ES2347975T3 - Procedimiento para el analisis de peptidos de origen natural y proteinas pequeñas mediante espectrometria de masas. - Google Patents
Procedimiento para el analisis de peptidos de origen natural y proteinas pequeñas mediante espectrometria de masas. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para el análisis de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular <=10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular <=10 kDa presentes en una muestra de plasma o suero, que comprende: a) un volumen del fluido biológico se mezcla con 7 a 9 volúmenes de una disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%, b) se centrifuga, c) el sobrenadante se separa y se concentra, d) se desala y se limpia, e) se analiza mediante espectrometría de masas.
Description
Esta invención se refiere a un procedimiento para la
separación e identificación por medio de espectrometría de
masas de péptidos y proteínas pequeñas de 1.000-10.000 Da (110 kDa) de tamaño, a los que se hace referencia como péptidos
de origen natural y proteínas pequeñas (NOP/SP), presentes en
fluidos biológicos como plasma, suero, líquido amniótico,
líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, etc.
Mediante la aplicación de este procedimiento, los
NOP/SP se separan de las proteínas de peso molecular superior
a 10 kDa presentes en los fluidos biológicos sin necesidad de
procedimientos complicados que requieren mucho tiempo, como
el fraccionamiento y enriquecimiento, y se analizan por
espectrometría de masas. Este procedimiento ofrece la
posibilidad de analizar los NOP/SP mediante la espectrometría
de masas MALDI-TOF, que es rápida y potencialmente
automatizable. Además, el análisis mencionado anteriormente
puede mejorarse adicionalmente por medio de la cuantificación
de los NOP/SP. Todos estos hechos hacen que este
procedimiento sea adecuado para el análisis de gran número de
muestras en un corto espacio de tiempo y para su aplicación
en el ámbito del diagnóstico, a través del análisis
cualitativo o cuantitativo de uno o más NOP/SP, bien en el
contexto de los marcadores biológicos específicos indicadores
de enfermedades o bien en el contexto de la comparación de
perfiles de proteínas entre muestras normales y muestras
procedentes de estados de enfermedad.
El término "proteómica" fue acuñado inicialmente en
1996 por Marc Wilkins y tiene su origen en la abreviatura de
las palabras proteína y genoma. Este término describe el
total del contenido de proteínas de un sistema biológico en
un momento o estado dados. Desde de ese momento, las
metodologías y técnicas que permiten el análisis de las
proteínas, como la bioinformática y la espectrometría de
masas, han evolucionado rápidamente. Algunas de estas, como
la electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2DPAGE), han adquirido una popularidad especial. La proteómica
se ha utilizado ampliamente en el ámbito académico, así como
en el sector de la industria farmacéutica, dado que se cree
firmemente que va a ser un factor de investigación puntero en
la era posgenómica.
El campo principal de la proteómica es el análisis
completo del contenido de proteínas de una muestra. La
estrategia general establecida en el análisis proteómico
incluye cuatro etapas: aislamiento de las proteínas de la
muestra, separación de las proteínas, detección de las
proteínas y, finalmente, identificación de las proteínas.
Además de las técnicas analíticas anteriormente mencionadas,
el procedimiento de identificación de proteínas incluye
software específico para el análisis de las imágenes de los
geles de poliacrilamida, lo que incluye la comparación de
geles, la cuantificación de proteínas en el gel y el
almacenamiento y gestión de los datos.
C.1.2.A. Separación de proteínas
La metodología aplicada para el aislamiento de las
proteínas de una muestra depende de dicha muestra. También
depende del procedimiento que se va a usar para la separación
e identificación de las proteínas. En caso de que la
separación de las proteínas vaya a tener lugar mediante la
estrategia general y bien establecida de isoelectroenfoque,
el aislamiento de las proteínas finaliza con la
solubilización de las proteínas en una disolución de
desnaturalización específica que fundamentalmente contiene
urea en una concentración de hasta 8 M y que adicionalmente
podría contener tiourea, CHAPS, 1,4-DTT, Tris, EDTA e
inhibidores de proteasas. En el caso de fluidos biológicos,
las proteínas ya se encuentran en disolución. La muestra se
centrifuga con el fin de eliminar todo el material celular
insoluble y otros elementos insolubles. A continuación, una
muestra que contiene 1 mg de proteína total se diluye en un
volumen apropiado de la disolución de desnaturalización
mencionada anteriormente antes de proceder con el
tratamiento. Debido al hecho de que la concentración de
proteína depende del tipo de fluido biológico, en el caso de
fluidos muy diluidos, como el líquido amniótico o la orina,
las muestras se concentran después de la centrifugación y
antes de su dilución con la disolución de desnaturalización.
La concentración de la muestra puede conseguirse mediante
precipitación de proteínas, ultrafiltración, etc.
En el caso de material biológico en estado sólido
(tejidos, células, muestras de biopsias, etc.), es necesario
extraer las proteínas por disolución antes de cualquier otro
paso. Esto se consigue mediante homogeneización (presión
mecánica, ultrasonidos, etc.) en un volumen pequeño de la
disolución de desnaturalización mencionada anteriormente o de
otros tipos de disoluciones. Después de esto se llevan a cabo
las etapas ya mencionadas de centrifugación y dilución en la
disolución de desnaturalización para preparar la muestra para
su análisis posterior.
Finalmente, para el aislamiento de grupos de proteínas
específicos de una muestra biológica pueden aplicarse
técnicas de fraccionamiento específicas como la cromatografía
o la inmunoprecipitación antes de proceder con el
tratamiento.
C.1.2.B. Separación de proteínas mediante electroforesis
bidimensional en gel de acrilamida (2D-PAGE)
El procedimiento general clásico para la separación y
detección de proteínas que se usa actualmente en proteómica
es la electroforesis en gel 2D-SDS-PAGE. El procedimiento se
basa en el aislamiento paralelo de las proteínas en función
de su carga eléctrica y peso molecular. El procedimiento
tiene como resultado la separación y visualización de cientos
de proteínas a la vez, lo que es algo que ningún otro
procedimiento puede conseguir en este momento. Inicialmente,
la técnica incluye el isoelectroenfoque (IEF) de las
proteínas, lo que significa la separación de las proteínas en
función de su carga eléctrica y, finalmente, su separación en
función de su peso molecular.
Literalmente, el IEF es un procedimiento de
equilibrado, durante el que se fuerza el movimiento de las
proteínas a lo largo de una tira portadora de derivados de
acrilamida (inmovilinas) de pH diferencial (tira de gradiente
de pH inmovilizado, IPG) bajo el efecto de un campo eléctrico
intenso. Las proteínas se mueven y se concentran en los
puntos de la banda en los que se neutraliza su carga (punto
isoeléctrico). Hay tiras IPG que cubren un amplio intervalo
de unidades de pH, como pH 3-10 (7-24 cm de longitud), así
como tiras adecuadas para el análisis de intervalos de pH muy
estrechos como pH 3,5-4,5. Una de las ventajas de las tiras
IPG es que la cantidad de muestra de proteína que puede
analizarse es relativamente elevada. Las condiciones exactas
del IEF dependen de una serie de factores, tales como la
cantidad de la muestra por analizar, la aplicación de la
muestra sobre la tira IPG, el potencial eléctrico y la
duración del isoelectroenfoque.
La separación de proteínas en función de su peso
molecular como una segunda dimensión se consigue mediante el
uso de un gel de poliacrilamida. Este gel puede ser de una
concentración constante de acrilamida o formar un gradiente,
dependiendo del peso molecular esperado para las proteínas en
estudio. Los geles de uso más corriente tienen una
concentración constante de acrilamida del 12% y un gradiente
de concentración de acrilamida del 9-16% para la separación
de proteínas de un peso molecular en el intervalo de 10-200
kDa.
C.1.2.C. Detección de proteínas
Después de la separación de las proteínas en el gel de
acrilamida, estas se detectan por tinción en el gel mediante
colorantes sensibles, cuya elección depende del procedimiento
de identificación posterior. Los colorantes de uso más
corriente son azul de Coomassie y plata. Estos colorantes se
eligen cuando va a usarse la espectrometría de masas para la
identificación de las proteínas.
Dada la heterogeneidad proteínica en los geles 2D, las
proteínas están representadas normalmente por más de una
mancha, lo que resulta en un número de productos génicos
traducidos muy superior al número de genes que los codifican
en realidad. Se ha observado en eucariotas que es posible que
un solo gen codifique de 5 a 20 proteínas diferentes.
C.1.2.D. Espectrometría de masas
La identificación de proteínas con alto rendimiento se
consigue mediante espectrometría de masas. Las manchas de
proteína se recortan mecánicamente del gel 2D, se decoloran,
se tratan con tripsina (en el gel) y los péptidos resultantes
se extraen por disolución. Los péptidos extraídos se analizan
por espectrometría de masas para determinar su masa y
secuencia de aminoácidos.
La espectrometría de masas comprende varias etapas para
producir las mediciones deseadas, tales como la ionización de
los péptidos, la descarga de estos péptidos ionizados en la
fase gaseosa y la medición de su masa con alta precisión. El
proceso de ionización y descarga de los iones en la fase
gaseosa puede conseguirse mediante: a) ionización/desorción
por láser asistida por una matriz (MALDI), b)
ionización/desorción por láser realizada en superficie
(SELDI) y c) ionización por electropulverización (ESI). A
continuación, la medición de la masa puede conseguirse por:
a) medición del tiempo de vuelo de los iones en un tubo de
alto vacío (TOF), b) mediante una trampa de iones (IT), c)
mediante cuadrupolos (Q) y d) mediante un sistema de
transformada de Fourier (FT). Por combinación de las
tecnologías de ionización y de medición de masas se obtienen
las técnicas siguientes, que se usan ampliamente en la
actualidad: a) MALDI-TOF, b) SELDI-TOF, c) ESI-TOF, d) ESIIT, e) ESI-FT, f) ESI-IT-FT, g) ESI-QqTOF, h) ESI-QqQ, etc.
Según las técnicas mencionadas anteriormente la
determinación de la masa de los péptidos tiene lugar mediante
la medición del tiempo de vuelo de los péptidos en tubos de
alto vacío, mientras que el análisis posterior incluye la
deducción de la secuencia de aminoácidos de estos péptidos.
Mediante software altamente especializado se compara la masa
de los péptidos detectados con la masa teórica de todos los
péptidos que resultan de todas las proteínas de todos los
organismos conocidos que se hallan incluidos en diversas
bases de datos proteómicos y genómicos y de aquí se deriva la
identificación de las proteínas mediante el uso de modelos
probabilísticos altamente sofisticados. Esta identificación
se basa normalmente en más de cinco péptidos, que pueden ser
más de 20 en algunos casos, en particular cuando la proteína
en estudio es de alto peso molecular, mientras que la
probabilidad de error es inferior a 10-6, dependiendo del
número de péptidos usados para la identificación de la
proteína. Es posible obtener unos resultados aún más fiables
al derivar la secuencia de aminoácidos de los péptidos
analizados mediante las técnicas MALDI-MS-MS y ESI-MS-MS. En
este caso, la identificación de las proteínas tiene lugar a
través de la secuencia de aminoácidos de los péptidos y la
probabilidad final de error es inferior a 10-10, dependiendo
del número de péptidos analizados para una proteína
específica.
De las técnicas mencionadas anteriormente, MALDI-TOF y
SELDI-TOF se caracterizan como de alto rendimiento por su
capacidad de análisis rápido y fiable de cientos de muestras.
Debido al hecho de que la tecnología MALDI-TOF no requiere la
separación de los péptidos, es especialmente sensible a los
iones contaminantes orgánicos e inorgánicos. Aunque la
tecnología MALDI-TOF tiene un gran poder de resolución
combinado con una gran sensibilidad en la señal de detección,
la presencia de contaminantes resulta en un alto nivel de
ruido de fondo en los espectros de masas, lo que reduce la
significancia de la señal recogida. Para poder evaluar los
espectros de masas que se producen mediante la técnica MALDITOF, la mezcla de péptidos cristalizada en la diana de acero
no debe contener contaminantes, en la medida de lo posible, y
la cantidad de los péptidos que pasa a la fase gaseosa debe
ser al menos dos veces superior al ruido de fondo
(señal/ruido = 2).
La técnica SELDI-TOF, para la separación de las
moléculas en estudio, se basa en la afinidad de estas
moléculas por sustratos específicos (biochip). Por esta razón
se usa un gran número de absorbentes estacionarios diferentes
(hidrófobos, aniónicos, catiónicos y metálicos) con el
objetivo de la unión específica de las proteínas de interés
sobre su superficie. La desventaja principal de este
procedimiento es que el instrumento que se usa para la
medición de masas es de bajo poder de resolución y no tiene
la sensibilidad suficiente para detectar un gran número de
moléculas importantes que están presentes en la muestra en
cantidades muy pequeñas. Además, probablemente las moléculas
específicas (poco abundantes) no se adhieren a los biochips
que se usan en la técnica SELDI-TOF, sino que se lavan de la
superficie de los absorbentes junto con otras moléculas,
perdiéndose así una información valiosa. Finalmente, las
técnicas ESI tienen la ventaja de una identificación de las
proteínas sin ambigüedad a través de la secuencia de
aminoácidos, pero requieren demasiado tiempo, ya que antes de
la medición de las masas hay una etapa de fraccionamiento de
la muestra mediante cromatografía de líquidos. Esta etapa de
fraccionamiento hace que el análisis de una sola muestra dure
entre 25 minutos y 3 horas, mientras que mediante las
tecnologías MALDI-TOF o SELDI-TOF se procesan 384 muestras en
2-3 horas.
