ES2347110T3 - Metodo para el analisis simultaneo de viabilidad celular, diferencial0de globulos blancos. - Google Patents

Abstract

METODO DE ANALISIS CITOMETRICO DE FLUJO, SIMULTANEO Y CUANTITATIVO, PARA DETERMINAR LOS GLOBULOS ROJOS NUCLEADOS (NRBC), LOS GLOBULOS BLANCOS (WBC), LOS WBC DAÑADOS Y UN DIFERENCIAL WBC (DIF./WBC) UTILIZANDO LOGICA Y/O DE TRIPLE DISPARADOR.

Description

Método para el análisis simultáneo de viabilidad celular, diferencial de glóbulos rojos nucleados y glóbulos blancos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a un método para el análisis simultáneo y cuantitativo de glóbulos blancos (WBC) dañados, glóbulos rojos nucleados (NRBC) y subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC/Diff). Más particularmente esta invención se refiere a la diferenciación de WBC, NRBC, WBC dañados y un diferencial de subclase MBC (WBC/Diff) en una muestra sanguínea total mediante el uso de análisis de fluorescencia y dispersión de luz multidimensional y un reactivo de lisis capaz de lisar glóbulos rojos (RBC) sin dañar las membranas celulares de WBC.

Los recuentos de NRBC se determinan convencionalmente por medio de la morfología de frotis sanguíneo. Un frotis sanguíneo teñido se examina en el microscopio y los NRBC se cuentan manualmente. En general, una concentración de NRBC se indica como el número de NRBC por 100 glóbulos blancos ("WBC"). Normalmente, se cuentan 200 WBC y el número de NRBC presente en la misma región de un frotis sanguíneo de paciente y se dividen los números por 2 para expresar la concentración de NRBC como el número de NRBC/100 WBC. El inconveniente principal de este tipo de método microscópico manual es que es un trabajo muy intensivo, que consume mucho tiempo, subjetivo e impreciso debido a las estadísticas pobres. Por lo tanto, patólogos y técnicos de laboratorio han buscado durante mucho tiempo un método automatizado preciso para los NRBC.

Un problema principal en la automatización de un método para NRBC para su uso en citómetro de flujo clínico ha sido que puesto que los NRBC se dan en casos excepcionales y las poblaciones de RBC son tan numerosas, las poblaciones de NRBC no se detectan fácilmente entre la población glóbulos rojos ("RBC") bien mediante las diferencias en la resistividad eléctrica celular (medidas de impedancia) o por sus características de dispersión de luz (medidas ópticas). Aunque se han hecho muchos intentos para contar los NRBC entre las poblaciones de WBC, en lugar de entre la población de RBC, estos esfuerzos generalmente no han tenido éxito.

Las poblaciones de NRBC no se distinguen fácilmente de las poblaciones WBC puesto que los NRBC no forman un grupo bien definido entre los WBC en los métodos habituales de diferenciación espacial bidimensional utilizados en los citómetros del flujo. Generalmente no se pueden separar las poblaciones de NRBC de las poblaciones de linfocitos cuando las señales detectadas se ven en los diagramas de puntos de dispersión de luz bidimensional (frontal frente a lateral) o de dispersión de luz frente a absorción generalmente aceptados. Las señales de la mayoría de la población de NRBC están mezcladas habitualmente con las señales del estroma de RBC y de plaquetas ("PLT") y el extremo superior del grupo de NRBC con mucha frecuencia se extenderá al espacio ocupado por la población de
linfocitos.

Los instrumentos de hematología clínica automatizados, tales como los instrumentos Technicon H*1®, Coulter STK® S y Abbott Cell-Dyn® 3000 y 3500 solo "señalan" muestras para la posible presencia de NRBC si el diagrama de puntos de la muestra presenta señales de ruido aumentadas por debajo del grupo de linfocitos. Este tipo de señalización produce muy a menudo resultados de falso positivo puesto que el nivel de ruido elevado podría deberse a grupos de PLT, PLT gigantes o RBC lisados incompletamente. Además, es extremadamente difícil obtener un recuento Total de WBC y Diferencial de WBC ("WBC/Diff") precisos en muestras que contienen NRBC debido a la interferencia. Adicionalmente, los frotis sanguíneos de las muestras señaladas deben examinarse y contarse en el microscopio por un técnico experto en la materia para obtener recuentos de NRBC y diferenciales de WBC precisos. Esto es un trabajo muy intensivo y un proceso subjetivo.

A pesar de estas dificultades, la identificación y cuantificación de células dañadas entre células intactas en una muestra puede ser de importancia para la caracterización precisa de poblaciones celulares que exhiben muerte celular espontánea o células afectadas por agentes citotóxicos o fármacos contra el cáncer. Las células no viables pueden unirse a anticuerpos u otros marcadores celulares de manera inespecífica, y por lo tanto deberían identificarse y cuantificarse en el inmunofenotipado así como a partir de los análisis hematológicos.

In vivo, hay dos formas diferentes de muerte celular: apoptosis y necrosis. La apoptosis, el término introducido por Kerr et al., es una muerte celular programada genéticamente que se produce durante la metamorfosis, embriogénesis y morfogénesis. Los neutrófilos experimentan apoptosis durante la reacción inflamatoria, los linfocitos en la regulación del sistema inmune. El daño celular debido a una variedad de agentes incluyendo daños citotóxicos quimioterapéuticos puede conducir a apoptosis. También se ha demostrado la apoptosis en tejidos premalignos y malignos. Durante el proceso de apoptosis, la membrana celular permanece intacta y la célula se rompe en cuerpos apoptóticos que después se fagocitan. La necrosis o muerte celular accidental, por otro lado, se produce en respuesta a daños nocivos tales como daño físico, hipoxia, hipertermia, inanición, ataque del complemento y daño químico. Estas células pierden la capacidad para filtrar selectivamente materiales extracelulares y experimentan fugas, finalmente perdiendo su membrana plasmática. Las células que han perdido la integridad de la membrana plasmática, se vuelven permeables a compuestos externos tales como tintes que normalmente no penetrarían en la membrana celular intacta, se considera que son "no viables" o dañadas. Las células dañadas que han perdido su integridad de membrana plasmática tampoco funcionan metabólicamente.

In vitro, un fenómeno similar, la muerte celular, se produce a medida que las muestras sanguíneas envejecen o durante los procedimientos de preparación de células que dañan la célula antes del análisis citométrico de flujo. Los procedimientos de preparación de células actuales someten a las células a un proceso largo que incluye el marcaje de células con anticuerpos monoclonales (Mab), el lisado de glóbulos rojos (RBC) y la fijación de los glóbulos blancos (WBC) para prevenir una destrucción adicional.

La combinación de 90º y las técnicas de dispersión de luz frontal se ha usado en la técnica para distinguir células dañadas de células intactas. Se ha descubierto, sin embargo, que la dispersión de luz sola no es lo suficientemente sensible para separar claramente y cuantificar las células dañadas o no viables de las células viables o intactas. Esto es particularmente cierto si una muestra contiene poblaciones celulares heterogéneas tal como una muestra sanguínea. El uso de un tinte fluorescente de ácidos nucleicos además de la dispersión de luz multiángulo aumenta dramáticamente la sensibilidad de la detección de células muertas. Actualmente existen una variedad de técnicas que utilizan métodos de fluorescencia y dispersión de luz para determinar si una célula en una muestra está intacta o dañada. De acuerdo con la técnica disponible, las células intactas se pueden distinguir de las células muertas usando bien diacetato de fluoresceína (FDA) o yoduro de propidio (PI). En estos métodos, la muestra se trata con FDA o PI. Las células que se tiñen con FDA se consideran viables y las células que se tiñen con PI se consideran "muertas". Sin embargo, estos métodos están limitados ya que las células no se pueden fijar puesto que las células fijadas generan autofluorescencia. Además, la fluoresceína, que es un producto del FDA después de la hidrólisis por una esterasa intracelular, es tan brillante que sobrepasa las señales de inmunofluorescencia de otros tintes tales como el FITC o la ficoeritrina
(PE).

