ES2347962T3

ES2347962T3 - Biological variability of asthma associated factor, AAF2 (IL-9 receptor), useful in treating and diagnosing atopic allergies including asthma and related disorders.

Info

Publication number: ES2347962T3
Application number: ES04013403T
Authority: ES
Inventors: Nicholas Nicolaides; Luigi Grasso; Roy Levitt
Original assignee: Ligand Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ligand Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-02
Filing date: 1997-12-02
Publication date: 2010-11-26
Anticipated expiration: 2017-12-02
Also published as: PT1471144E; CA2271952C; JP2009159976A; DE69739920D1; AU5689198A; AU746595B2; EP0942979A2; CA2271952A1; ATE471982T1; JP2002514911A; JP4552076B2

Abstract

Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana seleccionado de entre el grupo consistente en ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 617 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, fragmentos de los mismos que contienen la deleción y complementos de los mismos que contienen la deleción.

Description

Campo de la Invención

La presente invención describe la variabilidad biológica en el receptor IL-9 (Factor 2 Asociado a Asma) (SEQ ID NO:1) y relaciona estas variantes de secuencias con la sensibilidad al asma, la alergia atópica y trastornos asociados. Además, se describen métodos que emplean receptores variables de IL-9 en el desarrollo de productos farmacéuticos para el asma que depende de la regulación de la actividad de IL-9.

Antecedentes de la Invención

La inflamación es un proceso complejo en el que el sistema de defensa del cuerpo combate entidades extrañas. Aunque la lucha contra entidades extrañas puede resultar necesaria para la supervivencia del cuerpo, algunos sistemas de defensa responden a ellas de forma inadecuada, incluso ante aquellas que son inocuas, y peligrosa y dañan así el tejido circundante en la lucha subsiguiente.

La alergia atópica es un trastorno en el que el fondo genético dicta la respuesta a los estímulos ambientales. En general, el trastorno se caracteriza por un aumento de la capacidad de los linfocitos para producir anticuerpos IgE en respuesta a antígenos ubicuos. La activación del sistema inmune por estos antígenos conduce también a la inflamación alérgica, que puede producirse después de su ingesta, por su penetración en la piel o tras su inhalación. Cuando tiene lugar esta activación inmune y lleva a una inflamación pulmonar, en general este trastorno se clasifica como asma. En esta reacción inflamatoria de las vías aéreas son importantes determinadas células, incluyendo células T así como aquellas que presentan antígenos, células B que producen IgE y mastocitos/basófilos que almacenan mediadores inflamatorios y se unen a IgE, así como eosinófilos que liberan otros mediadores. Estas células inflamatorias se acumulan en el sitio de la inflamación alérgica y los productos tóxicos que liberan contribuyen a la destrucción del tejido relacionado con el trastorno.

Aunque generalmente el asma se define como un trastorno inflamatorio de las vías aéreas, los síntomas clínicos surgen de la obstrucción intermitente del flujo aéreo. Se trata de un trastorno crónico, incapacitante, que parece aumentar en su frecuencia y gravedad.1. Se estima que el 30-40% de la población padece de alergia atópica y un 15% de los niños y un 5% de los adultos de la población padece asma.1 Por tanto, el tratamiento de estos trastornos representa una enorme carga para nuestros recursos de atención sanitaria.

Tanto el diagnóstico como el tratamiento del asma y de sus trastornos relacionados son problemáticos1. En particular, a menudo la evaluación del tejido pulmonar inflamado es difícil y con frecuencia la causa de la inflamación no se puede determinar. Aunque el asma atópica es un trastorno ecogenético, tan sólo recientemente se ha tenido conocimiento de las variantes génicas particulares. Quedan por determinar los métodos para detectar estas variaciones genéticas y su papel en la inflamación, diagnóstico y pronóstico. La técnica necesita el desarrollo de una tecnología para acelerar el diagnóstico del asma atópica que se relaciona específicamente con las variaciones en los genes responsables de la sensibilidad/resistencia a esta enfermedad atópica.

Los tratamientos actuales tienen su propia serie de inconvenientes. Los principales agentes terapéuticos, los agonistas-β, reducen los síntomas, es decir, mejoran transitoriamente las funciones pulmonares, pero no afectan a la inflamación subyacente, de modo que los tejidos pulmonares siguen estando en peligro. Además, el uso constante de agonistas-β resulta en una insensibilización, lo que reduce su eficacia y seguridad2. Los agentes que pueden reducir la inflamación subyacente, los esteroides antiinflamatorios, tienen su propia lista de efectos secundarios conocidos, que van desde la inmunosupresión a la pérdida ósea2.

Debido a los problemas asociados a las terapias convencionales, se han A37

evaluado estrategias alternativas de tratamiento38-39 . La glicoforina , la ciclosporina38 y un fragmento nonapeptídico de IL-226 inhiben todos la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2. Se sabe, sin embargo, que tienen numerosos otros efectos2. Por ejemplo, la ciclosporina se utiliza como inmunosupresor después del transplante de un órgano. Aunque estos agentes pueden representar alternativas a los esteroides en el tratamiento de los asmáticos 36-39, inhiben la proliferación de linfocitos T dependientes de la interleucina-2, así como las funciones inmunes potencialmente críticas asociadas a la homeostasis. En la técnica se necesita una tecnología para acelerar el desarrollo de productos terapéuticos que estén diseñados específicamente para tratar la causa y no los síntomas del asma atópica. Estas terapias representan la vía más apropiada para evitar la toxicidad asociada al tratamiento no específico. Las terapias enfocarían selectivamente una vía aguas abajo de las funciones inmunes, tales como la activación de linfocitos T mediados por IL-2, que es necesaria para el desarrollo del asma y que explicaría la naturaleza episódica del trastorno y su estrecha asociación a la alergia. La naturaleza demuestra que una vía es la diana adecuada para la terapia del asma cuando normalmente existe una variabilidad biológica en la vía y los individuos que muestran tal variabilidad no están inmunocomprometidos o enfermos, excepto en cuanto a sus síntomas de asma atópica.

Debido a las dificultades relacionadas con el diagnóstico y el tratamiento de alergias atópicas, incluyendo el asma, la patofisiología compleja de estos trastornos se está sometiendo a profundo estudio. Aunque estos trastornos son heterogéneos y pueden resultar difíciles de definir, ya que pueden tomar muchas formas, se encuentran ciertas características comunes entre los asmáticos. Como ejemplos de dichas características se incluyen la respuesta anormal a la prueba de la piel al desafío con alérgenos, eosinofilia pulmonar, hiperreactividad bronquial (BHR), reversibilidad broncodilatadora y obstrucción del flujo de aire 3-10. Estas expresiones de las características relacionadas con el asma se pueden estudiar por medio de mediciones cuantitativas o cualitativas.

En muchos casos, los altos niveles de IgE están en correlación con la BHR, respuesta broncoconstrictora fuerte frente a una variedad de estímulos4,6,8,9. Se cree que la BHR refleja la presencia de inflamación en las vías aéreas 6,8 y se considera un factor de riesgo para el asma11-12 . La BHR viene acompañada de inflamación bronquial, incluyendo la infiltración eosinofílica en el pulmón y una diátesis alérgica en individuos asmáticos6,8,13-18.

Numerosos estudios documentan un componente hereditario del asma atópica4,10. Sin embargo, ha resultado difícil interpretar los estudios en familias, ya que la edad y el género influyen significativamente en estos trastornos, así como muchos factores ambientales tales como alérgenos, infecciones virales y contaminantes19-21. Además, debido a que no existe ningún defecto bioquímico conocido asociado a la sensibilidad a estos trastornos, los genes mutantes y sus productos genéticos anormales sólo se pueden reconocer por medio de los fenotipos anómalos que producen.

Las funciones de IL-9 y del receptor de IL-9 (la vía IL-9) se extienden ahora más allá de lo que se reconocían originalmente. Aunque la vía de IL-9 sirve de estimulante del crecimiento de células T, esta citoquina es conocida también por mediar en el crecimiento de progenitores eritroides, células B, mastocitos y timocitos fetales22,23. La vía de IL-9 actúa de forma sinérgica con IL-3, provocando la activación y proliferación de mastocitos24. La vía de IL-9 potencia asimismo la producción inducida por IL-4 de IgE, IgG e IgM por los linfocitos B humanos normales25 y la liberación inducida por IL-4 de IgE e IgG por los linfocitos B murinos26. Se ha demostrado también el papel de la vía de IL-9 en la respuesta inflamatoria a la infección parasitaria en mucosas27,28.

Sin embargo, no se sabe cómo la secuencia del receptor de IL-9 tiene correlación específica con el asma atópica, así como con la hiperreactividad bronquial. Se sabe que IL-9 se une a un receptor específico expresado en la superficie de las células diana23,29,30. El receptor se compone concretamente de dos cadenas de proteínas: una cadena proteica, conocida como receptor de IL9, se une específicamente a IL-9; la otra cadena proteica es compartida en común con el receptor de IL-223. Además, se ha clonado y secuenciado un ADNc que codifica el receptor de IL-9 humano23,29,30. Este ADNc codifica para una proteína de 522 aminoácidos que muestra una homología significativa con el receptor de IL-9 murino. La región extracelular del receptor está muy conservada, con una homología del 67% entre las proteínas murinas y humanas. La región citoplásmica del receptor está menos conservada. El dominio citoplásmico humano es mucho más grande que la región correspondiente del receptor murino23.

También se ha caracterizado el gen receptor de IL-930. Se cree que existe como única copia en el genoma del ratón y está compuesto de nueve exones y ocho intrones30. El genoma humano contiene al menos cuatro pseudogenes receptores de IL-9. El gen receptor humano de IL-9 ha sido mapeado en la región subtelomérica de 320 kb de los cromosomas sexuales X e Y23.

A pesar de estos estudios, no se han descubierto variantes del gen receptor de IL-9. Por tanto, se necesita específicamente información genética sobre la alergia atópica, asma, hiperreactivad bronquial, así como aclarar el papel del receptor de IL-9 en la etiología de estos trastornos. Esta información se puede utilizar para diagnosticar la alergia atópica y sus trastornos relacionados mediante métodos que identifiquen las variantes genéticas de este gen, las cuales están asociadas a estos trastornos. Además, se necesitan métodos que utilicen las variantes del receptor de IL-9 para desarrollar productos terapéuticos con el fin de tratar estos trastornos.

Sumario de la Invención

Los solicitantes han descubierto variantes naturales del receptor humano de IL-9 (también conocido como Factor 2 Asociado a Asma o AAF2) y han vinculado estas variantes a la patogénesis del asma y sus trastornos relacionados. Estos descubrimientos condujeron al desarrollo de métodos de diagnóstico, así como a métodos para descubrir productos farmacéuticos para el tratamiento terapéutico del asma atópica. Además, los solicitantes han determinado que el receptor de IL-9 es crítico para un número de respuestas inducidas por antígenos en ratones, que incluyen la hiperreactividad bronquial, eosinofilia y recuentos celulares elevados en el lavado bronquial, así como niveles elevados de IgE total en suero. Estos descubrimientos tipifican el asma atópica y la inflamación alérgica asociada.

Además, los solicitantes han determinado que se produce una variante del ácido nucleico de G a A en la posición 1.273 del ADNc (SEQ ID NO:2) que produce la sustitución prevista de aminoácidos de una histidina por una arginina en el codón 344 de la proteína precursora del receptor humano de IL-9. Cuando el residuo de arginina se encuentra en ambos alelos en un individuo, se asocia con menos evidencia al asma atópica. Por tanto, los solicitantes han identificado la existencia de un fenotipo no asmático caracterizado por la arginina en el codón 344 cuando se produce en ambos productos del gen receptor de IL-9 en un individuo. Como consecuencia adicional significativa, los solicitantes han identificado la aparición de sensibilidad a un fenotipo de asma atópica caracterizado por una histidina en el codón 344.

Los solicitantes han determinado también que existe una variante de empalme de IL-9R en la que el residuo de glutamina en la posición 173 de la proteína precursora de IL-9R ha sido eliminado (SEQ ID NO:3) (Figura 5). Los solicitantes han mostrado además que esta variante no puede transcribir una señal por la vía Jak-Stat (Figura 15) y que es incapaz de inducir la proliferación celular al ser estimulada con IL-9 (Figura 16); por tanto, los individuos con este alelo serían menos susceptibles al asma atópica y sus trastornos relacionados.