En la proteómica, todas las técnicas mencionadas
anteriormente pueden usarse simultáneamente y de manera
complementaria con el fin de obtener toda la información
valiosa relativa a la diferenciación del proteoma en un
estado de enfermedad en comparación con estado normal. La
identificación de estas diferenciaciones puede usarse como
marcadores biológicos y dianas terapéuticas.
El término fluidos biológicos en general se usa para
describir fluidos que pueden obtenerse de un organismo con
procedimientos invasivos o no invasivos y de los que se han
eliminado todos los componentes celulares. Se considera como
fluido biológico, plasma, suero sanguíneo, líquido amniótico,
líquido cefalorraquídeo, saliva, lágrimas, fluido gástrico y,
en general, cualquier líquido que puede obtenerse del
organismo en estado normal o enfermo. El fluido biológico
rodea a los tejidos o se deriva de ellos y contiene un gran
número de moléculas proteínicas diferentes (proteínas,
oligopéptidos, polipéptidos, etc.). El plasma y el suero de
la sangre periférica son fluidos biológicos especialmente
ricos en moléculas proteínicas, estimándose que contienen
10.000 proteínas diferentes, aproximadamente, que derivan de
todo el organismo. Debido a la variabilidad del contenido
proteínico de estos fluidos biológicos existe una seguridad
estadística de que dentro de este contenido se halla
información relevante sobre diversos estados fisiológicos y
patológicos del organismo. Por lo tanto, la identificación de
diversos tipos de moléculas proteínicas podría proporcionar
una información valiosa sobre las reacciones del organismo a
diversos estímulos y estados, la comprensión en profundidad
de las disfunciones celulares y de tejidos que conducen a
diversas enfermedades y por último, pero no de menor
importancia, nuevas dianas terapéuticas.
Basado en lo anterior, en la actualidad se considera
que el proteoma plasmático y los proteomas de los demás
fluidos biológicos constituyen una de las áreas de
investigación más desafiantes de la proteómica,
principalmente con respecto a la detección e identificación
de marcadores biológicos específicos de enfermedades y de
moléculas activas para el diagnóstico y la cura de estas
enfermedades. El análisis proteómico de los fluidos
biológicos es un procedimiento especialmente difícil y
complicado, fundamentalmente por el gran número de productos
génicos diferentes presentes en la muestra y, además, por el
alto grado de variación de la concentración de proteína que
es superior a miles de órdenes de magnitud. Como ejemplo de
lo anterior, la albúmina, que es la proteína más abundante en
el plasma, tiene una concentración de 10-3 g/l, mientras que
otras proteínas importantes como las hormonas y las citocinas
están presentes en un intervalo de concentración de 10-9 g/ml
(ng/ml) a 10-12 g/ml (pg/ml).
Es sabido que el 97-99% de la cantidad total de
proteína en el plasma y otros fluidos biológicos está
compuesto solo por 22 proteínas que pertenecen a siete grupos
principales y a las que se hace referencia como proteínas muy
abundantes. Estas son: albúmina (35-45 mg/ml),
inmunoglobulinas G, A y M (12-18 mg/ml), fibrinógeno (2-6
mg/ml), antitripsina α1 (2-5 mg/ml), macroglobulina α2 (2-4
mg/ml), transferrina (2-3 mg/ml) y lipoproteínas (2-8,5
mg/ml). El 1-3% restante de la cantidad de proteína presente
en los fluidos biológicos está compuesto por las proteínas
poco abundantes que parecen ser de extrema importancia para
un sistema biológico y, por lo tanto, presentan un potencial
muy alto para la investigación. La fracción proteómica poco
abundante está dividida en tres subgrupos, el proteoma de
alto peso molecular que incluye proteínas con un peso
molecular superior a 70 kDa, el proteoma de peso molecular
medio, que incluye proteínas con un peso molecular en el
intervalo de 30-70 kDa y el proteoma de bajo peso molecular
que incluye proteínas con un peso molecular inferior a 30
kDa.
La vasta variación molecular de las proteínas poco
abundantes presentes en los fluidos biológicos junto con su
poca abundancia hace que su detección y análisis sea una
tarea muy tediosa. Se han adoptado varias estrategias para
abordar este problema, tales como el fraccionamiento, la
separación y la concentración de la muestra biológica. El
mayor problema lo causan las proteínas muy abundantes, ya que
su presencia enmascara las proteínas poco abundantes,
inhibiendo su detección. La solución obvia sería la
eliminación de estas proteínas muy abundantes. Dentro de este
marco experimental, con el objetivo primario de eliminar la
albúmina y las inmunoglobulinas, se han usado varias
técnicas, tales como el colorante Cibacron, columnas de
proteína A/G, anticuerpos, filtros de corte de peso
molecular, cromatografía de afinidad, cromatografía,
cromatografía de exclusión molecular, etc. Todas estas
técnicas han hecho posible la detección del proteoma poco
abundante. Sin embargo, es necesario considerar un hecho de
gran importancia. La albúmina y otras proteínas muy
abundantes, tales como la macroglobulina α2 son proteínas
portadoras. Esto significa que se unen a un gran número de
proteínas poco abundantes, transportándolas. Por lo tanto, la
eliminación de estas proteínas significaría también la
eliminación de todas las proteínas transportadas, la mayor
parte de las cuales son poco abundantes y de extremo interés.
Por ejemplo, el péptido antimicrobiano defensina α circula en
el plasma unido a la albúmina, a la macroglobulina α2 y a
varias serpinas y se elimina durante los procesos de
eliminación de las proteínas muy abundantes.
El proteoma de bajo peso molecular de los fluidos
biológicos incluye una gran variedad de moléculas proteínicas
y péptidos de peso molecular inferior a 30 kDa. El proteoma
de bajo peso molecular incluye las proteínas pequeñas de peso
molecular superior a 10 kDa y los péptidos de origen natural
de peso molecular inferior a 10 kDa. La fracción de los
péptidos de origen natural incluye péptidos procedentes de la
degradación de las proteínas, del procesamiento de
precursores de proteínas inmaduros y de las alteraciones
proteínicas postranscripcionales intra y extracelulares.
Todos estos procesos funcionan dentro de los complicados
sistemas biológicos, ofreciendo una funcionalidad adicional
para las moléculas proteínicas, dado que la proteína intacta,
al igual que sus fracciones, puede utilizarse en muchas rutas
metabólicas y procesos celulares diferentes. Un ejemplo
típico de la afirmación anterior es el gen de la
propiomelanocortina y la proteína precursora producida por
este que, después del procesamiento postraduccional
intracelular, produce diez hormonas peptídicas diferentes.
Los péptidos de origen natural y las proteínas pequeñas se
mueven fácilmente a través de los tejidos y formaciones
celulares debido a su pequeño tamaño y se difunden en la
sangre periférica. Además, dado que estos péptidos son
relativamente resistentes a la degradación proteolítica,
tienen una semivida larga. Estas dos características hacen
que los péptidos de origen natural sean fácilmente accesibles
y detectables y, por lo tanto, buenos candidatos para
marcadores biológicos. Algunos estudios de importancia en el
plasma y suero humanos han ilustrado que hay moléculas
proteínicas pequeñas directamente relacionadas con
enfermedades tales como el cáncer, la diabetes y las
enfermedades cardiovasculares, así como con otras
enfermedades infecciosas. Más en particular, mediante el uso
de espectrometría de masas SELDI-TOF en combinación con
herramientas bioinformáticas para la comparación de perfiles
de proteínas, se detectaron cinco moléculas proteínicas que
estaban directamente relacionadas con los cánceres de ovario
y de próstata. Cuatro de estas moléculas proteínicas tenían
un peso molecular inferior a 2.500 Da y la última tenía un
peso molecular de 3.080 Da. Este resultado implica que el
proteoma de bajo peso molecular de los fluidos biológicos
contiene un depósito de información histológica muy
importante y puede proporcionar marcadores biológicos de
utilidad para el diagnóstico de diversas enfermedades.
C.3.A. Procedimientos para la separación, detección e
identificación de los péptidos de origen natural y proteínas
pequeñas en los fluidos biológicos
Los péptidos de origen natural y las proteínas pequeñas
pertenecen al proteoma de bajo peso molecular de la fracción
de proteínas poco abundantes de los fluidos biológicos.
Además, estas moléculas se caracterizan por bajos pesos
moleculares (<10 kDa) y no pueden separarse, detectarse e
identificarse con las técnicas proteómicas clásicas de amplio
uso como se describen en el capítulo C.1.2., dado que el
intervalo de pesos moleculares que puede analizarse mediante
dichas técnicas fluctúa entre 10 y 200 kDa. Existen varias
técnicas que se han usado para la identificación de proteínas
que pertenecen al proteoma de bajo peso molecular de los
fluidos biológicos y que incluyen, principalmente, diversos
esquemas de enriquecimiento de las proteínas poco abundantes
en combinación con técnicas de espectrometría de masas.
Aunque estas técnicas no solamente se usan para el análisis
de los péptidos de origen natural y proteínas pequeñas,
pueden identificar satisfactoriamente estas moléculas entre
otras de mayor tamaño. Los procedimientos que se usan
actualmente pueden separarse en tres grupos principales: a)
el proteoma de bajo peso molecular se separa mediante
ultrafiltración por centrifugación por medio de filtros de
corte de pesos moleculares específicos, b) el proteoma de
bajo peso molecular se separa y enriquece mediante el
tratamiento de la muestra con dos volúmenes de acetonitrilo
puro y c) los péptidos de origen natural y pequeñas proteínas
del plasma o el suero sanguíneo se fraccionan en 96
fracciones por cromatografía de líquidos que se analizan a
continuación por espectrometría de masas. En todos los casos,
la identificación de las moléculas proteínicas se consigue
mediante el uso combinado de la cromatografía de líquidos y
la espectrometría de masas. A causa de este último hecho,
ninguno de estos procedimientos es de alto rendimiento.
Además, dado que la concentración de los péptidos de origen
natural y proteínas pequeñas es bastante baja, la
incorporación de varias etapas de procesamiento puede
resultar en la pérdida de información valiosa.
- C.3.A.1.
- Primera estrategia metodológica: caracterización del proteoma de bajo peso molecular del suero humano. [Tirumalai,
- R.
- S., Chan, K. C., Prieto, D. A., Issaq, H. J., Conrads, T. P., Veenstra, T. D. Mol Cell Proteomics 2003, 2: 1096-1103].
En este artículo se desarrolló una metodología para la
eliminación de las proteínas de peso molecular alto y medio
(>30 kDa) del suero humano sin pérdida de la fracción de bajo
peso molecular. Esta estrategia comienza con la
ultrafiltración por centrifugación del suero mediante filtros
de corte de peso molecular superior a 30 kDa. Simultáneamente
se usó un disolvente específico (acetonitrilo al 20%) con el
fin de disociar las uniones proteína-proteína. Esto tiene
como resultado la liberación de los péptidos de origen
natural y proteínas pequeñas de las proteínas portadoras,
como la albúmina, y su paso a la disolución. A continuación,
el proteoma de bajo peso molecular se trata con tripsina y la
mezcla de péptidos resultante se fracciona posteriormente por
cromatografía de intercambio catiónico fuerte. Cada una de
estas fracciones se fracciona adicionalmente por
cromatografía de líquidos microcapilar de fase inversa, que
se acopla a un espectrómetro de masas ESI (µLC-MS/MS).
Mediante el uso de la bioinformática para analizar todos los
datos producidos se identificaron 341 proteínas en el suero
humano.
Aunque el número de proteínas identificadas es
indicativo de la eficiencia del procedimiento, parece que
esta estrategia metodológica específica no es eficiente para
el análisis de los péptidos de origen natural y proteínas
pequeñas de peso molecular inferior a 10 kDa, ya que
solamente se identificaron tres proteínas de peso molecular
inferior a 3,5 kDa. Debido a la tripsinación de la muestra,
no fue posible el análisis de los péptidos de origen natural
del suero humano en su estado natural. Finalmente, este
procedimiento requiere demasiado tiempo, ya que, solamente
para el análisis de una fracción mediante µLC-MS/MS, se
necesitaron 120 minutos. Por lo tanto, este procedimiento se
caracteriza como de bajo rendimiento. A causa de las etapas
sucesivas de cromatografía, es imposible analizar dos
muestras simultáneamente y en paralelo.
Procedimiento:
Se usaron filtros para centrífuga Centriplus con un
corte de peso molecular de 30 kDa. Las membranas filtrantes
se lavaron y usaron según las instrucciones del fabricante.