Las Patentes de Estados Unidos Nº 4.661.913 y 4.284.412 describen métodos de diferenciación de subpoblaciones de WBC mediante análisis de dispersión de luz en un citómetro de flujo. La Patente de Estados Unidos Nº 4.520.110 describe un método de diferenciación de poblaciones heterogéneas de leucocitos mediante inmunofenotipado usando una combinación de dispersión de luz y fluorescencia. Cada uno de los métodos descritos anteriormente requiere la preparación de manual muestras y un tiempo de incubación mucho más largo para incorporarse en un analizador de hematología multiparámetro rápido actual. Adicionalmente, estas referencias no parece que enseñen como distinguir células dañadas de células intactas.

La Patente de Estados Unidos Nº 4.751.188, de Valet, describe un método que está basado en el principio de que los componentes celulares se pueden teñir con tintes y medir simultáneamente con el volumen celular, por ejemplo en un citómetro de flujo. De acuerdo con la patente un recuento total sanguíneo se puede producir en unos pocos minutos. En este método, una muestra sanguínea se prepara manualmente mediante un procedimiento que comprende las etapas de: hacer una dilución 1:250 de la muestra con solución salina isotónica tamponada; añadir 5 microlitros de una concentración predeterminada de una solución madre que contiene un tinte fluorescente de ARN/ADN, un tinte fluorescente sensible a potencial de membrana, las partículas de calibración monodispersas fluorescentes y un disolvente orgánico en el que los tintes se disuelven; e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. Los tintes se almacenan en un disolvente orgánico tal como DMSO o DMF como una solución madre y sólo una cantidad muy pequeña de estas soluciones madre de tinte se añade directamente a la suspensión celular para teñir las células. La suspensión celular preparada se aspira después a través de la celda de citómetro de flujo para la medida. En este método, se usa un tinte de ADN/ARN. Este tinte de ADN/ARN es bien naranja de acridina (AO), quinacrina (QA) o pionina Y (PY) y en el tinte sensible de membrana es 3,3-dehexil-oxacarbocianina (DiOC6). Adicionalmente, al menos se usa otro tinte, siendo seleccionado del grupo de: tintes de proteínas celulares; tintes lipídicos; tintes enzimáticos; tintes de pH intracelular y tintes del grupo SH. La metodología de Valet, como se describe en esta patente: 1) no es totalmente automatizable debido a la etapa requerida para la adición manual de un volumen muy pequeño de tinte disuelto en disolventes orgánicos; 2) es relativamente largo, como la cantidad de tiempo necesaria para completar los recuentos de células sanguíneas; 3) requiere al menos dos tintes para caracterizar las células sanguíneas lo que puede producir un problema de inactivación; 4) el requisito de hacer una dilución de 250 veces de una muestra sanguínea no proporciona suficientes WBC para producir resultados estadísticamente satisfactorios a no ser que el tiempo de recuento se prolongue mucho; 5) no demuestra que sea posible separar monocitos, eosinófilos y basófilos, lo que sugiere que los contenidos de Valet pueden producir sólo resultados de un diferencial de WBC incompleto (sólo dos subpoblaciones de WBC, granulocitos y linfocitos, se muestran en las figuras y ejemplos).

La Patente de Estados Unidos 5.057.413, de Terstappen, describe un método citométrico de flujo para distinguir entre las células intactas y dañadas. En este método tanto las células intactas como las dañadas en la muestra se tiñen. Los contenidos de Terstappen se basan en el principio de que hay una diferencia suficiente en la intensidad fluorescente de las células intactas teñidas y aquella de las células dañadas. Un objetivo adicional que se indica de la descripción es el uso de los métodos de diferenciación de la técnica junto con anticuerpos monoclonales (Mab) marcados fluorescentemente con FITC o PE para identificar simultáneamente antígenos celulares, células intactas y células dañadas, en los espectros de emisión máximos de cada marca fluorescente deben ser distinguibles entre sí y del tinte de ácido nucleico. En este método, los RBC se lisan con cloruro de amonio durante de 3 a 5 minutos y se centrifugan a 200 g durante 5 minutos. El precipitado se lavó dos veces con medio de cultivo RPMI 1640, cada vez centrifugándolo a 200 g durante 5 minutos. Y después se resuspendieron las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con albúmina de suero bovino al 1% (BSA). Cuando los Mab se añaden a la muestra, se incuban 20 minutos en hielo, las células se lavaron dos veces con la solución de PBS y las células se resuspendieron en 1 ml de paraformaldehído al 1% en PBS. Se hizo una solución madre de LDS-751 en metanol y la solución de trabajo se preparó diluyendo la solución madre en PBS. Se añaden diez microlitros de esta solución de trabajo a la suspensión celular preparada. En otro experimento, los WBC no fijados, después de la lisis con cloruro de amonio de los RBC, se resuspendieron y se mantuvieron en solución RPMI durante 1 hora antes del análisis para obtener las propiedades de dispersión de luz óptimas de las células.

El método de Terstappen tiene varios problemas ya que puede ser variable en el proceso de fijación, tal como la temperatura, concentración del fijador/es y la duración de la fijación, puede cambiar la permeabilidad de la membrana celular y de esa manera la intensidad de la tinción. Las células originalmente intactas, fuertemente fijadas pueden tener la misma intensidad de tinción que aquellas de las células dañadas fijadas fuertemente puesto que el contenido de ADN de todas las células del mismo individuo es el mismo (son excepciones la hiperploidía tumoral proliferante o las células leucémicas). Además, si se produce cualquier fragmentación de ADN en la fase tardía de la muerte celular, entonces las células dañadas contendrán menos ADN y la intensidad de tinción disminuirá. El método de Terstappen también es largo e incómodo de hacer y difícil, si no imposible incorporar en un instrumento de hematología completamente automatizado actual. Los resultados presentados en la patente también indican que una gran porción de las células dañadas puede haberse producido durante el procedimiento largo y tortuoso de preparación de la
muestra.

Recientemente, la Patente de Estados Unidos Nº 5.298.426, emitida el 29 de marzo, 1994, de Inami et al. para la detección de NRBC. Esta patente enseña un método de dos etapas que comprende la tinción de WBC y NRBC por tintes nucleares específicos. En este método patentado, una muestra sanguínea se mezcla primero con una solución hipotónica ácida que contiene un tinte nuclear fluorescente. Después, se mezcla una solución que comprende un tampón salino alcalino, para ajustar el pH y la Osmolaridad, con la solución muestra/primer reactivo. Esta solución final se carga después en un citómetro de flujo para detectar y contar NRBC junto con otras células
nucleadas.

Hay varias razones por las que el enfoque de Inami et al. no es aceptable, especialmente para un método automatizable. Primero, una solución hipotónica ácida daña todas las membranas celulares haciendo que los WBC experimenten fuga y por tanto no es posible la tinción selectiva de los núcleos de NRBC mediante un tinte nuclear. No se conocen tintes que tiñan sólo los núcleos de NRBC y no los núcleos de WBC puesto que el material nuclear (ADN) es el mismo. El tinte nuclear reivindicado por Inami et al., es Yoduro de Propidio, un tinte de ácidos nucleicos usado comúnmente.

