ES2348069T3 - Utilización de genes asociados a crispr (cas). - Google Patents

Abstract

Utilización de uno o más genes o proteínas cas (asociados a CRISPR) para modular la resistencia en una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a, inter alia, la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo. En particular, la presente invención se refiere, en un aspecto, a la utilización de uno o más genes o proteínas cas para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los cultivos, tales como los cultivos iniciadores, son muy utilizados en la industria alimentaria en la preparación de productos fermentados, incluyendo productos lácteos (tales como yogur, mantequilla y queso), productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales. La preparación de cultivos es laboriosa, ocupa mucho espacio y requiere muchos equipos, y existe un riesgo considerable de contaminación por bacterias descomponedoras de los alimentos y/o fagos durante la etapa de propagación. El colapso de los cultivos bacterianos debido a la infección por bacteriófagos (fagos) y su multiplicación es un problema importante durante el uso industrial de los cultivos bacterianos. Existen muchos tipos diferentes de fagos con mecanismos diversos para atacar a las bacterias. Además, aparecen nuevas cepas de bacteriófagos.

Entre las estrategias utilizadas para minimizar la infección por bacteriófagos, y de esta manera el colapso de un cultivo bacteriano, se incluye la utilización de: (i) cultivos iniciadores mixtos, e (ii) la utilización alternativa de cepas que presentan diferentes perfiles de susceptibilidad a los fagos (rotación de cepas).

(i)

Tradicionalmente, los cultivos iniciadores en la industria láctea son mezclas de cepas bacterianas del ácido láctico. La composición compleja de los cultivos iniciadores mixtos garantiza la presencia de un cierto nivel de resistencia al ataque fágico. Sin embargo, el subcultivo repetido de cultivos de cepa mixta conduce a cambios impredecibles en la distribución de las cepas individuales y finalmente a la dominancia no deseada de una cepa. Esto, a su vez, puede conducir a una susceptibilidad incrementada al ataque fágico y al riesgo de fracasos de la fermentación.

(ii)

La rotación de cepas bacterianas seleccionadas que son sensibles a diferentes fagos es otro enfoque para limitar el desarrollo de fagos. Sin embargo, resulta difícil e incómodo identificar y seleccionar un número suficiente de cepas que presenten diferentes perfiles de tipo de fago para proporcionar un programa de rotación eficiente y fiable. Además, la utilización continua de cepas requiere el seguimiento cuidadoso para nuevos fagos infecciosos y la necesidad de sustituir rápidamente una cepa que se encuentra infectada por el nuevo bacteriófago por una cepa resistente. En las plantas de fabricación, en las que se preparan grandes cantidades de cultivos iniciadores en masa de antemano, este tipo de respuesta rápida habitualmente no resulta posible.

Se han realizado varios intentos para mejorar la resistencia de los cultivos para la utilización en la industria.

Pedersen et al. (7th Symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications, 1 a 5 de septiembre de 2002; Egmond aan Zee, Países Bajos) enseñan una cepa de Lactococcus lactis resistente a fagos que no presenta actividad de timidilato sintasa y que requiere timidina para la replicación del ADN.

La patente WO 01/14520 da a conocer una bacteria del ácido láctico que presenta una susceptibilidad reducida al ataque por como mínimo un tipo de bacteriófago. Dichas bacterias del ácido láctico comprenden un gen mutado implicado en el metabolismo de las piridinas, es decir pyrG, que resulta en un defecto en la CTP-sintetasa.

Kosuge et al. (Appl. Environ. Microbiol. volumen 64, número 11, páginas 43284332, 1998) y Kosuge et al. (FEMS Microbiology Letters 123(1/2):55-62, 1994) enseñan una bacteria Thermus thermophilus HB27 que se encuentra mutada en el gen proB y que es incapaz de utilizar la prolina para el crecimiento.

Sin embargo, existe una necesidad todavía de mejorar los cultivos para la utilización en la industria.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En la presente memoria se describe la utilización de loci CRISPR o un componente de los mismos para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas) (también conocidas como SPIDR -repeticiones directas intercaladas por espaciadores) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descrita. Los loci CRISPR están consituidos por repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (típicamente de 24 a 40 pb, repetidas 1 a 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Las secuencias repetidas (habitualmente específicas de una especie) se encuentran separadas por secuencias variables de longitud constante (típicamente de 20 a 58 pb, dependiendo del CRISPR). Se han encontrado hasta 20 loci CRISPR diferentes en un solo cromosoma.

Aunque se desconoce la función biológica de los loci CRISPR, se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que podrían encontrarse implicadas en la unión del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación del cromosoma y distribución de replicones (Jansen et al., 2002; Pourcel et al., 2005). Además, Mojica et al., 2005, han planteado la hipótesis de que CRISPR podría encontrarse implicado en proporcionar unidad específica contra el ADN foráneo, y Pourcel et al., (2005), han planteado la hipótesis de que los CRISPR son estructuras que pueden incorporar fragmentos de ADN foráneo como parte de un mecanismo de defensa. Bolotin et al., (2005), sugieren que los elementos espaciadores de CRISPR son trazas de invasiones pasadas por parte de elementos extracromosómicos, y han planteado la hipótesis de que proporcionan a la célula inmunidad frente a la infección por fagos, y más generalmente frente a la expresión de ADN foráneo mediante la codificación de un ARN antisentido. Bolotin et al., (2005), también sugieren que los genes cas resultan necesarios para la formación de CRISPR.

En contraste con las enseñanzas de la técnica anterior, que plantean la hipótesis de que CRISPR o los espaciadores de CRISPR podrían encontrarse implicados en proporcionar inmunidad específica, la presente invención se basa, en parte, en el inesperado resultado de que los genes o proteínas cas resultan necesarios para la inmunidad contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Todavía más inesperadamente, en el contexto de la presente invención se ha descubierto que uno o más genes o proteínas cas se encuentran asociados a dos o más repeticiones CRISPR dentro de los loci CRISPR. En otras palabras, los genes o proteínas cas aparentemente son específicos para una repetición CRISPR de ADN, implicando que los genes o proteínas cas y la secuencia repetida forman una pareja funcional. De acuerdo con lo anterior, puede utilizarse uno o más espaciadores de CRISPR conjuntamente con una o más de dichas parejas funcionales (es decir, repeticiones CRISPR y genes cas) con el fin de modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En una forma de realización, para que uno o más espaciadores de CRISPR proporcione inmunidad a la célula, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas forman una combinación funcional, es decir, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes o proteínas cas son compatibles.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, se sugiere en la presente memoria por primera vez que un gen o proteína cas influye sobre la resistencia, tal como la resistencia de una bacteria a uno o más bacteriófagos. En particular, el conocimiento de dos o más repeticiones CRISPR y/o de uno o más genes o proteínas cas para una célula dada resultará ventajoso para predecir, determinar y modificar su resistencia, por ejemplo su lisotipo, que define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada frente a diversos bacteriófagos. En consecuencia, la identificación y la detección de los loci CRISPR en, por ejemplo, las células y bacteriófagos, podrían ayudar a determinar, predecir y modificar el perfil de resistencia de una célula o las interacciones de fago-huésped.

Ventajosamente, la aplicación de uno o más loci de CRISPR, dos o más repeticiones CRISPR, uno o más genes o proteínas cas y/o uno o más espaciadores de CRISPR en la ingeniería genética podría conducir a variantes resistentes o sensibles de células para la utilización en una amplia diversidad de aplicaciones en la industria biotecnológica.

ASPECTOS SUMARIALES DE LA PRESENTE INVENCIÓN

En un aspecto, se proporciona la utilización de uno o más genes o proteínas cas para modular la resistencia en una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En un segundo aspecto, se proporciona la utilización de una secuencia de ácidos nucleicos recombinantes que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en el que por lo menos un espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones de CRISPR para modular la resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un tercer aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas.

En un cuarto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR.

En un quinto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas y por lo menos un espaciador de CRISPR.

En un sexto aspecto, se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que consta esencialmente de por lo menos un gen cas, por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR.

En un séptimo aspecto se proporciona una secuencia de ácidos nucleicos recombinante que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en el que el espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones CRISPR.

En un octavo aspecto se proporciona un constructo que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la presente memoria.

En un noveno aspecto se proporciona un vector que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos o uno o más de los constructos indicados en la presente memoria.

En un décimo aspecto se proporciona una célula que comprende la secuencia de ácidos nucleicos o el constructo o el vector indicados en la presente memoria.

En un undécimo aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

(i)

identificar una secuencia (por ejemplo una secuencia conservada) en un organismo (preferentemente una secuencia esencial para el funcionamiento o supervivencia del organismo), (ii) preparar un espaciador de CRISPR que es homólogo a la secuencia identificada, (iii) preparar un ácido nucleico (por ejemplo un ácido nucleico recombinante) que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador de CRISPR, e (iv) introducir dicho ácido nucleico en una célula, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un duodécimo aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

(i)

identificar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, (ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dicho espaciador o espaciadores identificados, e (iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en una célula, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un decimotercer aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula que comprende por lo menos uno

o más genes cas o proteínas de los mismos y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presenten homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR en el organismo.

En un decimocuarto aspecto, se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir o disminuir) la resistencia de una célula que comprende por lo menos uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende modificar uno o más genes o proteínas cas y/o dos o más repeticiones CRISPR en la célula.

En la presente memoria se enseña un método para identificar un espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas, (ii) identificar por lo menos un espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR en un organismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula de manera que el espaciador de CRISPR presente homología respecto al espaciador del organismo, e (iv) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el espaciador de CRISPR modula la resistencia de la célula.

En la presente memoria se enseña un método para identificar un gen cas para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana

o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR, (ii) manipular la célula de manera que comprende por lo menos un gen cas, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transición del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el gen cas puede utilizarse para modular la resistencia de la célula.

En la presente memoria se enseña un método para identificar una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos un gen cas, (ii) manipular la célula de manera que contenga la repetición de CRISPR, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que la repetición CRISPR pueda utilizarse para modular la resistencia.

En la presente memoria se enseña un método para identificar una combinación funcional de un gen cas y una repetición CRISPR, que comprende las etapas siguientes:

(a) determinar las secuencias del gen cas y la repetición CRISPR, (b) identificar una o más agrupaciones de genes cas según se determina mediante análisis de comparación de secuencias, (c) identificar una o más agrupaciones de repeticiones CRISPR, y (d) combinar las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR que se encuentran dentro de la misma agrupación, en donde la combinación de las secuencias del gen cas y de la repetición CRISPR en la misma agrupación es indicativa de que la combinación es una combinación funcional.

En la presente memoria se enseña un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana que comprende uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la secuencia genómica de un bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores CRISPR de la célula bacteriana de manera que el espaciador o espaciadores CRISPR de la célula bacteriana presente homología respecto al espaciador

o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia.

En un decimoquinto aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula bacteriana contra un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar una secuencia (por ejemplo una secuencia conservada) en un bacteriófago (preferentemente una secuencia esencial para el funcionamiento o la supervivencia del bacteriófago), (ii) preparar un espaciador CRISPR que es homólogo respecto a la secuencia identificada, (iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador CRISPR, e (iv) introducir dicho ácido nucleico en la célula bacteriana, convirtiendo de esta manera a la célula bacteriana en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un decimosexto aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula bacteriana frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción en un bacteriófago del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en un genoma de bacteriófago que puede proporcionar resistencia frente al ácido nucleico diana

o producto de transcripción del mismo, (ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dicho espaciador o seudoespaciadores de CRISPR identificados, e (iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en dicha célula bacteriana, convirtiéndola de esta manera a la célula bacteriana en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un decimoséptimo aspecto se proporciona un método para modular la resistencia de una célula bacteriana que comprende uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes:

(i)

identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en un bacteriófago que puede proporcionar resistencia a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo,

(ii)

identificar uno o más espaciadores CRISPR en una célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, e (iii) modificar la secuencia del espaciador o espaciadores CRISPR en la célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, de manera que el espaciador o espaciadores CRISPR presentan un grado elevado de homología respecto al espaciador o espaciadores CRISPR del bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia.

En un decimoctavo aspecto se proporciona un método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo que comprende una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPRcas y uno o más espaciadores CRISPR en la célula.

También se enseña en la presente memoria una célula obtenida u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.

También se enseña en la presente memoria un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR obtenido u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.

También se enseña en la presente memoria un gen cas obtenido u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.

También se enseña en la presente memoria una repetición CRISPR obtenida u obtenible mediante el método o métodos descritos en la presente memoria.

Es asimismo enseñada en la presente memoria una combinación funcional obtenida u obtenible mediante el(los) procedimiento(s) descrito(s) en la presente memoria.

También se enseña en la presente memoria un locus CRISPR recombinante que comprende un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR y/o un gen cas, y/o una repetición CRISPR y/o una combinación funcional.

También se enseña en la presente memoria la utilización de una célula, un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR, un gen cas, una repetición CRISPR o una combinación funcional para modular la resistencia de una célula frente a un

ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

También se enseña en la presente memoria un cultivo celular que comprende una célula, un espaciador CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR, un gen cas, una repetición CRISPR o una combinación funcional para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

También se enseña en la presente memoria un producto alimentario o pienso que comprende el cultivo indicado en la presente memoria.

