ES2346887T3 - Epitopo neutralizable de hgf y anticuerpo neutralizante que se une al mismo. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo neutralizante que comprende una región VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una región VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.
Description
Epítopo Neutralizable de HGF y Anticuerpo
Neutralizante que se une al mismo.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
neutralizante contra HGF que es capaz de neutralizar HGF como un
agente único uniéndose a un epítopo neutralizable de HGF.
HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) es un
polipéptido heterodimérico multifuncional producido por células
mesenquimales. HGF está compuesto de una cadena alfa que contiene un
dominio N-terminal y cuatro dominios kringle (NK4)
unidos covalentemente a un dominio C-terminal de la
cadena beta similar a una serín-proteasa (véase la
figura 1). El HGF humano se sintetiza como un precursor de cadena
única biológicamente inactivo que consiste en 728 aminoácidos con
un péptido señal de 29 aminoácidos que no está presente en la
proteína madura. El HGF biológicamente activo se logra mediante
corte en el residuo R494 por una serín-proteasa
extracelular de suero específica. El HGF activo así logrado es un
heterodímero completamente activo que está compuesto de la cadena
alfa de 69 kDa y la cadena beta de 34 kDa unidas por puentes
disulfuro. Sin embargo, la estructura terciara global de HGF es aún
desconocida y todavía no se ha clarificado cuál de estos dominios es
responsable para las funciones específicas de HGF (Maulik et
al., Cytokine & Growth Factor Reviews 13(1):
1-59, 2002).
La unión de HGF a su receptor, Met, induce
crecimiento y dispersión de varios tipos de células, media las
transiciones epiteliales mesenquimales y la formación de túbulos y
lúmenes y fomenta la angiogénesis. Tanto los ratones deficientes en
Met como en HGF son letales en fases embrionarias y muestran
defectos de desarrollo en la placenta, hígado fetal y formación de
extremidades/músculos (Cao et al., PNAS 98(13):
7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American
Journal of Pathology 159(2): 579-590,
2001).
Met se aisló originalmente como producto de un
oncogén humano, trp-met, que codifica una
proteína quinasa modificada constitutivamente activa con actividad
transformante. También se ha mostrado que la activación de Met
aumenta notablemente la propagación metastásica del cáncer que
proviene de su influencia estimuladora de procesos tales como
angiogénesis, motilidad celular y regulación de proteasas de la
superficie celular (Wielenga et al., American Journal of
Pathology 157(5): 1563-1573, 2000).
Puesto que se ha descrito que Met se sobreexpresa en varios
cánceres humanos de hígado, próstata, colon, mama, cerebro y piel
(Maulik et al., supra), se ha considerado como un factor
diana importante para la prevención y tratamiento del cáncer.
Además, se ha descrito que la infección de malaria depende de la
activación del receptor de HGF por HGF secretado y, según esto, se
han identificado HGF y su receptor como potenciales dianas para
nuevos planteamientos para la prevención de la malaria (Carrolo M,
et al., Nat. Med. 9(11):
1363-1369, 2003). También se ha descubierto la
posibilidad de que HGF se pueda encontrar en asociación con los
cambios patológicos que se producen en la enfermedad de Alzheimer
(Fenton H, et al., Brain Res.
779(1-2): 262-270, 1998).
Además, se ha encontrado que HGF está definitivamente implicado en
aumentar los procesos de cicatrización cutánea, incluyendo
reepitelización, neovascularización y formación de tejido de
granulación (Yoshida S, et al., J. Invest. Dermatol.
120(2): 335-343, 2003).
Mientras tanto, la neutralización selectiva de
factores de crecimiento o citoquinas asociados a tumores y sus
receptores, que desempeñan papeles cruciales en el desarrollo y
propagación del cáncer, ha sido siempre una estrategia atractiva
para el desarrollo de fármacos anticáncer. Recientemente, se han
desarrollado numerosos anticuerpos monoclonales (AcM) terapéuticos
para estas dianas, por ejemplo, herceptin y AcM humanos
anti-angiopoyetina usando tecnologías de
anticuerpos recombinantes tales como presentación en fago de
librerías combinatorias de anticuerpos.
Se sabe bien que los anticuerpos policlonales
contra HGF bloquean muchas de las funciones biológicas de HGF.
Además, se ha descrito recientemente que las mezclas de AcM
neutralizantes contra HGF muestran actividad antitumoral en modelos
animales (Cao et al., PNAS 198(13):
7443-7448, 2001). En particular, Cao y col.
divulgaron que se necesitan bloquear tres o más epítopos,
posiblemente dos para el receptor Met y uno para heparina, para
inhibir la actividad de HGF in vivo e in vitro, y una
mezcla de al menos 3 AcM es capaz de neutralizar HGF en un
experimento in vitro.
Además, Di Nicola et al. (Blood
99(10): 3838-3843, 2002) divulgaron un
anticuerpo anti HGF que inhibía la proliferación de linfocitos T
suprimida por BMSC fomentada por rhHGF.
Sin embargo, no se ha descrito ningún anticuerpo
monoclonal que puede neutralizar HGF como un agente único e inhibir
la actividad de dispersión celular in vitro.
Según esto, la presente invención
proporciona:
- 1.
- Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_{H} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 y una región V_{L} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.
- 2.
- Un anticuerpo neutralizante que comprende una región V_{H} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 y una región V_{L} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, y en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33.
- 3.
- El anticuerpo neutralizante de 1 o 2, que se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo humanizado.
- 4.
- El anticuerpo neutralizante de 1 o 2, que es un Fab.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo anterior y otros objetos y características de
la invención se harán aparentes de la siguiente descripción de la
invención, cuando se tomen junto con las figuras acompañantes que
respectivamente muestran:
Figura 1: la estructura de HGF;
Figura 2: el mapa genético del vector fagémido
pComb3X usado para la construcción de la librería de
anticuerpos,
- A: el caso de presentación de Fab en la superficie del fagémido, y
- B: el caso de presentación de scFv o diacuerpos en la superficie de fagémido.
