ES2347421T3 - Liposomas preparados a partir de lipidos extraibles de mycobacterium. - Google Patents

Abstract

Un liposoma que comprende uno o varios lípidos obtenibles a partir de una especie de micobacteria, y que se seleccionan entre el fosfatidilinositol (PI), el fosfatidilinositol manósido (PIM1), el fosfatidilinositol dimanósido (PIM2), las formas mono y dipalmitoiladas de PIM1 y PIM2, fosfolípidos acilados que tienen picos de espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos en 899, 1139 y 1155 m/z, la fosfatidiletanolamina y el cardiolípido, en donde dichos lípidos que se pueden obtener a partir de una micobacteria, son solubles en cloroformo y extraíbles con el mismo.

Description

Liposomas preparados a partir de lípidos extraíbles de Mycobacterium.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al uso de lípidos polares extraíbles con cloroformo a partir de la cepa BCG de la vacuna humana de Mycobacterium bovis, y de otras micobacterias con lípidos similares, para preparar liposomas con actividad inmunomoduladora y complementaria para estimular una respuesta inmune frente a un antígeno asociado. Los lípidos polares totales de BCG o de las fracciones lipídicas purificadas, de PI (fosfatidilinositol), PIM (fosfatidilinositol manósido), PIM_{2} (fosfatidilinositol dimanósido) y sus formas palmitoiladas, o los fosfolípidos acilados de 899, 1139 y 1155 m/z, se utilizan para formar liposomas a temperaturas elevadas y para activar las células presentadoras de antígeno de modo específico. La invención se refiere más específicamente al desarrollo de una vacuna, proporcionando un vehículo estable para el suministro del antígeno a las células presentadoras de antígeno, empleando glicerolípidos de BCG polares, extraíbles con cloroformo e inmunoestimuladores, que da como resultado una mejora de las respuestas del MHC de clase I y de clase II en un animal.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la historia, las vacunas humanas han consistido en agentes patógenos víricos o bacterianos vivos y atenuados. La tolerancia y la seguridad del paciente suponen una preocupación que se basa en posibles reacciones secundarias de vacunas complejas y mal definidas, y la posibilidad de una vuelta a la virulencia. Un enfoque más actual es emplear antígenos definidos y muy purificados. Las reacciones secundarias se minimizan, pero la eficacia de estas vacunas de subunidades es generalmente baja, debido a una pérdida en inmunogenicidad cuando se purifica el antígeno. Otra dificultad es dirigir hacia la diana de forma eficaz, tanto el antígeno como el aditivo precisamente hacia las mismas células que presentan el antígeno. Además, la falta de eficacia se puede explicar por una respuesta inmune inadecuada, porque la protección puede requerir que predominen las respuestas humorales, las mediadas por células o con linfocitos T citotóxicos (CTL), dependiendo del agente patógeno en cuestión. Por ejemplo, la inmunidad protectora contra el carbunco está pensada para que requiera solamente una respuesta humoral, mientras que, una vacuna protectora contra agentes patógenos intracelulares tales como M. tuberculosis o el cáncer, requiere una respuesta fuerte de los CTL. El uso del alumbre como aditivo (aprobado para el uso en seres humanos) se basa en la formación de un complejo con el antígeno para proporcionar un efecto de depósito, que produce solamente una respuesta Th2, y no CTL. Además, las reacciones locales pueden tener lugar en el sitio de la inyección de los aditivos basados en aluminio, tales como alumbre (Koike y col. 1998).

Otros sistemas de aditivos, tales como los arqueosomas (Krishnan y col. 2001) y los complejos inmunoestimuladores (ISCOMS), son especialmente adecuados como aditivos transmitidos por células, pero solamente producen respuestas moderadas de los anticuerpos. Los ISCOMS tienen problemas relacionados con la toxicidad de las preparaciones de saponina, utilizadas en su construcción, y con el uso con antígenos solubles en agua (Bowersock y Martin 1999). En casos en los que el antígeno y el aditivo no se suministran conjuntamente como un sistema en partículas, tiene lugar una falta de eficacia en el suministro del antígeno a las mismas células presentadoras de antígeno, activadas con el aditivo. Muchos sistemas de suministro también requieren aditivos tales como Quil A o Lípido A (ej. ISCOMS, liposomas convencionales) con problemas de coste, estabilidad y toxicidad asociados con su uso. La simplicidad de la producción y los costes pueden ser un problema para muchos de estos sistemas complementarios. Finalmente, la falta de retención del antígeno encapsulado, volverá ineficaz a un sistema de vesículas de una vacuna.

La Mycobacterium spp. está asociada frecuentemente con la patogénesis y se conoce bien como agente causante de la tuberculosis (M. tuberculosis), la lepra (M. leprae), y como agente patógeno oportunista (M. avium). La capacidad del sistema inmune para responder a las células micobacterianas o a sus componentes, ha sido un área de intenso interés durante décadas, debido a la patogenicidad asociada con este género.

La vacuna actual contra la tuberculosis en los seres humanos es el cultivo del bacilo de Calmette-Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis, que se pudo atenuar mediante pases en medio de laboratorio. Aunque las razones exactas para la atenuación todavía se están investigando (Behr y col. 2000), se descubrió pronto que las células completas termodestruidas de Mycobacterium tuberculosis mezcladas con aceite y un antígeno, daban como resultado una fuerte actividad como aditivo. Esto llegó a ser conocido como aditivo completo de Freund (FCA) y ha sido utilizado en numerosos laboratorios para potenciar a un anticuerpo fuerte, así como a una respuesta fuerte de los linfocitos T citotóxicos (CTL) (Skinner y col. 2001), frente a un antígeno proteico. Los componentes activos en el FCA incluyen el dipéptido de muramilo y el 6,6'-dimicolato de trehalosa, procedentes de la pared celular (Retzinger y col. 1981). El aditivo completo de Freund es tóxico por lo que causa una inflamación aguda, granulomas y toxicidad crónica (Retzinger y col. 1981) y es inaceptable, por lo tanto, para el uso en seres humanos o veterinario. La superficie de la Mycobacterium spp. está compuesta por la membrana citoplásmica rodeada por una pared celular formada por arabinogalactano de micoloilo, fijado covalentemente a peptidoglicano, y lipoarabinomanano asociado (LAM) (Chatterjee y Khoo 1998). Todas las cepas tienen estas capas, aunque la capa exterior parece diferir en detalles estructurales entre las cepas (Ortalo-Magné y col. 1996). Los lípidos comprenden parte de estas diferentes capas exteriores y representan hasta el 60% en peso de la pared celular micobacteriana. Esto incluye el micolil-arabinogalactano-peptidoglicano, el polímero unido covalentemente, y varios tipos de lípidos "extraíbles". Los lípidos "extraíbles" encontrados en diferentes cepas incluyen: (1) glicolípidos que contienen trehalosa, (2) lípidos de glicopéptido, (3) glicolípidos fenólicos, (4) lipooligosacáridos, (5) fosfatidilinositol manósidos (PIMs), (6) fosfatidiletanolamina y (7) triacilgliceroles (Wang y col. 2000; Besra y Brennan 1994). Las estructuras completadas para nuevos palmitoil- y dipalmitoil-PIMs se han descrito recientemente (Gilleron y col. 2001). Además, estos autores mostraron que el fosfatidilinositol (PI) tenía la misma capacidad que PIM_{1} y PIM_{2} (todo adsorbido aparentemente sobre alumbre) para inducir el reclutamiento de los linfocitos T citolíticos naturales, indicando que no había diferencias en la respuesta biológica con la adición de residuos de manosa al PI (Gilleron y col. 2001). Este efecto biológico está en contraste directo con la estimulación de las células dendríticas para secretar IL-12 mediante PIMs, y no PI, según se observa en la presente
invención.