Se enseña en la presente memoria un procedimiento para preparar un producto alimentario o pienso que comprende la utilización del cultivo indicado en la presente memoria.

Se enseña en la presente memoria un producto alimentario o pienso obtenido u obtenible mediante el procedimiento descrito en la presente memoria.

Se enseña en la presente memoria la utilización del cultivo indicado en la presente memoria para preparar un producto alimentario.

Se enseña en la presente memoria una secuencia de nucleótidos que comprende o que está constituida por la secuencia proporcionada en cualquiera de las secuencias SEC ID nº 7 a 10 y SEC ID nº 359 a 405, o una variante, fragmento, homólogo o derivado de la misma.

También se enseña en la presente memoria una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos indicada en la presente memoria.

Se enseña en la presente memoria un constructo o vector que comprende una o más de las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente memoria.

Se enseña en la presente memoria una célula huésped en la que se ha incorporado una o más de las secuencias de nucleótidos indicadas en la presente invención o el constructo o vector indicado en la presente memoria.

FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS

En algunas formas de realización, se utiliza uno o más genes cas en combinación con dos o más repeticiones CRISPR.

En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.

En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y dos o más repeticiones CRISPR de manera natural pueden encontrase simultáneamente en la misma célula.

En algunas formas de realizaciones, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con uno o más espaciadores CRISPR.

En algunas formas de realizaciones, el espaciador o espaciadores CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula a partir de la que puede derivarse (preferentemente se deriva) uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.

En algunas formas de realización, el espaciador se obtiene de una célula que es resistente a un ácido nucleico diana.

En algunas formas de realización, el espaciador CRISPR es una secuencia sintética de ácidos nucleicos.

En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR presenta homología respecto del ácido nucleico diana.

En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR presenta una identidad de 100% respecto al ácido nucleico diana a lo largo de por lo menos la longitud del núcleo del espaciador CRISPR.

En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con por lo menos uno o más espaciadores CRISPR y por lo menos dos o más repeticiones CRISPR.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es ADN de bacteriófago o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva) a partir de.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es ADN de plásmido o se deriva del mismo (preferentemente se deriva del mismo).

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un elemento genético móvil o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un elemento trasponible o una secuencia de inserción o puede derivarse de cualquiera de los mismos (preferentemente se deriva de cualquiera de los mismos).

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un gen de resistencia a antibiótico o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es un ácido nucleico codificante de un factor de virulencia o puede derivarse del mismo (preferentemente se deriva del mismo).

En algunas formas de realización, el factor de virulencia se selecciona de entre el grupo que consta de un ácido nucleico codificante de una toxina, una internalina y una hemolisina.

En algunas formas de realización, el gen o genes cas y las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.

En algunas formas de realización, el gen o genes cas y las dos o más repeticiones CRISPR de manera natural se encuentran simultáneamente en la misma célula.

En algunas formas de realización, los espaciadores CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula a partir de la que procede o puede derivarse (preferentemente se deriva) el gen o genes cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.

En algunas formas de realización, la célula es una célula receptora o una célula huésped.

En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula.

En algunas formas de realización, los espaciadores proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de un organismo que es diferente de la célula que comprende uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.

En algunas formas de realización, uno o más genes o proteínas cas y las dos o más repeticiones CRISPR se encuentran de manera natural simultáneamente en la misma célula.

En algunas formas de realización, dicha modificación comprende insertar uno o más espaciadores CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR en la célula.

En algunas formas de realización, el espaciador de la célula presenta una homología de 100% respecto al espaciador CRISPR o seudoespaciador de CRISPR del organismo.

En algunas formas de realización, dicha modificación comprende manipular genéticamente el espaciador CRISPR de la célula.

En algunas formas de realización, la totalidad o parte del espaciador en la célula ha sido modificado.

En algunas formas de realización, dicha modificación comprende la modificación de un espaciador recombinante.

En algunas formas de realización, dicha modificación se produce mediante mutación espontánea o mutagénesis.

En algunas formas de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR en la célula han sido delecionadas.

En algunas formas de realización, la repetición o repeticiones CRISPR en la célula han sido delecionadas.

En algunas formas de realización, el gen o genes cas han sido delecionados.

En algunas formas de realización, se han delecionado CRISPR y/o uno o más genes cas.

En algunas formas de realización, por lo menos un gen o proteína cas y/o dos o más repeticiones CRISPR en la célula han sido delecionados.

En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma cepa o de diferentes cepas.

En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma especie o de especies diferentes.

En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) del mismo género o de diferentes géneros.

En algunas formas de realización, las secuencias de nucleótidos del gen cas y la repetición CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) del mismo organismo o de organismos diferentes.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago es una secuencia de ácidos nucleicos altamente conservada.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una proteína de especificidad de huésped.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una proteína que resulta esencial para la supervivencia, replicación o crecimiento del bacteriófago.

En algunas formas de realización, el ácido nucleico diana en el bacteriófago codifica una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o una secuencia conservada de entre genes fágicos importantes.

En algunas formas de realización, el método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo comprende la etapa adicional de comparar la secuencia de uno o más espaciadores

CRISPR en la célula con la secuencia del ácido nucleico diana.

En algunas formas de realización, el método para determinar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo comprende la etapa adicional de determinar el perfil de resistencia de la célula.

En algunas formas de realización, dicho cultivo es un cultivo iniciador o un cultivo probiótico.

FIGURAS

Figura 1

Representación esquemática de CRISPR1 de S. thermophilus CNRZ1066 (42 repeticiones).

Figura 2

Análisis de gráfico de puntos de las secuencias de la proteína Cas (A) y de las secuencias del locus CRISPR (B). Los nombres de los organismos (género, especie, cepa) se indican en el lado derecho de cada gráfico de puntos (por ejemplo, Sth_LMG18311 = S. thermophilus LMG18311).

Figura 3

Las secuencias de espaciador del locus CRISPR de S. thermophilus CNRZ1066 se buscaron con un programa BLAST (búsquedas de secuencias cortas prácticamente exactas utilizando BlastN en el sitio de internet del NCBI) frente a la base de datos de virus, y se alinearon con los resultados posteriores en los bacteriófagos de S. thermophilus. (A) La tabla indica las secuencias de espaciador del CRISPR de CNRZ1066, presentando las identidades de secuencia significativas con las secuencias fágicas (celdas negras). (B) Alineación de la secuencia interespaciadora nº 29 con ocho secuencias fágicas (nota: el espaciador nº 20 muestra similitud con varias proteínas de especificidad de huésped).

Figura 4

Estructura secundaria de tallo-bucle putativa de una secuencia de repetición CRISPR de S. thermophilus. Se muestra únicamente una cadena de ADN.

Figura 5

La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de Streptococcus thermophilus proporciona resistencia frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR. La cepa parental DGCC7710 es sensible a los fagos, y la BIM DGCC7710RH1 es resistente a los fagos. La cepa BIM DGCC7710RH1 presenta un nuevo espaciador (Sn) en el locus CRISPR, que muestra una identidad de 100% respecto a la secuencia fágica. En la etapa (b), se reta la cepa con el fago 858 y se selecciona un mutante resistente a los fagos. En la etapa (c), el locus CRISPR I del mutante presenta un espaciador adicional que comparte una identidad de 100% con la región 31.921-31.950 pb del fago.

Figura 6

La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de Streptococcus thermophilus proporciona resistencia frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR. La cepa parental DGCC7710 es sensible a los fagos, y la cepa BIM DGCC7710RH2 es resistente a los fagos. La cepa BIM DGCC7710RH2 presenta un nuevo espaciador (Sn) en el locus CRISPR, que muestra una identidad de 100% respecto a la secuencia fágica. En la etapa (b) se reta la cepa con el fago 858 y se selecciona una cepa resistente a los fagos. En la etapa (c) se repitió independientemente el experimento y se seleccionó otro mutante. El locus CRISPR I del mutante presenta un espaciador adicional (diferente del que se encuentra presente en RH1) que comparte el 100% de identidad con la región 17.125-17.244 pb del fago.

Figura 7

Organización de los espaciadores de CRISPR I en diversas cepas de Streptococcus thermophilus. Los números indican la posición del espaciador. Se listan los nombres de las cepas a la izquierda. Las letras indican el tipo del espaciador de CRISPR, en donde los espaciadores idénticos se describen con un código similar de 2 letras. Los espaciadores con polimorfismos de nucleótidos únicos se etiquetan con una combinación idéntica de letras complementada con una etiqueta "prima". Los espaciadores únicos no se describen mediante una combinación de letras y se dejan en blanco.

Figura 8

Homología de los espaciadores de CRISPR con secuencias conocidas, incluyendo secuencias cromosómicas bacterianas (sombreadas en gris), secuencias de plásmido de ADN (cuadrados negros) y secuencias genómicas fágicas (sombreadas en negro).

Figura 9

Representación gráfica del sistema plásmido utilizado para manipular genéticamente varios constructos en Streptococcus thermophilus tal como describen Russell M.W. y T.R. Klaenhammer (2001) Efficient system for directed integration into the Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus gasseri chromosomes via homologous recombination, Applied and Environmental Microbiology 67:4361-4364.

Figura 10

Representación gráfica del plásmido utilizado para subclonar productos de PCR de los diversos constructos indicados en la presente memoria (cas1 KO, cas4 KO, RT y S1S2). El plásmido se encuentra comercializado por Invitrogen en el kit TOPO TA Cloning® .

Figura 11

Representación gráfica del plásmido utilizado para la recombinación homóloga en una forma de realización de la presente invención.

Figura 12

Representación gráfica que ilustra la preparación del constructo CAS1KO en el que se ha interrumpido el gen cas1 mediante recombinación homóloga.

Figura 13

Representación gráfica que ilustra la preparación del constructo CAS4KO en el que se ha interrumpido el gen cas4 mediante recombinación homóloga.

Figura 14

Representación gráfica que ilustra la manipulación del constructo S1S2 utilizando cebadores específicos y reacciones de PCR iterativa. El primer panel ilustra todos los cebadores utilizados y la organización utilizada para las dos primeras reacciones de PCR (reacción nº 1 con los cebadores P1 y P2, y la reacción nº 2 con los cebadores P2 y P3). El segundo panel muestra que los productos de PCR obtenidos de las dos primeras reacciones de PCR, presentando el producto de la reacción nº 1 en la parte izquierda y el producto de la reacción nº 2 en la parte derecha. El tercer panel muestra la tercera reacción de PCR, utilizando una combinación de los productos de las dos primeras PCR como el molde para la tercera reacción de PCR, y el cebador P1 de la primera reacción conjuntamente con el cebador P4 de la segunda reacción. El cuarto panel muestra el producto de la PCR nº 3, que técnicamente genera el constructo S1S2.

Figura 15

Representación gráfica de los detalles para el diseño de los cebadores 2 y 3, que contienen secuencias clave para el experimento, derivado de espaciadores idénticos a las secuencias fágicas (los productos de PCR derivados de dichos cebadores de PCR generarán los espaciadores que finalmente proporcionarán resistencia a los fagos).

Figura 16

Representación gráfica de la integración del constructo S1S2.

Figura 17

Representación gráfica de la preparación del constructo RT utilizando un enzima de restricción para generar el constructo RT a partir del constructo S1S2. Existen sitios de restricción BglI dentro de las repeticiones, permitiendo el corte de la parte "intermedia" del constructo. Tras la digestión enzimática, se utilizó una ligasa para empalmar entre sí los dos trozos terminales, generando de esta manera un nuevo constructo que presenta RT, pero que no presenta espaciadores.

Figura 18

Representación gráfica de la integración del constructo RT.

Figura 19

Representación gráfica del constructo RT'.

Figura 20

Representación gráfica del constructo RT'.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

LOCUS CRISPR

Los loci CRISPR son una clase claramente distinguible de repeticiones de secuencia corta intercaladas (SSR) que fueron reconocidas por primera vez en E. coli (Ishino et al., J. Bacteriol. 169:5429-5433, 1987; Nakata et al., J. Bacteriol. 171:3553-3556, 1989). Se han identificado SSR intercaladas similares en Haloferax mediterranei, Streptococcus pyogenes, Anabaena y Mycobacterium tuberculosis (Groenen et al., Mol. Microbiol. 10:1057-1065, 1993; Hoe et al., Emerg. Infect. Dis. 5:254-263, 1999; Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30, 1996; Mojica et al., Mol. Microbiol. 17:85-93, 1995). Los loci CRISPR difieren de otros SSR en la estructura de las repeticiones, que se han denominado repeticiones cortas uniformemente espaciadas (SRSR) (Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol. 6:23-33, 2002; Mojica et al., Mol. Microbiol. 36:244-246, 2000). Las repeticiones son elementos cortos que existen en agrupaciones, que en todos los casos se presentan espaciados uniformemente por secuencias intermedias únicas de una longitud constante (Mojica et al., Mol. Microbiol. 36:244-246, 2000). Aunque las secuencias de repetición se encuentran altamente conservadas entre cepas, el número de repeticiones intercaladas y las secuencias de las regiones intercaladas difieren de cepa a cepa (van Embden et al., J. Bacteriol. 182:2393-2401, 2000).