Los solicitantes han determinado además que existe una variante del ADN genómico de IL-9R en la que nt-213, un residuo de timina en el intrón 5 (213 nt aguas arriba del exón 6), se ha convertido en un nucleótido de citosina. Es probable que dicha variación pueda causar un aumento en la frecuencia de la variante de empalme que elimina el residuo de glutamina al inicio del exón 6.

Además, los solicitantes han descubierto una variante de IL-9R en la que se ha suprimido el exón 8 (SEQ ID NO:4), lo que resulta en un cambio en el marco de lectura y un codón de parada prematuro en el exón 9. Dicha variante sería impedida probablemente en la transmisión de una señal por la vía Jak-Stat y, por tanto, los individuos con este alelo también serían menos sensibles al asma atópica y sus trastornos relacionados.

La actividad biológica de IL-9 resulta de su unión al receptor de IL-9 y la consiguiente propagación de una señal reguladora en células específicas; por tanto, las funciones de IL-9 se pueden interrumpir mediante la interacción de los antagonistas de IL-9 con IL-9 o su receptor. La subregulación, es decir, la reducción de las funciones controladas por IL-9, se consigue de distintas maneras. La administración de antagonistas que pueden interrumpir la unión de IL-9 a su receptor es un mecanismo clave, encontrándose dichos antagonistas dentro del alcance de las reivindicaciones de la invención. Los ejemplos incluyen la administración de productos polipeptídicos codificados por las secuencias de ADN de una forma soluble de origen natural del receptor de IL-9, donde las secuencias de ADN codifican para un polipéptido que comprende los exones 2 y 3 (SEQ ID NO:5). Dos otras variaciones pueden producir formas solubles del receptor de IL-9R que comprenden los exones 2, 3 y 4 y en un caso cuatro aminoácidos procedentes de un marco de lectura diferente en el exón 5 (SEQ ID NO:6) (Figura 6) y en el otro caso hay 27 aminoácidos procedentes de un marco de lectura diferente en el exón 5 (SEQ ID NO:7) (Figura 7).

Los métodos para identificar los agonistas y antagonistas de la vía del receptor de IL-9 se pueden llevar a cabo mediante la evaluación de las interacciones receptor-ligando que vienen descritas en la literatura. Estos métodos se pueden adaptar a ensayos automatizados de alto rendimiento que facilitan los rastreos químicos y la identificación terapéutica potencial. Los agonistas se reconocen por la identificación de una interacción específica con el receptor de IL-9. Generalmente, se acepta la pérdida de unión de un ligando putativo que está marcado cuando se utiliza un exceso de 100 a 1.000 veces de ligando no marcado como evidencia de la unión específica al receptor. Durante estos experimentos, se pueden utilizar muy diversas etiquetas y esquemas de detección. También es una evidencia de un antagonista una pérdida similar de unión cuando se incrementan las concentraciones del compuesto de prueba añadidas a un ligando y receptor conocidos.

El conocimiento de los receptores variables proporciona el medio para construir vectores de expresión que se pueden utilizar para elaborar el receptor soluble para ensayos de unión a receptores. Se puede emplear la mutagénesis de estos receptores solubles para determinar qué residuos de aminoácidos son críticos para unirse al ligando y ayudar en el diseño de los antagonistas en base a su estructura.

Las células que carecen de receptor humano de IL-9 pueden ser transfectadas transitoria o establemente con los vectores de expresión que contienen un receptor variable y ser utilizadas para someter a ensayo la actividad de la vía de IL-9. Estas actividades pueden ser de proliferación celular

o de prevención de la apoptosis, ambas atribuidas a la vía de IL-9. Estas células se pueden utilizar para identificar los agonistas y antagonistas de los receptores tal como se ha descrito anteriormente.

Los métodos mencionados anteriormente representan diversos métodos eficaces que utilizan las formas variables del receptor de IL-9 para desarrollar productos terapéuticos contra el asma atópica y otros trastornos relacionados.

Se han descrito múltiples técnicas que pueden ser utilizadas para diagnosticar el asma atópica y que reconocen variantes de nucleótido único en el receptor de IL-9, incluida la secuenciación de ADN, polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs), análisis de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO), reacción en cadena de la ligasa (LCR), clivaje químico y análisis conformacional de polimorfismos de una sola hebra (SSCP). Un especialista reconocerá que se pueden utilizar una o varias de estas técnicas, así como otras mencionadas en la literatura, para detectar una o más variaciones en el gen receptor de IL-9 o en el transcripto de ARNm.

Se pueden utilizar incluso otras técnicas para detectar las variantes de aminoácido en el receptor de IL-9, las cuales incluyen ELISA, inmunoprecipitación, Western e Inmunoblotting.

Los métodos mencionados anteriormente constituyen métodos eficaces para diagnosticar el asma atópica y otros trastornos relacionados.

Así, los solicitantes han proporcionado métodos que utilizan el receptor de IL-9 para identificar los antagonistas que son capaces de regular la interacción entre IL-9 y su receptor. De forma más específica, los solicitantes proporcionan un método para someter a ensayo las funciones del receptor de IL9 con el fin de identificar aquellos compuestos o agentes que se pueden administrar en una cantidad suficiente para subregular la expresión o las funciones de la vía de IL-9.

Con la identificación del papel de la vía de IL-9 en la alergia atópica, la hiperreactividad bronquial y el asma, los solicitantes también proporcionan un método para el diagnóstico de la sensibilidad y resistencia a la alergia atópica, el asma y trastornos relacionados.

Las figura adjuntas que se incorporan y forman parte de esta especificación ilustran varias realizaciones de la invención y, junto con la descripción, sirven para explicar el principio de la misma.

Breve Descripción de las Figuras

Figura 1: Representación esquemática del ADNc del receptor IL humano. Las casillas describen el exón 2 a 9 que abarcan la región de codificación (tamaño relativo a escala, excepto la parte no traducida 3’ del exón 9, perfilada con una línea de trazos). La región transmembrana es codificada por el exón 7, el dominio intracelular por los exones 8 y 9 y el extracelular por los exones 2 a

6. Las flechas indican polimorfismos o empalmes aberrantes que afectan a la secuencia parcial del exón; a) deleción de los primeros 5 ó 29 nucleótidos en el exón 5; b) deleción de los primeros 3 nucleótidos en el exón 6 (codón 173); c) polimorfismo arg/gly en el codón 310; d) polimorfismo arg/his en el codón 344; e) polimorfismo en el codón 410+n que consiste en 8 ó 9 serinas; *) deleción completa del exón 3, 4 u 8.

Figura 2: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R de tipo salvaje con el alelo Arg en el codón 344 (nucleótidos 12721274) y las repeticiones de 8 Ser/4 Asn que empiezan en el codón 410 (nucleótidos 1470-1472).

Figura 3: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R de tipo salvaje con el alelo His en el codón 344 (nucleótidos 12721274) y las repeticiones de 9 Ser/4 Asn que empiezan en el codón 410 (nucleótidos 1470-1472).

Figura 4: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R con la deleción del exón 8 que provoca un cambio de marco en el exón 9, la producción de 11 aminoácidos de tipo no salvaje y un codón de parada prematuro.

Figura 5: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora IL-9R con deleción de Glutamina en el codón 173.

Figura 6: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R con un empalme alternativo en el exón 5 que resulta en un codón de parada prematuro y la producción de 4 aminoácidos de tipo no salvaje.

Figura 7: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R con un empalme alternativo en el exón 5 que resulta en un codón de parada prematuro y la producción de 27 aminoácidos de tipo no salvaje.

Figura 8: Secuencia de ADNc traducido de la proteína precursora de IL-9R con la deleción del exón 4 que produce un codón de parada como primer codón del exón 5.

Figura 9: Tabla que muestra la asociación entre el genotipo del receptor de IL-9 y la alergia atópica. Los individuos con Arg/Arg son homocigotos para el alelo Arg con las repeticiones de 8 Ser/4 Asn. Los individuos con Arg/His son heterocigotos para el alelo Arg con las repeticiones de 8 Ser/4 Asn y el alelo His con las repeticiones de 9 Ser/4 Asn, repeticiones de 9 Ser/3 Asn y repeticiones 10 Ser/2 Asn en el exón 9. Los individuos con His/His son homocigotos para el alelo His con las repeticiones de 9 Ser/4 Asn, repeticiones de 9 Ser/3 Asn, y repeticiones de 10 Ser/2 Asn en el exón 9. Los individuos con Arg/Arg están protegidos contra la alergia atópica.

Los individuos con Arg/His e His/His son susceptibles de alergia

atópica (P = 0,002).

Figura 10: Mapa del constructo de expresión del receptor de IL-9.

Figura 11: Western blot de las proteínas receptoras de IL-9 recombinante (izquierda: alelo Arg con las repeticiones de 8 Ser/4 Asn; derecha: alelo His con las repeticiones de 9 Ser/4 Asn) utilizando la sonda de anticuerpos C-terminal en la línea celular transfectada de TK.

Figura 12: Expresión de las variantes del receptor IL-9 humano en células TS1, mostrando la movilidad diferencial entre la variante de Arg 344 con las repeticiones de 8 Ser/4 Asn (GR8) y la variante de His 344 con las repeticiones de 9 Ser/4 Asn (GH9). Se observa un cambio de movilidad que demuestra la modificación post-traducción diferencial de estas dos formas de variantes del receptor de IL-9.

Figura 13: Amplímeros específicos de XY para la amplificación específica del gen receptor de IL-9. Los pseudogenes en los cromosomas 9, 10, 16 ó 18 no son amplificados por PCR (M es ADN de ratón, H es ADN humano, y C es ADN de hámster).

Figura 14: Inmunorreactividad de un anticuerpo neutralizante antihumano contra el receptor IL-9 con los receptores de tipo salvaje y Delta-Q. Panel A): células COS7 fueron transfectadas transitoriamente con el vector LXSN solo (A y B), IL-9R de tipo salvaje (C y D), IL-9R de tipo salvaje con 9 residuos de Ser empezando en el codón 410 (E y F), variante de Δ-Q 173 (G y H) y Δ-Q 173 con 9 residuos de Ser empezando en el codón 410 (I y J) e incubados secuencialmente con MAB290 y anticuerpo anti-ratón IgG Texas Red conjugado (B, D, F, H y J) tal como se describe (Ejemplo 8). Se incluyó la tinción DAPI (A, C, E, G e I) para visualizar cada célula en el campo fotografiado. Panel B): como en A) excepto que las células en primer lugar se fijaron/permeabilizaron y luego se incubaron con un anticuerpo específico C-terminal (sc698) seguido de incubación con el anticuerpo anti-conejo IgG Texas Red conjugado. Bar = 10 micras.

Figura 15: Activación de los miembros de las familias Jak, Stat e Irs a través de distintas variantes del receptor humano de IL-9. Células TS1 que expresan GH9, ΔQGR8, o ΔQGH9 fueron privadas de nutrientes durante 6 horas y luego tratadas durante 5 minutos sin citoquina (-), con IL-9 murina (m) o con IL-9 humana (h). Se inmunoprecipitaron los extractos celulares con varios anticuerpos específicos de distintos miembros de las familias Jak, Stat e Irs. Los inmunoblots se sometieron a reacción en primer lugar con un anticuerpo antifosfotirosina para detectar solamente las proteínas fosforiladas en tirosina y luego fueron despojados y re-hibridados con el mismo anticuerpo utilizado para inmunoprecipitar cada proteína. GH9, ΔQGR8, o ΔQGH9 son tal como se indican en la Figura 16.

Figura 16: Proliferación de células TS1 que expresan distintas formas del receptor humano de IL-9. Se sembraron células en cuadruplicado en placas de 96 pocillos (1.000/pocillo) y se trataron sin citoquina o con IL-9 murina o humana (5 ng/ml). Se realizó un ensayo colorimétrico 7 días más tarde para determinar el número de células y se calculó la relación entre las células tratadas y no tratadas (% de control) para evaluar la velocidad de crecimiento. LxSN = células transfectadas con el vector vacío; GR8 es IL-9R de tipo salvaje : GH9 es la variante de His 344 con 9 residuos de Ser empezando en el codón 410; ΔQGR8 y ΔQGH9 son las variantes de ΔQ173 en el tipo salvaje y el fondo de His 344 + 9 - Ser, respectivamente.

