centrifugar otra vez para sedimentar las
partículas.
7. Repetir las etapas 5-6 dos
veces más durante un total de 3 lavados.
8. Volver a suspender el látex final en tampón
de almacenamiento 10 ml proporcionando una concentración final de
sólidos al 1% en sólidos. Almacenar a 4ºC hasta su uso. No
congelar.
La glicina se usa en el tampón de almacenamiento
para cargar cualquier sitio reactivo en la superficie de las
microesferas que no se haya cubierto con la proteína. Esto es para
reducir la unión no específica. Las proteínas inertes como Albúmina
de Suero Bovino (BSA) o transferrina bovina se pueden usar para el
mismo fin si se desea. El NaN_{3} está presente en forma de
biocida. Si el látex se mantiene estéril, se puede omitir NaN_{3},
que no es compatible con el cultivo del tejido o célula.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento convencional anterior se aplicó
a las partículas de látex recubiertas con un diámetro de 0,08 \mum
para preparar conjugados de nanopartículas de la presente invención.
De acuerdo con la fórmula anterior, se usaron 24 mg de anticuerpo y
65 mg de albúmina para recubrir 100 mg de partículas.
Dichas inmunopartículas
anti-Cistatina C se produjeron por medio del
acoplamiento de anticuerpos anti-Cistatina C, número
de producto A167 Cys-C-AF de
Norwegian Antibodies AS, Noruega (dichos anticuerpos policlonales de
Cistatina C anti-humana corresponden a la fracción
de inmunoglobulina purificada por afinidad aislada de los huevos de
gallinas inmunizadas con Cistatina C de pacientes con proteinuria
tubular renal crónica; el procedimiento de purificación por afinidad
se realizó con Cistatina C humana inmovilizada), a partículas de
látex activadas con clorometilo (0,08 \mum, de Intefacial Dynamics
Inc., EE.UU, número de producto C37487). Para dicho acoplamiento se
puede usar el protocolo ``Coupling of Proteins to IDC Ultraclean
Chloromethyl Latex, descargado de
http://www.idclatex.com/body-bgrounder-superactiveprotocol-11.asp.
En el sitio web Interfacial Dynamics, el sitio
web de Invitrogen y el sitio web de Bangs Particles Inc. se pueden
encontrar protocolos de acoplamiento y partículas alternativos.
Las partículas obtenidas se usan en forma de una
suspensión de 2,26 mg partículas por ml en tampón borato 10 mM,
glicina 10 mM, NaCl 15 mM, con Tween 20 al 0,25% y albúmina 1
g/l.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo del ensayo
1
La suspensión de inmunopartículas como se
preparar por medio del Ejemplo de síntesis 3 como se usa en los
siguientes experimentos:
En dichos experimentos se usó el siguiente pH de
tampón de ensayo optimizado = 7,2.
polietilenglicol (Sigma) 22 g/l,
Tween 20 (Sigma) 3 g/l,
MOPS (Sigma) 9,4 g/l,
Azida de sodio 2,7 g/l,
Cloruro de sodio 27 g/l,
Se mezcló 3 \mul de muestra con 250 \mul de
tampón de ensayo, y se dejó reposar durante 300 segundos, seguido
de la adición de 40 \mul de suspensión de partículas y mezclado.
Después de dicho mezclado, la absorbancia de luz por cm se midió en
un espectrofotómetro Schimadzu UV 1601.