Adicionalmente, el método de Inami et al. no separa o distingue las señales fluorescentes de los núcleos de NRBC de aquellos otros restos nucleares tales como los cuerpos de Howell-Jolly, el Punteado Basófilo, el ARN de reticulocitos lisados y plaquetas reticuladas y el ADN de fragmentos Megacariocíticos y WBC. Tercero el método de Inami et al. requiere que la muestra se pretrate, sin conexión al instrumento, usando varios reactivos para "preparar" la muestra antes de que la solución de muestra/reactivo preparada pueda cargarse en el instrumento.

El documento EP 0 559 208 describe un método que usa citometría de flujo para identificar y enumerar células que representan subpoblaciones de leucocitos en una muestra biológica que contiene leucocitos mezclados con otros tipos celulares (por ejemplo, muestras sanguíneas o de médula ósea). El método utiliza un activador de fluorescencia para excluir subpoblaciones seleccionadas de partículas sanguíneas antes del acotamiento, y una ventana de análisis establecida mediante el análisis de parámetros de datos adquiridos para excluir subpoblaciones seleccionadas de leucocitos de los análisis de datos. Una ventana de análisis de 2 parámetros se puede establecer basándose en el análisis de un solo parámetro de dispersión de luz y un solo parámetro de fluorescencia (por ejemplo, SSC y fluorescencia). Como alternativa, una ventana de análisis de 3 parámetros puede establecerse basándose en un análisis combinado de SSC, FSC y parámetros de fluorescencia.

Para este fin, se usa un anticuerpo marcado por fluorocromo que reconoce un antígeno o marcador asociado con todas las subpoblaciones de leucocitos para teñir las células de la muestra.

Si los eritrocitos en la muestra marcada han de lisarse antes del análisis citométrico de flujo, se añade un reactivo de lisis a la muestra marcada.

Los problemas en la técnica existente descrita anteriormente se han resuelto en la presente invención.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método preciso para distinguir WBC dañados de WBC intactos y para cuantificar rápidamente el diferencial de WBC (WBC/Diff), NRBC y WBC dañados en una muestra sanguínea total.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método totalmente automatizable para distinguir WBC dañados de WBC intactos y para cuantificar rápidamente el WBC/Diff, NRBC y WBC dañados en una muestra sanguínea total.

Todavía otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método automatizado para distinguir WBC dañados de WBC intactos y para cuantificar rápidamente el WBC/Diff, NRBC y WBC dañados en una muestra sanguínea total y para el inmunofenotipado.

Sumario de la invención

Se proporciona un método de acuerdo con la reivindicación 1 para el análisis citométrico de flujo simultáneo y cuantitativo de glóbulos rojos nucleados (NRBC) y glóbulos blancos (WBC), WBC dañados o no viables y subpoblaciones de glóbulos blancos (WBC/Diff) en una muestra sanguínea total.

Se proporciona un dispositivo para el análisis simultáneo y cuantitativo de NRBC, WBC, WBC/Diff y células no viables en una muestra sanguínea total. El dispositivo comprende un citómetro de flujo para obtener al menos una señal para los parámetros incluyendo luz dispersada en un primer y segundo intervalo de ángulos de dispersión y fluorescencia (FL o F1) y un circuito de activación triple que capacita las señales obtenidas por el citómetro de flujo para la digitalización por medio de lógica Y/O en el que una señal capacitada debe ser mayor que el segundo umbral de señal de dispersión, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el primer umbral de señal de dispersión o el umbral FL {[(primera señal de ángulo de dispersión O señales FL) Y segunda señal de ángulo de dispersión]}.

En una realización de la invención, se proporciona un método para el análisis simultáneo y cuantitativo de NRBC, WBC y WBC/Diff en una muestra sanguínea total. El método comprende la eliminación de los glóbulos rojos ("RBC") y el citoplasma de NRBC a partir de una alícuota de una muestra sanguínea para exponer los núcleos de NRBC, la tinción de los núcleos de NRBC y WBC no viables con un tinte vital mientras que se minimiza la tinción de WBC viables, someter la alícuota a medidas de luz por citometría de flujo, obteniendo al menos una señal para los parámetros incluyendo extinción de luz dispersada a desde aproximadamente 0º a aproximadamente 1º (ALL), luz dispersada de aproximadamente 3º-10º (IAS) y fluorescencia (F1), la capacitación de las señales obtenidas mediante el uso de la lógica Y/O en la que la lógica comprende [(señales ALL O señales F1) Y (señales de dispersión 30-10º)], la construcción de un diagrama tridimensional de señales de intensidad capacitada de fluorescencia y luz dispersada de las señales detectadas y la diferenciación células no viables de viables y los NRBC, WBC y WBC/Diff, todos a partir del diagrama tridimensional construido, y la determinación del número de células de cada uno.

Se proporciona un dispositivo para el análisis cuantitativo de células no viables, NRBC, WBC y WBC/Diff en una muestra sanguínea total. El dispositivo comprende un citómetro de flujo para obtener al menos una señal para parámetros incluyendo la luz dispersada a de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º y de aproximadamente 3º-10º y fluorescencia (F1) y un circuito de activación triple que capacita señales obtenidas mediante el citómetro de flujo para la digitalización por medio de la lógica Y/O en el que la lógica comprende [(señales de dispersión de 0º a aproximadamente 1º) O (señales F1) Y (señales de dispersión 3º-10º)] para validar señales para un procesamiento adicional.

Estas y otras características y ventajas de la invención se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la misma.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un diagrama esquemático de la óptica de un citómetro de flujo clínico que puede emplearse en la implementación del método de la presente invención.

La Figura 2 es un diagrama que representa un circuito de activación triple "Válido".

Las Figuras 3A, 3B y 3C son dibujos del estroma de RBC, NRBC, WBC y de otra distribución del ruido de fondo de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1, utilizando activadores de detección normales o convencionales.

Las Figuras 4A, 4B y 4C son dibujos del estroma de RBC, NRBC, WBC y de otra distribución de ruido de fondo de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando sólo un activador de pérdida de luz del eje de dispersión de 0º a aproximadamente 1º (ALL).

Las Figuras 5A, 5B y 5C son dibujos del estroma de RBC, NRBC, WBC y de otra distribución de ruido de fondo de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1 que utilizando sólo un activador de dispersión de ángulo intermedio (IAS).

Las Figuras 6A, 6B y 6C son dibujos del estroma de RBC, NRBC y de otra distribución de ruido de fondo de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando sólo un activador de fluorescencia (FL3).

Las Figuras 7A, 7B y 7C son dibujos de la distribución de NRBC de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando un nivel activador para FL3 más alto que el activador que se utiliza en la Figura 6 para eliminar las señales de ruido.

La Figura 8 es un dibujo de los WBC, NRBC y otra distribución de ruido de fondo de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando dos activadores, de ALL y de FL3, electrónicamente juntos por "ventana de análisis O".

Las Figuras 9A, 9B y 9C son dibujos de la distribución de WBC y NRBC de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1, utilizando dos activadores de ALL y de FL3 electrónicamente juntos por "puerta O" con el nivel de activador de FL3 fijado a un valor más alto que en la Figura 8.

Las Figuras 10A, 10B y 10C son dibujos de la distribución de WBC y NRBC de una muestra sanguínea total procesada como se describe en el Ejemplo 1, con activadores para ALL, IAS y FL3.

Las Figuras 11A - 11C muestran las visualizaciones del diagrama de puntos de una muestra sanguínea normal procesada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando activadores de detección normales o convencionales.