Un volumen de 10 ml de suero humano se diluyó con 50 ml de
una disolución acuosa de NH4CO3 25 mM (pH 8,2) y acetonitrilo
al 20% (v/v) y se aplicó sobre el filtro. La muestra se
centrifugó a 3.000 g hasta que el 90% del volumen total de la
muestra hubo atravesado el filtro. El filtrado se liofilizó a
sequedad y se resuspendió en 1 ml de NH4CO3 25 mM, pH 8,2. A
continuación la muestra se desnaturalizó hirviendo durante 5
minutos. La muestra se dejó enfriar a temperatura ambiente. A
continuación se redujo mediante ditiotreitol 5 mM, calentando
a 56°C durante 1 hora. Después, la muestra se aciló con
yodoacetamida 10 mM a 25°C durante 1 hora. Se añadió tripsina
a la muestra en una relación proteína:enzima de 50:1 y se
dejó actuar durante 16-18 horas (durante la noche) a 37°C.
Después de la incubación, la tripsina se inactivó
acidificando la muestra con ácido trifluoroacético (TFA) a
una concentración final del 0,1%. La muestra se desaló
mediante la columna de extracción de fase sólida y fase
inversa Bond Elut C-18. El eluido de la columna se liofilizó
de nuevo a sequedad y se resuspendió en 500 µl de agua
desionizada y bidestilada. Un volumen de 5 µl de la muestra
se cargó en la µLC y los péptidos se eluyeron para pasar al
espectrómetro de masas en un gradiente de disolvente orgánico
(5%-85%) durante 100 minutos con una velocidad de flujo de
0,5 µl/min.
C.3.A.2. Segunda estrategia metodológica: análisis del
proteoma de bajo peso molecular del suero humano mediante
ultrafiltración, isoelectroenfoque y espectrometría de masas.
[Harper, R. G., Workman, S. R., Schuetzner, S., Timperman, A.
T., Sutton, J. N. Electrophoresis 2004, 25: 1299-1306].
Este artículo presentó una modificación y optimización
del primer procedimiento (capítulo C.3.A.1.) para el análisis
del proteoma de bajo peso molecular del suero humano. La
identificación de las proteínas se llevó a cabo por medio de
ultrafiltración por centrifugación, isoelectroenfoque,
separaciones cromatográficas multidimensionales fuera de
línea y espectrometría de masas (MS/MS). El resultado de esta
estrategia fue la identificación de 262 proteínas que se
consideró que pertenecían al proteoma de bajo peso moléculas
del suero humano. Al igual que el procedimiento anterior,
este procedimiento presenta las desventajas en cuanto a la
identificación de los péptidos de origen natural y proteínas
pequeñas, ya que el uso de la digestión enzimática hace
imposible el análisis de tales moléculas como de origen
natural por las razones que ya se han mencionado
anteriormente. Además, el tiempo de análisis en esta
estrategia es largo (235 minutos por enzima, sumando un total
de 705 minutos para tres enzimas, solamente para el análisis
de una muestra mediante espectrometría de masas). Esto hace
que el procedimiento sea de bajo rendimiento.
Procedimiento:
Se usaron filtros de centrífuga Micron con un corte de
peso molecular de 50 kDa. Los filtros se lavaron y usaron
según las instrucciones del fabricante. Un volumen de 1 ml de
suero humano se repartió en alícuotas de 200 µl. Cada
alícuota se diluyó en 120 µl de acetonitrilo al 20% en agua
desionizada y se calentó a 45°C durante 15 minutos para
desnaturalizar las proteínas. Las muestras diluidas se
centrifugaron a 14.000 g durante 10 minutos para eliminar el
material insoluble que podría bloquear los filtros. Los
sobrenadantes se cargaron en los filtros mencionados
anteriormente y se centrifugaron a 2.000 g durante 23 y 90
minutos (un total de 113 minutos).
Las proteínas de bajo peso molecular se fraccionaron en
una unidad de isoelectroenfoque a miniescala de la manera
siguiente. Todas las disoluciones que contenían las proteínas
de bajo peso molecular de la etapa anterior se reunieron y se
diluyeron en 18 ml de una disolución con anfolitos Bio-Lyte
3-10 al 1%, urea 8 M y DTT 2 mM. La disolución resultante con
las proteínas se sometió a isoelectroenfoque a 10 W durante 5
horas a 4°C. De este procedimiento se recogieron 20
fracciones. Las fracciones del mismo pH se reunieron y las
proteínas se precipitaron mediante el uso de tres volúmenes
de acetona por un volumen de muestra. Las proteínas se
sedimentaron por centrifugación. A continuación, se secaron y
se resuspendieron en una disolución que contenía urea 8 M y
Tris-HCl 100 mM, pH 8,5. El 30% de cada fracción de pH se
cargó y sometió a electroforesis en geles SDS-PAGE y el
perfil de proteínas se visualizó por medio de nitrato de
plata. El volumen restante de las fracciones se incubó
enzimáticamente. Antes de la incubación enzimática se
redujeron los puentes disulfuro mediante el tratamiento con 5
µl de una disolución que contenía DTT 100 mM a 57°C durante 1
hora. A continuación, las muestras se dejaron enfriar y los
tioles libres se acilaron mediante el tratamiento con 5 µl de
una disolución que contenía yodoacetamida 300 mM. Las
muestras tratadas se separaron en tres alícuotas de igual
volumen y se incubaron con tres proteasas diferentes
(tripsina, quimotripsina y subtilisina). Los péptidos
resultantes se analizaron mediante cromatografía de fase
inversa, acoplada (en línea) a un espectrómetro de masas ESI
(µLC-MS/MS). El tiempo total de análisis para cada digestión
enzimática diferente fue de 235 minutos.
C.3.A.3. Tercera estrategia metodológica: análisis
descendente del proteoma de bajo peso molecular del plasma
humano mediante espectrometría de masas con trampa de iones y
transformada de Fourier. [Sutton, J. N., Bonilla, L. E.,
Richmond, T., Gerszten, R. E., Liu, E., Shi, X., Senko, M.,
Zabrouskov, V., Kelleher, N., Forbes, A., Harper, R. G.
Thermo Electron Corporation, nota de aplicación: 344, 2005].
En los dos procedimientos anteriores, el proteoma de
bajo peso molecular se trató con enzimas y las proteínas se
identificaron a través de la comparación de los espectros de
los péptidos resultantes con espectros de péptidos generados
por ordenador a partir de las secuencias de proteínas
almacenadas en las bases de datos. Por el contrario, el
procedimiento descendente permite el estudio de proteínas
intactas, sin necesidad de una digestión enzimática. En este
artículo se aplicó una nueva estrategia descendente mediante
el uso del espectrómetro de masas LTQ de Thermo Electron Co
para el análisis del proteoma y el peptidoma de bajo peso
molecular del plasma humano. El objetivo de este
procedimiento fue proporcionar un protocolo de
enriquecimiento y análisis mediante el uso del espectrómetro
de masas LTQ para la identificación de las proteínas de bajo
peso molecular del plasma humano intactas, sin necesidad de
ninguna digestión enzimática.
Este procedimiento carece de la desventaja mencionada
anteriormente de la digestión enzimática de las proteínas
antes de su identificación. Por lo tanto, es capaz de
identificar moléculas de origen natural presentes en el
plasma humano. Sin embargo, considerando los procedimientos
aplicados, resulta evidente que los resultados se deben
fundamentalmente a las características del espectrómetro de
masas LTQ FT y no a los procedimientos usados, ya que estos
son muy similares a los procedimientos ya mencionados.
Además, el tiempo de análisis para una muestra parece ser
bastante largo, mientras que la aplicación de las técnicas
cromatográficas elimina la posibilidad del tratamiento
simultáneo de muchas muestras, haciendo que el procedimiento
sea de bajo rendimiento.
Procedimiento:
El aislamiento del proteoma de bajo peso molecular se
realiza mediante ultrafiltración por centrifugación de manera
muy similar a los procedimientos ya mencionados con
alteraciones menores. Los filtros usados tenían cortes de
peso molecular de 30 y 50 kDa y se trataron según las
instrucciones del fabricante. Un volumen de 1 ml de suero
humano se repartió en alícuotas de 200 µl. Cada alícuota se
diluyó en 120 µl de acetonitrilo al 20% en agua desionizada y
se calentó a 40°C durante 15 minutos para desnaturalizar las
proteínas. Las muestras diluidas se centrifugaron a 10.000 g
durante 10 minutos para eliminar el material insoluble que
podría bloquear los filtros. Los sobrenadantes se cargaron en
los filtros mencionados anteriormente y se centrifugaron a
1.500 g a 4°C durante el tiempo necesario para que prácticamente un cuarto del volumen aplicado pasara a través del filtro (90 minutos). Se reunieron todos los filtrados y se concentraron por liofilización. Se diluyeron alícuotas de las muestras concentradas en 100 µl de acetonitrilo al 5%, ácido fórmico al 0,1% y las proteínas de bajo peso molecular se recogieron y concentraron mediante una columna especial para HPLC (NPS-ODS I). Finalmente, el análisis del proteoma y
el peptidoma de bajo peso molecular se llevó a cabo con un
sistema de HPLC de fase inversa acoplado en línea a la
espectrometría de masas LTQ-FT. La elución de los péptidos de
la columna de HPLC tuvo lugar con un perfil de gradiente
lineal que duró 40 minutos.
C.3.A.4. Cuarta estrategia metodológica: análisis de las
proteínas poco abundantes de bajo peso molecular del suero
mediante espectrometría de masas. [Merrell, K., Southwick,
K., Graves, S. W., Esplin, M. S., Lewis, N. E., Thulin, G. D.
Journal of Biomolecular Techniques 2004, 15: 238-248].
En estudios previos se ha determinado que el
tratamiento de un volumen de plasma o suero humanos con
cuatro a cinco volúmenes de acetonitrilo puro es suficiente
para la precipitación del contenido de proteínas de estos
fluidos biológicos sin necesidad de otros tratamientos
(patente de los EE.UU número US 4171204/1979). Además, se ha
determinado que el tratamiento de un volumen de plasma o
suero con dos volúmenes de acetonitrilo puro es el mejor
procedimiento para eliminar la albúmina y las
inmunoglobulinas del plasma o el suero, debido al hecho de
que el acetonitrilo, no solamente desnaturaliza estas
proteínas grandes, sino que también fuerza el paso a
disolución de las proteínas pequeñas que están unidas a estas
proteínas portadoras muy abundantes (como la albúmina),
haciéndolas disponibles para su estudio posterior. En este
artículo se trató un volumen de suero con dos volúmenes de
acetonitrilo de calidad HPLC. Después de la precipitación de
las proteínas muy abundantes mediante centrifugación, las
proteínas pequeñas y péptidos que quedaban en el sobrenadante
se analizaron por LC-MS. Por medio de esta estrategia se
detectaron aproximadamente 4.000 especies iónicas diferentes
por debajo de 2,5 kDa, así como algunas proteínas pequeñas
entre 2,5 y 10 kDa, por muestra de suero. Además, es este
artículo se comparó el uso de filtros de centrífuga y el uso
de acetonitrilo puro para el análisis de los péptidos de
origen natural y pequeñas proteínas. Los autores reivindican
que el uso de acetonitrilo en una relación volumétrica de dos
volúmenes de acetonitrilo puro por una columna de muestra es
más efectivo que el uso de ultrafiltración o diálisis para el
análisis de las moléculas proteínicas de bajo peso molecular
mediante LC-MS.
Sin embargo, el tiempo necesario para el análisis
parece ser bastante largo, como en todos los procedimientos
mencionados anteriormente, mientras que el uso de
separaciones cromatográficas no permite el tratamiento
paralelo de más de una muestra a la vez, haciendo que esta
técnica sea de bajo rendimiento.
Procedimientos:
a) Dos volúmenes (400 µl) de acetonitrilo de calidad
HPLC se añadieron a un volumen de suero humano (200 µl). La
mezcla se agitó brevemente mediante un vórtex. La muestra se
dejó reposar en la mesa de laboratorio durante 30 minutos y
después se centrifugó a 12.000 rpm durante 4 minutos. Una
fracción del sobrenadante se concentró por liofilización
hasta un volumen de 50 µl. La muestra se llevó de nuevo al
volumen original de 200 µl añadiendo agua.
b) Dos volúmenes (400 µl) de acetonitrilo de calidad
HPLC se añadieron a un volumen de suero humano (200 µl). La
mezcla se agitó brevemente mediante un vórtex. La muestra se
dejó reposar en la mesa de laboratorio durante 30 minutos y
después se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos a
temperatura ambiente. Un volumen de 550 µl del sobrenadante
se concentró hasta 200 µl mediante centrifugación al vacío.
Se dedujo la cantidad total de proteína presente en la
disolución y un volumen de la disolución que contenía 4 µg de
proteína se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga y
se liofilizó prácticamente hasta sequedad. A la muestra
liofilizada se le añadieron 20 µl de ácido fórmico al 88%, 2
µl de melitina (5 pmol/µl) y 2 µl de fibrinopéptido y la
disolución se llevó a un volumen final de 40 µl con agua.
c) Se diluyó 1 ml de suero con 5 ml de una disolución
de bicarbonato de amonio 25 mM y se filtró por centrifugación
usando un filtro de corte de peso molecular de 30 kDa.