Los LAMs representan el equivalente micobacteriano de los lipopolisacáridos Gram negativos. Estos lípidos están compuestos por un anclaje de fosfatidilinositol, un núcleo de manano, un dominio de arabinano, y también casquetes de manooligosacárido en el caso de ManLAMs (Chatterjee y Khoo 1998). Los LAMs ejercen sus efectos sobre el sistema inmune en distintos modos. Por ejemplo, el LAM aislado a partir de micobacterias que crecían activamente, activaba células que expresaban un receptor 2 similar a Toll (TLR2) en una forma dependiente de TLR, pero el LAM aislado a partir de BCG no podía (Means y col. 1999). El LAM es un polímero hidrosoluble y, por lo tanto, no será un componente de los lípidos solubles en cloroformo utilizados en esta memoria (Nigou y col. 1997).

Otros lípidos de las micobacterias tienen actividad inmunomoduladora. El glicolípido fenólico 6,6-dimicolato de trehalosa (factor de cordón) es un componente activo en FCA capaz de promover una respuesta de tipo CTL específica del antígeno (Skinner y col. 2001), y moderar los títulos de anticuerpo cuando se inyecta con un antígeno (Koike y col. 1998). Esto contrasta con la presente invención en 1) los liposomas no se utilizaron, 2) los títulos de los anticuerpos no eran altos con el factor de cordón y 3) el factor de cordón estaba ausente de los lípidos utilizados en esta
invención.

Se ha observado que los glicolípidos fenólicos y los glicopeptidolípidos están sobre la superficie celular y son capaces de regular a la baja el sistema inmune del hospedador durante la infección (Ortalo-Magné y col. 1996). Esta regulación a la baja mediante los lípidos de la superficie, explica en parte, el éxito de los agentes patógenos micobacterianos para eludir la respuesta normal del hospedador a la invasión. Esto es de nuevo contrario y se aleja de las enseñanzas de la presente invención.

Aunque el documento de patente EP-A-0241376 describe liposomas preparados a partir de una mezcla de PIMs; y liposomas procedentes de los lípidos polares totales de M. bovis, se mencionan en el resumen del artículo de Sprott G. y col., "Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology", vol. 101, 2001, página 349 (XP008014632); y los liposomas preparados a partir de la mezcla de lípidos BCG de lípidos PIM_{1-5} + colesterol se describen en el resumen de Tenu Jean-Pierre y col., "Biochemical and Biophysical Research Communications" vol. 1.28, nº 1, 1995, páginas 295-301, estas descripciones no exponen la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones más adelante.

Sumario de la invención

Los liposomas se forman a temperaturas elevadas superiores a 55ºC, y preferiblemente 65ºC hasta 75ºC, a partir de la fracción lipídica total, soluble en cloroformo, del bacilo Calmette-Guérin (BCG) de Mycobacterium bovis, y de sus componentes lipídicos purificados. Los lípidos polares totales se separaron por cromatografía en capa fina, en ocho fracciones y se caracterizaron con reactivos reveladores pulverizados, específicos y espectrometría de masas. Células dendríticas expuestas a liposomas lipídicos polares totales de BCG, se activaron para excretar citocinas inflamatorias, mientras que los lípidos procedentes de fuentes comerciales eran relativamente inactivos. La célula dendrítica que activaba la secreción de IL-12, se localizó en los fosfatidilinositol manósidos con un residuo de manosa (PIM_{1} y PIM_{2}) y sus formas aciladas, y en nuevos fosfolípidos acilados de BCG que tenían unos picos de espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos en 899, 1139 y 1155 m/z. De hecho, la actividad era considerablemente más alta en estos liposomas lipídicos purificados procedentes de BCG, que en los liposomas lipídicos polares totales de BCG. En cambio, el fosfatidilinositol de BCG activaba las células dendríticas para secretar el factor de necrosis tumoral (TNF) (en ausencia de residuos de manosa) en cantidades más altas que los liposomas lipídicos polares totales de BCG. Esta estimulación dependía de la presencia de la cadena de acilo graso, ácido tuberculoesteárico, característica de los lípidos micobacterianos, ya que PI procedente de la soja no tenía efecto. El cardiolípido y la fosfatidiletanolamina formaban una porción principal de los lípidos polares totales de BCG, aún en forma purificada tenían actividades de activación bajas. Ratones inmunizados con un antígeno proteico atrapado en liposomas lipídicos polares totales de BCG, producían respuestas del MHC de clase I y de clase II. Pruebas similares con liposomas compuestos de los lípidos totales extraídos de otra bacteria Gram positiva, Bacillus firmus, o PC/PG/colesterol, revelaron que los liposomas de BCG tenían propiedades complementarias muy superiores. Una vacuna preparada a partir de los liposomas de BCG dio protección a los ratones después de una exposición a células tumorales.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un liposoma que comprende uno o varios lípidos obtenibles a partir de especies de micobacterias, y seleccionados entre el fosfatidilinositol (PI), el fosfatidilinositol manósido (PIM_{1}), el fosfatidilinositol dimanósido (PIM_{2}), las formas mono y dipalitoiladas de PIM_{1} y PIM_{2}, fosfolípidos acilados que tienen picos de espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos en 899, 1139 y 1155 m/z, fosfatidiletanolamina y cardiolípido, en donde dichos lípidos que se pueden obtener a partir de micobacterias son solubles en cloroformo y extraíbles.

Preferentemente las micobacterias son BCG de Mycobacterium bovis. El lípido soluble en cloroformo y extraíble puede ser PIM_{1,} PIM_{2}, palmitoil-PIM_{1}, palmitoil-PIM_{2} y preferentemente se puede obtener mediante extracción con etanol al 50%.

El liposoma puede comprender adicionalmente al menos otro lípido que puede ser fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, colesterol o una mezcla de los mismos.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición de vacuna a base de liposomas que comprende el liposoma del primer aspecto, en donde el liposoma contiene un antígeno asociado. La vacuna de liposoma también puede comprender un antígeno que puede ser una proteína.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para preparar un liposoma de acuerdo con el primer aspecto, comprendiendo dicho método secar un lípido soluble en cloroformo y que es extraíble a partir de Mycobacterium SPP e hidratar a continuación dicho lípido seco a una temperatura de 65º a 75ºC en agua o en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un liposoma de acuerdo con el primer aspecto, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune en un mamífero. Adicionalmente, hay otros aspectos de la presente invención que se refieren al uso de la composición de vacuna a base de liposomas mencionada anteriormente, para preparar un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico del cáncer o para preparar un medicamento para dirigir una respuesta inmune, para conferir protección contra un agente patógeno o un cáncer.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un espectro de la espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos (FAB MS) de los lípidos polares totales extraíbles con cloroformo, de BCG. Las señales se identifican como PI (fosfatidilinositol); PE (fosfatidiletanolamina); PIM_{1} (fosfatidilinositol monomanósido); PIM_{2} (fosfatidilinositol dimanósido); y el ion fragmento [PA] (ácido fosfatídico). Las designaciones se muestran en la figura para el número total de átomos de carbono en las cadenas de acilo graso de sn-1,2 glicerolípido: seguido por el número de insaturaciones.