Las Figuras 12A y 12B muestran los citogramas de una sangre anómala con NRBC, procesada como se describe en el Ejemplo 2, utilizando activadores de detección convencionales o normales.

Las Figuras 13A y 13B muestran los citogramas de una sangre anómala con NRBC, procesadas como se describe en el Ejemplo 3, utilizando activadores de detección normales.

Las Figuras 14A - 14C representan las distribuciones de una muestra sanguínea total que contenía 56 NRBC/100 WBC utilizando el método de detección de activación triple (ALL, FL3 e IAS) de la presente invención.

Las Figuras 15A y 15B representan las distribuciones de otra muestra sanguínea total que contenía 140 NRBC/100 WBC, también utilizando el método de detección de activación triple (ALL, FL3 e IAS) de la presente invención.

Las Figuras 16A y 16B muestran los resultados de muestras de linealidad que se prepararon y procesaron como se describe en el Ejemplo 6 mediante el uso de un método de la presente invención.

La Figura 17 es el diagrama de correlación de los recuentos de NRBC de un analizador de hematología automatizado (ordenadas) utilizando un método de la presente invención y recuentos manuales de microscopía de NRBC (abscisas). Se procesaron los datos como se describe en el Ejemplo 7.

Las Figuras 18A - 18F muestran los citogramas de muestra sanguínea normal como se describe en el Ejemplo 8.

Las Figuras 19A - 19F muestran los citogramas de una muestra sanguínea anómala con NRBC (4,99 k/\mul ó 46,6 NRBC/100 WBC) y como se describe en el Ejemplo 9.

Las Figuras 20A - 20F muestran citogramas de una muestra que contiene linfocitos dañados como se describe en el Ejemplo 10.

Las Figuras 21A - 21F muestran citogramas sanguínea normal con edad de 35 h. en refrigeración como se describe en el Ejemplo 11.

Las Figuras 22A - 22F muestran citogramas de una muestra manipulada en la que las plaquetas y los WBC humanos fijados fuertemente se mezclan con fracciones de RBC humanas y se resuspenden en plasma humano como se describe en el Ejemplo 12.

Las Figuras 23A - 23F son visualizaciones de citómetros de flujo comerciales de una muestra sanguínea procesada como se describen en el Ejemplo 13.

Las Figuras 24A - 24F son visualizaciones de citómetros de flujo comerciales de una muestra sanguínea procesada como se describe en el Ejemplo 14.

Descripción detallada de la invención

Ampliamente, la presente invención se refiere a un método automatizado para el análisis simultáneo del diferencial WBC (Diff), NRBC y la viabilidad celular en una muestra sanguínea total.

Un aspecto de la presente invención es que el método utiliza un sistema de tinte/reactivo de lisis en el que los RBC y el citoplasma de NRBC se lisan mientras que se minimiza el daño a las membranas celulares de WBC, y preferiblemente antígenos de superficie de WBC, los núcleos expuestos de NRBC y cualesquiera de los núcleos de WBC dañados se tiñen con un tinte de ácidos nucleicos que no se filtra a través de la membrana celular intacta (tinte vital). Los núcleos de WBC intactos no se tiñen por exclusión.

El método descrito también permite análisis preciso WBC/Diff en una muestra sanguínea que contiene NRBC mediante la sustracción de señales identificadas como NRBC a partir de las señales de WBC totales antes de que el análisis WBC/Diff se realice. Sólo se necesita un tinte para la tinción de WBC dañados y NRBC. Esto permite que el análisis WBC/Diff se realice por la diferencia de características de dispersión de luz de las subclases de WBC. Las subclases de WBC que se identifican como dañadas mediante señales de FL3+ se añaden de nuevo a la subclase a la que pertenecen y de esta manera producen unos resultados precisos de WBC/Diff en una muestra que contiene WBC dañados.

En el sistema presentado, una tinción vital se combina con un sistema de reactivos multiuso que contiene tampón de aproximadamente de 10 a 20 mM, sal de amonio no cuaternaria, un tensioactivo y una concentración muy baja de un fijador de WBC, pH de aproximadamente 6,0 a 7,5, osmolaridad de aproximadamente 230 a 310 mOsm/l, para realizar análisis simultáneos de una etapa de WBC/Diff, NRBC y WBC dañados.

Los tintes de ácidos nucleicos vitales que se pueden usar en la presente invención no deben filtrarse a través de la membrana de células intactas y tienen un coeficiente de extinción relativamente alto y baja intensidad de fluorescencia cuando no están unidos con los ácidos nucleicos. Las características espectrales [Extinción (EX) máx. (nm)/Emisión (EM) máx. (nm)] de los tintes vitales deben ser compatibles con la fuente de luz de láser que se usa en el sistema y sus espectros de emisión no deben solapar con aquel del fluorocromo conjugado el Mab usado en inmunofenotipado.

Las siguientes características se desean para las tinciones vitales para el sistema descrito:

Coeficiente de extinción alto;

Límite cuántico alto;

Afinidad de unión a ácidos nucleicos alta;

Baja fluorescencia cuando no está unido a ácidos nucleicos; y

Características Espectrales que deben ser compatibles con la fuente de luz usada en el sistema de detección. Por ejemplo, para la fuente de luz láser Argón, de EX máx. alrededor de 488 nm y de EM máx. alrededor de 630 nm.

Esto no es para limitar los tintes vitales con el intervalo de EX máx. alrededor de 488 nm a usar con los métodos descritos. Será obvio para aquellos que son familiares con la técnica que los tintes con diferentes EX máx. pueden excitarse con fuentes de luz apropiadas tales como HeNe, Xenón o lámparas de Mercurio.

Hay varios tintes nucleares idóneos para el uso en el sistema descrito con una fuente de luz adecuada. Algunos de los tintes disponibles en el mercado que se pueden usar en el sistema descrito son 7-aminoactinomicina D, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1, TO-PRO-1 y muchos más.

En una realización preferida de la presente invención, los tintes idóneos que se pueden usar con el láser Argón que están también disponibles en el mercado son yoduro de Propidio (PI), bromuro de etidio (EBr), homodímero de etidio 1 (EthD-1), homodímero de etidio 2 (EthD-2) y dietilentriamina (DTA).

En una realización preferida de la presente invención, el tinte vital es PI, el sistema de reactivo multiuso tiene un pH de aproximadamente 6,5 a 7,0, osmolaridad de aproximadamente 260, tampón acetato de aproximadamente 15 mM, cloruro de amonio de aproximadamente 5,0 g/l, bicarbonato potásico de aproximadamente 2 g/l, saponina de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 150 mg/l y formaldehído aproximadamente al 0,07% y una rutina de capacitación de señal de umbral triple que capacita señales para la digitalización usando una lógica Y/O. Tal reactivo se presenta y se describe en la Solicitud PCT de Número de Serie WO94/18828, titulada "Sistema de reactivo multiuso para la lisis rápida de muestras sanguíneas totales".

Sin embargo, cualquier reactivo de lisis se puede utilizar siempre y cuando el reactivo no dañe las membranas celulares de WBC de modo que permita que se tiñan los núcleos de WBC previamente (antes de la lisis) viables.

La mezcla reactivo/tinte/muestra después se pasa, esencialmente una célula por tiempo, a través de una celda de flujo óptico iluminada. Esto provoca que las células dispersen la luz incidente y cualquiera de los núcleos teñidos presentes emita fluorescencia. Las señales de luz fluorescente y dispersada se detectan por medios conocidos y, usando el método de la activación triple junto con el procesamiento de las señales detectadas, es posible identificar y cuantificar WBC, WBC/Diff, WBC dañados y NRBC. Un analizador de hematología que se ha descubierto que es particularmente compatible con el método de activación triple de esta invención se presenta y se describe en la Solicitud de Estados Unidos de Nº de Serie 08/283.379, titulada "Método y aparato para realizar un análisis automatizado", presentada el 7 de julio, 1995. Publicada como documento US5939326.

