ES2347574T3

ES2347574T3 - Compuestos de arn de doble hebra especificos de vglut.

Info

Publication number: ES2347574T3
Application number: ES05707623T
Authority: ES
Inventors: Clemens Gillen; Gregor Bahrenberg; Thomas Christoph; Eberhard Weihe; K.-H. Martin Schafer; Florian Bender
Original assignee: Gruenenthal GmbH; Chemie Gruenenthal GmbH
Current assignee: Gruenenthal GmbH
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2010-11-02
Anticipated expiration: 2025-02-24
Also published as: US20070117771A1; WO2005090571A1; DE102004011687A1; DE502005009757D1; EP1723234A1; EP1723234B1; PL1723234T3; ATE471375T1

Abstract

Moléculas de ARNsi específicas de VGLUT con una secuencia seleccionada entre **Fórmula**

Description

La invención se refiere a moléculas de ARN de doble hebra (ARNds) pequeñas, en particular a moléculas desencadenantes de interferencia dirigidas contra miembros de la familia de los VGLUT, y a células huésped que contienen el ARNds según la invención. Los ARNds según la invención y las células huésped correspondientes son adecuados como medicamentos o para la producción de medicamentos, en particular para el tratamiento del dolor y de otros estados patológicos relacionados con miembros de la familia de los VGLUT o con la expresión no fisiológica de éstos.

De acuerdo con la definición de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (IASP), el dolor es una “experiencia sensorial y emocional desagradable, asociada con una lesión aguda o potencial de un tejido o descrita en términos de este tipo de lesiones” (Wall y Melzack, 1999). El organismo reacciona frente a un estímulo doloroso (nociceptivo) con una reacción compleja en la que intervienen componentes discriminadores sensoriales, cognitivos, afectivos, autónomos y motores. Mientras que el dolor agudo constituye una reacción protectora fisiológica y tiene una importancia vital para la supervivencia del individuo, el dolor crónico no tiene ninguna función biológica clara. El dolor nociceptivo se desencadena a través de estímulos nóxicos, como calor, estimulación mecánica, protones o frío, en órganos sensoriales de umbral alto especializados, los nociceptores, y es transmitido en forma de actividad eléctrica al asta posterior de la médula espinal a través de fibras C no mielinizadas o fibras A poco mielinizadas. Para ello, los nociceptores están dotados de receptores específicos y canales de iones (Scholz y Woolf, 2002).

El tejido herido o lesionado, las inflamaciones o las células tumorales pueden ser señales para los nociceptores, conduciendo a la liberación de mediadores químicos de células inflamatorias, vasos sanguíneos y terminales aferentes, que bien producen por sí mismos una activación de los nociceptores (por ejemplo a través de la bradiquinina), bien modifican el comportamiento estímulo-respuesta de las fibras nerviosas aferentes, por ejemplo mediante la reducción del umbral de activación (por ejemplo a través de prostaglandinas, interleuquinas, NGF), provocando así una sensibilización de los nociceptores (Scholz y Woolf, 2002).

La intensidad del dolor viene determinada por la cantidad de impulsos por unidad de tiempo. En caso de una estimulación nociceptiva periférica, los componentes de respuesta sináptica rápida (5 - 20 mseg) y las respuestas reflejas monosinápticas están mediados principalmente por los receptores de AMPA y cainato, mientras que los receptores de NMDA y de glutamato metabotrópicos intervienen de forma especial en los componentes de respuesta tardíos más persistentes (20 - 150 mseg) y con mediación polisináptica (Tölle, 1997).

La liberación de glutamato en el asta posterior de la médula espinal desempeña un papel decisivo en el origen de dolores crónicos (Baranauskas y Nitri, 1998; Zhuo, 2001). La liberación de glutamato conduce a la activación de los receptores de glutamato (AMPA, cainato, mGlu-R, NMDA). Por consiguiente, las proteínas que intervienen en la liberación de glutamato son un objetivo interesante para la investigación del dolor.

El glutamato es uno de los neurotransmisores excitatorios más importantes del sistema nervioso de los vertebrados. El aminoácido no esencial glutamato no puede superar la barrera hematoencefálica y, por ello, se sintetiza en el cerebro a partir de glucosa y muchos otros precursores.

La enzima glutaminasa activada por fosfato (PAG) cataliza la formación de glutamato en las terminaciones nerviosas excitatorias a partir de glutamina. El transportador vesicular de glutamato (VGLUT) empaqueta el glutamato en vesículas y, después de la llegada de un potencial de acción despolarizadora por la afluencia de calcio, libera el glutamato de las vesículas en la fisura sináptica. Desde la fisura sináptica, el glutamato es transportado en parte a través de un transportador de membrana plasmática para aminoácidos excitatorios (EAATs) de vuelta a los terminales excitatorios, donde de nuevo es empaquetado en vesículas.

Por consiguiente, en el transporte de glutamato intervienen proteínas transportadoras de 2 superfamilias: transportadores de membrana plasmática y el transportador vesicular de membrana (Disbrow y col., 1982; Shioi y col., 1989; Tabb y col., 1992).

Se han identificado tres transportadores vesiculares de glutamato, el VGLUT1 (SLC17A6), el VGLUT2 (SLC17A7) y el VGLUT3 (SLC17A8) como miembros de la familia de los transportadores SLC-17 (transportadores vesiculares de glutamato/fosfato de tipo I), que median en el transporte de aniones orgánicos y que en primer lugar se identificaron como transportadores de fosfato dependientes de Na+). El VGLUT1, el VGLUT2 y el VGLUT3 se denominan en conjunto como VGLUT. Las proteínas de la familia SLV17 consisten en proteínas transmembrana de varios intervalos con 6 a 12 dominios transmembrana hipotéticos, apareciendo los tres transportadores de glutamato arriba mencionados como subfamlia de la familia SLC17. Las secuencias de aminoácidos de los tres VGLUT arriba mencionados presentan una altísima homología entre sí (Takamori y col., 2002). La secuencia de ADNc del VGLUT2 humano se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso de banco de genes NM_020346. La secuencia de aminoácidos del VGLUT2 humano se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso NP_065079. La secuencia de ADNc del VGLUT2 de rata se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso NM_053427. La secuencia de aminoácidos de VGLUT2 de rata se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso NP_445879. La secuencia de ADNc del VGLUT2 de ratón se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso BC038375. La secuencia de aminoácidos de VGLUT2 de ratón se encuentra en los bancos de datos bajo el número de acceso AAH38375.

Las capas corticales del cerebro presentan un fuerte nivel de expresión de ARNm de VGLUT1, mientras que el ARNm de VGLUT2 se puede detectar principalmente en la capa IV de la corteza. La expresión de VGLUT3 se localiza, por ejemplo, en las células inhibidoras en la capa II de la corteza parietal o en las interneuronas GAD-positivas del estrato radiado de CA1-CA3 del hipocampo. Además, VGLUT1 y VGLUT2 sólo se han podido detectar en las terminaciones nerviosas, mientras que VGLUT3 no sólo se ha detectado en las vesículas sinápticas, sino también en estructuras vesiculares de astrocitos y dendritas neuronales (Fremeau y col., 2002).

El VGLUT1 y el VGLUT2 se expresan en dos poblaciones independientes en el ganglio espinal, presentando una tercera subpoblación una coexpresión de VGLUT1 y VGLUT2. El ARNm de VGLUT2 es expresado principalmente por neuronas DRG pequeñas y medianas. En cambio, el ARNm de VGLUT1 es expresado principalmente por neuronas DRG medianas y grandes (ganglio de la raíz dorsal). Esporádicamente también se encuentran neuronas que expresan ARNm de VGLUT3 en el ganglio espinal (Oliveira y col., 2003; Tood y col., 2003).

Tanto el VGLUT1 como el VGLUT2 se pueden detectar a nivel proteínico en la sustancia gris de la médula espinal (Varoqui y col., 2002). La dominancia del VGLUT2 en el asta posterior superficial indica un papel destacado en la transmisión del dolor. La dominancia de VGLUT1 en el asta posterior profunda indica un papel en la propiocepción. Por consiguiente, principalmente el VGLUT2, pero también el VGLUT1, constituyen un objetivo para la investigación del dolor (Varoqui y col., 2002).

El tratamiento eficaz del dolor es uno de los grandes retos de la medicina molecular. El dolor agudo y transitorio es una importante señal del cuerpo para preservar a las personas contra daños graves producidos por el entorno o por sobrecarga del cuerpo. En cambio, el dolor crónico, que dura más que la causa del dolor y que el tiempo previsible de curación, no tiene ninguna función biológica conocida y afecta a cientos de millones de personas en todo el mundo. Sólo en Alemania, alrededor de 7,5 millones de personas padecen dolor crónico. Por desgracia, el tratamiento farmacológico del dolor crónico todavía es insatisfactorio y, en consecuencia, sigue siendo un reto para la investigación médica actual. A menudo, los analgésicos existentes en la actualidad no son suficientemente eficaces y, en parte, tienen graves efectos secundarios.

Debido a su función y su perfil de expresión, las proteínas de VGLUT en general y de VGLUT2 en especial constituyen un punto de partida interesante como objetivo para nuevos medicamentos contra el dolor (Varoqui y col., 2002).

De la investigación analgésica ya se conocen por ejemplo algunas sustancias que pueden modular la actividad o la expresión de los VGLUT (Carrigan y col., 2002; Roseth y col., 1995; Roseth y col., 1998). Sin embargo, dichas sustancias no actúan de forma específica sobre el subtipo y las aplicaciones terapéuticas están limitadas tanto por la disponibilidad de los inhibidores del sistema nervioso y de las vesículas sinápticas, como por la acción no específica en los tres VGLUT.

El objetivo de la invención consiste en proponer otras sustancias que puedan modular de forma selectiva y eficaz el efecto de los VGLUT, esto es por ejemplo VGLUT1, VGLUT2 y VGLUT3, y que en caso dado tengan permeabilidad celular. El objetivo de la presente invención también incluye la utilización de estas sustancias para fines terapéuticos, en particular para el tratamiento del dolor.

El objetivo arriba mencionado se resuelve mediante los objetos de la presente invención caracterizados en las reivindicaciones. De acuerdo con la invención, para resolver este objetivo se proponen ARNds específicos de VGLUT capaces de provocar el fenómeno de la interferencia de ARN.

La invención se refiere a moléculas de ARNsi específicas de VGLUT con una secuencia seleccionada entre

imagen1

La estructura general consiste en un ARN de doble cadena con una

10 macromolécula formada por ribonucleótidos, consistiendo el ribonucleótido en una pentosa (ribosa), una base orgánica y un fosfato. En este contexto, las bases orgánicas del ARN son las bases púricas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidínicas citosina (C) y uracilo (U). El ARNds contiene nucleótidos con una estructura dirigida con salientes. Los ARN de doble cadena de este tipo

15 según la invención pueden provocar el fenómeno de la interferencia de ARN (ARNsi).

El fenómeno de la interferencia de ARN como sistema de defensa inmunológico se observó en el curso de la investigación inmunológica con eucariotas superiores.

En un primer momento, el sistema se describió en diferentes especies independientes entre sí, primero en C. elegans (Fire y col., 1998), antes de poder identificar que los mecanismos básicos en determinados planos de los procesos son idénticos: la resistencia a virus mediada por ARN en plantas (Lindbo y Dougherty, 1992), el PTGS (posttranscriptional gene silencing) en plantas (Napoli y col., 1990) y la interferencia de ARN en eucariotas se basan, en consecuencia, en un funcionamiento común (Plasterk, 2002).

La técnica in vitro de la interferencia de ARN (ARNi) se basa en moléculas de ARN de doble hebra (ARNds) que provocan la supresión específica de la secuencia de expresión genética (Zamore (2001), Nat. Strict. Biol. 9: 746-750; Sharp (2001), Genes Dev. 5:485-490; Hannon (2002), Nature

41: 244-251). La activación de la proteína quinasa R y RNAsa L provocó efectos no específicos en la transfección de células de mamífero con ARNds largos, por ejemplo una respuesta de interferón (Stark y col. (1998), Annu. Rev. Biochem.

67: 227-264; He y Katze (2002), Viral Immunol. 15: 95-119). Estos efectos no específicos se evitan con la utilización de los denominados ARNds más cortos, por ejemplo de 21 a 23 pb (en inglés “small interfering RNA”), ya que los ARNds más cortos de 30 pb no provocan efectos no específicos (Elbashir y col. (2001), Nature 411: 494-498). Recientemente también se han utilizado ARNds in vivo (McCaffrey y col. (2002), Nature 418: 38-39; Xla y col. (2002), Nature Biotech.

20: 1006-1010; Brummelkamp y col. (2002), Cancer Cell 2: 243-247).

En el marco de la presente invención se dan a conocer ARNds (moléculas de ARN-si) dirigidos contra miembros determinados de la familia de los VGLUT. De acuerdo con la invención, estos ARNds consisten en las secuencias arriba definidas. El ARNds se puede encontrar (i) en forma de un ARNsi, (ii) en forma de un ARNds largo, que incluye uno o más ARNsi idénticos

o diferentes en la secuencia del ARNds largo, (iii) en forma de un ARN de horquilla basado en ARNsi o (iv) en forma de un ARNsi de horquilla basado en un ARNmi.

Mientras que el ARNsi (i) (típicamente obtenido por síntesis química y después incorporado intracelularmente en el complejo RISC eludiendo el paso “dicing”, con lo que comienza una degradación de ARNm específico de secuencia (de la secuencia diana)) se describe a continuación, el caso (ii), es decir, un ARNds largo (ds doble hebra), consiste en un precursor del ARNsi (según (i)), que primero se procesa mediante un paso “dicing” (enzima: Dicer) para obtener ARNsi maduro. Este precursor de ARNsi, que típicamente primero se transforma intracelularmente en ARNsi maduro, también cumple las condiciones para ser utilizado por ejemplo como medicamento o para la producción de un medicamento para el tratamiento de las indicaciones mencionadas en la presente solicitud.

Por consiguiente, a partir de moléculas de ARNds de VGLUT mayores, en particular moléculas de ARNds específicas de VGLUT-1, -2 o -3 (preferentemente > 30 pb, de forma especialmente preferente < 40 pb y en particular > 50 pb), después del procesamiento se obtienen diversos ARNsi distintos que pueden presentar diferentes eficacias. Las moléculas de ARNds largas (en caso dado en forma de horquilla), que se transforman intracelularmente en diferentes ARNsi después del procesamiento con Dicer, también se pueden expresar en una célula (sin tener en cuenta la síntesis química) en base a vectores y bajo el control de un promotor Pol II. El promotor Pol II permite aquí una expresión específica inducible de un tipo de tejido o de célula (Kennerdell y Carthew, 2000). Por consiguiente, esta forma de aplicación posibilita una expresión simultánea inducible y transitoria de una gran cantidad de ARNsi procedentes de un ARNds precursor.

Las moléculas de ARNds de este tipo pueden dar lugar a un fenotipo determinado mediante técnicas de manipulación genética, como recombinación homóloga de células madre.

También se pueden utilizar modificaciones de ARNsi según (i), es decir bucles en horquilla basados en ARNsi (iii). Este tipo de horquillas puede aparecer preferentemente en uno de los extremos de la doble cadena de ARNsi, pero en caso dado también puede aparecer en los dos extremos. En este caso se trata típicamente de al menos 5, preferentemente al menos 8 y de forma especialmente preferente al menos 10 nucleótidos que, debido a modificaciones y/o a una falta de complementariedad correspondiente, no forman ninguna cadena doble, sino que forman un bucle que al principio une las dos cadenas entre sí de forma covalente. Los ARN de horquilla de este tipo basados en ARNsi se pueden procesar, por ejemplo intracelularmente, con las enzimas correspondientes (por ejemplo Dicer) para obtener un ARNsi activo. Por último, también son posibles ARN de horquilla basados en ARNmi (iv) dirigidos contra secuencias de la familia de los VGLUT.

En este caso se trata de ARNsi no perfectamente complementario, preferiblemente con al menos una horquilla en el extremo (en los extremos).

Estas dobles cadenas de ARNm no perfectamente complementarias presentan al menos un emparejamiento erróneo, preferentemente entre 1 y 4 emparejamientos erróneos en la cadena doble. El efecto del ARN de horquilla basado en ARNmi se basa en su procesamiento enzimático (por ejemplo mediante Dicer) para obtener ARNmi, la incorporación subsiguiente de éste en RNPmi y finalmente la inhibición de su traducción.

Las longitudes correspondientes de las cadenas dobles según las formas de realización (i), (iii) y (iv) no se diferencian entre sí y todas las formas de realización se pueden sintetizar químicamente.

Para la preparación de un ARNm en una célula eucariótica, el gen se transcribe en toda su longitud, tanto intrones como exones, en una molécula de ARN larga, el transcripto primario. La estabilidad del ARNm celular se asegura mediante el procesamiento del transcripto primario en el extremo 5’ mediante la adición de un nucleótido atípico con una guanina metilada y una poliadenilación en el extremo 3’. Antes de que el ARN abandone el núcleo celular, las secuencias intrónicas se eliminan mediante empalme de ARN y los exones se unen entre sí.

Las secuencias diana para el ARNds según la invención pueden consistir tanto en el transcripto primario como en el ARNm procesado. En lo sucesivo, el transcripto primario y el ARNm se designarán colectivamente como ARN(m).

Las moléculas de ARN-si según la invención están dirigidas contra regiones definidas en el área de codificación del ARN(m) de un miembro de la familia de los VGLUT.

Por ello, los ARNsi (de doble hebra) según la invención presentan en su extremo al menos una cadena de secuencia TT, preferentemente en posición saliente con respecto al extremo de la otra cadena complementaria. La otra cadena complementaria del ARNsi según la invención se corresponde en su secuencia en un extremo típicamente con las secuencias detrás de AA arriba mencionadas a modo de ejemplo (sustituyendo T con respecto a las secuencias diana arriba indicadas por U en el ARNsi según la invención), y en el otro extremo presenta típicamente un TT saliente (véase también el ejemplo de realización 4).

No obstante, el bloqueo y la disociación efectivos del ARN(m) de un miembro de la familia de los VGLUT preferiblemente se logra teniendo en cuenta determinadas reglas de selección para elegir la secuencia diana de los ARNds según la invención.

Los ARNds según la invención presentan un contenido en GC de al menos un 30%, en particular del 30% al 70% y en especial del 40% al 60%.

5 Preferiblemente, los extremos del ARN de doble hebra (ARNds) se pueden modificar para impedir una degradación en la célula o una disociación en cadenas simples, en particular para evitar una degradación prematura por nucleasas.

Se produce la disociación de las cadenas simples del ARNds,

10 normalmente no deseada, especialmente cuando se utilizan concentraciones bajas o longitudes de cadena cortas. Para lograr una inhibición especialmente eficaz de la disociación, la cohesión de la estructura de doble cadena de los ARNds según la invención, causada por los pares de nucleótidos, se puede incrementar mediante al menos una y preferentemente 2 a 5 uniones químicas.

15 Un ARNds según la invención cuya disociación ha sido reducida presenta una mayor estabilidad frente a la degradación enzimática y química en la célula o en el organismo o ex vivo.

La unión química de las cadenas individuales de un ARNds según la invención se forma convenientemente mediante un enlace covalente o iónico, un 20 puente de hidrógeno, una interacción hidrófoba, preferentemente interacciones de van der Waals o interacciones de apilamiento, o mediante coordinación con iones metálicos. De acuerdo con una característica de configuración especialmente ventajosa, la unión química se puede establecer en al menos uno de los extremos, preferiblemente en los dos extremos. También se ha 25 comprobado que resulta ventajoso que la unión química se forme mediante uno

o más grupos de unión, consistiendo los grupos de unión preferentemente en cadenas poli-(oxifosfinicooxi-1,3-propanodiol) y/o polietilenglicol. La unión química también se puede conseguir utilizando análogos de purina en la estructura de doble hebra en lugar de purinas. También resulta ventajoso que la

30 unión química se forme mediante la introducción de unidades de azabenceno en la estructura de doble hebra. También se puede conseguir utilizando análogos de nucleótidos ramificados en la estructura de cadena doble en lugar de nucleótidos.