La Figura 2 muestra la separación del lípido polar total de BCG en 8 fracciones lipídicas mediante cromatografía en capa fina. Las fracciones se numeraron del 1 al 8, de más polar a menos polar. Los lípidos (aplicados en la parte de abajo de la placa) son BCG (extraíble con cloroformo, lípidos polares totales), y PI, PS (fosfatidilserina), PG (fosfatidilglicerol) y PE (fosfatidiletanolamina) son patrones de referencia. Un disolvente ácido se empleó para revelar la placa. Los lípidos se localizan rociando con el reactivo de pulverización de fosfato de Zinzade, de modo que las manchas mostradas son todas de fosfolípidos.

La Figura 3 es un espectro de FAB MS de la fracción lipídica 1 que muestra que contiene PIM_{2} saturado y un lípido de m/z 899. Tal y como se muestra, ambos lípidos produjeron la fragmentación de PA típica para generar m/z 688+H, en donde la suma de los átomos de carbono en ambas cadenas sn-1,2 y su estado de saturación es C35:0. La estructura del lípido de 899 m/z ha mostrado que es un fosfato de fosfatidilglicerol (PGP) acilado con un resto de m/z 57.

La Figura 4 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 2 que muestra que contiene palmitoil-PIM_{2} saturado (Palm-PIM_{2}). Cantidades más pequeñas que se corresponden a aproximadamente 12% de PIM_{1} y palmitoil-PIM_{1}, también están presentes.

La Figura 5 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 3 que muestra que contiene PI puro y saturado. Aproximadamente el 80% de PI tiene cadenas C19:0 y C16:0 y la mayoría del PI restante tiene cadenas C19:0 y C15:0.

La Figura 6 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 4 que muestra que contiene dipalmitoil-PIM_{2} saturado con cadenas de glicerolípidos sn-1,2 C19:0 más C19:0 o C19:0 más C16:0. Algunos PI también se encuentran en esta fracción.

La Figura 7 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 5 que muestra que contiene palmitoil-PIM_{1} saturado, PI y aproximadamente 12% de palmitoil-PIM_{2}.

La Figura 8 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 6 que muestra que contiene los lípidos nuevos saturados de m/z 899,1, mostrados como acilo-PGPs (fosfato de acil-fosfatidilglicerol). En estos lípidos PGP el fosfato terminal está protonado, tal y como se indica en la estructura por una carga negativa, solamente en el fosfato más cercano a la cadena principal de glicerol. Una forma más larga de la cadena de acilo de 1139,2 m/z, se corresponde con la pérdida del grupo metilo (en el fosfato) en la estructura mostrada y la sustitución por una cadena de palmitoilo. Otra estructura relacionada es 16 veces más larga que 1139, indicando la hidroxilación de una de las tres cadenas de acilo.

La Figura 9 es un espectro FAB MS de la fracción lipídica 7 que muestra que consiste en los lípidos PE puros y saturados con diferentes longitudes de cadena.

La Figura 10 es un espectro FAB MS de la fracción 8 que muestra que consiste en un cardiolípido insaturado.

La Figura 11 es un espectro FAB MS de los lípidos polares totales, extraídos a partir de Bacillus firmus y define estos lípidos principalmente como fosfatidilgliceroles y cardiolípidos.

La Figura 12 muestra que en ratones inmunizados por vía subcutánea en la semana 0 y 3, con antígeno (OVA) atrapado en liposomas de BCG, se proporciona una protección contra la estimulación con células tumorales EG.7 (que expresan OVA). También se muestra que los liposomas de BCG exentos de antígeno ejercen un cierto efecto protector natural contra el crecimiento tumoral, visto como un retardo en la aparición de los tumores.

Descripción detallada de la invención

Los liposomas son vesículas esféricas cerradas, compuestas por una bicapa lipídica con grupos principales polares expuestos a la superficie interior y exterior y las cadenas lipídicas que forman la parte interior de la bicapa. Los fármacos o los antígenos hidrosolubles están unidos a la superficie o están atrapados en el espacio fluido dentro del liposoma, mientras que las moléculas hidrófobas tienden para asociarse con la capa lipídica.

En la presente invención los lípidos totales procedentes de células de BCG de nuevo aporte, se extraen con metanol/cloroformo/agua (2:1:0,8 v/v) a temperatura ambiente, y los lípidos polares extraíbles con cloroformo se separan de los lípidos neutros como la fracción insoluble en acetona fría. Hemos mostrado por primera vez que esta fracción lipídica polar y total, y los lípidos purificados a partir de la misma, tales como los PIMs y palmitoil-PIMs, formarán liposomas con la condición de que la temperatura sea suficientemente elevada y preferiblemente 65-75ºC. Los animales se pueden inmunizar entonces con liposomas de BCG, asociados con uno o varios antígenos protectores, para conferir protección contra agentes patógenos o el cáncer, cuando se requiere una respuesta inmune fuerte, o para la producción de títulos elevados de anticuerpo para fines de la investigación. La actividad complementaria no incluye sólo las respuestas Th2 mediadas por el MHC de clase II y el brazo del anticuerpo de la respuesta inmune, sino también respuestas de la clase I del MHC observables por la inducción de las respuestas de CTL y los linfocitos T CDS+ que secretan INF-gamma en el ensayo de Elispot y que muestran que una vacuna de liposoma de BCG puede proteger en un modelo de tumor de ratón. No hay informes previos que nosotros conozcamos que muestren la construcción del liposoma a partir de los lípidos de micobacterias, y específicamente a partir de los lípidos extraíbles polarmente, o informes de inmunomodulación con tales liposomas, evitando de este modo la necesidad de incluir aditivos adicionales en una vacuna a base de liposomas de BCG.

Ya que se requieren temperaturas superiores a los 55ºC para preparar los liposomas de forma eficaz a partir de los lípidos polares totales de BCG, o de sus componentes purificados, se entiende que a temperaturas inferiores, tales como las temperaturas corporales, las membranas del liposoma pasarían desde la fase cristalina líquida a la fase sólida. En la fase sólida las membranas serían menos permeables para el antígeno atrapado y se mejoraría la estabilidad de los liposomas, dando como resultado un vehículo mejorado para la vacuna. Además, algunos de los lípidos purificados de BCG, cuando se convierten en liposomas, tienen actividad inmunoestimuladora, lo que se muestra en esta memoria por la activación de las células dendríticas, el tipo de célula más potente para procesar y presentar el antígeno a los linfocitos T. Los lípidos activos están compuestos por una cadena principal de glicerol enlazada con cadenas sn-1,2 con acilo graso saturado C19:0 de ácido tuberculoesteárico (único en las micobacterias) y ácidos palmíticos C16:0, y un grupo principal de fosfoinositol en la posición sn-3 enlazado con 1 ó 2 residuos de azúcar manosa (PIM1, PIM2), a veces mono-o dipalmitoilados.