Figura 3: enriquecimiento del conjunto de fagos
que presentan Fab que se unen específicamente a HGF mediante la
adsorción durante el cultivo de clones que se unen a HGF,
Figura 4: el resultado de la tinción de los
fragmentos Fab purificados con azul de coomassie,
- 1: marcador,
- 2: anticuerpo del clon 68 no reducido (50.000 Da) y
- 3: anticuerpo del clon 68 reducido (25.000 Da)
Figura 5: el resultado del análisis de
inmunotransferencia para determinar si los fragmentos Fab
purificados se expresan,
Figura 6: el nivel de unión de un fago que
contiene el epítopo neutralizable inventivo a
c-MET,
- 1: fago que contiene el péptido de SEQ ID NO: 32,
- 2: fago que contiene el péptido de SEQ ID NO: 33 y
- 3 y 4: fagos control que no contienen el péptido de SEQ ID NO: 32 o 33
Figura 7: la unión específica de los Fab de los
clones 61 y 68 a HGF, respectivamente,
Figura 8: dependencia de la conformación del
epítopo neutralizable inventivo definido por los clones 61 y 68,
respectivamente,
- A: clon 61,
- B: clon 68,
- Carril 1: HGF no reducido y
- Carril 2: HGF reducido
Figura 9a: los criterios que muestran el nivel
de dispersión celular que varía de los grados 1 a 6,
Figura 9b: el resultado del ensayo de dispersión
que muestra los niveles de dispersión de los Fab
anti-HGF y los anticuerpos anti-Fab
humano cambian con las concentraciones de HGF añadido,
\newpage
Figura 10: la cantidad de anticuerpo del clon 68
unido a HGF inmovilizado en un chip sensor CM5 aumenta con la
cantidad inyectada de anticuerpo del clon 68,
- I: inyección de Fab no específico,
- II: inyección de anticuerpo del clon 68 50 nM,
- III: inyección de anticuerpo del clon 68 100 nM,
- IV: inyección de anticuerpo del clon 68 200 nM,
- V: inyección de anticuerpo del clon 68 400 nM, y
- VI: inyección de anticuerpo del clon 68 600 nM
Figura 11: el anticuerpo del clon 68 inhibe la
unión de HGF a c-Met,
- I: inyección de HGF 50 nM,
- II: inyección de HGF 50 nM mezclado con anticuerpo del clon 68 50 nM,
- III: inyección de HGF 50 nM mezclado con anticuerpo del clon 68 250 nM,
- IV: inyección de HGF 50 nM mezclado con anticuerpo del clon 68 500 nM,
- V: inyección de HGF 50 nM mezclado con anticuerpo del clon 68 1 \muM, y
- VI: inyección de HGF 50 nM mezclado con anticuerpo del clon 68 1,5 \muM
Figura 12: c-Met soluble inhibe
la unión de HGF a c-Met,
- I: inyección de HGF 50 nM,
- II: inyección de HGF 50 nM mezclado con c-Met soluble 50 nM,
- III: inyección de HGF 50 nM mezclado con c-Met soluble 100 nM,
- IV: inyección de HGF 50 nM mezclado con c-Met soluble 200 nM,
- V: inyección de HGF 50 nM mezclado con c-Met soluble 400 nM,
- VI: inyección de HGF 50 nM mezclado con c-Met soluble 600 nM.
Como se usa aquí, el término "epítopo
neutralizable" incluye cualquier determinante proteico que sea
capaz de inhibir la unión de HGF a su receptor
c-Met. Los determinantes epitópicos normalmente
consisten en agrupamientos de superficie químicamente activos de
moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares y
normalmente tienen características estructurales terciarias
específicas, así como características de carga específicas.
Preferiblemente, el epítopo neutralizable inventivo es un
polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
32 o 33.
El término "anticuerpo neutralizante" se
refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse específicamente al
epítopo neutralizable de HGF e inhibir o eliminar sustancialmente la
actividad biológica de HGF. Típicamente, un anticuerpo
neutralizante inhibirá tal actividad biológica de HGF al menos en
alrededor del 50% y preferiblemente en más de 80%. El anticuerpo
neutralizante de la invención es especialmente útil en aplicaciones
terapéuticas: para prevenir o tratar enfermedades resistentes y
cánceres.
La presente solicitud describe un polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 o 33 que
funciona como un epítopo neutralizable de HGF.
Para preparar el epítopo neutralizable de HGF
según la presente invención, se realiza un estudio por ELISA para
examinar si los antisueros de animales inmunizados con HGF se unen a
un HGF humano recombinante; y el estudio ha mostrado que los
antisueros de los animales inmunizados con HGF se unen
específicamente a HGF. Después, se extrae el ARN total de animales
inmunizados con HGF y se somete a síntesis de ADNc.
Para amplificar la región variable que comprende
la cadena ligera (V_{L}) (V_{\kappa}, V_{\lambda}) y la
cadena pesada (V_{H}) de conejo y la región constante que
comprende C_{\kappa} y C_{H1} humanas, se realizan PCR usando
el ADNc sintetizado como molde y combinaciones de cebadores de SEQ
ID NO: 1 a 20, y después, las cadenas ligeras y pesadas del
anticuerpo quimérico de conejo/humano se amplifican usando los
productos de PCR obtenidos anteriormente como moldes. Después de
combinar las secuencias V_{L} y V_{H} de conejo amplificadas
con las secuencias C_{\kappa} y C_{H1} humanas amplificadas, los
productos finales de PCR que codifican una librería de fragmentos
de anticuerpo (Fab) se clonan en un vector de expresión y el vector
resultante se transforma en una célula huésped, por ejemplo E.
coli, para construir una librería de Fab quiméricos de
conejo/humano. El vector y la célula huésped utilizable en la
presente invención incluyen todos los vectores de expresión y cepas
de E. coli convencionalmente usados en la técnica sin límite,
pero es preferible usar el vector fagémido pComb3X (Scripps
Research Institute, CA, EE. UU.) como vector de expresión y E.
coli ER2537 (NEB) como célula huésped.
Se seleccionan clones de fagos que contienen Fab
anti-HGF mediante EIA usando placas de ELISA
recubiertas con HGF y anticuerpos policlonales de cabra
anti-Fab humano. Los clones de fagos seleccionados
anteriormente se designan H61 (clone 61) y H68 (clon 68).
Los clones H61 y H68 se someten a secuenciación
de nucleótidos y sus secuencias de aminoácidos se determinan a
partir de las secuencias de nucleótidos analizadas, respectivamente.
En una forma de realización preferida de la presente invención, la
secuenciación de nucleótidos se realiza según el método de
secuenciación de cebador marcado con colorante (Chung et
al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128:
641-649, 2002). Como resultado, se ha encontrado
que el clon H61 está compuesto de regiones V_{H} y V_{L} que
tienen las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y 24,
respectivamente; y el clon H68 comprende regiones V_{H} y V_{L}
que tienen las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y 26,
respectivamente.