Se ha comprobado que resulta conveniente utilizar al menos uno de los 35 siguientes grupos para la formación de la unión química: azul de metilo; grupos bifuncionales, preferentemente bis-(2-cloroetil)amina; N-acetil-N’-(pglioxibenzoil)cistamina; 4-tiouracilo; psoraleno. La unión química también se puede conseguir disponiendo grupos tiofosforilo en los extremos del área de doble hebra. Preferentemente, la unión química se forma en los extremos del área de doble hebra mediante enlaces de triple hélice. La unión química se puede inducir convenientemente mediante luz ultravioleta.

La modificación de los nucleótidos del ARNds conduce a una desactivación de una proteína quinasa dependiente de ARN (de doble cadena) (“RNA-dependent”) (PKR) en la célula. La PKR induce la apoptosis. Ventajosamente, al menos un grupo 2’-hidroxilo de los nucleótidos de los ARNds de la estructura de doble hebra se ha sustituido por un grupo químico, preferentemente un grupo 2’-amino o un grupo 2’-metilo. Al menos un nucleótido de al menos una cadena de la estructura de doble hebra también puede consistir en un, así llamado, “loked nucleotide” con un anillo de azúcar, preferiblemente modificado de forma química mediante un puente de 2’-O, 4’-Cmetileno. Ventajosamente varios nucleótidos consisten en “loked nucleotides”.

Las modificaciones de los nucleótidos del ARNds según la invención se refieren en particular a la disociación de los nucleótidos mediante refuerzo del enlace por puente de hidrógeno. De este modo se aumenta la estabilidad de los nucleótidos y éstos se protegen frente a un ataque por ARNasas.

Otra posibilidad para evitar una disociación prematura del ARNds según la invención en la célula se basa en la configuración del bucle de horquilla. En una forma de realización especial, un ARNds según la invención presenta una estructura de horquilla para retardar la cinética de disociación. En una estructura de este tipo preferentemente se configura una estructura de bucle en el extremo 5’ y/o en el extremo 3’. Una estructura de bucle de este tipo no presenta ningún puente de hidrógeno.

También se puede evitar una degradación prematura mediante la modificación del esqueleto del ARNds según la invención. Especialmente se trata de un ARNds modificado (por ejemplo fosfotioato, 2’-O-metil-ARN, LNA, LNA/GAP-meros de ADN) de modo que presenta una vida media in vivo más larga.

Un ARNds según la invención está dirigido contra los ARN(m) de la familia VGLUT2, en particular de mamíferos, como humano, mono, rata, perro, gato, ratón, conejo, cobaya, hámster, vaca, cerdo, oveja y cabra.

Preferentemente, una molécula de ARN-si según la invención inhibe la expresión de VGLUT2 en la célula al menos en un 50%, 60%, 70%, de forma especialmente preferente en al menos un 90%.

La medida de la inhibición puede realizarse mediante Northern-Blot, PCR cuantitativa en tiempo real o a nivel proteínico con anticuerpos específicos de VGLUT2.

El ARNds se prepara mediante procedimientos conocidos por los especialistas. En este contexto se sintetizan nucleótidos, en particular también oligonucleótidos, por ejemplo según la síntesis de Merryfield, en un soporte insoluble (H.G. Gassen y col., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Editorial Chemie, Weinheim 1982)) o de otro modo (Beyer/Walter; Lehrbuch der Organischen Chemie, 20 edición, (Editorial S. Hirzel, Stuttgart 1984), pp. 816 y siguientes). La obtención del ARNm de VGLUT se puede llevar a cabo por hibridación mediante bancos de datos genómicos y de ADNc. Las moléculas de ARNds según la invención, en particular las moléculas de ARNsi, se pueden preparar por ejemplo sintéticamente y en caso dado también se pueden adquirir de diferentes proveedores, por ejemplo IBA GmbH (Göttingen, Alemania).

El ARN de doble hebra (ARNds) según la invención puede estar incluido en estructuras micelares que influyen en la separación de grupos de sustancias in vitro e in vivo. En este caso, el ARNds está presente preferentemente en liposomas. Los liposomas consisten en membranas artificiales esféricas cerradas formadas por fosfolípidos en las que se pueden encapsular sustancias hidrófilas en el espacio interior acuoso e incorporar sustancias lipófilas en el espacio interior de la membrana lipídica. La condición previa para la utilización de liposomas para fines experimentales o terapéuticos consiste en su compatibilidad con las células y tejidos. El ARNds, que preferentemente está presente en los liposomas, puede estar modificado con una secuencia peptídica, preferentemente con una secuencia rica en lisina y arginina, por ejemplo una secuencia de la proteína TAT viral (que por ejemplo contiene AS 49-57), para después superar más fácilmente la membrana celular como péptido transportador.

El ARNds también puede estar incluido en cápsides virales naturales o en cápsides artificiales producidas por métodos químicos o enzimáticos o en estructuras derivadas de éstas. Las características arriba indicadas permiten la introducción del ARNds en células diana predeterminadas.

Una configuración de los ARNds de VGLUT alternativa al ARNsi consiste en microARN (véase más arriba) con al menos un bucle de horquilla que une de forma covalente las dos cadenas no perfectamente complementarias (ARN de horquilla basado en ARNmi) (véase también Schwarz y col., 2002). Estos ARNmi de VGLUT son transcritos por las propias células y, después de una unión específica de secuencia con el ARNm, no conducen a una degradación del ARNm, sino que únicamente inducen una inhibición de la traducción. Los ARNmi de VGLUT según la invención se transcriben como precursores con una longitud de al menos 50, preferentemente entre 60 y 80, de forma especialmente preferente entre 65 y 75 nucleótidos, y constituyen una “estructura de horquilla” característica. La enzima Dicer recorta en la célula de estos precursores un área de doble hebra con una longitud de 21 a 23 nucleótidos, que se separa en otros pasos. Esto permite por ejemplo incorporar el ARNmi maduro en una partícula de RNPmi. Estas partículas pueden mediar entonces en la inhibición de la traducción específica del ARNm complementario. El grado de complementariedad con respecto al ARNm diana determina si el ADN dúplex formado actúa como ARNmi o como ARNsi.

De acuerdo con la invención, numerosos sistemas vectoriales posibilitan la utilización de ARNmi para una transcripción posterior estable y regulada de los ARNsi de VGLUT correspondientes. La transcripción de los ARNmi puede estar controlada por promotores de polimerasa III (por ejemplo promotores H1 o U6) y también promotores de polimerasa II (Brummelkamp y col., 2002; Lee y col., 2002; Miyagishi y Taira, 2002). En este contexto, las cadenas sentido y antisentido pueden ser leídas por diferentes promotores y se pueden condensar en la célula formando duplicaciones de 19-nt con salientes 4-nt (B) (Lee y col., 2002), o se utiliza la expresión de estructuras de horquilla (Brummelkamp y col., 2002).

Preferentemente, para estos sistemas de vectores se utilizan vectores virales, por ejemplo vectores retrovirales o vectores derivados de adenovirus. Los vectores virales tienen una transducción muy eficiente y selectiva de células específicas, incluyendo células primarias, y con ello posibilitan un espectro de aplicación más amplio, por ejemplo en la terapia del dolor.

De acuerdo con otra configuración especialmente ventajosa está previsto que el ARNds esté unido, asociado o rodeado por una proteína de envoltura viral procedente de un virus, derivada de éste o preparada sintéticamente. La proteína de envoltura se puede derivar de poliomavirus. Por consiguiente, se puede tratar por ejemplo de la proteína viral 1 (VP1) y/o la proteína viral 2 (VP2) de poliomavirus. La utilización de proteínas de envoltura de este tipo se da a conocer por ejemplo en el documento DE 19618797 A1. Las características arriba indicadas facilitan considerablemente la incorporación de los ARNds en la célula.

En una forma de realización preferente, la expresión de los ARNds según la invención tiene lugar estando el 1er molde (ARNds sentido) y el 2º molde (ARNds antisentido) bajo el control de dos promotores idénticos o diferentes. La expresión tiene lugar in vivo y se introduce en las células por terapia genética a través de vectores.

Otro objeto de la presente invención consiste en un medicamento que contiene al menos un ARNds según la invención y/o una célula que incluye dicho ARNds, y en caso dado también sustancias auxiliares y/o aditivos adecuados.

Medicamento: Sustancia correspondiente a la definición dada en el Artículo 1§2 de la Ley Reguladora del Tráfico de Medicamentos (AMG) alemana. Es decir, sustancias o preparados de sustancias concebidos para ser utilizados en el cuerpo humano o animal con el fin de

1.: curar, mitigar, prevenir o reconocer enfermedades, dolencias, daños corporales o molestias patológicas;

2.: permitir reconocer la condición, el estado o las funciones del cuerpo o estados anímicos;

3.: sustituir principios activos o fluidos generados por el cuerpo humano;

4.: rechazar, eliminar o hacer inocuos los agentes patógenos, parásitos o sustancias exógenas; o

5.: influir en la condición, el estado o las funciones del cuerpo o estados anímicos.

Los medicamentos según la invención se pueden administrar como medicamentos líquidos en forma de soluciones para inyección, gotas o jugos, como medicamentos semisólidos en forma de granulados, tabletas, pellets, parches, cápsulas, apósitos o aerosoles y, además de al menos uno de los objetos de la invención, dependiendo de la forma galénica, también puede contener en caso dado materiales vehículo, sustancias de carga, disolventes, diluyentes, colorantes y/o aglutinantes. La selección de los materiales auxiliares y de la cantidad a utilizaR de los mismos depende de la forma de administración del medicamento, es decir, por vía oral, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intranasal, bucal, rectal o local, por ejemplo sobre infecciones en la piel, las mucosas y los ojos. Para la administración oral son adecuados los preparados en forma de tabletas, grageas, cápsulas, granulados, gotas, jugos y jarabes, y para la administración parenteral, tópica y por inhalación son adecuadas las soluciones, suspensiones, preparados secos de fácil reconstitución y los aerosoles. Los objetos de la invención en un depósito, en forma disuelta o en un apósito, dado el caso añadiendo agentes promotores de la penetración en la piel, son preparados adecuados para la administración percutánea. Los preparados a utilizar por vía oral o percutánea pueden liberar los objetos de la invención de forma retardada. La cantidad de principio activo a administrar a los pacientes varía en función del peso del paciente, del tipo de administración, de la indicación y del grado de la enfermedad. Normalmente se administran de 2 a 500 mg/kg de peso corporal de al menos un objeto de la invención. Si el medicamento se ha de utilizar principalmente para la terapia genética, como sustancias auxiliares o aditivos adecuados son recomendables, por ejemplo, soluciones fisiológicas salinas, estabilizadores, inhibidores de proteasa, inhibidores de ADNasa, etc.

Otro objeto de la presente invención se refiere a células huésped, excepto gametos humanos y células madre embrionarias humanas, que se transforman con al menos una molécula de ARNsi según la invención. Las moléculas de ARNds según la invención se pueden introducir en la célula huésped correspondiente a través de los métodos habituales, por ejemplo transformación, transfección, transducción, electroporación o pistola genética. En el caso de la transformación, se introducen en la célula al menos dos moléculas de ARNsi diferentes entre sí, siendo una cadena de cada molécula de ARNsi complementaria al menos por secciones al ARN(m) de un miembro de la familia VGLUT2. El área del ARNds complementaria al ARN(m) de VGLUT2 contiene menos de 25 pares de nucleótidos sucesivos.

Como células huésped entran en consideración todas las células procarióticas o eucarióticas, por ejemplo bacterianas, hongos, levaduras, células vegetales o animales. Algunas células huésped preferentes son células bacterianas como Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus o Pseudomonas, microorganismos eucarióticos como Aspergillus o Saccharomyces cerevisiae o las levaduras de panadería usuales (Stinchcomb y col. (1997) Nature 282: 39).

Sin embargo, en una forma de realización preferente, para la transformación mediante constructos de ARNds según la invención se eligen células de organismos multicelulares. En principio, como célula huésped se puede utilizar cualquier cultivo celular eucariótico superior, aunque son especialmente preferentes las células de mamíferos, por ejemplo de simio, rata, hámster, ratón o humanas. Los especialistas conocen numerosas líneas celulares establecidas. En una relación, que de ningún modo es definitiva, se mencionan las siguientes líneas celulares: 293T (línea celular renal embrionaria) (Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59 (1997), BHK (células renales de hámster recién nacido), CHO (células de ovarios de hámster, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Accad. Sci. EE. UU. 77: 4216, (1980)), HeLa (células de carcinoma humano) y otras líneas celulares establecidas, en particular para uso en laboratorio, por ejemplo células HEK293, SF9 o COS, wt-PC12 y cultivos primarios de DRG. De forma totalmente preferente se emplean células humanas, en particular células madre neuronales y células de la “vía del dolor”, preferentemente neuronas sensoriales primarias. Algunas células humanas, en particular células autólogas de un paciente, después de la transformación (sobre todo ex vivo) con moléculas de ARNds según la invención son adecuadas de forma totalmente preferente como medicamentos, por ejemplo para fines de terapia genética, es decir, después de realizar una extracción de células, en caso dado una expansión ex vivo, transformación, selección y finalmente retrasplante en el paciente.

Otro objeto preferente consiste también en la utilización de al menos una molécula de ARNsi o un preparado farmacéutico según la invención y/o una célula según la invención para producir un medicamento o analgésico para el tratamiento del dolor, en particular del dolor crónico, alodinia táctil, dolor provocado térmicamente y/o dolor inflamatorio.

Los objetos según la invención son adecuados como medicamentos, por ejemplo para la inhibición de la nocicepción, por ejemplo mediante la reducción de la expresión de al menos un miembro de la familia VGLUT2 mediante las moléculas de ARNsi según la invención.

Además se da a conocer la utilización de al menos una molécula de ARNsi según la invención y/o una célula según la invención para producir un medicamento para el tratamiento de la incontinencia urinaria, síntomas neurógenos de la vejiga, prurito, tumores, inflamaciones, en particular inflamaciones asociadas con VGLUT con síntomas como asma, y también de todos los síntomas patológicos relacionados con los miembros de la familia de los VGLUT.

Otro objeto de la invención consiste en un procedimiento para el tratamiento, en particular para el tratamiento del dolor, en un humano o un mamífero no humano que requiera un tratamiento contra el dolor, en particular dolor crónico, mediante la administración de un medicamento según la invención, en particular un medicamento que contiene una molécula de ARNsi según la invención. Otro objeto también consiste en los procedimientos correspondientes para el tratamiento del prurito y/o la incontinencia urinaria.

Otro objeto preferente consiste igualmente en la utilización de al menos una molécula de ARNsi según la invención, en particular ARNsi, y/o una célula según la invención para la terapia genética, preferentemente para la terapia genética in vivo o in vitro.

Otro objeto preferente consiste igualmente en la utilización de al menos una molécula de ARNsi según la invención y/o de una célula según la invención para la terapia genética, preferentemente para la terapia genética in vivo o in vitro. Por el concepto “terapia genética” se entiende una forma de terapia en la que, mediante la introducción de ácidos nucleicos en las células, se expresa por ejemplo un gen efector, en la mayoría de los casos una proteína, es decir, en el presente caso en particular el ARNds según la invención.

En principio se distingue entre procedimientos in vivo y procedimientos in vitro. En el caso de los procedimientos in vitro, se retiran células del organismo y se someten a transfección con vectores ex vivo para, a continuación, introducirlas de nuevo en el mismo organismo o en un organismo diferente. En la terapia genética in vivo se administran vectores, por ejemplo para luchar contra tumores, de forma sistémica (por ejemplo a través de la vía sanguínea) o directamente en el tumor. De acuerdo con una forma de realización preferente, se administra un vector que mantiene tanto el elemento de transcripción para el ARNds sentido como el elemento de transcripción para el ARNds antisentido bajo el control de los promotores adecuados. De acuerdo con otra forma de realización preferente, los dos elementos de transcripción se pueden encontrar en vectores diferentes.

Otro objeto preferente consiste en un sistema de diagnóstico que contiene al menos un ARNds y/o una célula según la invención, y en caso dado también aditivos adecuados. El concepto “sistema de diagnóstico” significa aquí un compuesto o un procedimiento que puede ser utilizado para diagnosticar una enfermedad.

También se describe un procedimiento para identificar sustancias moduladoras del dolor. En un paso de procedimiento (a), preferentemente previo, se lleva a cabo una sobreexpresión de VGLUT, preferentemente de VGLUT1, VGLUT2 o VGLUT3, en una célula de ensayo. Esta sobreexpresión en una célula de ensayo asegura una concentración elevada de VGLUT en estas células de ensayo manipuladas y utilizadas para la investigación posterior, lo que permite determinar con más precisión el grado de eficacia de las sustancias potencialmente moduladoras del dolor por ampliación de escala. No obstante, para el procedimiento también se pueden utilizar en principio células que no han sido manipuladas de este modo, pero que expresan VGLUT de forma nativa.

Las células de ensayo preferentemente cultivables, obtenidas en caso dado mediante la ejecución previa del paso de procedimiento (a), se someten a los pasos de procedimiento (b) y (b’) (en particular paralelos), es decir: (b) una manipulación preferentemente por ingeniería genética de al menos una célula (célula de ensayo) con al menos un ARNds según la invención, y (b’) un ensayo comparativo (ensayo control) (en particular paralelo) con al menos una célula idéntica (célula de control). Dependiendo de los conocimientos que se deseen obtener, este ensayo comparativo de acuerdo con el paso de procedimiento (b’) puede perseguir diferentes objetivos. Por ello, se pueden concebir diferentes formas de configuración. Por ejemplo, el ensayo comparativo se puede llevar a cabo con células de ensayo que, a diferencia del paso de procedimiento (b), se utilizan sin ningún tipo de manipulación por ingeniería genética con ARNds. No obstante, alternativamente las células de control también pueden presentar un ARNds modificado, por ejemplo no correspondiente a la invención, o haber sido manipuladas con un ARNds determinado de efecto conocido en la expresión de VGLUT. Por último, en caso dado también se puede prescindir del paso de procedimiento (b’). En un paso de procedimiento (c) se lleva a cabo la incubación de las células de ensayo que expresan VGLUT y, de acuerdo con el paso de procedimiento (b), también presentan la sustancia a ensayar, bajo condiciones adecuadas. Típicamente, la incubación de las células de ensayo del paso de procedimiento (b) y la incubación de las células de control de acuerdo con el paso de procedimiento (b’) se llevan a cabo en paralelo.

A continuación, en un paso de procedimiento (d) se mide por ejemplo la unión de la sustancia de ensayo con el ARN(m) de VGLUT sintetizado por las células, preferiblemente bajo condiciones adecuadas. Para ello puede ser necesaria por ejemplo una preparación de las células de ensayo manipuladas con la sustancia de ensayo. Sin embargo es preferible medir al menos un parámetro funcional modificado por la unión de la sustancia de ensayo, típicamente ARNds, por ejemplo con el ARN(m) de VGLUT. Este parámetro modificado puede consistir, por ejemplo, en un fenotipo cuantificable de la célula incubada, que se produce por la unión de la sustancia de ensayo con el ARN(m) de VGLUT, por ejemplo debido a la inhibición de la proteína de VGLUT causada por dicha unión. La medición también puede tener lugar, por ejemplo, mediante métodos de inmunofluorescencia, con los que se determina la concentración de VGLUT en las células diana. No obstante, el VGLUT sobreexpresado en la célula de ensayo mediante el paso de procedimiento (a) puede estar configurado (adicionalmente) en caso dado con una función indicadora. De este modo se podría medir directamente en la célula por ejemplo una propiedad de fluorescencia (o en caso dado su inhibición por la adición de una sustancia de ensayo positiva) vinculada con el VGLUT sobreexpresado mediante un constructo genético correspondiente. Después, en un paso de procedimiento (e) tiene lugar la identificación de las sustancias potencialmente moduladoras del dolor, por ejemplo según la magnitud de la diferencia entre el valor de medición de la célula de ensayo y el valor de medición de la célula de control.