Las características estructurales comunes de los loci CRISPR han sido descritas por Jansen et al., 2002: (i) presencia de múltiples repeticiones directas cortas, que muestran muy poca o ninguna variación de secuencia dentro de un locus dado,

(ii) presencia de secuencias espaciadoras no repetidas entre las repeticiones de tamaño similar, (iii) presencia de una secuencia líder común de unos cuantos cientos de pares de bases en la mayoría de especies que incluyen múltiples loci CRISPR, (iv) ausencia de marcos de lectura abierta largos dentro del locus, e (v) presencia de uno o más genes cas.

Los CRISPR típicamente son secuencias cortas parcialmente palindrómicas de 24 a 40 pb que contienen repeticiones internas y terminales invertidas de hasta 11 pb. Aunque se han detectado elementos aislados, generalmente se encuentra organizados en agrupaciones (de hasta aproximadamente 20 ó más en cada genoma) de unidades repetidas espaciadas por secuencias intercaladas únicas de 20 a 58 pb. Los CRISPR generalmente son homogéneos en un genoma dado, siendo la mayoría idénticos. Sin embargo, existen ejemplos de heterogeneidad en, por ejemplo, las arqueobacterias

(Mojica et al., 2000).

A título de ejemplo, el genoma de Streptococcus thermophilus LMG18311 contiene 3 loci CRISPR; las secuencias repetidas de 36 pb son diferentes en CRISPR1 (34 repeticiones), CRISPR2 (5 repeticiones) y CRISPR3 (una única secuencia). Sin embargo, se encuentran perfectamente conservadas dentro de cada locus. Las repeticiones CRISPR1 y CRISPR2 se encuentran interespaciadas por 33 y 4 secuencias de 30 pb de longitud, respectivamente. Todas dichas secuencias interespaciadoras son diferentes entre sí. También son diferentes de las que se encuentran en la cepa CNRZ1066 (41 secuencias interespaciadoras en CRISPR1) y en la cepa LMD-9 (16 dentro de CRISPR1 y 8 dentro de CRISPR3), siendo ambos S. thermophilus. La figura 1 describe uno de los CRISPR identificados en S. thermophilus.

Diversos métodos para identificar los loci CRISPR ya son conocidos en la técnica. A título de ejemplo, Jensen et al., 2002, describen un enfoque de tipo computerizado en el que se buscan secuencias de nucleótidos para encontrar motivos CRISPR utilizando el programa PATSCAN en el servidor de la Mathematics and Computer Science Division del Argonne National Laboratory, Argonne, IL, USA. El algoritmo que se utilizó para identificar los motivos CRISPR era p1 = a... bc...d p1 c...d p1 c ... d p1, en los que a y b son el límite inferior y superior de tamaño de la repetición y de p1, y c y d son el límite inferior y superior de tamaño de las secuencias espaciadoras. Los valores de a, b, c y d pueden modificarse entre aproximadamente 15 y aproximadamente 70 pb a incrementos de aproximadamente 5 pb.

Los loci CRISPR pueden identificarse utilizando gráficos de puntos (utilizando, por ejemplo, un programa informático denominado Dotter).

Puede llevarse a cabo un análisis de similitud de secuencias utilizando diversos métodos bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo, el análisis puede llevarse a cabo utilizando NCBI BLAST con una base de datos de genomas microbianos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) y GenBank.

La amplificación de los loci CRISPR ha sido descrita en, por ejemplo, Mojica et al., 2005, y en Pourcel et al., 2005. La amplificación de la región deseada del ADN puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El término "amplificación" se refiere en la presente memoria a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos. Ésta se lleva a cabo generalmente utilizando tecnologías de PCR bien conocidas en la técnica (Dieffenbach y Dveksler, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York, 1995).

La expresión "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere en la presente memoria a un método tal como el dado a conocer en las patentes US nº 4.683.195 y nº 4.683.202, que describen un método para incrementar la concentración de un segmento de una secuencia diana en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. La longitud del segmento amplificado de la secuencia diana deseada se determina a partir de las posiciones relativas de dos cebadores oligonucleótidos y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. En virtud del aspecto de repetición del procedimiento, el método se denomina "PCR". Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que han sido "amplificadas mediante PCR".

En el enfoque de la PCR, los cebadores oligonucleótidos pueden diseñarse para la utilización en reacciones de PCR para amplificar la totalidad o parte de un locus CRISPR. El término "cebador" se refiere en la presente memoria a un oligonucleótido, de origen natural, tal como en un digerido de restricción purificado, o producido sintéticamente, que puede actuar como punto de inicio de síntesis al someterlo bajo condiciones en las que la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácidos nucleicos resulta inducida (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como ADN polimerasa, y una temperatura y pH adecuados). El cebador puede ser de una cadena para máxima eficiencia de la amplificación, aunque alternativamente puede ser de doble cadena. En el caso de que sea de doble cadena, el cebador en primer lugar se trata para separar sus cadenas antes de utilizarse para preparar los productos de extensión. El cebador puede ser un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependen de muchos factores, incluyendo la temperatura, la fuente del cebador y la utilización del método. Los cebadores de PCR típicamente presentan una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos, y más típicamente de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos.

Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación mediante PCR son generalmente conocidos en la técnica y se dan a conocer en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989; ver también Innis et al., editores, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York, 1990); Innis y Gelfand, editores, PCR Strategies (Academic Press, New York), 1995; e Innis y Gelfand, editores, PCR Methods Manual (Academic Press, New York), 1999). Entre los métodos de PCR conocidos están comprendidos de manera no limitativa, los métodos que utilizan cebadores apareados, los cebadores anidados, los cebadores específicos únicos, los cebadores degenerados, los cebadores específicos de un gen, los cebadores específicos de un vector, los cebadores parcialmente desapareados, y similares.

Los loci CRISPR pueden comprender, estar constituidos o esencialmente constituidos por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

Los loci CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

Los loci CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.

Las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria pueden obtenerse de bases de datos, tales como GenBank o el sitio de internet de JGI en http://genome-jgipsf.org/mic_home.html.

ORIENTACIÓN DE CRISPR

Para evitar dudas, en el contexto de la presente invención, el locus CRISPR se orienta de la manera siguiente.

El líder de CRISPR es un segmento de ADN conservado de tamaño definido. Por ejemplo, la secuencia líder de S. thermophilus CRISPR1 es el segmento de ADN que se inicia inmediatamente después del codón de parada del gen str0660, y que finaliza inmediatamente antes de la primera repetición. El líder de CRISPR se localiza en el extremo 5' del locus CRISPR. El líder de CRISPR se localiza inmediatamente cadena arriba de la primera repetición CRISPR del locus CRISPR.

La secuencia remolque de CRISPR es un segmento de ADN conservado de tamaño definido. Por ejemplo, la secuencia remolque del CRISPR1 de S. thermophilus es el segmento de ADN que se inicia inmediatamente después de la repetición terminal y que finaliza inmediatamente antes del codón de parada del gen str0661 (situado en la cadena de ADN opuesta). La secuencia remolque de CRISPR se localiza en el extremo 3' del locus CRISPR. La secuencia remolque de CRISPR se localiza inmediatamente cadena abajo de la repetición terminal.

A título de ejemplo, las secuencias líder y remolque de CRISPR en el locus CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa CNRZ1066 son:

secuencia líder de CRISPR:

5'-CAAGGACAGTTATTGATTTTATAATCACTATGTGGGTATAAAAACGTCAAA ATTTCATTTGAG -3'

secuencia remolque de CRISPR:

5'-TTGATTCAACATAAAAAGCCAGTTCAATTGAACTTGGCTTT-3'

La secuencia líder de CRISPR corresponde a las posiciones 625.038 a 625.100, y la secuencia remolque de CRISPR corresponde a las posiciones 627.845 a 627.885 en el genoma total (CP000024) de Streptococcus thermophilus.

Para evitar dudas, el término "cadena arriba" se refiere a la dirección 5', y "cadena abajo" se refiere a la dirección 3'.

CAS

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "gen cas" presenta el significado convencional utilizado en la técnica y se refiere a uno o más genes cas que generalmente se encuentran acoplados, asociados o se encuentran próximos o son contiguos a loci CRISPR flanqueantes.

Se presenta una revisión exhaustiva de la familia de la proteína Cas en Haft et al., Computational Biology 1, 6 e60, 2005. Tal como se describen en dicha referencia, se describen 41 familias génicas asociadas a CRISPR (cas), además de las cuatro familias génicas previamente conocidas. Demuestra que los sistemas CRISPR pertenecen a diferentes clases, con patrones de repetición, conjuntos de genes y rangos de especies diferentes.

El número de genes cas en un locus CRISPR dado puede variar entre especies.

En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genes

o proteínas cas para modular la resistencia en una célula (por ejemplo una célula receptora) contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genes o proteínas cas y uno o más espaciadores de CRISPR para modular la resistencia en una célula (por ejemplo una célula receptora) contra un ácido nucleico diana

o un producto de transcripción del mismo.

En algunas formas de realización, uno o más de los genes y/o proteínas cas puede encontrarse naturalmente en una célula receptora y pueden integrarse o insertarse uno o más espaciadores heterólogos contiguamente a uno o más de los genes o proteínas cas.

En algunas formas de realización, apropiadamente uno o más de los genes y/o proteínas cas pueden ser heterólogos respecto a la célula receptora, y uno o más de los espaciadores puede ser homólogo o heterólogo. En este caso, los espaciadores pueden integrarse o insertarse contiguamente a uno o más de los genes o proteínas cas.

En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genes

o proteínas cas y a por lo menos dos repeticiones CRISPR para modular la resistencia en una célula (por ejemplo una célula receptora) contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En un aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de uno o más genes

o proteínas cas, por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un espaciador de CRISPR para modular la resistencia en una célula (por ejemplo una célula receptora) contra un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Las estructuras de CRISPR típicamente se encuentran en la proximidad de cuatro genes denominados cas1 a cas4. La organización más común de estos genes es cas3cas4-cas1-cas2. La proteína Cas3 aparentemente es una helicasa, mientras que Cas4 es similar a la familia RecB de exonucleasas y contiene un motivo rico en cisteínas, que sugiere la unión de ADN. Cas1 generalmente es altamente básica y es la única proteína Cas que se ha encontrado consistentemente en todas las especies que contienen loci CRISPR. Cas2 todavía no ha sido caracterizada. Cas1-4 típicamente se caracterizan por su estrecha proximidad a los loci CRISPR y por su amplia distribución en especies bacterianas y arqueobacterianas. Aunque no todos los genes cas1-4 se encuentran asociados a todos los loci CRISPR, la totalidad presenta múltiples subtipos.

Bolotin et al., 2005, recientemente han informado de otra agrupación de tres genes asociados a estructuras de CRISPR en muchas especies bacterianas, denominadas en la presente memoria cas1B, cas5 y cas6.

El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6. En una forma de realización, el gen cas es cas1.

El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o una pluralidad de los mismos o una combinación de los mismos, tal como cas1 y cas2; cas1 y cas3; cas1 y cas4; cas1 y cas1B; cas1 y cas5; cas1 y cas6; cas2 y cas3; cas2 y cas4; cas2 y cas1B; cas2 y cas5; cas2 y cas6; cas3 y cas4; cas3 y cas1B; cas3 y cas5; cas3 y cas6; cas4 y cas1B; cas4 y cas5; cas4 y cas6; cas1B y cas5; cas1B y cas6; cas1, cas2 y cas3; cas1, cas2 y cas4; cas1, cas2 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas4; cas1, cas2, cas3 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas5; cas1, cas2, cas3 y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas2, cas3 y cas4; cas2, cas3 y cas1B; cas2, cas3 y cas5; cas2, cas3 y cas6; cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas2, cas3, cas4, y cas5; cas2, cas3, cas4 y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas3, cas4 y cas1B; cas3, cas4 y cas5; cas3, cas4 y cas6; cas3, cas4, cas1B y cas5; cas3, cas4, cas1B y cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas4, cas1B y cas5; cas4, cas1B y cas6; cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas5 y cas6 ó una combinación de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas1 y cas2; cas1 y cas3 ; cas1 y cas4 ; cas1 y cas1B; cas1 y cas5; cas1 y cas6 ; cas2 y cas3 ; cas2 y cas4; cas2 y cas1B; cas2 y cas5; cas2 y cas6 ; cas3 y cas4; cas3 y cas1B; cas3 y cas5; cas3 y cas6 ; cas4 y cas1B; cas4 y cas5; cas4 y cas6; cas1B y cas5 o cas1B y cas6, o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas1, cas2 y cas3 ; cas1, cas2 y cas4 ; cas1, cas2 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas4 ; cas1, cas2, cas3 y cas1B; cas1, cas2, cas3 y cas5; cas1, cas2, cas3 y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5 ; cas1; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6 ; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5 ; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6, o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas2, cas2, cas3 y cas4; cas2, cas3 y cas1B; cas2, cas3 y cas5; cas2, cas3 y cas6; cas2, cas3, cas4 y cas1B; cas2, cas3, cas4, y cas5; cas2, cas3, cas4 y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5; cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6; cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6, o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas3, cas4 y cas1B; cas3, cas4 y cas5; cas3, cas4 y cas6 ; cas3, cas4, cas1B y cas5; cas3, cas4, cas1B y cas6; cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas4, cas1B y cas5; cas4, cas1B y cas6; cas4, cas1B, cas5 y cas6; cas5 y cas6 ó combinaciones de los mismos.