Las secuencias de aminoácidos de las respectivas
regiones V_{H} y V_{L} de los clones H61 y H68 a partir de las
secuencias de nucleótidos analizadas sugieren que el clon H61 está
compuesto de una región V_{H} que tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 28 y una región V_{L} que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; y el clon H68, una
región V_{H} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
29 y una región V_{L} que tiene la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 30.
El análisis de la región marco (FR) y la región
determinante de complementariedad (CDR) en las secuencias de
aminoácidos de los clones H61 y H68 ha mostrado que cada una de las
regiones V_{H} y V_{L} de los clones H61 y H68 tiene 4 FR y 3
DCR (véase la tabla 2).
Para definir un epítopo neutralizable de HGF, se
enriquecen los clones H61 y H68 mediante la adsorción usando
presentación en fagos de una librería combinatoria de péptidos y los
conjuntos de fagos así amplificados se someten a EIA usando Fab
anti-HGF H61 o Fab anti-HGF H68 y
placas de ELISA recubiertas con Fab anti-HGF H61 o
Fab anti-HGF H68. Los clones de fagos que muestran
afinidad de unión a los Fab anti-HGF H61 y H68 se
seleccionan de esta manera. En una forma de realización preferida
de la presente invención, se emplea la librería de péptidos PHD
(New England Biolob) como librería de péptidos.
Los clones de fagos seleccionados se someten a
secuenciación de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos
deducidas de las secuencias de nucleótidos analizadas tienen las
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 y 33, que se encuentran
que están unidas a c-MET (véase la figura 6). Estos
resultados sugieren que un sitio de unión a antígeno del anticuerpo
anti-HGF H61 o H68 imita un sitio de unión a HGF de
c-MET y los péptidos de SEQ ID NO: 32 y 33 que se
unen a un anticuerpo anti-HGF H61 o H68 imitan un
sitio de unión a c-MET de HGF. Según esto, los
péptidos inventivos de SEQ ID NO: 32 y 33 son capaces de funcionar
como un epítopo neutralizable de HGF.
Además, la presente solicitud describe el
polinucleótido que codifica dicho epítopo neutralizable. En
particular, dicho epítopo neutralizable tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 34 o 35.
Además, la presente invención proporciona un
anticuerpo neutralizante contra HGF que es capaz de neutralizar HGF
uniéndose al péptido de SEQ ID NO: 32 o 33 como un epítopo
neutralizable de HGF.
El anticuerpo neutralizante de la presente
invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo
monoclonal o un anticuerpo humanizado.
El anticuerpo quimérico es una molécula de
inmunoglobulina que comprende partes humanas y no humanas.
Específicamente, la región que se combina con el antígeno (región
variable) de un anticuerpo quimérico deriva de una fuente no humana
(por ejemplo, ratón, conejo, aves de corral) y la región constante
del anticuerpo quimérico que confiere la función biológica efectora
a la inmunoglobulina deriva de una fuente humana. El anticuerpo
quimérico debería tener la especificidad de unión a antígeno de la
molécula de anticuerpo no humana y la función efectora conferida
por la molécula de anticuerpo humano.
En general, los procedimientos usados para
producir anticuerpos quiméricos implican los siguientes pasos:
(a) identificar y clonar el segmento génico
correcto que codifica la parte de unión al antígeno de la molécula
de anticuerpo, que (conocidas como regiones V_{DJ}, variable, de
diversidad y de unión para las cadenas pesadas o regiones V_{J},
variable, de unión para las cadenas ligeras o simplemente como V por
región variable) puede estar en forma de ADNc o genómica;
(b) clonar los segmentos génicos que codifican
la región constante o parte deseada de la misma;
(c) ligar la región variable con la región
constante de modo que el anticuerpo quimérico completo esté
codificado en una forma que se pueda transcribir y traducir;
(d) ligar la construcción en un vector que
contiene un marcador de selección y regiones de control génicas
tales como promotores, potenciadores y señales de adición de
poli(A);
(e) amplificar el vector e introducirlo en
células eucariotas (transfección), normalmente linfocitos de
mamífero;
(f) seleccionar las células que expresan el
marcador de selección;
(g) cribar las células que expresan el
anticuerpo quimérico deseado; y
(h) probar las funciones apropiadas de
especificidad de unión y efectora del anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Un anticuerpo monoclonal se refiere a un
anticuerpo que deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon
eucariota, procariota o fago. El anticuerpo monoclonal puede
comprender, o consistir en, dos proteínas, es decir, cadenas
pesadas y ligeras. El anticuerpo monoclonal se puede preparar usando
uno de una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica
incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinante y
presentación en fago, o una combinación de las mismas.
Un anticuerpo humanizado se refiere a una
molécula cuyas CDR (regiones determinantes de complementariedad)
derivan de una inmunoglobulina de una especie no humana y el resto
de la molécula de anticuerpo deriva principalmente de una
inmunoglobulina humana. El término "anticuerpo" como se usa
aquí, a menos que se indique de otra manera, se usa ampliamente
para referirse tanto a una molécula de anticuerpo como a una
molécula derivada de anticuerpo. Tal molécula derivada de
anticuerpo comprende al menos una región variable (o una cadena
pesada o una cadena ligera de la región variable) e incluye
moléculas tales como fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos
F(ab')_{2}, fragmentos Fd, fragmentos Fabc, anticuerpos Sc
(anticuerpo de cadena sencilla), diacuerpos, cadenas ligeras
individuales de anticuerpos, cadenas pesadas individuales de
anticuerpos, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpo y
otras moléculas.
En particular, la presente invención proporciona
un anticuerpo quimérico de conejo/humano como un anticuerpo
neutralizante contra HGF. El anticuerpo neutralizante inventivo
comprende la región V_{H} de SEQ ID NO: 27 y V_{L} de SEQ ID
NO: 28 o la región V_{H} de SEQ ID NO: 29 y V_{L} de SEQ ID NO:
30.