Dependiendo de la concentración, la temperatura,
el tiempo después de añadir la suspensión de inmunopartículas y
mezclado, y la longitud de onda de la luz usada en el
espectrofotómetro, se obtuvieron los siguientes resultados (Unidades
de mAb/cm = unidades de miliabsorbancia por centímetro de
trayectoria de la luz):
a) A longitud de onda de 546 nm a 37 grados
Celsius en 260 segundos de tiempo de ensayo:
un cambio en la absorbancia de 33 unidades de
mAb a una concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la
mezcla de ensayo, y
88 unidades de mAb a una concentración de 19,8
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, y
194 unidades de mAb a una concentración de 34,1
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
b) A longitud de onda de 505 nm a 37 grados
Celsius en 260 segundos de tiempo de ensayo:
un cambio en la absorbancia de 43 unidades de
mAb a una concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la
mezcla de ensayo, y
128 unidades de mAb a una concentración de 19,8
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, y
282 unidades de mAb a una concentración de 34,1
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
c) A longitud de onda de 570 nm a 37 grados
Celsius en 260 segundos de tiempo de ensayo:
un cambio en la absorbancia de 24 unidades de
mAb a una concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la
mezcla de ensayo, y
65 unidades de mAb a una concentración de 19,8
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, y
148 unidades de mAb a una concentración de 34,1
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
d) A longitud de onda de 546 nm a 37 grados
Celsius en 120 segundos de tiempo de ensayo:
un cambio en la absorbancia de 11 unidades de
mAb a una concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la
mezcla de ensayo, y
31 unidades de mAb a una concentración de 19,8
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, y
72 unidades de mAb a una concentración de 34,1
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
e) A longitud de onda de 546 nm a 37 grados
Celsius en 40 segundos de tiempo de ensayo:
un cambio en la absorbancia de 4 unidades de mAb
a una concentración de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla
de ensayo, y
11 unidades de mAb a una concentración de 19,8
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, y
23 unidades de mAb a una concentración de 34,1
\mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
El "tiempo de ensayo" se definió como el
número de segundos a partir de mezclar las inmunopartículas con la
mezcla del tampón de ensayo y la muestra hasta la lectura de la
absorbancia. Las concentraciones de Cistatina C se determinaron
usando procedimientos nefelométricos de referencia ProSpec de
Dade-Behring, EE.UU., número de producto OONM13 N
Latex Cystatin C.
Estos resultados, con una señal turbidimétrica
más rápida y más fuerte, se usaron después para investigar el efecto
de interferencia a partir de triglicéridos, una sustancia común de
interferencia en inmunoensayos turbidimétricos, y la linealidad del
procedimiento de la invención, en comparación con el mejor
procedimiento de la técnica anterior. Estos experimentos se
describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo del ensayo
2
El propósito de este estudio fue determinar si
el procedimiento de la invención experimenta la interferencia a
partir de triglicéridos (TG) en la muestra experimental. Si se
encuentra interferencia por debajo de la concentración en TG
predeterminada, se realiza un estudio de respuesta de dosis para
demostrar la relación entre la interferencia y la concentración de
la sustancia posiblemente interferente. El procedimiento está basado
en las directrices del NCCLS "Interference testing in clinical
chemistry; approved guideline", NCCLS apartado 6.1.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Instrumento: instrumento Hitachi 917 con
accesorios convencionales, proporcionados por Roche Diagnostics.
Ajuste del instrumento Hitachi 917:
- \bullet
- Volumen del tampón de ensayo: 230 \mul
- \bullet
- Volumen de la muestra: 3 \mul
- \bullet
- Volumen de immunopartículas: 40 \mul
- \bullet
- Volumen de agua: 20 \mul
- \bullet
- Longitud de onda primaria: 546 nm
- \bullet
- Longitud de onda secundaria: 700 nm
- \bullet
- Diluciones de calibración 0,055, 0,125, 0,250, 0,432, 0,667, 1,000
- \bullet
- Logit Log (4P)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de ensayo: polietilenglicol (Sigma) 22
g/l, Tween 20 (Sigma) 3 g/l, MOPS (Sigma) 9,4 g/l, azida de sodio
2,7 g/l, cloruro de sodio 27 g/l, pH=7,2.
Calibrador: Un suero que comprende 7,70 mg de
Cistatina C por litro, como se determina por medio de un
procedimiento nefelométrico de Dade-Behring que usa
un laboratorio de referencia en el nefelómetro ProSpec.
Inmunopartículas: Inmunopartículas de
anti-Cistatina C como se prepara de acuerdo con el
Ejemplo de síntesis 2, arriba. Las partículas se usaron en forma de
suspensión (2,26 mg de partículas por ml de suspensión) en tampón
borato 10 mM, glicina 10 mM, NaCl 15 mM, con Tween 20 al 0,25% y 1
g/l de albúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
Suero 1: Una reserva de suero humano con
concentración de triglicéridos por encima de 20 mmol/l.
Suero 2: Una reserva de suero humano con
concentración de triglicéridos por debajo de 10 mmol/l.
Estas dos muestras de suero se usaron para
preparar muestras de las concentraciones de triglicéridos
deseadas.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de Cistatina C de las dos
reservas de suero que se van a usar se midió en 10 repeticiones.
\newpage
Los valores medios se asignaron a los valores de
Cistatina C de dichas reservas de suero.
Se eligió un límite de interferencia al +/-5% en
valores por encima de 1 mg/l y al +/-7,5% en valores por debajo de 1
mg de Cistatina C para la interferencia máxima permitida a partir de
triglicéridos. Esta diferencia se denomina d_{max}.
