ES2346647T3 - Secuencias de promotores asociados a semillas. - Google Patents
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Abstract
Molécula de ácido nucleico de doble cadena aislada que comprende un promotor bidireccional, que comprende en la dirección 3' a 5' en una primera cadena (a) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:7 o la SEQ ID Nº: 10, y (b) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:8 o la SEQ ID Nº:11, en la que dicho promotor bidireccional, cuando se une operablemente a una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido y una segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido, dirige la expresión de dichas secuencias a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.
Description
Secuencias de promotores asociados a
semillas.
El campo de la invención es el de promotores
asociados a semillas de plantas.
Existe un interés considerable en la
identificación y aislamiento de elementos regulatorios que controlan
la expresión génica en las semillas de plantas; tales promotores
asociados a semillas y específicos de semilla pueden utilizarse en
la generación de plantas transgénicas con las características de
semilla deseadas. Por ejemplo, resultan útiles elementos
regulatorios específicos de semilla para manipular el metabolismo de
lípidos, especialmente la síntesis de ácidos grasos en la semilla,
y para mejorar las características agronómicas como la resistencia
a los herbicidas y pesticidas y la tolerancia a la sequía.
Los genes de proteínas de almacenamiento de la
semilla se encuentran entre los genes de plantas más estrechamente
regulados. La expresión de proteínas de almacenamiento de la semilla
es altamente específica para semillas, y las transcripciones
correspondientes se acumulan a niveles elevados en la fase media a
tardía del desarrollo de la semilla. Se han clonado muchos genes de
proteínas de almacenamiento de semilla a partir de especies de
plantas diversas, y se han analizado en detalle sus promotores
(véase, p. ej., Thomas, 1993, Plant Cell
5:1401-1410). Los elementos promotores, que
constituyen las regiones reguladoras aguas arriba 5', se han
definido funcionalmente por su capacidad de conferir una expresión
específica de semilla del gen reporter de la
beta-glucuronidasa bacteriana (GUS) en plantas
transgénicas (p. ej., Bogue et al. 1990, Mol Gen Genet
222:49-57; Bustos et al. 1989, Plant Cell
1:839-853). El análisis de la deleción de estos
promotores ha permitido a los investigadores definir unas regiones
dentro de cada promotor que resultan críticas para su regulación
global (Bustos et al. 1991, EMBO J
10:1469-1479; Chung, 1995, Ph.D. Dissertation, Texas
A&M University; Nunberg et al 1994, Plant Cell
6:473-486).
En algunos casos, se han mapeado los elementos
reguladores cis y se han clonado los factores de transactivación
que confieren funcionalidad. Se han descubierto elementos en cis que
regulan la expresión de proteínas de almacenamiento de semilla en
genes de una variedad de especies de plantas que incluyen el arroz,
girasol, judías verdes y semillas de soja. Se han identificado las
secuencias conservadas de nucleótidos que se encuentran comúnmente
en las regiones reguladoras específicas de semilla e incluyen la
caja legumina (leg-box) que comprende un elemento
básico de CATGCATG, también denominado elemento de repetición
RY.
El promotor napin (del gen napA que codifica la
proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus) se utiliza
ampliamente para controlar la expresión de los genes biosintéticos
de lípidos en plantas transgénicas (Josefsson et al., 1987,
J Biol Chem 262:12196-201; Stalberg et al.,
1993, Plant Mol Biol 23:671-83; Ellerstrom et
al., 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27). El
promotor oleosina de Brassica napus dirige la expresión del
gen reporter en el embrión y endosperma (Keddie et al., 1994,
Plant Mol Biol 24:327-40). En Arabidopsis,
el promotor FAE1 se ha utilizado para controlar la expresión del
reporter GUS al desarrollar embriones, donde la actividad se
detectó tan pronto como 4-5 días después de la
fertilización (Rossak et al., 2001, Plant Mol Biol
46:717-25). El promotor de la legumina (LeB4;
Baumlein et al., 1991, Mol Gen Genet
225:121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J
2:233-9) de la legumbre Vicia faba también se
ha caracterizado funcionalmente y ha demostrado promover la
expresión específica de semilla de genes heterólogos. La
caracterización de los promotores específicos de semilla se reviso
en Goossens et al., 1999 (Plant Pyhsiol
120:1095-1104).
La gran mayoría de promotores de plantas nativos
son unidireccionales, con un promotor aguas arriba (5') que dirige
sólo un gen que es 3' respecto al promotor. Existen promotores
bidireccionales en algunos procariotas y virus, y se han
identificado promotores bidireccionales que son activos en plantas a
partir de patógenos de plantas virales (geminivirus; Frey et
al., 2001, Virus Genes 22:231-42) y bacterianos
(Agrobacterium; Schmulling et al., 1989, Plant Cell
1:665-70; Leung et al., 1991, Mol Gen Genet
230:463-74). Se ha propuesto una estrategia para
desarrollar promotores bidireccionales, básicamente añadiendo una
región promotora mínima al extremo aguas arriba de un promotor
unidireccional (Xie et al., 2001, Nat Biotechnol
19:677-9). Además, se ha caracterizado un promotor
bidireccional de Brassica napus en el que la región
reguladora controla la expresión específica de semilla en una
dirección mientras en la orientación opuesta, el promotor dirige la
expresión en una variedad de tejidos que incluyen las hojas y las
raíces (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 1994
24:327-40; Sadanandom et al., 1996, Plant J
10:235-42). Sin embargo, no se han descrito
promotores de plantas que controlen la expresión asociada a semilla
en ambas orientaciones.
Las globulinas y las albúminas son proteínas de
almacenamiento de semilla comunes en las plantas dicotiledóneas
(dicots). Estas proteínas pueden distinguirse una de otra en base a
la solubilidad diferencial; las albúminas son solubles en agua,
mientras que las globulinas son solubles en soluciones salinas. En
muchas dicots, incluyendo los cítricos y la almendra (Prunus
amygdalus), las globulinas 12S son las proteínas de
almacenamiento de semilla más prevalentes. Las globulinas 12S son
proteínas multiméricas compuestas por subunidades de dímero. Cada
dímero contiene una subunidad alfa de 30-40 kDa y
una subunidad beta de 20 kDa. Las subunidades de dímero se derivan
de un polipéptido precursor simple que experimenta varias
modificaciones post-traduccionales, que incluyen el
clivaje de un péptido señal seguido del clivaje de la
pre-proteína en las subunidades alfa y beta.
\newpage
Se han aislado de la almendra dos clones de cADN
de longitud completa que codifican proteínas de almacenamiento de
semilla de la globulina 12S de la prunina (Pru1 y Pru2) (Prunus
amygdalus cv Texas; Garcia-Mas et al.,
1995, Plant Mol Biol 27:205-10). Cada transcripción
codifica una pre-proteína que se procesa para crear
las subunidades alfa y beta que comprenden la proteína de
almacenamiento de semilla madura de \sim60 KDa. A nivel de
aminoácido, la Pru1 y Pru2 son idénticas en un 63% a la Pru2 que
contiene dos separaciones en la región que corresponde a la
subunidad alfa. Las dos transcripciones de prunina son específicas
de semilla y se encuentran entre los más abundantes en las semillas
inmaduras. Aparentemente las principales proteínas de almacenamiento
en la almendra son globulinas tipo legumina que consisten en dos
pares de polipéptidos, cada par codificado por un único gen
(Garcia-Mas
et al., 1995).
et al., 1995).
De acuerdo con un primer aspecto, la presente
invención proporciona un constructo de ácido nucleico según se
define en la reivindicación 1. La invención abarca un promotor
bidireccional (PRU) que tiene una actividad de promotores asociados
a semilla que comprende en la dirección 3' a 5', las siguientes
regiones: (a) una secuencia del promotor mínimo que contiene una
caja TATA, y (b) una secuencia que confiere la especificidad de
semilla que contiene un motivo con similitud al consenso caja
legumina CATGCATG. En algunas formas de realización el promotor PRU
comprende adicionalmente (c) un motivo de secuencia aguas arriba que
se predice que funciona como elemento potenciador. El promotor PRU
es bidireccional, teniendo una cadena complementaria que también
comprende unas regiones (a) y (b), y opcionalmente (c). En una forma
de realización de la invención, el promotor PRU bidireccional se
utiliza en un vector de expresión de doble cadena de la planta que
comprende, en la orientación 5' a 3', una primera secuencia de
codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido, el
promotor PRU, y una segunda secuencia de codificación heteróloga en
dirección sentido, en la que el promotor PRU dirige la expresión
asociada a semilla de la primera y de la segunda secuencia de
codificación de una proteína heteróloga. De acuerdo con un segundo
aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión en
plantas según se define en la reivindicación 9. De acuerdo con un
tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula de planta
transgénica según la reivindicación 12. De acuerdo con un cuarto
aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una
planta transgénica, método según se define en la reivindicación 16.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona
una planta transgénica según se define en la reivindicación 17. De
acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona una
parte de una planta según se define en la reivindicación 21.