Después de la centrifugación, el filtrado se liofilizó hasta
sequedad y se resuspendió inicialmente en 40 µl (20 µl de
ácido fórmico al 88% y 20 µl de agua) y finalmente se llevó
al volumen inicial de 1 ml añadiendo más agua. A 200 µl de
esta disolución se le añadieron 400 µl de acetonitrilo puro
con el fin de precipitar las proteínas en la disolución.
Para el análisis posterior, 1 µg de proteína de las
muestras obtenidas por los procedimientos mencionados
anteriormente se analizó mediante LC-MS. El tiempo total de
análisis para cada muestra fue de 55 minutos.
C.3.A.5. Quinta estrategia metodológica: extracción con
disolventes orgánicos de las proteínas y péptidos del suero
como una preparación efectiva de la muestra para la detección
e identificación de biomarcadores por espectrometría de
masas. [Chertov O., Biragyn, A., Kwak, L. W., Simpson, J. T.,
Boronina, T., Hoang, V. M., Prieto, D. A., Conrads, T. P.,
Veensrta, T. D., Fisher, R. J. Proteomics 2004, 4:1195-1203].
En este artículo se desarrolló un procedimiento para el
aislamiento de péptidos y proteínas de bajo peso molecular
del suero mediante el uso de acetonitrilo puro y TFA al 0,1%.
La estrategia usada fue prácticamente la misma que la de la
cuarta estrategia (capítulo C.3.A.4.). La única diferencia
fue la adición de TFA al 0,1% al acetonitrilo puro. Se mezcló
un volumen de suero con dos volúmenes de acetonitrilo puro,
TFA al 0,1% y la mezcla se centrifugó. Los autores afirman
que el uso de dos volúmenes de acetonitrilo puro con TFA al
0,1% satisface ambos criterios para el análisis del proteoma
de bajo peso molecular: las proteínas muy abundantes de alto
peso molecular, como la albúmina, se eliminan efectivamente
por precipitación, mientras que los péptidos y proteínas
pequeñas permanecen en la disolución y, por lo tanto, están
disponibles para el análisis posterior.
A juzgar por los resultados del artículo, el análisis
del proteoma de bajo peso molecular se llevó a cabo mediante
la tecnología SELDI-TOF, que no permite (debido a sus
limitaciones) la identificación de las moléculas analizadas.
Alguna identificación tuvo lugar mediante la tecnología
MALDI-TOF en una etapa posterior, en que la muestra se
fraccionó por cromatografía y las proteínas se digirieron
enzimáticamente. Este procedimiento tiene la desventaja de su
baja productividad, dado que la identificación de las
moléculas en estudio requiere la separación cromatográfica.
Procedimientos:
a) Un volumen de 150 µl de suero se mezcló con dos
volúmenes (300 µl) de acetonitrilo puro, TFA al 0,1%, dando
como resultado un sedimento compacto. El sobrenadante se
transfirió a un tubo nuevo y se centrifugó a 10.000 rpm
durante 5 minutos a 4°C. El nuevo sobrenadante se liofilizó
hasta sequedad y se resuspendió en acetonitrilo al 5%, TFA al
0,1% en agua. A continuación se llevó a cabo el
fraccionamiento por HPLC de la muestra resuspendida. Algunas
de las fracciones obtenidas se trataron con tripsina,
realizándose un análisis mediante MALDI-TOF para la
identificación de los péptidos.
b) A un volumen de suero se añadieron dos volúmenes de
acetonitrilo puro con TFA al 0,1% y se mezclaron rápidamente
mediante un vórtex. La muestra se centrifugó a 10.000 rpm
durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se liofilizó hasta
sequedad. El sobrenadante se suspendió adecuadamente y se
llevó a cabo un análisis mediante SELDI-TOF o MALDI-TOF.
La presente invención se refiere a un procedimiento de
tratamiento de fluidos biológicos dirigido al aislamiento e
identificación de los péptidos de origen natural de peso
molecular ≤10 kDa y las proteínas pequeñas (NOP/SP) de peso
molecular inferior a 10 kDa mediante espectrometría de masas.
Los NOP/SP, como ya se ha mencionado anteriormente,
pertenecen al proteoma poco abundante de bajo peso molecular
de los fluidos biológicos. Además de la baja abundancia de
estas moléculas, un problema adicional para su detección es
el hecho de que, en los fluidos biológicos, las moléculas
proteínicas pequeñas están asociadas con frecuencia a
proteínas portadoras muy abundantes de alto peso molecular,
como la albúmina. El procedimiento de aislamiento de los
NOP/SP ha de facilitar su paso a disolución desde estas
proteínas portadoras.
Para el desarrollo del procedimiento de la presente
invención se tomó en consideración el hecho de que la
solubilidad de las proteínas es el resultado de interacciones
polares con la cara soluble, interacciones iónicas con sales
y fuerzas electrostáticas entre moléculas cargadas que tienen
la misma carga. La perturbación de estas interacciones
mediante el uso de disolventes orgánicos, ácidos, sales o
iones metálicos causa la disminución de la solubilidad de las
proteínas y, finalmente, su precipitación de la cara soluble
de los fluidos biológicos. Cuando se usan para la
precipitación de proteínas, los disolventes orgánicos tienen
una acción doble. Por un lado, disminuyen la constante
dieléctrica de la disolución de proteínas, un hecho que
favorece las interacciones electrostáticas entre las
moléculas proteínicas. Además, desplazan a las moléculas de
agua de la superficie proteínica, lo que ocasiona el
predominio de las interacciones electrostáticas o las
interacciones hidrófobas, ocasionando la agregación y
precipitación de las proteínas. Adicionalmente, las proteínas
presentan su solubilidad mínima en su punto isoeléctrico
debido al hecho de que no existe una carga eléctrica neta en
la molécula de proteína. También se ha observado que los
reactivos ácidos causan la formación de sales insolubles con
los grupos amino cargados positivamente de las proteínas en
ambientes en los que el pH es inferior a su punto
isoeléctrico y, por lo tanto, el pH bajo favorece la
precipitación de las proteínas. Algunos estudios de
importancia han mostrado que la adición de acetonitrilo puro
al plasma en una relación volumétrica de 2:1 (dos volúmenes
de acetonitrilo por un volumen de muestra) precipita un
mínimo del 92% de la cantidad de proteína total presente,
mientras que el uso de reactivos ácidos como TFA y ácido
fórmico no solamente se ha demostrado que favorece la
precipitación de las proteínas, sino que también parece tener
un efecto en la ionización proteínica durante su análisis
posterior mediante LC-MS. [Optimisation of protein
precipitation based upon effectiveness of protein removal and
ionisation effect in liquid chromatography-tandem mass
spectrometry. Polson, C., Sarkar, P., Incledon, B.,
Raguvaran, V., Grant, R. Journal of Chromatography B 2003,
785:263-275].
Teniendo en cuenta todo lo anterior, en la presente
invención se usó acetonitrilo para la separación de los
NOP/SP del resto de las proteínas presentes en los fluidos
biológicos de peso molecular superior a 10 kDa, en primer
lugar por su eficacia como agente precipitante de proteínas y
adicionalmente por su capacidad para romper los enlaces
proteína-proteína para que los NOP/SP pasen a disolución. En
oposición a las metodologías actuales para el análisis del
proteoma de bajo peso molecular de los fluidos biológicos, la
originalidad de está invención reside en el hecho de con el
uso de una disolución acuosa que contenía acetonitrilo al 50%
y TFA al 0,1%, los NOP/SP se separaron de las restantes
moléculas de proteína de los fluidos biológicos de peso
molecular superior a 10 kDa, haciendo posible su análisis
como moléculas de origen natural mediante espectrometría de
masas.
La elección de la disolución específica de acetonitrilo
y TFA se hizo por tres razones:
a) para utilizar las propiedades del acetonitrilo en
relación con su capacidad para liberar las moléculas
proteínicas pequeñas de las proteínas portadoras;
b) para conseguir la alteración de la constante
dieléctrica de la disolución y las interacciones
electrostáticas entre las moléculas de proteína;
c) para aumentar las moléculas de agua disponibles.
El resultado de las elecciones mencionadas
anteriormente es el aislamiento de los NOP/SP de las
restantes moléculas de proteína de los fluidos biológicos de
peso molecular superior a 10 kDa. La adición de la disolución
de acetonitrilo a los fluidos biológicos parece romper los
enlaces proteína-proteína, haciendo que los NOP/SP pasen a la
disolución. Debido al aumento de las moléculas de agua, los
NOP/SP quedan estabilizados en la disolución mientras que, a
la vez, debido a la alteración de la constante dieléctrica de
la disolución y a las interacciones electrostáticas entre las
proteínas de mayor peso molecular, estas proteínas se agregan
y precipitan. A causa de su pequeño tamaño, los NOP/SP
permanecen en disolución.
A un volumen dado (a) de una muestra de fluido biológico se añaden siete a nueve volúmenes (7a-9a) de acetonitrilo al 50% en agua que contiene también TFA al 0,1% [el acetonitrilo y el agua son de calidad HPLC]. La mezcla se agita mediante un vórtex durante 5 segundos y se centrifuga inmediatamente a 13.000 rpm (15.000 g) durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se pasa a un tubo nuevo y se concentra por centrifugación en vacío hasta un volumen (b), que es apropiado y funcional para las etapas siguientes del procedimiento.
Antes del análisis mediante espectrometría de masas, la
muestra concentrada se desala mediante una punta de pipeta
rellena de material C18. Antes del desalado de la muestra
concentrada, el material C18 empaquetado en la punta de
pipeta se lava con acetonitrilo puro de calidad HPLC, después
con acetonitrilo al 50% en agua y, finalmente, se equilibra
con una disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 3% y
TFA al 0,1%. Después de la etapa de equilibrado, la muestra
concentrada pasa varias veces a través del material mediante
pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta apropiada.
En esta etapa los NOP/SP se unen al material C18. La muestra
se desala mediante lavados adicionales con acetonitrilo al
3%, TFA al 0,1%. Finalmente, los NOP/SP se eluyen del
material C18 mediante una disolución acuosa de acetonitrilo
al 60% y TFA al 0,3% directamente en una diana MALDI de
acero. Después se añade una disolución matriz [ácido α-ciano4-hidroxicinámico al 0,3% (p/v), acetonitrilo al 50% (v/v),
TFA al 0,1% (v/v)] al eluido, dejando secar la mezcla.
Después de que la disolución se ha secado, formando una
mancha, vuelve a añadirse disolución matriz y se deja secar.
Después de este procedimiento, la diana MALDI se inserta en
el instrumento MALDI para el análisis. De manera alternativa,
el eluido del material C18 se coloca sobre una mancha
específica en la diana MALDI, donde la disolución matriz se
ha dejado secar previamente. Después de secarse el eluido,
vuelve a añadirse disolución matriz y una vez que se ha
secado se coloca la diana en el instrumento para el análisis.
Para el análisis de la muestra concentrada mediante un
espectrómetro de masas ESI-TOF, la muestra se desala mediante
una punta de pipeta rellena con material C18, por el
procedimiento descrito previamente, siendo la única
diferencia que en lugar de TFA al 0,1%, se usa ácido fórmico
al 5% en todas las disoluciones. Por consiguiente, los NOP/SP
se eluyen mediante una disolución acuosa con acetonitrilo al
60% y ácido fórmico al 5% y se recogen en un tubo de
microcentrífuga. Una fracción del eluido se coloca entonces
en un tubo de vidrio especial con un revestimiento metálico
exterior y una sección transversal pequeña y se inyectainfusiona en el espectrómetro de masas a presión y con la
aplicación de alta tensión.
En el caso de fluidos biológicos con baja concentración
de proteína total se sigue el mismo procedimiento que con los
fluidos biológicos de alta concentración de proteína. La
única diferencia es que la etapa de concentración precede a
la etapa de centrifugación.
A un volumen dado (a) de fluido biológico se añaden siete a nueve volúmenes (7a-9a) de acetonitrilo al 50% en agua que contiene también TFA al 0,1% [el acetonitrilo y el agua son de calidad HPLC]. La mezcla se agita inmediatamente mediante un vórtex durante 5 segundos. La muestra se concentra por centrifugación en vacío hasta que la disolución transparente se vuelve turbia, a un volumen (b) que es
apropiado y funcional para las etapas siguientes. La
disolución concentrada se centrifuga a 13.000 rpm (15.000 g)
durante 30 minutos a 4°C. Después de la centrifugación, el
sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo y se aplica el
mismo procedimiento para desalado y análisis mediante
espectrometría de masas (MALDI-TOF, ESI-TOF, etc.) que el
descrito anteriormente (C.1.A.).