El ARNds introducido por transfección en las células de ensayo en forma de manipulación por ingeniería genética de acuerdo con el paso de procedimiento (b) o (b’), como sustancia típica de un procedimiento de este tipo, también se puede introducir por transfección a través de cualquier otro método alternativo. Por ejemplo, la adición puede tener lugar de forma exógena en las células de ensayo, en caso dado junto con otras medidas químicas o físicas conocidas en el estado actual de la técnica, para asegurar la absorción del ARNds en las células, por ejemplo por electroporación, etc. Si las sustancias de ensayo de ARNds aplicadas exógenamente a las células de ensayo no pueden atravesar como tales la membrana celular, su capacidad para atravesar la membrana celular se puede aumentar también mediante las formulaciones correspondientes, por ejemplo en liposomas o mediante el acoplamiento a reforzadores conocidos por su penetración de membrana, por ejemplo polímeros correspondientes, o reactivos de transfección.

En este contexto, el concepto “modulador del dolor” se refiere a una influencia reguladora potencial del dolor fisiológico, en particular a un efecto analgésico. El término “sustancia” incluye cualquier compuesto adecuado como principio activo medicinal, por consiguiente particularmente principios activos de bajo peso molecular, pero también otros como ácidos nucleicos, grasas, azúcares, péptidos o proteínas como anticuerpos. Por “incubación bajo condiciones adecuadas” se ha de entender aquí que la sustancia a examinar puede reaccionar con la célula o con el preparado correspondiente en un medio acuoso durante un tiempo determinado antes de la medición. La temperatura del medio acuoso se puede regular, por ejemplo entre 4ºC y 40ºC, preferentemente a temperatura ambiente o a 37ºC. El tiempo de incubación puede variar de unos segundos a varias horas, dependiendo de la interacción de la sustancia con la proteína. No obstante son preferentes tiempos de incubación de 1 minuto a 60 minutos. El medio acuoso puede contener sales y/o sistemas tampón adecuados, de modo que durante la incubación el medio presente un pH por ejemplo entre 6 y 8, preferentemente un pH 7,0 - 7,5. También se pueden añadir al medio otras sustancias adecuadas, como coenzimas, nutrientes, etc. Los especialistas pueden determinar fácilmente las condiciones adecuadas en función de la interacción examinada de la sustancia con la proteína basándose en su experiencia, en la literatura o en ensayos preliminares sencillos, con el fin de obtener el valor de medida lo más claro posible en el procedimiento. Una célula que ha sintetizado una proteína es una célula que ya ha expresado esta proteína de forma endógena o una célula que ha sido modificada por ingeniería genética de tal modo que expresa dicha proteína y correspondientemente contiene la proteína desde el comienzo del procedimiento descrito. Las células pueden ser células de líneas celulares dado el caso inmortalizadas o células nativas procedentes de tejidos y aisladas de éstos, estando la agrupación celular disuelta en la mayoría de los casos. El preparado de estas células incluye principalmente materiales homogeneizados de las células, el citosol, una fracción de membrana de las células con fragmentos de membrana, una suspensión de orgánulos celulares aislados, etc.

La escala por la cual el procedimiento permite hallar sustancias de interés consiste bien en la unión con la proteína, que se puede comprobar por ejemplo mediante desplazamiento de un ligando conocido o mediante la proporción de sustancia unida, bien en la modificación de un parámetro funcional por la interacción de la sustancia con la proteína. Esta interacción puede consistir principalmente en una regulación, inhibición y/o activación de receptores, canales de iones y/o enzimas. Los parámetros funcionales modificados pueden ser, por ejemplo, la expresión genética, el medio iónico, el pH o el potencial de membrana, o la variación de la actividad enzimática o de la concentración del 2º mensajero. En este contexto se han de tener en cuenta los siguientes significados:

-Manipulado por ingeniería genética: Manipulación de células, tejidos u organismos de tal modo que se introduce material genético en los mismos.

-Expresado de forma endógena: Expresión de una proteína que presenta una línea celular bajo condiciones de cultivo adecuadas, sin que dicha expresión de la proteína correspondiente haya sido inducida mediante manipulación por ingeniería genética.

En otra forma de realización de este procedimiento está previsto que la célula sea manipulada por ingeniería genética antes de los pasos de procedimiento (b) y (b’).

En otra forma de realización de este procedimiento está previsto que la manipulación por ingeniería genética permita la medida de al menos uno de los parámetros funcionales modificados por la sustancia de ensayo.

En otra forma de realización de este procedimiento está previsto que, mediante la manipulación por ingeniería genética, se exprese una forma de un miembro de la familia VGLUT2 que no es expresada de forma endógena en la célula, o se introduzca un gen indicador.

En otra forma de realización de este procedimiento está previsto que la medición de la unión tenga lugar a través del desplazamiento de un ligando marcado conocido de un miembro de la familia VGLUT2.

En otra forma de realización de este procedimiento está previsto que entre los pasos de procedimiento paralelos (b) y (b’) y el paso de procedimiento

(c) transcurran  8 h, preferentemente  12 h, en particular  24 h.

La introducción de los objetos según la invención en la célula puede tener lugar del modo arriba descrito.

La presente invención se explica más detalladamente mediante las siguientes figuras.

Las figuras muestran:

Figura 1: estrategias para la técnica de interferencia de ARN. Las

5 duplicaciones de ARNsi sintéticas se pueden transfectar directamente en las células, donde inducen la degradación de ARNm diana a través de la maquinaria de ARNi celular. Por otra parte, en el núcleo celular se forman ARNsi codificados por vector en forma de precursores en forma de horquilla, que se procesan en

10 el citoplasma de Dicer, para obtener ARNsi.

Figura 2ª: ARNsi producidos in vitro. En principio existen varias posibilidades para aprovechar de la técnica de ARNi: existe la posibilidad de utilizar ARNsi sintetizado químicamente (véase la figura 2A) o la posibilidad de emplear métodos de biología molecular (por ejemplo

15 figura 2B).

(A) el ARNsi sintetizado químicamente evita el paso “dicing”, se incorpora en el RISC y conduce a una degradación de ARNm específico de secuencia. (B) El ARNds largo se procesa mediante Dicer para obtener ARNsi activos. (C) El ARN de horquilla dúplex 20 se puede procesar mediante Dicer para obtener ARNsi activos. (D) El ARN de horquilla dúplex incompleto se procesa mediante Dicer para obtener ARNmi, que se incorporan en RNPmi y conducen a una inhibición de la traducción. Las moléculas de ARNds largas (B) transfectadas en las células se procesan para obtener moléculas 25 de ARNsi cortas, de 19 a 21 pb, que conducen a la degradación de las secuencias de ARNm complementarias. Los 21-meros de cadena simple sintetizables químicamente imitan los ARNsi hallados in vivo y, después de una formación de dúplex, se utilizan para efectos de ARNi relativamente cortos y transitorios in vitro e in 30 vivo (Elbashir y col., 2001a; Holen y col., 2002; Yu y col., 2002). De este modo se describen cuatro formas de realización de ARNds según la invención contra miembros de la familia de los VGLUT. Otra posibilidad consiste en los plásmidos que expresan ARNds (en particular ARNsi) según la invención (figura 2b), es decir

35 fragmentos cortos de ARN generados in vivo: (A) Un ARN de

horquilla largo expresado por ARN polimerasa II conduce, después de un procesamiento con Dicer, a varios ARNsi con las más diversas especificidades de secuencia. (B) Los promotores tándem Pol III provocan la expresión de cadenas sentido y antisentido individuales, que se condensan en la célula formando ARNsi activos. (C) Un promotor Pol III individual provoca la expresión de un ARN(sh) de horquilla corto, que se procesa mediante Dicer para obtener ARNsi activo. Con ayuda de promotores de ARN polimerasa III, como U6 o H1, es posible expresar intracelularmente ARNds y después moléculas de ARNsi y, de este modo, establecer sistemas de ARNi estables en células de mamífero (Brummelkamp y col., 2002; Lee y col., 2002; Miyagashi y Taira, 2002). En este contexto se pueden leer las cadenas sentido y antisentido de diferentes promotores y condensar en la célula formando duplicaciones de 19-nt con salientes de 4-nt, o se recurre a la expresión de estructuras de horquilla. En ambos casos se logra una supresión efectiva y estable de la expresión genética mediante el proceso de ARNi mediado por RISC. Aunque el menor tamaño de un transcripto que puede ser expresado por el promotor Pol III no es al principio contraproducente para la tecnología de ARNsi, sí limita la cantidad de ARNsi diferentes que pueden ser formados por un producto de transcripción (Myslinski, 2001).

Figura 3: producción de modelos de ADN para la síntesis de ARNsi.

Figura 4: transcripción e hibridación de los ARNsi.

Figura 5: ADNc de VGLUT1 con secuencia diana ARNsi; número de acceso del banco de genes U07609. Colores: codón de iniciación (amarillo), ARNsi si-rVGLUT1 739-759 EGT (rojo), cebador rVGLUT1(2_4)F (gris claro), cebador rVGLUT1(2_4)R (gris oscuro).

Figura 6: ADNc de VGLUT2 con secuencias diana ARNsi; número de acceso del banco de genes NM_053427. Colores: codón de iniciación (amarillo), ARNsi si-rVGLUT2 100-120 EGT (rojo), ARNsi sirVGLUT2 100-120 AMB (verde), ARNsi si-rVGLUT2 166-186 AMB (azul), cebador rVGLUT2(8_9)F (gris claro), cebador rVGLUT1(8_9)R (gris oscuro).

Figura 7: ADNc de VGLUT3 con secuencia diana ARNsi; número de acceso del banco de genes AJ491795. Colores: codón de iniciación (amarillo), ARNsi si-rVGLUT3 220-240 EGT (rojo), cebador rVGLUT3(4_5)F (gris claro), cebador rVGLUT3(4_5)R (gris oscuro).

Figura 8: transfección de células PC12 MR-A con ARNsi marcado con Cy3. El ARNsi marcado con Cy3 (100 pmol) se sometió a transfección mediante LF2000 (1 µl) en células de la línea celular PC12 MR-A (B). En el caso del control (A) se prescindió del LF2000. Las células se fijaron 24 horas después de la transfección y los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI.

Figura 9: tasa de transfección en cultivos primarios de DRG. La determinación de la tasa de transfección en 250.000 células de un cultivo primario de DRG (P0, 1 T.i.v.) se llevó a cabo 24 horas después de la transfección mediante microscopía de fluorescencia en una placa de 24 pocillos utilizando diferentes cantidades de LipofectamineTM 2000 (0,2 - 1,4 µl) y diferentes concentraciones de ARNsi-Cy3 (10 - 200 pmol).

Figura 10: tasa de transfección en células PC12 MR-A. La determinación de la tasa de transfección en 250.000 células PC12 MR-A se llevó a cabo 24 horas después de la transfección mediante microscopía de fluorescencia en una placa de 24 pocillos utilizando diferentes cantidades de LF 2000 (0,2 - 1,4 µl) y diferentes concentraciones de ARNsi-Cy3 (10 - 200 pmol).

Figura 11: tasa de transfección en células wt-PC12. Para ello se determinó la tasa de transfección en 250.000 células wt-PC12 24 horas después de la transfección mediante microscopía de fluorescencia en una placa de 24 pocillos utilizando diferentes cantidades de LF 2000 (0,2 - 1,4 µl) y diferentes concentraciones de ARNsi-Cy3 (10 - 200 pmol).

Figura 12: resultados del tratamiento de un cultivo primario de DRG con ARNsi marcado con Cy3 contra VGLUT2. La supresión de la expresión de proteínas VGLUT2 mediante ARNsi marcado con Cy3 en neuronas de un cultivo primario de DRG (P0, 2 T.i.v.) se determinó con ayuda de inmunofluorescencia 48 horas después de la transfección con LF 2000 (1 µl/pocillo) en una placa de 24 pocillos. VGLUT2 (cobaya, 1:800, verde), Cy3-si-rVGLUT2 166 186 AMB (100 pmol, rojo) y representación superpuesta de las señales de VGLUT2 y ARNsi-Cy3 con núcleos celulares teñidos con DAPI (C, F, I).

Figura 13: expresión de proteínas VGLUT2 en células PC12 MR-A y supresión proteínica mediante ARNsi. La detección inmunocitoquímica de la expresión de proteínas VGLUT2 se llevó a cabo (A) en células de la línea celular PC12 MR-A y reducción del nivel de proteínas VGLUT2 mediante ARNsi contra VGLUT2 (sirVGLUT2 100-120 EGT), 100 pmol ARNsi (C), 200 pmol ARNsi (D) y control negativo (B) sin anticuerpos primarios contra VGLUT2 (conejo 1:800).

Figura 14: detección de VGLUT2 en células wt-PC12 transfectadas. Mediante un proceso inmunocitoquímico se detectó proteína VGLUT2 con anticuerpos primarios contra VGLUT2 (conejo, 1:800) 24 horas después de la transfección de plásmidos rVGLUT2 mediante LF2000TM en células wt-PC12: (A) células VGLUT2-positivas (marcadas con A488, verde) en células transfectadas con rVGLUT2; (B) ninguna inmunorreactividad de VGLUT2 en células no transfectadas (control negativo).

Figura 15: tratamiento con ARNsi de células wt-PC12 cotransfectadas con VGLUT2. El recuento de las células wt-PC12 VGLUT2-positivas, marcadas de forma inmunocitoquímica, se llevó a cabo 24 horas después de la cotransfección del plásmido rVGLUT2 con ARNsi contra VGLUT2 (si-rVGLUT2 100-120 EGT, si-rVGLUT2 100-120 AMB, si-rVGLUT2 166-186), contra VGLUT1 (si-rVGLUT1 739-759 EGT) y contra VGLUT3 (si-rVGLUT3 220-240 EGT) y con un ARNsi desapareado (si-rVGLUT2 MM EGT). Representación de los valores medios  E.E.M. (error estándar de la media) para n = 6 por grupo, * p<0,05; ** p<0,01 y *** p<0,001 en comparación con el grupo control sin tratamiento con ARNsi (ANOVA, Bonferroni-Test). Comparación de dos métodos de evaluación: (A) recuento manual,

(B) recuento digital.

Figura 16: eficiencia de los ARNsi en células wt-PC12. Las eficiencias de ARNsi (porcentaje de la reducción de células VGLUT2-positivas con respecto a la expresión de VGLUT2 sin ARNsi) se compararon 24 horas después de la cotransfección del plásmido rVGLUT2 y ARNsi en células wt-PC12. Representación de los valores medios  E.E.M. para n = 6 por grupo, *** p<0,001 en comparación con el tratamiento con ARNsi desapareado (ANOVA, Bonferroni-Test).

Figura 17: tratamiento con ARNsi de células wt-PC12 seis horas antes de la transfección con rVGLUT2. En este caso se recontaron las células wt-PC12 VGLUT2-positivas marcadas de forma inmunocitoquímica 24 horas después del tratamiento con ARNsi contra VGLUT2 (sirVGLUT2 100-120 EGT, si-rVGLUT2 100-120 AMB, si-rVGLUT2 166-186), contra VGLUT1 (si-rVGLUT1 739-759 EGT) y contra VGLUT3 (si-rVGLUT3 220-240 EGT) y con un ARNsi desapareado (si-rVGLUT2 MM EGT). Las células se sometieron a transfección con el plásmido rVGLUT2 6 horas después del tratamiento con ARNsi. Representación de los valores medios  E.E.M. para n = 6 por grupo, ** p<0,01 en comparación con el tratamiento con ARNsi desapareado (ANOVA, Bonferroni-Test).

Figura 18: influencia del tratamiento con ARNsi 24 horas después de la transfección con rVGLUT2. Las células wt-PC12 VGLUT2-positivas marcadas de forma inmunocitoquímica se recontaron 24 horas después del tratamiento con ARNsi contra VGLUT2 (si-rVGLUT2 100-120 EGT, si-rVGLUT2 100-120 AMB, si-rVGLUT2 166-186), contra VGLUT1 (si-rVGLUT1 739-759 EGT) y contra VGLUT3 (sirVGLUT3 220-240 EGT) y con un ARNsi desapareado (sirVGLUT2 MM EGT). Las células se sometieron a transfección con el plásmido rVGLUT2 24 horas antes del tratamiento con ARNsi. Representación de los valores medios  E.E.M. para n = 6 por grupo, * p<0,05 y ** p<0,01 en comparación con células no tratadas (ANOVA, Bonferroni-Test).

Figura 19: eficiencia de los ARNsi 24 horas después de la transfección con rVGLUT2. Se compararon las eficiencias de ARNsi (proporción de la supresión de VGLUT2 con respecto a la expresión de VGLUT2 sin ARNsi) 24 horas después del tratamiento con ARNsi en células wt-PC12 que 24 horas antes del tratamiento con ARNsi habían sido transfectadas con el plásmido rVGLUT2. Representación de los valores medios  E.E.M. para n = 6 por grupo, *** p<0,001 en comparación con el tratamiento con ARNsi desapareado (ANOVA, Bonferroni-Test).

Figura 20: caracterización de las células en un cultivo primario del ganglio espinal. Se representa documentación de microscopía óptica y microscopía de fluorescencia de diferentes tipos de células en un cultivo primario del ganglio espinal (día postnatal 2, 1-5 días in vitro): (A) documentación de microscopía óptica (1 T.i.v.); (B, C) detección inmunocitoquímica de (B) neuronas (5 T.i.v.) mediante anticuerpos primarios contra PGP9.5U (1:1500) y de (C) células de Schwann (5 T.i.v.) mediante anticuerpos primarios contra GFAP (1:5000). Los núcleos celulares están contrateñidos de azul con DAPI en (B) y (C).

Figura 21: neuronas nociceptivas en cultivos primarios de DRG. A través de métodos inmunocitoquímicos se detectaron proteínas marcadoras nociceptivas en células de un cultivo primario de DRG (P2, 8 T.i.v.) mediante anticuerpos primarios contra (A) CGRP (conejo, 1:8000);

(B) TRPV1 (conejo, 1:250); (C) TRPV2 (conejo, 1:400).

Figura 22: expresión de proteínas VGLUT2 en cultivos primarios de DRG. Para ello se caracterizó inmunocitoquímicamente la expresión de proteínas VGLUT2 en cultivos primarios de ganglios espinales: (A) VGLUT2 (cobaya, 1:800); (B) VGLUT2 (1:800, verde), PGP9.5 (conejo, 1:1500, rojo), coexpresión de VGLUT2 y PGP9.5 (amarillo); (C) VGLUT2 (1:800, verde), GFAP (conejo, 1:5000, rojo). Todos los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI.

Figura 23: expresión de VGLUT1 o VGLUT2 en neuronas de DRG peptidérgicas. Se representa la inmunofluorescencia doble de VGLUT1 o VGLUT2 con CGRP en neuronas DRG (A-M): (A, C, D, F) VGLUT1 (cobaya, 1:800, verde); (B, C, E, F, H, I, L, M) CGRP (conejo, 1:5000, rojo); (G, I, K, M) VGLUT2 (cobaya, 1:800, verde). El VGLUT1 y el CGRP se expresan en subpoblaciones diferentes (C, F), ya que el CGRP coexiste con el VGLUT2 (I, M, señal amarilla).

Figura 24: expresión de VGLUT2 en neuronas TRPV1-positivas. A través de métodos inmunocitoquímicos se detectó la expresión de VGLUT2 en neuronas TRPV1-positivas de un cultivo primario de DRG: (A) VGLUT2 (cobaya, 1:800, verde); (B) TRPV (conejo, 1:250, rojo);

(C) colocalización de VGLUT2 en neuronas TRPV1-positivas (señal amarilla); (D) ampliación de una sección de la imagen C: señales de VGLUT2 en soma celular (amarillo) y en el axón (amarillo, verde) de la neurona TRPV1-positiva; (E, F) distribución de frecuencias en relación con las superficies celulares de neuronas VGLUT2-positivas o TRPV1-positivas.

Figura 25: sinopsis de las diferentes secuencias de VGLUT (humano, rata) (VGLUT1, VGLUT2, VGLUT3), incluyendo el código de acceso en el banco de datos correspondiente.

Figura 26: secuencias diana de ADN de ARNsi específicos de isoformas de VGLUT. Las secuencias preferentes están representadas en negrita. Las homologías se ensayaron con el algoritmo de Smith-Waterman.