La siguiente descripción se define mediante este analizador de hematología. Esta descripción se hace meramente por comodidad y de ninguna manera la presente invención está limitada a solo un instrumento.

Una porción de una muestra sanguínea total, aproximadamente de 25 microlitros, se deposita por medio de una sonda de aspiración de muestras en la cubeta de WBC que contiene aproximadamente 850 microlitros de un reactivo de lisis isotónico. Un reactivo de lisis se usa para lisar la fracción de eritrocitos de la muestra sanguínea y para lisar el citoplasma de los NRBC para exponer los núcleos de cualquier NRBC presente. Además de lisar la fracción de eritrocitos de la sangre, el reactivo debe ser lo suficientemente suave para proteger o para no dañar la fracción de WBC. No importa lo que la formulación de lisis utilice con el método de activación triple; el reactivo contendrá adicionalmente o estará combinado con, una pequeña concentración de un tinte nuclear vital que marca eficazmente cualquier NRBC que pudiera estar presente en la sangre periférica. Preferiblemente, para su uso con el analizador referenciado anteriormente, la química de lisis se configurará de modo que el índice de refracción coincida con aquel de una solución envolvente en sustancialmente menos del 0,1%.

La mezcla de reactivo de lisis y la muestra permanecerán normalmente en la cubeta de WBC anteriormente referenciada sólo durante 11 segundos. En ésta se lisa y se mezcla a 42ºC \pm 3ºC. En este punto, los contenidos de la cubeta de WBC se canalizan directamente a una celda de flujo óptico 100 para su detección, véase Figura 1.

El proceso de medida empieza cuando la corriente de células pasa a través de la celda de flujo 100, habiéndose diluido con la adición de lisis de modo que las células pasan a través del volumen iluminado por el láser en una única fila, en una corriente de muestra de flujo laminar rodeadas por una solución de diluyente/envolvente. El volumen iluminado está limitado en las dos dimensiones normales al eje del flujo por la corriente celular centrada hidrodinámicamente y en la dimensión paralela al eje de flujo por la anchura de la vertical del haz de láser que es aproximadamente 17 micras. Cuando se hace este ensayo, el caudal de la muestra es aproximadamente 2,5 microlitros por segundo y el volumen de detección iluminado correspondiente de las células WBC y NRBC se aproxima a un cilindro elíptico con una dimensión de aproximadamente 80 x 5 x 17 micras. La dimensión de 17 micras se mide a lo largo del eje del cilindro.

En este punto y como se muestra en la Figura 1, la presencia de una célula se detecta por un compuesto de fotodiodo 102 que detecta la pérdida de luz del eje (ALL) y la dispersión de ángulo intermedia (IAS), el tubo fotomultiplicador 104 que detecta fluorescencia roja y un único circuito de activación triple, mostrados en la Figura 2, en el espacio de características tridimensional de ALL, IAS y FL3 (fluorescencia roja). El circuito de activación triple capacita señales para la digitalización usando lógica Y/O. Una señal capacitada debe ser mayor que el activador de IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el activador de ALL o el activador de FL3. La combinación de este único circuito de activación y las propiedades de lisis que incluyen un fijador equilibrado, permiten a los núcleos expuestos de NRBC y dañados de WBC teñirse rápidamente y contarse claramente y de manera no ambigua y excluirse del recuento diferencial de células de WBC sin la interferencia normal de fondo, tanto fluorescente como no fluorescente, tal como de fragmentos de ADN, de estroma de RBC y plaquetas.

Uno o más detectores se colocan preferiblemente en la trayectoria de luz frontal para medir la dispersión de ángulo intermedio frontal (IAS) y la dispersión de luz frontal de ángulo pequeño (SAS) o la pérdida de luz del eje (ALL; también conocida como extinción frontal). ALL es generalmente la disminución de la energía de la luz debido al paso de la célula por delante de un haz de láser y que se detecta por un fotodiodo. La pérdida de luz generalmente se debe a la dispersión y se define como la disminución en la energía de la luz que llega a un detector en la trayectoria de un haz de láser debido al paso de una célula a través de ese haz (generalmente ALL se detecta a un ángulo de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º). La dispersión frontal de ángulo pequeño (SAS), por el contrario, es energía de luz que llega a un detector fuera del haz de láser incidente (pero dentro de un ángulo estrecho desde aproximadamente 1º a 3º) debido a la dispersión de una célula que pasa a través del haz. Se proporciona generalmente un atenuador para evitar que el haz de luz se introduzca en el detector. Los sistemas de medida de ALL recogen luz dentro del cono incidente de la iluminación láser, mientras que los sistemas de dispersión de ángulo pequeño recogen luz fuera de este cono. En los sistemas de medida de ALL la señal de interés es una señal negativa sustraída de la señal de láser de estado estacionario, mientras que en la medida de la dispersión frontal de ángulo pequeño la señal es una señal positiva pequeña impuesta en un nivel de fondo muy bajo. La dispersión frontal de ángulo intermedio (IAS) es similar a la dispersión frontal de ángulo pequeño, excepto porque la luz se dispersa en un ángulo mayor a partir del haz de láser incidente. Más específicamente, IAS se refiere a luz dispersada en un anillo a aproximadamente entre 3º y 10º del incidente o línea central de un haz de láser. En una realización preferida, ALL se recoge en los ángulos menores de aproximadamente 0,3º horizontalmente y menores de aproximadamente 1,2º verticalmente del eje del láser, e IAS se recogen en ángulos entre aproximadamente 3º y 10º del eje del láser.

Cuando las células, que están activadas, pasan a través del volumen iluminado anteriormente mencionado, se generan pulsos en los detectores 102, 104, 106 y 108. Las amplitudes de estos pulsos se filtran después, se amplifican, se digitalizan y se almacenan a modo de lista en el correspondiente espacio de características de cinco dimensiones de ALL, IAS, FL3, PSS (dispersión lateral polarizada) y DSS (dispersión lateral despolarizada). El tiempo de recuento normal a través de la celda de flujo 100 es 10 segundos. El caudal y el porcentaje de dilución descritos anteriormente, con un recuento de WBC en un paciente normal de 7000 células por microlitro de volumen sanguíneo, la tasa de recuento del acontecimiento resultante sería 5000. En muestras de recuento bajo, este tiempo de recuento puede prolongarse automáticamente para mejorar las estadísticas de la medida. Al finalizar del tiempo de medida, la corriente de muestra se canaliza hacia los desechos y la sonda se limpia y se seca y se prepara para procesar una muestra subsiguiente.

Después se aplican los algoritmos a los datos a modo de lista del espacio de características mencionado anteriormente de ALL, IAS, FL3, PSS y DSS y los siguientes tipos celulares se enumeran y/o señalizan en menos de 30 segundos de tiempo de procesado:

1

Las señales ALL e IAS se detectan y se recogen para el análisis WBC/Diff y las señales de FL3 de núcleos NRBC teñidos se recogen para el análisis de NRBC, como se describirá a continuación. El circuito de activación triple, mostrado en la Figura 2, capacita estas señales para la digitalización usando una lógica Y/O. Para que una señal esté capacitada debe ser mayor que el activador de IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el activador de ALL o el activador de FL3.