Figura 17: Secuencia de ADN genómico del intrón 5 de IL-9R con una variación en el ácido nucleico 213 nt aguas arriba del exón 6 donde un residuo T se convierte en un residuo C tal como se indica por una flecha.

Descripción Detallada de la Invención

Los solicitantes han resuelto estas necesidades de la técnica determinando una vía de IL-9 así como las composiciones que afectan a esta vía, las cuales se pueden utilizar en el tratamiento, diagnóstico y desarrollo de métodos para identificar agentes para prevenir o tratar el asma atópica y trastornos relacionados. La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.

El asma abarca trastornos inflamatorios de las vías aéreas con obstrucción reversible del flujo de aire. La alergia atópica se refiere a atopia y trastornos relacionados incluidos el asma, hiperreactividad bronquial (BHR), rinitis, urticaria, trastornos inflamatorios alérgicos del intestino y varias formas de eczema. La atopia es una hiperreactividad a los alérgenos ambientales expresados como elevación de IgE total en suero o respuestas anormales en la prueba de la piel a alérgenos en comparación con un control. La BHR se refiere a hiperreactividad bronquial, respuesta broncoconstrictora incrementada a una variedad de estímulos.

Al analizar el ADN de individuos que muestran alergia atópica y trastornos relacionados con el asma, los solicitantes han identificado polimorfismos en el gen receptor de IL-9 (IL-9R) que pueden estar en correlación con la expresión del asma. El gen receptor de IL-9 (también conocido por Factor 2 Asociado a Asma o AAF2) se refiere al locus genético del receptor de la interleucina-9, un receptor de citoquina asociado a diversas funciones que implican la regulación de los sistemas linfoide y mieloide humanos. El gen receptor humano de IL-9 de la presente invención se encuentra en la región subtelomérica de los cromosomas XY.

Por polimorfismo, los solicitantes se refieren a un cambio en una secuencia específica de ADN, denominado “locus”, de una secuencia predominante. En general, un locus se define como polimórfico cuando los especialistas en la técnica han identificado dos o más alelos que engloban aquel locus y el alelo menos común aparece con una frecuencia del 1% o superior.

La amplificación específica de IL-9R auténtica (gen que codifica para la proteína biológicamente funcional localizada en la región pseudoautosómica XYq) que utiliza el diseño estándar del cebador no fue posible debido a que IL9R tiene cuatro pseudógenes no procesados altamente homólogos (> 90% de identidad de nucleótidos) en otros loci en el genoma humano (cromosoma 9, 10, 16, 18). Debido a la alta identidad de estos otros genes, la amplificación genómica por PCR utilizando el diseño estándar del cebador resultó en una coamplificación de todos los genes, provocando así que el análisis de la secuencia del gen auténtico fuese equívoco. Para estudiar la estructura auténtica de IL-9R, ya que puede estar relacionada con la predisposición a una enfermedad, tal como el asma, que se describe en esta solicitud, u otras enfermedades como el cáncer (Renauld y col., Oncogene, 9:1327-1332, 1994; Gruss y col., Cancer Res., 52:1026-1031, 1992), los solicitantes han diseñado amplímeros específicos. Se descubrió que los cebadores específicos eran auténticos para la amplificación de IL-9R sin amplificación de los 4 pseudogenes. Se muestran en el Ejemplo 2 las secuencias del cebador y su especificidad se muestra en la Figura 13.

Los solicitantes han amplificado también, por RT-PCR, la totalidad de la región de codificación del ADNc del receptor de IL-9 utilizando ARN extraído de PBMCs (células mononucleares de sangre periférica) purificadas de 50 donantes. La Fig. 1 ilustra las variaciones más frecuentes encontradas en 50 individuos analizados. Los exones 3, 4, 5, 6 y 8 fueron afectados por eventos de empalmes aberrantes en muestras en las que los ADNc de longitud total también se pudieron clonar. Algunos transcriptos mostraron la deleción completa del exón 3, lo que provoca un cambio de marco de lectura que crea un codón de parada después de una expansión de 79 residuos no relacionados. En caso de deleción del exón 4, se genera también un cambio del marco de lectura y el primer codón en el exón 5 se convierte en un codón de parada. En algunos otros ADNc, el exón 5 presentaba la deleción parcial de los primeros 5 o 29 nucleótidos, conduciendo ambas deleciones a cambios en los marcos de lectura que resultaban en codones de parada tempranos dentro del exón 5. Por tanto, en todos los casos, la proteína truncada putativa carecería de la mayor parte del dominio extracelular así como de todos los dominios transmembrana y citoplásmicos. Si se secretan, estas formas pueden funcionar como receptores solubles. Finalmente, los primeros tres nucleótidos del exón 6, que corresponde al codón 173, con frecuencia se encontraron desempalmados, resultando en la deleción de la glutamina en este codón sin ningún otro cambio en la secuencia proteica restante. Esta variante de empalme se relaciona posiblemente con una variante encontrada en el intrón 5 del ADN genómico (SEQ ID NO:24) que incrementaría la frecuencia de la variante de empalme (Figura 17 y Ejemplo 12).

Los solicitantes han encontrado asimismo variaciones alélicas limitadas a la secuencia de codificación del exón 9. Se han descrito anteriormente polimorfismos que involucran el codón 310 y 41029,30 (Kermouni, A y col., Genomics, 371-382 (1995)). El codón 310 codifica para la arginina o la glicina, dependiendo de si el primer nucleótido en aquel codón es una adenina o una guanidina, respectivamente. En el codón 410 (en adelante denominado “410+n”) empieza una expansión de 8 ó 9 repeticiones de trinucleótidos AGC que se traducirían en 8 ó 9 serinas, respectivamente. Los solicitantes han descubierto un nuevo polimorfismo en el codón 344. Aquí, el segundo nucleótido es adenina

o guanidina, siendo respectivamente los dos posibles residuos codificados por este codón histidina o arginina. Además, se observó una correspondencia entre el codón 344 y 410+n donde la arginina en el codón 344 se encuentra consecuentemente con 8 serinas en el codón 410+n y la histidina en el codón 344 se encuentra con 9 serinas. El ADNc del receptor humano de IL-9 originalmente clonado a partir de una línea celular leucémica megacarioblástica humana, Mo7e, presentaba 9 serinas en el codón 410+n y, a diferencia de los clones de los solicitantes, una arginina en el codón 34429. Se ha reportado que otra línea celular leucémica megacarioblástica UT-7 llevaba el mismo alelo de 9 serinas/arginina30. Los solicitantes clonaron 16 ADNc de la línea celular Mo7e y descubrieron que 6 tenían 8 serinas en el codón 410+n y la arginina en el codón

344. Los 10 clones restantes presentaban la secuencia publicada. Los solicitantes genotiparon también la línea celular de leucemia mielocítica humana aguda KG-1 y descubrieron que era homocigota histidina/9 serinas. Estas moléculas de ADN y ARN correspondiente se aíslan por técnicas que son estándar en la técnica, tal como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1985). Por aislado, los solicitantes se refieren a que el ADN está exento de al menos algunos de los contaminantes asociados al ácido nucleico y a los polipéptidos que aparecen en un ambiente natural.

La invención incluye asimismo las proteínas codificadas por secuencias de ácidos nucleicos tal como se describe en las reivindicaciones. La invención incluye también fragmentos de las moléculas. Por fragmentos, los solicitantes se refieren a porciones de la secuencia de ácido nucleico que mantienen la función de la secuencia total. Según se conoce en la técnica, los fragmentos resultan de deleciones, adiciones, sustituciones y/o modificaciones. El origen de las variantes del receptor de IL-9 de la invención es humano. Como alternativa, el ADN o un fragmento del mismo se puede sintetizar por métodos conocidos en la técnica. También es posible producir el compuesto mediante técnicas de ingeniería genética, mediante la construcción de ADN por cualquier técnica aceptada, mediante clonación de ADN en un vehículo de expresión y transfección del vehículo en una célula que expresará el compuesto. Véase por ejemplo los métodos mencionados en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1985).

La demostración de las secuencias variantes del receptor de IL-9, que se pueden asociar a la alergia atópica y a un fenotipo asmático, y otros que se pueden asociar a la carencia de un fenotipo asmático, proporciona métodos de diagnóstico de la susceptibilidad al asma atópica y trastornos relacionados. Ciertas variantes pueden producir receptores solubles que se pueden utilizar para tratar estos trastornos.

Un receptor es un componente soluble o unido a membrana que reconoce y se une a moléculas, y el receptor de IL-9 de la invención es el componente que reconoce y se une a IL-9. Las funciones del receptor de IL-9 consisten en unirse a IL-9 o a una molécula de tipo 9 y en propagar su señal reguladora en células específicas29,30,34,35. Se ha demostrado que la IL-9 humana provoca la fosforilación del receptor de IL-9 mismo y la activación de las proteínas de la vía Jak-Stat, Jak1, Stat1, Stat3, Stat5 e Irs2, a la unión del receptor humano de IL-9 (Demoulin, J-B y col., Molecular and Cellular Biology,

p. 4710-4716, Sept. 1996). Los solicitantes han examinado si IL-9R o sus variantes mostraban alguna tendencia a la activación de estas proteínas y extendieron el análisis a Jak3 e Irs1. Se determinó que todas las proteínas de la vía, incluidas las vías Jak3 e Irs1, fueron fosforiladas por la activación de IL-9R. Se determinó también que las variantes de IL-9R con cambios en los codones 310, 344 y 410+n proporcionaban la misma sobrerregulación que la IL-9R de tipo salvaje. Por tanto, un aspecto de la invención consiste en productos terapéuticos para el tratamiento del asma atópica que inhiban las interacciones en la vía Jak-Stat.

A diferencia del receptor de tipo salvaje y de las otras variantes sometidas a prueba, la variante ΔQ173 no pudo activar proteínas en la vía Jak-Stat (Figura 15). Además, la variante ΔQ173 no pudo soportar la proliferación celular a la estimulación de IL-9 (Figura 16). Por tanto, los individuos que expresan la variante ΔQ173 probablemente son menos sensibles al asma atópica y trastornos relacionados. Así, un aspecto de la invención se refiere a productos terapéuticos para incrementar la expresión de la variante de empalme ΔQ173 para el tratamiento del asma atópica y trastornos relacionados.

Una realización diagnóstica implica el reconocimiento de variaciones en la secuencia de ADN del gen receptor de IL-9 o su transcripto. Un método implica la utilización de una molécula de ácido nucleico (también conocida como sonda) que tiene una secuencia complementaria de los receptores de IL-9 de la invención en condiciones de hibridación suficientes, tal como lo entenderán los especialistas en la técnica. En una realización, la molécula de ácido nucleico se unirá específicamente al codón para Arg344 de la proteína madura del receptor de IL-9, o a His 344, y en otra realización se unirá tanto a Arg344 como a His344. En todavía otra realización, se unirá al codón para Gln 173. Estos métodos se pueden utilizar también para reconocer otras variantes del receptor de IL-9. Otro método para reconocer la variación en la secuencia de ADN asociada a estos trastornos es el análisis directo de la secuencia de ADN por diversos métodos bien conocidos en la técnica44. Otra realización implica la detección de la variación en la secuencia de ADN en el gen receptor de IL-9 asociado a estos trastornos40-44. Estos métodos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa, el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) y el análisis conformacional en una sola hebra. En una realización preferente, los solicitantes proporcionan específicamente un método para reconocer, a nivel genético, el polimorfismo en el receptor de IL-9 asociado a los alelos His344 y Arg344 utilizando una ASO PCR. En otras realizaciones, se puede emplear la reacción en cadena por ligación para distinguir estos alelos de los genes receptores de IL-9.

Se describen también métodos para la identificación de los antagonistas de IL-9 y su receptor. Los antagonistas son compuestos que están desprovistos ellos mismos de actividad farmacológica, pero que causan efectos al presentar la acción de un agonista. Para identificar un antagonista de la invención, se puede someter a prueba la unión competitiva con un agonista conocido o la subregulación de las funciones de tipo IL-9 tal como se describe aquí y en la literatura mencionada 2,22-35.