Las figuras 1A y 1B muestran un alineamiento de
la secuencia completa del nucleótido del promotor ChPRU (cadena
superior en la Fig. 1; SEQ ID Nº:1) con su complemento inverso
(cadena inferior; SEQ ID Nº:6). Las siguientes características se
indican en texto en cursiva y en negrita para cada secuencia: (1)
caja TATA putativa, (2) motivo con similitud al consenso caja
legumina CATGCATG, y (3) un motivo de secuencia aguas arriba común
a ambas orientaciones del promotor ChPRU. Cada una de estas
características está asociada a regiones de alta identidad entre la
secuencia del promotor ChPRU y su complemento inverso, indicado
mediante subrayado, y se predice que funcionan como (1) secuencias
del promotor mínimo, (2) secuencias que confieren la especificidad
de semilla, y (3) elementos potenciadores.
Se describen secuencias aisladas de ácidos
nucleicos correspondientes a promotores bidireccionales que dirigen
la expresión específica de semilla en la semilla de una planta. Se
describen genes quiméricos, constructos de ADN, y vectores de
transformación de plantas que son útiles para la expresión de genes
heterólogos y para la generación de tejido de plantas transgénicas
con las características deseadas.
Identificamos los ortólogos putativos de la
cereza (Prunus avium) del gen de la prunina de la almendra
(Prunus amygdalus), y recuperamos la secuencia del promotor
asociado, que hemos denominado "promotor chPRU". Tal como se
utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia del
promotor" se refiere a una secuencia de una molécula de ADN que
dirige la transcripción de un gen aguas abajo al que está unida
operablemente. La expresión "unido operablemente" en relación
con un vector o constructo de ADN recombinante significa que los
componentes del nucleótido del vector o constructo de ADN
recombinante se encuentran en relación funcional con otra secuencia
de ácido nucleico. Más concretamente, en el contexto de un promotor,
"unido operablemente" significa que la transcripción o
traducción de la secuencia del nucleótido heterólogo está bajo la
influencia de la secuencia del promotor. Por ejemplo, un promotor
está unido operablemente a una secuencia de codificación si afecta
a la transcripción de la secuencia. Las secuencias unidas
operablemente suelen ser, aunque no siempre, contiguas (por
ejemplo, los potenciadores no suelen ser contiguos a las secuencias
cuya expresión afectan).
Se descubrió que el promotor aislado dirigía la
expresión de genes asociados a semilla de alto nivel cuando se unía
operablemente a las secuencias de codificación heterólogas. Tal como
se utiliza en la presente memoria, las expresiones "promotor PRU
aislado" y "promotor chPRU" se refieren a un ácido nucleico
que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1 o el
complemento inverso de la misma, la SEQ ID Nº:6. La expresión
también abarca fragmentos y derivados de las mismas que conservan la
actividad de promotores asociados a semilla según se analiza en
mayor detalle más adelante. Tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión "promotor asociado a semilla" se refiere
a un promotor que dirige la síntesis de ARN a niveles más altos en
las semillas que en otras células y tejidos. Un promotor
"específico de semilla" es un promotor asociado a semilla que
dirige la síntesis de ARN básicamente sólo en la semilla. Pero, bajo
determinadas condiciones y utilizando unos métodos de detección
concretos, pueden detectarse niveles muy bajos de expresión en
tejido diferente de la semilla a partir de un promotor específico
de semilla.
Hemos descubierto que el promotor chPRU es
bidireccional porque dirige la expresión de genes que lo flanquean
a cada lado, lo que hemos denominado ChPru1 y ChPru2. La secuencia
proporcionada en la SEQ ID Nº:1 se encuentra en la misma
orientación 5' a 3' como la orientación sentido del gen que tiene la
mayor homología con la Pro2 de la almendra, lo que hemos denominado
chPru2. Su complemento inverso (SEQ ID Nº:6) se encuentra en la
misma orientación 5' a 3' que el gen que hemos denominado chPru1. Un
experto en la materia entenderá que una molécula de ácido nucleico
de doble cadena (p. ej. ADN) que comprende una secuencia específica
comprende intrínsecamente el complemento inverso de esa secuencia.
Sin embargo, puesto que las secuencias en una u otra orientación
pueden ser importantes para utilidades concretas, puesto que puede
haber ocasiones en las que se utilicen moléculas de ácido nucleico
de una sola cadena, y puesto que el promotor PRU aislado funciona
de manera bidireccional, se detallan específicamente las secuencias
en ambas orientaciones.
En una forma de realización preferente, el
promotor PRU de la presente invención es bidireccional, y comprende
la secuencia proporcionada en la SEQ ID Nº:1. En otra forma de
realización preferente, el promotor PRU de la presente invención
comprende el complemento inverso de la secuencia proporcionada en la
SEQ ID Nº:1, como se proporciona en la SEQ ID Nº:6. Las secuencias
del promotor PRU también pueden definirse como secuencias situadas
naturalmente aguas arriba del codón de inicio de la traducción de un
gen chPru1 o chPru2 en el genoma de la cereza, secuencias que son
capaces de dirigir la expresión asociada a semilla de chPru1 o
chPru2. Los genes chPru1 y chPru2 pueden identificarse por
fragmentos de sus secuencias de codificación, que se describen en
la presente memoria como SEQ ID Nº:2 (chPru1) y SEQ ID Nº:3
(chPru2). El codón de inicio predicho de chPru1 se encuentra en los
nucleótidos 1-3 de la SEQ ID Nº:2. Existen dos
codones de inicio potenciales predichos para chPru2, y éstos se
sitúan en los nucleótidos 1-3 de la SEQ ID Nº:3 y en
los nucleótidos 7-9 de la SEQ ID Nº:3 (el marco de
lectura de la proteína no se vería afectado por qué codón de inicio
se utiliza).
Aunque toda la secuencia de un promotor PRU
aislado es suficiente para la actividad de promotores asociados a
semilla, también serán suficientes secuencias menores o alteradas.
De esta manera, se incluyen en el alcance de los promotores PRU
para su uso en la presente invención los derivados (que incluyen
fragmentos y variantes) de los promotores PRU aislados, derivados
que son promotores según se define en la reivindicación 1 y son
capaces de dirigir la expresión asociada a semilla de genes
heterólogos a los que los promotores se unen operablemente; tales
derivados se denominan "funcionalmente activos".
Los derivados incluyen inserciones, deleciones
(que incluyen truncamientos 5' y/o 3') y sustituciones de uno o más
nucleótidos. Tales derivados pueden ser naturales (p. ej.,
secuencias polimórficas) o pueden ser sintéticos (incluyendo las
variantes de las secuencias descritas que resulten de la mutagénesis
aleatoria o dirigida al sitio) y pueden obtenerse utilizando
métodos conocidos por los expertos en la materia. Los métodos
mediante los que puede determinarse empíricamente si una secuencia
derivada candidata es lo suficientemente homóloga al promotor PRU
aislado para dirigir la expresión de genes asociados a semilla son
bien conocidos en la técnica y se describen en la presente
memoria.
Se espera que los fragmentos de las secuencias
del promotor chPRU descritas que conservan la actividad de
promotores asociados a semilla comprendan mínimamente un dominio del
promotor mínimo y un dominio que confiera especificidad de semilla.
Estas regiones están contenidas en los nucleótidos
1.055-1.212 de la SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos
1.043-1.198 de la SEQ ID Nº:6. De esta manera, en
una forma de realización de la invención, el promotor chPRU
derivado es unidireccional y comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada de entre los nucleótidos 1.055-1.212
de la SEQ ID Nº:1, y los nucleótidos 1.043-1.198 de
la SEQ ID Nº:6. Preferentemente, el promotor chPRU derivado
comprende adicionalmente un dominio potenciador putativo, y así
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre los
nucleótidos 854-1.212 de la SEQ ID Nº:1, y los
nucleótidos 827-1.198 de la SEQ
ID Nº:6.
ID Nº:6.
Se puede hacer referencia a la figura 1 para
orientarse en la fabricación de la secuencia chPRU derivada que
comparte menos del 100% de la identidad con las SEQ ID N^{os} 1 y
6, y fragmentos de las mismas. En general, se espera que las
regiones que comparten una gran identidad con una alineación de la
SEQ ID Nº:1 (cadena superior) y su complemento inverso (cadena
inferior; SEQ ID Nº:6) contribuyan a la función promotora asociada
a semilla y deberían conservarse por lo general en las secuencias
derivadas del promotor chPRU. Estas regiones están subrayadas en la
Figura 1. Se espera que las regiones de menor identidad resulten
innecesarias para la función del promotor asociado a semilla, y
puedan por tanto variar sustancialmente en las secuencias derivadas
correspondientes, p. ej., que puedan variar en longitud (es decir,
que puedan servir como regiones espaciadoras de longitud variable)
y/o puedan variar en la identidad de secuencia. Las secuencias
dentro de la SEQ ID Nº:1 que se predice que funcionan como (1)
secuencia del promotor mínimo, (2) secuencia que confiere la
especificidad de semilla, y (3) elemento potenciador, como se
muestra en la Figura 1, se exponen en las SEQ ID N^{os}:
7-9, respectivamente. Y, las secuencias dentro de la
SEQ ID Nº:6 que se predice que funcionan como (1) secuencia del
promotor mínimo, (2) secuencia que confiere la especificidad de
semilla, y (3) elemento potenciador, se exponen en las SEQ ID
N^{os}: 10-12,
respectivamente.
respectivamente.