Los distintos componentes y señales generadas o utilizadas identificados en la Figura 2 corresponden a los siguientes nombres:

2

Las señales en tiempo real a partir de sus respectivos canales están presentes en las entradas de los comparadores de voltaje. Los comparadores de voltaje 300, 314 y 322 funcionan comparando las "entradas +" (302, 310 y 318) con las "entradas -" (304, 312 y 320) a las salidas resultantes (306, 316, 324). Si la entrada "+" es de un voltaje superior a la "entrada -" la salida será elevada. Si la "entrada +" es de un voltaje menor que la "entrada -" la salida será baja.

Los voltajes umbral son voltajes independientes que se determinan mediante parámetros del sistema.

Las salidas de los comparadores 300 y 314 son entradas a la puerta O 326 para dar una salida resultante de puerta O 328. La puerta O funciona comparando sus entradas. La salida será alta si cualquiera, o ambas, entradas son altas.

La salida de la puerta O 328 y las salidas de los comparadores 322 y 324 son entradas a la puerta Y 330. La puerta de análisis Y funciona por comparación de sus entradas para derivar su salida 332 que también es la salida de activación válida. La salida será alta solo si ambas entradas son altas.

La salida de activación válida (332) sólo será alta si la señal de IAS 318 es mayor que su voltaje umbral 320, y cualquiera o ambas de las siguientes, la señal ALL 302 es mayor que su voltaje umbral 304 o la señal FL3 310 es mayor que su voltaje umbral 312.

ALL e IAS se recogen para el análisis WBC/Diff y las señales de fluorescencia (FL3) se recogen para el análisis de NRBC y WBC dañados. Una rutina de capacitación o un circuito de umbral triple capacitan señales para la digitalización usando una lógica Y/O. De acuerdo con este circuito o rutina únicos, para que una señal esté capacitada debe ser mayor que el umbral de IAS, mientras que al mismo tiempo debe ser mayor que el umbral ALL o el umbral de FL3. Usando este circuito de activación, los NRBC forman un único grupo en el espacio tridimensional mencionado anteriormente, véanse las Figuras 14 y 15, que pueden contarse fácilmente durante el análisis Diferencial de WBC Óptico y excluir de manera no ambigua a partir del recuento de WBC. De esta manera, se indica un recuento de NRBC por 100 WBC y un total de NRBC por \mul de sangre de paciente. Consecuentemente, los NRBC se sustraen de los recuentos totales de WBC permitiendo el análisis Diferencial y del total de WBC precisos en presencia de NRBC en una muestra sanguínea. Las señales que están sobre tanto los activadores de ALL como los de FL3 se identifican como WBC dañados. La subpoblación dañada de WBC se identifica del mismo modo que en el análisis diferencial de WBC intactos. El ruido de fondo, tanto fluorescente como no fluorescente, de los fragmentos de ADN, del estroma de RBC, de las plaquetas de los cuerpos de Howell-Jolly, del Punteado Basofílico, del ARN de reticulocitos lisados y del ADN de WBC y fragmentos Megacariocíticos se elimina sustancialmente. Los núcleos teñidos de NRBC se separan de las distintas señales de ruido de fondo mediante el proceso de activación triple descrito (en ALL, IAS y FL3) y solo las señales de FL3+ de los núcleos de NRBC sobre el umbral de FL3 en el diagrama de puntos de ALL frente a FL3 se cuentan como NRBC.

En las Figuras 3 a 10 las áreas de poblaciones celulares identificadas por los números indicados a continuación, corresponden a los siguientes tipos celulares:

3

Otra ventaja técnica del sistema presentado es que requiere una concentración mucho menor de tinte para teñir eficazmente y rápidamente los NRBC para la detección y recuento precisos debido a la lisis completa del citoplasma de NRBC que hace que sus núcleos sean más accesibles a la tinción. Esta condición permite una alta señal para el porcentaje de ruido (S/N), mayor de 100, en la detección de NRBC. La concentración de un tinte vital que requirió este sistema para realizar rápidamente el análisis simultáneo de WBC/Diff/NRBC/WBC dañados es solo de 1 a 2 \mug/ml que es al menos 50 veces menor que aquel de la técnica previa.

El método presentado es único ya que se puede realizar el análisis simultáneo de WBC/Diff/NRBC/WBC dañados automáticamente, de manera precisa y rápidamente sin interferencia de otros residuos celulares. Una ventaja adicional de la presente invención es que tiene un valor clínico muy alto ya que el método puede incorporarse en un analizador de hematología clínico que calibra rutinariamente respecto a los recuentos de WBC, RBC y plaquetas. Este sistema es capaz de producir unos datos precisos de WBC/Diff/NRBC/WBC dañados (% así como recuentos absolutos) en muestras sanguíneas clínicas. Esto previamente no ha sido posible.

Ejemplo 1

Una sangre normal fresca anticoagulada con EDTA se procesó en una unidad experimental de un analizador de hematología clínico automatizado descrito anteriormente y presentado y descrito en la Solicitud de Estados Unidos de Nº de Serie 08/283.379, titulado "Método y aparato para realizar un análisis automatizado", presentada el 7 de Junio, 1995, publicada como el documento US 5939326. Mientras que la presente invención se incorporó en el analizador mencionado anteriormente no siempre se utilizó en todos los ejemplos siguientes. Se mezclaron veinticinco (25) microlitros de muestra sanguínea, en conexión con el instrumento, con 675 microlitros del reactivo multiuso isotónico (pH 6,5, 260 mOsm/l) presentado en la Solicitud PCT de Nº de Serie WO24/18828, titulada "Sistema de reactivo multiuso para la lisis rápida de muestras de sangre total".

Para los fines de estos experimentos el sistema de reactivo multiuso está comprendido de cloruro de amonio (5 g/l) de aproximadamente 95 mM, formaldehído aproximadamente al 0,075% en volumen, tampón acetato de aproximadamente 10 mM a aproximadamente de 20 mM, bicarbonato potásico de aproximadamente 10 mM y saponina a aproximadamente 0,01% por volumen de peso (es decir, gramos por 100 ml). El pH del sistema de reactivo se ajusta a un intervalo de aproximadamente 6,2 a aproximadamente 7,0 y la osmolaridad del sistema de reactivo es de aproximadamente 215 a aproximadamente 270 mOms/l.

Se precalienta el reactivo a 42ºC \pm 3º en la cámara de mezcla calentada del instrumento, en la que la muestra y el reactivo se mezclan y se incuban durante 11 segundos. Esta mezcla se transporta después a la celda de flujo (que tarda 8 segundos y 1/2) para el análisis de WBC/Diff/NRBC. La configuración óptica del sistema se presenta en la Figura 1. El análisis se realizó sin la implementación del circuito de activación triple; usando sólo los activadores duales de ALL y de FL3 como es común en la técnica. Véanse todas las Figuras de la Figura 3A a la 10C.

La visualización del diagrama de puntos superior de la Figura 11A localiza las señales de dispersión de luz (ALL frente a IAS) obtenidas a partir de la muestra y refleja tres poblaciones distintas de WBC. El grupo de los Basófilos no se manifiesta aquí porque la sangre normal no contiene muchos Basófilos. El grupo de los Eosinófilos no se muestra aquí porque los Eosinófilos se separan mediante un diagrama de puntos de DSS frente a PSS (no mostrado) y el citograma del centro de la Figura 11B muestra una visualización del diagrama de puntos de las señales de ALL y FL3 como marcadas. Nótese que la sangre normal no contiene ningún NRBC. Los grupos de la parte más baja FL3+de las Figuras 11B y 11C, son aparentemente residuos celulares que contienen ARN o ADN, como se describe
anteriormente.