De acuerdo con las directrices del NCCLS, el
número de repeticiones (n) necesarias para realizar este experimento
con nivel de confianza al 95% (\alpha=0,05) y poder al 95%
(\beta=0,05) de la prueba bilateral:
en la que s es la precisión
intra-ensayo (en mg Cistatina C/l) de la reserva de
suero.
\vskip1.000000\baselineskip
Cálculo del mínimo de repeticiones de acuerdo
con las directrices del NCCLS:
Los resultados demostraron que eran suficientes
3 repeticiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó suero con aproximadamente 20 mmol/l
de triglicéridos (reserva de suero A). Un servicio de laboratorio
independiente determinó el contenido en triglicéridos. La mitad de
esta porción de suero fue inyectada con Cistatina C purificada de
Scipac Ltd. R.U., dando como resultado un valor de Cistatina C por
encima de 3 mg/l. (reserva de suero B).
La mitad de las reservas de suero A y B se
trataron por ultracentrifugación a 50.000 rpm durante 30 minutos en
una ultracentrifugadora Beckman TL-100. La porción
transparente de la muestra se usó como la reserva de control, y el
volumen se corrigió por el volumen de los lípidos eliminados.
(Denominadas reservas de suero C y D, respectivamente).
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon 3 alícuotas de cada mezcla de
reservas básicas y las mezclas de reservas de control A, B, C y
D.
Se realizó la calibración del instrumento de
acuerdo con las instrucciones y análisis de las mezclas de reservas
básicas y las mezclas de reservas de control (reservas A, B, C y D)
en orden alternante.
Si se observaba interferencia, se realizaba una
reserva media al 50% desde el 0% y el 100% de las reservas. A partir
de la reserva media y reserva al 0%, se realizó una reserva al 25%.
A partir de la reserva media y reserva al 100%, se realizó una
reserva al 75% mezclando cantidades iguales de cada reserva. Se
midieron las repeticiones n de todas en orden aleatorio en un ensayo
con calibración nueva.
Se calculó la concentración media para la
reserva al 0% y se separó de la totalidad de los otros
resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó que de acuerdo con las condiciones
experimentales específicas, TG en concentraciones por debajo de 18
mmol/l no interfiere en el inmunoensayo de Cistatina C de la
presente invención.
Por lo tanto se puede determinar que la presente
invención proporciona un procedimiento de inmunoensayo
turbidimétrico para Cistatina C caracterizado por tener una
interferencia de 15 mmol/litro de triglicéridos en la muestra
experimental de igual a o menos del 5% sobre el valor medido de
Cistatina C a un nivel de 3,2 y 0,83 mg de Cistatina por litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo del ensayo
3
Se realizó una investigación correspondiente
usando el instrumento Hitachi 917 y los reactivos de la técnica
anterior.
\newpage
Inmunopartículas: LX002/EFG/CS/25.10.04
Calibrador: X0974/EFG/SUM/09.09.04
Conjunto de control: X0973/EFG/SUM/09.09.04
Tampón de reacción 9: S2361/EFG/KGR/09.07.03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
De las tablas anteriores se puede determinar que
el procedimiento de la presente invención es más consistente contra
la interferencia de triglicéridos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de ensayo
4
Esta investigación se realizó de acuerdo con el
protocolo del NCCLS EP6-A, vol. 23, No 16.
En este experimento, se investigó la linealidad
del inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención. Esto se
realizó diluyendo 3 muestras diferentes de suero alto inyectado con
una muestra de suero de concentración baja, del 0%-100%. Mediante
la representación gráfica de los resultados de las series de
dilución e investigando la representación gráfica por medio de
análisis de regresión de primer, segundo y tercer orden se determinó
que el procedimiento del inmunoensayo de Cistatina C de la presente
invención era lineal de acuerdo con los criterios proporcionados.
Los criterios eran para examinar y comparar los parámetros de la
representación gráfica por medio de una prueba t de Student para
ver si los puntos de medición (representados gráficamente contra el
factor de dilución) se podrían ajustar mejor a un polinomio de
primer o segundo orden. Si la prueba t fallaba, se aceptaba una
diferencia del 6% entre el polinomio de primer orden y el polinomio
de orden más alto con el valor chi-cuadrado más
bajo en relación con el valor medio medido a cada nivel (excepto en
los puntos finales, donde una diferencia de hasta el 25% se puede
aceptar debido al hecho de que rara vez o nunca se miden muestras
con concentraciones de Cistatina C en esta área). De acuerdo con
estos criterios, el procedimiento de inmunoensayo de Cistatina C de
la presente invención es lineal en el sistema de medición Hitachi
911.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un instrumento Hitachi 911.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron el tampón de ensayo, calibrador de
Cistatina C e inmunopartículas anti-Cistatina C
anteriormente mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
3 muestras de suero de pacientes diferentes, A,
B y C, donde todas las muestras tienen valores de Cistatina C por
encima de 6 mg/l.
