ES2347694T3 - Variantes de la molecula gp130 solubles utiles como medicamento. - Google Patents

Abstract

Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped.

Description

Se describe un polipéptido-dímero formado por dos fragmentos monoméricos idénticos que comprende los dominios 1 a 3 de la parte extracelular (soluble) de la glicoproteína (gp) 130 y un espaciador polipéptido concreto, unidos covalentemente entre sí, y que supone ventajas significativas respecto a su tasa de producción en células huésped, su purificación mejorada y su potencial para unirse a complejos IL-6/receptor IL-6 soluble. Además, se describe

una

composición farmacéutica que contiene dicha molécula

dimérica y diversos usos médicos.

La

citoquina pleiotrópica interleuquina-6 (IL-6)

muestra un amplio espectro de funciones biológicas entre las cuales las más notables son la estimulación de las células B y T, el control de los procesos inmunitarios adquiridos e innatos y la inducción de la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado. La IL-6 ejerce su actividad a través de un receptor IL-6 unido a membrana o soluble (“IL-6R” o “gp80”) el cual tras la unión induce la dimerización de la gp130 para desencadenar respuestas celulares.

Dado que el domino citoplasmático de IL-6R carece de actividad quinasa, la señalización por el homodímero gp130 puede ser inducida por la IL-6 unida al IL-6R unido a membrana o soluble. Mientras que gp130 puede hallarse en prácticamente todos los tipos celulares, la expresión de

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IL-6R está restringida a los hepatocitos y leucocitos. Sin embargo, las células pueden ser activadas por IL-6 a través de sIL-6R el cual es liberado desde las células que expresan IL-6R ya sea mediante escisión proteolítica o mediante corte y empalme (splicing) alternativo. Este mecanismo se denomina trans-señalización. De hecho, se ha demostrado que diversas

actividades

celulares son dependientes del complejo de

sIL-6R más IL-6 y no son inducibles por la IL-6 sola.

La

trans-señalización juega un papel clave en la

transición

de las respuestas inmunitarias innatas a las

adquiridas

y es crucial para el aclaramiento de los

infiltrados neutrofílicos y el reclutamiento y activación de células T y B para una respuesta inmunitaria mantenida. La alteración de la regulación de este mecanismo conlleva el desarrollo y persistencia de enfermedades alérgicas inflamatorias y/o crónicas tales como la enfermedad de Crohn, la artritis reumatoide, el asma y otras.

Para el tratamiento de estas enfermedades, se ha demostrado que el bloqueo específico de los procesos mediados por IL-6 es terapéuticamente efectivo. Desafortunadamente, todos los compuestos disponibles en la actualidad para este fin hasta el momento tienen el problema de provocar efectos secundarios graves en parte (por ejemplo infecciones secundarias, tuberculosis, sepsis), toxicidad o inmunogenicidad. Adicionalmente, también se han observado dificultades indisolubles durante el desarrollo de un procedimiento de purificación útil y económico.

La solución de estos problemas técnicos se consigue

mediante las realizaciones caracterizadas en las

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reivindicaciones. En el transcurso de los experimentos que han dado lugar a la presente invención, se observó que la purificación del compuesto original sgp130F que comprende dos moléculas de la parte extracelular completa de gp130 era insatisfactoria. Esta proteína de fusión, si se expresa en células eucariotas CHO tiende a formar productos secundarios indeseables tales como ciertos fragmentos más pequeños, oligómeros y agregados en combinaciones diversas. No fue posible hallar ningún tipo de método de purificación que fuera adecuado para separar el compuesto diana de estas impurezas en cantidades adecuadas debido a las propiedades físicas y químicas muy similares entre las impurezas y el

producto

de interés. Entre los métodos analizados se

incluyeron diferentes

cromatografías de afinidad, de

exclusión

de tamaño y de intercambio iónico, estrategias

para cambiar la solubilidad de la proteína mediante suplementación iónica o cambios en el pH y otros. Ninguno de estos métodos dio resultados satisfactorios o fue adecuado para ser realizado a mayor escala para desarrollar un proceso de purificación que cumpliera con las buenas prácticas de fabricación (GMP). Por el contrario, se observó que una variante más corta de la molécula original sgp130Fc, denominada sgp130(D1-3)Fc, que carece de los dominios extracelulares 4 a 6 era separable de los productos secundarios contaminantes. Ello indicaba que los elementos formadores de agregados con los dominios de fibronectina III (dominios 4 a 6) de la molécula original sgp130Fc se habían eliminado con éxito. Además, esta molécula se expresó por

células eucariotas a niveles considerablemente más elevados.

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En la siguiente etapa se optimizó la eficiencia de unión a IL-6/sIL-6R de la nueva molécula sgp130(D1-3)Fc mediante la fusión de espaciadores polipéptidos de diferente longitud entre sgp130(D1-3) y la parte IgG-Fc. La capacidad de unión de las moléculas resultantes se determinó mediante ensayos de enzimoinmunoanálisis (ELISA) específicos y se comparó con la molécula original sgp130Fc (Figura 5).

Se ha demostrado que la unión de los complejos IL-6/sIL-6R inhibe el efecto anti-apoptótico de IL-6 sobre los monolitos en pacientes con enfermedad de Crohn indicando que dicho compuesto es útil para el tratamiento de dicha enfermedad y de enfermedades relacionadas tales como la colitis, la artritis reumatoide, la psoriasis, la peritonitis y otras.

La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflamatoria crónica de todo el tracto gastrointestinal caracterizada por recidivas frecuentes de inflamación aguda. La inflamación asociada con infección, lesión y otros factores induce rápidamente una reacción de fase aguda (APR) acompañada de la expresión de proteínas de fase aguda (APPs). La APR provoca principalmente un aumento de la permeabilidad vascular y fiebre. Los miembros de la familia de la IL-6 incrementan la expresión de los genes APP de tipo II que está mediada por la (STAT3). La potente activación de STAT3 (es decir fosforilación de tirosina) se ha descrito en tejido de colon de pacientes con enfermedades intestinales inflamatorias (IBD). Además, se ha observado una disminución

-/

de la actividad STAT3 en ratones IL-6 asociada a una

disminución del desarrollo de colitis de ratón experimental

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(Suzuki y otros, J. Exp. Med 2001, 193:471). Esto experimentos indican que la activación de STAT3 mediada por IL-6/sIL-6R juega un papel clave en el desarrollo y perpetuación de la colitis. En otro modelo inflamatorio, la artritis reumatoide (RA), se ha demostrado que STAT3 es importante para la supervivencia de los fibroblastos sinoviales de la RA (Krause y otros, J. Immunol, 2002, 169:6610). Por ello se ha sugerido que STAT3 puede ser una buena diana para la terapia génica. También se conoce que la activación constitucional de STAT3 es un factor “causante de cáncer” y se acompaña de un incremento de proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 y Bcl-XL (Turkson y otros, Oncogene, 2000, 19:6613).