Estos lípidos activos se pueden obtener a partir de células de BCG que crecen fácilmente con alto rendimiento, o alternativamente, se puede apreciar que se pueden sintetizar químicamente, ya que sus estructuras son conocidas. Además, el ácido tuberculoesteárico encontrado en especies de Mycobacteria es una cadena de acilo graso totalmente saturada, de cadena larga y ramificada en metilo, y como tal se prevé que puede contribuir a la estabilidad del liposoma. De hecho, el único lípido de BCG que tiene insaturación es la fracción S de los cardiolípidos.

Materiales y métodos Fuente de bacterias y crecimiento

La cepa del Pasteur de Mycobacterium bovis (BCG) fue obtenida por el Dr. Robert North (Trudeau Institute, EE.UU.) y se dejó crecer de forma aerobia en frascos de agitación de 1 litro que contenían medio complejo convencional. Bacillus firmus se adquirió de la American Type Culture Collection (ATTC 14575) y se dejó crecer de forma aerobia en 8 g/l de caldo nutriente, 3 g/l de extracto de levadura (Difco Laboratories, Mich.), 1,5 g/l de urea y 1 g/l de bactopeptona a 30ºC.

Fuente de cultivos celulares

EL-4 y EG.7, un subclon de EL-4 transfectado de forma estable con el gen de OVA, fueron obtenidos en la ATTC, y se mantuvieron y se dejaron crecer tal y como se ha descrito anteriormente (Krishnan y col. 2000).

Extracción de lípidos

Brevemente, los extractos de lípidos totales se obtuvieron a partir de las pastas de células congeladas-descongeladas de B. firmus, o de las pastas de células de nuevo aporte de M. bovis, añadiendo una solución de una fase de metanol, cloroformo y agua (2:1:0,8 v/v) en una proporción de 15 g de peso de células secas/1. Después de 16 h, el residuo de las células se recogió por centrifugación y se extrajo dos veces más. Los extractos se reunieron y se hicieron bifásicos con la adición de cloroformo y de agua por el método de Bligh y Dyer, descrito previamente (Sprott y col. 1995). Los lípidos polares en la fase inferior de cloroformo se liberaron de los lípidos neutros por solubilidad diferencial en acetona fría (Sprott y col. 1995). Los lípidos polares, insolubles en acetona fría, se secaron y se disolvieron en el cloroformo como los lípidos polares totales extraíbles con cloroformo. Los lípidos polares totales de BCG disueltos en cloroformo, se filtraron empleando un filtro de jeringa de nilón de 0,45 \mum, para asegurar que no había un transporte de las células enteras en el extracto del lípido.

Preparación de liposomas

1) Liposomas de B. subtilis - aproximadamente 30 mg de los lípidos polares totales en cloroformo se secaron bajo una corriente de nitrógeno, y se hidrataron añadiendo 3,0 ml de agua exenta de pirógeno. Se permitió que la hidratación procediera durante 2-3 h a 35ºC, agitando con sacudidas antes de la adición de 10 mg de ovoalbúmina (OVA)/30 mg de lípido. Los diámetros promedio de las vesículas disminuyeron desde 80 hasta 100 nm en un baño ultrasónico. A continuación, las preparaciones se liofilizaron y se rehidrataron en la solución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato potásico 10 mM más NaCl 160 mM, pH 7,1). La OVA se eliminó por centrifugación y con tres lavados con PBS. Los sedimentos finales de liposoma se suspendieron de nuevo en PBS, y los liposomas se esterilizaron por filtración empleando filtros de una bomba de jeringa de 45 \mum (Millipore, MA). La OVA atrapada se cuantificó después de eliminar los lípidos mediante el método de Lowry y SDS para el revelado con color, tal y como se ha descrito anteriormente (Krishnan y col. 2000) y se determinaron los pesos secos. Desde el principio hasta el fin, se utilizó agua estéril exenta de pirógeno.

2) Lípidos comerciales -L-\alpha-dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), L-\alpha-dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), L-\alpha-fosfatidilinositol (soja, PI), cardiolípido (corazón bovino) y L-\alpha-dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) fueron adquiridos de Sigma. Los liposomas se prepararon tal y como se ha descrito para los lípidos polares totales de B. subtilis, a excepción de la omisión de OVA.

3) Liposomas de BCG - aproximadamente 30 mg de los lípidos polares totales en cloroformo se secaron bajo una corriente de nitrógeno, seguido de 1 h a vacío. La hidratación se realizó de forma rutinaria añadiendo 3 ml de agua exenta de pirógeno que contenía el antígeno (por ejemplo 10 mg de OVA) e incubando durante 2-3 h a 65ºC agitando con sacudidas. Para investigar el efecto de la temperatura sobre la formación de liposomas, se permitió que la hidratación tuviera lugar a 35ºC hasta 75ºC, en etapas de 10ºC. Los diámetros promedio de las vesículas disminuyeron entre 80-100 nm en un baño ultrasónico a 65ºC. A continuación, las preparaciones se liofilizaron y se rehidrataron en PBS a 65ºC. Los liposomas se dejaron durante una noche a 4ºC para reasociarse, después, toda la OVA no asociada con los liposomas se eliminó por ultracentrifugación y lavando los liposomas tres veces con PBS. Los sedimentos finales de liposoma se suspendieron de nuevo en PBS, y los liposomas se estirilizaron por filtración a través de un filtro de 0,45 \mum. La OVA atrapada se cuantificó después de eliminar los lípidos y se determinaron los pesos en seco, tal y como se ha descrito más arriba. Los diámetros promedio se midieron en un medidor de partículas con láser de 5 mW He/Ne (modelo 370 de Nicomp). Los liposomas de BCG se prepararon a partir de las fracciones lipídicas aisladas 1 a 8, por el método antedicho, a excepción de la fracción 7 de PE de BCG. Los liposomas de PE se prepararon incluyendo 80% molar de DMPC, ya que los lípidos de PE en general no forman liposomas en forma pura. Éste también era el caso de PE de BCG.

Análisis de los lípidos

Los extractos polares de lípidos se analizaron mediante espectrometría de masas con bombardeo rápido de átomos (FAB MS) con un instrumento JEOLJMS-AX 505H operado a 3 kV en modo de ion negativo. La pistola de xenón fue operada a 10 kV. Los rastreos controlados con corriente se adquirieron con una tasa de la escala completa de 10-s. Una mezcla de trietanolamina y de Kryptofix® (Sigma) se utilizó como matriz. La tinción de los grupos funcionales se realizó después de separar los lípidos polares sobre 60 placas de capa fina con gel de sílice de 0,25 mm (Merck) reveladas con un disolvente ácido de cloroformo/metanol/ácido acético/agua (85:22,5:10:4 v/v) o disolvente básico cloroformo/metanol/hidróxido amónico 7 N (60:35:8 v/v). Las manchas de lípido se caracterizaron usando vaporizaciones de fosfolípido (reactivo de Zinzade), glicolípido (\alpha-naftol), aminolípido (ninhidrina), y lípido total (reactivo de carbón del ácido sulfúrico), descritas en Kates (1986). Para el análisis del azúcar, primero se hidrolizaron los lípidos con ácido trifluoroacético 2 M, durante 2 h a 100ºC. A continuación, se añadió D-ribosa como un patrón interno, y se prepararon derivados de acetato de alditol para la identificación y la cuantificación mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC MS) (17). El contenido total en hidratos de carbono de cada extracto de lípidos, se determinó mediante la reacción de Anthrone usando D-glucosa como patrón.