La muestra de suero de un paciente, D con
concentración de Cistatina C baja, por debajo de 0,8 mg/l, se usó en
forma de diluyente de suero alto.
Se realizaron series de dilución de muestras de
plasma A, B y C como se describe en la Tabla 1 para la muestra A. Se
prepararon diluciones de cada muestra A, B y C 10 veces, desde el
100% al 0% de la concentración original con la muestra baja D, en la
que el 100% es suero de concentración alta pura (A_{100},
B_{100}, C_{100}) y el 0% es suero de concentración baja pura
(D_{100}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron las mismas series de diluciones
para la muestra B y la muestra C, como se describe en la tabla
1.
Se llevó a cabo una calibración en el Hitachi
911 para establecer una curva convencional usando los siguientes
parámetros de ensayo.
- \bullet
- Volumen de ensayo: 230 \mul
- \bullet
- Volumen de muestra: 3 \mul
- \bullet
- Volumen de inmunopartículas: 40 \mul
- \bullet
- Volumen de agua: 10 \mul
Cada una de las muestras diluidas se midió en 3
repeticiones, y se registró el resultado de cada muestra A, B y
C.
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
En las Figuras 1, 2 y 3 se muestran una
representación gráfica de los valores medios medidos frente al
factor de dilución para la totalidad de los tres sueros con análisis
de regresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una prueba t de Student para
comprobar si los parámetros de la regresión de orden superior se
ajustaban a los datos. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla 4 se determina que el
conjunto de datos del suero 1 no se ajusta a un polinomio de segundo
orden, ya que el valor t calculado es menor que el valor t
tabulado.
A partir de la tabla 4 se determina que el
conjunto de datos se puede ajustar a un polinomio de orden superior
y es necesario comprobar si la diferencia entre el polinomio de
primer orden y el polinomio de orden superior con el valor
chi-cuadrado más bajo es de más del 6%. El polinomio
de tercer orden tiene el valor chi-cuadrado más
bajo.
DL=P(x)-L(x),
en el que P(x) es ecuación
polinómica y L(x) es la ecuación
lineal
\newpage
La representación gráfica de DL (%) para el
suero 1 se muestra en la Figura 4.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla 4 se determina que el
conjunto de datos del suero 2 no se ajusta a un polinomio de segundo
orden, ya que el valor t calculado es menor que el valor t
tabulado.
A partir de esto se determina que el conjunto de
datos del suero 2 no se ajusta a un polinomio de tercer orden, ya
que el valor t calculado es menor que el valor t tabulado, y la
serie de dilución se considera lineal.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la tabla 4 se determina que el
conjunto de datos del suero 3 no se ajusta a un polinomio de segundo
orden, ya que el valor t calculado es menor que el valor t
tabulado.
A partir de la tabla 4 se determina que el
conjunto de datos se puede ajustar a un polinomio de orden superior
y es necesario comprobar si la diferencia entre el polinomio de
primer orden y el polinomio de orden superior con el valor
chi-cuadrado más bajo es más del 5% (DL). El
polinomio de tercer orden tiene el valor
chi-cuadrado más bajo.
DL=P(x)-L(x),
en el que P(x) es ecuación
polinómica y L(x) es la ecuación
lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
La representación gráfica de DL (%) para el
suero 3 se muestra en la Figura 5.
A partir de los cálculos anteriores y las
especificaciones establecidas para la linealidad, se descubre que el
inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención es lineal en el
intervalo analizado de aproximadamente 0,6 mg/l-8,5
mg/l.
Como el intervalo de referencia está cubierto en
este intervalo, y las concentraciones de Cistatina C por encima de 8
mg/l todavía se tienen que medir, el intervalo lineal documentado es
suficiente para todos los efectos clínicos de inmunoensayo de
Cistatina C del presente procedimiento.
Se puede determinar a partir de este estudio que
el procedimiento de inmunoensayo turbidimétrico para Cistatina C de
acuerdo con la presente invención se caracteriza por tener una
desviación de linealidad por debajo del 4% en un intervalo de
medición de 1,32 mg a 7,5 mg de Cistatina C por litro, y una
desviación de linealidad por debajo del 15% en un intervalo de
medición de 0,75 mg a 7,5 mg de Cistatina C por litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de ensayo
5
Esta investigación se realizó de acuerdo con el
protocolo del NCCLS EP6-A, vol. 23, No 16.