Se puede examinar si un anticuerpo neutralizante
ejerce una actividad neutralizante o no mediante un ensayo de
dispersión de MDCK2 (Cao et al., PNAS 98(13):
7443-7448, 2001). En el caso de tratar células MDCK2
con HGF 2 ng/ml (29 pM), el anticuerpo neutralizante inventivo
muestra la mayor actividad inhibidora de la dispersión cuando la
relación molar de Fab anti-HGF a HGF se hace 50:1 y
la relación molar de anti-Fab humano a HGF, varía
desde 50:1 hasta 100:1 (véase la figura 9). Estos resultados
muestran por primera vez que el bloqueo de sólo un epítopo es
suficiente para neutralizar HGF al menos in vitro, a
diferencia del artículo de Cao que es necesario neutralizar al
menos tres epítopos para inhibir la dispersión de células MDCK2 (Cao
et al., supra). Además, en la presente invención se
muestra el hecho de que el anticuerpo neutralizante ejerce su
actividad neutralizante solo cuando el anticuerpo que se une al
epítopo neutralizable es divalente o más, lo que sugiere que el
mismo epítopo neutralizable puede existir en dos o más sitios de
HGF.
También se puede examinar mediante EIA la
afinidad de unión de Fab anti-HGF para HGF,
actividad inhibidora del clon 68 para la unión de HGF a
c-Met y la actividad inhibidora de
c-Met soluble para la unión de HGF a
c-Met. La cantidad de anticuerpo del clon 68 que se
une a HGF inmovilizado en un chip sensor aumenta con la cantidad de
inyección de anticuerpo del clon 68 (véase la figura 10) y la
cantidad de HGF que se une a c-Met disminuye según
aumenta la concentración de anticuerpo del clon 68 (véase la figura
11). Además, la cantidad de HGF que se une a c-Met
inmovilizado en el chip sensor disminuye al aumentar la
concentración de c-Met soluble (véase la figura
12).
Los resultados anteriores demuestran que el
anticuerpo neutralizante inventivo actúa como un agente único que
es capaz de neutralizar HGF.
La presente solicitud describe además una
composición farmacéutica que comprende una dosis eficaz del
anticuerpo neutralizante inventivo y un vehículo farmacéuticamente
aceptable para prevenir y tratar enfermedades resistentes y
cánceres producidos por la unión de HGF a un receptor del mismo.
Además, la presente invención proporciona un método para prevenir y
tratar enfermedades resistentes y cánceres usando el anticuerpo
neutralizante inventivo. Preferiblemente, el cáncer incluye, pero
no está limitado a, varios cánceres humanos de hígado, próstata,
colon, mama, cerebro y piel, y las enfermedades resistentes abarcan
las causadas por la unión de HGF a su receptor,
c-Met, e incluye, pero no están limitadas a,
malaria, enfermedad de Alzheimer etcétera.
La formulación farmacéutica inventiva se puede
preparar según cualquiera de los procedimientos convencionales. Al
preparar la formulación, el principio activo preferiblemente se
mezcla o diluye con el vehículo. Los ejemplos de vehículos,
excipientes o diluyentes adecuados son lactosa, dextrosa, sacarosa,
sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, alginatos, gelatina,
fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa,
celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua,
metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de
magnesio y aceite mineral. La formulación puede incluir
adicionalmente rellenos, agentes antiaglutinantes, agentes
lubricantes, agentes humectantes, agentes saborizantes,
emulsionantes, conservantes y similares. La composición de la
invención se puede formular de modo que proporcione una liberación
rápida, sostenida o retrasada de principio activo después de
administrarla a un paciente, empleando cualquiera de los
procedimientos bien conocidos en la técnica.
La formulación farmacéutica de la presente
invención se puede administrar mediante inyección (por ejemplo,
intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea) o mediante
otros métodos tales como infusión que asegura su distribución al
torrente sanguíneo en una forma eficaz. La formulación farmacéutica
también se puede administrar por vías intratumoral, peritumoral,
intralesión o perilesión, para ejercer efectos terapéuticos locales
así como sistémicos. La inyección local o intravenosa es la
inyección preferida.
Para tratar un paciente humano, una dosis diaria
típica del anticuerpo neutralizante inventivo como principio activo
puede variar desde alrededor de 0,1 hasta 100 mg/kg de peso
corporal, preferiblemente de 1 a 10 mg/kg de peso corporal, y se
puede administrar en una dosis única o en dosis divididas. Sin
embargo, se debe entender que la cantidad de principio activo
realmente administrado se debe determinar a la luz de varios
factores relevantes incluyendo la afección a ser tratada, la vía de
administración elegida, la edad, sexo y peso corporal del paciente
individual y la gravedad del síntoma del paciente; y, por lo tanto,
no se pretende que las dosis anteriores limiten el ámbito de la
invención en ninguna manera.
La presente invención se ilustra adicionalmente
en los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Durante un periodo de 4 a 5 meses, se
inmunizaron dos conejos de la cepa Nueva Zelanda blanco mediante 5
inyecciones subcutáneas de HGF (R&D Systems, EE. UU.)
dispersado en una emulsión de adyuvante MPL (monofosforil lípido A;
lípido A muy refinado no tóxico aislado de remutantes de S.
minnesota) + TDM (dicorinomicolato de trehalosa sintético; un
análogo de dimicolato de trehalosa del factor de acordonamiento del
bacilo de la tuberculosis) + CWS (esqueleto de la pared celular; de
paredes celulares de micobacteria desproteinizadas y delipidadas)
(Sigma) a intervalos de 3 semanas. Se analizó la unión de los
antisueros de los animales inmunizados a HGF humano recombinantes
(R&D systems o Research Diagnostics, Inc.) mediante ELISA usando
anticuerpos policlonales de cabra anti-Fc de conejo
conjugados a peroxidasa de rábano (Pierce). Como resultado, se
encontró que mientras que los antisueros obtenidos antes de la
inmunización con HGF casi nunca se unían a HGF, los antisueros
obtenidos después de 5 inyecciones cutáneas se unieron
específicamente a HGF.
Siete días después de la dosis final, se
extrajeron el bazo y la médula ósea de los animales inmunizados y
se usaron para la preparación de ARN total con el reactivo TRI
(Molecular Research Center, Cincinnati, EE. UU.) y precipitación
con cloruro de litio. La primera hebra de ADNc se sintetizó usando
el sistema de preamplificación SUPERSCRIPT con cebado de
oligo(dT) (Life Technologies, Inc.).
Se construyó una librería de anticuerpos
quiméricos de conejo/humano según el método descrito por Rader y
col (Rader C. et al., J. Biol. Chem. 275:
13668-13676, 2000).