Figura 27: secuencias de nucleótidos de VGLUT1, VGLUT2 y VGLUT3 (humanas en cada caso).

Figura 28: resultados de los ensayos in vivo con ratas de acuerdo con el método de dolor de Bennett (véase el ejemplo de realización 4). Los ensayos se realizaron con tres dosificaciones diferentes. Las figuras 28 A, 28 B y 28 C muestran los resultados de los ensayos utilizando 1 ng, 10 ng y 100 ng de sustancia de ensayo (ARNsi de VGLUT2) y cantidades correspondientes de ARNsi de control. Además se administró a cada animal NaCl como control adicional. El efecto antialodínico del ARNsi de VGLUT2 (símbolo cruzado) se puede observar de forma especialmente clara en la figura 28A.

La presente invención se caracteriza más detalladamente mediante los siguientes ejemplos de realización.

Ejemplos de realización

Ejemplo de realización 1

A) Diseño de moléculas de ARNsi

El diseño de las moléculas de ARNsi según la invención utilizadas corresponde a las formas de realización según la invención. En la figura 5, la figura 6 y la figura 7 están representadas las secuencias codificadoras de los tres transportadores vesiculares de glutamato diferentes. En cada caso están

5 marcados con colores el codón de iniciación (amarillo), y también los pares de cebadores utilizados para la determinación (cuantitativa) (gris claro y oscuro). Las secuencias diana de los diferentes ARNsi también están marcadas con colores (rojo, verde, azul).

B) Preparación del ARNsi

10 Los ARNsi utilizados por un lado fueron sintetizados por encargo por la firma Eurogentec (EGT) y, por otro, se obtuvieron mediante preparación propia con el kit de construcción de ARNsi de la firma Ambion (AMB). La síntesis de las siguientes moléculas de ARNsi se encargó a Eurogentec:

si-rVGLUT1 739-759 EGT

imagen2

si-rVGLUT2 100-120 EGT (ARNsi activo)

imagen3

Contenido de GC: 42,8%

si-rVGLUT3 220-240 EGT

imagen3

Contenido de GC: 52,4%

20 si-VGLUT2 MM EGT (ARNsi de control)

imagen3

Contenido de GC: 42,8%

Con el kit de construcción de ARNsi SilencerTM de la firma Ambion se prepararon las siguientes moléculas de ARNsi:

si-rVGLUT2 100-120 AMB (ARNsi activo)

Contenido de GC: 42,8%

imagen3

si-rVGLUT2 166-186 AMB

imagen3

Contenido de GC: 57,1%

Una parte de los ARNsi de producción propia se marcó con el colorante

5 Cy3 con el kit de marcado de ARNsi Silencer de la firma Ambion. Las secuencias arriba indicadas se utilizaron para los experimentos in vitro descritos más abajo.

Preparación de ARNsi mediante el kit de construcción de ARNsi SilencerTM (Ambion)

10 Para preparar modelos de transcripción eficientes para la síntesis de ARNsi, los oligonucleótidos sentido y antisentido se han de transformar en ARNds mediante el promotor T7 en el extremo 5’. Esto se logra hibridando los dos oligonucleótidos con el cebador de promotor T7 y prolongándolos mediante una reacción postrior de polimerización de ADN (véase también la figura 3).

15 Los moldes de ARNsi sentido y antisentido se transcriben durante dos horas en cargas de reacción independientes. A continuación se mezclan las cargas y la carga de reacción común se incuba durante una noche. Las cargas de transcripción independientes evitan una competencia potencial entre los moldes por los reactivos de transcripción, lo que podría limitar la síntesis de una

20 de las dos cadenas del ARNsi. Mediante la mezcla de las cargas de transcripción se facilita la hibridación de las dos cadenas de ARNsi y así se permite una síntesis continua de ARN, lo que aumenta el rendimiento de los ARNds. El ARNsi obtenido mediante transcripción in vitro tiene en el extremo 5’ “secuencias conductoras” salientes que han de ser eliminadas antes de una

25 transfección. Esta “secuencia conductora” se digiere mediante una ribonucleasa específica de cadena simple. En la misma carga de reacción se elimina el molde de ADN mediante una digestión con DNAasa (véase también la figura 4).

El ARNsi resultante se purifica mediante columnas de ARN para eliminar la mezcla de nucleótidos, enzimas, oligómeros cortos y sales.

30 El ARNsi así purificado se somete a elución en agua libre de nucleasa y a continuación está listo para la transfección.

Realización

A partir de la solución madre 200 µM se preparó una solución 100 µM de cada ARNsi ONV. Para la hibridación de los ARNsi ONV con el cebador de promotor T7 se prepararon en cada caso las siguientes cargas de reacción para

sentido y antisentido:

Cebador de promotor T7: 2 µl

Tampón DNA Hyb: 6 µl

ARNsi ONV sentido / antisentido: 2 µl

En primer lugar las cargas se calentaron durante 5 minutos a 70ºC y después se mantuvieron durante 5 minutos a TA. A continuación se añadió a las cargas de reacción la siguiente mezcla de reacción, que se mezcló con cuidado y se incubó durante 30 minutos a 37ºC:

10X tampón de reacción Klenow 2 µl 10X mezcla dNTP 2 µl Agua libre de nucleasa 4 µl ADN polimerasa Exo-Klenow 2 µl

Para las dos cargas de ADN se preparó en cada caso una carga de reacción de transcripción a TA para sintetizar las cadenas de ARNss sentido y antisentido. Para ello se agruparon los siguientes componentes en el orden indicado, se mezclaron con cuidado, sin pipetear, y la mezcla se incubó durante 2 horas a 37ºC:

Molde de ADN sentido o antisentido 2 µl Agua libre de nucleasa 4 µl 2X mezcla NTP 10 µl 10X tampón de reacción T7 2 µl Mezcla de enzimas T7 2 µl

Después de estas 2 horas, las dos cargas de transcripción se juntaron por pipeteado y se incubaron a lo largo de la noche a 37ºC.

Para la digestión de los ARNds hibridados con RNAasa y DNAasa se preparó la siguiente carga de reacción y se añadió con pipeta al ARNds, se

mezcló con cuidado y se incubó durante 2 horas a 37ºC:

Tampón de digestión: 6 µl

Agua libre de nucleasa: 48,5 µl

RNAasa: 3 µl

Para la digestión de nucleasa se añadieron a continuación 400 µl de ARNsi y la carga se incubó durante 2 -5 minutos a TA. Entre tanto, la membrana filtrante suministrada con el equipo se humedeció con 100 µl de tampón de lavado de ARNsi. Sobre el filtro humedecido se aplicó el ARNsi en el tampón de unión de ARNsi y el filtro se centrifugó durante 1 minuto a 10.000

r.p.m. El caudal de circulación se desechó y la membrana filtrante se lavó 2 veces con 500 µl del tampón de lavado de ARNsi en cada caso y se centrifugó (2 minutos a 10.000 r.p.m.). A continuación, el ARNsi purificado se sometió a elución con 100 µl de agua libre de nucleasa a 75ºC y se centrifugó en un recipiente colector limpio (2 minutos a 12.000 r.p.m.). El ARNsi se conservó a -20ºC o -80ºC hasta su utilización.

Síntesis en Eurogentec y formación de ARNsi dúplex

Con los oligonucleótidos de ARN sintetizados por Eurogentec se realizó una solución 50 µM mediante H2O tratada con DEPC y la solución se dividió en partes alícuotas. En cada caso 30 µl de las soluciones de oligonucleótidos de ARN del mismo grupo se mezclaron con 15 µl de 5X tampón de reasociación (concentraciones finales: 20 µM ARNsi dúplex; 50 mM Tris pH 7,5-8,0; 100 mM NaCl en DEPC-H2O). La solución e calentó durante 1 - 2 minutos en un baño de agua a 90 - 95ºC y se dejó enfriar durante 45 - 60 minutos a TA. El ARNsi se conservó a -20ºC hasta su utilización.

Marcado del ARNsi con Cy3

Para el marcado de ARNsi con el colorante de fluorescencia Cy3 se utilizaron tanto los ARNsi dúplex sintetizados por Eurogentec como los de producción propia. Para marcar 5 µg de ARNsi se preparó la siguiente carga de reacción, que se incubó durante 1 hora a 37ºC:

Agua libre de nucleasa 18,3 µl 10x mezcla de marcado 5,0 µl

ARNsi dúplex 21-mero (20 µM) 19,2 µl Reactivo de marcado Cy3 7,5 µl

El ARNsi marcado con Cy3 se purificó mediante precipitación en etanol. Para ello se añadieron a la carga de reacción 0,1 volúmenes de NaCl 5M y 2,5 volúmenes de etanol al 100%, la carga se mezcló bien y se conservó durante 60 minutos a -80ºC. El precipitado se pelletizó con 20 minutos de centrifugación (>

8.000 x g), el sobrenadante se retiró con cuidado, sin destruir la pella, y finalmente se lavó con 175 µl de etanol al 70%. Después de otra centrifugación (5 minutos a > 8.000 x g) se retiró todo el sobrenadante, la pella se secó a TA durante 5 - 10 minutos y finalmente se disolvió en una cantidad correspondiente de agua libre de nucleasa (en este caso 19,2 µl).

Ejemplo de realización 2

Utilización de los ARNsi de VGLUT en diferentes modelos in vitro

Para ensayar la efectividad de los ARNsi preparados, éstos se utilizaron en diferentes modelos in vitro y a continuación se determinó la expresión de las proteínas mediante inmunocitoquímica.

A) Optimización de las condiciones de transfección

Para lograr una alta eficiencia de la supresión de genes de ARNsi, además de la eficacia propia del ARNsi, también es necesaria una alta tasa de transfección de las células correspondientes. En este contexto desempeñan un papel importante la densidad celular, la cantidad del reactivo de transfección y la concentración de los ARNsi. La tasa de transfección (RT = cantidad de células transfectadas / cantidad total de células) se determinó mediante ARNsi marcado con Cy3 bajo variación de estos diversos parámetros. Como reactivo de transfección se utilizó LipofectamineTM 2000.

La figura 8 muestra a modo de ejemplo los resultados de la localización de ARNsi marcado con Cy3 24 horas después de la transfección con LF2000TM. En las células PC12 MR-A aquí mostradas, el ARNsi marcado se acumula en el citoplasma, especialmente cerca del núcleo celular.

La transfección de células del ganglio espinal en un cultivo primario resultó sumamente difícil. Como muestra la figura 9, en la transfección de las células con ARNsi marcado con Cy3 mediante LF2000 sólo se logra una tasa de transfección máxima 2%. En este contexto no se pudo detectar ninguna preferencia de la transfección por un tipo de célula determinado, sino que tanto las células neuronales como las células no neuronales mostraban igualmente una señal de fluorescencia de Cy3. Sin embargo, dado que la proporción de neuronas era a lo sumo del 60%, el rendimiento de neuronas transfectadas con ARNsi fue muy bajo.

Las tasas de transfección más altas (RTmáx  80 %) se alcanzaron con células de las líneas celulares PC12 MR-A y PC12 MR-B, como muestra la figura 10 a modo de ejemplo en el caso de la línea celular PC12 MR-A.

Las células wt-PC12 normales también se pueden transfectar bien con ARNsi. La figura 11 muestra las diferentes tasas de transfección para las diferentes condiciones de transfección. La tasa de transfección máxima fue  28%.

B) Supresión de la expresión de VGLUT mediante ARNsi en diferentes modelos in vitro

1. Supresión de la expresión endógena de VGLUT en cultivos primarios de DRG

Las células de los cultivos primarios de DRG se transfectaron inmediatamente después de la disociación de los ganglios y purificación de la suspensión celular con el reactivo de transfección LF2000TM con diferentes ARNsi. Las células transfectadas se sembraron en bandejas de cultivo normales

o se cultivaron en una placa de 24 pocillos sobre cubreobjetos revestidos con poli-L-lisina.

Se fijaron los cultivos primaros de DRG, que se transfectaron con ARNsi marcado con Cy3 (Cy3-si-rVGLUT2 166 - 186 AMB) 48 horas después de la transfección y se caracterizaron inmunocitoquímicamente en cuanto a la expresión de proteínas VGLUT2. La figura 12 muestra el resultado de un tratamiento de este tipo con ARNsi.

Sobre los cubreobjetos tratados con ARNsi había aproximadamente un 2% de células transfectadas, que se podían reconocer por su coloración con Cy3. Ninguna de estas células transfectadas con ARNsi mostraba una señal proteínica clara para VGLUT2 después de un marcado inmunocitoquímico del transportador vesicular de glutamato VGLUT2. En cambio, ninguna de las células VGLUT2-positivas presentaba señales del ARNsi marcado con Cy3.

2. Supresión de la expresión endógena de VGLUT en líneas celulares establecidas

Las líneas celulares diferenciadas PC12 MR-A y PC12 MR-B expresan el transportador vesicular de glutamato VGLUT1 y VGLUT2. La figura 13 muestra la expresión de la proteína VGLUT2 en las células PC12 MR-A.

Estas células se transfectaron con ARNsi contra VGLUT2 (si-rVGLUT2 100-120 EGT) bajo condiciones optimizadas. Como muestra la figura 13, con 100 pmol de ARNsi (C) ya se logra una reducción de la inmunorreactividad de VGLUT2, con 200 pmol de ARNsi (D) la mayoría de las células carecen de inmunorreactividad de VGLUT2 o ya sólo presentan una inmunorreactividad de VGLUT2 muy pequeña.

3. Supresión de la expresión de VGLUT2 en células wt-PC12 transfectadas transitoriamente

Las células de la línea celular wt-PC12 normal sólo expresan VGLUT1 y no VGLUT2. Por este motivo, estas células endocrinas, producidas en vesículas, son adecuadas como sistema modelo para experimentos de supresión después de una transfección con VGLUT2 transitoria. Para la optimización de las transfecciones de ADN se utilizó un vector de EGFP cuyo producto genético, la proteína de fluorescencia verde (GFP), se puede detectar directamente mediante microscopía de fluorescencia. Mediante la optimización de las condiciones de transfección de ADN se alcanzó una tasa de transfección de EGFP  40%. También se pudo lograr una tasa de transfección similarmente alta en el caso de las transfecciones con plásmidos rVGLUT2 (figura 14).

Los experimentos de supresión de ARNsi se configuraron de diferentes formas:

 Cotransfecciones de ARNsi y vector de ADNc.

 Transfección de ARNsi 6 horas antes de la transfección de ADNc.

 Transfección de ADNc 24 horas antes de la transfección de ARNsi.

En primer lugar se llevaron a cabo cotransfecciones con plásmidos rVGLUT2 y diferentes ARNsi. Para ello se utilizaron tres ARNsi contra VGLUT2, y también ARNsi contra VGLUT1, VGLUT3 y un ARNsi desapareado para el control de especificidad. Las células se fijaron 24 horas después de la transfección y se detectó inmunocitoquímicamente la expresión de proteínas VGLUT2. La evaluación tuvo lugar en el microscopio de fluorescencia, realizándose el recuento de las células VGLUT2-positivas tanto manualmente como mediante análisis digital de imágenes (MCID).

La figura 15 muestra una comparación de la proporción de células VGLUT2-positivas después de transfecciones de plásmido rVGLUT2 con y sin cotransfección de ARNsi, y también una comparación de los dos métodos de evaluación. Los resultados del recuento digital (B), con el que se ahorra tiempo, coinciden en sus proporciones relativas con el recuento manual (A). Por ello, todos los experimentos posteriores se evaluaron digitalmente. Después del tratamiento con ARNsi dirigidos específicamente contra VGLUT2 se había reducido significativamente la proporción de células VGLUT2-positivas en comparación con células no tratadas con ARNsi (24,92  1,9) (si-rVGLUT2 100200 EGT 11,4  2,2 p<0,01; si-rVGLUT2 100-200 AMB 9,84  1,1 p<0,01; sirVGLUT2 166-186 AMB 6,29  1,1 p<0,001).

En cambio, los ARNsi contra VGLUT1 o contra VGLUT3 y el ARNsi desaparedo no influyen significativamente (p>0,05) en la proporción de células VGLUT2-positivas (A).

Si a partir de estos resultados se calcula la eficiencia de los ARNsi utilizados como el porcentaje de la reducción de células VGLUT2-positivas con respecto a la expresión de VGLUT2 sin la influencia del tratamiento con ARNsi, se obtiene el resultado mostrado en la figura 16.

Se ha comprobado que los ARNsi dirigidos contra VGLUT2 presentan una alta eficiencia en comparación con el ineficaz ARNsi desapareado. Reducen la proporción de células que expresan el VGLUT2 en un 79 - 82%, siendo más eficaces los ARNsi de producción propia en las concentraciones utilizadas que el ARNsi sintetizado por Eurogentec. Mientras que el ARNsi contra VGLUT3 y el ARNsi desapareado no tienen ningún efecto significativo en la expresión de las proteínas VGLUT2, parece que el ARNsi dirigido contra VGLUT1 actúa de forma no específica sobre la expresión de VGLUT3 con una eficiencia  47%. No obstante, los ARNsi contra VGLUT2 son considerablemente más eficaces (p<0,001) que el ARNsi contra VGLUT1.

A continuación se modificó el experimento de transfección: se trataron células wt-PC12 con diferentes ARNsi 6 horas antes de la transfección con el plásmido rVGLUT2, de modo que en el momento de la transfección de ADN los ARNsi ya estaban dentro de las células.

La figura 17 muestra la proporción de células VGLUT2-positivas en esta carga de ensayo. Como en el caso de las cotransfecciones, los ARNsi contra VGLUT2 conducen a una reducción significativa (p<0,01) de células que expresan VGLUT2 en comparación con los cultivos tratados con ARNsi desapareado. En cambio, en el caso del tratamiento con ARNsi contra VGLUT1

o VGLUT3, la proporción de células VGLUT2-positivas no experimenta ninguna variación significativa (p>0,05).

En otro experimento se analizó la influencia del nivel de proteínas VGLUT2 ya existente en la eficiencia de supresión de los ARNsi. Este modelo es el que más se corresponde con las células que expresan VGLUT2 de forma endógena y con la situación in vivo. Para ello, 24 horas antes del tratamiento con ARNsi, las células wt-PC12 se transfectaron con el plásmido rVGLUT2. Después de otras 24 horas se calculó la proporción de las células VGLUT2positivas.

La figura 18 muestra la proporción de las células VGLUT2-positivas después de un marcado inmunocitoquímico. Como en los ensayos precedentes, los ARNsi de control (contra VGLUT1 y VGLUT3, ARNsi desapareado) no conducen a ninguna reducción significativa (p>0,05) de la expresión de proteínas VGLUT2. En cambio, los ARNsi dirigidos específicamente contra VGLUT2 (de Ambion) reducen considerablemente la proporción de las células VGLUT2-positivas.

La figura 19 muestra la eficiencia de los ARNsi en esta carga de ensayo. Esta imagen muestra de nuevo claramente que los ARNsi dirigidos contra VGLUT2 reducen considerablemente la proporción de células VGLUT2-positivas y que este efecto es muy significativo en comparación con el ARNsi desapareado (p<0,001).

Los resultados de estos ensayos prueban la eficacia específica de los ARNsi dirigidos contra VGLUT2 (si-rVGLUT2 100-120 EGT, si-rVGLUT2 100120 AMB, si-rVGLUT2 166-186 AMB). En este contexto no existe ninguna diferencia entre los ARNsi de producción propia (si-rVGLUT2 100-120 AMB) y los sintetizados por Eurogentec (si-rVGLUT2 100-120 EGT). Los controles de ARNsi contra VGLUT1 (si-rVGLUT1 739-759 EGT) y contra VGLUT3 (sirVGLUT3 220-240 EGT) no condujeron a ninguna reducción del nivel de proteínas VGLUT2. El denominado ARNsi desapareado (si-rVGLUT2 MM EGT), que tiene los mismos nucleótidos que los ARNsi específicos contra VGLUT2 pero en una disposición aleatoria y por consiguiente no complementaria, tampoco influye en el nivel de proteínas VGLUT2.