Las SEQ ID N^{os} 7 y 10, que se corresponden
con las regiones del promotor mínimo predichas del promotor chPRU,
comparten aproximadamente el 85% de identidad de secuencia entre sí.
De esta manera, una secuencia chPRU derivada comprende una región
del promotor mínimo que comparte por lo menos un 80% de identidad de
secuencia con la SEQ ID Nº: 7 ó 10, y preferentemente por lo menos
un 85% de identidad de secuencia con SEQ ID Nº: 7 ó 10. Tal como se
utiliza en la presente memoria, "porcentaje (%) de la identidad de
secuencia" con respecto a una secuencia sujeto especificada, o
una parte especificada de la misma, se define como el porcentaje de
nucleótidos en la secuencia derivada candidata idénticos a los
nucleótidos de la secuencia sujeto (o parte especificada de la
misma), después de alinear las secuencias e introducir las
separaciones, en caso de ser necesario para lograr el porcentaje
máximo de identidad de secuencia, según se genera mediante el
programa WU-BLAST-2.0a19 (Altschul
et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403-410;
http://blast.wustl.edu/blast/README.html) con unos parámetros de
búsqueda establecidos a valores por defecto. Los parámetros HSP S y
HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el propio programa
dependiendo de la composición de la secuencia concreta y la
composición de la base de datos concreta contra la que se está
buscando la secuencia de interés. Un % de valor de identidad se
determina mediante el número de nucleótidos idénticos coincidentes
divido por la longitud de la secuencia para la que se está
describiendo el porcentaje
de identidad.
de identidad.
Las SEQ ID N^{os} 8 y 11, que se corresponden
con las regiones que confieren la especificidad de semilla del
promotor chPRU, comparten aproximadamente un 87% de identidad de
secuencia entre sí. De esta manera, una secuencia chPRU derivada,
además de la región del promotor mínimo anteriormente descrita,
comprende adicionalmente una secuencia que confiere la
especificidad de semilla que comparte por lo menos un 80% de
identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 8 ó 11, y preferentemente
por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID
Nº:
8 ó 11.
8 ó 11.
Como se ha indicado anteriormente, se espera que
una región del promotor mínimo y la región que confiere la
especificidad de semilla sean suficientes para la actividad de
promotores asociados a semilla. De esta manera, en una forma de
realización de la invención, un promotor chPRU derivado comprende de
la dirección 5' a 3' una secuencia que confiere la especificidad de
semilla, y una secuencia del promotor mínimo. En unas formas de
realización preferentes, el promotor chPRU derivado comprende
adicionalmente un elemento potenciador putativo que se encuentra
aguas arriba (es decir, 5') de la región que confiere la
especificidad de semilla. Las SEQ ID N^{os} 9 y 12, se
corresponden con las regiones potenciadoras predichas del promotor
chPRU, y comparten aproximadamente un 80% de identidad de secuencia
entre sí. De esta manera, una secuencia chPRU derivada comprende
preferentemente una región potenciadora putativa que comparte por lo
menos un 75% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº: 9 ó 12, y
preferentemente por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la
SEQ ID Nº: 7 ó 10.
Las secuencias derivadas pueden identificarse
por su capacidad de hibridación con un promotor PRU aislado bajo
condiciones de hibridación rigurosas. El rigor de hibridación puede
controlarse mediante temperatura, fuerza iónica, pH, y la presencia
de agentes desnaturalizantes como la formamida durante la
hibridación y el lavado. Las condiciones utilizadas rutinariamente
se presentan en textos de procedimientos fácilmente accesibles (p.
ej., Current Protocol in Molecular Biology, Vol. 1, Cap. 2.10, John
Wiley & Hijos, Publishers (1994); Sambrook et al.,
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1989)). En algunas formas de
realización, una molécula de ácido nucleico de la invención es
capaz de hibridar con una molécula de ácido nucleico que contenga
la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID Nº:1 o el complemento de la
misma bajo condiciones de hibridación rigurosas que comprenden: la
prehibridación de filtros que contienen el ácido nucleico durante 8
horas hasta toda la noche a 65ºC en una solución que comprende 6X
de citrato salino estándar (SSC) (1X SSC es 0,15 M de NaCl, 0,015
M de citrato de Na; pH 7,0), 5X solución de Denhardt, pirofosfato de
sodio al 0,05% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de arenque;
hibridación durante 18-20 horas a 65ºC en una
solución que contenía 6X SSC, 1X solución de Denhardt, 100
\mug/ml de tARN de levadura y pirofosfato de sodio al 0,05%; y
lavado de filtros a 65ºC durante 1 h en una solución que contenía
0,2X SSC y SDS al 0,1% (dodecil sulfato de sodio). En otras formas
de realización, se utilizan condiciones de hibridación moderadamente
rigurosas que comprenden: pretratamiento de filtros que contienen
ácido nucleico durante 6 h a 40ºC en una solución que contiene
formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5),
5 mM EDTA, PVP al 0,1%, Ficoll al 0,1%, BSA al 1%, y 500 \mug/ml
de ADN de esperma de salmón desnaturalizado; hibridación durante
18-20 h a 40ºC en una solución que contiene
formamida al 35%, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5),
5 mM EDTA, PVP al 0,02%, Ficoll al 0,02%, BSA al 0,2%, 100 \mug/ml
ADN de esperma de salmón, y sulfato de dextran al 10%(peso/vol);
seguido de lavar dos veces durante 1 hora a 55ºC en una solución
que contiene 2X SSC y SDS al 0,1%. De manera alternativa, pueden
utilizarse condiciones poco rigurosas que comprenden: incubación
durante 8 horas hasta toda la noche a 37ºC en una solución que
comprende formamida al 20%, 5 x SSC, 50 mM fosfato de sodio (pH
7,6), 5X solución de Denhardt, sulfato de dextran al 10%, y 20
\mug/ml de ADN de esperma de salmón cizallado desnaturalizado;
hibridación en el mismo tampón durante 18 a 20 horas; y lavado de
filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37ºC durante
1 hora.
1 hora.
Además de los promotores chPRU y derivados
anteriormente descritos, la presente invención se dirige a otras
secuencias de promotores que se corresponden con el mismo gen, es
decir, un ortólogo, en otras especies de plantas. Hemos mostrado
que, además de la almendra y la cereza, el albaricoque (Prunus
armeniaca), el melocotón (Prunus persica), y la ciruela
(Prunus domestica) también expresan la globulina 12S como
proteína de almacenamiento de semilla principal. Por consiguiente,
un promotor PRU de la invención puede aislarse a partir de una de
estas especies. En base a las secuencias de codificación Pru1 y Pru2
de la almendra (Garcia-Mas et al., 1995,
supra) y los métodos descritos en la presente memoria, sería
de rutina para la persona experta en la materia aislar promotores
PRU a partir de estas especies. En un ejemplo, se construye una
biblioteca adaptada a PCR de ADN genómico a partir de las especies
de interés (véase, p. ej., "PromoterFinder^{TM} Construction
Kit," CLONTECHniques, julio 1996). Los cebadores oligonucleótidos
se diseñan para la secuencia 5' del cADN de Pru1 de almendra y se
utilizan para amplificar una región genómica aguas arriba de la
región homóloga de las especies de interés. Secuencias de
oligonucleótidos de ejemplo utilizadas para amplificar la secuencia
de la prunina de cereza se proporcionan en las SEQ ID N^{os}: 4 y
5. Se utiliza el análisis de secuencias para confirmar que la
secuencia de promotor aislada contiene una región de homología a la
secuencia del gen de la prunina conocida.
La invención se refiere a unos genes quiméricos
(casetes de expresión) que comprenden unas secuencias de
nucleótidos del promotor PRU aislado, o un derivado funcionalmente
activo del mismo, unido operablemente a, y que controla la
expresión de un gen heterólogo. Las expresiones "gen quimérico"
y "casete de expresión" se refieren a una secuencia de
nucleótidos que codifican una proteína que comprende unas secuencias
que son heterólogas una respecto a la otra (es decir, no se dan
conjuntamente de forma natural). Un gen quimérico de la presente
invención comprende una secuencia del promotor PRU que es heteróloga
con respecto a las secuencias que codifican la proteína. De esta
manera, un gen quimérico puede comprender una secuencia que codifica
una proteína que sea nativa de una planta, pero heteróloga con
respecto al promotor unido operablemente. De esta manera, el gen
heterólogo puede ser cualquier gen diferente de chPRU1 o chPRU2. Tal
como se utiliza en la presente memoria, el término "gen"
significa un segmento de ADN implicado en la producción de una
cadena polipeptídica, que puede incluir o no regiones que preceden
y siguen a la región de codificación, p. ej. secuencias 5' no
traducidas (5'UTR) o "líder" y secuencias 3'UTR o
"remolque", así como secuencias de intervención (intrones)
entre segmentos de codificación individuales (exones). El término
"gen" puede utilizarse como sinónimo de las expresiones
"secuencia de codificación de un ácido nucleico heterólogo" o
la expresión "secuencia de codificación de una proteína".