Aislamiento y activación de las células dendríticas (DC)

Las células dendríticas obtenidas a partir de la médula ósea se prepararon tal y como se ha descrito anteriormente (Krishnan y col. 2001), y eran homogéneas >80% de CD11c^{+} por citometría de flujo. Brevemente, se inundó la médula ósea de los fémures y de las tibias de ratones C57BL/6, y se hicieron suspensiones de células individuales. Las células obtenidas se cultivaron (1 x 10^{6}/ml) en medio RMPI suplementado con suero bovino fetal al 8%, FBS (RS) y 5 ng/ml de GM-CSF de múrido recombinante (ID Lab, Londres, ON, Canadá) durante 6-8 días a 37ºC en CO_{2} al 8%. Las células no adherentes se eliminaron los días 2 y 4 del cultivo, y se añadió R8 de nuevo aporte más GM-CSF. Las células dendríticas se recolectaron los días 6-8 como células no adherentes. Las células dendríticas (10^{5}) se incubaron in vitro con diferentes concentraciones de arqueosomas exentos de antígeno o lipopolisacárido (LPS, E. coli, Sigma), por triplicado en placas de cultivo de tejidos con 96 pocillos, durante 72 h a 37ºC, al 8% de CO_{2}, en una atmósfera humidificada. A las 72 h, la activación de las células fue evaluada por medición de la absorción de MTT (bromuro de dimetiltioazol difeniltetrazolio) y el material sobrenadante se recogió y la IL-12 se sometió a ensayo mediante ELISA de tipo sándwich (Mosmann y Fong 1989). El TNF se sometió a ensayo con un bioensayo al que se hace referencia en Krishnan y col. 2001.

Inmunizaciones

Ratones hembra, C57BL/6, de 6-8 semanas de edad, fueron inmunizadas por vía subcutánea en la base de la cola, los días 0 y 21. Las inmunizaciones fueron con 15 \mug de OVA con y sin aditivo, o con OVA atrapada en liposomas preparados a partir de los lípidos polares totales, extraídos de BCG o de B. firmus. En algunos casos, FCA se incluyó en la primera inmunización y el aditivo incompleto de Freund (FIA) en la segunda, con un 62% de eficacia con 15 \mug de OVA en PBS.

Análisis de la respuesta humoral

El suero fue recogido a partir de la sangre obtenida de las venas de la cola de los ratones, y se analizó en busca de anticuerpos anti OVA. Los títulos de los anticuerpos se determinaron mediante ELISA indirecto específico del antígeno. Brevemente, placas de ELISA (placas de microtitulación EIA, fondo plano con 96 pocillos, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) se recubrieron con el antígeno en PBS (10 \mug/ml), y las diluciones en serie dobles del suero (de ratones individuales) se sometieron a ensayo por duplicado. La inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con HRP (IgG + IgM) que revelaba el anticuerpo (Caltag, San Francisco, CA) se utilizó para determinar los títulos de los anticuerpos totales del suero. Las reacciones se revelaron con el sistema de peroxidasa de micropocillo de ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithesburg, Maryland) y la absorbancia se determinó a 415 nm después de 15 min. Los títulos de los anticuerpos se representan como diluciones de punto final que exhiben una densidad óptica de 0,3 unidades sobre la señal de fondo.

Ensayos de CTL

Para los ensayos de CTL, se cultivaron 30 x 10^{6} células del bazo con 5 x 10^{5} células EG.7 irradiadas (10.000 rads) en 10 ml de RPMI más 8% de FBS que contenía 0,1 ng/ml de IL-2, en matraces para el cultivo de tejidos de 25 cm^{2} (Falcon), mantenidos verticales. Después de 5 días (37ºC, 8% de CO_{2}), las células recuperadas del matraz se utilizaron como efectoras en un ensayo patrón CTL con liberación de ^{51}Cr y se determinó el % de lisis específica contra las dianas EG.7 (Krishnan y col. 2001).

Ensayo de ELISPOT

La relación de células que secretaban IFN-\gamma se realizó mediante el ensayo ELISPOT (Vijh y Pamer, 1997). Brevemente, las células del bazo se incubaron en placas de ELISPOT recubiertas con el anticuerpo anti-IFN-\gamma, con diferentes cantidades (con una densidad celular final de 5 x 10^{5}/pocillo, usando células nodriza) en presencia de IL-2 (1 ng/ml) y medio RPMI u OVA_{257-264} (10 \mug/ml) durante 48 h a 37ºC, 8% de CO_{2}. Las placas se bloquearon posteriormente, se incubaron con el anticuerpo secundario biotinilado (4ºC, durante una noche), seguido por el conjugado de avidina-peroxidasa (temperatura ambiente durante 2 h). Las manchas fueron reveladas usando di-amino bencidina.

Modelo tumoral

Un modelo tumoral sólido de múrido se utilizó para determinar el potencial protector relativo de los linfocitos T CD8^{+} inducidos con liposomas TPL de BCG con OVA atrapada. Los ratones fueron inyectados dos veces los días 0 y 21 con OVA, 15 \mug/0, 1 ml inyectados por ratón, por vía subcutánea. Las células EG.7 (5 x 10^{6}) que expresaban OVA (en PBS más suero normal de ratón al 0,5%) fueron inyectadas con 0,1 ml en la región dorsal más inferior afeitada, 9 semanas después de la primera inyección. Desde el día 5 en adelante, se midieron los tumores sólidos detectables usando calibradores. El tamaño del tumor, expresado en mm^{2}, se obtuvo por la multiplicación de las mediciones diametralmente perpendiculares.