Se ha observado que la activación de STAT3 mediada por IL-6/sIL-6R es reducida significativamente por sgp130(D1-3)Fc con un nivel de eficacia comparable al del compuesto original sgp130Fc. Además, sgp130(D1-3)Fc (sgp130Var) se expresa en células eucariotas en cantidades más elevadas que sgp130Fc, genera menos productos secundarios no deseados y es separable de las impurezas residuales mediante cromatografía en columna estándar. Estas ventajas mejoran de forma significativa el desarrollo de procedimientos de producción acordes con las GMP y disminuye el coste de los productos.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Dibujo esquemático de las moléculas

sgp130(D1-D3)Sn

Las variantes sgp130(D1-D3)Sn se generaron mediante deleción de los dominios D4 a D6 de la molécula original

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sgp130Fc y su substitución por un espaciador polipéptido de longitud diversa (Sn). La “n” indica el número de repeticiones dentro de la región del espaciador. A continuación la molécula se dimeriza covalentemente ya sea mediante un fragmento IgG-Fc (panel superior) para construir sgp130(D1-D3)Sn-Fc o (panel inferior) mediante fusión adicional con un elemento conector artificial o natural que confiere uniones covalentes, por ejemplo mediante la formación de puentes disulfuro, interacciones químicas u otros (sgp130(D1-D3)Sn-L). Además, estas moléculas pueden contener etiquetas para la purificación y/u otros fines de detección.

Figura 2: Expresión de sgp130(D1-D3)Sn en células CHO

Se muestra como ejemplo de la expresión de sgp130(D1-D3)Sn la correspondiente a sgp130(D1-D3)S1-Fc. Se transfectó transitoriamente el constructo correspondiente (pDEST40_sgp130(D1-D3)S1-Fc) en células CHO. En paralelo, otro grupo de células CHO se transfectó con un constructo que comprendía la sgp130Fc original. Las células se incubaron durante 24 horas, se recogió el sobrenadante y se inmunoprecipitaron las proteínas de fusión sgp130. Finalmente se analizaron los precipitados mediante SDS-PAGE y se detectaron utilizando un anticuerpo IgG anti-humano según los procedimientos de transferencia Western estándar.

Figura 3: Purificación de las moléculas de fusión

sgp130Fc

Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) de sgp130Fc. El panel superior muestra el perfil de elución (cromatograma) derivado durante la filtración en gel por

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rastreo UV. Los paneles medio e inferior representan el análisis de las fracciones recolectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y

tinción

con coomassie (COOM) o argéntica según

procedimientos estándar.

Figura

4: Purificación de moléculas de fusión

sgp130(D1-D3)-Fc

(A)

Se muestra como ejemplo de la purificación de las moléculas sgp130(D1-D3)Sn-Fc mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) la correspondiente a sgp130(D1-D3)S1-Fc. El panel superior muestra el perfil de elución (cromatograma) derivado durante la filtración en gel mediante rastreo UV. Los paneles medio e inferior representan el análisis de las fracciones recolectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE) y tinción con coomassie (COOM) o argéntica según procedimientos estándar.

(B)

La comparación de los cromatogramas de elución de las SEC de variantes con espaciadores (GGGGS)n muestra las propiedades de purificación óptimas con un espaciador de longitud n = 3 que no se correlaciona con un incremento continuo de la actividad biológica (ver diagrama a continuación y figura 5).

Figura 5: Unión específica de los complejos

IL-6/sIL-6R por moléculas sgp130(D1-D3)Sn-Fc

Se recubrieron placas de 96 pocillos con moléculas sgp130(D1-D3)Sn-Fc purificadas (con n = 0 a 3) y se incubaron con cantidades crecientes de IL-6 + receptor de

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IL-6 soluble (sIL-6R) recombinante. Los complejos IL-6/sIL-6R unidos se detectaron utilizando un anticuerpo anti-IL-6R de ratón y un anticuerpo IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (□,•, ■, ▲). En paralelo se analizó la molécula sgp130Fc original (♦).

Figura 6: Dibujo esquemático de un ensayo para detectar anticuerpos que se unen a sgp130(D1-D3)Sn-Fc

(A) sgp130(D1-D3)Sn-Fc fijada a una matriz sólida se incuba con una mezcla de anticuerpos (por ejemplo, los contenidos en muestras de suero) marcados previamente (por ejemplo, con colorantes fluorescentes). Los anticuerpos no unidos se lavan y se detectan las moléculas con unión específica mediante tecnologías de última generación. (B) sgp130(D1-D3)Sn-Fc fijada a una matriz sólida se incuba con una mezcla de anticuerpos (por ejemplo, los contenidos en muestras de suero). Los anticuerpos no unidos se lavan y los complejos sgp130(D1-D3)Sn-Fc / anticuerpo remanentes se incuban a continuación con una cantidad determinada de sgp130(D1-D3)Sn-Fc marcada (por ejemplo con colorantes fluorescentes) y finalmente se detectan mediante tecnologías de última generación.

Figura 7: Secuencia de ADNc del sgp130(D1-D3)

optimizado

La secuencia incluye el péptido señalizador así como los dominios D1 a D3 de sgp130. La secuencia de optimizó en cuanto a los codones presentes para la expresión del polipéptido codificado en células de mamífero.

Figura 8: Secuencia de aminoácidos de gp130(D1-D3)

soluble

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Algunos fragmentos de molécula están subrayados del

modo siguiente: Péptido señalizador:

imagen1 ; dominio

tipo C2 similar a Ig (D1):

imagen1 ; dominio

fibronectina tipo III (D2):

imagen1 ; dominio

5 Dominio fibronectina tipo III (D3):

Por tanto, la presente invención hace referencia a un polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130

10  pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y en sus extremos C-terminales un espaciador polipéptido que posee una longitud entre 5 y 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión

15  óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente disminuido para formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas, y en el que se obtiene una productividad

20 significativamente superior en células huésped. Los polipéptidos-dímero de la presente invención pueden sintetizarse mediante métodos conocidos. El término “soluble” tal como se utiliza en la presente invención (abreviatura “s”) hace referencia a una molécula gp130 que

25  carece de al menos el dominio intracelular y el dominio transmembrana. Los dominios utilizados pueden comprender los dominios extracelulares D1 a D3 de gp130 o pueden comprender

imagen2

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mutantes o fragmentos de los mismos que mantengan la capacidad para inhibir la actividad del complejo agonista IL-6/sIL-6R. Preferentemente, el polipéptido correspondiente a la parte soluble de gp130 es el único polipéptido biológicamente activo del polipéptido-dímero de la presente invención.