Ejemplo 2

Las Figuras 12A y 12B, los citogramas superior e inferior respectivamente, son visualizaciones de diagramas de puntos de una sangre anómala con NRBC (47 NRBC/100 WBC) analizada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando un método de detección convencional. El grupo justo debajo de la población de linfocitos en el citograma superior pertenece a los NRBC y el grupo pequeño en la esquina izquierda inferior pertenece al ruido de origen que incluye el estroma de RBC (retículo, cuerpos de Howell Jolly y etc.), plaquetas y residuos de WBC. La Figura 12B muestra que el grupo de ruido de origen de esta muestra teñida con el tinte nuclear de manera brillante, sigue muy de cerca al grupo de NRBC teñido en el canal de FL3, por lo tanto hace imposible fijar el activador de FL3 para contar los NRBC de manera precisa.

Ejemplo 3

Los citogramas de las Figuras 13A y 13B son visualizaciones de diagramas de puntos de una sangre anómala con NRBC (51 NRBC/100 WBC) analizada como se describe en el Ejemplo 1 utilizando un método de detección convencional. El grupo justo debajo de la población de linfocitos en la visualización superior, la Figura 13A pertenece a NRBC. Se puede ver un ruido de origen de FL3+ aumentado de esta muestra. El grupo de ruido se localiza muy cerca del grupo de NRBC en el canal de FL3. Por tanto, el ruido de FL3 está interfiriendo con la posición del activador de FL3. Cuando el activador de FL3 se fijó suficientemente alto para eliminar todo el ruido de origen, una parte de la población de NRBC también se perdió por debajo del activador de FL3 como se muestra en la Figura 13B.

Ejemplo 4

El circuito de activación triple descrito (ALL/IAS/FL3), la Figura 2, de la presente invención se incorporó en el mismo instrumento usado en los EJEMPLOS 1 hasta 3 y se utilizó durante este procedimiento.

Una muestra clínica anticoagulada con EDTA que contenía 56 NRBC/100 WBC se procesó como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en las Figuras 14A a 14C. Nótese la desaparición del grupo de ruido de FL3+. Las señales de ruido se bloquean por el activador de IAS añadido. El ruido de origen fluorescente de esta sangre anómala ya no es visible sobre el activador de FL3, a pesar de que el activador se fija lo suficientemente bajo para recuperar la población total de NRBC (Nótese la forma circular del grupo NRBC).

Ejemplo 5

Las Figuras 15A y 15B muestran las visualizaciones de diagramas de puntos de la distribución de NRBC de otra muestra sanguínea total clínica que contenía 140 NRBC/100 WBC, también después de la implementación del activador triple (ALL, FL3 e IAS). El ruido de origen no es visible y la población total de NRBC se recupera por encima del activador de FL3. Nótese la alta densidad del grupo de NRBC debido a la alta concentración de NRBC en esta muestra.

Ejemplo 6

Las muestras de linealidad se prepararon añadiendo distintas concentraciones de eritrocitos de pollo no fijados a una sangre humana normal anticoagulada con EDTA. Se procesaron las muestras como se describe en el Ejemplo 1, utilizando el método de detección de triple activación de la presente invención. El citoplasma de los eritrocitos de pollo se lisa en el método de la presente invención dejando solo núcleos desnudos (CEN). Los CEN se tiñeron muy rápidamente con el tinte nuclear vital (PI) en el diluyente y se volvieron fluorescentes (FL3). Los CEN FL3+ se cuentan como NRBC y se indican como el número de NRBC/100 WBC y como los recuentos absolutos por \mul de la muestra sanguínea total en el método de la presente invención. Los resultados se presentan en las Figuras 16A y 16B. Los diagramas de linealidad de NRBC/100 WBC y NRBC en números absolutos en la figura demuestran que el método de la presente invención genera recuentos de NRBC lineales.

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Ejemplo 7

La Figura 17 muestra el diagrama de correlación de los recuentos de NRBC (ordenadas) de 85 muestras clínicas obtenidas por el método de la invención actual. Los resultados se correlacionaron con aquellos de los recuentos microscópicos de los manuales de referencia (abscisas). Para los recuentos manuales de NRBC, se realizó un diferencial de WBC de 200 células en cada frotis sanguíneo de paciente teñido con Wright-Giemsa y los recuentos de NRBC presentes en la misma región se dividieron por 2 para indicar NRBC/100 WBC. El coeficiente de correlación (R) es 0,973 (R2= 0,946), la pendiente es 0,86 y la ordenada de origen es 1,32.

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Ejemplo 8

Se mezclaron veinticinco (25) microlitros de la muestra sanguínea y se incubaron, en conexión con el instrumento, a 42ºC durante 11 segundos con 675 microlitros del reactivo multiuso del Ejemplo 1 (pH 7.0, 260 mOsm/L) en el agitador calentado del analizador de hematología presentado y descrito en la Solicitud de Estados Unidos de Nº de Serie 08/283.379, titulada "Método y aparato para realizar análisis automatizados", presentada el 7 de Junio, 1995, publicada como el documento US 5939326. Esta mezcla se transportó después automáticamente a la celda de flujo y se analizó (aproximadamente 8 segundos y 1/2 para el análisis WBC/Diff/NRBC). Las Figuras 18A - 18F son los citogramas de la sangre. El citograma superior de la izquierda, La Figura 18A, de las señales de dispersión de luz (ALL frente a IAS) muestran 3 poblaciones distintas de WBC (neutrófilos, monocitos y linfocitos). El grupo de Basófilos no se manifiesta aquí porque la sangre normal contiene sólo aproximadamente el 1% o menos de basófilos. Los Eosinófilos se separan en la parte superior derecha del citograma de PSS frente a DSS, Figura 18B. El citograma del centro a la izquierda, la Figura 18C, es una visualización de ALL y FL3. Nótese que la sangre normal no contiene ningún NRBC y que hay sólo unas pocas células dañadas a la derecha de la línea vertical en la Figura 18C (señales FL3+).

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Ejemplo 9

Una sangre anómala con NRBC (4,99 k/\mul o 46,6 NRBC/100 WBC) se analizó como se describe en el Ejemplo 8 y los resultados se presentan en las Figuras 19A - 19F. El grupo justo debajo de la población de linfocitos en la parte superior izquierda del citograma (ALL frente a IAS), Figura 19A, pertenece a NRBC. El citograma de la parte inferior derecha (ALL frente a FL3+), Figura 19F, revela que los núcleos separados de NRBC se tiñen de manera brillante y se mueven por encima del activador de FL3+ y se cuentan. Los recuentos de NRBC se sustraen después de los recuentos totales de WBC antes del análisis diferencial de WBC produciendo unos resultados de WBC/Diff precisos.

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Ejemplo 10

Una muestra clínica (CLL) que contiene linfocitos dañados se analizó como se describe en el Ejemplo 8 y los resultados se presentan en las Figuras 20A - 20F. El grupo a la derecha justo debajo de la población de linfocitos en el citograma superior (ALL frente a IAS), la Figura 20A, pertenece a los linfocitos dañados. La Figura 20C (ALL frente a FL3+) muestra que al menos una mitad de la población de linfocitos se tiñeron con el tinte de ácido nucleico (PI). La revisión microscópica del frotis de la muestra reveló que aproximadamente el 50% de la población de linfocitos se tiñó o había perdido su membrana citoplasmática (núcleos desnudos). Los linfocitos dañados se distinguen de los NRBC a lo largo del eje ALL puesto que su señales de dispersión de luz son más altas que aquellas de los núcleos de NRBC separados.