Resultados y discusión Extracción de lípido a partir de BCG

Los sedimentos celulares centrifugados de BCG de esta invención (10 g) se extrajeron a temperatura ambiente, agitando durante 24 h con 1 litro de Bligh y Dyer de una fase de metanol/cloroformo/agua (2:1:0,8, v/v). La mezcla se centrifugó a 10.500 x g durante 15 minutos y se separaron fracciones del sobrenadante y del sedimento. La fracción del sedimento se extrajo dos veces más que antes y se combinaron los tres materiales sobrenadantes. Después de almacenar a 4ºC, se forma un precipitado blanco turbio y se elimina centrifugando a 4.100 x g durante 15 min. Este material sobrenadante contiene la mayoría de los lípidos extraíbles con cloroformo. El pequeño sedimento eliminado se extrae otra vez con 1 fase y el material sobrenadante de esta extracción se combina con los lípidos extraíbles con cloroformo. Un volumen de cloroformo y agua, cada uno igual al volumen total de los lípidos extraíbles con cloroformo divididos entre 3,8, se añade para obtener un sistema bifásico en embudos de separación de vidrio. La fase de cloroformo más inferior que contiene los lípidos deseados se retira, y dos volúmenes de 200 ml de cloroformo se emplean para lavar la fase superior de metanol/agua. Estos lavados con cloroformo se combinan con la primera fase de cloroformo. También está combinado con las fases de cloroformo, el cloroformo recuperado por centrifugación de las emulsiones lechosas formadas en la interfaz de dos fases. Los lípidos polares totales se recuperan a partir de las fases de cloroformo concentradas por evaporación rápida, precipitando después de añadir 20 volúmenes de acetona helada. El sedimento obtenido se lava dos veces con acetona helada, disuelta en cloroformo, y finalmente se filtra a través de filtros de nilón de 0,45 \mum, para obtener los lípidos polares totales extraíbles con cloroformo (TPL). Los lípidos totales justifican aproximadamente 10,2% del peso de las células de partida de BCG, en donde el 65% son los lípidos polares totales y el 35% los lípidos solubles en acetona. Un espectro típico FAB MS de los lípidos polares totales se muestra en la figura 1. Los lípidos dominantes eran PE, PI, PIM_{1}, palmitoil-PIM_{1}, PIM_{2}, palmitoil-PIM_{2} y cardiolípido. Los aniones dominantes de carboxilato de ácido graso generados a partir de los lípidos polares durante el análisis MS son C16:0, C19:0 y C18:1. La señal de m/z 297,3 se corresponde con el ácido graso C19:0 de M. tuberculosis, 10-metiloctadecanoato, conocido como ácido tuberculoesteárico (Leopold y Fisher 1993). Un análisis del grupo principal muestra que la manosa es azúcar principal presente en una cantidad aproximadamente igual al inositol
(Tabla 1).

Una fracción lipídica soluble en etanol caliente se puede obtener a partir del sedimento celular anterior, ya extraído tres veces con una solución de Bligh y Dyer de 1 fase, dispersando en etanol al 50% y sometiendo a reflujo a 65ºC durante 8 h. La mezcla se centrifuga a 10.500 x g durante 20 minutos y el material sobrenadante se evapora rápidamente para eliminar el etanol. El líquido restante se extrae con una solución de Bligh y Dyer de 1 fase y se hace bifásica para recuperar los lípidos con etanol caliente en la fase de cloroformo. Los lípidos extraídos con etanol caliente eran similares a TPL en el contenido en manosa e inositol y representan la mitad aproximada de la manosa y del inositol recuperados en los lípidos TPL (Tabla 1). La cromatografía en capa fina y el FAB MS muestran los mismos lípidos que están presentes en TPL. Así, aunque solamente se utiliza en esta memoria el TPL extraíble con cloroformo, se aprecia que el rendimiento de TPL se puede incrementar combinando o reemplazando con una extracción con etanol caliente. También se puede apreciar que una extracción con etanol caliente se puede utilizar como alternativa al método de Bligh y Dyer para obtener esencialmente los mismos lípidos, usando un disolvente menos tóxico y menos costoso.

Purificación y caracterización de los lípidos TPL de BCG

La cromatografía en capa fina se utiliza para separar TPL en 8 fracciones, las cuales se tiñen todas positivamente con fosfato (Fig. 1). La fracción 4 tiene una movilidad similar al PI estándar y la fracción 7 se corresponde con un patrón de PE. Las reacciones de tinción definen además estas 8 fracciones lipídicas (Tabla 2). Los lípidos 1, 2, 4 y 5 son fosfoglicolípidos, 3, 6 y 7 son fosfolípidos, y 7 es un fosfoaminolípido.

Para purificar los componentes de TPL, TPL de BCG se aplica como una banda (6 mg/placa) y se separa de este modo en las 8 fracciones, localizando las bandas con vapor de yodo y recuperando los lípidos solubles en cloroformo a partir del adsorbente eliminado. Las bandas 3 y 4 se fusionan y se pueden recuperar juntas, después se separan y se recuperan usando otra placa de capa fina y un disolvente alcalino. La abundancia relativa de cada fracción recuperada 1 a 8, se muestra en la Tabla 2.

Las 8 fracciones lipídicas se definen estructuralmente por análisis FAB MS en las Figuras 3 a 10. La fracción 1 consiste en PIM_{2} y un lípido de 899,5 m/z. Ambos tienen cadenas C19:0 y C16:0, ya que solamente se observan estas dos cadenas como aniones de carboxilato (Figura 3). El lípido 899,5 m/z está claramente en una cantidad relativa baja, ya que no se observa en un espectro de TPL (Figura 1). Una estructura del lípido acilo-PGP que concuerda con el espectro anterior, se muestra en la Figura 3, en la que el grupo acilo debe tener 57 m/z (un acilo graso propiónico o un grupo butilo). En estas estructuras de lípidos de BCG, los restos de glicerol se muestran en forma de "varilla" y el ácido tuberculoesteárico es sn-1 basado en Gilleron y col. (2001).

La fracción lipídica 2 es sobre todo palmitoil-PIM_{2} con cadenas C19:0 y C16:0 (Figura 4), y la fracción 3 es PI puro (Figura 5). En el caso de PI, la mayoría de las moléculas tienen cadenas C19:0 y C16:0, teniendo el volumen del PI restante, cadenas C19:0 y C15:0. La fracción 4 es un fosfoglicolípido definido por FAB MS como dipalmitoil-PIM_{2} con diferentes formas de cadena sn-1,2 en el intervalo de C35:0 a C38:0 (Figura 6). El PI se detecta también en esta fracción. El palmitoil-PIM_{1} y el PI en una cantidad aproximadamente igual, comprenden la fracción 5 (Figura 7) una fracción de fosfoglicolípido con una abundancia de solamente el 3% en TPL de BCG (Tabla 2). La fracción 6 es un fosfolípido de 899,1 m/z (Figura 8) que comprende solamente 1,2% de TPL. El ion del fragmento de PA más dominante es 731,2 m/z, lo que indica un metil-PGP con cadenas sn-1,2 de ácido graso del ácido tuberculoesteárico. Sin embargo, otros aniones del fragmento PA, y señales del carboxilato de ácido graso, indican moléculas de PGP con otras cadenas sn-1,2 y restos de acilo sobre el fosfato terminal hasta el total de 899,1 m/z, la señal principal para el anión molecular. Claramente, la fracción 7 es PE puro con varias combinaciones de la cadena sn-1,2, sobre todo C18:0 más C16:0 (C34:0). Los iones del fragmento PA en 647,1 y 675,1 m/z confirman las asignaciones de PE y se corresponden con los fragmentos procedentes de C32:0 y C34:0, respectivamente. Finalmente, la movilidad de las placas de capa fina, la reacción de tinción, y FAB MS identifican la fracción 8 como un cardiolípido principalmente con cadenas C18:1 y C16:0 y una señal de anión molecular de 1403,2 m/z (Figura 10).