La eficiencia de los ARNsi específicos en estos ensayos oscila entre 15 y 80%. En el caso de las cotransfecciones simultáneas de ARNsi y ADN se logra una alta eficiencia (78-82%), mientras que en el caso de los ensayos de supresión con niveles de proteína VGLUT2 ya existentes en el momento de las transfecciones de ARNsi se alcanza una menor eficiencia (15-23%). De ello se puede deducir en primer lugar que los ARNsi específicos reducen la formación de proteínas VGLUT2 de forma muy eficiente y, en segundo lugar, que las proteínas VGLUT2 son muy estables o presentan un bajo nivel de renovación (turnover).

Ejemplo de realización 3

Caracterización de la expresión de VGLUT en cultivos primarios del ganglio espinal

Se prepararon ganglios espinales de ratas neonatas y se sometieron a un cultivo bajo las condiciones experimentales descritas más detalladamente en los ejemplos de realización. Para los cultivos se prepararon en cada caso 20 - 30 ganglios espinales de 8 - 16 ratas neonatas y se purificaron las células. La proporción de las neuronas en la cantidad total de células se aumentó claramente en comparación con el protocolo estándar mediante purificación a través de una columna BSA y también mediante la disposición en placas de la suspensión celular sobre materiales revestidos con poli-L-lisina (Grothe y Unsicker, 1987). Las neuronas, que son considerablemente más grandes y en consecuencia también más pesadas que las células no neuronales, se depositan con mayor rapidez sobre el fondo revestido. Mediante la retirada del sobrenadante después de transcurrir tan sólo 5 minutos se reduce la cantidad de células no neuronales, que se presentan principalmente como células fusiformes con ramificaciones. Después de 4 a 10 días in vitro, las células se fijaron y se caracterizaron inmunocitoquímicamente.

La figura 20 muestra las células cultivadas del ganglio espinal. Con el microscopio óptico (A) ya se pueden diferenciar los distintos tipos de células por su morfología. Las neuronas se reconocen por su forma esférica y por una refracción evidente, mientras que la inmensa mayoría de las células no neuronales son fibroblastos fusiformes. Las neuronas también se pudieron preparar inmunocitoquímicamente con anticuerpos primarios contra el marcador panneuronal “Protein-Genprodukt 9.5” (PGP9.5) (B). En los cultivos también había algunas células de Schwann, que se identificaron con anticuerpos contra GFAP (C).

Dado que para los ensayos posteriores interesaban sobre todo las neuronas sensoriales primarias nociceptivas, se comprobó mediante marcadores inmunocitoquímicos que esta población de neuronas estaba presente en el cultivo primario y que se podía cultivar in vitro durante al menos 8 días. La figura 12 muestra estas neuronas: células peptidérgicas de ganglios espinales (A) con expresión de proteína CGRP y también neuronas sensibles al calor que expresan los canales de iones (B) TRPV1 y (C) TRPV2.

La figura 22 muestra la expresión de VGLUT2 (A-C, señal verde) en células del cultivo primario de DRG. El VGLUT2 es expresado en neuronas (B), siendo todas las células VGLUT2-positivas también positivas para el marcador neuronal PGP9.5 (señal amarilla). Sin embargo, no todas las células PGP9.5positivas son VGLUT2-positivas (señal roja). La posibilidad de una coexpresión de VGLUT2 en células de Schwann se pudo excluir mediante marcado conjunto con los anticuerpos utilizados contra GFAP (C, señal roja).

La expresión de proteínas se desarrolla correspondientemente en el caso del VGLUT1 (no mostrado): el VGLUT12 es expresado en una subpoblación de neuronas PGP9.5-positivas y no está presente en células de Schwann.

A continuación se investigó la expresión de los transportadores vesiculares de glutamato VGLUT1 y VGLUT22 en neuronas peptidérgicas CGRP-positivas (figura 23): la expresión de VGLUT1 (verde) y CGRP (rojo) tiene lugar en dos poblaciones celulares diferentes (C, F). En cambio, el VGLUT2 y el CGRP coexisten (I, M). Se observa que todas las neuronas inmunorreactivas de CGRP tienen el transportador vesicular de glutamato VGLUT2. Sin embargo, no todas las neuronas VGLUT2-positivas forman el neuropéptido CGRP.

Para investigar la expresión de VGLUT2 en nociceptores polimodios se llevó a cabo una inmunofluorescencia doble para VGLUT1 y VGLUT2. Como muestra la figura 24, todas las neuronas TRPV1-positivas utilizan el transportador vesicular de glutamato VGLUT2 (C, D). El VGLUT2 se localizó sobre todo en el soma celular y en el axón (D). En la figura 24 (E, F) están representadas las distribuciones de frecuencias de los tamaños celulares de las

neuronas VGLUT2-positivas (E) o de las neuronas TRPV1-positivas (F). Se puede observar que las neuronas TRPV1-positivas con un tamaño celular medio 180 µm2 constituyen una subpoblación de las neuronas VGLUT2-positivas pequeñas y medianas, que presentan un tamaño celular medio 200 µm2.

Ejemplo de realización 4

Ensayos in vivo para comprobar la eficacia del ARNsi contra el VGLUT2 en el tratamiento del dolor in vivo

Para estos ensayos se utilizó el modelo de dolor en la rata según Bennett.

El efecto analgésico del ARNsi según la invención se analizó en el modelo de rata in vivo. Para ello, como componente activo se utilizó un ARNsi dirigido contra la secuencia diana AAGCAGGATAACCGAGAGACC de VGLUT2.

Las: dos cadenas de este ARNsi de doble hebra tienen las siguientes

secuencias:: r(GCAGGAUAACCGA GAGAC C)dTT y

r(GGUCUCUCGGUUAUCCUGC)d(TT).

El ARNsi de control está dirigido contra la siguiente secuencia diana (AAGGACTAGCA-AAGCGAGCCA) (no se trata de una secuencia VGLUT2). Las cadenas del ARNsi de control de doble hebra tienen respectivamente las siguientes secuencias: r(GGACUAGCAAAGCGAGCCA)d(TT) y r(UGGCUCGCUUUGCUAGUCC)d(TT).

Todas las secuencias arriba mencionadas se sintetizaron químicamente (Xeragon, Germantown, EE. UU.) y su pureza se comprobó mediante análisis MALDI-TOF. Las secuencias se disolvieron en una disolución de NaCl al 0,9%.

El dolor neuropático se produce, entre otros casos, después de una lesión de los nervios periféricos o centrales y, en consecuencia, se puede inducir y observar en la experimentación animal mediante lesiones selectivas de nervios individuales. Un modelo animal consiste en la lesión nerviosa según Bennett (Bennett y Xie (1988) Pain 33: 87-107). En el modelo de Bennett se realizan ligaduras sueltas unilaterales en el nervio ciático. Se observa el desarrollo de síntomas de dolor neuropático, que se puede cuantificar mediante alodinia térmica o mecánica.

Para ello, 5 ratas Sprague-Dawley (Janvier, Francia) con un peso de 140 a 160 gramos se anestesiaron primero con pentobarbital (50 mg por kg de peso corporal de la rata, Nembutal®, intraperitoneal, Sanofi, Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Hannover, Alemania). A continuación se realizaron múltiples ligaduras unilaterales en el nervio ciático principal derecho de las ratas. Para ello se descubrió el nervio ciático a la altura del centro del muslo y se fijaron cuatro ligaduras sueltas (softcat®chrom USP 4/0, metric2, Braun Melsungen, Alemania) alrededor del nervio ciático de tal modo que no se interrumpió el riego sanguíneo epineural. El día de la operación fue el día 1. La medición se realizó 1 semana después de la ligadura nerviosa.

La alodinia se analizó en una placa metálica que se ajustó a una temperatura de 4ºC con ayuda de un baño de agua. Para comprobar la alodinia, las ratas se colocaron sobre la placa metálica fría, que se encontraba dentro de una jaula de plástico. Después, durante un período de dos minutos antes de la administración de la solución, se contó cuántas veces los animales retiraban impetuosamente su pata dañada de la placa metálica fría (valor previo). Luego se administraron las soluciones, que contenían 3,16 µg (5 µl) de ARNsi según la invención en 15 µl de NaCl o 3,16 µg (5 µl) de ARN de control (cadena sentido del ARNsi) en 15 µl de NaCl i.t. o soluciones de NaCl (5 µl) para el control después de la administración intatecal aguda única bajo narcosis con éter, y en cada caso después de 60 minutos se contó de nuevo la cantidad de reacciones de retirada de la pata durante 2 minutos (valor de ensayo). Las mediciones se realizaron durante 4 días seguidos, en cada caso con un intervalo de 24 h (días 2 a 5) y en cada caso con tres dosificaciones diferentes (0,001, 0,01 y 0,1 µg/animal). Los animales a los que se les administró solución de NaCl pura sirvieron tanto en los experimentos con ARNsi como con el ARN de control a modo de grupo comparativo.

El ARNsi contra VGLUT2 mostró en este modelo de dolor un fuerte efecto analgésico, es decir, una clara inhibición de la alodinia por frío sin dependencia de la dosis, habiéndose logrado el mejor efecto con el grupo correspondiente a la dosis más baja (1 ng/animal). Con las dosis más altas, los animales mostraron un incremento de la actividad espontánea tanto en el caso del control como en el experimento verdadero. Ésta podría ser la causa del efecto más débil en el grupo correspondiente a una dosis alta. No se produjeron otros efectos secundarios (véase también la figura 28).

A continuación se describen más detalladamente los materiales y métodos, o las condiciones experimentales concretas, mencionados y utilizados en los ejemplos de realización arriba indicados.

1. Materiales utilizados

1.1 Animales de experimentación

Todos los animales de ensayo adultos eran ratas Wistar macho o hembra (300 g) y se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld) o de la Deutschen Versuchstieranstalt (Hannover). Los animales se mantuvieron con un ritmo día-noche de 12h/12h, con acceso libre a comida y agua. Entre el suministro de los animales y el comienzo de los ensayos transcurrieron al menos 4 días, en los que se controló el estado de salud de los animales. Las ratas neonatas procedían de una cría propia de ratas Wistar macho y hembra, que se cubrían a intervalos regulares. Todos los animales neonatos fueron utilizados desde P0 (día posnatal 0) hasta P5 para la preparación de cultivos primarios.

1.2 Líneas celulares

wt-PC12

La línea celular tumoral inmortal PC12 se aisló en 1976 de un tumor de la médula suprarrenal de la rata (Greene y Tischler, 1976). Las células no crecen de forma adherente, producen tumores trasplantables en ratas y reaccionan de forma reversible al NGF (nerve growth factor - factor de crecimiento del tejido nervioso) con la formación de apéndices similares a neuronas. La línea celular PC12 fue puesta a disposición del laboratorio de la firma Grünenthal (Aquisgrán), que a su vez obtuvo la línea celular de ATCC. Las células se mantuvieron en cultivo en un medio DMEM modificado. En adelante, estas células PC12 se denominarán wt-PC12 (wild type - salvaje) para diferenciarlas mejor.

PC12 MR-A y PC12 MR-B

Estas dos líneas celulares consistían en variantes mutadas o diferenciadas de las células wt-PC12, obtenidas originalmente por el Dr. Reiner Westermann (Institut für Anatomie und Zellbiologie, Marburg) de ATCC. A diferencia de sus mutantes salvajes, las células crecían de forma adherente, eran planas y fusiformes y formaban apéndices sin necesidad de añadir NGF. Las indicaciones dadas en la literatura dieron lugar a la suposición de que estas variantes podrían formar un fenotipo glutamatérgico (Jimenez y col., 2003; Zheng y col., 1996).

1.3 Cepas bacterianas

E. coli cepa DH5  Clontech (Heidelberg)

E. coli cepa XL-1 blue Clontech (Heidelberg)

1.4 Aparatos

Centrifugadoras

Centrifugadora de mesa tipo Biofuge pico Heraeus (Hanau) Labofuge III Heraeus (Hanau) Centrifugadora refrigerada, 5403 Eppendorf (Hamburgo) Centrifugadora JS21 Beckmann (Munich)

Incubadoras

Estufa de incubación (16/37°C) WTB Binder (Reiskirchen) Incubadora (37ºC/5% CO2) Heraeus (Hanau) Incubadora (37ºC/5% CO2) Heraeus (Hanau)

Electroforesis

Accesorios de electroforesis en gel de agarosa Kodak/Integra (New Haven)

Instalación de documentación de gel, Gel Doc 1000 BIO-RAD (Munich)

Microscopía y análisis digital de imágenes

Microscopio de exploración láser confocal Olympus (Hamburgo) Microscopio, AX70 Olympus (Hamburgo) Microscopio, IX70 Olympus (Hamburgo) Olympus SZH10 research stereo Olympus (Hamburgo) Sistema de análisis de imágenes MCID M4 Imaging Research

(St. Catharines, Canadá) Cámara SPOT Diagnostics Instruments Inc.

(Seúl, Corea) SPOT image analyses (Version 3.4) Diagnostics Instruments Inc.

(Seúl)

Otros aparatos y materiales de consumo

Dispositivo de aspiración: Neo-Lab, Vogel (Heidelberg)

Autoclave: Integra BioSciences Inc.

(Woburn, EE. UU.)

Cartucho de autorradiografía: Amersham

(Little Chalfont, Inglaterra)

Agitador de bacterias, Certomat H: Braun Biotech (Melsungen)

Cubreobjetos: Menzei (Braunschweig)

Pipetas de un solo uso: Greiner bio-one (Frickenhausen)

Frascos para cultivos de tejidos Cellstar®: Greiner bio-one (Frickenhausen)

Placa calentadora: Medax (Kiel)

Pipetas de émbolo: Eppendorf (Hamburgo)

Criotubos: Nalge Nunc International

(Rochester, EE. UU.)

Criostato CM 3050: Leica (Nussloch)

Cámara de recuento Neubauer: Marienfeld (Lauda-Königshofen)

Portaobjetos: Menzel (Braunschweig)

Peltier Thermal Cycler PTC-200: MJ Research

(Watertown, EE. UU.)

pH-Meter 766: Knick (Berlín)

Placas Petri: Nalge Nunc International

(Rochester, EE. UU.)

Puntas de pipeta: Eppendorf (Hamburgo)

Cubetas de plástico: Neolab (Heidelberg)

Instalación de agua purísima: (Milli-Q) Millipore

(Billerica, EE. UU.)

Speedvac (trampa fría): Heraeus (Hanau)

Aparato estereotáctico: David Kopf Instruments

(Tujunga, EE. UU.)

Taumler Polymax 1040: MJ Research

(Nueva York, EE. UU.)

Termómetro: IKA Labortechnik (Staufen)

Horno de ventilación forzada: Memmert (Schabach)

Videoimpresora: Mitsubishi Electric (Tokio, Japón)

Vortex: VF2 y MS2 Minishaker: IKA (Staufen)

Vortex Genie 2: Bender & Hohenheim AG

(Zürich, Suiza)

Balanza 1012 MP: Sartorius (Göttingen)

Baño de agua Julabo 5: Julabo (Seelbach)

Baño de agua: Memmert (Schabach)

Placas de cultivo celular Nunclon™

(6/24/96 pocillos): Nalge Nunc International

(Rochester, EE. UU.)

1.5 Productos químicos

Todos los productos químicos no mencionados aquí en detalle, siempre que no se indique otra cosa en la parte correspondiente a la descripción de los métodos, se han obtenido de las firmas Fluka (Buchs, Suiza), GibcoBRL (Eggenstein), Merck (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze), Roche (Basilea, Suiza), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) y Sigma (Deisenhofen).

Bacto Agar Difco (Detroit, EE. UU.) Bacto Tryptone Difco (Detroit, EE. UU.) Bacto Yeast Extract Difco (Detroit, EE. UU.) Solución fijadora Formamid BDH (Poole, Inglaterra) NaOH Baker (Deventer, Holanda) Ketamina Parke-Davis (Freiburg) Parafina Vogel Histo-Comp x-GAL Invitrogen (Karlsruhe) Xilazina Bayer (Leverkusen)

1.6 Tampones y soluciones

H2O MilliQ purificada y tratada en autoclave

PBS (solución salina fosfatada): 6,5 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

2,5 mM KCl

140 mM NaCl pH 7,25

6x Tampón para muestras (ADN/ARN): 50 % (p/v) glicerina 1 mM EDTA 0,4 % (p/v) azul de bromofenol 0,4 % (p/v) xilencilanol

TE (Tris EDTA): 10 mM Tris-Base

1 mM EDTA pH 8,0

TAE (Tris-acetato-EDTA): 1 x TAE 40 mM Tris- Base, 2m M EDTA

50x

242 g Tris base

57,1 ml ácido acético glacial

37,2 g Na2EDTA x H2O

hasta 1 l H2O pH 8,5

1.7 Medios y aditivos para medios

Medios básicos

Todos los medios se obtuvieron de GibcoBRL (Eggenstein):

DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco) con alta proporción de glucosa Ham’s F12 HBSS (10x) libre de Ca2+/Mg2+ OptiMEM (con reducción de suero) RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute)

Aditivos para medios

Mezcla de antibióticos GibcoBRL (Eggenstein) Arabinósido de citosina Sigma (Deisenhofen) Suero bovino fetal (FCS) Sigma (Deisenhofen) HyClone FBS GibcoBRL (Eggenstein) HAT Supplement GibcoBRL (Eggenstein) Glutamina GibcoBRL (Eggenstein) Suero equino GibcoBRL (Eggenstein) Factor de crecimiento del tejido nervioso NGF 7S Sigma (Deisenhofen)

Composición de los medios de crecimiento

Medio para células PC12: RPMI con

10% suero equino 5% FCS 1% Glutamina (200 mM)

Medio para células del ganglio espinal:

1.8 Enzimas y otras proteínas

Colagenasa (267 U/ml) Dispasa ADN polimerasa AmpliTaq Gold™

ADNasa (LS002139) Poli-L-lisina, bromhidrato Poli-D-lisina, MG > 300 kDa Endonucleasas de restricción ARN polimerasas (SP6, T3, T7) ADNasa I libre de RNasa ARNasa (A, T1) ARNsin Transcriptasa inversa Superscript™ II H T4 ADN ligasa Tripsina/EDTA (0,5% / 0,2%) Tripsina

1.9 Ácidos nucleicos y vectores

Ladder ADN 100 pb Ladder ADN 1 kb ATP, CTP, GTP, UTP Vector de transcripción (pGEM-T) Vector de expresión (pCR3.1) Cebador Oligo(dT)15-18

1.10 Oligonucleótidos

1% Mezcla antibióticos (100x)

DMEM con

10% FCS 1% Mezcla antibióticos (100x) 1% Glutamina 10 µM arabinósido de citosina 25 ng/ml NGF

Seromed, Biochrom (Berlín) GibcoBRL (Eggenstein) Applied Biosystems (Foster City, EE. UU.) Worthington Sigma (Deisenhofen) Sigma (Deisenhofen) Boehringer (Mannheim) Boehringer (Mannheim) Boehringer (Mannheim) Boehringer (Mannheim) Fermentas (Vilnius, Lituania) GibcoBRL (Eggenstein) Biolabs (Beverly, EE. UU.) GibcoBRL (Eggenstein) GibcoBRL (Eggenstein)

GibcoBRL (Eggenstein) GibcoBRL (Eggenstein) Boehringer (Mannheim) Promega (Madison, EE. UU.) Invitrogen (Karlsruhe) Boehringer (Mannheim)

Todos los oligonucleótidos se diseñaron con el programa Oligo 4.0, se comprobó con BLAST la posible presencia de homologías de secuencia no intencionadas y la síntesis de los mismos se encargó a MWG-Biotech (Ebersberg).