\vskip1.000000\baselineskip
Para amplificar las regiones variables de
V_{L} (V_{\kappa}, V_{\lambda}) y V_{H} de conejo, se
realizó PCR usando las combinaciones de cebadores descritas en la
tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una solución de reacción de PCR
mezclando 1 \mul de ADNc molde (alrededor de 0,5 \mug)
sintetizado en el ejemplo 1, 60 pmoles de cada cebador, 10 \mul
de tampón de PCR 10X, 8 \mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y 0,5
\mul de Taq polimerasa y se ajustó a un volumen final de 100
\mul. La condición de la PCR fue de 30 ciclos de 15 segundos a
94ºC, 30 segundos a 56ºC y 90 segundos a 72ºC después de una
desnaturalización inicial de 10 minutos a 94ºC, y una extensión
final de 10 minutos a 72ºC. El ADN amplificado se sometió a
electroforesis en gel de agarosa y se purificó del gel usando el kit
de extracción de gel Qiaex (Qiagen).
Se realizó PCR para amplificar la región
C_{\kappa} de la región constante de Ac de origen humano como
sigue: Se preparó una solución de reacción de PCR mezclando 20 ng de
vector pComb3XTT (Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 15:88(18), 7978-82, 1991), 60 pmoles
de cada cebador (SEQ ID NO: 14 y 15), 10 \mul de tampón de PCR
10X, 8 \mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y 0,5 \mul de Taq
polimerasa y se ajustó a un volumen final de 100 \mul. La
condición de la PCR fue de 20 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30
segundos a 56ºC y 90 segundos a 72ºC después de una
desnaturalización inicial de 10 minutos a 94ºC, y una extensión
final de 10 minutos a 72ºC.
Mientras tanto se realizó una PCR para
amplificar la región C_{H1} de la región constante de Ac de origen
humano como sigue: Se preparó una solución de reacción de PCR
mezclando 20 ng de vector pComb3XTT (Barbas et al.,
supra), 60 pmoles de cada cebador (SEQ ID NO: 16 y 17), 10
\mul de tampón de PCR 10X, 8 \mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y
0,5 \mul de Taq polimerasa y se ajustó a un volumen final de 100
\mul. La condición de la PCR fue de 20 ciclos de 15 segundos a
94ºC, 30 segundos a 56ºC y 90 segundos a 72ºC después de una
desnaturalización inicial de 10 minutos a 94ºC, y una extensión
final de 10 minutos a 72ºC.
Los ADN amplificados se sometieron a
electroforesis en gel de agarosa y se purificaron del gel usando el
kit de extracción de gel Qiaex (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una PCR para amplificar la
cadena ligera como sigue: Se preparó una solución de reacción de
PCR mezclando 100 ng de cada uno del producto de PCR de V_{L}
(V_{\kappa}, V_{\lambda}) purificado en el ejemplo
(2-1) y el producto de PCR de C_{\kappa}
purificado en el ejemplo (2-2), 60 pmoles de cada
cebador (SEQ ID NO: 18 y 15), 10 \mul de tampón de PCR 10X, 8
\mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y 0,5 \mul de Taq polimerasa y se
ajustó a un volumen final de 100 \mul. La condición de la PCR fue
de 20 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 120
segundos a 72ºC después de una desnaturalización inicial de 10
minutos a 94ºC, y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.
El ADN amplificado se sometió a electroforesis
en gel de agarosa y se purificó del gel usando el kit de extracción
de gel Qiaex (Qiagen).
Se realizó una PCR de extensión solapante para
amplificar la región Fd (V_{H} y C_{H1}) de una cadena pesada
como sigue: Se preparó una solución de reacción de PCR mezclando 100
ng de cada uno de producto de PCR de V_{H} purificado en el
ejemplo (2-1) y el producto de PCR de C_{H1}
purificado en el ejemplo (2-2), 60 pmoles de cada
cebador (SEQ ID NO: 19 y 17), 10 \mul de tampón de PCR 10X, 8
\mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y 0,5 \mul de Taq polimerasa y se
ajustó a un volumen final de 100 \mul. La condición de la PCR fue
de 20 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 120
segundos a 72ºC después de una desnaturalización inicial de 10
minutos a 94ºC, y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.
El ADN amplificado se sometió a electroforesis
en gel de agarosa y se purificó del gel usando el kit de extracción
de gel Qiaex (Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo una PCR para amplificar el gen
Fab quimérico de conejo/humano como sigue: Se preparó una solución
de reacción de PCR mezclando 100 ng de cada uno del producto de
cadena ligera quimérica purificado en el ejemplo
(3-1) y el producto de cadena pesada quimérica
purificado en el ejemplo (3-2), 60 pmoles de cada
cebador (SEQ ID NO: 18 y 20), 10 \mul de tampón de PCR 10X, 8
\mul de mezcla de dNTP 2,5 mM y 0,5 \mul de Taq polimerasa y se
ajustó a un volumen final de 100 \mul. La condición de la PCR fue
de 20 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 180
segundos a 72ºC después de una desnaturalización inicial de 10
minutos a 94ºC, y una extensión final de 10 minutos a 72ºC.
El ADN amplificado se sometió a electroforesis
en gel de agarosa y se purificó del gel usando el kit de extracción
de gel Qiaex (Qiagen).
Después de combinar los productos de PCR que
codifican las secuencias V_{L} y V_{H} de conejo con los
productos de PCR que codifican las secuencias C_{\kappa} y
C_{H1} humanas, los fragmentos de PCR finales que codifican una
librería de fragmentos de anticuerpo se sometieron a digestión con
SfiI y se clonaron en el vector fagémido pComb3X (Scripps Research
Institute, CA, EE. UU.) (Figura 2). El ADN fagémido se transformó
en E. coli ER2537 (NEB) mediante electroporación. El fago
introducido presentaba Fab como una proteína de fusión fusionada en
la proteína de cubierta del fago pIII y su ADN formaba una partícula
de fago (gen y polipéptido como una unidad) en ADN del fago.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de recubrir una placa de 96 pocillos
(Costar No. 3690) con HGF disuelto en 25 \mul de solución de TBS
a una concentración de 10 \mug/ml por pocillo, se añadieron los
fagos que presentaban Fab preparados en el ejemplo 4 a la placa, la
placa se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas y se
adsorbió contra antígeno HGF inmovilizado en la placa. La placa se
lavó con Tween 20 al 0,5% (v/v) en PBS y se eluyó con
HCl-glicina 0,1 M (pH 2,2). Los pasos de lavado se
aumentaron de 5 veces en la primera ronda hasta 10 veces en la
segunda ronda y 15 veces en las rondas siguientes. Típicamente se
realizaron siete rondas de adsorción. Según procedía la adsorción,
los conjuntos de fagos que presentaban Fab anti-HGF
que específicamente se unían a HGF aumentaban, lo que resulta en
una absorbancia creciente que muestra la unión de HGF a Fab en EIA
usando anticuerpos anti-fago M13 conjugados a HRP
(Pharmacia) y placas de ELISA recubiertas con HGF (Figura 3).