Un casete de expresión incluye por lo general,
en la dirección de transcripción 5' a 3', una región de inicio de
la transcripción y la traducción que comprende un promotor sujeto y
una secuencia de codificación de proteínas para un gen heterólogo
(también denominado "gen de interés"). En una forma de
realización preferente, el casete de expresión incluye
adicionalmente, 3' respecto a la secuencia de codificación de la
proteína, una región de terminación de la transcripción y la
traducción funcional en las plantas. La región de terminación, que
por lo general incluye un sitio de poliadenilación, puede ser nativa
del gen de interés o puede derivarse de otra fuente (véase, p. ej.:
Guerineau et al. 1991, Mol. Gen. Genet.
262:141-144; Sanfacon et al. 1991, Genes
Dev. 5:141-149; Mogen et al. 1990, Plant Cell
2:1261-1272; Joshi et al. 1987, Nucleic Acid
Res. 15:9627-9639). Regiones de terminación
convenientes están disponibles en el plásmido Ti de A.
tumefaciens, como regiones de terminación de la octopina sintasa
y la nopalina sintasa. En caso necesario, se incluyen en los
constructos quiméricos elementos reguladores adicionales de genes
diferentes de chPRU1 o chPRU2 suficientes para expresar una
cantidad efectiva de polipéptido codificado por el gen
heterólogo.
Las técnicas estándares para la construcción de
tales genes quiméricos son bien conocidas por las personas
capacitadas en la técnica (p, ej., Sambrook et al. Molecular
Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e incluyen
la ligación de ADN, así como la síntesis química o enzimática.
Los promotores PRU de la invención pueden
utilizarse en constructos quiméricos diseñados para inhibir
específicamente la expresión de un gen endógeno en la semilla
transformada. Métodos de ejemplo para practicar este aspecto de la
invención incluyen, pero no se limitan a la supresión antisentido
(Smith, et al., 1988; van der Krol et al., 1988);
cosupresión (Napoli, et al., 1990); ribozimas (publicación
PCT WO 97/10328); y combinaciones de sentido y antisentido
(Waterhouse, et al., 1998). Los métodos para la supresión de
secuencias endógenas en una célula huésped emplean por lo general la
trascripción o la trascripción y traducción de por lo menos una
parte de la secuencia a suprimir. Tales secuencias pueden ser
homólogas de las regiones de codificación así como las de no
codificación de la secuencia endógena. La inhibición antisentido
puede utilizar toda la secuencia de cADN (Sheehy et al.,
1988), una secuencia parcial de cADN que incluya fragmentos de la
secuencia de codificación 5', (Cannon et al., 1990), o
secuencias de no codificación 3' (Ch'ng et al., 1989). Las
técnicas de cosupresión pueden utilizar toda la secuencia de cADN
(Napoli et al. 1990, The Plant Cell
2:270-289; van der Krol et al., 1990, Plant
Mol Biol 14:457-466), o una secuencia de cADN
parcial (Smith et al., (1990). Tal como se utiliza en la
presente memoria, la expresión "constructos y genes quiméricos de
la invención" abarca tales constructos destinados específicamente
a inhibir la expresión de un
gen endógeno.
gen endógeno.
Los constructos y genes quiméricos de la
invención se encuentran contenidos por lo general dentro de
vectores de plantas (también denominados "vectores de expresión en
plantas" y "vectores de transformación en plantas") que
facilitan su introducción y uso en plantas y células de plantas. Un
vector de expresión en plantas contiene todos los elementos para
expresar un gen en una planta (es decir, un casete de expresión), y
un vector de transformación de plantas también suele contener
elementos que permiten que el casete de expresión se integre en el
genoma de la planta.
Además del gen quimérico o del constructo de
inhibición genética que comprende un promotor PRU, los vectores de
la presente invención pueden comprender otras secuencias
funcionales. Secuencias de ejemplo incluyen genes marcadores
seleccionables que permiten la selección de las células de plantas
transformadas haciendo a las células resistentes a una cantidad de
agente que resultaría tóxico para las células de plantas no
transformadas. Genes marcadores seleccionables de ejemplo incluyen
el gen de resistencia neomicina fosfotransferasa (nptll),
higromicina fosfotransferasa (hpt), nitrilasa específica para
bromoxinil (bxn), enzima fosfinotricin acetiltransferasa
(BAR) y el gen de resistencia espectinomicina (spt), en el
que el agente selectivo es kanamicina, higromicina, geneticina, el
herbicida glufosinato de amonio ("Basta") o espectinomicina,
respectivamente. Los vectores pueden contener secuencias
adicionales que permiten la selección y propagación en un huésped
secundario, como un origen de replicación y una secuencia marcadora
seleccionable. Huéspedes secundarios típicos incluyen bacterias y
levadura. En una forma de realización, el huésped secundario es
Escherichia coli, el origen de replicación es de tipo
colE1, y el marcador seleccionable es un gen que codifica la
resistencia a la ampicilina. Los vectores de la invención pueden
comprender adicionalmente secuencias que faciliten la integración
de genes quiméricos en los cromosomas de las plantas, como regiones
del plásmido Ti de Agrobacterium tumifaciens. Los sistemas
de vectores basados en Ti binarios que pueden utilizarse para
transferir polinucleótidos son conocidos por los expertos en la
materia, y muchos están comercialmente disponibles (p. ej., pBI121
Clontech Laboratories, Palo Alto, CA).
Dependiendo del vector, toda la secuencia del
ácido nucleico del vector de expresión o parte de la misma puede
transferirse al genoma de la célula de la planta en la que se
introduce. Por ejemplo, para vectores binarios que comprenden unas
regiones de borde izquierdo y derecho del plásmido Ti de
Agrobacterium, la secuencia de ácido nucleico insertada
entre las secuencias de borde izquierdo y derecho suele transferirse
al genoma de la célula de una planta, mientras que la secuencia de
esqueleto del vector no suele transferirse. De esta manera, cuando
se dice que una célula de una planta transgénica comprende un vector
de expresión en planta en su genoma, se entenderá que sólo puede
comprender la parte del vector que se transfiere normalmente al
genoma de la planta.
Una característica importante de la presente
invención es la bidireccionalidad del ADN del promotor PRU aislado.
Hemos observado que el ADN del promotor aislado es funcional en
ambas orientaciones; por consiguiente, la invención proporciona
unos vectores en los que el promotor PRU controla simultáneamente la
expresión específica de semilla de dos genes heterólogos distintos,
así como unos métodos para controlar simultáneamente la expresión
específica de semilla de dos genes heterólogos. Tales vectores
comprenden por lo general, en dirección 5' a 3', un primer gen
heterólogo en dirección antisentido, un promotor PRU bidireccional,
un segundo gen heterólogo en dirección sentido. Cada gen heterólogo
puede asociarse con secuencias de terminación de la traducción en
la orientación y posición apropiada. Un constructo de inhibición
genética puede sustituir uno de los genes heterólogos.
La invención proporciona el primer ejemplo de un
promotor bidireccional que controla una expresión asociada a
semilla similar en cada orientación. La bidireccionalidad del
promotor PRU aislado proporciona ventajas específicas para la
ingeniería genética de las plantas. Primero, la característica
facilita la introducción de múltiples genes en plantas, lo que es a
menudo necesario para la ingeniería metabólica y la acumulación de
características. El uso del promotor bidireccional puede además
evitar el silenciamiento de genes, que puede ser inducido por el
uso repetido de un único promotor en una célula.
Los vectores descritos en la presente memoria
pueden formar parte de un kit de transformación de plantas.
Los constructos y genes quiméricos de la
invención pueden transferirse a células de plantas mediante
cualquier serie de metodologías de transformación de plantas. El
experto en la materia reconocerá que existen en la técnica una
amplia variedad de técnicas de transformación, y que nuevas técnicas
están disponibles continuamente. Puede emplearse cualquier técnica
adecuada para la planta huésped diana dentro del alcance de la
presente invención. Por ejemplo, los constructos pueden
introducirse en una variedad de formas que incluyen, pero no se
limitan a una cadena de ADN, en un plásmido, o en un cromosoma
artificial. La introducción de los constructos en las células de la
planta diana puede llevarse a cabo mediante una variedad de
técnicas, que incluyen, pero no se limitan a la transformación
mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyección,
bombardeo de microproyectiles, co-precipitación de
ADN-fosfato de calcio o transformación mediada por
liposomas de un ácido nucleico heterólogo. La transformación de la
planta es preferentemente permanente, es decir, por integración de
los constructos de expresión introducidos en el genoma de la planta
huésped, de manera que se hagan pasar los constructos introducidos
por las sucesivas generaciones de plantas.
En una forma de realización, los genes
quiméricos se introducen en las plantas por medio de un plásmido Ti
sin ADN-T portado por Agrobacterium
tumefaciens, seguido de un co-cultivo de células
de A. tumefaciens con células de plantas. En tales casos,
los vectores para su uso en la invención contienen un gen marcador
seleccionable para determinar si el suceso de transformación ha
tenido éxito, las regiones de borde T-ADN de
Agrobacterium tumefaciens, un gen heterólogo de interés, y
otros elementos como se deseaba.