En este experimento, se investigó la linealidad
del inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención. Esto se
realizó diluyendo una muestra de suero alto inyectado con una
muestra de suero de concentración baja, del 0%-100%. Mediante la
representación gráfica de los resultados de las series de dilución e
investigando la representación gráfica por medio de análisis de
regresión de primer, segundo y tercer orden, se determinó que el
procedimiento del inmunoensayo de Cistatina C de la presente
invención era lineal de acuerdo con los criterios proporcionados.
Los criterios eran para examinar y comparar los parámetros de la
representación gráfica por medio de una prueba t de Student para
ver si los puntos de medición (representados gráficamente contra el
factor de dilución) se podrían ajustar mejor a un polinomio de
segundo o tercer orden que en un polinomio de primer orden. Si la
prueba t fallaba, se aceptaba una diferencia del 6% entre el
polinomio de primer orden y el polinomio de orden más alta con el
valor chi-cuadrado más bajo en relación con el valor
medio medido a cada nivel (excepto en los puntos finales, donde una
diferencia de hasta el 25% se puede aceptar debido al hecho de que
rara vez o nunca se miden muestras con concentraciones de Cistatina
C en esta área). De acuerdo con estos criterios, el procedimiento
de inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención es lineal en
el sistema de medición Architect ci8200.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un instrumento Architect ci8200.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron el tampón de ensayo, calibrador de
Cistatina C e inmunopartículas anti-Cistatina C
anteriormente mencionados.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de suero de un paciente A, que tiene
valores de Cistatina C por encima de 6 mg/l. La muestra de suero de
un paciente, D con concentración de Cistatina C baja, por debajo de
0,8 mg/l, se usó en forma de diluyente de suero alto.
Se realizaron series de dilución de muestras de
plasma A, como se describe en la Tabla 1. Se diluyó la muestra 10
veces, desde el 100% al 0% de la concentración original con la
muestra baja D, en la que el 100% es suero de concentración alta
pura (A_{100}) y el 0% es suero de concentración baja pura
(D_{100}).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una calibración en el Hitachi
911 para establecer una curva convencional usando los siguientes
parámetros de ensayo.
- \bullet
- Volumen de ensayo: 220 \mul
- \bullet
- Volumen de muestra: 3 \mul
- \bullet
- Volumen de inmunopartículas: 40 \mul
Cada una de las muestras diluidas se midió en 3
repeticiones, y se registró el resultado de la muestra A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En las Figuras 6, 7 y 8 se muestran una
representación gráfica de los valores medios medidos frente al
factor de dilución para el suero A con análisis de regresión.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
A partir de la tabla 9 se determina que el
conjunto de datos del suero A no se ajusta a un polinomio de segundo
orden, ya que el valor t calculado es menor que el valor t
tabulado.
A partir de la tabla 9 se determina que el
conjunto de datos se puede ajustar a un polinomio de orden superior
y es necesario comprobar si la diferencia entre el polinomio de
primer orden y el polinomio de orden superior con el valor
chi-cuadrado más bajo es de más del 6%. El polinomio
de tercer orden tiene el valor chi-cuadrado más
bajo.
DL=P(x)-L(x),
en el que P(x) es ecuación
polinómica y L(x) es la ecuación
lineal
\newpage
A partir de los cálculos anteriores y las
especificaciones establecidas para la linealidad, se descubre que el
inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención es lineal en el
intervalo analizado de aproximadamente 0,6 mg/l-8,8
mg/l.
Como el intervalo de referencia está cubierto en
este intervalo, y las concentraciones de Cistatina C por encima de 8
mg/l todavía se tienen que medir, el intervalo lineal documentado es
suficiente para todos los efectos clínicos de inmunoensayo de
Cistatina C del presente procedimiento.