Después de la última ronda de adsorción, se seleccionaron los
clones de fagos que contenían Fab anti-HGF mediante
EIA usando placas de ELISA recubiertas con HGF y anticuerpos
policlonales anti-Fab humano de cabra (Pierce),
respectivamente. Los clones seleccionados se designaron H61 (clon
61) y H68 (clon 68). Los clones H61 y H68 que dieron señales
fuertes sobre el fondo (figura 7) se analizaron adicionalmente
mediante secuenciación de nucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación de nucleótidos se llevó a cabo
mediante el método de secuenciación del cebador marcado con
colorante (Chung et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol.
128: 641-649, 2002) usando dos cebadores de
secuenciación de SEQ ID NO: 21 y 22. Como resultado, se encontró
que el clon H61 codifica el Fab anti-HGF que
consiste en una región V_{H} que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ ID NO: 23 y una región V_{L} que tiene la
secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24; y el clon H68, el Fab
anti-HGF que consiste en una región V_{H} que
tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 25 y una región
V_{L} que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 26.
Las secuencias de aminoácidos de los clones H61
y H68 se dedujeron de las secuencias de nucleótidos analizadas,
respectivamente. Como resultado, se encontró que las regiones
V_{H} y V_{L} del clon H61 tenían las secuencias de aminoácidos
de SEQ ID NO: 27 y 28, respectivamente, mientras que las regiones
V_{H} y V_{L} del clon H68 tenían las secuencias de aminoácidos
de SEQ ID NO: 29 y 30, respectivamente.
Como resultado de analizar una región marco (FR)
y región determinante de complementariedad (CDR) en las secuencias
de aminoácidos de los clones H61 y H68 según el método descrito por
Harris (Harris et al., Protein Science 4(2):
306-10, 1995), los clones H61 y H68 tenían los
constituyentes regionales descritos en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se transformaron los ADN fagémidos de los clones
seleccionados en el ejemplo 5 en la cepa no supresora de E.
coli HB2151. Los clones se hicieron crecer hasta una absorbancia
A600 nm de 0,5 a 1 y se indujo la expresión de Fab
anti-HGF con IPTG (1 mM) durante 20 a 24 horas. Los
sobrenadantes de los cultivos se concentraron mediante el sistema
Labscale TFF (Millipore). El Fab anti-HGF
concentrado se purificó mediante cromatografía de afinidad usando
el anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta HA.
Los fragmentos Fab purificados se analizaron mediante tinción con
Coomassie e inmunotransferencia.
Primero, el Fab de anticuerpo H68 purificado
(alrededor de 1-3 \mug) se sometió a
electroforesis cargando en un gel NuPAGE Novex del
4-12% Bis-Tris (Invitrogen). El gel
cargado se empapó en una solución de tinción de geles de coomassie
(Invitrogen), se agitó durante 30 minutos, se transfirió a una
solución de destinción de geles de coomassie y se agitó hasta que
se observaron las bandas de proteínas desarrolladas. La figura 4
muestra el resultado de la tinción con coomassie. Como se muestra en
la figura 4, en el caso de anticuerpo H68 no reducido (carril 2),
la mayoría de los anticuerpos Fab se detectaron en una posición
correspondiente a un peso molecular de 50.000 Da; en el caso del
anticuerpo H68 reducido (carril 3), el anticuerpo Fab se separó en
las respectivas regiones Fd de las cadenas ligera y pesada, y por
tanto, las bandas se detectaron en una posición correspondiente a
25.000 Da; y no se detectaron otras bandas salvo bandas de
anticuerpo. En vista del hecho de que las cadenas ligera y pesada
del Fab del anticuerpo H68 son de un tamaño de alrededor de 25.000
Da, respectivamente, y el Fab formado mediante la unión covalente
entre cadenas ligera y pesada por un puente disulfuro tiene el
tamaño de alrededor de 50.000 Da, el Fab del anticuerpo H68
sucesivamente se aisló y purificó a una pureza satisfactoria. Sin
embargo, la banda débil detectada en el carril 2 en la posición
correspondiente a 25.000 Da es debida a la presencia de regiones Fd
libres de cadenas ligeras y pesadas de Fab que no se unen entre
sí.
Mientras tanto, para la inmunotransferencia, el
Fab anti-HGF purificado (alrededor de
1-3 \mug) se sometió a electroforesis cargando en
un gel NuPAGE Novex del 4-12%
Bis-Tris (Invitrogen). El Fab separado según el
peso molecular se inmovilizó en una membrana de nitrocelulosa
BioTrace (PALL). La membrana se trató con leche desnatada en polvo
al 5%/TBS durante 30 minutos para bloquear. Se diluyó anticuerpo
policlonal de cabra anti-Fab humano conjugado a
peroxidasa de rábano (Pierce) con leche desnatada en polvo al 3%/TBS
en una relación 1:1000 y se hizo reaccionar con la membrana durante
1 hora con agitación. La membrana se lavó con TBS durante 30
minutos y se mojó uniformemente con una mezcla de igual volumen de
solución de peroxidasa estable Supersignal West Pico (Pierce) y
solución de luminol/potenciador Supersignal West Pico (Pierce). La
membrana se expuso a película de rayos X (Kodak) en un cuarto
oscuro.
La figura 5 muestra el resultado de la
inmunotransferencia que analiza la expresión de los fragmentos Fab
purificados, en donde el carril izquierdo es un marcador de tamaño y
los otros carriles son los Fab purificados. Como se muestra en la
figura 5, se detectó una gran cantidad de Fab en la posición
correspondiente a 50.000 Da y regiones Fd libres de cadenas ligeras
y pesadas, en una posición correspondiente a 25.000 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
Se recubrió una placa de 96 pocillos (Costar No.
3690) con Fab anti-HGF H61 o Fab
anti-HGF 68 disuelto en 25 \mul de solución de
TBS a una concentración de 10 \mug/ml por pocillo. Se añadió a la
placa la librería de péptidos PHD^{TM} (presentación en fago de
un librería combinatoria de péptidos) (New England Biolob.) y,
después, la placa se mantuvo durante 2 horas a temperatura ambiente.