Cebadores para PCR:

rVGLUT1

rVGluT1 (2_4)F 5’-TCTGGGTTTCTGCATCAGC-3’ rVGluT1(2_4)R 5’-CCATGTATGAGGCCGACAGT-3’ Tamaño producto PCR: 153 pb

rVGLUT2

rVGluT2(8_9)F 5’-AAGACCCCATGGAGGAAGTT-3’ rVGluT2(8_9)R 5’-ATTGTCATGACCAGGTGTGG-3’ Tamaño producto PCR:184 pb

rVGLUT3

rVGluT3(4_5)F 5’-ATCCAGAGACGGTGGGTCTT-3’ rVGluT3(4_5)R 5’-ATGACACAGCCGTAATGCAC-3’ Tamaño producto PCR: 185 pb

rGAPDH

rGAPDH(7_8)F 5’-ATCCTGGGCTACACTGAGGA-3’ rGAPDH(7_8)R 5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’ Tamaño producto PCR: 162 pb

Cebadores para la síntesis de ARNsi mediante el kit de construcción de ARNsi (Ambion):

para si-rVGLUT2 de ARNsi 100-120 AMB

rVGluT2 TS10 as 5’-AAGCAGGATAACCGAGAGACCCCTGTCTC-3’ rVGluT2 TS10 s 5’-AAGGTCTCTCGGTTATCCTGCCCTGTCTC-3’

para si-rVGLUT2 de ARNsi 166-186 AMB

rVGluT2 TS14 as 5’-AAGGCTCCGCTATGCGACTGTCCTGTCTC-3’

rVGluT2 TS14 s 5’-AAACAGTCGCATAGCGGAGCCCCTGTCTC-3’

5 1.11 Kits

qPCR Core kit for SYBR® Green Eurogentec (Lieja, Bélgica) RNeasy Mini Kit QIAGEN (Hilden) Silencer™ siRNA Construction Kit Ambion (Austin, EE. UU.) Silencer™ siRNA Labeling Kit Ambion (Austin, EE. UU.)

10 QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN (Hilden) QIAprep Spin MAxiprep Kit QIAGEN (Hilden) QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN (Hilden) QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN (Hilden) QIAquick Nucleotide Removal Kit QIAGEN (Hilden)

15 QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN (Hilden) Vectastain Elite Avdin-Biotin-Blocking Kit Vector Laboratories Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories

1.12 Anticuerpos y sistemas de detección

20 Los diferentes tipos de células se identificaron con anticuerpos primarios contra epítopes (marcadores) conocidos y bien caracterizados del tipo de célula correspondiente. Éstos son PGP9.5 en las neuronas, GFAP en los astrocitos y S100 en los oligodendrocitos. Además de los anteriores, también se utilizaron otros anticuerpos contra proteínas especiales. Las concentraciones óptimas de

25 los anticuerpos primarios se determinaron en cada caso por titulación. La Tabla 1 muestra una sinopsis de los anticuerpos primarios utilizados y también sus diluciones de trabajo.

La identificación de los anticuerpos primarios se llevó a cabo mediante anticuerpos secundarios acoplados con fluorocromo o estreptavidina acoplada

30 con fluorocromo (Tabla 2), que interactuaba con anticuerpos biotinilados específicos de especies. Como fluorocromos se utilizaron Cy3 (fluorescencia roja) o Alexa 488 (fluorescencia verde).

Tabla 1 Lista de los anticuerpos primarios utilizados

Antígeno: Denominación interna Fuente Dilución Especie

β-III tubulina: Tubulina DPC/Biermann (Bad Nauheim) 1:4 Ratón, monoclonal

CGRP: CGRP/Ste Fred Nyberg, Stefan Persson 1:8000 Conejo

GFAP: GFAP-Dako DakoCytomation (Dinamarca) 1:5000 Conejo

GFAP
GFAP: Boehringer (Mannheim) 1:4 Ratón, monoclonal

PGP9.5: PGP UltraClone (Wellow, Inglaterra) 1:1500 Conejo, policlonal

S100
S100: Biogenesis (Poole, Inglaterra) Dilución previa Conejo, policlonal

Sustancia P: SP Lee Eiden (NIH, EE. UU.) 1:1000 Conejo

TRPV1: Receptor caps. (SA 6583) Eurogentec (Bélgica) 1:250 Conejo

TRPV2: VRL-1 Chemicon (Temecula, EE. UU.) 1:400 Conejo, policlonal

VGLUT1: BNPI/BC66 J. Erickson (Nueva Orleans) (Varoqui y col., 2002b) 1:600 Conejo

VGLUT1: BNPI/p437/7/01 J. Erickson (Nueva Orleans) (Varoqui y col., 2002b) 1:800 Cobaya

VGLUT2: DNPI/p438/7101 J. Erickson (Nueva Orleans) (Varoqui y col., 2002b) 1:800 Cobaya

VGLUT2: DNPI/DC68 J. Erickson (Nueva Orleans) (Varoqui y col., 2002b) 1:100 Conejo

VGLUT3: VGLUT3/447/bl9 J. Erickson (Nueva Orleans) (Schafer y col., 2002) 1:600 Cobaya policlonal

Además se utilizó Isolektyin B4 biotinilada (Sigma, Deisenhofen) en una concentración 1:20.

Tabla 2 Lista de los anticuerpos secundarios utilizados

Anticuerpo: Fuente Dilución Donante

IgG-Cy3 anti-cobaya: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

IgG-Cy3 anti-ratón: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

IgG-Cy3 anti-conejo: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

IgG-A488 anti-cobaya: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

IgG-A488 anti-ratón: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

IgG-A488 anti-conejo: Dianova (Hamburgo) 1:100 Asno

Avidin- biotin-peroxidasa: Boehringer (Mannheim) 1:500 Asno

Estreptavidin-Alexa 488: MoBiTec (Göttingen) 1:200 Asno

5

2. Métodos

2.1 Toma y preparación de tejidos

Los animales fueron sacrificados por inhalación de CO2 y decapitación subsiguiente. A continuación se tomó el tejido necesario para los diversos usos 10 previstos de diferentes formas:

Extracción de ácido nucleico:

Después de retirar el tejido, éste se dividió sobre hielo, se introdujo en un criotubo y, después de la congelación ultrarrápida por nitrógeno líquido, el tejido primero se dispuso sobre hielo seco y después se conservó a -70ºC.

15 Cultivo primario:

Para la preparación de cultivos primarios, el tejido (ganglios espinales) se recogió de forma continua sobre placas de preparación de producción propia enfriadas con hielo y en primer lugar se reunió en medio 1x CMF hasta su posterior procesamiento. El medio 1x CMF libre de calcio y magnesio consistía en 10% HBSS (10x), 1% mezcla de antibióticos y 0,2% rojo de fenol (0,5%). El valor pH se tituló con bicarbonato (7,5%) y se podía identificar por el color rojo cereza del indicador.

2.2 Preparación de cultivos primarios

Para la preparación de los cultivos primarios se utilizaron ratas de los estadios P0 a P5 para el cultivo de células del ganglio espinal y P0 a P3 para los cultivos de cerebelo. Los animales fueron desinfectados con alcohol y sacrificados por decapitación con unas tijeras estériles.

2.2.1 Cultivos primarios neuronales de ganglios espinales

La preparación de los ganglios espinales se llevó a cabo de acuerdo con un protocolo modificado de C. Grothe (Grothe y Unsicker, 1987).

Disección de los ganglios espinales

El cuerpo de la rata sacrificada se fijó boca abajo sobre una placa de corcho y se descubrió la columna vertebral retirando la piel y la musculatura de la nuca y la espalda. A continuación se abrió la columna vertebral desde el extremo caudal hacia el extremo craneal y se dejó a la vista la médula espinal. En las ratas jóvenes, la médula espinal se dejó en el canal espinal y la columna vertebral abierta se extirpó in toto para fijarla a una placa de preparación fría. Sólo entonces se retiró la columna vertebral cuidadosamente paso a paso y se extrajeron los ganglios espinales de los agujeros intervertebrales que quedaron al descubierto.

Los ganglios espinales diseccionados se reunieron en una placa Petri fría con medio 1x CMF hasta la preparación fina. El ganglio espinal se limpió bajo el binocular eliminando nervios, tejido conjuntivo y restos de sangre y, a continuación, se trasladó a un tubo de ensayo lleno de medio 1x CMF y enfriado con hielo.

Disociación y purificación de las células de los ganglios espinales

Después de retirar el medio, para la disociación química los ganglios espinales se incubaron con una mezcla de enzimas formada por un 0,075% de colagenasa y un 0,15% de dispasa en medio CMF durante 30 a 45 minutos a 37ºC y con un 5% de CO2. Con la agitación repetida durante la incubación se debía evitar que los ganglios de adhirieran entre sí. Una vez finalizada la incubación, se retiró la mitad de la mezcla de enzimas y a la parte restante se añadió un volumen igual de una solución de tripsina al 0,25%. Después de 15 a 25 minutos de incubación a 37ºC y con un 5% de CO2, se retiró la solución enzimática excepto 300 µl y los ganglios se disociaron mecánicamente en este volumen. Para ellos se utilizaron tres pipetas Pasteur estériles siliconadas con aberturas de pipeta de diferentes tamaños, que se prepararon bajo la llama de un mechero Bunsen. De este modo, mediante una reducción creciente del diámetro de abertura, se pudo preparar una suspensión celular uniforme de los ganglios espinales. Finalmente, la suspensión celular se centrifugó a 1.000

r.p.m.: durante 5 minutos, el sobrenadante se desechó y la pella celular se resuspendió en  1 ml CMF. Para enriquecer el cultivo con células neuronales, la suspensión celular se separó en capas a través de una columna BSA al 20% (20% BSA p/v en 0,5 ml medio CMF) y a continuación se centrifugó a 1.000

r.p.m.: durante 5 minutos. El medio se aspiró excepto  100 µl y se resuspendió en 1 ml de medio fresco. Para ello se utilizó ya el medio de cultivo posterior (DMEM/FCS).

Preparación de los cultivos celulares en placas

Una vez determinada la cantidad de células, las células de ganglios espinales se distribuyeron en los recipientes de cultivo correspondientemente a su uso posterior y se cultivaron a 37ºC y con un 5% de CO2. Para el cultivo se utilizó un medio DMEM rico en glucosa con diferentes aditivos (composición exacta descrita bajo el apartado “Cultivo celular”). Además de glutamina y una mezcla de antibióticos, también se añadió el factor de crecimiento de tejido nervioso NGF 7S en una concentración de 25 ng/ml, ya que la supervivencia y la diferenciación de las neuronas neonatales del ganglio espinal dependen del NGF. También se añadió al medio citosin-arabinósido, un inhibidor de la mitosis, en una concentración de 10 µM para evitar una proliferación de las células no neuronales.

Las células de ganglios espinales dispuestas en placas se pudieron mantener en cultivo sin problemas hasta dos semanas cambiando el medio cada dos o tres días.

2.3 Cultivo celular de eucariotas

Cultivo y pasaje de células eucarióticas

Todas las líneas celulares se trataron en su medio de crecimiento correspondiente a 37ºC en incubadora con una humedad relativa del aire del 95% y con un 5% de CO2. Los medios y soluciones se calentaron a 37ºC antes de su uso.

Las líneas celulares de crecimiento adherente (F-11, wt-PC12 MR-A, PC12 MR-B) se fraccionaron de forma rutinaria cada 4-6 días. Para ello se trataron durante unos minutos a 37ºC con una solución de tripsina/EDTA (0,05% tripsina, 0,02% EDTA en PBS) (control microscópico). La tripsina es una enzima proteolítica que hidroliza los enlaces peptídicos de uniones célula-célula en los que el grupo carbonilo está fijado por la lisina o la arginina. Unas pequeñas trazas de medio pueden influir negativamente en el efecto de la tripsina, por lo que fue necesario lavar las células con una solución salina fosfatada (PBS) libre de calcio y magnesio antes del tratamiento con tripsina. Posteriormente, la tripsina utilizada se inactivó mediante adición de medio conteniendo FCS. El quelante EDTA se une al calcio, que es necesario para algunas uniones célula-célula.

Una vez disueltas las células, éstas se trasladaron en un medio conteniendo suero desde el recipiente de cultivo a un tubo Falcon. Después de centrifugar y aspirar el medio antiguo, las pellas celulares se resuspendieron en 5 ml de medio fresco y se dispusieron en placas en su medio de crecimiento en los recipientes de cultivo correspondientes.

En el caso de las células wt-PC12 se trata de células en suspensión. Para el pasaje, los recipientes de cultivo se colocaron inclinados, de modo que las células wt-PC12, que crecían en cúmulos en forma de uva, poco a poco se fueron sedimentando en una esquina del recipiente. Se retiró el sobrenadante, en el que también se encontraban los detritus celulares más ligeros, y las células se trasladaron en un medio fresco a un tubo Falcon. A continuación, la suspensión se centrifugó a 1.000 r.p.m. durante 5 minutos, el sobrenadante se retiró y las células se dispusieron en placas en un medio de crecimiento fresco.

Congelación de células eucarióticas

Para el almacenamiento prolongado de las células, éstas se congelaron en un medio conteniendo DMSO en nitrógeno líquido, con el fin de protegerlas de los cambios genéticos y de reducir al mínimo el riesgo de contaminación. Sin la adición de reactivos que actúan como crioprotección de las células, la mayor parte de las células de mamífero mueren con la congelación. La mortalidad de las células se reduce al mínimo con DMSO en el medio, ya que disminuye el punto de congelación y de este modo se ralentiza el proceso de enfriamiento.

Después de su separación con una solución de tripsina/EDTA, las células primero se lavaron con PBS y luego se determinó la cantidad de células con ayuda de una cámara de recuento Neubauer. La cantidad de células a congelar se introdujo en un tubo Falcon y, después de centrifugación a 1.000 r.p.m., se desechó el sobrenadante. Finalmente, la pella celular se resuspendió en medio de congelación (90% medio de crecimiento, 10% DMSO) y se separó en partes alícuotas de 2 ml cada una (por ejemplo con 2 millones de células) en tubos Nunc. Los tubos se congelaron durante varias horas a -80ºC en un criocongelador con una velocidad de enfriamiento de 1ºC por minuto y a continuación se depositaron en nitrógeno líquido.

Revitalización de las células eucarióticas

En algunos casos se realizaron de nuevo cultivos con las células. Para ello, después de sacarlas del tanque de nitrógeno (-196ºC), se calentaron rápidamente a 37ºC en un baño de agua. Se retiró la suspensión celular, se trasladó a 5 ml de medio precalentado y se sedimentó en la centrifugadora (3 minutos, 200 x g). El medio se aspiró, la pella celular se resuspendió en medio fresco y se trasladó a una placa de cultivo celular. Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se dispusieron en medio fresco.

Determinación de la cantidad de células

Para determinar la cantidad de células se utilizó una cámara de recuento Neubauer. Para ello se colocó una gota de la suspensión celular en la cámara de recuento Neubauer, se recontó bajo el microscopio la cantidad de células (Z = células / 0,01 mm2) de cuatro cuadrados, y se determinó la cantidad de células por ml (cantidad de células = Z x 2.500= (Amiri y col.).

Prueba de micoplasmas

Todas las líneas celulares se analizaron a intervalos regulares en cuando a la contaminación con micoplasmas. Los micoplasmas son bacterias inevitablemente parasitarias. Se trata de parásitos intracelulares sin pared, muy pequeños, y no se pueden reproducir independientemente de la célula huésped. Dado que sólo tienen una membrana celular, pero no una pared bacteriana de mureína, no tienen una forma fija y son insensibles a la penicilina. Su tamaño oscila entre 0,22 y 2 µm. Una filtración a través de una membrana con un tamaño de poro de 0,1 µm permite realizar una separación de micoplasmas. El método más rápido para detectar las contaminaciones con micoplasmas consiste en la tinción del ADN de los micoplasmas con flurocromo DAPI (4-6diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato), que se une especialmente al ADN. Si un cultivo celular está contaminado con micoplasmas, se observan puntos fluorescentes independientes en el citoplasma y a veces también en el espacio intercelular.

Para la prueba de micoplasmas, una cantidad correspondiente de solución DAPI (1 mg/ml, 10 mg DAPI disueltos en 10 ml de agua, divididos en partes alícuotas y conservados a -20ºC) se diluyó con metanol a una concentración de trabajo de 1 µg/ml (estable durante aproximadamente 6 meses a 4ºC). Para teñir las células, las células cultivadas sobre los cubreobjetos o placas Petri se lavaron una vez con la solución de trabajo y se incubaron durante 15 minutos a TA también con la solución de trabajo. A continuación se lavaron una vez con metanol y los cubreobjetos se evaluaron bajo el microscopio de fluorescencia después de su inclusión en una gota de glicerina o PBS.

Revestimiento de los recipientes de cultivo

En determinados ensayos, los recipientes de cultivo o los cubreobjetos se revistieron para lograr una mejor adherencia de las células. Como materiales de revestimiento se utilizaron poli-L-lisina (0,1 mg/ml) para las células wt-PC12 o poli-D-lisina (0,5 mg/ml) para el cultivo de cerebelo. Los recipientes de cultivo se incubaron durante al menos 2 horas a TA con poli-L-lisina o poli-D-lisina, a continuación se lavaron dos veces con H2O y se conservaron a 4ºC cubiertos con una capa de H2O hasta su utilización. Mientras que los materiales revestidos con poli-L-lisina se utilizaron en húmedo, los materiales revestidos con poli-Dlisina no ser utilizaron hasta después de secarlos bajo el banco estéril.

Transfección en células eucarióticas

Por el concepto “transfección” se entiende la introducción de ADN o ARN extraño en células eucarióticas mediante métodos físicos o químicos. El método químico más importante para la transferencia de ácidos nucleicos es la lipofección: reactivos de lípidos catiónicos forman en solución acuosa, bajo condiciones óptimas, liposomas unilaminares pequeños (100 - 400 nm). La superficie de estos liposomas tiene carga positiva y es atraída electrostáticamente tanto por el esqueleto fosfato de los ácidos nucleicos como por la membrana celular, que tiene carga negativa (Garels y col., 1991; Gershon y col., 1993; Smith y col., 1993). Los ácidos nucleicos no están encerrados dentro de los liposomas, sino que se unen espontáneamente a los liposomas con carga positiva y forman complejos de ADN/ARN-lípido (Felgner y col., 1987). Existen indicios de que la absorción de los complejos se desarrolla por vía endosomal o liposomal (Coonrod y col., 1997).

Transfección de ADN mediante LipofectamineTM 2000

Para la transfección de ADN en células eucarióticas se utilizó principalmente el reactivo lipídico catiónico LipofectamineTM 2000 (LF2000TM) y se observaron las siguientes recomendaciones generales del fabricante Invitrogen:

Para preparar los complejos de ADN-LF2000TM se recomendaba una relación entre el ADN y el LF2000TM de 1:2 a 1:3. Además, en el momento de la transfección debía haber una densidad celular del 90-95% para alcanzar una alta eficiencia y un alto nivel de expresión. Durante la transfección se prescindió de la adición de antibióticos, ya que éstos provocarían la muerte celular. Para optimizar la eficiencia de transfección se llevan a cabo transfecciones bajo diferentes condiciones con un vector de EGFP. Para medir la eficiencia de transfección se calculó semicuantitativamente la expresión proteínica de la proteína de fluorescencia verde GFP mediante microscopía de fluorescencia.

Transfección de ADN en células wt-PC12

El día de la transfección se dispusieron 2,5 x 105 células wt-PC12 en 0,5 ml de medio sobre cubreobjetos revestidos con poli-L-lisina en una placa de 24 pocillos. El medio consistía en el medio de crecimiento normal para células wtPC12, pero sin adición de antibióticos. Para cada pocillo a transfectar se disolvieron 0,8 - 1 µg de ADN en 50 µl de OPTI-MEM®. Además, para cada pocillo se disolvieron 1 - 2 µl de LF2000TM en 50 µl de OPTI-MEM® y la solución se incubó durante 5 minutos a TA. Después, el ADN disuelto se mezcló con la solución de LF2000TM diluida y se incubó durante 20 minutos a TA para formar los complejos de ADN-LF2000TM, y a continuación se añadieron 100 µl de los complejos directamente a los pocillos correspondientes, que se mezclaron cuidadosamente por agitación. Las células se mantuvieron en cultivo bajo condiciones normales y en el mismo medio durante otras 24 - 72 horas hasta el análisis de la expresión.