En una realización preferente, los dos fragmentos monoméricos del polipéptido-dímero de la presente invención son idénticos.

La unión entre los dos monómeros para formar el dímero puede llevarse a cabo por un experto en la técnica mediante métodos bien conocidos. Para formar el dímero, las dos moléculas gp130 solubles pueden unirse entre sí mediante uno

o más puentes disulfuro. Ello puede conseguirse, por ejemplo mediante expresión recombinante, en la que la secuencia de ácidos nucleicos que codifica sgp130 se fusiona en su extremo C-terminal con un conector de polipéptidos que contiene uno o más codones que codifican residuos cisteína entre el extremo C-terminal de sgp130 y el codón de finalización. Alternativamente, para generar el dímero pueden emplearse conectores en el extremo de cada molécula sgp130 que confieran otro tipo de unión intermolecular (por ejemplo covalente, iónica) entre las dos moléculas sgp130. Estos conectores pueden ser completamente artificiales (por ejemplo, repeticiones de poliglicina que pueden interrumpirse con serina, alanina y/o treonina a intervalos determinados). Alternativamente, para generar el dímero, las dos moléculas gp130 solubles pueden fusionarse por su

extremo C-terminal a un fragmento IgG-Fc que incluya la

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región bisagra (ya sea directamente o mediante un conector). Además, pueden eliminarse residuos cisteína libres de la región bisagra de la molécula Fc mediante mutación para reducir el riesgo de formación de puentes disulfuro intermoleculares no deseados. Adicionalmente, las moléculas del dímero pueden marcarse, por ejemplo con His-His-His-His-His-His (His6), Myc, Strep, poliarginina, Flag, proteína verde fluorescente (GFP), TAP, glutatión S-transferasa (GST), HA, péptido de unión a calmodulina (CBP), péptido de unión a maltosa (MBP), V5, HSV, S, virus de la estomatitis vesicular (VSV), Proteína C, Luciferasa, Glu-Glu, E, beta-GAL, T7 u otros epitopos de los cuales se encuentran disponibles anticuerpos u otras moléculas de unión para permitir la purificación mediante sistemas de cromatografía adecuados y/o la detección, por ejemplo mediante transferencia Western, ELISA, bioensayos etc.

Para proporcionar una distancia óptima entre las dos subunidades sgp130 dentro de la molécula dimérica, la cual es necesaria para obtener una unión óptima al complejo IL-6/sIL-6R, las subunidades sgp130 se fusionan en su extremo C-terminal con espaciadores (poli)peptídicos que poseen una longitud entre 5 y 30 aminoácidos, preferentemente (i) 10 a 25 o (ii) 15 a 25 aminoácidos o, particularmente preferente, de 10 a 15 aminoácidos. El tipo de aminoácidos que forman el espaciador no es particularmente crítico, sin embargo, son preferentes aminoácidos (como G o S) que (a) garanticen una flexibilidad estérica ideal que permita un alineamiento óptimo de los

monómeros, (b) no sean fácilmente accesibles por proteasas y

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anticuerpos y (c) no estén cargados para disminuir o eliminar cualquier agregación no deseada del dímero con otras moléculas o la formación de trímeros etc. Son aminoácidos preferentes para la construcción de la molécula espaciadora una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos “GGGGS”, sin embargo el espaciador puede comprender cualquier otra secuencia que incremente la unión al ligando de dicha molécula sgp130.

En una realización particularmente preferente del polipéptido-dímero de la presente invención, el espaciador

está

glicosilado de forma selectiva para proteger la

molécula de su escisión proteolítica.

En

una realización adicionalmente preferente, el

polipéptido-dímero de la presente invención forma menos de un 50% de agregados homoméricos y fragmentos de molécula, preferentemente menos de un 25% de agregados homoméricos y fragmentos de molécula, más preferentemente menos de un 10% de agregados homoméricos y fragmentos de molécula, y más preferentemente, menos de un 5% de agregados homoméricos y fragmentos de molécula.

La presente invención también da a conocer polinucleótidos que codifican un polipéptido-dímero (o los monómeros respectivos) de la presente invención, los cuales pueden optimizarse en cuanto a los codones presentes para la producción eficiente de la proteína codificada en células huésped eucariotas, bacterias, células de levadura o insecto. Preferentemente, dicho polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 7.

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Además, la presente invención también se refiere a vectores que contienen un polinucleótido de la invención y las células huésped correspondientes.

Pueden utilizarse diversos métodos para generar e identificar mutaciones o modificaciones de sgp130 que poseen las propiedades deseadas. Puede utilizarse la mutagénesis específica de sitio mediante técnicas estándar del ADN que codifica sgp130 o métodos de última generación tales como la digestión de restricción y ligadura, seguida del análisis de la recopilación de productos para identificar las moléculas mutadas que poseen las propiedades deseadas.

Los polipéptidos-dímero de la presente invención se producen preferentemente mediante técnicas de recombinación utilizando polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención y vectores, preferentemente vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos. Para la producción de los polipéptidos de la presente invención, los polinucleótidos se obtienen a partir de clonas existentes, es decir, preferentemente codifican polipéptidos existentes de forma natural o partes de los mismos. También son útiles para la producción del polipéptido o polipéptidos de la presente invención los polipéptidos codificados por cualquier polinucleótido que se hibride al complemento del ADN o ARN nativo bajo condiciones alta o moderadamente estrictas (para sus definiciones, ver Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual (“Clonación molecular. Un manual de laboratorio”), Cold Spring Habor Laboratory (1989) Nueva York) siempre y cuando el polipéptido mantenga la actividad

biológica de la secuencia nativa.

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Los vectores recombinantes pueden construirse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual (“Clonación molecular. Un manual de laboratorio”), Cold Spring Habor Laboratory (1989) Nueva York. Pueden utilizarse diversos sistemas de vectores de expresión/huésped para contener y expresar las secuencias que codifican los polipéptidos sgp130 de la presente invención. Estos incluyen, sin carácter limitante, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN cósmidos, bacteriófagos recombinantes o plásmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión víricos (por ejemplo baculovirus); sistemas de células de plantas transformadas con vectores de expresión víricos (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o vectores de expresión bacterianos (por ejemplo li o pBR322); o sistemas de células de animales.