Se pueden utilizar ensayos específicos para rastrear productos farmacéuticos útiles para el tratamiento de la alergia atópica en base al papel conocido del receptor de IL-9 en la proliferación de los linfocitos T, síntesis de IgE y liberación de los mastocitos29,30,33-35. Otro ensayo implica la capacidad del receptor humano de IL-9 para inducir específicamente la fosforilación rápida y transitoria de la tirosina de múltiples proteínas en células Mo7e34. Debido a que esta respuesta depende de la expresión y activación del receptor de IL-9, representa un método o ensayo sencillo para la caracterización de compuestos potencialmente valiosos. La fosforilación de la tirosina del factor de transcripción Stat3 parece estar relacionada específicamente con las funciones del receptor de IL-935 y esta respuesta representa un método o ensayo sencillo para la caracterización de los compuestos tal como se describe.

Todavía otro método para caracterizar la función del receptor de IL-9 implica la utilización del bien conocido clon TS1 murino transfectado con un receptor humano, que se puede utilizar para evaluar la función de IL-9 humana en un ensayo de proliferación celular29. Se pueden emplear estos métodos para identificar los antagonistas del receptor de IL-9.

En otra realización, la invención incluye la subregulación de la expresión

: o función de IL-9 mediante la administración de moléculas del receptor soluble de IL-9 que, según se reivindica, se unen a IL-9. Los solicitantes y Renauld y col.29 han mostrado la existencia de una forma soluble del receptor de IL-9. Esta molécula se puede utilizar para impedir la unión de IL-9 al receptor unido a la célula y actuar como antagonista de IL-9. Se han utilizado receptores solubles para unir citoquinas u otros ligandos para regular su función45. Un receptor soluble es una forma de un receptor unido a membrana que aparece en solución

: o fuera de la membrana. Los receptores solubles pueden presentarse debido a que el segmento de la molécula que se asocia comúnmente a la membrana está ausente. Este segmento se denomina comúnmente en la técnica como dominio transmembrana del gen o segmento de unión a membrana de la proteína. Así, en una realización de la invención, un receptor soluble puede representar un fragmento o un análogo de un receptor unido a membrana.

Los solicitantes han identificado tres variantes de empalme del receptor humano IL-9 que resultan en la producción de proteínas que podrían actuar como receptores solubles.

Una variante del empalme resultó en la deleción del exón 4 que introdujo un cambio del marco de lectura, resultando en un codón de parada como primer codón del exón 5. Esta variante produciría un péptido de aproximadamente 45 residuos que contiene un epítopo reactivo con los anticuerpos que bloquean la interacción IL-9/IL-9R. Las otras dos variantes contienen deleciones en el exón 5, que producirán codones de parada prematuros de forma temprana en el exón, pero, en estos casos, sin deleción del exón 4. Estas variantes producirían una proteína de aproximadamente 100 residuos que contiene también el epítopo reconocido por el anticuerpo bloqueante.

Los receptores solubles de IL-9 se pueden utilizar para rastrear productos terapéuticos potenciales, incluido el antagonista, útiles en el tratamiento del asma atópica y trastornos relacionados.

Por ejemplo, el screening de péptidos y anticuerpos de una sola cadena por medio de la visualización de fagos se podría facilitar con la utilización de un receptor soluble. El fago que se une al receptor soluble se puede aislar y la molécula puede identificarse por captura por afinidad del receptor y del fago unido. Además, el screening de compuestas para agentes útiles en el tratamiento del asma atópica y trastornos relacionados puede incorporar un receptor soluble y un ligando que se unen en ausencia de un antagonista. La detección de la interacción del ligando y del receptor se debe a la proximidad de estas moléculas. Los antagonistas se reconocen por inhibir estas interacciones.

La invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos procedentes del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferente cuando la composición farmacéutica se administra de forma intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se pueden emplear también como vehículos líquidos, en particular para soluciones inyectables. Se describen vehículos farmacéuticamente adecuados en Martin, E.W., Remington’s Pharmaceutical Sciences, incorporados aquí específicamente como referencia.

Los compuestos utilizados en el método de tratamiento se pueden administrar sistémica o tópicamente, dependiendo de consideraciones como la condición que se debe tratar, la necesidad de un tratamiento específico del sitio, la cantidad de medicamento que se debe administrar y consideraciones similares.

Se puede utilizar la administración tópica. Se puede emplear cualquier forma tópica común, tal como solución, suspensión, gel, ungüento o bálsamo y similares. La preparación de dichas formulaciones tópicas está bien descrita en la técnica de las formulaciones farmacéuticas, tal como se ilustra, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Science, Edición 17, Mack Publishing Company, Easton, Pa. Para la aplicación tópica, se pueden administrar también estos compuestos como polvo o pulverización, particularmente en forma de aerosol. En una realización preferente, los compuestos de la presente invención se pueden administrar por inhalación. Para la terapia por inhalación, el compuesto puede encontrarse en una solución útil para la administración mediante inhaladores de dosis medidas, o en una forma adecuada para un inhalador de polvo seco. El ingrediente activo se puede administrar en composiciones farmacéuticas adaptadas para la administración sistémica. Como se conoce, si se debe administrar sistémicamente un medicamento, se puede preparar en forma de polvo, píldora, tableta o similar, o como jarabe o elixir para la administración oral. Para la administración intravenosa, intraperitoneal o intralesional, el compuesto se puede preparar como solución o suspensión a administrar mediante inyección. En ciertos casos, puede resultar útil formular estos compuestos en forma de supositorio o como formulación de liberación prolongada para su depósito bajo la piel o por inyección intermuscular.

Una cantidad eficaz es aquella cantidad que subregulará las funciones controladas por el receptor de IL-9. Determinada cantidad eficaz variará de una condición a otra y, en ciertos casos, puede variar según la gravedad de la condición que se está tratando y la sensibilidad del paciente al tratamiento. En consecuencia, se determinará cierta cantidad eficaz en el momento y lugar por experimentación de rutina. Se anticipa, sin embargo, que en el tratamiento del asma y trastornos relacionados de acuerdo con la presente invención, una formulación que contiene entre un 0,001 y un 5 por ciento en peso, preferentemente alrededor del 0,01 al 1%, constituirá normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz. Cuando se administra sistémicamente, una cantidad entre 0,01 y 100 mg por kg de peso corporal al día, pero preferentemente alrededor de 0,1 a 10 mg/kg, tendrá un resultado terapéutico en la mayoría de los casos.

Los solicitantes proporcionan asimismo un método para seleccionar los compuestos que subregulan las funciones controladas por el receptor de IL-9. Se puede determinar si las funciones expresadas por el receptor de IL-9 están subreguladas por medio de técnicas estándar en la técnica29,30,34,35. En una realización específica, los solicitantes proporcionan un método de identificación de los compuestos de funciones comparables con IL-9. En una realización, las funciones del receptor de IL-9 se pueden evaluar in vitro. Como es conocido por los especialistas en la técnica, la activación del receptor humano de IL-9 induce la fosforilación rápida y transitoria de la tirosina de múltiples proteínas en células sensibles a IL-9. La fosforilación de la tirosina del factor de transcripción Stat3 parece estar relacionada específicamente con las acciones de la vía de IL-9. Otro método para caracterizar la función de IL-9 y moléculas de tipo IL-9 depende de la “expresión estable” de los receptores de IL-9 en clones murinos TSI o clones TF1, que no expresan normalmente el receptor humano. Se pueden utilizar estos transfectantes para evaluar la función del receptor humano de IL-9 con un ensayo de proliferación celular29.

La presente especificación incluye también un ensayo de screening simple para la unión saturable y específica de ligandos basado en líneas celulares que expresan las variantes del receptor de IL-923,29. El receptor de IL-9 se expresa en una amplia variedad de tipos celulares, incluyendo K562, C816645, KG-1 transfectadas con receptores humanos de IL-9, células B, células T, mastocitos, HL60, clon 5 de HL60, TS1 transfectada con receptores humanos de IL-9, 32D transfectada con receptores humanos de IL-9, neutrófilos, megacariocitos (células UT-7)30, la línea celular de la leucemia megacarioblástica humana Mo7e34, TF129, macrófagos, eosinófilos, timocitos fetales, la línea celular renal humana 29330 y 32D murina, así como las líneas celulares progenitoras hipocampales embrionarias23,29,30.

La práctica de la presente invención emplea los términos y técnicas convencionales de biología molecular, farmacología, inmunología y bioquímica que forman parte de la especialización normal de los especialistas en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, o Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.

Sin embargo, ofrecemos la siguiente información preliminar básica. El material genético del cuerpo, o ADN, está dispuesto en 46 cromosomas, comprendiendo cada uno de ellos dos brazos unidos por un centrómero. Cada cromosoma se divide en segmentos designados p o q. El símbolo p se utiliza para identificar el brazo corto de un cromosoma, según se mide desde el centrómero hasta el telómero más próximo. El brazo largo de un cromosoma se designa por el símbolo q. El emplazamiento en un cromosoma viene dado por el número del cromosoma (es decir, el cromosoma 5) así como las coordenadas de la región p o q (es decir, q31-q33). Además, el cuerpo lleva los cromosomas sexuales, X e Y. Durante la meiosis, los cromosomas X e Y intercambian información de las secuencias de ADN en zonas conocidas como regiones pseudoautosómicas.

El ADN, ácido desoxirribonucleico, se compone de dos hebras complementarias de nucleótidos, que incluyen los cuatro diferentes compuestos base, adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). A de una hebra se une a T de la otra hebra, mientras C de una hebra se une a G de la otra para formar “pares de bases” complementarios, teniendo cada par una base en cada hebra.

Un agrupamiento secuencial de tres nucleótidos (un “codón”) codifica para un aminoácido. Así, por ejemplo, los tres nucleótidos CAG codifican para el aminoácido Glutamina. Los 20 aminoácidos naturales, y sus códigos de una

letra, son los siguientes:

Alanina: Ala A

Arginina: Arg R

Asparagina: Asn N

Ácido Aspártico: Asp D

Asparagina o Ácido Aspártico: Asx B

Cisteína: Cys C

Glutamina: Gln Q

Ácido de Glutamina: Glu E

Glutamina o Ácido Glutámico: Glx Z

Glicina: Gly G

Histidina: His H

Isoleucina: Ile I

Leucina: Leu L

Lisina: Lys K

Metionina: Met M

Fenilalanina: Phe F

Prolina: Pro P

Serina: Ser S

Treonina: Thr T

Triptófano: Trp W

Tirosina: Tyr Y

Valina: Val V

Los aminoácidos comprenden proteínas. Los aminoácidos pueden ser hidrofílicos, es decir, presentar afinidad por el agua, o hidrofóbicos, es decir, tener aversión al agua. Así, los aminoácidos designados por G, A, V, L, I, P, F, Y, W, C y M son hidrofóbicos y los aminoácidos designados por S, Q, K, R, H, D, E, N y T son hidrofílicos. En general, la naturaleza hidrofílica o hidrofóbica de los aminoácidos afecta al plegado de una cadena peptídica y, por consiguiente, a la estructura tridimensional de una proteína.

El ADN se relaciona con la proteína como sigue:

ADN genómico ARNm proteína

imagen1

ADNc

El ADN genómico comprende todas las secuencias de ADN encontradas en una célula del organismo. Se “transcribe” en ARN mensajero (“ARNm”). El ADN complementario (“ADNc”) es una copia complementaria del ARNm realizada por transcripción inversa del ARNm. A diferencia del ADN genómico, tanto ARNm como ADNc contienen sólo las regiones de codificación de proteínas o de codificación de polipéptidos del ADN, los denominados “exones”. El ADN genómico puede incluir también “intrones” que no codifican proteínas.