Transfección de ADN en células de ganglios espinales

Para la transfección se utilizaron 5 x 105 células de la suspensión de DRG recién purificada, que se dispusieron en una placa de 24 pocillos sobre cubreobjetos revestidos con poli-L-lisina en 0,5 ml de medio de crecimiento sin adición de antibiótico. Para cada pocillo a transfectar se disolvieron 0,8 - 1 µg de ADN en 50 µl de OPTI-MEM®. Además, para cada pocillo se disolvieron 1 - 2 µl de LF2000TM en 50 µl de OPTI-MEM® y la solución se incubó durante 5 minutos a TA. Después, el ADN disuelto se mezcló con la solución de LF2000TM diluida y se incubó durante 20 minutos a TA para formar los complejos de ADNLF2000TM, y a continuación se añadieron 100 µl de los complejos directamente a los pocillos correspondientes, que se mezclaron cuidadosamente por agitación. Las células se mantuvieron en cultivo bajo condiciones normales y en el mismo medio durante otras 24 - 72 horas hasta el análisis de la expresión.

Transfección de ARNsi

Las transfecciones de ARNsi en las células eucarióticas se llevaron a cabo mediante LipofectamineTM 2000. La F2000TM ya ha sido utilizada con éxito por otros grupos para experimentos con ARNi en células de mamíferos (Gitlin y col., 2002; Yu y col., 2002). Como en el caso de la transfección de ADN, las condiciones de transfección óptimas se tuvieron que determinar experimentalmente. Para ello se utilizó ARNsi marcado con Cy3.

Transfección de ARNsi en células wt-PC12

El día de la transfección se dispusieron 2,5 x 105 células wt-PC12 en 0,5 ml de medio sobre cubreobjetos revestidos con poli-L-lisina en una placa de 24 pocillos. El medio consistía en el medio de crecimiento normal para células wtPC12, pero sin adición de antibióticos. Para cada pocillo a transfectar se disolvieron 20 - 100 pmol de ARNsi en 50 µl de OPTI-MEM®. Además, para cada pocillo se disolvieron 1 - 2 µl de LF2000TM en 50 µl de OPTI-MEM® y la solución se incubó durante 5 minutos a TA. Después, el ARNsi disuelto se mezcló con la solución de LF2000TM diluida y se incubó durante 20 minutos a TA para formar los complejos de ADN-LF2000TM, y a continuación se añadieron 100 µl de los complejos directamente a los pocillos correspondientes, que se mezclaron cuidadosamente por agitación. Las células se mantuvieron en cultivo bajo condiciones normales y en el mismo medio durante otras 24 - 72 horas hasta el análisis de la expresión.

Transfección de ARNsi en células de las líneas PC12 MR-A y PC12 MR-B

El día de la transfección se dispusieron 2,5 x 105 células PC12 en 0,5 ml de medio sobre cubreobjetos en una placa de 24 pocillos. El medio consistía en el medio de crecimiento normal para células PC12 MR-A/B, pero sin adición de antibióticos. Para cada pocillo a transfectar se disolvieron 20 - 200 pmol de ARNsi en 50 µl de OPTI-MEM®. Además, para cada pocillo se disolvieron 1 -2 µl de LF2000TM en 50 µl de OPTI-MEM® y la solución se incubó durante 5 minutos a TA. Después, el ARNsi disuelto se mezcló con la solución de LF2000TM diluida y se incubó durante 20 minutos a TA para formar los complejos de ADN-LF2000TM, y a continuación se añadieron 100 µl de los complejos directamente a los pocillos correspondientes, que se mezclaron cuidadosamente por agitación. Las células se mantuvieron en cultivo bajo condiciones normales y en el mismo medio durante otras 24 - 72 horas hasta el análisis de la expresión.

Transfección de ARNsi en células de los cultivos primarios de DRG

Para la transfección se utilizaron 5 x 105 células de la suspensión de DRG recién purificada, que se dispusieron en una placa de 24 pocillos sobre cubreobjetos revestidos con poli-L-lisina en 0,5 ml de medio de crecimiento sin adición de antibiótico. Para cada pocillo a transfectar se disolvieron 10 - 200 pmol de ARNsi en 50 µl de OPTI-MEM®. Además, para cada pocillo se disolvieron 1 - 2 µl de LF2000TM en 50 µl de OPTI-MEM® y la solución se incubó durante 5 minutos a TA. Después, el ARNsi disuelto se mezcló con la solución de LF2000TM diluida y se incubó durante 20 minutos a TA para formar los complejos de ADN-LF2000TM, y a continuación se añadieron 100 µl de los complejos directamente a los pocillos correspondientes, que se mezclaron cuidadosamente por agitación. Las células se mantuvieron en cultivo bajo condiciones normales y en el mismo medio durante otras 24 - 72 horas hasta el análisis de la expresión.

Estudio de toxicidad

Para analizar la influencia citotóxica de los reactivos de transfección LF2000TM en las células se llevó a cabo un ensayo con azul de triptano. Para ello, 24 horas antes de la transfección se dispusieron 3,0 x 104 células en una placa de 24 pocillos. La transfección se llevó a cabo con controles ARNsinegativos y diferentes cantidades de reactivos de transfección. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, todas las células se lavaron con PBS y se tiñeron con un 10% de azul de triptano. La tasa de supervivencia se calculó de la siguiente manera:

Tasa de vitalidad = (cantidad total de células - cantidad de células teñidas) / cantidad total de células x 100.

Fijación de las células

Las células se fijaron bien con paraformaldehído al 3 - 4% (v/v) en PBS durante 20 minutos a TA, bien con metanol (-20ºC) durante 15 minutos a TA.

2.4 Microbiología

Para la amplificación de los fragmentos de ADN de doble hebra se utilizaron bacterias competentes. Para ello, el ADN a amplificar se incorporó en plásmidos con marcadores de selección y se transformó en bacterias. Las bacterias se dispusieron sobre placas de agar selectivas, se tomaron los clones correspondientes y se cultivaron en medio LB conteniendo antibiótico. Más adelante se aislaron los plásmidos con inserción de las bacterias reproducidas y se continuó su procesamiento.

Preparación de células competentes para transformación

Un tratamiento con solución helada de cloruro de calcio y magnesio capacita a las bacterias para la absorción espontánea de ADN extraño (transformación). Para preparar las células bacterianas competentes se utilizaron las cepas de E. coli DH5  o XL-1 blue. Para ello se realizó un cultivo de las células en medio TYM (medio LB + MgSO4 10 mM) y éste se incubó hasta que se alcanzó una densidad suficiente (OD600nm = 0,4 - 0,6). Las células se debían encontrar en la fase log. Después de centrifugación breve y de desechar el sobrenadante, la pella se resuspendió en 40 ml de tampón Tfb1 (KAc 30 mM, MgCl2 50 mM x 2H2O, KCl 100 mM, CaCl2 10 mM x 2H2O, 15% glicerol) por 100 ml de cultivo. Después de 45 minutos de incubación sobre hielo, las células se pelletizaron de nuevo y se recogieron en 1/10 volumen de tampón Tfb2 (Na-MOPS 10 mM, KCl 10 mM, CaCl2 75 mM x 2H2O, 15% glicerol). Las células competentes se conservaron a -70ºC en partes alícuotas de 100 µl hasta su utilización.

Transformación de E. coli

Las bacterias competentes (aproximadamente 108 clones por µg de ADNplásmido) se mezclaron con ADN-plásmido, se dispusieron sobre hielo durante 45 minutos y se incubaron apenas 1 minuto a 42ºC. Después se añadió medio LB (Sambrook y col., 1989) y la mezcla se incubó bajo agitación durante otros 30 minutos a 37ºC. Las bacterias se aislaron sobre placas de agar selectivas (Sambrook y col., 1989) y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se inocularon cultivos previos (5 ml de medio LB con un antibiótico adecuado) con colonias aisladas y se agitaron durante varias horas a 37ºC. Se inocularon cultivos preparativos (100 ml de LB con un antibiótico adecuado) 1:1.000 con los cultivos previos y se incubaron a lo largo de una noche a 37ºC.

Aislamiento analítico de plásmidos

Para aislar los plásmidos de las bacterias, éstas han de ser sometidas a lisis. A continuación, los plásmidos se separan de las proteínas y el ADN bacteriano genómico por centrifugación. La purificación de los plásmidos se llevó a cabo por cromatografía en columna con kits de QIAGEN comerciales.

Las bacterias se pelletizaron por centrifugación durante 5 minutos a 5.000 x g, el sobrenadante se desechó y la pella se resuspendió en 250 µl de tampón P1. Las bacterias se sometieron a lisis mediante la adición de 250 µl de tampón P2 y la solución se neutralizó mediante la adición de otros 350 µl de tampón N3. A continuación, la mezcla se centrifugó durante otros 10 minutos (siempre que no se indique otra cosa, los pasos de centrifugación se llevaron a cabo a velocidad máxima), el sobrenadante se retiró con cuidado y se trasladó a una columna QIAprep. Después de 1 minuto de centrifugación, la columna se lavó con 750 µl de tampón PE y de nuevo se llevó a cabo una centrifugación de 1 minuto. La elución del ADN-plásmido en un recipiente colector limpio se llevó a cabo mediante adición de 30 - 50 µl de H2O a la columna y centrifugación final durante 1 minuto. Una cantidad de 5 a 10 µl de esta carga se analizó mediante digestión de restricción y electroforesis subsiguiente en gel de agarosa para el control de calidad.

Aislamiento cuantitativo de plásmidos

Con ayuda del Qiagen Plasmid Maxi Kit se aislaron cantidades mayores de ADN plásmido con un alto grado de pureza para la realización de transfecciones. Durante el día se preparó un cultivo previo, es decir, una colonia bacteriana se inoculó en 3 ml de medio LB conteniendo ampicilina y se cultivó durante aproximadamente siete horas en la incubadora de agitación a 37ºC. Este cultivo previo se trasladó después a 500 ml de medio LB y la mezcla se agitó durante una noche a 37ºC. A la mañana siguiente, la suspensión bacteriana se centrifugó a 4ºC a una velocidad de 3.000 r.p.m. La pella bacteriana resultante se utilizó para el aislamiento de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de recoger la pella de ADN en H2O estéril se determinó la concentración por fotometría y la calidad del ADN se comprobó mediante digestión de restricción y electroforesis subsiguiente en gel de agarosa.

2.5 Métodos biológicos moleculares

2.5.1 Ácidos nucleicos

Purificación de ADN

Con el fin de enriquecer los ácidos nucleicos de soluciones acuosas diluidas o para limpiarlos de sustancias no precipitables se puede llevar a cabo una salificación y precipitación subsiguiente en alcohol o una purificación en columnas de gel de sílice (QIAGEN). Una ventaja del primer método consiste por ejemplo en la posibilidad de concentrar los ácidos nucleicos en la recogida en el producto de elución después del secado. Una ventaja de la purificación mediante columnas consiste en la facilidad de manejo.

Precipitación de ADN

A la solución de ADN se añadió una mezcla 1/10 en volumen de acetato de sodio 3M (pH 5,2) y 3 volúmenes de etanol 100% y se conservó a -20ºC durante al menos 4 horas. A continuación, la mezcla se centrifugó a -4ºC a

13.000 x g durante 30 minutos, el sobrenadante se desechó y la pella se resuspendió mediante adición de 500 µl de etanol 70% (-20ºC). Después de otro paso de centrifugación durante 10 minutos (10 minutos, 13.000 x g, 4ºC), el sobrenadante se desechó y la pella se secó durante 10 minutos en la trampa fría previamente enfriada y finalmente se disolvió en una cantidad correspondiente de agua.

Purificación del ADN amplificado por PCR con el QIAGEN PCR Purification Kit

La mezcla de PCR se diluyó en 5 volúmenes de tampón PB y después de entremezclar a fondo esta combinación se trasladó a la columna y se centrifugó durante 1 minuto. En la columna se introdujeron 500 µl de tampón de lavado PE y de nuevo se llevó a cabo una centrifugación. Los productos de amplificación de ADN ligados se sometieron a elución en un recipiente colector limpio mediante adición de 30 - 50 µl de agua en la columna y centrifugación.

Purificación de ácidos nucleicos a partir de geles de agarosa con el QIAGEN Gel Extraction Kit

La banda de gel de agarosa con el ácido nucleico a aislar se recortó y se pesó y se añadió una cantidad correspondiente de tampón QX1 (3 volúmenes del peso del gel). El gel se disolvió con 10 minutos de incubación a 50ºC y la solución se trasladó a una columna y se centrifugó. Después de una adición de 750 µl de tampón de lavado PE y centrifugación subsiguiente, el ácido nucleico ligado se sometió a elución en un recipiente colector limpio mediante adición de 30 - 50 µl de agua en la columna y centrifugación posterior.

Aislamiento y purificación de ARN

Para los análisis de expresión mediante RT-PCR se extrajo ARN de tejidos o de células. La extracción se llevó a cabo mediante el método de TRIzol-cloroformo con kits de aislamiento de ARN correspondientes de QIAGEN

o de Roche.

Extracción del ARN mediante reactivo TRIzol

En el caso de la purificación de ARN de tejido, los fragmentos de tejido (< 100 mg) se pesaron y, después de añadir 1 ml de reactivo TRIzol, se homogeneizaron con un Glaspotter. En el caso de la purificación de ARN de células cultivadas se añadió 1 ml de reactivo TRIzol para placas de cultivo monocapa de 3,5 cm2 o 1 ml de reactivo TRIzol para cultivo en suspensión centrifugada (5 - 10 x 106 células) directamente sobre las células y la mezcla se homogeneizó recogiéndola y soltándola con la pipeta. La mezcla de TRIzol se incubó durante aproximadamente 5 minutos a TA. Después de añadir 20 µl de cloroformo, la mezcla se agitó intensamente, se incubó durante otros 5 minutos y finalmente se centrifugó (20 minutos, 12.000 x g, 4ºC), con lo que se formaron tres fases: (a) ARN en la fase acuosa superior, (b) ADN en la interfase media y

(c) proteína en la fase orgánica inferior.

La fase acuosa se retiró con cuidado, sin tocar la interfase, y se mezcló con 100 µl de isopropanol al 100%. Después de un breve tratamiento en Vortex se llevó a cabo una incubación durante 10 minutos y a continuación una centrifugación (10 minutos, 16.000 x g, 4ºC). El sobrenadante se desechó y la pella se lavó con 1 ml de etanol 70% (-20ºC) y se pelletizó de nuevo (10 minutos, 12.000 x g, 4ºC). El sobrenadante se desechó y la pella se secó en la trampa fría previamente enfriada. Por último, el ARN se disolvió en un volumen cualquiera de agua y se conservó a -80ºC.

Extracción de ARN mediante el QIAGEN RNeasy Mini Kit

A la pella celular (aproximadamente 5 x 106 células) se añadieron 350 µl de tampón RLT y la pella celular se homogeneizó en columnas QIAGEN Shredder. Después de añadir 350 µl de etanol 70% y agitar la suspensión intensamente, ésta se trasladó a la columna y se centrifugó (30 segundos a

8.000 x g). El lavado de la columna se llevó a cabo por adición de 700 µl de tampón RW1 y centrifugación (30 segundos a 8.000 x g). A continuación se realizaron dos lavados por adición de 500 µl de tampón RPE en cada caso y una centrifugación (30 segundos, 8.000 x g). Luego se secó la columna por centrifugación (2 minutos, 12.000 r.p.m.). El ARN ligado se sometió a elución mediante adición de 30 - 50 µl de agua y centrifugación (1 minutos a 8.000 x g).

Tratamiento con ADNasa-I

Para excluir la posibilidad de que el ARN purificado estuviera contaminado con ADN, la solución de ARN se trató enzimáticamente con ADNasa-I. Para ello, 50 µl de ARN se mezclaron con 4 µl de ADNasa-I y 6 µl de 10x tampón de transcripción y la mezcla se incubó durante 30 - 45 minutos a 37ºC. A continuación se llevó a cabo una purificación del ARN mediante columnas QIAGEN RNeasy Mini.

Digestión de restricción

La digestión por restricción sirve para comprobar si un plásmido también contiene la inserción deseada. Ésta se puede separar mediante la digestión y se puede identificar en función de su tamaño. Las digestiones de restricción se llevaron a cabo con enzimas y tampones de reacción de las firmas GibcoBRL/Eggenstein y Boehringer/Mannheim. Para ello, 1 µg de ADN plásmido se digirió en un volumen total de 20 µl. El tiempo de incubación fue de 1 a 2 horas a una temperatura correspondiente a la temperatura óptima de la enzima.

Cuantificación de los ácidos nucleicos

El registro de la concentración se llevó a cabo mediante un espectrofotómetro de UV. La concentración se calculó a partir de la absorción a una longitud de onda I específica (260 nm para ARN, oligonucleótidos y ADN).

A = d x e x c (A = absorción; d = espesor de capa; e = constante de materia; c = concentración).

Una OD260 igual a 1 corresponde a una concentración de 50 µg/ml de ADN, 40 µg/ml de ARN o 30 µg/ml de oligonucleótido. La medición se realizó en cubetas de cuarzo, que entre una medición y otra se lavaron a fondo con agua pasada por el autoclave.

Modelos de ADN-oligonucleótido para la preparación de ARNsi

Los modelos de oligonucleótido (ONV) se diluyeron en agua libre de nucleasas hasta una concentración final 200 µM y se midió la absorción A a 260 nm de una dilución 1:250. Con ayuda de la absorción medida se calcula la concentración de ONV B en µg/ml y B’ en µM:

A x 5.000 = B [µg/ml]

(5.000 = dilución en un factor 250 x 20 µg de oligo / ml / unidad de absorción) B [µg/ml] / 9,7 = B’ [µM] (29 nt x 0,333 µg/nmol para cada nt = 9,7 µg/nmol)

ARNsi

Para cuantificar las soluciones de ARNsi se midió la absorción A a 260 nm de una dilución 1:25. Con ayuda de la absorción medida se calcula la concentración de ARNsi B en µg/ml y B’ en µM:

A x 1.000 = B [µg/ml]

(1.000 = dilución en un factor 25 x 40 µg de ARNsi / ml / unidad de absorción) B [µg/ml] / 14 = B’ [µM] (21 nt x 2 cadenas = 42 nt x 0,333 µg/nmol para cada nt = 14 µg/nmol)

Control de calidad mediante electroforesis en gel de agarosa

Para la separación del ADN plásmido, el ADN plásmido digerido por restricción, los productos de PCR y ARN se utilizaron geles de agarosa TAE al 1

- 2 por ciento con 0,5 µg/ml bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en 1x tampón TAE (véase 2.1.3). Las muestras y 1 µg de marcadores de tamaño (“escalera de ADN 100 pb” “escalera de ADN 1 kb”) se mezclaron a 1/6 con un volumen de tampón de muestra y se separaron a 10 v/cm. Mediante el colorante intercalador bromuro de etidio, el ADN o ARN se hizo visible a la luz UV y se pudo documentar fotográficamente. Para evitar la degeneración durante la electroforesis de ARN, en primer lugar le limpió con etanol tanto la cámara como el peine, y se preparó tampón de carrera fresco con DEPC-H2O pasado por autoclave.

2.5.2 Reacción en cadena de polimerasa por transcripción inversa (RTPCR)

En la transcripción inversa se realiza una transcripción de ARN en ADNc. Como lugar de aplicación de la transcriptasa inversa se utilizan por ejemplo cebadores oligo(dT)15 - 18, que se unen específicamente a la cola poli-A del ARNm. Dependiendo del material de partida se mezclaron 0,5 - 2,5 µg de ARN (disueltos en 11 µl de agua) con 1 µl de oligo(dT)15 - 18 100 nM y la mezcla se desnaturalizó durante 10 minutos a 70ºC. Después de enfriar a 4ºC, se llevó a cabo una adición de 4 µl tampón 5x RT, 2 µl DTT 2 µl, 1 µl mezcla dNTP 10 mM, 1 µl ARNsin y 1 µl SuperscriptTM II (200 u/µl) y una incubación a 42ºC durante 1 hora. El ADNc se conservó a -20ºC hasta su uso.