Los “elementos de control” o “secuencias reguladoras” son aquellas regiones no traducidas de los potenciadores del vector, promotores y regiones 5’ y 3’ no traducidas que interaccionan con las proteínas celulares del huésped para proceder a la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden varias en su potencia y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped utilizado, pueden utilizarse cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitucionales e

inducibles. Por ejemplo, al clonar en sistemas bacterianos,

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pueden utilizarse promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido de Bluescript RTM.phagemid (Stratagene, LaJolla, CA) o el plásmido pSPORT1.TM (Gibco BRL) o similares. Puede utilizarse el promotor de la polihedrina de baculovirus en células de insecto. Pueden clonarse en el vector promotores o potenciadores derivados de genomas de células de planta (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO y de proteínas de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo promotores o secuencias líder virales). En sistemas de células de mamífero, son preferentes promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario para generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia que codifica los polipéptidos de sgp130, pueden utilizarse vectores basados en SV40 o EBV con un marcador seleccionable adecuado.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse una serie de vectores de expresión en función del uso previsto del polipéptido-dímero de la presente invención. Como vectores adecuados para ser utilizados en la presente invención se incluye, sin carácter limitante, el vector de expresión pSKK para la expresión en bacterias.

En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, pueden utilizarse una serie de vectores que contienen promotores constituyentes o inducibles tales como el factor alfa, la alcohol oxidasa, y el PGH; para revisión ver Grant y otros (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

En casos en los que se utilizan vectores de expresión en plantas, las secuencias de expresión que codifican el

anticuerpo de la presente invención pueden ser conducidas

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por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, pueden utilizarse promotores virales tales como los promotores 35S y 19S del CaMV solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, N (1987) EMBO J. 6:307-311). Alternativamente, pueden utilizarse promotores de planta tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi, G. y otros (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. y otros (1984) Science 224:838-843; y Winter, J. y otros (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Los constructos pueden introducirse en células de planta mediante transformación de ADN directa o mediante transfección mediada por patógenos. Dichas técnicas se describen en diversas revisiones generalmente disponibles (ver, por ejemplo Hobbs, S. y Murry, L.E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (“Anuario de ciencia y tecnología”) (1992) McGraw Hill, Nueva York, NY; pp. 191-196.

También puede utilizarse un sistema de insecto para expresar las moléculas sgp130 de la presente invención. Por ejemplo, en uno de estos sistemas, se utiliza el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa california (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias pueden clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y situarse bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa del gen que codifica sgp130 hará que se inactive el gen de la polihedrina y producirá un virus recombinante que carece de

la proteína de recubrimiento. A continuación pueden

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utilizarse los virus recombinantes para infectar, por ejemplo células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales puede expresarse APOP (Engelhard, E.K. y otros (1994.) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).

En células huésped de mamífero, pueden utilizarse diversos sistemas de expresión basados en virus. En los casos en los que se utiliza como vector de expresión un adenovirus, las secuencias que codifican el o los polipéptidos de la presente invención pueden ligarse dentro de un complejo de transcripción/traducción de adenovirus formado por el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Puede utilizarse la inserción en una región no esencial E1 o E3 del genoma viral para obtener un virus viable capaz de expresar la proteína en células infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659). Además, pueden utilizarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (RSV) para incrementar la expresión de células huésped de mamífero.

También pueden utilizarse cromosomas humanos artificiales (HACs) para suministrar fragmentos de ADN más grandes que pueden estar contenidos y expresarse en un plásmido. Los HACs de 6 a 10 M se construyen y liberan a través de métodos de liberación convencionales (liposomas, polímeros amino policatiónicos o vesículas) con fines terapéuticos.

También pueden utilizarse señales de iniciación específicas para conseguir una traducción más eficiente.

Dichas señales incluyen el codón de iniciación ATG y

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secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican la sgp130, su codón de iniciación y las secuencias por encima se insertan en el vector de expresión adecuado, pueden no necesitarse señales de control de la traducción o la transcripción adicionales. Sin embargo, en el caso de que solamente se inserte la secuencia de codificación, deben proporcionarse señales de control de la traducción exógenas incluyendo el codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debería hallarse en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de todo el inserto. Los elementos de control de la traducción y los codones de iniciación pueden ser de orígenes diversos, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede incrementarse mediante la inclusión de potenciadores que sean adecuados para el sistema celular concreto que se utiliza, tales como los descritos en la literatura (Scharf, D. y otros (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.

Además, puede escogerse una cepa de células huésped por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar las cadenas de polipéptidos expresadas del modo deseado. También puede utilizarse el procesamiento post-traducción que escinde una forma “prepro” del polipéptido para facilitar una inserción, plegamiento y/o función correctas. Están disponibles del American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) diferentes células huésped que poseen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades post-traducción

(por ejemplo CHO, HeLa, MDCK, HEK293 o W138) y pueden

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escogerse para garantizar una modificación y procesamiento correctos de las cadenas polipeptídicas extrañas. Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de polipéptidos recombinantes, es preferente la expresión estable. Por ejemplo, pueden transformarse las líneas celulares que expresan de forma estable las cadenas sgp130 utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo o en un vector diferente. Tras la introducción del vector, se permitirá que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a un medio selectivo. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Las clonas resistentes de células transformadas estables pueden proliferar utilizando técnicas adecuadas al tipo celular.

Tras la introducción de uno o varios vectores recombinantes, las células huésped se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector. Puede utilizarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Estos incluyen, sin carácter limitante, la timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. y otros (1977) Cell 11:223-232 y los genes de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy, I. y otros (1980) Cell 22:817-823) que pueden utilizarse en células tk.sup. y

aprt.sup. respectivamente. También puede utilizarse la

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resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M. y otros (1980) Proc. Natl. Acd. Sci. 77: 3567-3570); npt que confiere resistencia a los aminioglucósidos neomicina y, G-418 (Colbere-Garapin,

F. y otros (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y als o pat que confieren resistencia a la clorosulfona y la fofinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murray, ver cita previa). Se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman S.C. y Mulligan, R.C. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051). Recientemente, ha ganado popularidad la utilización de marcadores visibles, utilizándose extensamente marcadores como las antocianinas, la beta-glucoronidasa y su substrato el GUS y la luciferasa y su substrato la luciferina, no solamente para identificar transformantes, si no también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes, C.A. y otros (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).

La purificación de los polipéptidos recombinantes se lleva a cabo mediante uno de los métodos conocidos para este fin, es decir, cualquier procedimiento convencional que suponga extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares. Un procedimiento de purificación adicional que puede utilizarse es la cromatografía de

afinidad utilizando anticuerpos monoclonales u otras

-21 –

moléculas que se unan al polipéptido diana y que se produzcan e inmovilicen en una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen el polipéptido recombinante se pasan a través de la columna o se utilizará la matriz en tecnologías de proceso por lotes para unirse a los polipéptidos diana. El polipéptido se unirá a la matriz mientras que las impurezas no lo harán. Tras el lavado se eluye el polipéptido de la matriz mediante un cambio en el pH o la fuerza iónica.

En consecuencia, la presente invención también se refiere a un método para la producción de un polipéptido-dímero de la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que codifica dicho polipéptido y recuperar el polipéptido de dicha célula huésped o del medio de cultivo.