\newpage
El procedimiento óptimo para la transformación
de plantas con vectores Agrobacterium variará con el tipo de
planta que se está transformando. Métodos de ejemplo para la
transformación mediada por Agrobacterium incluyen la
transformación de explantes de hipocotilo, punta apical, tejido de
la hoja o tallo, derivado de plántulas y/o plantas de semillero
estériles. Tales plantas transformadas pueden reproducirse
sexualmente, o mediante cultivo tisular o celular. La
transformación por Agrobacterium se ha descrito anteriormente
para un gran número de tipos diferentes de plantas y métodos para
tal transformación pueden encontrarse en la literatura científica.
Resultan de particular relevancia los métodos para transformar las
cosechas comercialmente importantes, como la semilla de colza (De
Block et al., 1989, Plant Physiol
91:694-701), girasol (Everett et al., 1987,
Bio/Technology 5:1201), y semillas de soja (Christou et al.,
1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:7500-7504; Kline
et al., 1987, Nature 327:70). También son relevantes los
métodos para la transformación de las especies con prunina, que
incluyen la almendra (Miguel et al. 1999, Plant Cell Reports
18:387-93), cereza (Brasileiro et al. 1991,
Plant Mol Biol 17:441-52; Dolgov et al. 1998,
Acta Hort. [ISHS] 484:577-580), albaricoque y
ciruela (Camara Machado et al. 1994, Euphytica
77:129-134; Ravelonandro et al. 1998, Acta
Virol 42:270-2), y melocotón (Scorza et al.
1989, Acta Hort. (ISHS) 254:47-47).
La invención proporciona plantas transgénicas o
la progenie de estas plantas que contiene constructos y genes
quiméricos de la invención. Las células de las plantas se
transforman con los genes quiméricos mediante cualquier método de
transformación de plantas. La célula de la planta progenitora
transformada, habitualmente en forma de un cultivo de callo, disco
de hoja, explante o toda la planta (p. ej., a través del método de
infiltración al vacío de Bechtold et al. 1993, CR Acad Sci
316:1194-1199) se regenera en una planta transgénica
completa mediante métodos bien conocidos para una persona
capacitada en la técnica (p. ej., Horsh et al., 1985). Tal
como se utiliza en la presente memoria una "célula progenitora
transformada" se refiere a una célula transformada que dará
lugar directamente o indirectamente a la planta transgénica. Cuando
el gen quimérico se porta en un vector que contiene un gen marcador
seleccionable que se ha utilizado, las células progenitoras pueden
cultivarse en un medio que contenga el agente de selección apropiado
para identificar y células de plantas que comprenden el gen
quimérico. Puesto que la progenie de plantas transformadas hereda
los genes quiméricos, pueden utilizarse las semillas o cortes de
las plantas transformadas para mantener la línea transgénica.
La presencia del constructo o gen quimérico en
las plantas transformadas o células de plantas puede detectarse
utilizando PCR, transferencia de Southern, u otros métodos conocidos
para la detección de las secuencias específicas de ADN. La
expresión del gen heterólogo o la inhibición de un gen endógeno
pueden evaluarse utilizando la transferencia Northern,
RT-PCR, u otros métodos conocidos de detección de la
síntesis de las especies de nARN específicas. Si hay disponibles
anticuerpos para el polipéptido codificado por el gen heterólogo,
pueden utilizarse el análisis de Western y la localización
inmunohistoquímica para evaluar la producción y localización del
polipéptido. La expresión de un gen heterólogo o inhibición de un
gen endógeno también puede evaluarse midiendo la actividad del
producto del gen, por ejemplo utilizando las técnicas bioquímicas
descritas en la presente memoria.
Los métodos descritos en la presente memoria son
aplicables generalmente a todas las plantas. Se contemplan tanto
las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas (monocots y
dicots). En las plantas cultivadas dicot, el embrión constituye
casi toda la semilla, mientras que en los cultivos monocot, el
embrión es una pequeña parte de toda la semilla. El grueso de la
semilla monocot está comprendido por endosperma, un tejido
triploide que sirve de fuente energética para el embrión en
germinación. En las monocots, se espera que el promotor PRU dirija
la expresión en el embrión y por tanto resulte útil para la
manipulación de las características de los embriones, como el
contenido en aceite y la calidad del aceite, así como la expresión
de las proteínas de almacenamiento embrionarias.
En una aplicación preferente la invención se
refiere a frutales y plantas de nuez del género Prunus,
incluyendo la almendra, el albaricoque, la cereza, el melocotón, y
la ciruela. En otra forma de realización preferente, la invención
se refiere a plantas productoras de aceite, que producen y almacenan
triacilglicerol en órganos específicos, fundamentalmente en las
semillas. Tales especies incluyen la semilla de soja (Glycine
max), semilla de colza y canola (incluyendo Brassica
napus, B. campestris), girasol (Helianthus
annus), algodón (Gossypium hirsutum), maíz (Zea
mays), cacao (Theobroma cacao), cártamo (Carthamus
tinctorius), palma de aceite (Elaeis guineensis), palma
de coco (Cocos nucifera), lino (Linum usitatissimum),
ricino (Ricinus communis) y cacahuete (Arachis
hypogaea). La invención también puede referirse a plantas de
vegetales y frutas, plantas productoras de granos, plantas
productoras de nueces, especies de Brassica de ciclo rápido,
alfalfa (Medicago sativa), tabaco (Nicotiana), césped
(familia Poaceae), otros cultivos de forraje, y especies
silvestres que pueden ser una fuente de ácidos grasos únicos. La
invención se refiere adicionalmente a especies de plantas modelo,
incluyendo la Arabidopsis thaliana.
Los genes quiméricos, vectores, y plantas
transformadas y células de plantas descritas en la presente memoria
resultan útiles para someter a ensayo derivados del promotor PRU
aislado para la actividad asociada a semilla y para evaluar la
actividad de un promotor sujeto en una especie de planta específica.
Para este uso, el gen heterólogo codifica preferentemente una
proteína cuya expresión se detecta fácilmente. Por ejemplo, los
genes reporter, ejemplificados por la cloranfenicol acetil
transferasa y la beta-glucuronidasa (GUS; véase, p.
ej., Jefferson et al. 1987, EMBO J
6:3901-3907), se utilizan comúnmente para evaluar la
competencia de transcripción y de traducción de las construcciones
quiméricas. Otros genes adecuados incluyen GFP (proteína verde
fluorescente; Chalfie et al. (1994) Science 263:802),
luciferasa (Riggs et al. (1987) Nucleic Acids Res.
15(19):8115; Luehrsen et al. (1992) Methods Enzymol.
216:397-414) y genes que codifican la producción de
antocianina (Ludwig et al. (1990) Science 247:449). Hay
ensayos estándares disponibles para detectar con sensibilidad la
actividad del gen reporter en un organismo transgénico.
Los vectores, y constructos y genes quiméricos
de la presente invención resultan útiles para la manipulación
genética de plantas y para la producción de plantas con las
características deseadas, particularmente características asociadas
a semilla. Las plantas transgénicas, células de plantas transgénicas
y semilla transgénica de la invención también pueden resultar una
fuente útil de material expresado de manera recombinante.
Son de interés diversas características
asociadas a las semillas. En una forma de realización de la
invención, se utiliza un promotor PRU para modificar la cantidad y/o
composición de los carbohidratos, lípidos (especialmente ácidos
grasos), y/o aminoácidos en la semilla. Por consiguiente, los genes
heterólogos de interés incluyen aquellos implicados en el
metabolismo de los aceites, almidón, carbohidratos y nutrientes, así
como aquellos que afectan al tamaño del kernel, carga de sucrosa, y
similares. En una aplicación específica de la invención, se espera
que el gen de la albúmina 2S de la nuez de brasil (Muntz et
al., Nahrung 1998
Aug;42(3-4):125-7) se exprese
en la semilla para alterar la composición de aminoácidos. En otras
aplicaciones, los genes del metabolismo lipídico se expresan para
alterar el contenido y/o la composición de los aceites de semilla.
Genes del metabolismo lipídico de ejemplo incluyen las desaturasas
(véase, p. ej., U.S. Pat. N^{os}. 5.552.306 y 5.614.393),
proteínas portadoras de acilo (ACPs), tioesterasas, acetil
transacilasas, acetil-coA carboxilasas,
ketoacil-sintasas, malonil transacilasas, y
elongasas. Tales genes del metabolismo lipídico se han aislado y
caracterizado a partir de una serie de bacterias diferentes y
especies de plantas. Genes específicos cuya expresión alterada en
la semilla han demostrado causar fenotipos lipídicos modificados
incluyen diacilglicerol aciltransferasa (Jako et al., 2001,
Plant Physiol 2001, 126:861-74), desaturasa ACP
modificada (Cahoon and Shanklin, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A
97:12350-5), fitoeno sintasa (Shewmaker et
al., 1999, Plant J 20:401-412),
acetil-coenzima A carboxilasa (Roesler et
al., 1997, Plant Physiol 113:75-81),
beta-Ketoacil-CoA sintasa (Lassner
et al., 1996, Plant Cell 1996, 8:281-92),
sn-2 aciltransferasa (Zou et al., 1997,
Plant Cell 9:909-23), acil-ACP
tioesterasas e hidroxilasa de glicerolípidos.