La placa se lavó con Tween 20 al 0,5% (v/v) en PBS y se eluyó con
HCl-glicina 0,1 M (pH 2,2). Los pasos de lavado se
aumentaron de 5 veces en la primera ronda hasta 10 veces en la
segunda ronda y 15 veces en las rondas siguientes. Típicamente se
realizaron siete rondas de adsorción. Después de la última ronda de
adsorción, se seleccionaron los clones de fagos que contenían Fab
anti-HGF H61 o Fab anti-HGF H68
mediante EIA usando placas de ELISA recubiertas con Fab
anti-HGF H61 o Fab anti-HGF H68 y
anticuerpo monoclonal de cabra anti-fago M13
conjugado a peroxidasa de rábano (Roche). Los clones seleccionados
se sometieron a secuenciación de nucleótidos y las secuencias de
aminoácidos se determinaron a partir de las secuencias de
nucleótidos analizadas.
La secuenciación de nucleótidos se realizó según
el método de secuenciación del cebador marcado con colorante (Chung
et al., supra) usando un cebador de secuenciación de
SEQ ID NO: 31. Como resultado, los péptidos que codifican los Fab
anti-HGF H61 y H68 deducidos de las secuencias de
nucleótidos analizadas tenían las secuencias de aminoácidos de SEQ
ID NO: 32 y 33, respectivamente.
A continuación, se recubrió una placa de 96
pocillos (costar No. 3690) con c-Met disuelto en 25
\mul de solución de TBS a una concentración de 10 \mug/ml por
pocillo, y se añadieron a la misma cada uno de los clones que
contenían los péptidos de SEQ ID NO: 32 y 33. La placa se lavó con
Tween 20 al 0,5% (v/v) en PBS y se añadió a la misma anticuerpo
monoclonal de cabra anti-fago M13 conjugado a
peroxidasa de rábano (Roche).
Como se muestra en la figura 6, mientras que los
fagos que contienen los respectivos péptidos (1 y 2) de SEQ ID NO:
32 y 33 se unieron a c-Met, dos fagos control (3 y
4) sin dichos péptidos no lo hicieron. Estos resultados sugieren
que puesto que un sitio de unión a antígeno del anticuerpo
anti-HGF H68 imita un sitio de unión a HGF de
c-Met y los péptidos de SEQ ID NO: 32 y 33 que se
unen al clon 68 imitan el sitio de unión a c-Met de
HGF, los péptidos de SEQ ID NO: 32 y 33 pueden funcionar como un
epítopo neutralizable de HGF.
Para caracterizar el sitio de unión a antígeno
del anticuerpo anti-HGF, se llevó a cabo
inmunotransferencia como sigue. Se sometieron de 1 a 3 \mug de
HGF a electroforesis cargando en un gel NuPAGE Novex del
4-12% Bis-Tris (Invitrogen). En
este momento, algunos se cargaron después de tratarlos con un agente
reductor y otros se cargaron sin tal tratamiento con el agente
reductor. Las proteínas separadas según el peso molecular se
inmovilizaron en una membrana de nitrocelulosa BioTrace (PALL). Cada
membrana se trató con leche desnatada en polvo al 5%/TBS durante 30
minutos para bloquear. Se añadieron los Fab anti-HGF
H61 y H68 a la membrana, y la membrana se agitó durante 1 hora. Se
diluyó anticuerpo policlonal de cabra anti-Fab
humano conjugado a peroxidasa de rábano (Pierce) con leche
desnatada en polvo al 3%/TBS en una relación de 1:1000 y se hizo
reaccionar con la membrana durante 1 hora con agitación. La membrana
se lavó con TBS durante 30 minutos y se mojó uniformemente con una
mezcla de igual volumen de solución de peroxidasa estable
Supersignal West Pico (Pierce) y solución de luminol/potenciador
Supersignal West Pico (Pierce). La membrana se expuso a película de
rayos X (Kodak) en un cuarto oscuro.
La figura 8 muestra la dependencia de la
conformación de los epítopos neutralizables definidos por H61 y H68,
en donde una flecha indica un marcador de tamaño; A, clon 61; B,
clon 68; carril 1, un HGF no reducido y carril 2 un HGF reducido.
Como resultado, se encontró que los clones 61 y 68 se unían al HGF
no reducido, pero no al HGF reducido. Estos resultados sugieren que
la estructura terciaria de los determinantes antigénicos, por
ejemplo epítopos, que sirven como sitios de unión de los clones 61 y
68, son cruciales para la respuesta
antígeno-anticuerpo y los epítopos neutralizables
inventivos tienen una estructura no lineal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células MDCK (células de riñón
canino de Madin Darby; ATCC CCL 34) en un medio DMEM suplementado
con SFT al 5% a 37ºC en una cámara húmeda con aire al 95% y CO_{2}
al 5%. Las células se distribuyeron en una placa de 96 pocillos a
una concentración de 2x10^{3} células/pocillo y se expusieron a
HGF 2 ng/ml (29 pM) en medio fresco durante la noche. A
continuación, se añadieron Fab anti-HGF y
anticuerpos anti-Fab humano a la placa a diferentes
concentraciones. El efecto de dispersión se controló mediante
microscopía óptica y el resultado se muestra en la figura 9. La
figura 9a muestra los criterios que indican el nivel de dispersión
celular que varían desde los grados 1 a 6, en donde el grado 6
significa el 100% de inhibición del efecto de dispersión por HGF;
el grado 5, la inhibición varía desde el 90 hasta el 100% del efecto
de dispersión por HGF; el grado 4, la inhibición varía desde el 60
hasta el 90% del efecto de dispersión por HGF; el grado 3, la
inhibición varía desde el 30 hasta el 60% del efecto de dispersión
por HGF; el grado 2, la inhibición varía desde el 10 hasta el 30%
del efecto de dispersión por HGF; y el grado 1, la inhibición del
10% y menor del efecto de dispersión por HGF. La figura 9b muestra
que los niveles de dispersión de Fab anti-HGF y
anticuerpos anti-Fab humanos pueden ser diferentes
según la concentración de HGF añadida.
Como resultado, se encontró que el efecto de
dispersión más eficaz se esperaba cuando la relación molar de Fab
anti-HGF a HGF era de 50:1 y la relación molar de
anticuerpo anti-Fab humano a HGF variaba desde 50:1
hasta 100:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la afinidad de unión de Fab
anti-HGF para HGF mediante SPR (resonancia de
plasmón de superficie) usando el BIAcore 3000 (BIAcore AB, Upsala,
Suecia).