Los

polipéptidos-dímero de la presente invención son

útiles

para el tratamiento y/o prevención de todas las

patologías

en las cuales la actividad del complejo

IL-6/sIL-6R agonista contribuye a la patogénesis de la enfermedad y debe ser inhibida. Por ejemplo, los usos terapéuticos de los polipéptidos-dímero de la presente invención incluirían los siguientes:

a) Aparentemente IL-6 está directamente involucrada en el mieloma múltiple actuando ya sea de forma autocrina

o paracrina para promover la formación tumoral. Además, los niveles elevados de IL-6 crean efectos secundarios indeseables tales como la resorción ósea, la hipercalcemia y la caquexia. En estos casos es conocido

que sIL-6R sensibiliza las células diana de IL-6. Por

-22 –

tanto, los polipéptidos-dímero de la presente invención tal como se describen en la misma serían beneficiosos tanto para los efectos secundarios como para inhibir el crecimiento tumoral. b) En enfermedades autoinmunes: el significado patogénico de IL-6 en las enfermedades autoinmunes ha sido revisado por diversos autores en la literatura (ver, por ejemplo Yoshizaki y otros (1992) Semin. Immunol. 4(3):155-166), de tanto, la interferencia con la transducción de la señal de IL-6 puede ser útil en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes (Nishimoto y otros (1999) Intern. Med. 38(2):178-182). Son ejemplos de estas patologías el lupus eritematoso sistémico, la tiroiditis de Hashimoto, la escleroderma,

la

artritis reumatoide, la esclerosis múltiple,

la

epitelitis

autoinmune, la diabetes mellitas, el

síndrome

de Sjögren, la polimiositis, la

glomerulonefritis y otras enfermedades inflamatorias, tales como la psoriasis, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa y la uveítis. Además, se mencionan algunas enfermedades cancerosas asociadas a inflamación como el cáncer de colon. c) En la osteoporosis, que puede exacerbarse por la disminución de los niveles de estrógenos en las mujeres post-menopáusicas o tras una ooforectomía, aparentemente IL-6 es un mediador crítico de la osteoclastogénesis, que provoca resorción ósea. Es importante destacar que, aparentemente IL-6 juega un

papel principal en el estado de depleción de

-23 –

estrógenos, y aparentemente está mínimamente involucrado en el mantenimiento óseo normal. De acuerdo con ello, la evidencia experimental indica que los anticuerpos bloqueadores de función contra IL-6 pueden disminuir el número de osteoclastos. Aunque también se utiliza el tratamiento sustitutivo con estrógenos, parece que existen efectos secundarios que pueden incluir un incremento del riesgo de cáncer de mama y endometrio. Por tanto, los polipéptidos-dímero de la presente invención serían más específicos para reducir la osteoclastogénesis a niveles normales. d) IL-6 puede ser un mediador del factor de necrosis tumoral (TNF) que provoca la caquexia asociada con el SIDA y el cáncer, quizás reduciendo la actividad de la lipoproteína lipasa en el tejido adiposo. En consecuencia, los polipéptidos-dímero de la presente invención descritos en la misma serían útiles para aliviar o disminuir la caquexia de dichos pacientes. e) Infecciones bacterianas y virales: se ha demostrado la presencia del virus del herpes humano (HHV8) en más del 91% de las lesiones de sarcoma de Karposi (KS). Además, el virus ha sido identificado en el linfoma de efusión primaria (PEL) y en pacientes con enfermedad de Castleman multicéntrica (MCD). Curiosamente, se ha demostrado que las células dendríticas de la médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (MM) están infectadas por HHV8. Desde entonces, la asociación de HHV8 con el MM ha sido objeto de un intenso debate, que

se ha revisado recientemente. El genoma de HHV8

-24 –

codifica diversas proteínas con homologías significativas con proteínas anti-apoptóticas, quimioquinas y citoquinas humanas, incluyendo una forma vital de la IL-6 viral (vIL-6) con un 25% de homología con la IL-6 humana. Se ha demostrado que vIL-6 posee actividades biológicas reminiscentes de la IL-6 humana, es decir estimulación de la proliferación de células de hibridoma de ratón y de mieloma humano. Más recientemente, se ha demostrado en ratones a los que se inyectaba células NIH3T3 transfectadas con vIL-6, que vIL-6 inducía angiogénesis y hematopoyesis. Se concluyó que mediante estas funciones vIL-6 juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades asociadas a HHV8. La contribución del IL-6R a la señalización por vIL-6 ha generado polémica. Un grupo utilizando sobrenadantes no purificados de células COS-7 transfectadas con vIL-6 ha demostrado que la actividad STAT se inducía en células que expresaban gp130 pero no IL-6R. Por el contrario, otro grupo ha hallado que la actividad de vIL-6 se reducía mediante un antagonista de IL-6R abogando por una participación de IL-6R en la señalización por vIL-6. Por tanto, la presente invención también se refiere a

una composición farmacéutica que contiene una cantidad

efectiva de un polipéptido-dímero o de un polinucleótido de

la presente invención, preferentemente combinado con un

vehículo farmacéuticamente aceptable. El término

“farmacéuticamente aceptable” pretende englobar cualquier

vehículo, que no interfiera con la efectividad de la

-25 –

actividad biológica del principio activo y que no sea tóxico para el huésped al que se administra. En la técnica son bien conocidos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables entre los que se incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Dichos vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al individuo a una dosis efectiva.

El término una “cantidad efectiva” se refiere a una cantidad del principio activo que es suficiente para afectar el curso y la gravedad de la enfermedad, provocando la reducción o remisión de dicha patología.

La “dosis efectiva” útil para el tratamiento y/o prevención de estas enfermedades o alteraciones puede determinarse utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica (ver por ejemplo, Finl y otros (1975) The Pharmacological Basis of Therapeutics (“Bases farmacológicas de la terapéutica”), Goodman y Gilman, editores. Macmillan Publishing Co., Nueva York, pp. 1-46).

La administración de composiciones adecuadas puede efectuarse por diferentes vías, por ejemplo mediante administración endovenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica (por ejemplo mediante enema, inhalación, ungüento, gotas) o intradérmica. La vía de administración, obviamente, depende del tipo de tratamiento y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación vendrá determinado

por el médico al cargo y otros factores clínicos. Como es

-26 –

sabido en el técnica médica, la dosificación en un paciente en particular depende de diversos factores, incluyendo el tamaño del paciente, la superficie corporal, el peso, la edad, el sexo, el compuesto en concreto a administrar, el tiempo y vía de administración, el tipo de tratamiento, el estado de salud y otros fármacos que se administren de forma concomitante.