Se puede concluir a partir de este estudio que
el procedimiento de inmunoensayo turbidimétrico para Cistatina C de
acuerdo con la presente invención se caracteriza por tener una
desviación de linealidad por debajo del 4% en un intervalo de
medición de 1,32 mg a 7,5 mg de Cistatina C por litro, y una
desviación de linealidad por debajo del 15% en un intervalo de
medición de 0,75 mg a 7,5 mg de Cistatina C por litro. C por
litro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de ensayo
6
Se realizó una investigación correspondiente al
Ejemplo de ensayo 4 usando el procedimiento y ajustes de la técnica
anterior. De acuerdo con "Cystatin C-The marker of
choice for renal function testing", de Camilla Schmidt en el
Journal European Clinical Laboratory, 10 Feb. 2004, y el prospecto
de los productos Dako a los que se refiere en dicho artículo, se
obtuvieron los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
En las Figuras 10, 11 y 12 se muestran las
representaciones gráficas de los valores medios medidos frente al
factor de dilución para la totalidad de los tres sueros A, B y C
con análisis de regresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó una prueba t de Student para
comprobar si los parámetros de regresión de orden superior se
ajustaban a los datos. Los valores correspondientes se resumen en la
Tabla 11.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de datos se puede ajustar a un
polinomio de orden superior y es necesario comprobar si la
diferencia entre el polinomio de primer orden y el polinomio de
orden superior con el valor chi-cuadrado más bajo es
de más del 6% (DL). El polinomio de tercer orden tiene el valor
chi-cuadrado más bajo. Las diferencias (DL) son:
\vskip1.000000\baselineskip
La representación gráfica de DL (%) para el
suero 1 se muestra en la Figura 13.
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de datos se puede ajustar a un
polinomio de orden superior y es necesario comprobar si la
diferencia entre el polinomio de primer orden y el polinomio de
orden superior con el valor chi-cuadrado más bajo es
de más del 6% (DL). El polinomio de tercer orden tiene el valor
chi-cuadrado más bajo.
Las diferencias (DL) son:
\vskip1.000000\baselineskip
La representación gráfica de DL (%) para el
suero 2 se muestra en la Figura 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Esto significa que el conjunto de datos se puede
ajustar a un polinomio de orden superior y es necesario comprobar si
la diferencia entre el polinomio de primer orden y el polinomio de
orden superior con el valor chi-cuadrado más bajo es
de más del 6% (DL). El polinomio de tercer orden tiene el valor
chi-cuadrado más bajo.
Las diferencias (DL) son:
La representación gráfica de DL (%) para el
suero 3 se muestra en la Figura 15.
Se determina que la técnica anterior de
inmunoensayos turbidimétricos de ilustrada por medio del
inmunoensayo de Cistatina C de Dako no es satisfactoriamente linear
en la parte más baja del intervalo de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo de ensayo
7
Se hace referencia a la publicación "New
improved automated particle-enhanced turbidimetric
immunoassay for quantitative determination of human Cystatin C in
serum and plasma" de C. Schmidt, C. Kjoller y K Gronkjaer, que
se puede descargar del sitio web de Dako Cytomation, primavera de
2005. En un estudio de correlación con el procedimiento de
referencia nefelométrico de Dade-Behring, se
descubre una ordenada en el origen de +0,214 y un
incremento/pendiente en la curva de correlación de 0,6954. Hay una
gran diferencia con el procedimiento de referencia.
Por medio de la presente invención se
proporciona un procedimiento que tiene una correlación mucho mejor
al procedimiento de referencia, por las rezones indicadas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, el inmunoensayo de
Cistatina C de esta invención, con los ajustes del instrumento
Hitachi 917 como se describe anteriormente, se comparó con el
procedimiento de Cistatina C de Dade-Behring en BN
ProSpec en el Akademiska University Hospital de Uppsala, Suecia,
midiendo las mismas 51 muestras de suero por duplicado en ambos
procedimientos (en una calibración y un día) y comparándolos con
análisis de desviación y análisis de regresión lineal. Además, se
determinó la diferencia del límite de confianza superior de
Dade-Behring, también denominado Punto de Decisión
Médica. El diseño experimental y el análisis de los datos siguieron
las recomendaciones del protocolo del NCCLS EP-2,
Vol. 22, Nº 19.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes Figuras 16, 17 y 18 demuestran el
resultado. Dichas Figuras 16, 17 y 18 demuestran que el
procedimiento de la presente invención proporciona de forma
sorprendente mediciones de Cistatina C con muy buena exactitud
obteniendo resultados que no son significativamente diferentes del
procedimiento de referencia nefelométrico. En el presente estudio
de 50 muestras experimentales, no hubo desviación significativa
entre los dos procedimientos. En total hubo una desviación de
0,023, con un intervalo de confianza al 95% de -0,023 a +0,0658;
esencialmente, no hubo una desviación significativamente diferente
de cero.