2.5.3 Reacción en cadena de la polimerasa

Con la reacción en cadena de polimerasa (PCR), desarrollada en 1987, es posible realizar enzimáticamente in vitro millones de copias de determinadas secuencias de nucleótidos (Saiki y col., 1988). Este proceso, denominado amplificación, también permite analizar cantidades muy pequeñas de ADN. Para una reacción de PCR se preparó la siguiente carga de reacción:

10x tampón: 2,5 µl (1x)

MgCl2 (25 mM): 3 µl (3 mM)

dNTPs (10 mM): 0,5 µl (0,2 mM)

Mezcla de cebadores (2 µm): 5 µl (0,4 µM)

ADNc/ARN: 1 µl

Ampli-Taq polimerasa (5 u/µl): 0,1 µl (0,5 U)

H2O: 12,9 µl

La concentración óptima de MgCl2 y la cantidad de ciclos de amplificación se determinaron individualmente para cada par de cebadores (la secuencia, la posición y el tamaño de cada amplímero están presentados bajo (0)). Antes de comenzar se llevó a cabo una desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto y cada paso individual de un ciclo duró 20 segundos. Se utilizó el Thermozykler PTC

200 (MJ REsearch). PCR estándar: 95ºC 2 minutos 95ºC 30 segundos

10 57ºC 30 segundos 70ºC 30 segundos 70ºC 5 minutos

+4ºC 

2.5.4 Ligación

40 x

15 Las ligaciones se realizaron con la T4 ADN ligasa (Promega). La T4 ADN ligasa es una enzima que une entre sí los extremos 3’ y 5’ de ADN lineal de forma covalente dependiente de la energía (ATP). En el caso de los salientes con extremos cohesivos (‘cohesive-ended’) se consume mucha menos energía que en los salientes con extremos romos (‘blunt-ended’). Por ello, en el caso de

20 los extremos cohesivos se realizó la ligación durante 1 hora a temperatura ambiente; en cambio, en los productos de PCR o ADN sin salientes se realizó la ligación durante una noche a 4ºC. Como plásmido se utilizó el vector pGEM-T.

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Zhuo, M. (2001). No pain, no gains. SclentificWorldJournal 1, 204-206.

Tabla de concordancias

SEQ ID NO:: Soporte

1-9: p.6 y p. 7

10-13: p.9

14-51: Figura 26

52-69: p. 12

70-72: p. 17

73-83: p. 36

84: p.37

85: p. 18

86-87: p. 18 y p. 48

88-91: p. 48

92-101: p. 56

102-103: p. 57

104: Figura 5

105: Figura 6

106: Figura 7

107: Figura 27a

108: Figura 27b

109: Figura 27c

110: Reivindicación 21

111: Reivindicación 22

112: Reivindicación 22

Listado de secuencias

<110> Grünenthal GmbH

<120> Compuestos de ARNds específicos de VGLUT <130> GR01P011WO

5: <160> 112

<170> PatentIn version 3.1

10: <210> 1 <211> 17 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

15: <223>ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23) <220> de forma preferente

20: <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 1

nnnnnnnnnn nnnnnnn: 17

25: <210> 2 <211> 18 <212> ARN <213> Secuencia artificial

30: <220>

5: <223>ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros de forma preferente

10: <400> 2

nnnnnnnnnn nnnnnnnn: 18

15: <210> 3 <211> 19 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

<223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción).

Listado de secuencias

<110> Grünenthal GmbH

<120> Compuestos de ARNds específicos de VGLUT <130> GR01P011WO

5: <160> 112

<170> PatentIn version 3.1

10: <210> 1 <211> 17 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

15: <223>ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23) de forma preferente

20: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 1

nnnnnnnnnn nnnnnnn: 17

25

<210> 2 <211> 18 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

<223>ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción).

5: Estructura general: N(17-25), preferentemente especialmente preferente N(19-24), de forma N(21-23) N(19-25), aún más de forma preferente

10: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 2

nnnnnnnnnn nnnnnnnn: 18

15: <210> 3 <211> 19 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

20: <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción).

Estructura general: N(17-25), preferentemente especialmente preferente N(19-24), de forma N(21-23): N(19-25), aún más de forma preferente

25: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 3

30: nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 4 <211> 20 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220> <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción).

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 4 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn: 20

<210> 5 <211> 21 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220> <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción).

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 5

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n: 21

5: <210> 6 <211> 22 <212> ARN <213> Secuencia artificial

10: <220> <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23) de forma preferente

15: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

20: <400> 6 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22

25: <210> 7 <211> 23 <212> ARN <213> Secuencia artificial

30: <220> <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23) de forma preferente

35: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 7 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnn: 23

<210> 8 <211> 24 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220> <223> ARNds según la invención (pp. 6 y 9 de la descripción). Estructura general: N(17-25), preferentemente N(19-25), especialmente preferente N(19-24), de forma aún más N(21-23): de forma preferente

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 8 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn: 24

<210> 9 <211> 25 <212> ARN <213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (25)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 9 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

<210> 10

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Motivo de secuencia de un ARNds de VGLUT preferente según la invención (p. 9 de la descripción). El motivo de secuencia es AAN(19)TT

<220>

<221> misc_feature

<222> (3) .. (21)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 10 aannnnnnnn nnnnnnnnnn ntt 23

<210> 11

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Motivo de secuencia de un ARNds de VGLUT preferente según la invención (p. 9 de la descripción). El motivo de secuencia es NAN(19)NN.

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 11 nannnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 23

<210> 12

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Motivo de secuencia de un ARNds de VGLUT preferente según la invención (p. 9 de la descripción). El motivo de secuencia es NARN(17)YNN.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros; y = c o t; r = a o g

<400> 12 narnnnnnnn nnnnnnnnnn ynn 23

<210> 13

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Motivo de secuencia de un ARNds de VGLUT preferente según la invención (p. 9 de la descripción). El motivo de secuencia es NANN(17)YNN.

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23) <223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros; y = c o t.

<400> 13 nannnnnnnn nnnnnnnnnn ynn: 23

<210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una secuencia de ADN diana de VGLUT1 (Figura 26).

<400> 14 aacgtgcgca agttgatgaa c: 21

<210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1) .. (21) <223> Una secuencia de ADN diana de VGLUT1 (Figura 26).

<400> 15

aagttgatga actgcggagg c: 21

<210> 16 <211> 21

<212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una secuencia de ADN diana de VGLUT2 (Figura 26).

<400> 16 aatgccttta gctggcattc t: 21

<210> 17 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT2 (Figura 26).

<400> 17 aatggtctgg tacatgtttt g: 21

<210> 18 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 18

aaagtcctgc aaagcatcct a: 21

<210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 19 aagtcctgca aagcatccta c: 21

<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 20 aagaacgtag gtacatagaa g: 21

<210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT2 (Figura 26).

<400> 21 aattgttgca aacttctgca g: 21

<210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 22

aaattagcaa ggttggtatg c: 21

<210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 23 aattagcaag gttggtatgc t: 21

<210> 24

<211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 24 aaggttggta tgctatctgc t: 21

<210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 25

aagcaagcag attctttcaa c: 21

<210> 26 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 26 aaccacttgg atatcgctcc a: 21

<210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 27 aa tgggcatt tcgaatggtg t: 21

<210> 28 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 28 aataagtcac gtgaagagtg g: 21

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 29 aagtcacgt g aagagtggca g: 21

<210> 30 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 30 aagagtggca gtatgtcttc c: 21

<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 31 aatatttgcc tcaggagaga a: 21

<210> 32 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 32 aagtcttatg gtgccacaac a: 21

<210> 33 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 33 aatggaggtt ggcctagtgg t: 21

<210> 34 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 34 aagactcaca tagctataag g: 21

5: <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

10: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT3 (Figura 26).

15: <400> 35 aatcttggag ttgccattgt g 21

20: <210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

25: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT3 (Figura 26).

<400> 36 aaccggaaat tcagacagca c: 21

30: <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

35: <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT3 (Figura 26).

<400> 37 aaacagtggg ccttatccat g: 21

<210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT3 (Figura 26).

<400> 38 aattccaggt ggtttcattt c: 21

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 39 aacatcgact ctgaacatgt t: 21

<210> 40

<211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 40 aaggtttagt ggagggtgtg a: 21

<210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 41 aagaggtctt tggatttgca a: 21

<210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 42 aataagtaag gtgggtctct t: 21

<210> 43 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 43 aagtaaggtg ggtctcttgt c: 21

<210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 44 aaggtgggtc tcttgtcagc a: 21

<210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 45 aatcgttgta cctattggag g: 21

<210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 46 aagacccgtg aagaatggca g: 21

<210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 47 aagaatggca gaatgtgttc c: 21

<210> 48 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 48 aatcattgac caggacgaat t: 21

<210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 49 aactcaacca tgagagtttt g: 21

<210> 50 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<400> 50 aaagaagatg tcttatggag c 21

<210> 51 5 <211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Una de las secuencias de ADN diana de VGLUT3 (Figura 26).

<400> 51 15 aagagctgac atcctaccag a 21

<210> 52

<211> 17

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de un ARNds cuya secuencia diana presenta en el extremo 5’

la sucesión de nucleótidos AA (p. 12 de la descripción). 25 Motivo de secuencia 5’AAN(15-23)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(17)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros.

30

<400> 52 aannnnnnnn nnnnnnn 17

<210> 53

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de un ARNds cuya secuencia diana presenta en el extremo 5’ la sucesión de nucleótidos AA (p. 12 de la descripción). Motivo de secuencia 5’AAN(15-23)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(18)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros.

<400> 53 aannnnnnnn nnnnnnnn 18

<210> 54

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(19)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros.

<400> 54 aannnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 55

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(20)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 55 aannnnnnnn nnnnnnnnnn 20

<210> 56

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de un ARNds cuya secuencia diana presenta en el extremo 5’ la sucesión de nucleótidos AA (p. 12 de la descripción). Motivo de secuencia 5’AAN (15-23)

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(21)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 56 aannnnnnnn nnnnnnnnnn n 21

<210> 57

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(22)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 57 aannnnnnnn nnnnnnnnnn nn 22

<210> 58

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(23)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 58 aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnn 23

<210> 59

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(24)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 59 aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 60

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(25)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 60 aannnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

<210> 61

<211> 17

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de un ARNds cuya secuencia diana presenta en el extremo 3’ la sucesión de nucleótidos TT (p. 12 de la descripción). Motivo de secuencia 3’TTN(15-23)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(15)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 61 nnnnnnnnnn nnnnntt 17

<210> 62

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 62 nnnnnnnnnn nnnnnntt 18

<210> 63

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 63 nnnnnnnnnn nnnnnnntt 19

<210> 64

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 64 nnnnnnnnnn nnnnnnnntt 20

<210> 65

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 65 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt t 21

<210> 66

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 66 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tt 22

<210> 67

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 67 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntt 23

<210> 68

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 68 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntt 24

<210> 69

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(23)

<223> n = a, t/u, g, c, desconocido u otros

<400> 69 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntt 25

<210> 70

<211> 21

<212> ARN

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Secuencia diana del ARNm de VGLUT2 (p. 17 de la descripción).

<400> 70 aaggcuccgc uaugcgacug u 21

<210> 71

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Cadena sentido del ARNds dirigido contra la secuencia diana arriba indicada del ARNm de VGLUT2 de rata (con un TT saliente en el extremo 3’) (p. 17 de la descripción).

<400> 71 ggcuccgcua ugcgacugut t 21

<210> 72

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena antisentido del ARNds dirigido contra la secuencia diana arriba indicada del ARNm de VGLUT2 de rata (con un TT saliente en el extremo 3’) (p. 17 de la descripción).

<400> 72 acagucgcau agcggagcct t 21

<210> 73

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT1 739-759 EGT (p. 36 de la descripción).

<400> 73 agcgccaagc ucaugaacct t 21

<210> 74

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT1 739-759 EGT (p. 36 de la descripción)

<400> 74 gguucaugag cuuggcgcut t 21

<210> 75

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT2 100-120 EGT (ARNsi activo) (p. 36 de la descripción)

<400> 75 gcaggauaac cgagagacct t 21

<210> 76

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT2 100-120 EGT (ARNsi activo) (p. 36 de la descripción)

<400> 76 ggucucucgg uuauccugct t 21

<210> 77

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT3 220-240 EGT (p. 36 de la descripción)

<400> 77 gcgguacauc aucgcuguct t 21

<210> 78

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT3 220-240 EGT (p. 36 de la descripción)

<400> 78 gacagcgaug auguaccgct t 21

<210> 79

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-VGLUT2 MM EGT (ARNsi de control) (p. 36 de la descripción)

<400> 79 ggacuagcaa agcgagccat t 21

<210> 80

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-VGLUT2 MM EGT (ARNsi de control) (p. 36 de la descripción)

<400> 80 uggcucgcuu ugcuagucct t 21

<210> 81

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT2 100-120 AMB (ARNsi activo) (p. 36 de la descripción)

<400> 81 gcaggauaac cgagagacct t 21

<210> 82

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> si-rVGLUT2 100-120 AMB (ARNsi activo) (p. 36 de la descripción)

<400> 82 ggucucucgg uuauccugct t 21

<210> 83

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> si-rVGLUT2 166-186 AMB (p. 36 de la descripción)

<400> 83 ggcuccgcua ugcgacugut t: 21

<210> 84 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> si-rVGLUT2 166-186 AMB (p. 37 de la descripción)

<400> 84 acagucgcau agcggagcct t: 21

<210> 85 <211> 21 <212> ADN <213> Rattus norvegicus

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Secuencia diana de VGLUT2 de rata (p. 18 de la descripción).

<400> 85 aagcaggata accgagagac c: 21

<210> 86

<211> 21

<212> ARN

<213> Rattus norvegicus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> Secuencia diana del ARNm de VGLUT2 de rata (p. 48 de la descripción).

<400> 86 aagcaggaua accgagagac c 21

<210> 87

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena sentido del ARNsi dirigido contra la secuencia diana de VGLUT2 arriba indicada o la secuencia diana de ARNm de VGLUT2 (pp. 18 y 48 de la descripción).

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 87 gcaggauaac cgagagacct t 21

<210> 88

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena antisentido del ARNsi dirigido contra la secuencia diana de VGLUT2 arriba indicada o la secuencia diana de ARNm de VGLUT2 (pp. 18 y 48 de la descripción).

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 88 ggucucucgg uuauccugct t 21

<210> 89

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia diana (no es una secuencia de VGLUT2) del ARNsi de control en el ejemplo de realización 4. (p. 48 de la descripción).

<400> 89 aaggactagc aaagcgagcc a 21

<210> 90

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena sentido del ARNsi de control de doble cadena dirigido contra la secuencia diana arriba indicada (p. 48 de la descripción).

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 90 ggacuagcaa agcgagccat t 21

<210> 91

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena antisentido del ARNsi de control de doble cadena dirigido contra la secuencia diana arriba indicada (p. 48 de la descripción).

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 91 uggcucgcuu ugcuagucct t: 21

<210> 92 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rVGluT1(2_4)F; (p. 56 de la descripción).

<400> 92 tctgggtttc tgcatcagc: 19

<210> 93 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rVGluT1(2_4)R; (p. 56 de la descripción).

<400> 93 ccatgtatga ggccgacagt: 20

<210> 94 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rVGluT2(8_9)F; (p. 56 de la descripción).

<400> 94 aagaccccat ggaggaagtt: 20

<210> 95 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR-Primer: rVGluT2(8_9)R; (p. 56 de la descripción).

<400> 95 attgtcatga ccaggtgtgg: 20

<210> 96 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rVGluT3(4_5)F; (p. 56 de la descripción).

<400> 96 atccagagac ggtgggtctt: 20

<210> 97 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rVGluT3(4_5)R; (p. 56 de la descripción).

<400> 97

atgacacagc cgtaatgcac: 20

<210> 98 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rGAPDH(7_8)F; (p. 56 de la descripción).

<400> 98 atcctgggct acactgagga: 20

<210> 99 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador PCR: rGAPDH(7_8)R; (p. 56 de la descripción).

<400> 99 atgtaggcca tgaggtccac: 20

<210> 100 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador rVGluT2 TS10 as; (p. 56 de la descripción).

<400> 100 aagcaggata accgagagac ccctgtctc: 29

<210> 101 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador rVGluT2 TS10 s; (p. 56 de la descripción).

<400> 101 aaggtctctc ggttatcctg ccctgtctc: 29

<210> 102 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador rVGluT2 TS14 as; (p. 57 de la descripción).

<400> 102 aaggctccgc tatgcgactg tcctgtctc: 29

<210> 103 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> Cebador rVGluT2 TS14 s; (p. 57 de la descripción).

<400> 103 aaacagtcgc atagcggagc ccctgtctc: 29

<210> 104

<211> 1683

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia codificadora de un VGLUIT1 con el número de acceso de banco de genes U07609 (figura 5).

<400> 104

imagen3

<210> 105

<211> 1749

<212> ADN 5 <213> Rattus norvegicus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1749)

10 <223> Secuencia codificadora de VGLUT2; número de acceso de bando de genes NM_053427 (figura 6).

<400> 105

imagen3

<210> 106

<211> 1767 5 <212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia codificadora de un VGLUT3 con el número de acceso de 10 banco de genes AJ491795 (figura 7).

<400> 106 <210> 107

imagen3

<211> 2959 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (1)..(2959)

<223> VGLUT1 (figura 27A)

<400> 107

imagen3

<210> 108

<211> 3946 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (1)..(3946)

<223> VGLUT2 (figura 27B)

<400> 108

imagen3

<210> 109

<211> 3838

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3838)

<223> VGLUT3 (figura 27C)

<400> 109

imagen4

imagen3

<210> 110

<211> 21

<212> ARN

<213> Desconocido

<220>

<223> Secuencia diana de un (ARN)m de un miembro de la familia de los VGLUT complementaria a la secuencia de ARNdc de la invención (reivindicación 21).

<400> 110 aaguguacuu uaggcaaagg g 21

<210> 111

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena sentido del ARNdc complementaria a la secuencia diana arriba indicada (reivindicación 22).

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 111 guguacuuua ggcaaagggt t 21

<210> 112

<211> 21 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cadena antisentido del ARNdc complementaria a la secuencia diana 10 arriba indicada (reivindicación 22).

<220>

<221> misc_feature

<222>: (20)..(20) 15 <223> T = dT (desoxitimidina)

<220>

<221> misc_feature

<222>: (21)..(21) 20 <223> T = dT (desoxitimidina)

<400> 112 cccuuugccu aaaguacact t 21

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Moléculas de ARNsi específicas de VGLUT con una secuencia seleccionada entre
2.

Célula aislada que contiene al menos una molécula de ARNsi según la reivindicación 1, a excepción de células madre embrionarias humanas.
3.

Medicamento que contiene al menos una molécula de ARNsi según la

imagen1

5

reivindicación 1 y/o al menos una célula según la reivindicación 2 y en 10 caso dado también sustancias auxiliares y/o aditivos adecuados.
4.

Sistema de diagnóstico que contiene al menos una molécula de ARNsi según la reivindicación 1 y/o al menos una célula según la reivindicación 2 y en caso dado también aditivos adecuados.
5.

Utilización de al menos una molécula de ARN-si según la reivindicación 1

15 y/o al menos una célula según la reivindicación 2 para la producción de un medicamento o un analgésico para el tratamiento del dolor, en particular del dolor crónico, alodinia táctil, dolor provocado térmicamente y/o dolor inflamatorio.
6. Utilización de al menos una molécula de ARNsi según la reivindicación 1 20 y/o al menos una célula según la reivindicación 2 para la producción de un medicamento para el tratamiento de la incontinencia urinaria, síntomas neurógenos de la vejiga, prurito, tumores, inflamaciones, asma.
7. Molécula de ARNsi según la reivindicación 1 y/o célula según la

reivindicación 2 para su utilización en la terapia genética, preferentemente 5 en la terapia genética in vivo o in vitro.
8. Procedimiento in vitro para la inhibición de la expresión de al menos un miembro de la familia de los VGLUT en una célula, caracterizado porque se introduce una molécula de ARNsi según la reivindicación 1 en dicha célula.

10 9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula de ARNsi se incluye en estructuras micelares, preferentemente liposomas.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 ó 9, caracterizado porque la molécula de ARNsi se incluye en cápsides virales naturales o

15 en cápsides producidas por métodos químicos o enzimáticos o en estructuras derivadas de éstas.