Aproximadamente, se acoplaron 1069 unidades de
resonancia (UR) de HGF al chip sensor CM5 (BIAcore AB) mediante un
método de acoplamiento con amina. Se dejó seguir la interacción de
unión en tampón PBS que contenía agente tensoactivo P20 al 0,005% a
un velocidad de flujo de 30 \mul/min a 25ºC. La superficie se
regeneró con NaCl 1 M/NaOH 50 mM. Se determinaron las constantes
cinéticas de velocidad (k_{on} y k_{off}) así como la constante
de equilibrio de disociación (K_{d}). La figura 10 muestra la
afinidad de unión de Fab anti-HGF H68 para HGF.
Como resultado, se encontró que la cantidad de Fab
anti-HGF H68 unido a HGF inmovilizado en el chip
sensor aumenta con la concentración de Fab anti-HGF
H68.
Para asegurar el hecho de que el Fab
anti-HGF H68 puede inhibir la unión de HGF a
c-Met en tiempo real, se acopló
c-Met al chip sensor CM5 mediante un método de
acoplamiento con amina. Después de ello, se inyectó HGF solo a una
concentración de 50 nM, y premezclado con Fab
anti-HGF H68 de 5 concentraciones diferentes (50
nM, 250 nM, 500 nM, 1 \muM y 1,5 \muM) y con
c-Met soluble de 5 concentraciones diferentes (50
nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 600 nM), respectivamente. Se dejó
seguir la interacción de unión en tampón PBS que contenía agente
tensoactivo P20 al 0,005% a un velocidad de flujo de 30 \mul/min a
25ºC. La superficie se regeneró con NaCl 1 M/NaOH 50 mM.
La figura 11 muestra que el Fab
anti-HGF H68 inhibe la unión de HGF a
c-Met. Como resultado, en el caso de la inyección
de HGF 50 nM, se encontró que HGF se unía a c-Met a
455,5 UR (I), mientras que en el caso de inyección de HGF 50nM con
Fab anti-HGF H68 a 5 concentraciones diferentes de
50 nM (II), 250 nM (III), 500 nM (IV), 1 \muM (V) y 1,5 \muM
(VI), HGF se unió a c-Met a 406,5, 328, 260, 111,1 y
71 UR, respectivamente. Estos resultados sugieren que la unión de
HGF a c-Met se reduce al aumentar la concentración
de Fab anti-HGF H68. No hubo unión de HGF en el
caso en el que se inyectó Fab anti-HGF H68 solo.
Se examinó si la unión de HGF a
c-Met se inhibe por c-Met soluble
como sigue. Se inmovilizaron 2979 UR de c-Met en el
chip sensor CM5 mediante un método de acoplamiento con amina. Se
dejó seguir la interacción de unión en tampón PBS que contenía
agente tensoactivo P20 al 0,005% a un velocidad de flujo de 30
\mul/min a 25ºC. La superficie se regeneró con NaCl 1 M/NaOH 50
mM.
La figura 12 muestra que c-Met
soluble inhibe la unión de HGF a c-Met. Como se
muestra en la figura 12, en el caso de la inyección de HGF 50 nM,
se encontró que HGF se unía a c-Met a 455,5 UR (I);
mientras que en el caso de inyección de HGF 50 nM con
c-Met soluble a 5 concentraciones diferentes de 50
nM (II), 100 nM (III), 200 nM (IV), 400 nM (V) y 600 nM (VI), HGF
se unió a c-Met a 310,3, 225,7, 167,4, 93,7 y 70,9
UR, respectivamente. Estos resultados sugieren que la cantidad de
HGF que se une a c-Met inmovilizado en el chip
sensor gradualmente disminuye al aumentar la concentración de
c-Met soluble.
<110> National Cancer Center et
al
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Epítopo neutralizable de HGF y
anticuerpo neutralizante que se une al mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCA31170-NCC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Kopatentin 1.71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 5' cebador directo RSCVK1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 5' cebador directo RSCVK2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 5' cebador directo RSCVK3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 3' cebador inverso
RHybK1-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 3' cebador inverso
RHybK2-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vkappa 3' cebador inverso
RHybK3-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vlambda 5' cebador directo
RSClambda1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vlambda 3' cebador inverso
RHybL-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 5' cebador directo RHyVH1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 5' cebador directo RHyVH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 5' cebador directo RHyVH3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 5' cebador directo RHyVH4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 3' cebador inverso
RHyIgGCH1-B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo
HKC-F para la amplificación de la región Ckappa
humana y la secuencia líder pelB
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde un Fab humano clonado
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso
Lead-B para la amplificación de la región Ckappa
humana y la secuencia líder pelB
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipde un Fab humano clonado
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo
HIgGCH1-F para la amplificación de la cadena CH1
humana de un Fab humano clonado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo dpseq para la
amplificación de la cadena CH1 humana de un Fab humano clonado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo
RSC-F para el ensamblaje por PCR de secuencias VL de
conejo con el producto de
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPCR Ckappa humana
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo LeadVH para el
ensamblaje por PCR de secuencias VH de conejo con el producto de
PCR CH1 humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso
dp-EX para el ensamblaje por PCR de secuencias
quiméricas de la cadena ligera con secuencias quiméricas de la
cadena pesada (Fd)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica la región VH del clon 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica la región VL del clon 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica la región VH del clon 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 327
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica la región VL del clon 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
región VH del clon 61
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
región VL del clon 61
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
región VH del clon 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la
región VL del clon 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip0.800000\baselineskip
-
37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de secuenciación
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
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<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítopo neutralizable de HGF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm39
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<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epítopo neutralizable de HGF
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 33
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\hskip1cm40
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<210> 34
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica SEQ ID NO 32
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm41
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<210> 35
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<211> 36
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos que
codifica SEQ ID NO 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm42
Claims (4)
1. Un anticuerpo neutralizante que comprende una
región V_{H} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
27 y una región V_{L} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 28, en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a cMet
y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un
epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 32 o 33.
2. Un anticuerpo neutralizante que comprende una
región V_{H} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
29 y una región V_{L} que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 30, y en donde dicho anticuerpo inhibe la unión de HGF a
cMet y además en donde dicho anticuerpo específicamente se une a un
epítopo neutralizable de HGF que tiene la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 32 o 33.
3. El anticuerpo neutralizante de la
reivindicación 1 o 2, que se selecciona del grupo que consiste en un
anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo
humanizado.
4. El anticuerpo neutralizante de la
reivindicación 1 o 2, que es un Fab.
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