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Ejemplo 11

Una muestra sanguínea normal envejecida durante 35 horas en refrigeración se analizó como se describe en el Ejemplo 8 y los resultados se presentan en las Figuras 21A - 21F. La muestra se procesó como se describe en el Ejemplo 8. Las señales FL3+ mostradas en el citograma de ALL frente a FL3 a la derecha de los granulocitos y linfocitos, la Figura 19F, representa granulocitos y linfocitos dañados respectivamente.

Ejemplo 12

Una muestra manipulada en la que plaquetas y WBC humanas fijadas fuertemente se mezclaron con la fracción de RBC humana y se resuspendieron en un plasma humano. Esta mezcla se analizó como en el Ejemplo 8 y los resultados se presentan en las Figuras 22A - 22F. A diferencia de los WBC conservados por el sistema de reactivo multiuso que se describe en el presente documento, el citograma de ALL frente a FL3, Figura 22C, de las células fijadas fuertemente revela que todos los WBC están teñidos intensamente. El reactivo de entrecruzamiento hace a la membrana celular muy porosa permitiendo que el tinte de ácido nucleico penetre en las células. Las subpoblaciones de WBC se identifican mediante análisis de dispersión de luz multidimensional como se describe en la Solicitud de Estados Unidos de Nº de Serie 08/283.379, titulada "Método y aparato para realizar un análisis automatizado", presentada el 7 de Junio, 1995, publicada, como el documento US 5939326.

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Ejemplo 13

Cincuenta \mul de cada dos muestras sanguíneas normales se mezclaron con 10 \mul de Mab solución que contenía anti-CD3FITC y anti-CD4-PE en tubos de ensayo separados. Una segunda alícuota de 50 \mul de muestras sanguíneas normales se mezcló con 10 \mul de solución Mab que contenía anti-CD3FITC y anti-CD8-PE en dos tubos de ensayo adicionales y separados. Se preparó un control negativo sin añadir ningún Mab a un tubo de ensayo. Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de añadir 1,7 ml del reactivo multiuso del Ejemplo 1 sin ningún tinte de ácido nucleico, se precalentaron a 42ºC para cada tubo. Las muestras se presentaron a un instrumento FACScan® (Becton, Dickinson & Co.) y la adquisición de señal empezó exactamente 11 segundos después de la adición del reactivo multiuso. Los resultados se presentan en las Figuras 23A - 23F y la Tabla 1. Los citogramas superiores, las Figuras 23A & B representan el control negativo de la sangre normal, el citograma izquierdo, la Figura 23A, muestra la dispersión frontal (FCS) frente a la dispersión lateral de 90º mostrando el acotamiento de linfocitos; el citograma de la derecha, Figura 23B, muestra la visualización bidimensional de FL1 frente a FL2; los citogramas del centro, Figuras 23C & D, representan la misma muestra pero que ha reaccionado con Mab anti-CD4; los citogramas inferiores, las Figuras 23E & F, representan la misma sangre pero que ha reaccionado con Mab anti-CD8.

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Ejemplo 14

Cincuenta \mul de dos muestras sanguíneas normales se mezclaron con 10 \mul de solución de Mab que contenía anti-CD3FITC y anti-CD4-PE en un tubo de ensayo. En un segundo tubo, se mezcló 50 \mul de una muestra sanguínea normal con 10 \mul de solución Mab que contenía anti-CD3FITC y anti-CD8-PE en un tubo de ensayo. Un control negativo se preparó sin añadir ningún Mab. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. antes de añadir 1,7 ml del reactivo multiuso descrito anteriormente con PI (0,2 \mug/ml), precalentado a 42ºC. La muestra se presentó a un instrumento FACScan® (Becton, Dickinson & Co.) y la adquisición de señal empezó exactamente 11 segundos después de la adición del reactivo multiuso. Los resultados se presentan en las Figuras 24A - 24F y en la Tabla 1. Los citogramas superiores, las Figuras 24A & B, representan un control negativo de una sangre normal; el citograma izquierdo, Figura 24A, muestra la dispersión frontal (FCS) frente a la dispersión lateral de 90º mostrando el acotamiento de linfocitos; el citograma de la derecha, Figura 24B, es la visualización bidimensional de FL1 frente a FL2; los citogramas del centro, las Figuras 24C & D, representan la misma muestra pero que ha reaccionado con Mab anti-CD4; y los citogramas inferiores, Figuras 24E & F, representan la misma sangre pero que ha reaccionado con Mab anti-CD8.

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TABLA 1

4

5

Claims (10)

1. Un método de diferenciación de glóbulos rojos nucleados NRBC, glóbulos blancos dañados y glóbulos blancos WBC en una muestra por citometría de flujo que comprende:

(a)

la mezcla de una alícuota de una muestra sanguínea con un sistema de reactivo que comprende un componente de lisis de glóbulos rojos RBC y un componente de tinción nuclear vital para teñir el núcleo de los NRBC y de cualquier WBC dañado, donde componente de lisis lisa RBC mientras que minimiza el daño a las membranas celulares de WBC;

(b)

pasar la alícuota mezclada, sustancialmente una célula por tiempo, a través de un área de estimulación óptica;

(c)

la obtención de una señal para cada uno de los parámetros de fluorescencia FL y de luz dispersada tanto de un primer intervalo de ángulos de dispersión como de un segundo;

(d)

la capacitación de las señales obtenidas sometiendo las señales a una lógica donde para que la señal esté capacitada para la luz dispersada a un segundo intervalo de ángulos de dispersión debe ser mayor que un segundo umbral de señal de dispersión, mientras que al mismo tiempo la señal para la luz dispersada a un primer intervalo de ángulos de dispersión debe ser superior que un primer umbral de señal de dispersión o la señal FL debe ser mayor que un umbral de FL donde los umbrales se fijan para eliminar falsas señales de ruido de FL e incluyen señales de población de NRBC en las señales obtenidas;

(e)

la construcción de un diagrama tridimensional de señales de intensidad de FL y luz dispersada de las señales capacitadas y obtenidas;

(f)

la diferenciación de WBC, NRBC, WBC dañados y un diferencial WBC/Diff de subclase de WBC del diagrama tridimensional construido y las señales capacitadas y la determinación del número de células de cada clase y subclase.

2. El método de la reivindicación 1 donde el primer intervalo de ángulos de dispersión es de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º.

3. El método de la reivindicación 1 donde el parámetro de luz dispersada en un primer intervalo de ángulos de dispersión es la pérdida de luz del eje ALL.

4. El método de la reivindicación 4 en el que la ALL se obtiene a un ángulo de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º.

5. El método de la reivindicación 1 donde un parámetro de señal obtenido comprende pérdida de luz del eje ALL.

6. El método de la reivindicación 1 donde un parámetro de dispersión obtenido es dispersión de ángulo frontal FSC.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho primer intervalo de ángulos de dispersión comprende ángulos de aproximadamente 0º a aproximadamente 1º y dicho segundo intervalo de ángulos comprende ángulos de aproximadamente 3º - 10º.

8. El método de la reivindicación 1 donde el tinte nuclear se selecciona del grupo que consiste en yoduro de propidio PI, bromuro de etidio EBr, homodímero de etidio-1 EthD-1, homodímero de etidio-2 EthD-2 y dietilentriamina DTA.

9. El método de la reivindicación 1 donde el recuento determinado de NRBC se sustrae de los recuentos determinados de WBC antes de la determinación de WBC/Diff.

10. El método de la reivindicación 1 que además comprende la etapa de adición de anticuerpos marcados con fluorescencia a la muestra y la incubación de la mezcla anticuerpo/muestra durante un tiempo suficiente para que los anticuerpos se unan con su pareja de unión, los antígenos de superficie, antes de la etapa (a).