De hecho, los genes eucariotas son discontinuos con las proteínas codificadas por ellos, consistentes en exones interrumpidos por intrones. Después de la transcripción en ARN, los intrones son eliminados mediante empalmes para generar el ARN mensajero maduro (ARNm). Los puntos de empalme entre los exones son determinados típicamente por las secuencias consenso que actúan como señales para el proceso de empalme. El proceso de empalme se compone de una deleción del intrón de la transcripción primaria del ARN y de una unión o fusión de los extremos del ARN restante en cada lado del intrón suprimido. La presencia o ausencia de intrones, la composición de intrones y el número de intrones por gen pueden variar entre cepas de la misma especie y entre especies con el mismo gen funcional básico. Aunque, en la mayoría de los casos se supone que los intrones son no esenciales y benignos, su categorización no es absoluta. Por ejemplo, un intrón de un gen puede representar un exón de otro. En algunos casos, modelos alternativos o diferentes de empalmes pueden generar distintas proteínas de la misma única extensión de ADN. De hecho, las características estructurales de los intrones y los mecanismos de empalmes subyacentes forman la base de la clasificación de distintos tipos de intrones.

Con respecto a los exones, éstos pueden corresponder a dominios o motivos discretos tales como, por ejemplo, dominios funcionales, regiones de plegado o elementos estructurales de una proteína, o a secuencias polipeptídicas cortas, tales como vueltas inversas, bucles, señales de glicosilación y otras secuencias señal, o a regiones enlazantes de polipéptidos no estructurados. Los módulos de exones del presente método combinatorio pueden comprender secuencias de ácido nucleico que corresponden a secuencias de exones naturales o a secuencias de exones naturales que han sido mutados (por ejemplo mutaciones de puntos, truncaciones, fusiones).

Volviendo ahora a la manipulación de ADN, el ADN se puede cortar, empalmar y de otro modo manipular utilizando “enzimas de restricción”, que cortan el ADN en ciertos sitios conocidos y las ADN ligasas que se unen al ADN. Los especialistas en la técnica conocen bien estas técnicas, tal como se establece en textos como Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1985) o Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

El ADN de un tamaño y secuencia específicos se puede insertar entonces en un “replicón”, que es cualquier elemento genético, tal como un plásmido, cósmido o virus que es capaz de replicación bajo su propio control. Un “vector recombinante” o “vector de expresión” es un replicón en el que se inserta un segmento de ADN para permitir la expresión del ADN; es decir, la producción de la proteína codificada por el ADN. Los vectores de expresión se pueden construir en laboratorio, obtenerse de otros laboratorios o comprarse a fuentes comerciales.

El vector recombinante (conocido por varios términos en la técnica) se puede introducir en un huésped mediante un proceso genéricamente conocido como “transformación”. Transformación significa la transferencia de un segmento de ADN exógeno mediante uno cualquiera de los métodos que incluyen infección, captación directa, transducción, apareamiento-F, microinyección o electroporación en una célula huésped.

Las células huésped unicelulares, conocidas de diferentes modos como células huésped recombinantes, células y cultivo celular, incluyen bacterias, levaduras, células de insectos, células vegetales, células de mamíferos y células humanas. En realizaciones particularmente preferentes, las células huésped incluyen E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Levadura, células CHO, RI-1, B-W, LH, COS-J, COS-7, BSC1, BSC40, BMT10 y S69. Las células de levadura incluyen especialmente Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula y Torulopsis.

Como es conocido por los especialistas en la técnica, la expresión del segmento de ADN por la célula huésped requiere secuencias o elementos reguladores adecuados. Las secuencias reguladoras varían según la célula huésped empleada, pero incluyen, por ejemplo, en procariotas, un promotor, un sitio de unión ribosómico y/o un sitio de terminación de la transcripción. En eucariotas, dichas secuencias reguladoras incluyen un promotor y/o un sitio de terminación de la transcripción. Como es conocido por los especialistas en la técnica, la expresión del polipéptido se puede mejorar, es decir, aumentar en los niveles estándar, mediante la selección y colocación cuidadosas de estas secuencias reguladoras.

El ADN se puede expresar como un polipéptido de cualquier longitud tal como péptidos, oligopéptidos y proteínas. Los polipéptidos incluyen asimismo modificaciones traslacionales tales como glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares.

Otra técnica biológica molecular de interés para la presente invención es el “análisis de enlaces genéticos”. El análisis de enlaces es un método analítico empleado para identificar el cromosoma o la región cromosómica que tiene correlación con una característica o trastorno47. Los cromosomas son las unidades básicas de la herencia sobre las que se organizan los genes. Además de los genes, los especialistas han identificado “marcadores de ADN” en cromosomas. Los marcadores de ADN son secuencias conocidas de ADN cuya identidad y secuencia se pueden determinar fácilmente. La metodología de análisis de enlaces genéticos ha sido aplicada al mapeo de genes de enfermedades, por ejemplo, genes relacionados con la sensibilidad al asma, a cromosomas específicos47,48. Otras realizaciones de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica al considerar la especificación y práctica de la invención descrita. Se pretende que la especificación y los ejemplos sean considerados como solamente ilustrativos, indicando las reivindicaciones el alcance real de la invención.

Habiéndose proporcionado esta información preliminar, los solicitantes describen ahora los aspectos preferentes de la invención.

Ejemplo 1: Identificación de polimorfismos de transcripción del receptor de IL-9

Se determinó aleatoriamente una población de 52 individuos con respecto al asma y atopia de la región de Filadelfia, Pensilvania. Se sometió a ensayo el IgE total en suero mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Genzyme, Cambridge, Massachusetts).

Para evaluar las formas estructurales del ADNc del receptor humano de IL-9, se aislaron las PBMCs procedentes de estos 52 donantes no relacionados y se cultivaron en presencia de PHA y PMA (descritos en el Ejemplo 4). Los datos previos procedentes del laboratorio de los solicitantes demostraron la cinética de expresión para el mensaje del receptor de IL-9 en el pico de cultivos primarios el día 6 después de la estimulación con mitógenos. Así, los solicitantes cultivaron las células durante 6 días, momento en el cual se cosecharon las células y se aislaron su ARN y ADN tal como se describe en el Ejemplo 5.

Los ARN se sometieron a transcripción inversa y amplificación por PCR utilizando cebadores específicos de ADNc de longitud total del receptor de IL-9 tal como se describe en el Ejemplo 5. Los productos de amplificación procedentes de cada individuo se clonaron en el vector de clonación TA mediante PCR, se secuenciaron diez clones que contenían las inserciones esperadas (tal como se determina mediante digestión y electroforesis en gel) en su totalidad y se analizaron en busca de la variación estructural o de secuencia.

Del screening anterior se identificaron siete variantes principales. Estos ADNc representan una deleción en el codón 173, una deleción en el exón 4, dos deleciones separadas en el exón 5, una deleción en el exón 8, y un ADNc de longitud total que contenía un cambio de ARG en HIS en el codón 344 de la proteína madura. Existen variantes adicionales en cada uno de estos fondos genéticos. El alelo Arg se asocia con las repeticiones 8 Ser / 4 Asn y las repeticiones 7 Ser / 4 Asn; el alelo His se asocia con las repeticiones 9 Ser / 4 Asn, las repeticiones 9 Ser / 3 Asn, y 10 Ser / 2 Asn. Se describen en la Figura 1 todas estas variantes.

Las variantes se clonaron en el vector de expresión eucariota pCEP4 (Clontech) que contiene un promotor de CMV que dirige la expresión del ADNc clonado seguido de una señal de poliadenilación de SV40. El vector contiene asimismo un gen de resistencia a la higromicina B, que se utiliza para la selección de células eucariotas que contienen el vector y que expresan probablemente el ADNc clonado bajo el control del promotor de CMV. Se analizaron por secuencia los plásmidos recombinantes y aquellos plásmidos que contenían inserciones correctas de ADNc fueron transfectados en células receptoras eucariotas, tales como fibroblasto TK-ts13 de hámster sirio, glioblastoma T98G humano, la línea de leucemia mieloide humana TF-1, y la línea celular murina precursora mieloides 32D, tal como se describe en el Ejemplo 3. Se evaluó biológicamente la función como respuesta al ligando de IL9 en el crecimiento y/o la apoptosis (Ejemplo 7 y 10).

Se desarrollaron experimentos con los ADNc de longitud total del receptor de IL-9 que contenían las variantes ARG o HIS son fibroblastos de hámster TKts13 o células humanas de glioblastoma T98G. Se transfectaron las células y se analizaron 48 horas después mediante Westernblot y tinción in situ utilizando anticuerpos humanos carboxi-terminal específicos (Santa Cruz) (Ejemplo 8). El análisis in situ demostró que ambas formas del receptor parecían expresarse en las líneas tanto de hámster como humana (Figuras 11 y 12). Es interesante observar que, mientras los Westernblots de ambas formas parecían expresarse a niveles iguales en las líneas tanto humanas como de hámster, apareció un modelo de migración diferencial entre las formas receptoras de ARG e HIS en la línea celular TS1 (Figura 12), lo que sugiere una modificación post-traducción diferencial como glicosilación, fosforilación, etc. La diferencia bioquímica puede ser el mecanismo por el cual la función alterada resulta en el fenotipo alterado.

La frecuencia de las diversas sustituciones se utilizó como estimación puntual del predominio de cada variante en la población general. Se comparó el genotipo con el fenotipo evaluado mediante cuestionario. Un médico determinó un diagnóstico de alergia y asma con la revisión de los cuestionarios. Era menos probable que los individuos homocigotos para los alelos Arg344 mostrasen una notable evidencia de alergia y asma en comparación con los heterocigotos u homocigotos con His344 (Figura 9).

Ejemplo 2: Análisis genómico de los genes receptores de IL-9

Con el fin de realizar análisis genómicos de individuos alérgicos y/o asmáticos, se diseñó la siguiente estrategia para crear cebadores específicos de PCR para los genes receptores auténticos de IL-9 localizados en las regiones pseudoautosómicas X/Y y excluir los pseudógenes altamente conservados del receptor de IL-9 localizados en los cromosomas 9, 10, 16 y 18. En primer lugar, se preformaron alineamientos de secuencias entre los dos pseudógenes publicados y la secuencia genómica de los genes receptores de IL-9. Entonces se diseñaron inicialmente cebadores en regiones divergentes entre los genes auténticos y los pseudogenes, y luego se analizaron por PCR utilizando únicos híbridos específicos de cromosomas procedentes del Depósito de ADN Coriell

(Camden, NJ). Si los cebadores producen solamente productos correctamente dimensionados procedentes de los híbridos X e Y, entonces se optimizan para una amplificación robusta. En varios casos, los cebadores dirigidos a las regiones divergentes no eran específicos de XY; por tanto, los solicitantes 5 introdujeron cambios adicionales de bases en el cebador particular para aumentar un número de desajustes más alto frente a los pseudogenes en comparación con la secuencia del gen receptor de IL-9. La Tabla 1 contiene la secuencia de los cebadores y las temperaturas óptimas de alineamiento para la amplificación específica de XY. La especificidad de estos cebadores para la

10 amplificación de XY se muestra en la Figura 13.

Tabla 1 Amplímeros Específicos del Receptor de IL-9

Exón: Cebador sentido Cebador antisentido T Tamaño

2: 5’- AGG CTT GAC ATC GGA CAA C -3’ (SEQ ID NO 9) 68* 300 pb

3: 62* 222 pb

4: 5’- CAA GGC CCT GCT CCA AA 3’ (SEQ ID NO 13) 64* 335 pb

5: 62* 259 pb

6: 5’-TGAGGTGAACAGGGGAGAA3’ (SEQIDNO17) 62* 337 pb

7: 5’- ACA AGG GCG GCC TTT GAT -3’ (SEQ ID NO 19) 60* 262 pb

8: 5*- CCT GCC CCC CAT GTT CTT -3’ (SEQ ID NO 21) 58* 376 pb

9: 5’-GGACATGATGCATCTGGCG3’ (SEO IDNO23) 62* 664 pb

Estos cebadores representan un nuevo método para analizar la variación en las secuencias de ADN de estos genes, pudiéndose utilizar para diagnosticar 15 la sensibilidad o la resistencia al asma atópica y trastornos relacionados.

Utilizando esta tecnología, se examinó cada exón mediante análisis de las secuencias de ADN para individuos en poblaciones de los solicitantes para detectar la variación en las secuencias del gen receptor de IL-944. Los polimorfismos de las secuencias se distinguieron del artefacto mediante análisis repetidos. Una asociación de las variantes del receptor con los fenotipos alérgicos se establece en la Figura 9. La secuencia de los alelos del receptor se establece en las Figuras 1-8.