Para la evaluación de la eficacia del procedimiento que
se describe en la presente invención para el análisis de los
NOP/SP se realizaron los siguientes experimentos.
a) Un volumen de plasma humano (a µl) se mezcló con ocho volúmenes (8a) de una disolución acuosa de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% y se trató según el procedimiento presentado en el capítulo D.1.A. El sedimento y el sobrenadante volvieron a llevarse al volumen original (a) con agua de alta pureza y se analizaron para su análisis posterior. En un gel de acrilamida SDS-PAGE se cargaron y analizaron las muestras siguientes: un volumen, 5 µl, de plasma humano sin y con tratamiento, con 20 µg de proteína total, 5 µl de la disolución del sedimento y una cantidad igual, doble y triple del volumen original (5, 10, 15 µl) de la disolución del sobrenadante. Como resulta evidente de la figura 1, el procedimiento facilita la liberación de los NOP/SP de las proteínas portadoras para pasar a la disolución. La mayoría de las proteínas portadoras permanece en el sedimento. Además es evidente que todas las proteínas de peso molecular superior a 60 kDa se precipitaron totalmente.
b) Un volumen de plasma humano (b µl) que contenía 2 mg de proteína total se mezcló con (8b µl) de una disolución acuosa de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% y se procesó según el procedimiento descrito en el capítulo D.1.A. El sedimento que se forma por la centrifugación, así como el sobrenadante concentrado vuelven a llevarse al volumen original (b µl) con agua de alta pureza y se almacenan para su tratamiento posterior por medio de electroforesis en gel
2D-SDS. Para el análisis, la mitad del volumen inicial (b/2
µl) de la muestra de plasma sin tratar con 1 mg de proteína
total, una cantidad igual (b/2 µl) de la disolución del
sedimento y toda la disolución del sobrenadante (b µl) se
mezclan con 250 µl de una disolución tampón para muestras que
contiene Tris 20 mM, urea 7M, tiourea 2M, CHAPS al 4%, 1,4DTE 10 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, inhibidores de proteasa,
Na2VO3 0,2 mM y NaF 1 mM. Inicialmente, el material
proteínico de estas muestras se somete a isoelectroenfoque en
tiras con un intervalo de pH no lineal de 3-10 (primera
dimensión). El enfoque comienza con 250 V durante 30 minutos
y después aumenta de manera lineal durante 14 horas hasta
6.000 V. En este punto se mantiene constante durante otras 18
horas. Después de finalizar el isoelectroenfoque, las
proteínas se separan en función de su peso molecular (segunda
dimensión). La tira IPG que porta las proteínas enfocadas se
aplica a un gel de acrilamida al 12%. Este gel se somete a
electroforesis durante 6 horas a 15 W/gel. Después de
finalizar la electroforesis, el gel se fija en metanol al
50%, ácido fosfórico al 5% y entonces se tiñe con Coomassie
coloidal durante 16 horas. A partir de la comparación de los
geles en la figura 2, queda establecido que la aplicación del
procedimiento presentado en esta invención resulta en la
precipitación de la mayoría de las proteínas de peso
molecular superior a 10 kDa. Un bajo porcentaje de las
proteínas mencionadas anteriormente permanece en el
sobrenadante, así como la mayoría de las proteínas de peso
molecular inferior a 10 kDa. Estas proteínas pequeñas no
pueden detectarse mediante la electroforesis en gel por
limitaciones de la técnica.
c) Un volumen de plasma humano ( µl) se mezcló con ocho volúmenes (8 µl) de una disolución acuosa de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% y se trató según el procedimiento presentado en el capítulo C.1.A. Un volumen de 3 µl de plasma sin tratar, 3 µl de sobrenadante concentrado sin desalar y 3 µl de sobrenadante desalado (como se describe en D.1.A.) se colocaron en una diana MALDI de acero. Después de la adición
de la disolución matriz (D.1.A.), las muestras se analizaron
mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. A partir de los
espectros obtenidos, que se presentan en la figura 3, se
concluye que los NOP/SP no pueden analizarse mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF, ni en el plasma sin tratar
ni tampoco en el sobrenadante concentrado sin desalar. La
completa aplicación del procedimiento presentado en esta
invención tuvo como resultado la adquisición de un espectro
de masas con gran número de picos de alta intensidad,
haciendo posible el análisis de los NOP/SP del plasma humano.
d) Un volumen de líquido amniótico humano (d µl) se mezcló con ocho volúmenes (8d µl) de una disolución acuosa de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% y se trató según el procedimiento presentado en el capítulo D.1.B. Un volumen de 3 µl de líquido amniótico sin tratar, 3 µl de sobrenadante concentrado y 3 µl de sobrenadante desalado (como se describe en D.1.A.) se aplicaron sobre una diana MALDI de acero. Las muestras se analizaron mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. A partir de los espectros obtenidos, que se presentan en la figura 4, se concluye que los NOP/SP no pueden analizarse mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, ni en el líquido amniótico sin tratar ni tampoco en el sobrenadante concentrado sin desalar. La completa aplicación del procedimiento presentado en esta invención tuvo como resultado la adquisición de un espectro de masas con gran número de picos de alta intensidad, haciendo posible el análisis de los NOP/SP del líquido amniótico.
e) A un volumen de plasma humano ( µl) que contenía 2 mg de proteína total se añadieron 10 pmol del fragmento 1-8 de bradicinina (PM: 904,4681) y 20 pmol del fragmento 18-39 de ACTH (PM: 2.465,1982) y la mezcla se agitó mediante un vórtex. A continuación, la muestra se mezcló con ocho volúmenes de una disolución acuosa de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%, se trató según el procedimiento presentado en
D.1.A. y se analizó mediante espectrometría de masas MALDITOF. El espectro adquirido se presenta en la figura 5. Los
fragmentos de bradicinina y ACTH son fragmentos de bajo peso
molecular, 904,4681 y 2.465,1982 Da, respectivamente. La
razón de la realización de este experimento fue determinar si
el procedimiento descrito en esta invención es capaz de
aislar moléculas proteínicas de bajo peso molecular. Como
resulta evidente del espectro adquirido, ambos fragmentos de
bradicinina y ACTH se detectan en las posiciones
correspondientes a sus pesos moleculares después del
tratamiento de la muestra con el procedimiento descrito en
esta invención.
En la presente invención se presenta un procedimiento
eficiente para el análisis selectivo de NOP/SP en fluidos
biológicos. Este procedimiento se desarrolló para fluidos
biológicos con alta concentración de proteínas y para fluidos
biológicos con baja concentración de proteínas con
modificaciones menores. El presente procedimiento se aplicó
al análisis de NOP/SP en plasma humano (caso de fluido
biológico con alta concentración de proteínas) y en líquido
amniótico (caso de fluido biológico con baja concentración de
proteínas). La aplicación de este procedimiento facilitó la
liberación de las moléculas proteínicas pequeñas de las
proteínas portadoras (figura 1) y su aislamiento selectivo de
las proteínas de peso molecular superior a 10 kDa (figura 2).
Los NOP/SP se detectaron por primera vez como moléculas de
origen natural mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y
ESI-TOF (Q-TOF). Los espectros adquiridos se presentan en las
figuras 13, 14 y 15, en las que cada pico corresponde a un
NOP/SP.
Para la determinación de la relación de mezcla más
apropiada entre el fluido biológico y la disolución de
acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% para el análisis de los
NOP/SP, se mezcló un volumen de plasma humano con seis a once
volúmenes de la disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al
0,1%. A cada muestra se aplicó el procedimiento de análisis
de NOP/SP como se describe en el capítulo D.1.A. La mezcla de
un volumen de plasma humano con diez a once volúmenes de la
disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% no produjo
ningún sedimento después de la etapa de centrifugación. Esto
indica que las relaciones de mezcla son inadecuadas para la
precipitación de proteínas. La mezcla de un volumen de plasma
humano con seis volúmenes de la disolución de acetonitrilo al
50% y TFA al 0,1% produjo un sedimento después de la
centrifugación. Sin embargo, el espectro producido por MALDITOF fue muy pobre en cuanto al número de picos e intensidad
de las señales. Este resultado indica que la cantidad de
NOP/SP en el sobrenadante era muy baja, posiblemente debido a
precipitación durante la centrifugación (figura 6A). La
mezcla de un volumen de plasma humano con siete, ocho o nueve
volúmenes de la disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al
0,1% resultó en la producción de un sedimento adecuado, así
como en espectros muy ricos y de alta calidad, en cuanto al
número de picos e intensidad de la señal, en el análisis por
MALDI-TOF. Los mejores resultados entre los tres volúmenes
anteriores se produjeron por la mezcla de un volumen de
plasma humano con ocho o nueve volúmenes de la disolución de
acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% (figuras 6B, 6C, 6D).
Para la determinación de la cantidad más apropiada de
acetonitrilo en la disolución acuosa de acetonitrilo y TFA se
prepararon las disoluciones siguientes: a) acetonitrilo al
40%, b) acetonitrilo al 45%, c) acetonitrilo al 50%, d)
acetonitrilo al 60%, e) acetonitrilo al 90%. Para la
preparación de todas las disoluciones anteriores se usó
acetonitrilo de grado de pureza HPLC. Todas las disoluciones
contenían TFA al 0,1%. Se mezclaron nueve volúmenes de cada
una de estas disoluciones con un volumen de plasma humano y
se llevó a cabo el procedimiento de análisis de NOP/SP
descrito en D.1.A. La mezcla del plasma humano con las
disoluciones con concentraciones de acetonitrilo del 40 y el
45% no produjo ningún sedimento después de la centrifugación.
La mezcla del plasma humano con las disoluciones con
concentraciones de acetonitrilo del 60 y el 90% produjo un
sedimento después de la centrifugación, pero los espectros
obtenidos por MALDI-TOF fueron muy pobres, lo que indica que
la concentración de NOP/SP es estos sobrenadantes era muy
baja, posiblemente debido a precipitación durante la
centrifugación (figuras 7A y B). La mezcla del plasma humano
con la disolución con una concentración de acetonitrilo del
50% produjo un sedimento adecuado después de la
centrifugación, mientras que el espectro producido fue rico y
de alta calidad en cuanto al número de picos e intensidad de
la señal (figura 7C).
Para la determinación de la concentración más apropiada
de TFA en la disolución acuosa de acetonitrilo y TFA se
prepararon las disoluciones siguientes: a) acetonitrilo al
50%, TFA al 0,1%, b) acetonitrilo al 50%, TFA al 0,3%. Para
la preparación de todas las disoluciones se usó acetonitrilo
de calidad HPLC. Nueve volúmenes de cada una de estas
disoluciones se mezclaron con un volumen de plasma humano y
se llevó a cabo el procedimiento de análisis de NOP/SP
descrito en D.1.A. La mezcla de la disolución que contenía
TFA al 0,1% produjo un sedimento adecuado después de la
centrifugación y los espectros producidos mediante el
análisis por MALDI-TOF fueron ricos y de alta calidad (figura
7C). La mezcla de la disolución con TFA al 0,3% no produjo
ningún sedimento después de la centrifugación.
Para la determinación de las condiciones (tiempo y
temperatura) más apropiadas de estancia de la muestra antes
de la centrifugación se realizaron los experimentos
siguientes: a) un volumen de plasma humano se mezcló con
nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo al 50% y TFA
al 0,1%, la mezcla se agitó mediante un vórtex durante 5
segundos y se centrifugó inmediatamente a 13.000 rpm durante
30 minutos a 4°C. A continuación se aplicó el procedimiento
de análisis de NOP/SP. b) Un volumen de plasma humano se
mezcló con nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo
al 50% y TFA al 0,1%, la mezcla se agitó mediante un vórtex
durante 5 segundos, se dejó a temperatura ambiente durante 30
minutos y entonces se centrifugó a 13.000 rpm durante 30
minutos a 4°C. A continuación se aplicó el procedimiento de
análisis de NOP/SP. c) Un volumen de plasma humano se mezcló
con nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo al 50% y
TFA al 0,1%, la mezcla se agitó mediante un vórtex durante 5
segundos, se dejó a 4°C durante 30 minutos y entonces se
centrifugó a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4°C. A
continuación se aplicó el procedimiento de análisis de
NOP/SP. Los NOP/SP de todos los experimentos anteriores se
analizaron mediante MALDI-TOF. De los espectros adquiridos
(figura 8) resulta evidente que la mezcla del fluido
biológico con la disolución de acetonitrilo y TFA debe
centrifugarse inmediatamente después de la agitación mediante
vórtex (figura 8A).
Para la determinación del tiempo de centrifugación de
la muestra más apropiado se realizaron los experimentos
siguientes: a) un volumen de plasma humano se mezcló con
nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo al 50% y TFA
al 0,1%, la mezcla se agitó mediante un vórtex durante 5
segundos y se centrifugó inmediatamente a 13.000 rpm durante
15 minutos a 4°C. A continuación se aplicó el procedimiento
de análisis de NOP/SP. b) Un volumen de plasma humano se
mezcló con nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo
al 50% y TFA al 0,1%, la mezcla se agitó mediante un vórtex
durante 5 segundos y se centrifugó inmediatamente a 13.000
rpm durante 30 minutos a 4°C. A continuación se aplicó el
procedimiento de análisis de NOP/SP. c) Un volumen de plasma
humano se mezcló con nueve volúmenes de la disolución de
acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%, la mezcla se agitó
mediante un vórtex durante 5 segundos y se centrifugó
inmediatamente a 13.000 rpm durante 60 minutos a 4°C. A
continuación se aplicó el procedimiento de análisis de
NOP/SP. Los NOP/SP de todos los experimentos anteriores se
analizaron mediante MALDI-TOF. De los espectros adquiridos
resulta evidente que un tiempo de centrifugación de 15
minutos de no es suficiente para la separación de las
proteínas de alto peso molecular, haciendo que la disolución
resultante no sea apropiada para el desalado. Para el
aislamiento de los NOP/SP, la mezcla del fluido biológico y
la disolución de acetonitrilo y TFA debe centrifugarse al
menos durante 30 minutos.