El gen cas puede ser uno o más de entre cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o una pluralidad de los mismos, tal como una pluralidad de 2 genes cas cualesquiera, 3 genes cas cualesquiera, 4 genes cas cualesquiera, 5 genes cas

cualesquiera, 6 genes cas cualesquiera o 7 genes cas cualesquiera.

La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o estar constituida esencialmente por una pluralidad de los mismos genes cas, tal como 2 genes cas,3 genes cas, 4 genes cas, 5 genes cas, 6 genes cas, 7 genes cas, 8 genes cas, 9 genes cas, 10 genes cas, 15 genes cas, 20 genes cas, 25 genes cas, 30 genes cas, 35 genes cas, 40 genes cas o incluso 50 ó más genes cas.

La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de genes cas diferentes, tal como 2 genes cas diferentes, 3 genes cas diferentes, 4 genes cas diferentes, 5 genes cas diferentes, 6 genes cas diferentes, 7 genes cas diferentes, 8 genes cas diferentes, 9 genes cas diferentes, 10 genes cas diferentes, 15 genes cas diferentes, 20 genes cas diferentes, 25 genes cas diferentes, 30 genes cas diferentes, 35 genes cas diferentes, 40 genes cas diferentes o incluso 50 o más genes cas diferentes.

La pluralidad de genes cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de genes cas iguales y/o diferentes, tal como 2 genes cas diferentes, 3 genes cas diferentes, 4 genes cas diferentes, 5 genes cas diferentes, 6 genes cas diferentes, 7 genes cas diferentes, 8 genes cas diferentes, 9 genes cas diferentes, 10 genes cas diferentes, 15 genes cas diferentes, 20 genes cas diferentes, 25 genes cas diferentes, 30 genes cas diferentes, 35 genes cas diferentes, 40 genes cas diferentes, o incluso 50 o más genes cas diferentes. El mismo gen cas puede duplicarse una pluralidad de veces.

Apropiadamente, la expresión "gen cas" se refiere a una pluralidad de genes cas, tal como entre 2 y 12 genes cas, más preferentemente entre 3 y 11 genes cas, más preferentemente entre 4 y 10 genes cas, más preferentemente entre 4 y 9 genes cas, más preferentemente entre 4 y 8 genes cas, más preferentemente entre 4 y 7 genes cas, tal como 4, 5, 6 ó 7 genes cas.

El gen o genes cas puede comprender, estar constituido o consituido esencialmente por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

El gen o genes cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

El gen o genes cas pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.

Tal como se describe posteriormente en la presente memoria, el gen cas puede ser un fragmento de un gen cas, indicando de esta manera que el gen cas comprende una fracción de una secuencia de tipo salvaje. Apropiadamente, la secuencia comprende por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%,

o por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje.

5

10

15

20

25

30

35

40

45 -22

Para algunas formas de realización resulta preferido que el gen cas sea el gen cas más próximo a la secuencia líder de la primera repetición CRISPR en el extremo 5' y del locus CRISPR, tal como cas4 o cas6.

La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6.

La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado de la misma.

La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 o una combinación de las mismas, tal como Cas1 y Cas2; Cas1 y Cas3; Cas 1y Cas4; Cas1 y Cas1B; Cas1 y Cas5; Cas1 y Cas6; Cas2 y Cas3; Cas2 y Cas4; Cas2 y Cas1B; Cas2 y Cas5; Cas2 y Cas6; Cas3 y Cas4; Cas3 y Cas1B; Cas3 y Cas5; Cas3 y Cas6; Cas4 y Cas1B; Cas4 y Cas5; Cas4 y Cas6; Cas1By Cas5; Cas1By Cas6; Cas1, Cas2 y Cas3; Cas1, Cas2 y Cas4; Cas1, Cas2 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas2, Cas3 y Cas4; Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas2, Cas3 y Cas5; Cas2, Cas3 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4,y Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas3, Cas4 y Cas5; Cas3, Cas4 y Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6 or Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6, Cas5 y Cas6.

La proteína Cas puede ser Cas1 y Cas2; Cas1 y Cas3; Cas1 y Cas4; Cas1 y Cas1B; Cas1 y Cas5; Cas1 y Cas6; Cas2 y Cas3; Cas2 y Cas4; Cas2 y Cas1B; Cas2 y Cas5; Cas2 y Cas6; Cas3 y Cas4; Cas3 y Cas1B; Cas3 y Cas5; Cas3 y Cas6; Cas4 y Cas1B; Cas4 y Cas5; Cas4 y Cas6; Cas1 By Cas5 or Cas1By Cas6 ó combinaciones de los mismos.

La proteína Cas puede ser Cas1, Cas2 y Cas3; Cas1, Cas2 y Cas4; Cas1, Cas2 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas4; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas1B Cas1, Cas2, Cas3 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3 y Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4 y Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6 o combinaciones de los mismos.

La proteína Cas puede ser Cas2, Cas3 y Cas4; Cas2, Cas3 y Cas1B; Cas2, Cas3 y Cas5; Cas2, Cas3 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas2, Cas3, Cas4,y Cas5; Cas2, Cas3, Cas4 y Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6 ó combinaciones de los mismos.

La proteína Cas puede ser Cas3, Cas4 y Cas1B; Cas3, Cas4 y Cas5; Cas3, Cas4 y Cas6; Cas3, Cas4, Cas1By Cas5; Cas3, Cas4, Cas1By Cas6; Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas4, Cas1By Cas5; Cas4, Cas1By Cas6; Cas4, Cas1B, Cas5 y Cas6; Cas5 y Cas6 ó combinaciones de los mismos.

La proteína Cas puede ser una o más de entre Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas1B, Cas5 y/o Cas6 ó una pluralidad de los mismos, tal como una pluralidad de 2 genes cas cualesquiera, 3 genes cas cualesquiera, 4 genes cas cualesquiera, 5 genes cas cualesquiera, 6 genes cas cualesquiera o 7 genes cas cualesquiera.

La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, estar constituida o constituida esencialmente por una pluralidad de las mismas proteínas Cas, tal como 2 proteínas Cas, 3 proteínas Cas, 4 proteínas Cas, 5 proteínas Cas, 6 proteínas Cas, 7 proteínas Cas, 8 proteínas Cas, 9 proteínas Cas, 10 proteínas Cas, 15 proteínas Cas, 20 proteínas Cas, 25 proteínas Cas, 30 proteínas Cas, 35 proteínas Cas, 40 proteínas Cas, o incluso 50 ó más proteínas Cas diferentes.

La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, estar constituida o esencialmente constituida por una pluralidad de las mismas proteínas Cas tales como 2 proteínas Cas, 3 proteínas Cas, 4 proteínas Cas, 5 proteínas Cas, 6 proteínas Cas, 7 proteínas Cas, 8 proteínas Cas, 9 proteínas Cas, 10 proteínas Cas, 15 proteínas Cas, 20 proteínas Cas, 25 proteínas Cas, 30 proteínas Cas, 35 proteínas Cas, 40 proteínas Cas o incluso 50 o más proteínas Cas.

La pluralidad de proteínas Cas puede comprender, consistir o consistir esencialmente de una pluralidad de las mismas y/o diferentes proteínas Cas, tal como 2 proteínas Cas diferentes, 3 proteínas Cas diferentes, 4 proteínas Cas diferentes, 5 proteínas Cas diferentes, 6 proteínas Cas diferentes, 7 proteínas Cas diferentes, 8 proteínas Cas diferentes, 9 proteínas Cas diferentes, 10 proteínas Cas diferentes, 15 proteínas Cas diferentes, 20 proteínas Cas diferentes, 25 proteínas Cas diferentes, 30 proteínas Cas diferentes, 35 proteínas Cas diferentes, 40 proteínas Cas diferentes, o incluso 50 o más proteínas Cas diferentes. Las mismas proteínas Cas pueden duplicarse una pluralidad de veces.

Apropiadamente, la expresión "proteína Cas" se refiere a una pluralidad de proteínas Cas, tal como entre 2 y 12 proteínas Cas, más preferentemente entre 3 y 11 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 10 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 9 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 8 proteínas Cas, más preferentemente entre 4 y 7 proteínas Cas, tal como 4, 5, 6 ó 7 proteínas Cas.

La proteína o proteínas Cas puede encontrarse codificada por un gen cas que puede comprender ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La proteína o proteínas Cas puede encontrarse codificada por un gen cas que puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La proteína o proteínas Cas puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar un gen cas para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR, (ii) manipular la célula de manera que comprende por lo menos un gen cas, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia contra el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en donde la modulación de la resistencia de la célula contra el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el gen cas puede utilizarse para modular la resistencia de la célula.

Puede utilizarse uno o más genes cas para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más genes cas para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y uno o más espaciadores de CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana

o un producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, el gen o genes cas pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden utilizarse como molde en el que se modifica (por ejemplo se muta) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crean o se forman genes cas en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los indicados en la presente memoria.

Los genes cas pueden comprender o consistir de una agrupación cas seleccionada de entre el grupo constituido por una o más cualesquiera de entre SEC ID nº 461, SEC ID nº 466, SEC ID nº 473, SEC ID nº 478, SEC ID nº 488, SEC ID nº 493, SEC ID nº 498, SEC ID nº 504, SEC ID nº 509 y SEC ID nº 517.

Los genes cas pueden comprender o estar constituidos por uno o más cualesquiera de entre SEC ID nº 462 a nº 465, nº 467 a nº 472, nº 474 a nº 477, nº 479 a nº 487, nº 489 a nº 492, nº 494 a nº 497, nº 499 a nº 503, nº 505 a nº 508, nº 510 a nº 516 y/o nº 517 a nº 521.

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza conjuntamente o en combinación con uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y opcionalmente uno o más espaciadores de CRISPR.

REPETICIÓN CRISPR

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "repetición CRISPR" presenta el significado convencional utilizado en la técnica, es decir, múltiples repeticiones directas cortas, que muestran una variación de secuencia nula o muy reducida dentro de un locus CRISPR dado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "CRISPR" es sinónimo de la expresión "repetición CRISPR".

El número de nucleótidos en una repetición es generalmente de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 pares de bases, pero puede ser de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 33 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 40 pares de bases, aproximadamente 21 a aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 35 pares de bases,

o de aproximadamente 28 ó 29 pares de bases. El número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente entre aproximadamente 30 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 40, o de aproximadamente 32.

Apropiadamente, el número de nucleótidos en una repetición es generalmente de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 40 pares de bases, aunque puede ser de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 35 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 33 pares de bases, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 30 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 21 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 23 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 40 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 39 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37 pares de bases, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 35 pares de bases, o de aproximadamente 28 ó 29 pares de bases.

Apropiadamente, el número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 140, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100, o de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100.

Apropiadamente, el número de repeticiones puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 40, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 30, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 10, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 8, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 7, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 6, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5, de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 4, o de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3.

La repetición o repeticiones CRISPR pueden comprender, estar constituidas o esencialmente constituidas por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La repetición o repeticiones CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La repetición o repeticiones CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante), tal como se describe en la presente memoria.

Puede utilizarse una o más de las repeticiones CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse una o más, preferentemente dos o más, repeticiones CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y uno o más espaciadores de CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, la repetición o repeticiones CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, la repetición o repeticiones CRISPR pueden utilizarse como molde a partir del que pueden modificarse (por ejemplo mutarse) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crean una o más repeticiones CRISPR o se manipulan en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, la repetición o repeticiones CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar, que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

En un aspecto adicional de la presente invención también se proporciona un método para identificar una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos un espaciador CRISPR y por lo menos un gen cas, (ii) manipular la célula de manera que contenga una repetición CRISPR, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en el que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo es indicativa de que la repetición CRISPR puede utilizarse para modular la resistencia.

Apropiadamente, se utiliza uno o más genes o proteínas cas conjuntamente o en combinación con uno o más, preferentemente dos o más, repeticiones CRISPR, y opcionalmente uno o más espaciadores de CRISPR. Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y la repetición o repeticiones CRISPR forman una combinación funcional tal como se describe posteriormente.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

Las repeticiones CRISPR pueden comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos proporcionada una o más cualesquiera de las secuencias SEC ID nº 1 a 22.

COMBINACIÓN FUNCIONAL

Tal como se ha mencionado anteriormente, en el contexto de la presente invención inesperadamente se ha descubierto que un conjunto dado de genes o proteínas cas se asocia en todos los casos con una secuencia repetida dada dentro de un locus CRISPR particular. En otras palabras, los genes o proteínas cas aparentemente son específicos para una repetición de ADN dada, implicando que los genes o proteínas cas y la

secuencia repetida forman una pareja funcional.