Los usos médicos preferentes de los polipéptidos-dímero y polinucleótidos de la presente invención descritos previamente son el tratamiento de la resorción ósea, la hipercalcemia, la caquexia, los tumores, el cáncer, las enfermedades autoinmunes, las enfermedades inflamatorias como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la artritis reumatoide, la artritis reumatoide juvenil, el asma, la psoriasis, el lupus eritematoso, la esclerosis múltiple, la uveítis y otras, las infecciones virales o bacterianas.

Los ejemplos siguientes describen la invención en mayor detalle:

Ejemplo 1: Preparación de las variantes sgp130(D1-D3)Sn-Fc de sgp130

(A) Material

La secuencia optimizada en codones de sgp130Fc (longitud completa) fue sintetizada y proporcionada en forma de un constructo pCR-Script-AMP por GeneART (Regensburg, Alemania). Los componentes del sistema de clonación Gateway (ADN polimerasa AccuPrime Pfx, donador de vectores pDONR221, el vector de expresión controlado por promotor de CMV

pcDNA-DEST40, la recombinasa BP y LR para la transferencia

-27 –

del inserto y las células E. Coli competentes) se adquirieron de Invitrogen (Karlsruhe, Alemania). El kit de mutagénesis específica de sitio QuickChange II se obtuvo de Stratagene (Amsterdam, Holanda). Los cebadores de mutagénesis purificados HYPUR fueron de MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Las células CHO-K1 se obtuvieron de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Braunschweig, Alemania). Los componentes para los medios de cultivo se obtuvieron tal como sigue: Medio F12 de Ham y PBS (PAA Laboratories; Cölbe, Alemania), FBS (Biochrom; Berlin, Alemania), solución Tripsina/EDTA (Invitrogen) y solución G418 (Sigma-Aldrich; Taufkirchen, Alemania). El reactivo de transfección Lipofectamina 2000 se obtuvo de Invitrogen. Santa Cruz (Heidelberg, Alemania) suministró la “Protein A/G Plus Agarose” para la inmunoprecipitación. Tanto para la inmunoprecipitación como para la detección primaria en membranas Western, se utilizó in anticuerpo monoclonal IgG(Fc) antihumano de ratón (CBL102; Chemicon; Hofheim, Alemania). La detección secundaria en las membranas Western se realizó con un anticuerpo anti-ratón IgG unido a HRP, substrato de transferencia Western ECL-Plus e Hyperfilm ECL (todos de GE Healthcare; Freiburg, Alemania). Los frascos de cultivo rotativos (2,1 L, superficie 2,5X) se obtuvieron de Greiner Bio-One (Frickenhausen, Alemania).

(B) Construcción de sgp130(D1-D3)Sn-Fc

Sgp130Fc de longitud completa se subclonó en pDONR221 utilizando cebadores Gateway, ADN polimerasa AccuPrime Pfx y recombinasa BP mediante un procedimiento Gateway estándar.

Se verificó completamente la secuencia del inserto

-28 –

subclonado utilizando cebadores superpuestos hacia delante y hacia atrás cada 250-300 pares de bases. En una mutagénesis específica de sitio con el kit QuikChange II, los dominios D4-D6 de sgp130Fc se substituyeron por elementos espaciadores ideales (S1, S2, S3 y S5) utilizando un par de cebadores que salvaba el final del dominio D3 (YED) y el

inicio

de la parte Fc (SCD) de sgp130Fc y codificaba un

número

diferente de repeticiones de la secuencia de

espaciador

de aminoácidos

“glicina-glicina-glicina-glicina-serina” (GGGGS). La variante sgp130(D1-D3)Fc se dejó sin espaciador (a modo de aclaración: si se menciona una variante “sgp130(D1-D3)S0-Fc” significa que la molécula no contiene péptido espaciador y por tanto es idéntica a sgp130(D1-D3)Fc. Las clonas positivas se identificaron mediante digestión de restricción con AlwNI y se verificó mediante secuenciación completa tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, se transfirió el inserto al vector de expresión pcDNA-DEST40 mediante recombinación Gateway LR. Como el inserto codifica dos codones de finalización después de la parte Fc, los marcadores de pcDNA-DEST40 (epítopos V5 y 6xHis) no están presentes en las proteínas sgp130(D1-D3)Sn-Fc. De nuevo, las clonas positivas se identificaron mediante digestión de restricción con AlwNI: no fue necesaria la verificación de secuencia, pues el procedimiento de recombinación Gateway es altamente específico y no supone la amplificación de ADN. La transferencia correcta de insertos utilizando las recombinasas Gateway se ha verificado en experimentos

independientes en nuestro laboratorio.

-29 –

(C) Cultivo y transfección

Se cultivaron células CHO-K1 en medio F12 de Ham suplementado con FBS al 10% a 37ºC y en una ambiente saturado de humedad con un 5% de CO2. Los cultivos de mantenimiento se dividieron cada 3-4 días y se utilizaron solamente hasta los 20 pases. Las células se transfectaron con el constructor de expresión pcDNA-DEST40_sgp130(D1-D3)Sn-Fc utilizando Lipofectamina 2000 y condiciones estándar para CHO-K1 suministrada por Invitrogen. Para un primer ensayo de expresión transitoria, las células CHO-K1 se transfectaron en placas de 6 pocillos, y se recolectaron tanto las células como los sobrenadantes 24 horas después de la transfección. Sgp130(D1-D3)Sn-Fc se inmunoprecipitó de los sobrenadantes utilizando “Protein A/G Plus Agarose” y el anticuerpo IgG (Fc) anti-humano según las instrucciones del fabricante. Se extrajo la proteína total y se realizaron transferencias Western con el anticuerpo IgG (Fc) anti-humano con los lisados celulares y los

inmunoprecipitados

tal como describe Waetzig y otros, J.

Immunol.168: 5342 (2002).

(D) Expresión de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en células CHO

Tras

una expresión transitoria exitosa, se

transfectaron células CHO-K1 y se seleccionaron utilizando 400 µg/mL de G418 en placas de 10 cm. Para obtener una primera impresión de la calidad y propiedades del producto, se transfirió un pool policlonal CHO-K1 preseleccionado a frascos de cultivo rotativos. Se recolectaron los sobrenadantes de las células confluentes tres veces por

semana, se centrifugaron dos veces a 4.000 rpm y 4ºC durante

-30 –

15 minutos para eliminar los desecho celulares y o bien se procesaron inmediatamente o se congelaron a -80ºC. En paralelo, se seleccionaron clonas celulares estables del pool pre-seleccionado utilizando el método de la dilución limitada y se caracterizaron mediante análisis de expresión con transferencia Western tal como se ha descrito anteriormente. La clona con la expresión más alta y estable se transfirió a frascos de cultivo rotativos y se utilizó para la producción adicional.