Como ya se ha mencionado, el análisis de espectrometría
de masas mediante la tecnología MALDI-TOF es sensible a
contaminaciones por iones orgánicos e inorgánicos. Por esta
razón, la limpieza y desalado de la muestra antes de la
técnica MALDI-TOF es una etapa crucial para el éxito del
análisis. Según el procedimiento de análisis de los NOP/SP
descrito en la presente invención, las moléculas de proteína
se eluyen del material adsorbente y se aplican directamente
sobre la diana de acero sin realizar ninguna otra etapa de
limpieza o desalado. Para la determinación de las condiciones
más apropiadas de limpieza y desalado se realizaron los
experimentos siguientes: a) un volumen de plasma humano se
mezcló con nueve volúmenes de la disolución de acetonitrilo
al 50% y TFA al 0,1%. La muestra se trató según el
procedimiento de análisis de NOP/SP descrito en esta
invención, D.1.A. El desalado de la muestra se realizó por
medio de material C18 empaquetado en una punta de pipeta. La
disolución de equilibrado del material C18, que también se
usó para el lavado y desalado de la muestra, estaba compuesta
de acetonitrilo al 3% y ácido fórmico al 5%. La elución de
los NOP/SP del material C18 se realizó mediante una
disolución de acetonitrilo al 60% y ácido fórmico al 5%. b)
Se aplicó el mismo procedimiento que en (a), pero la elución
de los NOP/SP del material C18 se realizó mediante
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,1%. c) Se aplicó el mismo
procedimiento que en (b), pero el equilibrado del material
C18, así como el desalado, se realizaron con acetonitrilo al
3%, TFA al 0,1%. d) Se aplicó el mismo procedimiento que en
(c), pero la elución de los NOP/SP del material C18 se
realizó con acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3%.
Los espectros de masas adquiridos en cada experimento
se presentan en la figura 9. El mejor espectro, en cuanto a
un ruido de fondo bajo y un número elevado de picos de alta
intensidad se obtuvo para la muestra desalada con
acetonitrilo al 3%, TFA al 0,1% y eluida del material C18 con
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3% (figura 9D).
Para la determinación de las condiciones más apropiadas
para la elución de los NOP/SP del material C18 empaquetado
dentro de la punta de pipeta se realizaron los experimentos
siguientes: a) un volumen de plasma se mezcló con nueve
volúmenes de acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1% y la mezcla se
trató según el procedimiento presentado en la presente
invención y descrito en D.1.A. Los NOP/SP se eluyeron cuatro
veces sucesivas del material de la punta de pipeta con
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3%. Cada eluido se aplicó en
una posición diferente en la diana de acero. Las cuatro
manchas diferentes en la diana, correspondientes a las cuatro
eluciones sucesivas, se analizaron mediante MALDI-TOF y los
espectros adquiridos se presentan en la figura 10 (A, B, C y
D). b) Con el objetivo de un mayor enriquecimiento de los
NOP/SP se realizó el experimento (a), pero los cuatro eluidos
sucesivos se aplicaron sobre la misma posición en la diana de
acero. El espectro adquirido se presenta en la figura 10E.
Queda establecido que la mayor parte de los NOP/SP se
eluyen durante la primera elución. Cantidades menores de los
NOP/SP se eluyen durante la segunda elución y cantidades
insignificantes se eluyen en la tercera y cuarta eluciones.
El intento de enriquecimiento de la cantidad de los NOP/SP
(experimento b) no parece tener un efecto considerable.
Los fluidos biológicos con baja concentración de
proteína total, como el líquido amniótico, la orina, el
líquido cefalorraquídeo, etc., no solamente se caracterizan
por la baja concentración de proteína total, sino también por
la alta concentración de sales, lípidos, azúcares, etc. Para
la determinación de las condiciones más apropiadas para el
aislamiento de los NOP/SP de tales fluidos biológicos se
realizaron los experimentos siguientes: a) un volumen de
líquido amniótico se mezcló con ocho volúmenes de
acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1% y a continuación se aplicó
el procedimiento de análisis de NOP/SP descrito en D.1.A., b)
un volumen de líquido amniótico se mezcló con ocho volúmenes
de acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1% y a continuación se
aplicó el procedimiento de análisis de NOP/SP descrito en
D.1.B., c) a un volumen de líquido amniótico se le añadió la
cantidad apropiada de inhibidores de proteína y la muestra se
concentró hasta la décima parte de su volumen original. A
esta muestra se le añadieron nueve volúmenes de acetonitrilo
al 50%, TFA al 0,1% y la muestra se trató según el
procedimiento descrito en D.1.A.
En el primer caso no se formó ningún sedimento después
de la centrifugación, lo que indica que las proteínas de peso
molecular superior a 10 kDa no precipitaron. En el segundo y
tercer casos, las muestras se analizaron mediante MALDI-TOF y
los espectros adquiridos se presentan en la figura 11. Se
observó que la adición de inhibidores de proteasas produce la
aparición de un gran número de picos de gran intensidad en el
espectro obtenido por MALDI-TOF, que suprimieron los picos de
los NOP/SP (figura 11A). Por el contrario, el segundo
experimento produjo un espectro rico en cuanto al número de
picos correspondientes a distintos NOP/SP y de intensidad de
los picos (figura 11B).
Como resulta evidente de las figuras 1 y 2, la
aplicación del presente procedimiento parece resultar en la
separación de los NOP/SP del resto de las proteínas de los
fluidos biológicos de peso molecular superior a 10 kDa, a
diferencia del resto de los procedimientos que analizan los
NOP/SP como parte del proteoma de bajo peso molecular. La
separación de los NOP/SP del resto de las proteínas de los
fluidos biológicos constituye la máxima ventaja del presente
procedimiento ya que, después de la separación, las moléculas
pueden analizarse mediante todas las tecnologías de
espectrometría de masas disponibles (MALDI-TOF, ESI-TOF,
et.). Otra ventaja del presente procedimiento es que no
incluye una digestión enzimática como prerrequisito para la
identificación de los NOP/SP. Debido a ello, los NOP/SP
pueden analizarse como moléculas de origen natural presentes
en los fluidos biológicos y no como parte de moléculas de
proteína de mayor tamaño. La aplicación del procedimiento
presentado en la presente invención puede proporcionar una
información valiosa para sobre funcionalidad de los NOP/SP en
los fluidos biológicos y contribuir a la investigación de
marcadores biológicos de bajo peso molecular relacionados con
diversos estados patológicos.
En oposición a los procedimientos ya usados para el
análisis del proteoma de bajo peso molecular de los fluidos
biológicos, la originalidad de la presente invención reside
en el hecho de que los NOP/SP se separan del resto de las
moléculas de proteína de peso molecular superior a 10 kDa.
Para la valoración de las ventajas del procedimiento
presentado en la presente invención, relativas al análisis
selectivo de los NOP/SP en los fluidos biológicos, en
comparación con los procedimientos ya en uso, se realizaron
los experimentos siguientes: a) un volumen de plasma humano
se procesó con ocho volúmenes de acetonitrilo al 50%, TFA al
0,1% como se describe en la presentación del procedimiento en
D.1.A. b) El mismo volumen de plasma humano se mezcló con dos
volúmenes de acetonitrilo puro con TFA al 0,1%. La mezcla se
trató según la estrategia metodológica 5 (capítulo C.3.A.5.).
c) El mismo volumen de plasma humano se mezcló con cinco
volúmenes de NH4HCO3 25 mM, acetonitrilo al 20%, pH 8,2 y la
mezcla se colocó en un filtro de ultracentrifugación con un
corte de peso molecular de 10 kDa y se llevó a cabo el
procedimiento descrito en la estrategia metodológica 1
(capítulo C.3.A.1.).
Las muestras obtenidas en cada experimento se
analizaron mediante MALDI-TOF y ESI-TOF y los espectros
adquiridos se presentan en la figura 12. El espectro
adquirido en el experimento (b) indica que la cantidad de
NOP/SP en disolución después del tratamiento fue muy baja e
inadecuada para el análisis, ya que la intensidad de los
picos detectados fue muy baja y próxima al ruido de la señal
(figura 12A). El espectro adquirido en el experimento (c)
presentó los mismos picos de baja intensidad, además de la
detección de grandes cantidades de pastificantes de diversos
pesos moleculares, lo que hizo imposible el análisis de los
NOP/SP, ya que los picos de alta intensidad correspondientes
a las moléculas plastificantes enmascararon la detección de
los NOP/SP (figura 12B). El espectro adquirido de la muestra
tratada mediante el procedimiento presentado en la presente
invención fue rico en cuanto al número de picos y a la
intensidad de los picos (figura 12C). Los mismos resultados
se obtuvieron mediante el uso de la tecnología ESI-TOF
(figura 12D). De la evaluación y comparación de los espectros
se concluye que el procedimiento presentado en la presente
invención es el más eficiente para el análisis de NOP/SP en
fluidos biológicos mediante espectrometría de masas. Resultó
evidente que para el análisis de las mismas moléculas
mediante los otros procedimientos se requiere un
enriquecimiento adicional y etapas de fraccionamiento
mediante el uso de procedimientos cromatográficos.
A diferencia del resto de los procedimientos de
análisis e identificación de NOP/SP, el procedimiento
presentado en la presente invención ofrece el importante
potencial de analizar estas moléculas mediante espectrometría
de masas MALDI-TOF. Como se ha mencionado anteriormente, esta
tecnología particular es de alto rendimiento y combina la
elevada resolución con altos niveles de intensidad. La
tecnología MALDI-TOF ofrece el potencial de analizar
numerosas muestras, dado que el tiempo de análisis por
muestra es inferior a un minuto, siendo la única desventaja
su sensibilidad a la contaminación por iones orgánicos y no
orgánicos. Esta contaminación afecta a la significancia de la
señal, dado que se introducen muchos picos contaminantes de
fondo en el espectro. Para la evaluación precisa de una
señal, en primer lugar, las proteínas que se cristalizan en
la diana MALDI de acero no deben contener contaminantes en la
medida de lo posible y, en segundo lugar, los NOP/SP deben
estar presentes en cantidad suficiente para proporcionar una
señal con una intensidad de al menos el doble del ruido
(señal/ruido = 2).
De los resultados adquiridos en el empleo del
procedimiento específico en una amplia gama de fluidos
biológicos resulta evidente que la calidad y pureza de los
NOP/SP presentes en la muestra que se aplica sobre la diana
MALDI de acero es adecuada para la detección, evaluación e
identificación de dichos NOP/SP. De la comparación del
presente procedimiento con el resto de los procedimientos
(capítulo E.2.), se concluye que el procedimiento de
análisis de NOP/SP descrito en la presente invención es el
único adecuado para el análisis de estas moléculas mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF.
El tiempo total requerido para un análisis completo de
una muestra con el procedimiento descrito en la presente
invención es de aproximadamente 1 hora, cuando los NOP/SP se
analizan mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. El
tiempo de 1 hora se requiere fundamentalmente para la
preparación de la muestra (centrifugación, concentración,
desalado) y es sustancialmente inferior al tiempo requerido
por los procedimientos usados actualmente, que incluyen
ultrafiltración por centrifugación y digestión enzimática de
las moléculas de proteína antes de su análisis. Además,
debido al uso de MALDI-TOF para el análisis de los NOP/SP, el
presente procedimiento es sustancialmente más rápido que los
procedimientos usados actualmente, ya que la muestra no se
separa por cromatografía antes de la espectrometría de masas,
lo que es una etapa que requiere particularmente mucho
tiempo.
Debido a la fiabilidad del análisis de los NOP/SP que
puede realizarse por espectrometría de masas MALDI-TOF, el
procedimiento puede caracterizarse como de alto rendimiento.
Los procedimientos usados actualmente para el análisis de los
NOP/SP presentan la limitación del análisis de las muestras
de una en una mediante cromatografía líquida antes de
someterlas a espectrometría de masas. A causa del análisis
mediante MALDI-TOF, el procedimiento descrito en la presente
invención ofrece el potencial de analizar 384 muestras en
menos de 2 horas.
Una gran ventaja de la tecnología MALDI-TOF, en
comparación con otras tecnologías de espectrometría de masas
es el potencial de automatización. Este potencial deriva del
uso de sistemas robóticos especializados para el tratamiento
de las muestras y su aplicación sobre dianas MALDI. Mediante
el uso de estos sistemas es posible el tratamiento y la
aplicación simultánea sobre una diana MALDI de acero de 8 a
384 muestras. A consecuencia del uso de la tecnología
MALDI-TOF para el análisis de los NOP/SP, el procedimiento
descrito en la presente invención es susceptible de
automatización. En particular, las puntas de pipeta usadas
para el desalado y limpieza de la muestra concentrada pueden
colocarse en sistemas robóticos con el fin de que el desalado
de la muestra, su aplicación sobre la diana de acero y su
mezcla con la disolución matriz se lleven a cabo
automáticamente. Tales sistemas robóticos están ya
disponibles en el comercio, ofreciendo la capacidad del
manejo simultáneo de 8 a 384 muestras y se han utilizado
ampliamente ya en paralelo con la tecnología MALDI-TOF. El
manejo de la muestra, en cuanto a su aplicación sobre la
diana de acero, tiene que ser particularmente preciso, ya que
el volumen que se maneja es muy pequeño y el posicionamiento
sobre la diana está definido muy ajustadamente. Por lo tanto,
el uso de sistemas robóticos facilitaría el análisis,
reduciendo el tiempo de preparación y eliminando los errores
de un operador humano.