Formación del liposoma a partir de lípidos polares de BCG extraíbles con cloroformo

Contrario a lo esperado, de TPL de BCG (lípido polar total) no formaba liposomas a la temperatura normal de crecimiento de BCG de M. bovis, a saber 37ºC. Los lípidos TLP se secaron a partir del disolvente y los liposomas se vigilaron por microscopía de fase después de añadir agua, o tampón PBS, a 35, 45, 55, 65 y 75ºC. Los liposomas no se forman bien a 55ºC o inferior, dando como resultado acumulaciones de lípido, pero elevando la temperatura a 65 o a 75ºC se obtenía como resultado una formación espectacular, especialmente cuando se utilizaba agua para la hidratación. En esta invención entonces, el TPL de BCG extraíble con cloroformo se hidrata preferiblemente a 65ºC, en presencia de antígeno para formar liposomas multilamelares. Liposomas más pequeños se producen, si se desea, reduciendo el tamaño a preferiblemente 65ºC usando un baño ultrasónico. Otros métodos para reducir el tamaño se podrían utilizar si la temperatura es 65ºC. La sujeción del antígeno se puede mejorar por liofilización y rehidratación del polvo del liposoma en agua a 65ºC, seguido de PBS. A continuación, los liposomas se reasocian y se elimina cualquier antígeno no atrapado, tal y como se ha descrito en Materiales y Métodos. Los diámetros promedio eran
230 \pm 136 nm con cargas de OVA en 3 preparaciones, en el intervalo de 33 a 67 \mum/mg de peso seco de los liposomas. Los diámetros promedio de los liposomas de BCG preparados a partir de las fracciones lipídicas purificadas, se muestran en la Tabla 3. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden aplicar diferentes métodos descritos para la formación de liposomas, a estos lípidos de BCG, con la condición de que se tenga cuidado para conseguir la temperatura requerida, preferiblemente 65ºC.

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Activación de células dendríticas con liposomas TPL de BCG y liposomas preparados a partir de las fracciones lipídicas purificadas 1 a 8

Ya que las células dendríticas representan las células presentadoras de antígeno principales en mamíferos, son las células preferidas para el ensayo complementario in vitro. Las células dendríticas de la médula ósea se cultivaron con cero (sólo medio R8) hasta 10 \mug de peso seco de los liposomas/ml de medio R8. Los liposomas sometidos a ensayo se muestran en la Tabla 3 e incluyen varios preparados a partir de lípidos comerciales. Después 72 h, se cuantificó el número de células viables mediante el ensayo de MTT y las citocinas inflamatorias secretadas se sometieron a ensayo en el material sobrenadante del cultivo. Los liposomas a 10 \mug/ml que proporcionaban un MTT >25% sobre el medio R8 testigo, se limitaban a liposomas TPL de BCG, y las fracciones lipídicas purificadas de BCG 3 (PI) y 6. Todos los liposomas preparados a partir de lípidos no BCG; a saber, DMPC, DMPG, PI de la soja, DPPE + DMPC, y cardiolípido del cerebro, no tenían una actividad significativa, medida como la secreción de IL-12 en las células dendríticas. Sin embargo, las fracciones 1 y 2 de PIM, así como la fracción 6, inducían la secreción de IL-12 varias veces por encima de lo que inducían incluso los liposomas TPL de BCG (a 10 \mug/ml). Además, la inducción de la secreción de IL-12 requería la adición de por lo menos la complejidad de 1 unidad de manosa con PI de BCG, ya que el PI de BCG purificado (fracción 3) era relativamente inactivo en este respecto.

Otros resultados inesperados se observan en el caso de la inducción de la secreción de TNF (factor de necrosis tumoral) en las células dendríticas. Los liposomas TPL de BCG eran de nuevo activos. Sin embargo, al contrario de los efectos sobre la secreción de IL-12, la secreción de TNF tenía lugar con liposomas PI de BCG purificados, y no con otros liposomas lipídicos de BCG o con liposomas lipídicos comerciales, mostrando claramente que PI de BCG es el lípido activo en TPL de BCG, lo que explica la actividad secretora de TNF. El hecho de que PI procedente de soja (sin cadenas de ácido tuberculoesteárico) fuera inactivo, mientras que el PI de BCG era muy activo señala unánimemente hacia el ácido tuberculoesteárico (C19:0) como diferencia estructural clave para explicar los PIs activos frente a los PIs inactivos. Claramente, los lípidos en TPL de BCG tienen efectos biológicos muy diferentes sobre la activación y la secreción de citocinas en las células dendríticas y, por lo tanto, sobre el tipo de respuesta inmune obtenida. A modo de aclaración, el preparar los liposomas usando diferentes combinaciones de lípidos polares de BCG es indicado como mecanismo para dirigir el tipo de respuesta inmune obtenida hacia un antígeno atrapado.

Las fosfatidiletanolaminas (PEs) se conocen en general como lípidos fusogénicos, capaces de promover la fusión de membranas, y representan aproximadamente el 25% de los lípidos en TPL de BCG (Tabla 2). Para preparar una reacción inmune de CTLs, primero es necesario suministrar antígeno al citosol de las células presentadoras de antígeno. A esto sigue que la inclusión de este lípido en un liposoma con el antígeno atrapado, puede ayudar a dirigir la respuesta inmune para la presentación de la clase I del MHC del antígeno y organizar una respuesta de
CTL.

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Respuesta inmune en ratones

En un primer ejemplo, la actividad complementaria de los liposomas de BCG se compara con otros sistemas complementarios diversos. En uno de éstos, están incluidos los liposomas TPL procedentes de otra bacteria Gram positiva. La bacteria escogida era Bacillus firmus, basándose en la observación de que inyecciones de estos lípidos en ratones, 5 días antes de la infección con Listeria monocytogenes, daba como resultado cierta protección a corto plazo (Mára y col. 1992), probablemente activando el sistema inmune innato. Los lípidos TPL de esta bacteria, extraídos por el método de Bligh y Dyer y recogidos como lípidos insolubles en acetona, se caracterizan mediante FAB MS (Figura 11). En el caso de los extractos lipídicos polares de B. firmus, las señales m/z para el anión molecular de cada lípido fueron asignadas a un grupo de lípidos de PG con cadenas de acilo graso sn-1,2 completamente saturadas, que consistían en 25 a 33 átomos de carbono (suma de ambas cadenas) (Fig. 3). Estas asignaciones concuerdan con el m/z de los aniones carboxilato generados a partir de las glicerocadenas de acilo graso durante el análisis, que estaban en el intervalo de C13:0 a C17:0. También, las señales se encontraron en el cardiolípido y las regiones de LPG (lisofosfatidilglicerol) del espectro. Un análisis de los aminoácidos confirmó la presencia de pequeñas cantidades de lisina en hidrolizados del extracto lipídico polar de B. firmus, indicando la posibilidad de LPG y/o de lisilcardiolípidos (Fisher y Leopold 1999).

La Tabla 4 representa un primer ejemplo de una respuesta inmune mejorada de los linfocitos T citotóxicos (CTL) obtenida en un animal, frente a un antígeno atrapado en liposomas de BCG. Los liposomas de BCG sirvieron para promover una respuesta inmune frente al antígeno atrapado, que era similar al BCG recombinante vivo, y superior al aditivo de Freund. Además, el TPL de otra bacteria Gram positiva, también con glicerolípidos saturados, formaba liposomas con propiedades inferiores a los liposomas de BCG, apartándose del resultado positivo con los liposomas de BCG.