(E) Resultados

Tal como se demuestra en la figura 2, sgp130(D1-D3)Sn-Fc (mostrado a modo de ejemplo para sgp130(D1-D3)S1-Fc) se expresión con unas tasas de expresión que eran incluso mejores que las obtenidas con la proteína sgp130Fc original. Ello indica que la expresión de una variante más pequeña de sgp130Fc parece ser mayor y confiere ventajas para la preparación de la proteína. Finalmente, tasas de producción mayores significaran costes menores para la producción a nivel industrial.

Ejemplo 2: Purificación de sgp130(D1-D3)Sn-Fc

(A) Material

Los filtros de acetato de celulosa (0,45 µm) para un filtro de vacío se adquirieron de Sartorius (Göttingen Alemania). El PBS fue de PAA Laboratories (Cölbe, Alemania). Todos los materiales para la cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño (SEC) se obtuvieron de GE Healthcare (Freiburg, Alemania): material MabSelect (código de producto 17-5199-01) en una columna XK16/20, columnas de

desalinización PD-10 y HiLoad 26/60 Superdex 200 pg para

-31 –

SEC. La unidades de concentración de membrana Amicon Ultra-15 50 kD Ultracel-PL se adquirieron de Millipore (Eschborn, Alemania). La solución de archilamida-bis prefabricada (19:1, 30%) fue suministrada por Bio-Rad (Munich, Alemania).

(B) Cromatografía de afinidad

A modo de ejemplo de la purificación de las variantes sgp130(D1-D3)SnFc se muestra la purificación de sgp130(D1-D3)S1-Fc. Se purificaron los sobrenadantes con sgp130(D1-D3)S1-Fc de los cultivos en frasco de cultivo rotativo a 4ºC utilizando una bomba peristáltica P-1 y un sistema AKTA Purifier 100 (ambos de GE Healthcare; Freiburg, Alemania). El protocolo se basó en las recomendaciones del fabricante para la purificación de anticuerpos monoclonales. Tras la centrifugación, se ajustó el pH del sobrenadante fresco o descongelado (en hielo) a 6,7-7,0. Tras dos rondas de filtración en vacío (0,45 µM), se desgasificó el sobrenadante y, en caso necesario, se ajustó de nuevo el pH a un valor de 6,7-7,0. A continuación, se cargó la columna de cromatografía de afinidad equilibrada con PBS (6-25 mL de MabSelect en una columna XK16/20) con 2-4 L de sobrenadante a una velocidad de flujo de 3-10 mL/min utilizando la bomba P-1. Tras lavado con PBS, se transfirió la columna al purificador ÄKTA y se lavó de nuevo con PBS hasta que la A280 se estabilizó tras la eliminación cuantitativa de proteína no unida. Para la elución el sistema ÄKTA se equipó con dos tampones de citrato sódico 50 mM a pH de 3,25 y 5,5, respectivamente, que se mezclaron para producir las

condiciones de pH deseadas. Una etapa de lavado a pH 5,1 se

-32 –

siguió de la elución a pH 3,7. Se recolectaron fracciones de 10 mL en tubos de 15 mL que contenían 2 mL de Tris-HCl 1 M (pH 11). Se agruparon las fracciones de los picos, y se midió el pH y se ajustó a 7,5, en caso necesario. La concentración de proteína del pool se midió mediante A280 y se concentró cuidadosamente hasta un máximo de 1,5 mg/mL utilizando unidades Amicon Ultra-15 50 kD. Se utilizaron columnas de desalinización PD-10 equilibradas con PBS para cambiar el tampón a PBS, seguido de otra medición de la concentración de proteína a 280 nm.

(C) Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) mediante filtración de gel

Para la SEC, es recomendable una concentración máxima de 1,2 mg/mL en PBS. La SEC se realizó con el sistema ÄKTA en una columna HiLoad 26/60 Superdex 200 pg equilibrada con PBS a una velocidad de flujo de 0,8 mL/min. Sgp130(D1-D3)S1-Fc se eluyó como un pico único tras una meseta baja de agregados de alto peso molecular (figura 4A). En los primero pases, se obtuvieron muestras de todas las fracciones para análisis mediante PAGE (ver más adelante). Se agruparon las fracciones de los picos, se determinó su concentración de proteína y se fijó a 400-500 µg/mL, y se congelaron alícuotas de un solo uso a -80ºC para almacenamiento a largo plazo.

(D) Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Se analizaron muestras del pool y de las fracciones mediante PAGE nativa (gel de poliacrilamida al 7,5%) seguida de tinción con argéntica o con Coomassie (figura 4A).

(E) Resultados

-33 –

Tal como se muestra en las figuras 4A y 4B, la cantidad de productos secundarios no deseados se redujo significativamente en comparación con el producto original sgp130Fc, que se purificó en paralelo en otro experimento (los resultados se muestran en la figura 3). Además, la elución del producto principal (carriles 8 a 14 en la figura 4A) es claramente separable de las fracciones de las impurezas (carriles 1 a 6 en la figura 4A). Sgp130Fc tiende a generar cantidades mucho mayores de impurezas (ver el primer pico del cromatograma y la PAGE en la figura 3). Además, ninguna de las fracciones de la elución que contenía el producto principal (carriles 6 a 11 en la figura 3) está libre de impurezas. Estos resultados indican una mejora evidente de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en comparación con la molécula sgp130Fc original. Sin embargo, la longitud del espaciador es decisiva para la capacidad de purificación de las moléculas sgp(130(D1-D3)Sn-Fc. La actividad de unión y, por tanto, la eficacia terapéutica mejora al aumentar la longitud del espaciador. Existe una “ventana de capacidad de purificación óptima” con un máximo cuando n = 3 (figura 4B). Por tanto, la longitud ideal del espaciador está entre 3 y 5 elementos, dependiendo de la necesidad de una actividad óptima o una pureza y rendimiento óptimos.

Ejemplo 3: Comparación de las propiedades de unión al complejo IL-6/sIL-6R de sgp130Fc y sgp130(D1-D3)Sn-Fc

(A) Material

Las placas de microtitulación de 96 pocillos Microlon se adquirieron de Greiner Bio-One (Frickenhausen, Alemania). La IL-6 y el receptor IL-6 soluble (sIL-6R) recombinantes

-34 –

humanos se obtuvieron de BioSource (Solingen, Alemania) y R&D Systems (Wiesbaden, Alemania), respectivamente. El anticuerpo primario anti-sIL-6R (clona M91, ratón IgG1) se obtuvo de Beckman Coulter (Krefeld, Alemania). El anticuerpo secundario anti-ratón IgG conjugado con HRP de GE Healthcare (Freiburg, Alemania) fue el mismo que en los experimentos de transferencia Western (ver Ejemplo 1, A y C). El substrato de HRP tetrametilbencidina (TMB) prefabricado se adquirió de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania).