Ejemplo 3: Expresión del receptor de IL-9 y ensayo de unión de ligandos

Se marcaron por fluorescencia con alta actividad específica la IL-9 recombinante purificada y los compuestos potencialmente similares a IL-9 en estructura o función por medio de técnicas comerciales de acuerdo con las recomendaciones del suministrador (Pierce). Células humanas Mo7e y murinas 32D se cultivan y resuspenden a 37ºC en 0,8 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco completado por un 10% (vol/vol) de suero fetal bovino, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 0,55 mM de L-arginina, 0,24 mM de L-asparagina y 1,25 mM de L-glutamina o RPMI completado por un 10% (vol/vol) de suero fetal bovino, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 0,55 mM de L-arginina, 0,24 mM de L-asparagina, y 1,25 mM de L-glutamina, respectivamente. Se utilizaron las células tal como son TF1.1 (células TF1 que carecen de receptores humanos de IL-9), T98G, TK-y murinas 32D, (Ejemplo 7 y 10) o después de transfección con los constructos del receptor humano de IL-9 tal como se describe más adelante. Se clonó ADN plasmídico que contiene una de las formas de longitud total o truncada de los receptores de IL-9 en el plásmido pCEP4 (Clontech) y se purificó por centrifugación en columnas Qiagen (Qiagen). Se añadió ADN plasmídico (50 microgramos) a las células en cubetas de 0,4 cm justo antes de la electroporación. Después de un doble impulso eléctrico (750 V/74 ohm/40 microfaradios y 100 V/74 ohm / 2100 microfaradios), se diluyen inmediatamente las células en medio fresco completado con IL-9.

Se generaron células transfectadas estables después de 14 días de selección con higromicina-B (400 μg/ml a 1,6 mg/ml). Se analizaron por Westernblot y tinción in situ clones resistentes a higromicina en busca de la expresión del receptor de IL-9 tal como se describe en el Ejemplo 8.

Se visualiza la unión del receptor celular directamente en tiempo real con microscopía de fluorescencia. La unión e internalización se sigue en el tiempo en células control (no transfectadas) y con células transfectadas con cada una de las variantes conocidas del receptor de IL-9. Se utiliza un exceso de ligando no marcado o anticuerpo bloqueante en experimentos paralelos para demostrar la unión específica.

El receptor soluble de IL-9 que incluye los aminoácidos 44 a 270 con o sin una marca doble (ditag) de HA se incuba también con distintas formas de IL-9 humana recombinante marcada. Cantidades variables de ligando marcado con FLAG (IBI) se incuban en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos con 0,5 μg de receptor soluble. Se añade tampón EBC (300 μl) (50 mM de Tris con pH 7,5; 0,1 M de NaCl; 0,5% de NP40) junto con 1 μg de anticuerpo anti-HA o anticuerpo monoclonal anti-FLAG (IBI) y se incuba durante 1 hora en hielo. Se añaden cuarenta microlitros de una solución de sefarosa-proteína A a cada muestra y se mezclan durante 1 hora a 4ºC. Se centrifugan las muestras durante 1 minuto 1.000xg y se lavan los gránulos 4 veces con 500 μl de EBC. Se disuelven los gránulos en 26 μl de tampón 2 x SDS, se hierven durante 4 minutos y se someten a electroforesis en un gel de poliacrilamida con SDS al 18%. Se someten a prueba los Westernblot con un anticuerpo del receptor de anti-IL-9 (Santa Cruz Inc.) o un anticuerpo monoclonal anti-FLAG (IBI) contra rhIL-9 marcado con FLAG. Se evalúan los candidatos terapéuticos midiendo el antagonismo de la unión de ligando. En las Figuras 11 y 14 se muestra la expresión del receptor.

Ejemplo 4: Aislamiento de células y cultivo

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de donantes sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando Ficoll-Paque PLUS probado para endotoxina de acuerdo con el fabricante (Pharmacia Biotech, AB Uppsala Suecia). Se cultivaron PBMC (5 x 106), células de bazo de ratón (5 x 106), o células Mo7e (5 x 106) en 7 ml de RPMI-1640 (Bethesda Research Labs (BRL), Bethesda, MD) completadas hasta una concentración final del 10% con suero humano isogénico o FBS inactivado por calor. Se cultivaron las células durante 24 horas a 37ºC sin estimular, o estimuladas con PMA 5 μg/ml / PHA 5 μg/ml, o PHA 5 μg/ml y rhlL2 50 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN).

Ejemplo 5: Aislamiento de ADN & ARN, rtPCR, clonación y secuenciación de productos de PCR

Se extrajo ARN citoplásmico y ADN genómico después de 6 días de estimulación con mitógenos procedentes de PBMC cultivadas, tal como se describe en Nicolaides y Stoeckert46. Un μg de ARN procedente de cada fuente se desnaturalizó durante más de 10 minutos a 70ºC y luego se sometió a transcripción inversa (V+) en ADNc utilizando 2,5 unidades de transcriptasa inversa Superscript II (GIBCO, BRL), 1 U/l de Inhibidor de ARNasa, 2,5 mM de cebador oligo d(T)16, 1mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl, pH de 7,0, 25 mM de MgCl2 a 37ºC durante una hora. Se utilizó una reacción de transcripción inversa de simulación como control negativo.

Se utilizó la vigésima parte de la reacción rt en la PCR (50 μl) que contenía 6,7 mM de MgCl2, 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM de Tris-HCl, pH de 8,8, 10 mM de 2-mercaptoetanol, 6% de DMSO, 1,25 mM de cada uno de dNTP, 2,5 U de Amplitaq ADN polimerasa, y 300 ng de cada uno de los oligonucleótidos que representan el exón 2 de IL-9 humana de ADNc (hacia adelante 5’-GCT GGA CCT TGG AGA GTG-3’) (SEQ ID NO:1) y el exón 9 (inversa 5’-GTC TCA GAC AAG GGC TCC AG-3’) (SEQ ID NO:2). La mezcla de reacción se sometió a las siguientes condiciones de PCR: 120 segundos a 95ºC, luego 35 ciclos a: 30 segundos a 94ºC, 90 segundos a 58ºC; 90 segundos a 72ºC. Finalmente, la mezcla de reacción se sometió a ciclos una vez durante 15 minutos a 72ºC para la extensión.

Los productos de PCR que representan ADNc del receptor de hIL-9 se sometieron a electroforesis en gel con geles de agarosa al 1,5% y se visualizaron utilizando una tinción con bromuro de etidio. Los productos de una reacción de transcriptasa rinersa de simulación, en la que H2O se sustituyó por ARN, se utilizaron como amplificación del control negativo en todos los experimentos.

Los productos de PCR se subclonaron en el vector de clonación TA (Invitrogen, San Diego, CA). La amplificación del ADNc humano dio un producto de 1614 pb. Los plásmidos que contenían inserciones de ADNc del receptor de hIL-9 se aislaron por técnicas convencionales (Sambrook, J., y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Después de la amplificación, la secuencia de ADN que incluía y rodeaba cada inserción se analizó mediante secuenciación (Sanger y col., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) utilizando didesoxi terminadores fluorescentes en un secuenciador automático (ABI 377, Perkin Elmer) para la determinación de errores inducidos por la PCR o inducidos por la clonación. Las inserciones de ADNc del receptor de hIL-9 sin clonación y/o los errores en secuencias inducidos por polimerasa se subclonaron en vectores de expresión.

Ejemplo 6: Clonación y expresión de los constructos del receptor de IL-9

in vitro

Los receptores de hIL-9 se subclonaron en el vector de expresión eucariota episomal pCEP4 (Clontech). Las inserciones se clonaron como fragmentos de BamH1-Xhol en el polienlazador de pCEP4 en el sentido de orientación al promotor de CMV utilizando técnicas estándar (Figura 10). Los constructos se expresaron en células huésped tal como se ha descrito.

Ejemplo 7: Ensayos celulares utilizando Mo7e, 32D, TF1.1, TK-ts13 y T98G

Se utilizaron líneas celulares para evaluar la función de los receptores variables de IL-9 y para la selección de compuestos potencialmente útiles en el tratamiento del asma atópica. Se sometieron a ensayo los compuestos en cuanto a su capacidad para antagonizar la respuesta antiapoptótica o proliferativa de la línea base provocada por IL-9. Una vez establecida una respuesta proliferativa o antiapoptótica de la línea base en determinada línea celular, una pérdida de respuesta estadísticamente significativa en ensayos repetidos tres veces en triplicado fue considerada como una evidencia del antagonismo. Una respuesta antagonística real se diferenció de la toxicidad celular mediante observación directa, tinción con azul de tripano (técnica bien conocida por un especialista en la técnica), o por pérdida de actividad fosfatasa ácida. La especificidad del antagonismo se evalúa para cada compuesto mediante la evaluación de si se demuestra actividad contra otros agentes proliferativos, tales como interleucina-3 o interleucina-4.

La IL-9 recombinante y compuestos potenciales análogos a IL-9 en estructura o función se purificaron y prepararon para su uso en medios apropiados. Se prepararon agonistas y antagonistas putativos en agua, en solución salina o en DMSO y agua. Se utilizaron células tal como estaban o después de la transfección con los constructos del receptor de IL-9 tal como se describe en el Ejemplo 3. Tras 24 horas de deprivación de los factores de crecimiento, se incubaron las células sin (control) o con cantidades variables de IL-9 purificada y los compuestos potenciales análogos a IL-9 en estructura o función.

Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante el Kit de Proliferación Celular Abacus (Clontech, Palo Alto, CA) que determina la cantidad de fosfatasa ácida intracelular presente como indicación del número celular. El substrato fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) se convirtió, mediante la fosfatasa ácida, en p-nitrofenol, lo cual se midió como indicador de la concentración enzimática. Se añadió pNPP a cada pocillo y se incubó a 37ºC durante una hora. Entonces se añadió hidróxido de sodio 1N para interrumpir la reacción enzimática y se cuantificó la cantidad de p-nitrofenol utilizando un lector de placas Dynatech 2000 (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) a una longitud de onda de 410 nm. Se utilizaron curvas estándar que comparan el número celular con la absorbancia óptica para determinar el rango lineal del ensayo. Se utilizaron los resultados del ensayo solamente cuando las mediciones de absorbancia se encontraban en el rango lineal del ensayo. Brevemente, los ensayos se realizaron con muestras en cuadruplicado de células en placas de microtitulación de fondo plano (pocillos de 150 ó 200 microlitros) con o sin ligando durante 72 a 96 horas a 37º C. Se utilizó la fosfatasa ácida como medición del número de células presentes. Se repitieron todos los experimentos al menos dos veces.

Se sometió a ensayo la apoptosis utilizando el kit Annexin V tal como indica el suministrador (Clontech), el cual determina la apoptosis inducida por la dexametasona mediante el reconocimiento de la fosfatidilserina extracelular, un marcador temprano de la apoptosis. Se obtuvo el número celular apoptótico por microscopía de fluorescencia como porcentaje de células teñidas con Annexin

V.

La línea Mo7e es una línea celular humana megacarioblástica, cultivada en RPMI 1640 (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD), Suero Fetal Bovino al 20% (Hyclone) y 10 ng/ml de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN). La línea T98G es una línea celular humana de glioblastoma cultivada en RPMI 1640 (GIBCO/BRL). Se utilizó también la línea TK-ts13 de fibroblastos de hámster así como la línea celular murina 32D, una línea precursora murina mieloide, y ambas se cultivaron en RPMI 1640 /GIBCO/BRL) que contenía suero fetal bovino al 10% (Hyclone); además, se utilizó 1 ng/ml de IL-3 con las líneas celulares 32D. La TF1.1 es una línea de leucemia mieloide humana conocida por expresar la subunidad gamma del receptor de IL-2 (confirmada por Westernblot y rtPCR), pero, en comparación con su predecesor (TF1), ya no soporta el receptor de IL-9 por rtPCR, inmunotinción y análisis por Westernblot. La TF1.1 se cultiva en RPMI 1640 (GIBCO/BRL) y suero fetal bovino al 10% (Hyclone). Todas las líneas celulares responden a múltiples citoquinas, incluida la IL-9. Las líneas celulares se alimentaron y volvieron a sembrar a 2 x 105 células/ml cada 72 horas.