La Tabla 5 describe la actividad complementaria humoral de los liposomas de BCG frente a la proteína atrapada. Primero, la inyección de cantidades equivalentes de liposomas de BCG y OVA, no produjeron actividad complementaria, mientras que el atrapamiento daba como resultado una actividad complementaria humoral comparable a la del aditivo alumbre. El aditivo tóxico FCA era superior en potencia y en mantener el título de anticuerpos durante períodos más largos después de la vacunación. El BCG recombinante vivo que expresaba OVA in vivo producía CTL, tal y como se esperaba (Dudani y col., 2002), pero no una respuesta de los anticuerpos. Finalmente, los liposomas que contenían lípidos que no eran BCG dieron títulos de anticuerpo muy bajos que mejoraron cuando se incorporaron lípidos de BCG en cantidades crecientes desde 10 hasta 50%.

El efecto de cargar liposomas de BCG con diferentes cantidades de antígeno por mg de liposomas, parece no ser significativo desde el intervalo de 15 \mug de antígeno cargado en 0,22 a 1,8 mg (peso seco) de liposomas. Esto se muestra en la Tabla 6 para la respuesta de linfocitos T CD8^{+} restringida a la clase I del MHC. En A) se muestran los resultados de ensayos de CTL y en B) las cantidades de linfocitos T precursores de la secreción de IFN-gamma en los bazos de los ratones inmunizados de manera diversa, que reconocen específicamente al antígeno en la vacunación original. Ambos ensayos muestran una buena actividad complementaria, pero ninguna diferencia basada en la carga de la vacuna dentro de este intervalo.

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Liposomas de BCG cargados con antígeno como vacunas protectoras

A los ratones a los que se daba una gran cantidad de células tumorales EG.7, desarrollan tumores sólidos que crecen rápidamente, que alcanzan >250 mm^{2} en los 5 ratones en el grupo sin tratamiento previo, en un plazo de 12 días (Figura 12). Las inyecciones de liposomas de BCG sin antígeno daban como resultado una ligera disminución del crecimiento tumoral, en donde solamente 2 ratones de los 5, desarrollaron tumores > 250 mm^{2}, después de 12 días. Además, se observa un retardo claro en el comienzo del crecimiento tumoral. Una protección más considerable se observó en los ratones inmunizados con la vacuna de liposoma de BCG y OVA, en donde todos los ratones tenían tumores <250 mm^{2} después de 12 días y permanecieron así durante la duración del estudio (para 4 ratones
de 5).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Porcentaje relativo de la abundancia de grupos principales de inositol y de manosa en los en los lípidos polares totales de BCG (TPL) y en los lípidos extraídos con etanol caliente

1

TABLA 2 Cromatografía en capa fina de los lípidos polares totales extraíbles con cloroformo a partir de células de BCG en 8 fracciones

2

TABLA 3 Activación de las células dendríticas de la médula espinal mediante liposomas de BCG exentos de antígeno

4

5

TABLA 4 Comparación de la actividad de los CTL en cultivos celulares esplénicos procedentes de ratones inmunizados con OVA en diferentes sistemas complementarios

6

7

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TABLA 5 Comparación de los títulos de anticuerpos anti-OVA en los sueros de ratones inmunizados con OVA en diferentes sistemas complementarios

8

TABLA 6 Efecto de la carga del antígeno en liposomas de BCG sobre la inducción de una respuesta inmune en ratones

9

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Claims (27)

1. Un liposoma que comprende uno o varios lípidos obtenibles a partir de una especie de micobacteria, y que se seleccionan entre el fosfatidilinositol (PI), el fosfatidilinositol manósido (PIM_{1}), el fosfatidilinositol dimanósido (PIM_{2}), las formas mono y dipalmitoiladas de PIM_{1} y PIM_{2}, fosfolípidos acilados que tienen picos de espectrometría de masas con bombardeo de átomos rápidos en 899, 1139 y 1155 m/z, la fosfatidiletanolamina y el cardiolípido, en donde dichos lípidos que se pueden obtener a partir de una micobacteria, son solubles en cloroformo y extraíbles con el mismo.

2. Un liposoma de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la especie de micobacteria es Mycobacterium bovis BCG.

3. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el lípido soluble en cloroformo y extraíble con el mismo es PIM_{1}.

4. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el lípido soluble en cloroformo y extraíble con el mismo es PIM_{2}.

5. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el lípido soluble en cloroformo y extraíble con el mismo es palmitoil-PIM_{1}.

6. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el lípido soluble en cloroformo y extraíble con el mismo es palmitoil-PIM_{2}.

7. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el lípido polar soluble en cloroformo y extraíble con el mismo se puede obtener mediante extracción con etanol caliente al 50%.

8. Un liposoma de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende el lípido fosfatidiletanolamina.

9. Un liposoma de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende adicionalmente otro lípido, en donde el otro lípido es fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, colesterol o una mezcla de cualquiera de ellos.

10. Una composición de vacuna con liposoma que comprende un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el liposoma contiene un antígeno asociado.

11. Una composición de vacuna con liposoma de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el antígeno es una proteína.

12. Un método para preparar un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, cuyo método comprende secar el lípido soluble en cloroformo y extraíble con el mismo procedente de Mycobacterium SPP y a continuación hidratar dicho lípido seco a una temperatura de 65 a 75ºC en agua o en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha temperatura es 65ºC.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho liposoma resultante de dicho método es multilamelar.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende adicionalmente reducir el tamaño de un liposoma multilamelar a una temperatura de 65ºC para obtener un liposoma unilamelar.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde un antígeno está atrapado en dicho liposoma multilamelar mediante la inclusión de dicho antígeno en dicha agua o dicha solución salina tamponada con fosfato.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde un antígeno está atrapado en dicho liposoma unilamelar mediante la inclusión de dicho antígeno en dicha agua o dicha solución salina tamponada con fosfato.

18. Uso de un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la preparación de un medicamento para estimular una respuesta inmune en un mamífero.

19. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la estimulación de la respuesta inmune en un mamífero se consigue activando las células dendríticas en donde la activación produce la secreción de interleucina-12 (IL-12) a través de dichas células dendríticas.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la estimulación de la respuesta inmune en un mamífero se consigue activando las células dendríticas en donde la activación produce la secreción del factor de necrosis tumoral (TNF) a través de dichas células dendríticas.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la estimulación de la respuesta inmune en un mamífero se consigue activando las células dendríticas en donde la activación produce la secreción de interleucina 12 (IL-12) y el factor de necrosis tumoral (TNF) a través de dichas células dendríticas.

22. El uso de un liposoma de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde dicho liposoma comprende adicionalmente un antígeno.

23. Uso de una composición de vacuna con liposoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, para preparar un medicamento para producir una respuesta inmune en un mamífero.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el liposoma sirve a la vez como vehículo para el antígeno y como estimulador de una respuesta inmune.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la respuesta inmune es una respuesta de un anticuerpo específica del antígeno y una respuesta de linfocitos T citotóxicos específica del antígeno.

26. Uso de una composición de vacuna con liposoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, para preparar un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico del cáncer.

27. Uso de una composición de vacuna con liposoma de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, para preparar un medicamento para dirigir una respuesta inmune de manera que confiera una protección contra un agente patógeno o un cáncer.