Genes adicionales de interés codifican
características importantes para la agronomía, como la resistencia
a los insectos, resistencia a las enfermedades, resistencia a los
herbicidas, y características del grano. La invención también
permite la expresión asociada a semilla de proteínas
farmacéuticamente o industrialmente importantes.
Un aspecto importante de la invención es la
capacidad de limitar la expresión de un gen heterólogo bajo el
control de un promotor PRU de la semilla de una planta transgénica.
Alterar las rutas metabólicas primarias que controlan la producción
de carbohidratos, lípidos, y/o aminoácidos puede tener consecuencias
perjudiciales en el rendimiento o comportamiento de las plantas si
estos cambios metabólicos se dan en todos los tejidos de la planta.
Por ejemplo, la eliminación global de la producción de ácidos grasos
poliinsaturados tiene como resultado plantas que ya no son
fotoautotróficas (McConn and Browse 1998, Plan J
15:521-30); sin embargo, cuando tales alteraciones
de los ácidos grasos se confinan a la semilla, no han afectado a la
productividad de la planta (Mazur et al. 1999, Science
285:372-5). Para otras aplicaciones, una
característica deseada puede depender de la toxicidad localizada
del producto del gen. Por ejemplo, la expresión de genes deletéreos
o tóxicos puede utilizarse para crear variedades de plantas
sin semilla.
sin semilla.
\vskip1.000000\baselineskip
El género Prunus está representado por
una serie de nueces y frutas comercialmente importantes, incluyendo
la almendra, el albaricoque, la cereza, el melocotón y la ciruela.
En base a la proximidad taxonómica, se tenía la hipótesis de que
los genes que codificaban las proteínas de almacenamiento de semilla
principales mostrarían una conservación de la secuencia en las
especies de Prunus. Se utilizaron las regiones conservadas
de las secuencias Pru1 y Pru2 de la almendra para amplificar los
genes de las proteínas de almacenamiento de semilla principales a
partir del ADN genómico de la cereza.
Se construyó una biblioteca genómica accesible a
PCR a partir de ADN extraído de hojas de cerezo (Prunus
avium). Se diseñaron cebadores oligonucleótidos complementarios
a la secuencia 5' del clon cADN de la prunina Pru1 (entrada GenBank
X78119, gi|460805) a partir de la almendra (pru1 PFa, SEQ ID Nº:4;
pru1 PFb, SEQ ID Nº:5) y se utilizaron para amplificar un fragmento
genómico de la secuencia aguas arriba de un conjunto de bibliotecas
de "promoter finder" (PF) de cereza (Prunus avium). La
amplificación dio como resultado un fragmento de 1,2 Kb presente en
todas las bibliotecas "promoter finder", lo que proporcionó un
resultado interesante puesto que los productos de cada biblioteca
por separado se determinan por la posición de un único sitio de
restricción.
El producto de amplificación de 1,2 Kb de la
biblioteca Dral se clonó en el vector de clonación pCR2.1 y se
secuenció. El análisis de la secuencia de nucleótidos confirmó que
una región del fragmento de 1,2 Kb es efectivamente homólogo, pero
no idéntico, a la Pru1 de almendra. Una búsqueda BLASTN reveló que
las 100 bases en el extremo 3' del fragmento compartían una
homología significativa con el mARN de P. amygdalus (HS=201,
P(N)=3,3e-13), y a ninguna otra secuencia en
GenBank.
Además, la secuencia del cebador complementaria
a Pru1 se detectó tanto en el extremo 5' como en el 3' del clon, lo
que explicaría el resultado inusual de la amplificación del ADN
genómico. Los resultados indicaban que existen dos genes similares
a la Prunina homólogos en el genoma de la cereza que están en
orientaciones opuestas y separadas por una secuencia aguas arriba
de 1,2 Kb. Se da un único sitio EcoRI en el centro de la secuencia.
También puede deducirse, debido a la ausencia de cualquier otro
producto de amplificación de las bibliotecas PF, que estos pueden
ser sólo dos copias de genes parecidos a Prunina en el genoma
de la cereza.
La secuencia completa del fragmento de 1,2 Kb se
determinó y se presenta como la SEQ ID Nº:1. El gen en la
orientación con la mayor homología (es decir, de secuencias de
codificación) con la Pru1 de almendra se ha denominado chPru1, y el
gen el la orientación opuesta se denominó chPru2. La secuencia de la
SEQ ID Nº:1 se flanqueó con los sitios de las enzimas de
restricción Ncol (CCATGG), que se desarrollaron alrededor de los
sitios de inicio de la traducción predichos de ChPru1 y ChPru2. En
la orientación hacia adelante, se identificaron una caja TATA y un
motivo con homología con una caja legumina, que se ha demostrado que
dirige la expresión específica de semilla de las globulinas, en los
nucleótidos 1.169-1.175 y en los nucleótidos
1.092-1.098, respectivamente. En la orientación
inversa, se identificaron una caja TATA y un motivo tipo caja
legumina en los complementos inversos de los nucleótidos
95-100 y los nucleótidos 170-176,
respectivamente, de la SEQ ID Nº:1. La alineación de las secuencias
aguas arriba chPru1 y chPru2 (es decir, SEQ ID Nº:1 y el
complemento inverso de la misma, SEQ ID Nº:6), como se representa en
la Figura 1, muestra regiones de conservación entre dos promotores
alrededor de la caja TATA putativa, el motivo tipo caja legumina, y
un motivo conservado de aproximadamente -350 desde el inicio de
traducción (nucleótidos 885-911 en la orientación
hacia delante y el complemento inverso de los nucleótidos
372-438 en la
orientación inversa).
orientación inversa).
La búsqueda de homología de la secuencia de
nucleótidos utilizando la secuencia completa aguas arriba de chPru
(blastn contra all.na) reveló cierta similitud entre la chPru2 5'UTR
y las regiones flanqueadoras 5' de los genes de legumina del
guisante, como se muestra en la Tabla 1. La región de similitud
comienza en la posición 1.028 en el promotor PRU de la orientación
hacia delante (es decir, como se presenta en la SEQ ID Nº:1), que
se encuentra en los alrededores del motivo tipo caja legumina, y se
extiende a través de la posición 1.235, que se encuentra en el
5'UTR predicho del gen chPru2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se inició un estudio de las proteínas de
almacenamiento de semilla para identificar otras especies de
vegetales y frutas que tuvieran la globulina 12S como proteína de
almacenamiento de semilla principal. Se aislaron embriones de
semillas de albaricoque, melocotón, ciruela, melón y tomate. Se
separaron las albúminas y las globulinas en base a la solubilidad
diferencial, se separaron por SDS-PAGE, y se tiñeron
con azul de Coomassie. Se confirmó la presencia de globulinas 12S
en las semillas de albaricoque, melocotón, y ciruela (embriones).
Se encontraron presentes dobletes del polipéptido principal
aproximadamente en 20 kDa y 36-38 kDa en las
proteínas extraídas de estos embriones. Estos resultados confirmaron
la presencia de globulinas como proteína de almacenamiento de
semilla principal en el género Prunus. Por el contrario, las
proteínas de almacenamiento de semilla principales del tomate y el
melón se encontraron presentes como polipéptidos abundantes de
aproximadamente 32 y 45 kDa. Los polipéptidos del melón y el tomate
son solubles en sal, lo que sugiere que son globulinas pero de una
masa molecular diferentes a las pruninas. Estos experimentos
sugieren que el promotor PRU será activo en plantas del género
Prunus.
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Hemos evaluado la fuerza y la especificidad de
los promotores chPRU aislados en Arabidopsis, una planta de
semilla oleaginosa dicot. El sistema de evaluación utilizaba genes
quiméricos que comprendían el cADN de FAD2, que codifica una
desaturasa de ácidos grasos, bajo el control de promotores chPRU.
Una mutación de pérdida de la función en el FAD2 endógeno
("fad2-1") afecta a la composición de
los ácidos grasos tanto en las semillas como en las hojas de las
plantas afectadas (Okuley et al. 1994, Plant Cell
6:147-158). Sometimos a ensayo la capacidad de los
genes quiméricos de complementar los defectos lipídicos en las
plantas transgénicas fad2-1. Comparamos la
composición del aceite de semilla y de hoja en las plantas mutantes
fad2-1 con la de las plantas mutantes
transformadas con cADN de FAD2 bajo el control de un promotor PRU o
un promotor constitutivo fuerte.