El inmunoensayo de Cistatina C de
Dade-Behring tiene un Punto de Decisión Médica de
0,95 mg/l. Usando análisis de regresión lineal, se encuentra que
una muestra que mide 0,95 mg/l con el procedimiento de Dade Behring
medirá entre 0,83-0,89 mg/l con el procedimiento de
inmunoensayo de Cistatina C de la presente invención. El análisis
de comparación del procedimiento de plasma dio como resultado una
pendiente de la curva de correlación de 0,968, con una ordenada en
el origen de 0,103 mg/l. Esto significa que la pendiente y ordenada
en el origen del análisis de plasma se encuentran dentro del
intervalo de confianza de la pendiente y ordenada en el origen del
análisis de suero.
Lo mencionado demuestra que el procedimiento de
la presente invención da como resultado una correlación mucho mejor
con el procedimiento de referencia nefelométrico, en comparación con
la mejor técnica avanzada en procedimientos turbidimétricos.
La publicación arriba mencionada "New improved
automated particle-enhanced turbidimetric
immunoassay for quantitative determination of human Cystatin C in
serum and plasma" demuestra que las mediciones de Cistatina C
turbidimétricas se pueden usar para el cálculo de la velocidad de
filtración glomerular. Esto también se demostró por medio de la
publicación "Simple Cystatin C-Based Prediction
Equations for Glomerular Filtration Rate Compared with the
Modification of Diet in Renal Disease Prediction Equation for Adults
and the Schwartz and the Counahan-Barratt
Prediction Equations for Children", de Grubb & col. In
Clinical Chemistry 51:8, 1420-1431. Una publicación
similar que usa el procedimiento nefelométrico de referencia es
"Calculation of glomerular filtration rate expressed in ml/min
from plasma Cystatin C values in mg/l" de A. Larsson & col.,
en Scand. J. Lab. Invest. 2004; 64, 25-30. Un
procedimiento de acuerdo con la presente invención, que tiene una
correlación mejor con el procedimiento nefelométrico, es, por
supuesto, incluso más adecuado para este fin que los procedimientos
de mediciones turbidimétricas de la técnica anterior.
Claims (18)
1. Un inmunoensayo turbidimétrico para evaluar
Cistatina C humana en una muestra líquida corporal humana por medio
de:
- (a)
- formar una mezcla de ensayo poniendo en contacto dicha muestra con un conjugado de nanopartículas-anticuerpos, que comprende nanopartículas adecuadas para medición turbidimétrica, en la que dichas nanopartículas están recubiertas con un recubrimiento de material proteináceo que comprende anticuerpos de Cistatina C anti-humana o fragmentos que se unen al antígeno de los mismos, para unirse a dicha Cistatina C, en la que dichas nanopartículas recubiertas tienen un diámetro medio en el intervalo de más de 58 nm hasta 200 nm, y
- (b)
- evaluar el contenido en Cistatina C humana midiendo el cambio en turbidez de dicha mezcla; en la que el recubrimiento es de tal forma que dichas nanopartículas están recubiertas con del 10% al 35% de anticuerpo que se une a Cistatina C humana por peso total del conjugado nanopartículas-anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un inmunoensayo turbidimétrico para evaluar
Cistatina C humana en una muestra líquida corporal humana por medio
de:
- (a)
- formar una mezcla de ensayo poniendo en contacto dicha muestra con un conjugado de nanopartículas-anticuerpos, que comprende nanopartículas adecuadas para medición turbidimétrica, en la que dichas nanopartículas están recubiertas con un recubrimiento de material proteináceo que comprende anticuerpos de Cistatina C anti-humana aviar o fragmentos que se unen al antígeno de los mismos, para unirse a dicha Cistatina C, en la que dichas nanopartículas recubiertas tienen un diámetro medio en el intervalo de más de 58 nm hasta 200 nm, y
- (b)
- evaluar el contenido en Cistatina C humana midiendo el cambio en turbidez de dicha mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dichos anticuerpos son anticuerpos policlonales, no humanos,
no roedores, contra Cistatina C humana.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que dichos anticuerpos policlonales son anticuerpos aviares
contra Cistatina C humana.