Algunos estudios relevantes han demostrado que los
péptidos y proteínas de bajo peso molecular originados en
tejidos y fluidos biológicos pueden analizarse mediante
espectrometría de masas con poco tratamiento o incluso sin
ningún tratamiento, simplemente mediante la aplicación de la
muestra sobre la diana MALDI y su mezcla con la disolución
matriz o, en el caso de la tecnología ESI-TOF, mediante la
realización de un simple intercambio de disolución tampón por
la disolución tampón de infusión (acetonitrilo al 60%, ácido
fórmico al 5%). [Baggerman, G., Verleyen, P., Clynen, E.,
Huybrechts, J., De Loof, A., Schoofs, L. Peptidomics J.
Chromatography B 2004, 803: 3-16].
Dada la complejidad de los fluidos biológicos, que
pueden contener varios cientos o incluso miles de especies
proteínicas de bajo peso molecular diferentes, el análisis
del proteoma de bajo peso molecular mediante espectrometría
de masas requiere un fraccionamiento adecuado de la muestra
antes de la espectrometría de masas. Además, algunas de las
especies proteínicas presentes en los fluidos biológicos,
como hormonas peptídicas o toxinas microbianas son
extremadamente poco abundantes, por lo que para su detección
se requiere la concentración de la muestra. Finalmente, los
péptidos de origen natural y proteínas pequeñas presentes en
los fluidos biológicos se hallan, con gran frecuencia,
asociadas a proteínas portadoras muy abundantes de alto peso
molecular, como la albúmina. Por lo tanto, es muy probable
que la aplicación de procedimientos dirigidos a eliminar las
proteínas muy abundantes de los fluidos biológicos resulte en
la eliminación de las moléculas de bajo peso molecular
asociadas, las cuales constituyen marcadores biológicos
potenciales.
La eficacia de un procedimiento para el análisis del
proteoma poco abundante de bajo peso molecular de los fluidos
biológicos depende del cumplimiento de las condiciones
siguientes: a) separación suficiente de las proteínas
pequeñas de las proteínas portadoras, b) separación
suficiente de los NOP/SP del resto de las proteínas presentes
en los fluidos biológicos, c) capacidad de analizar moléculas
de proteína presentes en baja concentración.
El procedimiento presentado en la presente invención
tiene la ventaja de que cumple todas las condiciones
anteriores. Como resulta evidente de los resultados ya
presentados (capítulo D.4.), los NOP/SP se separan de las
proteínas portadoras y del resto de las proteínas presentes
en los fluidos biológicos. Además, el uso de la técnica
MALDI-TOF, que se caracteriza por un poder de resolución
elevado y una alta sensibilidad, hace posible la detección de
NOP/SP presentes en bajas concentraciones con gran precisión.
a) Tratamiento de un gran volumen inicial de fluido
biológico
En los procedimientos para el análisis del proteoma de
bajo peso molecular de los fluidos biológicos usados
actualmente, el volumen inicial del fluido biológico usado
para el análisis queda determinado y limitado por la
capacidad de carga de los filtros de ultracentrifugación y de
las columnas de cromatografía. El análisis de grandes
volúmenes de fluidos biológicos mediante estos procedimientos
es posible a través del reparto de la muestra en alícuotas,
el tratamiento simultáneo de las alícuotas y su reunión antes
del análisis por espectrometría de masas. Al ser
independiente de la filtración por ultracentrifugación y la
cromatografía, el presente procedimiento puede aplicarse a
cualquier volumen inicial de fluidos biológicos, que se trata
y concentra uniformemente. Este hecho ofrece el potencial
para el tratamiento de grandes volúmenes con el fin de
detectar e identificar con precisión los NOP/SP
extremadamente poco abundantes.
b) Análisis simultáneo múltiple de la disolución
concentrada de NOP/SP
La disolución concentrada de NOP/SP resultante de la
aplicación del presente procedimiento puede tratarse
posteriormente mediante diferentes procedimientos. Debido a
la alta sensibilidad de los procedimientos de espectrometría
de masas, la disolución concentrada de NOP/SP puede
repartirse en alícuotas y una alícuota puede analizarse
mediante MALDI-TOF-MS, otra mediante ESI-TOF-MS, otra
mediante µLC-MS, otra puede fraccionarse adicionalmente
mediante cromatografía de líquidos, otra fracción puede
analizarse por inmunotransferencia, etc. El potencial de
análisis simultáneo de la disolución concentrada de NOP/SP
por procedimientos diferentes otorga al presente
procedimiento la ventaja del análisis exhaustivo del fluido
biológico en estudio y de la detección e identificación
incluso de los NOP/SP menos abundantes.
Al contrario que los procedimientos usados actualmente,
el procedimiento descrito en la presente invención presenta
la ventaja de la cuantificación de los NOP/SP en el fluido
biológico inicial, considerando el hecho de que la disolución
concentrada de NOP/SP puede analizarse por diversos
procedimientos. La cuantificación puede conseguirse mediante
el uso de software sofisticado para realizar el análisis de
la señal y la comparación del perfil proteínico en los
espectros adquiridos, o haciendo uso de reacciones de
modificación especiales (marcado con isótopos, reacciones de
introducción de aductos, etc.) o por medio de estándares
internos. Como ya se ha descrito en la sección relativa a la
investigación de la eficacia del procedimiento, una cantidad
definida de uno o más péptidos de peso molecular conocido
(fragmentos de bradicinina y ACTH) puede añadirse a un
volumen específico de una muestra de fluido biológico antes
de su tratamiento con la disolución de acetonitrilo y TFA,
con el fin de detectar estos péptidos particulares en el
espectro resultante (capítulo D.2.E.). La determinación
cuantitativa de los NOP/SP en la muestra original del fluido
biológico puede conseguirse mediante uno de los
procedimientos de análisis cuantitativo, por ejemplo,
mediante una curva estándar de los estándares internos que
correlacione la concentración con la intensidad de los picos
y extrapolando entonces las concentraciones de los NOP/SP en
función de esta curva.
Además de en la muestra inicial de fluido biológico, la
adición de estándares internos para la cuantificación de los
NOP/SP es posible también en otras partes del procedimiento,
tales como la disolución concentrada de NOP/SP o la
disolución matriz. La cuantificación de los NOP/SP en el
fluido biológico puede conseguirse mediante uno de los
procedimientos de análisis cuantitativo (por ejemplo, curva
estándar, comparación de la intensidad de los picos), por
extrapolación.
En oposición a los procedimientos usados actualmente
para el análisis del proteoma de bajo peso molecular de los
fluidos biológicos, la originalidad de la presente invención
reside en el hecho de que los NOP/SP se separan del resto de
las moléculas de proteína de peso molecular superior a 10 kDa
y pueden analizarse selectivamente mediante espectrometría de
masas como moléculas de origen natural.
El procedimiento específico no incluye una digestión
enzimática ni separaciones cromatográficas complicadas, es
rápido, reproducible y susceptible de automatización
robótica. Todos estos hechos caracterizan el procedimiento
descrito en la presente invención como de alto rendimiento.
Las moléculas de proteína separadas por este procedimiento
pueden detectarse, analizarse e identificarse mediante
cualquiera de los procedimientos de espectrometría de masas
disponibles, incluyendo MALDI-TOF-MS/MS, sin ninguna
limitación. Además, debido al bajo número de etapas de
procesamiento, se minimizan las pérdidas de moléculas de
proteínas poco abundantes presentes en los fluidos
biológicos.
Figura 1. Imagen representativa de un gel 1D de acrilamida
en el que se analizó lo siguiente: un volumen de 5
µl de plasma humano sin procesar que contenía 20
µg de proteína total (A), un volumen igual de la
disolución del sedimento (B) y un volumen igual,
doble y quíntuple (5 µl, 10 µl y 15 µl) de la
disolución del sobrenadante (C, D y E,
respectivamente), según el procedimiento descrito
en el capítulo D.2.a. M: marcador de pesos
moleculares para proteínas.
Figura 2. A: imagen representativa de un gel de
poliacrilamida que contiene plasma humano según el
método descrito en el capítulo D.2.b. B: imagen
representativa de un gel de poliacrilamida que
contiene el sedimento obtenido en la
centrifugación según el procedimiento descrito en
el capítulo D.2.b. C: imagen representativa de un
gel de poliacrilamida que contiene el sobrenadante
obtenido en la centrifugación según el
procedimiento descrito en el capítulo D.2.b.
Figura 3. Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
de plasma humano según el procedimiento descrito
en el capítulo D.2.c. A: espectro representativo
de plasma humano sin tratar. B: espectro
representativo de sobrenadante concentrado, pero
sin desalar. C: espectro representativo de plasma
humano tratado según el procedimiento descrito en
la presente invención (capítulo D.1.A.).
Figura 4. Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
de líquido amniótico humano según el procedimiento
descrito en el capítulo D.2.d. A: espectro
representativo de líquido amniótico sin tratar. B:
espectro representativo de sobrenadante
concentrado, pero sin desalar. C: espectro
representativo de plasma humano tratado según el
procedimiento descrito en la presente invención
(capítulo D.1.B.).
Figura 5. Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
de plasma humano al que se había añadido un
fragmento de bradicinina (PM: 904,4681) y un
fragmento de ACTH (PM: 2.465,1982) y en que la
muestra se trató según el procedimiento descrito
en el capítulo D.2.e. Las flechas indican las
posiciones de bradicinina y ACTH en el espectro
final.
Figura 6. Investigación de la relación de mezcla entre el
fluido biológico y la disolución de acetonitrilo y
TFA como se describe en el capítulo D.4.1. A:
espectro representativo obtenido después de
mezclar un volumen de plasma humano con seis
volúmenes de la disolución de acetonitrilo y TFA.
B: espectro representativo obtenido después de
mezclar un volumen de plasma humano con siete
volúmenes de la disolución de acetonitrilo y TFA.
C: espectro representativo obtenido después de
mezclar un volumen de plasma humano con ocho
volúmenes de la disolución de acetonitrilo y TFA.
D: espectro representativo obtenido después de
mezclar un volumen de plasma humano con nueve
volúmenes de la disolución de acetonitrilo y TFA.
Figura 7. Investigación de la concentración de acetonitrilo
en la disolución de acetonitrilo y TFA como se
describe en el capítulo D.4.2. A: espectro
representativo obtenido después de mezclar un
volumen de plasma humano con nueve volúmenes de
una disolución de acetonitrilo al 60% y TFA. B:
espectro representativo obtenido después de
mezclar un volumen de plasma humano con nueve
volúmenes de una disolución de acetonitrilo al 90%
y TFA. C: espectro representativo obtenido después
de mezclar un volumen de plasma humano con nueve
volúmenes de una disolución de acetonitrilo al 50%
y TFA.
Figura 8. Investigación del tiempo y las condiciones de
estancia de la mezcla como se describe en el
capítulo D.4.4. A: espectro representativo
adquirido en la aplicación del procedimiento
descrito en la presente invención (D.1.A.). B:
espectro representativo adquirido de una mezcla de
plasma humano con una disolución de acetonitrilo y
TFA que permaneció a temperatura ambiente durante
30 minutos y después se trató mediante el presente
procedimiento. C: espectro representativo
adquirido de una mezcla de plasma humano con una
disolución de acetonitrilo y TFA que permaneció a
4°C durante 30 minutos y después se trató mediante
el presente procedimiento.
Figura 9. Investigación de las condiciones de desalado de la
muestra como se describen en el capítulo D.4.4. A:
espectro representativo adquirido de una muestra
después de su desalado con una disolución de
acetonitrilo al 60% y ácido fórmico al 3%. B:
espectro representativo adquirido de una muestra
después de su desalado con una disolución de
acetonitrilo al 3% y ácido fórmico al 5% y elución
de la punta de pipeta rellena mediante
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,1%. C: espectro
representativo adquirido de una muestra después de
su desalado con una disolución de acetonitrilo al
3% y TFA al 0,1% y elución de la punta de pipeta
rellena mediante acetonitrilo al 60%, TFA al 0,1%.
D: espectro representativo adquirido de una
muestra después de su desalado con una disolución
de acetonitrilo al 3% y ácido fórmico al 5% y
elución de la punta de pipeta rellena mediante
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3%.
Figura 10.Investigación de la elución de los NOP/SP del
material empaquetado dentro de la punta de pipeta
usada para desalar como se describe en el capítulo
D.4.7. La muestra de plasma se procesa según el
procedimiento presentado en la presente invención
(capítulo D.1.A.). Los NOP/SP se eluyen de la
punta de pipeta cuatro veces sucesivas. Cada vez,
el producto de la elución se aplica en un punto
diferente de la diana MALDI de acero. A: espectro
representativo adquirido del primer eluido. B:
espectro representativo adquirido del segundo
eluido. C: espectro representativo adquirido del
tercer eluido. D: espectro representativo
adquirido del cuarto eluido. E: espectro
representativo adquirido de una mancha de eluido
en la que se habían superpuesto todos los eluidos.