Por lo tanto, las combinaciones particulares de uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente, dos o más repeticiones CRISPR son utilizadas con el fin de que se confiera resistencia a un espaciador CRISPR contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en una célula (por ejemplo una célula receptora). Por lo tanto, se ha descubierto inesperadamente que no es posible únicamente utilizar cualesquier genes o proteínas cas o cualquier repetición CRISPR. En su lugar, es una característica de la presente invención que la combinación sea funcional.

En el contexto de la combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas descrita en la presente memoria, el término "funcional" se refiere a que la combinación puede proporcionar resistencia frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo al utilizarla conjuntamente con un espaciador de CRISPR que se alinea o es homólogo a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "combinación funcional de repetición CRISPR-cas" y "combinación funcional de repetición CRISPR-gen ca " incluye una combinación funcional en la que cas es un gen cas o una proteína Cas.

Apropiadamente, el gen o proteínas cas y/o por lo menos uno, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR proceden o pueden derivarse (preferentemente se derivan) de la misma célula (por ejemplo la misma célula receptora).

En una forma de realización, el término "derivable" es sinónimo del término "obtenible".

En una forma de realización, el término "derivado" es sinónimo del término "obtenido".

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y/o por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son derivables (preferentemente se derivan) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma o plásmido, preferentemente un genoma o plásmido de la misma cepa, especie o género.

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y/o por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son derivables (preferentemente se derivan) del mismo locus CRISPR dentro de un único genoma o plásmido, preferentemente un único genoma o plásmido de la misma cepa, especie o género.

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos una, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente naturalmente en la misma célula (por ejemplo una célula receptora).

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en la misma célula (por ejemplo en una célula receptora).

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en el mismo genoma de una célula (por ejemplo una célula receptora).

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes naturalmente en el mismo genoma de una cepa, especie o género.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un aspecto adicional, se proporciona una combinación o ácido nucleico que consiste esencialmente de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas.

En una forma de realización, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas y excluye por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR, tal como la ausencia de uno o más espaciadores CRISPR y/o la ausencia de una o más secuencias líder comunes de un locus CRISPR.

En una forma de realización, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas únicamente y excluye todos los demás componentes de un locus CRISPR, tal como un locus CRISPR presente naturalmente.

En una forma de realización adicional, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas sólo y excluye todos los demás componentes de un locus CRISPR, tal como un locus CRISPR natural.

En una forma de realización adicional, la expresión "está esencialmente constituida por" se refiere a una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas con la condición de que por lo menos un componente adicional del locus CRISPR natural se encuentre ausente (por ejemplo sustancialmente ausente).

Apropiadamente, se proporciona una combinación de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas con la condición de que todos los demás componentes del locus CRISPR se encuentren ausentes (por ejemplo sustancialmente ausentes), preferentemente de que la totalidad de los demás componentes del locus CRISPR de la combinación natural de una o más repeticiones CRISPR y uno o más genes cas se encuentre ausente.

Apropiadamente, se utiliza por lo menos un gen o proteína cas en combinación o conjuntamente con uno o más espaciadores de CRISPR.

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación o conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos uno o más, preferentemente, dos o más repeticiones CRISPR.

En una forma de realización, el espaciador o espaciadores CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de un organismo (por ejemplo de un organismo donante) que es diferente de la célula (por ejemplo la célula receptora) a partir de la que proceden o son derivables (preferentemente que se deriva) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR.

Se encuentran contempladas diversas organizaciones de la repetición o repeticiones CRISPR y de por lo menos un gen o proteína cas, tales como las combinaciones funcionales de repeticiones CRISPR-cas.

La combinación puede comprender, estar constituida o esencialmente constituida por lo menos por cualquiera de entre 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 repeticiones CRISPR en combinación con cualquiera de entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 genes o proteínas cas, tal como 16 repeticiones CRISPR y 12 genes o proteínas cas, ó 18 repeticiones CRISPR y 20 genes o proteínas cas, o cualquier otra combinación de los mismos.

La repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes cas pueden organizarse de diversas maneras.

La combinación puede ser cas1-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas2-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas3-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas4-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas1B-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), cas5-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones), y/o cas6-repetición (en la que la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones).

El gen cas puede ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6 o un fragmento, variante, homólogo o derivado del mismo.

Los genes cas pueden ser cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y/o cas6, o una pluralidad de los mismos o una combinación de los mismos, tal como cas1 y cas2repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas6-epetición; (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas1B-repètición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5, cas6repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones).

Los genes cas pueden ser cas1 y cas2-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas1Brepetición(en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas5repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1B y cas5repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas1, cas2 y cas3-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas1, cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas2, cas3 y cas4-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3 y cas6-repeticion (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas1Brepetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas2, cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.

Los genes cas pueden ser cas3, cas4 y cas1B-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas3, cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas5-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas4, cas1B, cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones); cas5 y cas6-repetición (en donde la repetición es por lo menos dos repeticiones, preferentemente con por lo menos un espaciador entre las repeticiones) o combinaciones de los mismos.

En el caso de que la combinación de un gen cas y una repetición CRISPR comprenda más de un gen cas, se entenderá que la repetición CRISPR puede insertarse en el extremo 3' de los genes cas, en el extremo 5' de los genes cas, o incluso entre los genes cas, con la condición de que por lo menos uno de los genes cas siga siendo funcional.

En una forma de realización, puede utilizarse una primera combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR, en donde ambos son derivables (preferentemente derivados) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma, en combinación con una segunda combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR, en donde ambos son derivables (preferentemente derivados) del mismo locus CRISPR o de un locus CRISPR diferente dentro de un genoma). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en la presente forma de realización de la invención, la primera y la segunda combinaciones son derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma.

De esta manera, la primera y segunda combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas incluso puede proceder de diferentes genomas, tal como de diferentes genomas dentro de la misma agrupación, tal como se describe en mayor detalle en la presente memoria.

En todavía una forma de realización adicional de la presente invención, puede utilizarse unas primera y/o segunda combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas (que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR derivables (preferentemente derivadas) del mismo locus CRISPR dentro de un genoma), en combinación con 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 ó más combinaciones de repetición CRISPR-gen o proteína cas (comprendiendo cada una por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en la presente forma de realización de la invención, las combinaciones son derivables (preferentemente derivadas) de los mismos loci CRISPR o de diferentes loci CRISPR dentro de un genoma.

En una forma de realización adicional de la invención, las combinaciones incluso pueden proceder de genomas diferentes, tal como de genomas diferentes dentro de la misma agrupación, tal como se describe en mayor detalle en la presente memoria.

En otras palabras, para que la combinación de repetición CRISPR-gen o proteína cas proporcione resistencia, en algunas formas de realización, la repetición o repeticiones CRISPR y el gen o genes, o proteína o proteínas, cas se encuentran presentes simultáneamente de manera natural dentro del mismo locus CRISPR de un genoma. En algunas formas de realización, la(s) repetición(ones) CRISPR y la(s) proteína(s) o gen(es) cas de coocurrencia natural con el mismo locus CRISPR de un genoma. Estas combinaciones funcionales conjuntamente pueden proporcionar resistencia frente a un

ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para identificar una combinación funcional de un gen o proteína cas y una repetición CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) analizar las secuencias (por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos o de proteína) del gen o proteína cas, y la repetición CRISPR, (ii) identificar una

o más agrupaciones de genes o proteínas cas, (iii) identificar una o más agrupaciones de repeticiones CRISPR, e (iv) combinar las secuencias de gen o proteína cas proteína cas y repetición CRISPR que se encuentran dentro de la misma agrupación.

En un aspecto adicional se proporciona un método para identificar una combinación funcional de un gen o proteína cas y una repetición CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana

o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende una combinación de uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más, repeticiones CRISPR, (ii) manipular la célula de manera que contenga uno o más espaciadores de CRISPR, e (iii) determinar si la célula modula la resistencia frente a un ácido nucleico diana, en la que la modulación de la resistencia del a célula frente al ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo es indicativa de que la combinación puede utilizarse para modular la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana.

Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de la misma cepa o de cepas diferentes.

Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR proceden o son derivables (preferentemente se derivan) de la misma especie o de especies diferentes.

Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) del mismo género o de géneros diferentes.

Apropiadamente, las secuencias del gen o proteína cas y la repetición CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) del mismo organismo o de organismos diferentes.

Apropiadamente, el análisis se lleva a cabo utilizando análisis de gráficos de puntos.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por ADN y ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN y un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ADN y un gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN y un gen cas de ADN de origen genómico, sintético o recombinante.

La combinación puede estar constituida, o esencialmente constituida por una repetición CRISPR de ARN y un gen cas de ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La repetición CRISPR puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

El gen cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido, o combinaciones de las mismas.

La repetición CRISPR puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La repetición CRISPR puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La repetición CRISPR puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La repetición CRISPR puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de doble cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La repetición CRISPR puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas, y el gen cas puede ser de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

Pueden utilizarse una o más de las combinaciones funcionales indicadas anteriormente para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse una o más combinaciones funcionales para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más espaciadores de CRISPR pueden utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo. A título de ejemplo, pueden insertarse combinaciones funcionales en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica. A título de ejemplo adicional, pueden utilizarse las combinaciones funcionales como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen combinaciones funcionales en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse combinaciones funcionales en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transformen en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

En una forma de realización, la combinación funcional se obtiene o es obtenible mediante un método que comprende las etapas siguientes: (a) analizar las secuencias de un gen cas y una repetición CRISPR, (b) identificar una o más agrupaciones de genes cas, (c) identificar una o más agrupaciones de repeticiones CRISPR, y (d) combinar las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR que se encuentran en la misma agrupación, en la que la combinación de las secuencias de gen cas y de repetición CRISPR dentro de la misma agrupación es indicativa de que la combinación es una combinación funcional.

Se describen agrupaciones con mayor detalle a continuación.

ESPACIADOR DE CRISPR

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "espaciador de CRISPR" presenta el significado convencional utilizado en la técnica y se refiere a secuencias espaciadoras no repetitivas que se encuentran entre múltiples repeticiones directas cortas (es decir, repeticiones CRISPR) de loci CRISPR. En otras palabras, se encuentra un espaciador de CRISPR entre dos repeticiones CRISPR.

Se ha encontrado que las secuencias espaciadoras de CRISPR en los procariotas con frecuencia presentan similitudes significativas con una diversidad de moléculas de ADN, tales como elementos genéticos (incluyendo, aunque sin limitación, cromosomas, bacteriófagos y plásmidos conjugativos). Resulta interesante que las células que portan dichos espaciadores de CRISPR son incapaces de ser infectados por moléculas de ADN que contienen secuencias homólogas a los espaciadores (Mojica et al., 2005).

Típicamente, el espaciador de CRISPR se encuentra naturalmente presente entre dos repeticiones directas cortas múltiples idénticas que son palindrómicas.

Apropiadamente, el espaciador de CRISPR es homólogo del ácido nucleico diana o del producto de transcripción del mismo de una secuencia identificada. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud, en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Se considera que una secuencia homóloga incluye un espaciador de CRISPR, que puede ser por lo menos 70, 75, 80, 85 ó 90% idéntica, o por lo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada.

En algunas formas de realización, el espaciador de CRISPR es 100% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana.

El número de espaciadores de CRISPR en un locus o en loci CRISPR dados puede variar entre especies.

Apropiadamente, el número de espaciadores puede encontrarse comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 140, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 25 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 35 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 100, entre aproximadamente 45 y aproximadamente 100 ó entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100.

Apropiadamente, el número de espaciadores puede encontrarse comprendido en el intervalo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 135, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 130, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 125, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 120, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 115, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 110, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 105, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 95, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 70, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 60, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 9, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 7, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 o de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2.

Típicamente los espaciadores de CRISPR se identifican mediante análisis de secuencias como los tramos de ADN situados entre dos repeticiones.

Tal como se describe en la presente memoria, en el contexto de la presente invención inesperadamente se ha descubierto que la utilización de uno o más genes o proteínas cas en combinación con una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR (preferentemente la combinación o combinaciones de las mismas) permite proporcionar la especificidad de inmunidad por parte de uno o más espaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "especificidad de inmunidad" se refiere a que la inmunidad puede proporcionarse contra una secuencia de ácido nucleico específica o producto de transcripción de la misma utilizando una secuencia específica de espaciador de CRISPR específico (o de seudoespaciador de CRISPR). De acuerdo con lo anterior, un espaciador dado de CRISPR no proporciona resistencia frente a ninguna secuencia de ácido nucleico o producto de transcripción de la misma, sino únicamente frente a las secuencias que son homólogas del espaciador de CRISPR (o del seudoespaciador de CRISPR), tal como 100% idénticas.

El espaciador o espaciadores CRISPR pueden derivarse o ser derivables (preferentemente derivarse) de un organismo, tal como un organismo donante, que es diferente a la célula, tal como la célula receptora o incluso un organismo donante adicional, a partir del que por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan). Los espaciadores de CRISPR pueden derivarse o ser derivables (preferentemente se derivan) de un organismo, tal como un organismo donante, que es heterólogo respecto a la célula, tal como la célula receptora o incluso un organismo donante adicional, a partir del que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR. Por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR puede derivarse o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una célula homóloga (es decir la misma), tal como una célula receptora homóloga.