5. El procedimiento de una de las
reivindicaciones 3 y 4, en la que al menos el 25% en peso de dichos
anticuerpos policlonales o fragmentos se han obtenido por
purificación por afinidad con Cistatina C humana.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2,
en el que los anticuerpos comprenden (a) anticuerpos monoclonales
que se unen a un solo epitope de Cistatina C humana o (b) un
conjunto de dos o más especies de anticuerpos monoclonales, en el
que cada especie de anticuerpo monoclonal se une a un epitope
diferente de Cistatina C humana o dos o más especies se unen a
epitopes idénticos con fuerza de unión diferente.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que los anticuerpos monoclonales son de origen no humano.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las nanopartículas
recubiertas están recubiertas con una mezcla de anticuerpo de
Cistatina C anti-humana y al menos una proteína
inerte.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la proteína inerte es hidrófila, en particular seleccionada
de hemocianina de lapa, haptoglobina, albúminas y transferrinas.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cambio en turbidez se
mide a través del cambio en dicha absorbancia de la luz de la mezcla
del ensayo a una longitud de onda en el intervalo de 500 nm a 600 nm
y a una temperatura en el intervalo de 10 a 50 grados Celsius.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que dicho cambio en turbidez,
expresado como unidades / cm de mAb, para luz de una longitud de
onda de 546 nm es
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 75 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla; o
en el que dicho cambio en turbidez, expresado
como unidades / cm de mAb, para luz de una longitud de onda de 505
nm es
más de 20 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 50 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 90 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla; o
para luz de de una longitud de onda de 570 nm
de
más de 10 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 30 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 80 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 260 segundos después de formar la mezcla; o
para luz de de una longitud de onda de 546 nm
de
más de 12 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 25 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 70 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 32º Celsius
durante 600 segundos después de formar la mezcla; o
para luz de de una longitud de onda de 546 nm
de
más de 8 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 20 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 50 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 120 segundos después de formar la mezcla; o
para luz de de una longitud de onda de 648 nm
de
más de 4 unidades/cm de mAb a una concentración
de 9,9 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 7 unidades/cm de mAb a una concentración
de 19,8 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo, o de
más de 15 unidades/cm de mAb a una concentración
de 34,1 \mug de Cistatina C por l en la mezcla de ensayo,
si dicha mezcla se mantiene a 37º Celsius
durante 40 segundos después de formar la mezcla.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por
-cuando se construye una curva de correlación contra procedimientos
nefelométricos- se obtiene un valor de ordenada en el origen de
menos de 0,15 mg/l de Cistatina C para el procedimiento
turbidimétrico para un valor correspondiente de 0 mg/l de Cistatina
C, como se obtiene por medio del procedimiento nefelométrico;
y/o
caracterizado por -cuando se construyen
una curva de correlación contra procedimientos de inmunoensayo no
homogéneos- se obtiene un valor de ordenada en el origen de menos de
0,25 mg/l de Cistatina C para un valor correspondiente de 0 mg/l de
Cistatina C, y/o
caracterizado por tener una interferencia
de 15 mmol/litro de triglicéridos en la muestra experimental de
menos del 6% sobre el valor medido de Cistatina C a un nivel de 1,2
mg de Cistatina C por litro, y/o
caracterizado por tener una desviación de
linealidad por debajo del 5% en un intervalo de medición de 1,32 a
7,5 mg de Cistatina C por litro, y una desviación de linealidad por
debajo del 15% en la región de medición del intervalo de medición de
0,75 a 1,32 mg de Cistatina C por litro.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por determinar
la concentración de Cistatina C de una muestra midiendo la velocidad
inicial del aumento de la absorbancia, (a) registrando directamente
en el momento de la mezcla, o (b) registrando brevemente después de
mezclar en combinación con una extrapolación hacia atrás a la
absorbancia de aumento inicial, o (c) midiendo la diferencia de
absorbancia entre dos o más momentos de tiempo menos de 1 minuto
después de mezclar la muestra y los reactivos.
14. Un procedimiento para la evaluación de la
velocidad de filtración glomerular de un mamífero, comprendiendo
dicho procedimiento la evaluación turbidimétrica de Cistatina C
humana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. Un kit de reactivos o conjunto de reactivos
para la realización del procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, que comprende (a) partículas, que
comprenden inmunopartículas anti-Cistatina C como se
define en una de las reivindicaciones precedentes 1 a 10 en forma
seca o suspendida, (b) un tampón de ensayo en forma seca o disuelta,
y, opcionalmente (c) mezcla(s) de calibrador y
mezcla(s) de control cada una en forma seca o disuelta.
16. El kit de la reivindicación 15, en el que
las partículas y el tampón de ensayo se proporcionan en combinación
en forma seca o suspendida.
17. conjugados de
nanopartículas-anticuerpos de acuerdo con la
definición en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
18. El uso de conjugados de
nanopartículas-anticuerpos de la reivindicación 17
en un inmunoensayo para la evaluación de Cistatina C humana o en un
procedimiento de diagnóstico para la evaluación de la velocidad de
filtración glomerular de un mamífero; o
en un inmunoensayo para la evaluación de
Cistatina C humana o en un procedimiento de diagnóstico para la
evaluación de la disfunción renal.
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