Figura 11.Investigación de la aplicación del procedimiento
de la presente invención en el caso de fluidos
biológicos con bajas concentraciones de proteína
total como se describe en el capítulo D.4.8. A:
espectro representativo adquirido después de la
adición de inhibidores de proteasas a un volumen
de líquido amniótico, concentración de la muestra
a una décima parte del volumen inicial y
procesamiento de la muestra según el procedimiento
presentado en la presente invención (capítulo
D.1.A.). B: espectro representativo adquirido de
una muestra de líquido amniótico tratada mediante
el procedimiento descrito en el capítulo D.1.B.
Figura 12.Eficiencia del procedimiento para el análisis de
los NOP/SP en comparación con otros procedimientos
usados actualmente. A: espectro de masas MALDI-TOF
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante la estrategia metodológica 5 (capítulo
C.3.A.5.). B: espectro de masas MALDI-TOF
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante la estrategia metodológica 1 (capítulo
C.3.A.1.). C: espectro de masas MALDI-TOF
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante el procedimiento presentado en la
presente invención. D: espectro de masas ESI-TOF
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante el procedimiento presentado en la
presente invención.
Figura 13.Espectro de masas MALDI-TOF de NOP/SP
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante el procedimiento presentado en detalle en
el capítulo G.1.
Figura 14.Espectro de masas ESI-TOF de NOP/SP
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de plasma humano
mediante el procedimiento presentado en detalle en
el capítulo G.2.
Figura 15.Espectro de masas MALDI-TOF de NOP/SP
representativo, adquirido después del
procesamiento de un volumen de líquido amniótico
humano mediante el procedimiento presentado en
detalle en el capítulo G.3.
Para el análisis de los NOP/SP se usó plasma humano con
una concentración de proteína total de 76,01 mg/ml. A un
volumen de 26,31 µl de plasma con aproximadamente 2 mg de
proteína total se añaden ocho volúmenes (210,48 µl) de una
disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% (mínimo grado
de pureza, HPLC) (relación entre los componentes de la
disolución: 50 partes de acetonitrilo, 49,9 partes de agua,
0,1 partes de TFA). La muestra se agita mediante vórtex
durante 5 segundos y se centrifuga inmediatamente a 13.000
rpm (15.000 g) durante 30 minutos a 4°C. Después de finalizar
la centrifugación, el sobrenadante se transfiere a un tubo
nuevo y se concentra por centrifugación en vacío hasta un
volumen de 20 µl. Antes del análisis mediante espectrometría
de masas, la muestra se desala por medio de una punta de
pipeta rellena con material C18. Antes del desalado de la
muestra, el material C18 se lava tres veces mediante el
pipeteo hacia arriba y hacia abajo de 10 µl de acetonitrilo
al 100% en agua y tres veces mediante el pipeteo hacia arriba
y hacia abajo de 10 µl de acetonitrilo al 50% en agua. A
continuación, el material se equilibra mediante cinco pasadas
de una disolución de acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1%
(volumen de 10 µl). La muestra concentrada se pipetea hacia
arriba y hacia abajo 30 veces con el fin de que los NOP/SP se
unan al material. Los NOP/SP unidos al material se lavan
entonces mediante 15 pasadas de una disolución de
acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1% (volumen de 10 µl) y se
eluyen directamente sobre la diana MALDI con 3 µl de
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3% en agua. Los NOP/SP eluidos
se mezclan inmediatamente con 1 µl de una disolución matriz
[ácido α-ciano-4-hidroxicinámico al 0,3% (p/v), acetonitrilo
al 50% (v/v), TFA al 0,1% (v/v)] sobre la diana y se dejan
secar. Una vez que la mezcla se ha secado se añade 1 µl de la
disolución matriz sobre dicha mezcla y vuelve a dejarse
secar. Después de este procedimiento, la muestra se coloca en
el espectrómetro de masas (MALDI ULTRAFLEX, Bruker Daltonics)
para su análisis. El análisis se lleva a cabo para un
intervalo de pesos moleculares de 1.000-5.200 Da, con el
espectrómetro de masas en el modo reflector y fijando la
potencia del láser al 80% y la ganancia del detector a 4. El
espectro final es la suma de cinco espectros, en que cada uno
de estos comprende 200 disparos de láser (un total de 1.000
disparos de láser). El espectro obtenido se presenta en la
figura 13. El análisis del espectro indica que los picos
detectados corresponden a los NOP/SP del plasma humano
analizado.
espectrometría de masas ESI-TOF
Para el análisis de los NOP/SP se usó plasma humano con
una concentración de proteína total de 76,01 mg/ml. A un
volumen de 26,31 µl de plasma con aproximadamente 2 mg de
proteína total se añaden ocho volúmenes (210,48 µl) de una
disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% (mínimo grado
de pureza, HPLC) (relación entre los componentes de la
disolución: 50 partes de acetonitrilo, 49,9 partes de agua,
0,1 partes de TFA). La muestra se agita mediante vórtex
durante 5 segundos y se centrifuga inmediatamente a 13.000
rpm (15.000 g) durante 30 minutos a 4°C. Después de finalizar
la centrifugación, el sobrenadante se transfiere a un tubo
nuevo y se concentra por centrifugación en vacío hasta un
volumen de 20 µl. Antes del análisis mediante espectrometría
de masas, la muestra se desala por medio de una punta de
pipeta rellena con material C18. Antes del desalado de la
muestra, el material C18 se lava tres veces mediante el
pipeteo hacia arriba y hacia abajo de 10 µl de acetonitrilo
al 100% en agua y tres veces mediante el pipeteo hacia arriba
y hacia abajo de 10 µl de acetonitrilo al 50% en agua. A
continuación, el material se equilibra mediante cinco pasadas
de una disolución de acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1%
(volumen de 10 µl). La muestra concentrada se pipetea hacia
arriba y hacia abajo 30 veces con el fin de que los NOP/SP se
unan al material. Los NOP/SP unidos al material se lavan
entonces mediante 15 pasadas de una disolución de
acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1% (volumen de 10 µl) y se
eluyen en un tubo de microcentrífuga con 10 µl de
acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3% en agua. Un volumen de 3 µl
del eluido se carga en un tubo de vidrio especial con un
revestimiento metálico exterior que termina en una aguja
capilar. La muestra se inyecta-infusiona a través de este
tubo en el espectrómetro de masas ESI-TOF (Qstar, Applied
Biosystems) mediante la aplicación de alta tensión y presión
inversa. Las condiciones de análisis de la muestra son las
siguientes: velocidad de infusión 5 nl/min, tensión de
pulverización iónica: 1,0 kV, cortina de gas: 20 l/min,
potencial de la placa de orificios: 50-75 V, potencial de enfoque: 220 V, frecuencia de pulsos: 6,991 kHz, duración del pulso: 14 µs, presión de la sección de transferencia de iones: 2,67 10-5 hPa, presión del analizador TOF: 2,27 107 hPa, presión de nitrógeno de la célula de colisión, 5,33 10-3 hPa, detector de placa multicanal: 2.300 V, tensión aplicada a la célula de colisión: 4 V, intervalo de masas 400-2.000 uma. El espectro adquirido se presenta en la figura
14.
Para el análisis de los NOP/SP se usó líquido amniótico
con una concentración de proteína total de 8,65 mg/ml. A un
volumen de 231 µl de líquido amniótico con aproximadamente 2
mg de proteína total se añaden ocho volúmenes (1.848 µl) de
una disolución de acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% (mínimo
grado de pureza, HPLC) (relación entre los componentes de la
disolución: 50 partes de acetonitrilo, 49,9 partes de agua,
0,1 partes de TFA). La muestra se agita mediante vórtex
durante 5 segundos y se concentra por centrifugación en vacío
hasta el momento en la disolución se vuelve turbia (volumen
aproximado de 50 µl). La disolución concentrada se centrifuga
a 13.000 rpm (15.000 g) durante 30 min a 4°C y el
sobrenadante se transfiere a un tubo nuevo. Antes del
análisis mediante espectrometría de masas, la muestra se
desala por medio de una punta de pipeta rellena con material
C18. Antes del desalado de la muestra, el material C18 se
lava tres veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia
abajo de 10 µl de acetonitrilo al 100% en agua y tres veces
mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo de 10 µl de
acetonitrilo al 50% en agua. A continuación, el material se
equilibra mediante cinco pasadas de una disolución de
acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1% (volumen de 10 µl). La
muestra concentrada se pipetea hacia arriba y hacia abajo 30
veces con el fin de que los NOP/SP se unan al material. Los
NOP/SP unidos al material se lavan entonces mediante 15
pasadas de una disolución de acetonitrilo al 3% y TFA al 0,1%
(volumen de 10 µl) y se eluyen directamente sobre la diana
MALDI con 3 µl de acetonitrilo al 60%, TFA al 0,3% en agua.
Los NOP/SP eluidos se mezclan inmediatamente con 1 µl de una
disolución matriz [ácido α-ciano-4-hidroxicinámico al 0,3%
5 (p/v), acetonitrilo al 50% (v/v), TFA al 0,1% (v/v)] sobre la
diana y se dejan secar. Una vez que la mezcla se ha secado se
añade 1 µl de la disolución matriz sobre dicha mezcla y
vuelve a dejarse secar. Después de este procedimiento, la
muestra se coloca en el espectrómetro de masas (MALDI
10 ULTRAFLEX, Bruker Daltonics) para su análisis. El análisis se
lleva a cabo para un intervalo de pesos moleculares de 1.000
5.200 Da, con el espectrómetro de masas en el modo reflector
y fijando la potencia del láser al 80% y la ganancia del
detector a 4. El espectro final es la suma de cinco
15 espectros, en que cada uno de estos comprende 200 disparos de
láser (un total de 1.000 disparos de láser). El espectro
obtenido se presenta en la figura 15. El análisis del
espectro indica que los picos detectados corresponden a los
NOP/SP del líquido amniótico analizado.
20
Claims (17)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento para el análisis de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa presentes en una muestra de plasma o suero, que comprende: a) un volumen del fluido biológico se mezcla con 7 a 9 volúmenes de una disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%, b) se centrifuga, c) el sobrenadante se separa y se concentra, d) se desala y se limpia, e) se analiza mediante espectrometría de masas.
-
- 2.
- Un procedimiento para el análisis de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa presentes en una muestra de orina, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, saliva o lágrimas, que comprende: a) un volumen del fluido biológico se mezcla con 7 a 9 volúmenes de una disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1%, b) se concentra, c) se centrifuga y se separa el sobrenadante, d) se desala y se limpia, e) se analiza mediante espectrometría de masas.
-
- 3.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 1 y 2, la disolución obtenida después de finalizar la etapa
(c) se desala y se limpia por medio de un material de retención adecuado. - 4. Un procedimiento en el que, según la reivindicación 3, el material de retención se empaqueta en una punta de pipetao una columna de cromatografía.
-
- 5.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 1 a 4, la disolución obtenida al finalizar la etapa (c) se separa en fracciones.
-
- 6.
- Un procedimiento en el que, según la reivindicación 5, el fraccionamiento se lleva a cabo mediante cromatografía, en
particular mediante HPLC y/o LC. -
- 7.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 1 y 2, el análisis incluye la separación y/o la identificación y/o la especificación cualitativa y/o la especificación cuantitativa de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa.
-
- 8.
- Un procedimiento en el que, según la reivindicación 7, la especificación cuantitativa de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa se lleva a cabo mediante el uso de uno o más controles internos.
-
- 9.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 7 y 8, el análisis de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa se lleva a cabo mediante el uso de algoritmos especializados.
-
- 10.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 1 y 2, la tecnología de espectrometría de masas es MALDI-TOF, SELDI-TOF, ESI-TOF, ESI-IT, ESI-FT, ESI-QqTOF y ESI-QqQ.
-
- 11.
- Un procedimiento en el que, según las reivindicaciones 1 y 2, el procedimiento completo o parte de este se realiza mediante sistemas robóticos.
-
- 12.
- Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 11 para la detección y análisis de marcadores biológicos indicativos de estados patológicos.
-
- 13.
- Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 12 para el diagnóstico de estados patológicos a través de la comparación, evaluación y/o análisis de patrones y/o perfiles de proteínas.
-
- 14.
- El uso del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 13 para la detección y análisis de marcadores biológicos.
- 15. El uso del procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5 14 para el diagnóstico de estados patológicos.
- 16. El uso de la disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% en el procesamiento de fluidos biológicos, mediante la mezcla de 7 a 9 volúmenes de esa10 disolución con un volumen del fluido biológico, con el fin de la separación y/o la identificación y/o la especificación cualitativa y/o la especificación cuantitativa de uno o más o todos los péptidos de origen natural de peso molecular ≤10 kDa y/o proteínas pequeñas de peso molecular ≤10 kDa.15
- 17. El uso de la disolución acuosa que contiene acetonitrilo al 50% y TFA al 0,1% según la reivindicación 16, en el que el fluido biológico es plasma, suero, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, lágrimas.
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