Para evitar dudas, el espaciador o espaciadores de CRISPR pueden diseñarse y producirse sintéticamente (por ejemplo utilizando técnicas de ADN recombinante).

En una forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos (es decir diferentes) respecto a la célula, tal como la célula receptora, a partir de la que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR, y por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) de una célula homóloga, tal como una célula receptora homóloga.

En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos (es decir, diferentes) respecto a la célula, tal como la célula receptora, a partir de la que se derivan o son derivables (preferentemente se derivan).

En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula, tal como la célula receptora, y por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR se derivan o son derivables (preferentemente se derivan) de una célula homóloga, tal como una célula receptora homóloga.

En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula, tal como la célula receptora, mientras que por lo menos un gen o proteína cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR son homólogas respecto a la célula, tal como la célula receptora.

En otra forma de realización, los espaciadores de CRISPR son heterólogos respecto a la célula receptora, mientras que la célula receptora es homóloga respecto a uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR.

En otra forma de realización, el espaciador de CRISPR según la presente invención es uno que no se encuentra naturalmente asociado a la repetición CRISPR y/o genes cas y/o combinación funcional de repetición CRISPR-gen cas. En otras palabras, el espaciador de CRISPR en el locus CRISPR recombinante según la presente invención es heterólogo respecto a la repetición CRISPR y/o genes cas del locus CRISPR.

Puede utilizarse uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR (preferentemente una o más combinaciones funcionales de los mismos) pueden utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Apropiadamente puede utilizarse uno o más espaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, se utiliza uno o más espaciadores CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

A título de ejemplo, los espaciadores CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como un ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica.

A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula.

A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando

métodos tales como los descritos en la presente memoria.

En un aspecto adicional, también se proporciona un método para identificar un espaciador CRISPR para la utilización en la modulación de la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) preparar una célula que comprende por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen o proteína cas, (ii) identificar por lo menos un espaciador de CRISPR en un organismo, tal como un organismo donante, (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que presente homología respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante que comprende el ácido nucleico diana, e (iv) determinar si la célula modula la resistencia frente al ácido nucleico diana, en la que la modulación de la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana

o producto de transcripción del mismo es indicativa de que el espaciador de CRISPR modula la resistencia de la célula frente al ácido nucleico diana.

Los espaciadores de CRISPR pueden comprender o consistir de la secuencia de nucleótidos proporcionar en una o más cualesquiera de entre las secuencias SEC ID nº 23 a 460 y/o SEC ID nº 522 a 665.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

Sin pretender restringirse a ninguna teoría en particular, cuanto más alejado se encuentre un espaciador de CRISPR dado del extremo 5' del locus CRISPR (que comprende el gen o genes cas y/o la secuencia líder), menor será la resistencia proporcionada por el espaciador de CRISPR. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en una forma de realización de la presente invención resulta preferente que se modifique uno o más de los primeros 100 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 50 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 40 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 30 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 20 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder), más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 15 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder) y más preferentemente se modifica uno o más de los primeros 10 espaciadores de CRISPR desde el extremo 5' del locus CRISPR (que comprende los genes cas y/o la secuencia líder).

Tal como apreciará el experto en la materia, diferentes bacterias presentan un número diferente de espaciadores de CRISPR.

NÚCLEO DE ESPACIADOR DE CRISPR

Para un tipo específico de CRISPR en una especie microbiana, el espaciador de CRISPR típicamente se encuentra representado por una longitud predominante definida, aunque el tamaño puede variar. Los tipos de CRISPR descritos hasta hoy se ha encontrado que contienen una longitud predominante de espaciado de entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 58 pb.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "núcleo de espaciador de CRISPR" se refiere a la longitud del espaciador observado más corto dentro de un tipo de CRISPR. De esta manera, a título de ejemplo, dentro del tipo 1 de CRISPR de Streptococcus thermophilus, la longitud predominante de espaciador es de 30 pb, con una minoría de espaciadores de tamaños comprendidos entre 28 pb y 32 pb. Por lo tanto, en el presente ejemplo particular (CRISPR de tipo 1 de S. thermophilus), el núcleo del espaciador de CRISPR se define como un tramo continuo de 28 pb.

Apropiadamente, el núcleo del espaciador de CRISPR es homólogo respecto al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, o una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo. Aunque también puede considerarse la homología en términos de similitud, en el contexto de la presente invención resulta preferente expresar la homología en términos de identidad de secuencia. Se considera que una secuencia homóloga incluye un núcleo de espaciador de CRISPR, que puede ser por lo menos 90% idéntico o por lo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo.

Apropiadamente, el núcleo de espaciador de CRISPR es 100% idéntico a la secuencia de ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo o a una secuencia identificada a lo largo de la longitud de la secuencia de núcleo.

SEUDOESPACIADOR DE CRISPR

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "seudoespaciador de CRISPR" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos presente en un organismo (por ejemplo un organismo donante), tal como un bacteriófago, que resulta preferentemente esencial para el funcionamiento y/o la supervivencia y/o replicación y/o infectividad y similar, y que forma una secuencia espaciadora de CRISPR y/o que puede utilizarse para formar o preparar una secuencia espaciadora de CRISPR que es complementaria u homóloga respecto al seudoespaciador de CRISPR, y/o que puede utilizarse para modular la resistencia.

Puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora. En particular, puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR, para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas y/o una o más repeticiones CRISPR (por ejemplo una o más combinaciones funcionales de los mismos) pueda utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

Puede utilizarse uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para manipular una célula, tal como una célula receptora, que en combinación con uno o más genes o proteínas cas puede utilizarse para modular la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

A título de ejemplo, los seudoespaciadores de CRISPR o el espaciador o espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR pueden insertarse en el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como un ADN de plásmido o ADN genómico de una célula, utilizando diversos métodos que son bien conocidos en la técnica.

A título de ejemplo adicional, los seudoespaciadores de CRISPR pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector, o similar, seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que sean complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR, que después se transforman en una célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

SECUENCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

En un aspecto adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo una secuencia de ácido nucleico recombinante o aislada) que está esencialmente constituida por lo menos por un gen o proteína cas.

La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante, por ejemplo ADNc. La secuencia de nucleótidos puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas. Las secuencias de ácidos nucleicos recombinantes pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante, tal como se describe en la presente memoria. La secuencia de ácidos nucleicos diana puede ser un gen o derivarse de un gen.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "que está esencialmente constituida por" en el contexto de la secuencia de ácido nucleico se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende uno o más genes cas y que excluye por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR, tal como las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y/o la secuencia líder común.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en una forma de realización se proporciona una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente constituida por lo menos por un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR.

En una forma de realización adicional, se proporciona una secuencia de ácido nucleico que está esencialmente constituida por lo menos por un gen cas y por lo menos un espaciador de CRISPR.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que consiste esencialmente de por lo menos un gen cas, por lo menos un espaciador de CRISPR y por lo menos dos repeticiones CRISPR.

En una forma realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR se encuentre ausente, apropiadamente, con la condición de que por lo menos un componente adicional de un locus CRISPR natural se encuentre ausente (por ejemplo sustancialmente ausente).

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR del locus CRISPR se encuentre ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR de un locus CRISPR natural se encuentren ausentes (por ejemplo sustancialmente ausentes).

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR del locus CRISPR se encuentre ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR de un locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las repeticiones CRISPR del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las repeticiones CRISPR del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR y las

secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

En una forma de realización adicional se proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas, con la condición de que las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR se encuentren ausentes, apropiadamente con la condición de que las repeticiones CRISPR, los espaciadores de CRISPR y las secuencias líder comunes del locus CRISPR natural se encuentren ausentes.

La secuencia de ácido nucleico y los ácidos nucleicos pueden aislarse o purificarse sustancialmente. El término "aislado" o la expresión "sustancialmente purificado" pretenden referirse a que las moléculas de ácido nucleico, o fragmentos o variantes biológicamente activos, homólogos o derivados de los mismos, se encuentran sustancialmente o esencialmente libres de componentes normalmente presentes en asociación con el ácido nucleico en su estado natural. Entre dichos componentes se incluyen otros materiales celulares, medios de cultivo de producción recombinante y diversos compuestos químicos utilizados en la síntesis química de los ácidos nucleicos.

Una secuencia de ácido nucleico o un ácido nucleico "aislado" típicamente se encuentra libre de secuencias de ácido nucleico que flanquean el ácido nucleico de interés en el ADN genómico del organismo a partir del que se deriva el ácido nucleico (tal como secuencias codificantes presentes en los extremos 5' ó 3'). Sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases o grupos adicionales que no afectan negativamente a las características básicas de la composición.

La secuencia o secuencias de ácidos nucleicos pueden utilizarse para manipular una célula, tal como una célula receptora. A título de ejemplo, la secuencia de ácido nucleico puede insertarse en el ADN, tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de una célula receptora, utilizando métodos tales como la recombinación homóloga. A título de ejemplo adicional, la secuencia o secuencias de ácido nucleico pueden utilizarse como molde en el que modificar (por ejemplo mutar) el ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se crea una o más secuencias de ácido nucleico en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO DIANA

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia diana de ácido nucleico" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o producto de transcripción de la misma frente a la que debe modularse la resistencia en una célula, tal como una célula receptora.

La resistencia puede ser frente a la secuencia de ácido nucleico diana per se.

Ventajosamente, lo expuesto anteriormente proporciona resistencia a una célula frente a un organismo donante a partir del que son derivables (preferentemente que se derivan) uno o más ácidos nucleicos. De esta manera, a título de ejemplo, la inserción de un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de un bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, puede proporcionar resistencia al bacteriófago. De esta manera, a título de ejemplo adicional, la inserción entre dos repeticiones CRISPR de un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de un bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, puede proporcionar resistencia frente al bacteriófago.

La resistencia puede ser contra un producto de transcripción de la secuencia diana de ácido nucleico, tal como un transcrito de la secuencia diana de ácido nucleico (por ejemplo un transcrito de ARN (por ejemplo ARNm) (por ejemplo un transcrito de ARN de sentido o antisentido) o incluso un producto de transcripción polipéptido. Ventajosamente, lo expuesto anteriormente proporciona resistencia a una célula frente a un organismo donante a partir del que es derivable (preferentemente que se deriva) el producto de transcripción.

La secuencia diana de nucleótidos puede ser ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

La secuencia de nucleótidos puede ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

La secuencia de nucleótidos puede prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante).

La secuencia de nucleótidos puede ser igual a la forma natural, o puede ser derivable (preferentemente derivada) a partir de la misma.

La secuencia diana de ácido nucleico se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de un gen.

La secuencia diana de ácido nucleico se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una variante, homólogo, fragmento o derivado de un gen.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un bacteriófago.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de ADN de plásmido.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un elemento genético móvil.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un elemento trasponible o de una secuencia de inserción.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un gen que proporciona resistencia.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un gen que proporciona resistencia a un antibiótico.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de un factor de virulencia.

En una forma de realización, la secuencia diana de ácido nucleico se deriva o es derivable (preferentemente se deriva) de una toxina, una internalina o una hemolisina.

MODULACIÓN DE LA RESISTENCIA

En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular la resistencia de una célula, tal como una célula receptora, frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "modula la resistencia" puede referirse a suprimir, reducir, disminuir, inducir, proporcionar, restaurar, elevar, incrementar o, de otro modo, presentar un efecto sobre la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "resistencia" no pretende implicar que una célula es 100% resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, sino que incluye células que son tolerantes del ácido nucleico diana o de un producto de transcripción del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "resistencia a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo" se refiere a que se proporciona resistencia frente a una célula o a un organismo, tal como un fago, que comprende o que produce el ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo.

Sin pretender vincularse a ninguna teoría en particular, se cree que la resistencia o inmunidad no se encuentra ligada a la "entrada" de ADN foráneo en una célula (es decir, la penetración a través de la membrana celular). La inmunidad o resistencia, por el contrario, correspondería a una obstrucción, obstáculo, impedimento, barrera o evitación de la persistencia, mantenimiento o supervivencia del ácido nucleico entrante (por ejemplo en una forma lineal libre o integrado dentro del cromosoma bacteriano, fuera de un locus CRISPR o dentro de una molécula circular, tal como un plásmido), o a un obstrucción, obstáculo, impedimento, barrera o evitación de su replicación y/o transcripción y/o expresión.

En una forma de realización, los componentes mínimos que proporcionan inmunidad o resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de expresión del mismo es por lo menos un gen cas (o una proteína Cas) y por lo menos dos repeticiones CRISPR flanqueantes de un espaciador.

En una forma de realización, resulta preferido que la expresión "modular la resistencia" se refiere a inducir, proporcionar, elevar o incrementar la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.

En un aspecto se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar una secuencia (por ejemplo una secuencia conservada) en un organismo (preferentemente una secuencia esencial para el funcionamiento o la supervivencia del organismo),

(ii) preparar un espaciador de CRISPR que es una secuencia homóloga (apropiadamente idéntica al 100%) de la secuencia identificada, (iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador de CRISPR, e (iv) transformar una célula con dicho ácido nucleico, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia conservada" en el contexto de la identificación de una secuencia conservada en un organismo no necesariamente debe encontrarse conservada en su sentido más estricto, debido a que el conocimiento de una secuencia de un organismo dado resultará suficiente. Además, la secuencia no es necesariamente parte de una entidad esencial, debido a que se cree que un espaciador inspirado en un gen esencial resultaría más eficiente en la provisión de inmunidad o resistencia.