Se centrifugaron las células durante 10 minutos a 2000 rpm y se resuspendieron en RPMI 1640 con seroalbúmina bovina al 0,5% (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD) y cofactores insulina-transferrina-selenio (ITS) (GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). Se contaron las células utilizando un hemocitómetro, se diluyeron hasta una concentración de 1 x 105 células/ml y se colocaron en placas de microtitulación de 96 pocillos. Cada pocillo contenía 0,15 ó 0,2 ml, dando una concentración final de 10 a 50 mil células por pocillo, dependiendo de la célula. Las células Mo7e se estimularon con 50 ng/ml de Factor de Células Madres (SCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) solo, 50 ng/ml de SCF más 50 ng/ml de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN), o 50 ng/ml de SCF más 50 ng/ml de IL-9. Se incluyó un control que contenía células y medios basales solamente. Se añadieron diluciones seriales de los compuestos de prueba (es decir, proteínas recombinantes IL-9, péptidos, moléculas pequeñas) a cada condición de prueba por triplicado. Células TF1.1 que no estaban transfectadas con los receptores de IL-9 se utilizaron como control independiente para la respuesta y citotoxicidad no específica. Se incubaron los cultivos durante 72-96 horas a 37ºC en CO2 al 5%.

Ejemplo 8: Análisis in situ y Western del receptor de IL-9 exógeno en las líneas celulares transfectadas

Se llevó a cabo la tinción in situ del receptor de IL-9 como sigue. Se cultivaron células en cubreobjetos durante 24 horas y después los cubreobjetos que contenían las células adherentes se lavaron dos veces con una solución salina tamponada con fosfato que contenía calcio y magnesio (PBS) (GIBCO/BRL). Para la tinción intracelular del receptor de IL-9, se fijaron las células en PBS/paraformaldehído al 4% más un 0,1% de triton-X durante 15 minutos a temperatura ambiente antes del tratamiento con el anticuerpo antihumano del receptor de IL-9; para la tinción extracelular, se trataron las células con el anticuerpo antes de la fijación. Entonces, se lavaron las células dos veces en PBS y se bloquearon con BSA al 7,5% en dH2O durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células lavadas en PBS se incubaron entonces con una solución de 10 μg/ml del receptor antihumano de IL-9 (anticuerpo policlonal dirigido contra el carboxi-terminal del receptor de IL-9) en PBS / BSA al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lavaron las células tres veces en PBS y luego se incubaron en una solución de 10 μg/ml de un anticuerpo anti-conejo conjugado con rhodamina en PBS / BSA al 1% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron entonces las células tres veces en PBS y se contratiñieron utilizando 1 μg/ml DAPI durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se lavaron las células tres veces en H2Od, se fijaron en un portaobjetos de microscopio y se analizaron por microscopía de fluorescencia. Se muestran en la Figura 14 los resultados de las células transfectadas COS7.

Se realizaron Westernblots en lisados proteicos obtenidos de lisis directa de extractos celulares en un tampón de lisis al 0,5% ((Tris 50 mM, NaCl 150 mM, NP40), 1 mM DTT e inhibidores de la proteasa) y se hirvieron durante 5 minutos. Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de SDS con un 4-20% de Tris-glicina (Novex) en un tampón de pasada de Tris-glicina. Se transfirieron entonces las proteínas a nitrocelulosa mediante electroblot utilizando el aparato Trans Blot II (Bio Rad). Después de la transferencia, se bloqueó la membrana en TBS-T ((20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH de 7,6) más un 0,05% de Tween 20) más un 5% de blotto durante 1 hora a temperatura ambiente. Se sondearon entonces los blots utilizando un anticuerpo policlonal dirigido contra el carboxi-terminal del receptor de IL-9 (1 μg/ml) en TBS-T durante 1 hora. Se lavaron entonces los blots tres veces en TBS-T durante 10 minutos y se sondearon utilizando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo (1:10.000) en TBS-T durante 30 minutos. Se lavaron los blots tal como se menciona anteriormente y luego se incubaron con una solución potenciada por Luminol (Pierce), un sustrato quimioluminiscente, durante 5 minutos a temperatura ambiente, y después se expuso a una película durante 1-60 segundos. Véase las Figuras 11 y 12.

Ejemplo 9: Métodos para la Amplificación Genómica de la IL-9R Auténtica

La amplificación específica de la IL-9R auténtica (gen que codifica para la proteína biológicamente funcional localizada en la región pseudoautosómica XYq) por medio del diseño de cebadores estándar no fue posible debido a que IL-9R tiene cuatro pseudogenes altamente homólogos (>90% de identidad nucleotídica), no procesados en otros loci del genoma humano (cromosoma 9, 10, 16, 18). Debido a la alta identidad de estos otros genes, la amplificación genómica por PCR por medio del diseño de cebadores estándar resultó en la co-amplificación de todos los genes, convirtiendo así el análisis de las secuencias del gen auténtico en un equívoco. Con el fin de estudiar la estructura auténtica de IL-9R, ya que puede relacionarse con la predisposición a enfermedades tales como el asma, según se expone en esta solicitud, u otras enfermedades como el cáncer (Renauld y col., Oncogene, 9:1327-1332, 1994; Gruss y col., Cancer Res., 52: 1026-1031, 1992), se diseñaron amplímeros específicos como sigue:

Las secuencias del pseudogen de IL-9R y genes auténticos se alinearon utilizando el software Mac Vector. Las secuencias intrónicas que rodean cada exón se examinaron entonces en las regiones de diversidad entre el gen auténtico y los pseudogenes. Se diseñaron entonces cebadores contra estas regiones y se utilizaron para amplificar por PCR los ADN híbridos de humano / roedor que contenían cromosomas humanos individuales. Los productos se realizaron en geles de agarosa al 3% y se analizaron en busca de la amplificación de IL-9R auténtica sin amplificación de los 4 pseudogenes. Las condiciones específicas de amplificación por PCR se optimizaron también variando la temperatura de alineamiento así como las condiciones del tampón (contenido en DMSO del 5-10%). En los casos donde la amplificación de los pseudogenes seguía produciéndose, se introdujeron cambios nucleotídicos en las secuencias de los cebadores para provocar una mayor divergencia de los pseudogenes en comparación con el gen auténtico. Se muestran en el Ejemplo 2 las secuencias de cebadores y su especificidad se demuestra en la Figura 13.

Ejemplo 10: Ensayo de proliferación celular y estimulación por citoquinas

Para determinar la respuesta del crecimiento de las células TS1 que expresan varias formas del receptor humano de IL-9, se lavaron las células con PBS y se resuspendieron en D-MEM, suero fetal bovino al 10%. Se sembraron 103 células por pocillo, en triplicado, en microplacas de 96 pocillos y, cuando convenía, se añadió IL-9 humana recombinante o IL-9 murina (R&D Systems, Minneapolis, MN) a una concentración final de 5 ng/ml. Se evaluó la proliferación celular a los 7 días utilizando un ensayo de la fosfatasa ácida. Brevemente, se añadió a cada pocillo 50 μl de un tampón que contenía 0,1M acetato de sodio (pH 5,5), 0,1% Triton X-100 y 10 mM fosfato de p-nitrofenilo (sustrato de fosfatasa Sigma 104). Se incubó la placa durante 1-1/2 horas a temperatura ambiente, la reacción se interrumpió con 10 μl/pocillo de hidróxido de sodio 1N y se leyó la absorbancia en un Dynatech Modelo MR600 a 410 nm. Para analizar la fosforilación de la tirosina en las proteínas de la cascada de transducción de señales con la estimulación por citoquinas, las células TS1 que expresan varias formas del receptor humano de IL-9 se lavaron con PBS, se resuspendieron en D-MEM, seroalbúmina bovina al 0,5% y se incubaron durante 6 horas a 37ºC. Sucesivamente, se trataron 20 x 106 células durante 5 minutos con IL-9 humana o IL-9 murina (100 ng/ml) y se lavaron inmediatamente con PBS frío. Se lisaron las células en tampón RIPA tal como se describe en el Ejemplo 11.

Ejemplo 11: Inmunoprecipitaciones, inmunoblotting y anticuerpos

Típicamente, se lisaron 20-50 x 106 células en 1 ml de tampón RIPA (PBS que contenía 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS, 1 mM PMSF, 50 mM fluoruro de sodio, 1 nM ortovanadato de sodio y 1 x mezcla “completa” de inhibidores de la proteasa, Cat. Nº 1697498 Boehringer Mannheim) y se incubaron durante 45 minutos en hielo. Se centrifugaron los lisados durante 20 minutos en una microcentrifugadora Eppendorf y se recuperó el sobrenadante, que se trasladó a un tubo fresco. Para la inmunoprecipitación, se añadieron al lisado 1-5 μg de anticuerpo y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Se añadieron durante 2 horas 20 ml de perlas conjugadas con agarosa de proteínas A+G, seguido de cuatro lavados utilizando el tampón RIPA. Se resuspendieron las perlas en tampón Laemmli y se hirvieron durante 3 minutos antes de la electroforesis. Se transfirieron las proteínas a una membrana Immobilion-P (Millipore) y se detectaron por medio de un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano picante, seguido de un ensayo de detección por quimioluminiscencia (Pierce). Los anticuerpos específicos para el receptor de IL-9 murina y humana (sc698), Jak1, Irs1, Irs2, Stat1, Stat2, Stat3, Stat4, Stat5 y la fosfotirosina (PY) se compraron a Santa Cruz (Santa Cruz, CA). El anti-Jak3 y el receptor monoclonal antihumano de IL-9, MAB290, se compraron a Upstate Biotechnology y R&D Systems, respectivamente. La Figura 15 demuestra la activación de los miembros de la familia Jak a través de distintas variantes del receptor humano de IL-9.

Ejemplo 12: Identificación de los polimorfismos genómicos del receptor de IL-9

Se aislaron los ADN genómicos de las PBMC de donantes voluntarios tal como se describe en Nicolaides and Stoeckert, Bio-techniques 8:154-156, 1990. El análisis de secuencia del intrón 5 del gen humano de IL-9R se realizó por PCR utilizando los cebadores de secuencia ID NO:14 y de secuencia ID NO:17, lo cual resultó en un producto con un tamaño molecular aproximado de 1243 pares de bases. Se llevaron a cabo las amplificaciones a 94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 1,5 minutos, 72ºC durante 1,5 minutos durante 35 ciclos en los tampones descritos anteriormente (Nicholaides y col., Genomics 30:195-206, 1995). Se purificaron entonces los productos y se secuenciaron por medio de un protocolo estándar para secuenciación. La inspección de las

5 secuencias desde el intrón 5 en múltiples individuos descubrió un cambio nucleotídico en -213nt aguas arriba de las secuencias del exón 6, lo que resultó en un cambio nucleotídico de una timidina (secuencia publicada) en una citosina. Se muestra en la Figura 17 un ejemplo de este cambio.

10 Aunque se ha descrito e ilustrado aquí la invención con referencia a varios materiales, procedimientos y ejemplos específicos, se entiende que la invención no se limita a las combinaciones particulares de materiales y procedimientos seleccionados con este propósito. Numerosas variaciones de dichos detalles pueden estar implícitas, tal como lo apreciarán los especialistas

15 en la técnica.

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17.: Robinson DS, Hamid Q, Ying S, et al. Prednisolone treatment in asthma is associated with modulation of bronchoalveolar lavage cell interleukin-4, interleukin-5, and interferon-_ cytokine gene expression. Am Rev Respir Dis 1993; 148:401-406.

18.: Robinson DS, Ying S, Bentley A, et al. Relationship among numbers of bronchoalveolar lavage cells expressing messenger ribonucleic acid for cytokines, asthma symptoms, and airway methacholine responsiveness in atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 1993;92:397-403.

19.: O’Connor GT, Sparrow D, and Weiss ST: The role of allergy and nonspecific BHR in the pathogenesis of COPD. Am Rev Respir Dis 140:225-252, 1989.