Constructos. Se crearon constructos
reporter para someter a ensayo la actividad y la especificidad de
tejido del promotor ChPru bidireccional candidato en cada
orientación. Se insertó el promotor ChPru en ambas orientaciones en
un constructo vector binario de manera que dirigiese la expresión
del gen FAD2 en una orientación y el gen uid que codifica
GUS en la otra orientación. La secuencia de codificación GUS se
encontraba bajo control de una secuencia de terminación 3' Nos de
Agrobacterium ("NosT;" Depicker et al., 1983, J
Mol Appl Genet
1:561-573).
1:561-573).
La región de codificación de FAD2 y el
3'UTR se amplificaron mediante PCR a partir de un clon de cADN
utilizando una polimerasa de alta fidelidad, y se desarrolló un
sitio Ncol alrededor del codón de inicio ATG. A continuación se
secuenció y se subclonó completamente la región de codificación de
FAD2 aguas arriba de un gen GUS. Se amplificó mediante PCR el
promotor chPRU de la reacción Cherry Genome Walker Primary PCR, y
los sitios Ncol añadidos alrededor de los codones de inicio en cada
extremo. Este fragmento de promotor se clonó en un vector
intermedio y se secuenció completamente, a continuación se subclonó
en ambas orientaciones en el sitio Ncol único entre las regiones de
codificación de FAD2 y GUS. Se aislaron casetes
FAD2/chPRU/Gus/NosT que comprendían chPRU en ambas
orientaciones y se clonaron en un vector de expresión en planta
modificada. Se clonó un casete de selección de planta de
resistencia a la kanamicina, que comprendía el gen nptll
(Beck et al., 1982, Gene 19:327-36) bajo
control del promotor CsVMV constitutivo fuerte (Verdaguer et
al., 1996, Plant Mol Biol 31:1129-39) y la
secuencia de terminación del gen 7 de Agrobacterium
("G7"), en ambos constructos en un sitio de restricción
único adyacente a la región del borde derecho (RB) de
T-ADN (Velten and Schell, 1985, Nucleic Acids Res
13:6981-98). pAG4021 contiene la secuencia de
codificación de FAD2 bajo el control de trascripción del
promotor chPRU en la orientación chPru1 (complemento inverso de la
secuencia presentada en SEQ ID Nº:1), mientras que pAG4022 contiene
el FAD2 bajo el control del promotor en la orientación
chPru2.
Además, se generó un constructo de expresión de
FAD2 constitutivo como control positivo. pAG4708 contiene la
región de codificación de FAD2 bajo el control del promotor
CsVMV y NosT. PAG4708 también contiene un casete de selección
compuesto por el gen nptll bajo el control del promotor
constitutivo RE4 (Pat. U.S. Nº 6.054.635) y la secuencia de
terminación G7, clonada en un sitio adyacente al borde izquierdo
(LB) de T-ADN. Los constructos de expresión en
planta utilizaron el vector binario pPZP200 (Hajdukiewicz et
al., 1994, Plant Mol Biol 25:
989-94).
989-94).
Primero se transformaron los constructos
de expresión en planta en la cepa de Agrobacterium GV3101
(plásmido helper pMP90RK) y posteriormente se introdujeron en el
mutante fad2-1, Arabidopsis thaliana,
mediante un protocolo in planta modificado (de Bechtold et
al., 1993, supra). Se seleccionaron los transformantes
en 0,5 XMS suplementado con 100 \mug/ml de kanamicina.
Análisis de ésteres metílicos de ácidos
grasos (FAME). Se prepararon ésteres metílicos de ácidos grasos
a partir de hojas y semillas de líneas transformantes que portaban
las tres líneas de controles y constructos anteriormente descritos
(tanto Col-0 tipo salvaje como mutante fad2).
Se llevó a cabo la determinación cuantitativa de la composición de
ácidos grasos en semilla y hoja como sigue. Las semillas completas o
las hojas cortadas se trans-esterificaron en 500 ul
H_{2}SO_{4} al 2,5% en MeOH durante 3 horas a 80 grados C,
seguido del método de Browse et al. (Biochem J
235:25-31, 1986) con modificaciones. Se incluyó una
cantidad conocida de ácido heptadecanoico en la reacción como
estándar interno. Se añadieron a cada vial 750 ul de agua y 400 ul
de hexano, que se agitaron a continuación enérgicamente y se dejó
que se separaran en fases. Se cargaron los viales de reacción
directamente sobre GC para el análisis, y se muestreó la fase de
hexano superior mediante el automuestreador. Se utilizó la
cromatografía de gases con detección por Ionización de Llama para
separar y cuantificar los ésteres metílicos de ácidos grasos. Se
utilizó un Agilent 6890 Plus de GC para la separación con columnas
Agilent Innowax (30 m x 0,25 mm ID, grosor de película
250 um).
250 um).
\newpage
El gas portador fue hidrógeno a un flujo
constante de 2,5 ml/minuto. Se inyectó 1 ul de muestra sin división
de flujo (temperatura de la entrada 220ºC, flujo de purga 15 ml/min
a 1 minuto). Se programó el horno para una temperatura inicial de
105ºC, tiempo inicial 0,5 minutos, seguido de una rampa de 60ºC por
minuto hasta 175ºC, una rampa de 40ºC/minuto hasta 260ºC con un
tiempo de retención final de 2 minutos. La detección se hizo
mediante ionización por llama (temperatura de 275ºC, flujo de
combustible 30,0 ml/min, oxidante 400,0 ml/min). El control de
instrumentos y el análisis y la recogida de datos se hicieron
utilizando el Sistema de Gestión de Cromatografía Millennium
(Versión 3.2, Waters Corporation, Milford, MA). La integración y
cuantificación se llevaron a cabo automáticamente mediante el
software Millennium.
Análisis Estadístico. Los análisis
estadísticos descriptivos se llevaron a cabo utilizando Microsoft
Excel 97(Microsoft Inc) SR-2 y el Analysis
Tool Pak incluido.
Resultados. El producto del gen
FAD2 produce ácidos grasos 18:2 (linoleato) a partir de 18:1
tanto en hojas como en semillas. El linoleato puede convertirse
además en 18:3 (linolenato) mediante otras enzimas desaturasas en
las hojas. De esta manera, en las hojas, la comparación de 18:1 y la
suma de poliinsaturados de 18 carbonos (es decir, 18:2+18:3)
proporcionó un buen indicio de la mutación fad2 y del grado
de complementación por el cADN de tipo salvaje introducido. Los
resultados del análisis FAME de las hojas se resumen en la Tabla 2.
Para cada transformante o línea de control sometida a ensayo, se
analizaron las hojas simples de cada una de las 24 plantas T1. Los
contenidos medios de ácidos grasos 18:1 y 18:2+18:3 como porcentaje
de los ácidos grasos totales se muestran con la desviación estándar
entre paréntesis.
El mutante fad2-1 de
control presentó el alto nivel esperado de ácidos grasos 18:1
(\sim18% de los ácidos grasos totales, en comparación con sólo
\sim3% del total en el tipo salvaje). El contenido medio de 18:1
de los transformantes CsVMV-FAD2 (pAG4708) fue del 8%, lo que
representaba un grado de complementación desde casi completo, a no
observable. Cinco de los 22 transformantes tuvieron un contenido de
ácidos grasos totales de 18:1 del 3% o menos - la cantidad máxima
de 18:1 observada en cualquiera de los individuos de tipo salvaje -
lo que indicaba que el 22% de los transformantes presentaban una
complementación completa de la mutación
fad2-1. Anticipamos que el grado de expresión
transgénica en los transformantes independientes variaría
ampliamente por una variedad de razones, y así éstos resultados
estuvieron en conformidad con nuestras expectativas. El contenido
de 18:1 en las hojas de los transformantes que portaban FAD2 bajo el
control del promotor chPRU en ambas orientaciones resultó algo
reducido en comparación con el mutante
fad2-1, lo que reflejaba el pequeño número
de transformantes que tenían un grado modesto de complementación en
las hojas. Nunca se observó complementación completa en las hojas
que comprendían el promotor chPRU en ambas orientaciones. El
promotor PRU en ambas orientaciones resulta claramente menos
efectivo que el promotor CsVMV para complementar el fenotipo en las
hojas.
Los resultados de los análisis de los ácidos
grasos en semilla se resumen en la Tabla 3. Se cosecharon las
semillas T2 a partir de los mismos individuos T1 analizados para la
composición grasa de la hoja (Tabla 2). Se muestran los contenidos
medios de los ácidos grasos 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 20:0, y
20:1 como porcentaje de los ácidos grasos totales. También se
muestra el contenido total de los monoinsaturados (18:1 + 20:1). El
error estándar fue inferior al 5% del valor descrito en todos los
casos.
La gran cantidad de ácidos grasos 18:1 y 20:1 en
el mutante fad2-1 en comparación con el tipo
salvaje Col-0 es un resultado de la pérdida de la
mutación de la función. Resulta evidente de inmediato a partir de
los datos que el promotor CsVMV tenía un rendimiento mucho menos
eficaz en las semillas. El contenido total de monoinsaturados del
62,42% en los transformantes pAG4708 es el más cercano al valor del
mutante fad2-1 de 78,3%. La expresión
conducida por chPRU en ambas orientaciones produjo unas reducciones
mayores de monoinsaturados totales que el promotor CsVMV.