En una forma de realización, la secuencia conservada es una secuencia que resulta esencial para el funcionamiento y/o supervivencia y/o replicación y/o infectividad y similar de un organismo o de una célula. A título de ejemplo, la secuencia conservada puede ser una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o una secuencia conservada entre genes fágicos importantes.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular (por ejemplo para proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, (ii) preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dicho espaciador o espaciadores identificados, e

(iii) transformar una célula con dicho ácido nucleico recombinante, convirtiendo la célula receptora de esta manera en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para modular (por ejemplo proporcionar o incrementar) la resistencia de una célula que comprende por lo menos uno

o más genes o proteínas cas y uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, e

(ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presenta homología respecto al espaciador

o espaciadores de CRISPR en el organismo.

En una forma de realización, se modifica (por ejemplo se manipula genéticamente) uno o más espaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presentan homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo, tal como un organismo donante, que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo con el fin de convertir la célula en resistente al ácido nucleico diana.

Apropiadamente, por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR en la célula son una combinación funcional tal como se describe en la presente memoria.

La manipulación genética puede incluir, aunque sin limitación, añadir (por ejemplo insertar), delecionar (por ejemplo eliminar) o modificar (por ejemplo mutar) la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR o en una célula de manera que el espaciador de CRISPR presente homología (por ejemplo homología incrementada tras la manipulación genética) respecto a uno o más espaciadores de CRISPR de un organismo donante. Esta etapa de manipulación resultará en que una célula que era sustancialmente sensible a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo sea sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

La ingeniería genética puede comprender incluso, de manera no limitativa, añadir (por ejemplo insertar) o eliminar (por ejemplo extraer) la secuencia de dichos uno o más seudoespaciadores de CRISPR en una célula. Esta etapa de ingeniería producirá una célula que es sustancialmente sensible a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o al producto de transcripción del mismo.

En otra forma de realización, la expresión "modular la resistencia" se refiere a suprimir, reducir o disminuir la resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana.

De esta manera, en un aspecto adicional, se proporciona un método para disminuir

o reducir la resistencia de una célula, tal como una célula receptora, que comprende por lo menos un gen o proteína cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

Según la presente forma de realización, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR en un organismo que es sustancialmente resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, e (ii) modificar la secuencia de uno o más espaciadores de CRISPR en la célula, de manera que el espaciador o espaciadores de CRISPR presentan un grado reducido de homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR en el organismo.

En otra forma de realización se proporciona un método para modular (por ejemplo para reducir) la resistencia de una célula que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR en un organismo que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo contra el que debe modularse la resistencia, e (ii) identificar el espaciador de CRISPR en el organismo en el que debe modularse la resistencia, e (iii) adaptar la secuencia del espaciador de CRISPR en el organismo en el que debe modularse la resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR presente un grado más bajo de homología respecto al espaciador de CRISPR o el seudoespaciador de CRISPR del organismo que comprende el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia.

Se manipulan uno o más espaciadores de CRISPR en una célula sustancialmente resistente con el fin de convertir a la célula en sensible en un ácido nucleico diana. La manipulación genética puede incluir, aunque sin limitación, la adición (por ejemplo la inserción), la deleción (por ejemplo la eliminación) o la modificación de una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas o partes o fragmentos de las mismas en la célula sustancialmente resistente y/o la adición (por ejemplo la inserción), la deleción (por ejemplo la eliminación) o la modificación de uno o más espaciadores de CRISPR o partes o fragmentos de los mismos en la célula sustancialmente resistente.

Dicha etapa de manipulación producirá a continuación una célula que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, sensibilizándose sustancialmente frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

Típicamente, con el fin de proporcionar sensibilidad a una célula, se espera que uno o más espaciadores de CRISPR, uno o más genes o proteínas cas, una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR o una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas de una célula sustancialmente resistente se eliminen, se delecionen o se modifiquen de manera que ya no se proporcione resistencia.

Ventajosamente, las células que son sensibles a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo pueden prepararse de manera que sus niveles en un cultivo dado, tal como un cultivo inicial, puedan modularse (por ejemplo reducirse) según se desee. De esta manera, a título de ejemplo, puede desarrollarse un cultivo inicial que comprende dos o más cepas bacterianas de manera que todos los miembros del cultivo sean sensibles al mismo agente (por ejemplo un bacteriófago). De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en el momento en que ya no se desee que el cultivo se encuentre vivo, éste puede ponerse en contacto con el mismo agente individual con el fin de matar todos los miembros del cultivo.

Además, incluso puede ser posible modular la sensibilidad de una célula a uno o más agentes (por ejemplo bacteriófago) de manera que el agente mate únicamente una proporción de las células en un cultivo dado, tal como 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ó 95% de las células en un cultivo dado.

En un aspecto, puede manipularse una célula, tal como una célula receptora, de manera que comprenda un espaciador de CRISPR o una secuencia correspondiente a un seudoespaciador de CRISPR, convirtiendo la célula en resistente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo. Apropiadamente, las células se manipulan de manera que el espaciador de CRISPR o la secuencia correspondiente al seudoespaciador de CRISPR se utilice conjuntamente con una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, tal como se describe en la presente memoria.

En un aspecto, se manipula una célula que es resistente a un ácido nucleico diana

o producto de transcripción del mismo de manera que se inserte el espaciador de CRISPR que proporciona inmunidad frente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo, en una célula que comprende una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En un aspecto, se prepara un espaciador de CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, y una combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR de la misma célula o de células diferentes, tal como la misma célula receptora o células receptoras diferentes. A continuación, se manipula una célula adicional, tal como una célula receptora, de manear que comprenda la secuencia de espaciador de CRISPR y la combinación funcional de gen cas-repetición CRISPR, convirtiendo de esta manera a la célula en resistente al ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

BACTERIÓFAGO

En un aspecto particularmente preferente de la presente invención, se modula la resistencia de una célula frente a un bacteriófago.

El bacteriófago es virulento para la célula.

El bacteriófago puede ser un bacteriófago virulento o atemperado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "bacteriófago" presenta su significado convencional entendido en la técnica, es decir, un virus que infecta selectivamente los procariotas, tales como las bacterias. Muchos bacteriófagos son específicos de un género, especie o cepa de célula.

El bacteriófago puede ser un bacteriófago lítico o un bacteriófago lisogénico.

Un bacteriófago lítico es uno que sigue la ruta lítica hasta completar el ciclo lítico, y que no entra en la ruta lisogénica. Un bacteriófago lítico experimenta replicación vírica que conduce a la lisis de la membrana celular, a la destrucción de la célula y a la liberación de progenie de partículas de bacteriófago que pueden infectar otras células.

Un bacteriófago lisogénico es el que puede entrar en la ruta lisogénica, en la que el bacteriófago se convierte en una parte pasiva durmiente del genoma de la célula mediante el completado de su ciclo lítico.

El término "bacteriófago" es sinónimo del término "fago".

Aunque puede utilizarse la resistente frente a cualquier bacteriófago (incluyendo bacteriófagos de tipo salvaje, naturales, aislados o recombinantes), resultan preferidos los bacteriófagos activos contra bacterias. Más apropiadamente, los bacteriófagos activos contra bacterias que son patogénicas para plantas y/o animales (incluyendo seres humanos) resultan de interés particular.

A título de ejemplo, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar una bacteria que comprende naturalmente uno o más loci CRISPR. Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), incluyendo, aunque sin limitación, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthamonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.

A título de ejemplo, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar bacterias pertenecientes a los géneros siguientes: Escherichia, Shigella, Salmonella, Erwinia, Yersinia, Bacillus, Vibrio, Legionella, Seudomonas, Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Listeria, Agrobacterium, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium, Treponema, Borrelia, Francisella, Brucella y Xanthomonas.

A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar (o transducir) especies de bacterias del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacterium, una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo Lactobacillus acidophilus, una especie de Enterococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y una especie de Oenococcus.

A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii o Bifidobacterium longum.

A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar cualquier bacteria fermentativa susceptible de alteración por infección de bacteriófagos, incluyendo, aunque sin limitación, procedimientos para la producción de antibióticos, aminoácidos y solventes. Entre los productos producidos mediante fermentación que se ha conocido que han experimentado infección por bacteriófagos, y las bacterias de fermentación infectadas correspondientes, se incluyen los quesos Cheddar y cottage (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactotoccus lactis subsp. cremoris), el yogur (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus), el queso suizo (S. thermophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus), el queso azul (Leuconostoc cremoris), el queso italiano (L. bulgaricus, S. thermophilus), viili (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc cremoris), yakult (Lactobacillus casei), caseína (Lactococcus lactis subsp. cremoris), natto (Bacillus subtilis var. natto), vino (Leuconostoc oenos), sake (Leuconostoc mesenteroides), polimixina (Bacillus polymixa), colistina (Bacillus colistrium), bacitracina (Bacillus licheniformis), ácido L-glutámico (Brevibacterium lactofermentum, Microbacterium ammoniaphilum), y acetona y butanol (Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum).

Son bacterias preferidas, S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus y/o L. acidophilus.

A título de ejemplo adicional, entre los bacteriófagos están comprendidos de manera no limitativa, los bacteriófagos que pueden infectar una bacteria que comprenden uno o más loci CRISPR heterólogos. La bacteria puede comprender uno o más loci CRISPR heterólogos, uno o más genes cas heterólogos, una o más repeticiones CRISPR heterólogas y/o uno o más espaciadores de CRISPR heterólogos.

Entre los bacteriófagos pueden estar comprendidos de manera no limitativa, bacteriófagos que pertenecen a cualquiera de las siguientes familias de virus: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae o Tectiviridae.

Para provocar la infección por bacteriófago de las células, el bacteriófago "infecta" una célula al inyectar o transferir su ácido nucleico en la célula, existiendo el ácido nucleico fágico de manera independiente del genoma e la célula. La infección puede conducir a la expresión (transcripción y traducción) del ácido nucleico del bacteriófago dentro de la célula y la continuación del ciclo vital del bacteriófago. En el caso de un bacteriófago recombinante, las secuencias recombinantes dentro del genoma fágico, tales como los ácidos nucleicos informadores, pueden expresarse también.

Se ha encontrado que las secuencias de espaciador de CRISPR en procariotas con frecuencia presentan similitudes significativas con una diversidad de moléculas de ADN, tales como elementos genéticos (incluyuendo, aunque sin limitación, cromosomas, bacteriófagos y plásmidos conjugativos). Resulta interesante que las células que portan estos espaciadores de CRISPR son incapces de resultar infectados por moléculas de ADN que contienen secuencias homólogas a los espaciadores (Mojica et al. 2005).

En el contexto de la presente invención, uno o más seudoespaciadores particulares derivables o derivados de ADN de bacteriófago o de uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR, pueden añadirse a un locus CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, con el fin de modular (por ejemplo proporcionar) resistencia frente a un bacteriófago particular, impidiendo sustancialmente de esta manera el ataque fágico.

Típicamente las dianas pueden ser regiones particulares del genoma fágico para preparar los seudoespaciadores, tal como genes codificantes de proteínas de especificidad de huésped, que proporcionan capacidad de reconocimiento de un fago particular-huésped, tales como helicasas, primasa, proteínas estructurales de cabeza o cola, proteínas con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras) o secuencias conservadas entre genes fágicos importantes.

Cualquier ácido nucleico que opere desde el genoma fágico puede proporcionar inmunidad frente al fago al insertarlo, por ejemplo, entre dos repeticiones en un locus CRISPR activo. La inmunidad puede ser más "eficiente" en el caso de que el espaciador de CRISPR corresponda a una secuencia interna de un gen fágico, e incluso más "eficiente" en el caso de que este gen codifique proteínas "esenciales" (por ejemplo el antirreceptor).

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, en un aspecto adicional, se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago,

(b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) manipular uno o más loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprende uno o más seudoespaciadores de CRISPR de un bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR para convertir a la célula en resistente.

En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) insertar uno o más seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que se convierte a la célula en sustancialmente resistente al bacteriófago.

En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) manipular por lo menos un locus CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprenda uno o más seudoespaciadores de CRISPR de un bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR.

En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar uno o más seudoespaciadores de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en por lo menos una célula que es sustancialmente sensible al bacteriófago, y (c) insertar uno o más seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos de uno o más seudoespaciadores de CRISPR en la célula sustancialmente sensible.

En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente al bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modifica la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar resistencia a una célula (apropiadamente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente una homología o identidad de 100% respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago, que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

En un aspecto adicional se proporciona un método para modular el lisotipo de una célula bacteriana, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta una homología o identidad de 100% respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

Apropiadamente el espaciador de CRISPR de la célula bacteriana presenta una homología o identidad de 100% respecto a una secuencia, tal como un seudoespaciador de CRISPR, en el bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

Apropiadamente el espaciador de CRISPR de la célula bacteriana forma una parte componente de un locus CRISPR que comprende una combinación funcional de repetición CRISPR-cas tal como se describe en la presente memoria.