20.: Cogswell JJ, Halliday DF, and Alexander JR: Respiratory infections in the first year of life in children at the risk of developing atopy. Brit Med J 284:10111013, 1982.

21.: Boushey HA, Holtzman MJ, Sheller JR, and Nadel JA: BHR. Am Rev Respir Dis 121:389-413, 1980.

22.: Renauld, J-C, Houssiau, F, Druez, C. Interleukin-9. Int Rev Exp Pathology 1993;34A: 99-109.

23.: Renauld, J-C, Kermouni, A, Vink, A, Louahed, J, Van Snick, J. Interleukin-9 and its receptor: involvement in mast cell differentiation and T cell oncogenesis. J Leukoc Biol 1995;57:353-360.

24.: Hultner, L, Moeller, J, Schmitt, E, Jager, G, Reisbach, G, Ring, J. Dormer, P. Thiol-sensitive mast cell lines derived from mouse bone marrow respond to a mast cell growth-enhancing activity different from both IL-3 and IL-4. J Immunol 1989;142:3440-3446.

25.: Dugas, B, Renauld, J-C, Pene, J, Bonnefoy, J, Peti-Frere, C, Braquet, P. Bousquet, J, Van Snick, J, Mencia-Huerta, JM. Interleukin-9 potentiates the interleukin-4-induced immunoglobulin (IgG, IgM and IgE) production by normal human B lymphocytes. Eur J Immunol 1993;23:1687-1692.

26.: Petit-Frere, C, Dugas, B, Braquet, P, Mencia-Huerta, JM. Interleukin-9 potentiates the interleukin-4-induced IgE and IgG1 release from murine B lymphocytes. Immunology 1993;79:146-151.

27.: Behnke, JM, Wahid, FN, Grencis, RK, Else, KJ, Ben-Smith, AW, Goyal, PK. Immunological relationships during primary infection with Heligmosomoides polygyrus (Nematospiroides dubius): downregulation of specific cytokine secretion (IL-9 and IL-10) correlates with poor mastocytosis and chronic survival of adult worms. Parasite Immunol 1993;15:415-421.

28.: Gessner, A, Blum, H, Rollinghoff, M. Differential regulation of IL-9 expression after infection with Leischmania major in susceptible and resistant mice. Immunobiology 1993;189:419-435.

29.: Renauld J-C, Druez C, Kermouni A, et al. Expression cloning of the murine and human interleukin 9 receptor cDNAs. Proc Natl Acad Sci 89:56905694(1992).

30.: Chang M-S, Engel G, Benedict C et al. Isolation and characterization of the Human interleukin-9 receptor gene. Blood 83:3199-3205(1994).

31.: Renauld J-C, Goethals A, Houssiau F, et al. Human P40/IL-9. Expression in activated CD4+ T cells, Genomic Organization, and Comparison with the Mouse Gene. J Immunol 144:4235-4241(1990).

32.: Kelleher K, Bean K, Clark SC, et al. Human interleukin-9: genomic sequence, chromosomal location, and sequences essential for its expression in human T

cell leukemia virus (HTLV-1-transforrned human T cells. Blood 77:14361441(1991).

33.: Houssiau FA, Schandene L, Stevens M, et al. A cascade of cytokines is responsible for IL-9 expression in human T cells. Involvement of IL-2, IL-4, and IL-10. J of Immunol. 154:2624-2630(1995).

34.: Miyazawa K, Hendrie PC, Kim Y-J, et al. Recombinant human interleukin-9 induces protein tyrosine phosphorylation and synergizes with steel factor to stimulate proliferation of the human factor-dependent cell line, Mo7e. Blood 80:1685-1692(1992).

35.: Yin T, TsangML-S, Yang Y-C. JAK1 kinase forms complexes with interleukin4 receptor and 4PS/insulin receptor substrate-1-like protein and is activated by interleukin-4 and interleukin-9 in T lymphocytes. J Biol Chem 269:2661426617(1994).

36.: Zav’yalov VP, Navolotskaya EV, Isaev IS, et al. Nonapeptide corresponding to the sequence 27-35 of the mature human IL-2 efficiently competes with rIL-2 for binding to thymocyte receptors. Immunol Lett 31:285-288(1992).

37.: Chu JW, and Sharom FJ. Glycophorin A interacts with interleukin-2 and inhibits interleukin-2-dependent Tlymphocyte proliferation. Cell Immunol 145:223-239(1992).

38.: Alexander AG, Barnes NC, Kay AB. Trial of cyclosporin in corticosteroiddependent chronic severe asthma. Lancet 339:324-328(1992).

39.: Morely J. Cyclosporin A in asthma therapy: a pharmacological rationale. J Autoimmun 5 Suppl A:265-269(1992).

40.: Sheffield VC, Beck JS, Kwitek AE, Sandstrom DW, and Stone EM: The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions. Genomics 16:325-332, 1993.

41.: Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, and Hayashi K: Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 5:874-9, 1989.

42.: Sarkar G, Yoon H-S, and Sommer SS: Dideoxy fingerprint (ddF): A rapid and efficient screen for the presence of mutations. Genomics 13:441-443, 1992.

43.: Cotton RG: Detection of single base changes in nucleic acids. Biochemical Journal 263(1):1-10, 1989.

44.: Schwengel D, Nouri N, Meyers D, and Levitt RC: Linkage mapping of the human thromboxane A2 receptor (TBXA2R) to chromosome 19p13.3 using

5 transcribed 3’ untranslated DNA sequence polymorphisms. Genomics 18:212215, 1993.

45.: Cytokine Handbook, Angus Thomson (1994).

46.: Nicolaides, N.C. and Stoecker, C.J. A simple, efficient method for the

separate isolation of RNA and DNA from the same cells. Biotechniques 10 1996;8:154-156.

47.: Ott J. Analysis of Human Genetic Linkage. Baltimore, Maryland: The Johns Hopkins University Press, 1991.

48.: Meyers DA, Postma DS, Panhuysen CIM, et al. Evidence for a locus

regulating total serum IgE levels mapping to chromosome 5. Genomics 15 1994;23:464 470.41.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1): INFORMACIÓN GENERAL

(i): SOLICITANTE: MAGAININ, PHARMACEUTICALS INC.

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Variantes del Receptor de IL-9, Útil en el Tratamiento y Diagnóstico de Alergias Atópicas que Incluyen el Asma y Trastornos Relacionados

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Programa Patentln #1.0, Versión #1.30

(v): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/21992

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 DE DICIEMBRE DE 1997

(C): CLASIFICACIÓN:

(vi): DATOS ANTERIORES A LA SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/032.224

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 DE DICIEMBRE DE 1996

(vii) DATOS ANTERIORES A LA SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/980.872

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 01 DE DICIEMBRE DE 1997

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1947 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CARACTERÍSTICAS DE LAS HEBRAS (STRANDEDNESS): única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9

imagen1

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1947 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

5: (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2

10

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 1944 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

10

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 1862 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 226 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

5: (C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5

10

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15: (A) LONGITUD: 513 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 513 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

5: (C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7

10

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

15: (A) LONGITUD: 17 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

20: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8

GCAGGTGGGG ACCCATG: 17

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9

25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

AGGCTTGACA TCGGACAAC 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10

CTGGCCTGAA GTACTTACC 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11

CTGCTTCAAT CCTGGGGAA 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12

GTGAGTTCCC CAGGATTGA 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13

CAAGGCCCTG CTCCAAA 17

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14

TGGGGCTTCA GCCTCACATG 20

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15

TATGTAGAGT GGGGAGTCTA 20

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16

TGTATTCTCG AGGGCTGAG 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17

TGAGGTGAAC AGGGGAGAA 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18

CCCTGGGCCC TTCATGT 17

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:19

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19

ACAAGGGCGG CCTTTGAT 18

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:20

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20

AGGGACGAGG TGGGCGGAC 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:21

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21

CCTGCCCCCC ATGTTCTT 18

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:22

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22

ATGCTACCTG AGCCCTTCC 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:23

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23

GGACATGATG CATCTGGCG 19

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:24

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1944 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:25

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25

imagen1

GCTGGACCTT GGAGAGTG 18

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:26

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26

GTCTCAGACA AGGGCTCCAG 20

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:27

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 501 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): STRANDEDNESS: única

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:28

5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 501 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

imagen2

imagen1

5: (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:29

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 500 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) STRANDEDNESS: única

10: (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:30

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) LONGITUD: 286 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

10

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:31

5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 64 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31

imagen2

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:32

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 128 aminoácidos

10: (B) TIPO: aminoácido

(C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

15: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32

imagen1

(2): INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:33

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 150 aminoácidos

(B) TIPO: aminoácido

5: (C) STRANDEDNESS: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33

10

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana seleccionado de entre el grupo consistente en ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 617 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido suprimidos, fragmentos de los mismos que contienen la deleción y complementos de los mismos que contienen la deleción.
2.

Ácido nucleico aislado que codifica el receptor de la interleucina-9 (IL-9) humana según la reivindicación 1, caracterizado porque los nucleótidos correspondientes a las posiciones 613 a 641 del receptor de tipo salvaje de IL-9 (SEQ ID NO:1) han sido eliminados.
3.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que contiene la deleción codifica una proteína o un péptido que se une a IL-9.
4.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el fragmento que contiene la deleción codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33.
5.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO:7.
6.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos consiste en la SEQ ID NO:7.
7.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO:6.
8.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos consiste en la SEQ ID NO:6.
9.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico es ADN o ARN.
10.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el ADN es ADNc.
11.

Ácido nucleico aislado según la reivindicación 9, caracterizado porque el ARN es ARNm.

5 12. Vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Vector según la reivindicación 12 que comprende un plásmido, un cósmido o un virus.
14. Vector según la reivindicación 12 que es un vector recombinante o de 10 expresión.
15.

Vector según la reivindicación 12 que comprende además una secuencia reguladora.
16.

Vector según la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia

reguladora es un promotor, un sitio de unión ribosómico o un sitio de 15 terminación de la transcripción.
17. Vector según la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor se selecciona de entre el grupo consistente en el promotor de citomegalovirus humano, promotor inducible por tetraciclina, promotor de virus de simio, promotor de repeticiones terminales largas del virus de la

20 leucemia murina de Moloney, promotor del virus del tumor mamario murino inducible por glucocorticoides, promotor de la timidina quinasa del herpes, promotores humanos y murinos de la actina, región flanqueante 5’ de IL-9 del HTLV-1 y VIH, región flanqueante 5’ del receptor de IL-9 humana o de ratón, promotor bacteriano tac y elementos potenciadores

25 de la región de unión de proteínas de andamiaje asociadas al choque térmico en Drosofila (SAR).
18.

Célula huésped transformada por el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17.
19.

Célula huésped según la reivindicación 18 que es transformada por

30 infección, captación directa, transducción, apareamiento F, microinyección o electroporación.
20.

Célula huésped según la reivindicación 18 que se selecciona de entre el grupo consistente en células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, células vegetales y células de mamíferos.
21.

Célula huésped según la reivindicación 20 que se selecciona de entre el grupo consistente en E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, células CHO, RI-1, B-W, LH, COS-J, COS-7, BSC1, BSC40, BMT10 o S69.
22.

Célula huésped según la reivindicación 20, caracterizada porque las células de levadura se seleccionan de entre el grupo consistente en Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula o Torulopsis.
23.

Proteína receptora de IL-9 humana aislada codificada por el ácido nucleico de la reivindicación 1.
24.

Proteína humana aislada según la reivindicación 23 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:33.
25.

Proteína humana aislada según la reivindicación 23 consistente en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:33.
26.

Proteína humana aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 caracterizada porque la proteína se une a IL-9.
27.

Proteína según la reivindicación 26, caracterizada porque la proteína es soluble.
28.

Método para elaborar una proteína que comprende el cultivo de una célula huésped transformada con el ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en condiciones en las cuales se expresa la proteína codificada por dicho ácido nucleico.
29.

Composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
30.

Composición farmacéutica que comprende la proteína según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27.
31.

Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
32.

Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración tópica.
33.

Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la inhalación.

5 34. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración sistémica.
35. Composición según las reivindicaciones 29 ó 30, caracterizada porque la composición se formula para la administración intravenosa, intraperitoneal

o intralesional.