Cuando se analizaron las líneas de plantas
individuales, los transformantes chPRU representaron un grado de
complementación de complementación intermedia a completa. Lo que es
más importante, cuando se considera la frecuencia de
"complementación completa", o la restauración completa de la
composición de tipo salvaje en la planta mutante transformada, el
PRU superó claramente al promotor CsVMV. La Tabla 4 muestra el
porcentaje de transformantes que presentaron complementación
completa del fenotipo fad2-1 en hojas y
semillas cuando los promotores CsVMV y chPRU condujeron la
expresión de FAD2.
La efectividad diferencial de la expresión
conducida por chPRU en las semillas (complementación alta)
versus hojas (ausencia de complementación), y la
complementación con éxito de los promotores del fenotipo de semilla
de los mutantes fad2-1 (especialmente en
comparación con el promotor CsVMV) sostiene directamente la
utilidad de los promotores PRU para controlar la expresión de los
genes dirigidos a semilla en una variedad de plantas dicot,
incluyendo las semillas oleaginosas.
Ensayos GUS: Utilizando las mismas líneas
transgénicas Pru ensayadas bioquímicamente, se llevaron a cabo
ensayos de genes reporter en silicuas por etapas para 1) confirmar
la actividad de desarrollo del promotor chPru, y 2) confirmar que
el promotor dirige la expresión de los genes heterólogos
simultáneamente en ambas orientaciones.
Clasificación por fases de Silicuas de
Arabidopsis: Se seleccionaron tres eventos
Pru2-1 y tres eventos Pru1-2 que
mostraban un alto grado de complementación
fad2-1 para los ensayos de enzimas GUS. Se
seleccionaron semillas T2 en kanamicina y se trasplantaron a suelo
36 plantas de semillero por evento.
Tras la floración, las silicuas individuales se
marcaron con lazos de hilos de colores. Se continuó con el marcado
durante un total de catorce días, utilizando un marcador de color
diferente para cada cubo de dos días sucesivo (0-1
DAF por 12-13 DAF).
Se cosecharon las silicuas al final del período
de marcado de catorce días. Se agruparon de acuerdo con el evento y
el cubo. Se homogenizaron las silicuas para extraer la proteína, y
se mezclaron los extractos con un tampón de ensayo que contenía el
sustrato fluorogénico 4-metilumbelliferil
B-D-glucuronida (MUG). Se midió la
intensidad de fluorescencia a intervalos de una hora en el curso de
tres horas. Se normalizó la actividad GUS a una concentración total
de proteína para determinar la actividad reporter GUS estándar.
Resultados: Se midió la actividad GUS
durante el desarrollo de las silicuas. Se compararon tres eventos
diferentes cada uno de chPru1::GUS y chPru2::GUS a cuatro eventos de
CsVMV::GUS y a Col-0. Se observó lo siguiente:
- \bullet
- Los sucesos que mostraban un nivel alto de expresión de FAD2 también mostraban niveles relativamente altos de expresión de GUS en comparación con la actividad del promotor CsVMV.
- \bullet
- Los ensayos de actividad GUS confirmaron que el promotor CsVMV está activo a lo largo de todo el desarrollo de la silicua a un nivel relativamente constante en cualquier evento simple.
- \bullet
- El promotor chPru es relativamente inactivo durante las etapas tempranas del desarrollo de la silicua (de 0 a 3 DAF).
- \bullet
- Picos de actividad del promotor chPru alrededor de 10 a 11 DAF.
- \bullet
- La actividad máxima del promotor chPru es igual a la actividad máxima del promotor CsVMV.
- \bullet
- Aparentemente el promotor chPru1 se vuelve activo ligeramente antes que el promotor Pru2 (6 DAF vs. 8 DAF).
<110> Exelixis Plant Sciences, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> SECUENCIAS DE PROMOTORES ASOCIADOS A
SEMILLAS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
EP03-008C-PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/400.170
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-08-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (211)..(211)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (221)..(221)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (224)..(224)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (227)..(229)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (232)..(235)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (238)..(238)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (154)..(155)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacaaatacc agcgcccacc gctcgttgct tcaccatctc aaa
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Prunus avium
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
Claims (27)
1. Molécula de ácido nucleico de doble cadena
aislada que comprende un promotor bidireccional, que comprende en
la dirección 3' a 5' en una primera cadena
- (a)
- una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:7 o la SEQ ID Nº: 10, y
- (b)
- una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:8 o la SEQ ID Nº:11,
en la que dicho promotor bidireccional, cuando
se une operablemente a una primera secuencia de codificación de una
proteína heteróloga en dirección antisentido y una segunda secuencia
de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido,
dirige la expresión de dichas secuencias a niveles más altos en
semillas que en otras células y tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1 en la que el promotor comprende adicionalmente (c)
una secuencia que comparte por lo menos un 75% de identidad de
secuencia con la SEQ ID Nº:9 o la SEQ ID Nº:12.
3. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1 en la que el promotor comprende los nucleótidos
1.055-1.212 de la SEQ ID Nº:1.
4. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 3 en la que el promotor comprende los nucleótidos
854-1.212 de la SEQ ID Nº:1.
5. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 4 en la que el promotor comprende la SEQ ID
Nº:1.
6. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 1 en la que el promotor comprende los nucleótidos
1.043-1.198 de la SEQ ID Nº:6.
7. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 6 en la que el promotor comprende los nucleótidos
827-1.198 de la SEQ ID Nº:6.
8. Molécula de ácido nucleico aislada según la
reivindicación 7 en la que el promotor comprende la SEQ ID
Nº:6.
Nº:6.
9. Vector de expresión en plantas que comprende
la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación
1.
10. Vector de expresión en plantas según la
reivindicación 9, en la que el promotor se une operablemente a una
secuencia de codificación de una proteína heteróloga.
11. Vector de expresión en plantas según la
reivindicación 9 que comprende, en la orientación 5' a 3', una
primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en
dirección antisentido, definiéndose el promotor bidireccional según
la reivindicación 1, y una segunda secuencia de codificación de una
proteína heteróloga en dirección sentido, en la que el vector es de
doble cadena, y en la que el promotor bidireccional dirige la
expresión en las secuencias de codificación de los ácidos nucleicos
heterólogos primero y segundo a niveles más altos en semillas que
en otras células y tejidos.
12. Célula de planta transgénica que comprende
el vector de expresión en plantas según la reivindicación 9 en su
genoma.
13. Célula de planta según la reivindicación 12,
que es de una planta que pertenece al género Prunus.
14. Célula de planta según la reivindicación 13,
que es de una planta seleccionada de entre el grupo que consiste en
cereza, almendra, melocotón, albaricoque, y ciruela.
15. Célula de planta según la reivindicación 12,
que es de Arabidopsis.
16. Método para producir una planta transgénica
que muestra la expresión en una secuencia de codificación de una
proteína heteróloga a niveles más altos en semillas que en otras
células y tejidos, que comprende:
- a)
- transformar las células progenitoras de la planta con el vector de expresión en plantas según la reivindicación 10, y
\newpage
- b)
- cultivar las células progenitoras transformadas para producir una planta transgénica que muestra la expresión en la secuencia de codificación de una proteína heteróloga a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Planta transgénica que comprende el vector
de expresión en plantas según la reivindicación 10.
18. Planta según la reivindicación 17, que
pertenece al genero Prunus.
19. Planta según la reivindicación 18,
seleccionada de entre el grupo que consiste en cereza, almendra,
melocotón, albaricoque, y ciruela.
20. Planta según la reivindicación 17, que es
Arabidopsis.
21. Parte de una planta obtenida de una planta
según la reivindicación 17, en la que la parte de la planta
comprende el vector de expresión en plantas según la reivindicación
10.
22. Parte de una planta según la reivindicación
21, que es una semilla.
23. Molécula de ácido nucleico aislada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
en la que el promotor de semilla bidireccional
es de melocotón, albaricoque, ciruela o cereza, y,
en la que el promotor tiene una secuencia del
promotor que se sitúa naturalmente aguas arriba de un codón de
inicio de la traducción de un gen que codifica una proteína de
almacenamiento de semilla globulina 12S, y
en la que el promotor dirige la expresión en una
secuencia de codificación de ácidos nucleicos heterólogos a los que
se une operablemente a niveles más altos en semillas que en otras
células y tejidos.
24. Molécula de ácido nucleico aislada según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,
en la que la secuencia del promotor es un
promotor que se sitúa naturalmente aguas arriba de un codón de
inicio de la traducción de un gen chPru1 o chPru2 en el genoma de
cereza, en la que el gen chPru1 comprende la secuencia presentada
como SEQ ID Nº:2, y en la que el gen chPru2 comprende la secuencia
presentada como SEQ ID Nº:3.
25. Molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 2 que se hibrida bajo condiciones muy rigurosas a la
molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID Nº:1,
o el complemento de la misma.
26. Planta transgénica según la reivindicación
17, en la que la secuencia de codificación de una proteína
heteróloga es un gen del metabolismo lipídico.
27. Planta transgénica según la reivindicación
26, en la que la secuencia de codificación de una proteína
heteróloga codifica FAD2.
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