(B) Enzimoinmunoensayo (ELISA)

Para el control de calidad y poder comparar entre lotes diferentes de variantes de sgp130Fc se diseñó un ELISA estándar. Todas las etapas excepto el recubrimiento se realizaron a temperatura ambiente, todas las etapas de

lavado se realizaron tres veces con un volumen de 250 µL, y todas las condiciones de midieron por triplicado. Se recubrió una placa de microtitulación de 96 pocillos con 100 ng/pocillo de sgp130Fc original como estándar interno y una cantidad equimolar de sgp130(D1-D3)Sn-Fc en 100 µL de PBS a 4ºC durante una noche. Así la sgp130Fc y sus variantes sirvieron como reactivo de captura, detectándose el sIL-6R unido (ver más adelante). Tras el lavado con Tween-20 al 0,05% en PBS, se bloquearon todos los pocillos con 200 µL / pocillo de BSA al 3% en PBS durante 2 horas. A continuación, se eliminó la solución de bloqueo, y se incubaron los pocillos durante 1 hora con una serie de diluciones 1:2 (100 µL / pocillo) de IL-6 humana

recombinante (3,2 µg/mL a 50 ng/mL) y sIL-6R (1,6 µg/mL a 25

-35 –

ng/ml) en BSA al 3% en PBS. Tras lavar con Tween-20 al 0,05% en PBS, los pocillos se incubaron con el anticuerpo primario anti-sIL-6R a una dilución 1:2.000 en BSA al 3% en PBS (100

µL / pocillo) durante 1 hora. Otra serie de tres etapas de lavado con Tween-20 al 0,05% en PBS se siguió de una incubación de 1 hora con el anticuerpo secundario anti-ratón IgG conjugado con HRP a una dilución de 1:5.000 (100 µL / pocillo). Tras lavar con Tween-20 al 0,05% en PBS y subsiguientemente con dH2O, se incubaron las placas con 100 µL / pocillo de substrato TMB durante aproximadamente 5 minutos (dependiendo de la intensidad del color azul del revelado). La reacción de substrato se detuvo añadiendo a los pocillos 100 µL / pocillo de ácido sulfúrico 0,5M. Finalmente se determinó la A450 en un lector de placas de microtitulación.

(C) Resultados

Los resultados del ensayo de unión se muestran en la figura 5. La eficiencia de unión de sgp130(D1-D3)Sn-Fc dependía principalmente del número de repeticiones del espaciador utilizado en las respectivas variantes. En este caso las variantes que contenían 2 y 3 repeticiones (S2 y S3) se unían igual o incluso mejor que sgp130Fc. Ello indica que la modificación de la sgp130Fc originaria para mejorar su purificación no modificaba sus actividades biológicas y su uso potencial como medicamento para el tratamiento de las enfermedades activadas por IL-6.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CONARIS research institute AG

-36 –

<120> variantes solubles de la molécula gp130 útiles como medicamento

<130> C 1068

<140> EP 05 028 420.7

<141> 2005-12-23

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210>

<211> 6

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Marcador His

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencia del espaciador

<400> 2

imagen1

<210> 3

<211> 972

<212> ADN

<213> artificial

<220>

<223> ADNc de sgp130(D1-D3)

<400> 3

imagen3

5 <210> 4

<211> 324

<212> PRT

<213> artificial

<220> 10 <223> sgp130(D1-D3)

<400> 4

-38 –

imagen1

imagen4

-40 –

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Polipéptido-dímero de dos fragmentos monoméricos, en el que los fragmentos monoméricos comprenden (a) los dominios 1 a 3 (D1 a D3) de la parte extracelular de la glicoproteína (gp) 130 pero no contienen dominios adicionales (D4 a D6) de sgp130 y (b) en sus extremos C-terminal un espaciador polipéptido que posee una longitud de 5 a 30 aminoácidos, en el que ambos fragmentos monoméricos están unidos covalentemente entre sí, en el que la longitud del espaciador determina la unión óptima de la proteína dimérica resultante al complejo IL-6/receptor de IL-6 soluble y en el que dicho polipéptido-dímero muestra un potencial significativamente reducido de formar agregados homoméricos y fragmentos de moléculas y en el que se obtiene una productividad significativamente incrementada en células huésped.

2. 2.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1, en el que los dos fragmentos monoméricos son idénticos.

3. 3.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante uno o más puentes disulfuro.

4. 4.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la fusión de los fragmentos monoméricos a una molécula IgG-Fc.

5. 5.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 3, en el que el o los puentes disulfuro se generan mediante la

   -41 –

6. 6.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 1 o 2, en el que la dimerización covalente de ambos monómeros se obtiene mediante cualquier otro tipo de unión química o física.

7. 7.

   Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el espaciador polipéptido está glicosilado selectivamente para proteger la molécula de la escisión proteolítica.

8. 8.

   Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 10 a 25 aminoácidos.

9. 9.

   Polipéptido-dímero, según la reivindicación 8, en el que el espaciador polipéptido posee una longitud de 15 a 25 aminoácidos.

10. 10.

    Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el espaciador posee la secuencia de aminoácidos (GGGGS)n siendo n 1, 2, 3, 4, 5 o

    fusión

    de los fragmentos monoméricos a un polipéptido

    natural

    o artificial, que comprende uno o más residuos

    cisteína libremente accesibles.

11. 6.

12. 11.

    Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que forma menos de un 50% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

13. 12.

    Polipéptido-dímero, según la reivindicación 11, que forma menos de un 25% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

14. 13.

    Polipéptido-dímero, según la reivindicación 12, que forma menos de un 10% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

    -42 –

15. 14.

    Polipéptido-dímero, según la reivindicación 13, que forma menos de un 5% de agregados homoméricos y fragmentos de moléculas.

16. 15.

    Polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que los monómeros comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 8.

17. 16.

    Polinucleótido que codifica un polipéptido, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

18. 17.

    Polinucleótido, según la reivindicación 16, en el que la secuencia del polinucleótido está optimizada en codones para la producción de la proteína codifica en células huésped eucariotas, bacterias, levaduras o células de insecto.

19. 18.

    Polinucleótido, según las reivindicaciones 16 o 17, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la figura 7.

20. 19.

    Vector de expresión que contiene un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.

21. 20.

    Célula huésped que contiene un vector de expresión, según la reivindicación 19.

22. 21.

    Método para la producción de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende cultivar una célula huésped según la reivindicación 20, recuperar el polipéptido-monómero o dímero de dicha célula huésped o del medio de cultivo y su purificación.

23. 22.

    Composición farmacéutica que contiene un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones

    -43 –

    1 a 15 o un polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18.
24. 23. Utilización de un polipéptido-dímero, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o de un 5 polinucleótido, según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la resorción ósea, la hipercalcemia, la caquexia, un tumor, el cáncer, una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, o una

    10 infección bacteriana o viral.