Apropiadamente el ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo en el bacteriófago es una secuencia de ácido nucleico altamente conservada.

Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago es un gen codificante de una proteína de especificidad de huésped.

Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago codifica un enzima que resulta esencial para la supervivencia, replicación o crecimiento del bacteriófago.

Apropiadamente, el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo en el bacteriófago codifica una helicasa, una primasa, una proteína estructural de cabeza o cola, o una proteína con un dominio conservado (por ejemplo holina, lisina y otras).

Ventajosamente, pueden prepararse células bacterianas según la presente invención que presentan una "susceptibilidad reducida a la multiplicación o infección de bacteriófagos". Tal como se utiliza en la presente memoria, dicha expresión se refiere a que la bacteria presenta una susceptibilidad reducida o nula a la multiplicación o infección por bacteriófagos en comparación con la bacteria de tipo salvaje al cultivarla en, por ejemplo, un medio lácteo.

En una forma de realización, la expresión "baja susceptibilidad a la multiplicación de bacteriófagos" se refiere a que el nivel de multiplicación de bacteriófagos en una bacteria se encuentra por debajo de un nivel que podría provocar un efecto perjudicial a un cultivo en un periodo de tiempo dado. Entre dichos efectos perjudiciales en un cultivo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la falta de coagulación de la leche durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como el yogur o el queso), una reducción inadecuada o lenta del pH durante la producción de los productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), la maduración lenta del queso y el deterioro de la textura de un alimento hasta el punto en que no resulta apetecible o resulta inadecuado para el consumo humano.

Para un conjunto equivalente de condiciones de cultivo, la susceptibilidad a un bacteriófago de una bacteria de la presente invención es, en comparación con la bacteria de tipo salvaje, 100 veces inferior (eficiencia de plaqueo [EOP]=10-2), preferentemente

1.000 veces inferior (EOP=10-3), preferentemente 10.000 veces inferior (EOP=10-4), más preferentemente 100.000 veces inferior (EOP=10-5). Preferentemente, el nivel de multiplicación de los bacteriófagos en un cultivo se mide tras aproximadamente 14 horas de incubación del cultivo, más preferentemente tras aproximadamente 12 horas, más preferentemente tras aproximadamente 7 horas, más preferentemente tras aproximadamente 6 horas, más preferentemente tras aproximadamente 5 horas y más preferentemente tras aproximadamente 4 horas.

En un aspecto adicional se proporciona un método para proporcionar sensibilidad a una célula (preferentemente una célula bacteriana) frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar un seudoespaciador de CRISPR de por lo menos un bacteriófago, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente resistente al bacteriófago, y

(c) manipular por lo menos un locus CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprende uno o más seudoespaciadores de CRISPR o uno o más espaciadores de CRISPR que son complementarios u homólogos a uno o más seudoespaciadores de CRISPR que presentan un grado reducido de homología en comparación con el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente resistente.

En un aspecto adicional se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir) el lisotipo de una célula (preferentemente una célula bacteriana), que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar un seudoespaciador de CRISPR en un bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR de la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente un grado reducido de homología respecto al seudoespaciador de CRISPR del bacteriófago que comprende el ácido nucleico diana.

En todavía un aspecto adicional se proporciona un método para modular (por ejemplo reducir o disminuir) la resistencia de una célula bacteriana, que comprende uno o más genes o proteínas cas y una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR frente a un bacteriófago, que comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más seudoespaciadores de CRISPR en un bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia, (ii) identificar un espaciador de CRISPR en la célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, que es homólogo al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR, e (iii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula bacteriana en la que debe modularse la resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR presenta un grado de homología más bajo respecto al espaciador o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago frente al que debe modularse la resistencia.

Apropiadamente, el espaciador de CRISPR de la célula presenta un grado reducido de homología, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 ó 95% de la homología en comparación con el espaciador o seudoespaciadores de CRISPR del bacteriófago contra el que debe modularse la resistencia.

Por lo tanto, pueden prepararse células bacterianas según la presente invención que presentan una "susceptibilidad incrementada a la multiplicación de bacteriófagos". Tal como se utiliza en la presente memoria, dicha expresión se refiere a que la bacteria presenta una susceptibilidad incrementada o alta frente a la multiplicación de bacteriófagos en comparación con la bacteria de tipo salvaje al cultivarla en, por ejemplo, medio lácteo.

En una forma de realización, la expresión "susceptibilidad elevada a la multiplicación de bacteriófagos" se refiere a que el nivel de multiplicación de bacteriófagos en una bacteria es superior a un nivel que podría provocar un efecto perjudicial en un cultivo en un periodo de tiempo dado. Entre dichos efectos perjudiciales en un cultivo se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la falta de coagulación de la leche durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), una reducción inadecuada o lenta del pH durante la producción de productos lácteos fermentados (tales como yogur o queso), la maduración lenta del queso y el deterioro de la textura de un alimento hasta el punto de que resulta inapetecible o inadecuada para el consumo humano. Para un conjunto equivalente de condiciones de cultivo, la susceptibilidad a un bacteriófago de una bacteria de la presente invención es, en comparación con la bacteria de tipo salvaje, 100 veces más alta, 1.000 veces más alta, 10.000 veces más alta ó

100.000 veces más alta (EOP=10-5). El nivel de multiplicación de bacteriófagos en un cultivo se mide tras aproximadamente 14 horas de incubación del cultivo, más preferentemente tras aproximadamente 12 horas, más preferentemente tras aproximadamente 7 horas, más preferentemente tras aproximadamente 6 horas, más preferentemente tras aproximadamente 5 horas y en una realización altamente preferente, tras aproximadamente 4 horas.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

BACTERIAS

En una forma de realización adicional, la secuencia de ácidos nucleicos diana o un producto de transcripción de la misma se puede derivar o puede ser derivable (preferentemente se deriva) de una o más bacterias. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, puede modularse la resistencia de una célula, por ejemplo una célula bacteriana, frente a bacterias o a un componente de las mismas.

La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a la resistencia a la transferencia de plásmido a bacterias. Según la presente forma de realización de la presente invención, se modifica uno o más espaciadores de CRISPR en la célula de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presente homología respecto al espaciador de CRISPR y/o el seudoespaciador de CRISPR contenido en el ADN de plásmido de la célula bacteriana, de manera que proporcione resistencia frente a uno o más plásmidos particulares, impidiendo de esta manera la transferencia de ADN foráneo a la célula. Específicamente pueden ser dianas regiones particulares dentro del ADN de plásmido de manera que se proporcione inmunidad frente al ADN de plásmido, tal como secuencias dentro del origen de replicación del plásmido o secuencias dentro de genes codificantes de las proteínas de replicación.

De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) del ADN de plásmido de una célula bacteriana frente a la que debe modularse la resistencia, e (ii) modificar la secuencia de un espaciador de CRISPR en la célula en la que debe modularse resistencia, de manera que el espaciador de CRISPR y/o seudoespaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto al espaciador de CRISPR contenido en el elemento o elementos genéticos móviles de la célula.

En todavía un aspecto adicional se proporciona un método adicional para proporcionar resistencia a una célula frente a uno o más elementos genéticos móviles, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivable (preferentemente derivado) de uno o más elementos genéticos móviles, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente sensible al elemento o elementos genéticos móviles, y (c) manipular el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible, de manera que comprenda o presente homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR procedentes del elemento o elementos genéticos móviles, para proporcionar resistencia a la célula.

La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a la resistencia a antibióticos. El término "antibiótico" se entiende que se refiere a una composición o grupo químico que reduce la viabilidad o que inhibe el crecimiento o la reproducción de microbios. Entre los genes de resistencia a antibióticos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, blatem, blarob, blashv, aadB, aacC1, aacC2, aacC3, aacA4, mecA, vanA, vanH, vanX, satA, aacA-aphH, vat, vga, msrA sul y/o int. Entre los genes de resistencia a antibióticos se incluyen los se derivan o que son derivables (preferentemente que se derivan) de especies bacterianas, incluyendo, aunque sin limitación, los géneros Escherichia, Klebsiella, Seudomonas, Proteus, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Haemophilus y Moraxella. Los genes de resistencia a antibióticos también incluyen los que se derivan o que son derivables (preferentemente que se derivan) de especies bacterianas, incluyendo, aunque sin limitación, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Seudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.

Pueden añadirse espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR particulares derivables (preferentemente derivados) de genes codificantes de resistencia a antibióticos, dentro de un locus CRISPR de una célula, tal como una célula receptora, de manera que se evita la transferencia de genes que proporcionan resistencia a antibióticos a la célula, reduciendo de esta manera el riesgo de adquirir marcadores de resistencia a antibiótico. A título de ejemplo, entre las dianas también pueden incluirse vanR (un gen que proporciona resistencia a la vancomicina), o tetR, un gen que proporciona resistencia a la tetraciclina, o con diana en inhibidores de beta-lactamasa.

De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de una célula que comprende uno o más genes o marcadores de resistencia a antibióticos, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto a uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR contenidos en la célula que comprende uno o más genes

o marcadores de resistencia a antibióticos.

En todavía un aspecto adicional se proporciona un método para modular la adquisición de marcadores de resistencia a antibióticos en una célula, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de una célula que comprende uno o más genes o marcadores de resistencia a antibióticos, (b) identificar uno o más loci CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, y (c) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en la célula que no comprende o que no expresa los genes o marcadores de resistencia a antibióticos, de manera que el espaciador de CRISPR y/o los seudoespaciadores de CRISPR presenta homología respecto al espaciador de CRISPR contenido en la célula resistente a la transferencia de genes que proporcionan resistencia a uno o más antibióticos.

La secuencia de nucleótidos diana puede ser o derivarse de un gen que es o se asocia a genes codificantes de factores de virulencia. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR particulares derivables (preferentemente derivados) de genes codificantes de factores de virulencia, en un locus CRISPR de bacteria para proporcionar resistencia frente a la transferencia de genes que proporcionar virulencia en la bacteria. Por ejemplo, puede ser dianas factores que contribuyen comúnmente a la virulencia en los patógenos microbianos, tales como toxinas, internalinas y hemolisinas.

De esta manera, según el presente aspecto, el método comprende las etapas siguientes: (i) identificar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR derivables (preferentemente derivadas) de una célula que comprende uno o más factores de virulencia, e (ii) modificar la secuencia del espaciador de CRISPR en una célula que no comprende o que no expresa el factor o factores de virulencia o el marcador

o marcadores de manera que el espaciador de CRISPR de la célula presenta homología respecto al espaciador o espaciadores de CRISPR y/o los seudoespaciadores de CRISPR contenidos en la célula que comprende uno o más factores de virulencia.

En todavía un aspecto adicional, se proporciona un método adicional para proporcionar resistencia a una célula frente a uno o más factores de virulencia o marcadores, que comprende las etapas siguientes: (a) identificar un espaciador de CRISPR y/o un seudoespaciador de CRISPR derivables (preferentemente derivados) de uno o más factores de virulencia o marcadores, (b) identificar una o más combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas en una célula que es sustancialmente sensible a uno o más factores de virulencia o marcadores, y (c) manipular el locus o loci CRISPR en la célula sustancialmente sensible de manera que comprenda uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR procedentes de uno o más factores de virulencia o marcadores para convertir a la célula en resistente.

Un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

MODIFICACIÓN

Las secuencias de ácidos nucleicos pueden modificarse mediante la manipulación genética de secuencias de ácidos nucleicos.

Puede modificarse la totalidad o parte de la secuencia de ácidos nucleicos.

Puede modificarse la totalidad o parte de uno o más espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR o loci CRISPR.

Pueden modificarse espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR o loci CRISPR recombinantes.

Pueden modificarse espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones de CRISPR o loci CRISPR naturales.

Pueden modificarse genes o proteínas cas y repeticiones CRISPR naturales.

La manipulación genética puede llevarse a cabo utilizando diversos métodos que son conocidos en la técnica y típicamente incluyen métodos bien conocidos, tales como la amplificación por PCR, la clonación y la mutagénesis sitio-dirigida. Las mutaciones pueden introducirse utilizando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos flanqueantes de los sitios de mutación deseados. Se da a conocer un método adecuado en Morinaga et al. (Biotechnology 2:646-649, 1984). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos codificantes de enzima se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry 180:147-151, 1989). Se describe un método adicional en Sarkar y Sommer (Biotechniques 8:404-407, 1990, "The megaprimer method of site directed mutagenesis"). En la actualidad puede disponerse kits comercializados para llevar a cabo mutagénesis sitio-dirigida. Se describen en detalle métodos de manipulación genética en: J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.);

B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons, 1996; M.J. Gait (editor), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, 1984; y D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992.

La etapa de manipulación genética incluso puede incluir métodos tales como la recombinación homóloga que puede resultar particularmente útil en el caso de que, por ejemplo, se inserten o delecionen espaciadores de CRISPR.

La etapa de manipulación genética incluso puede incluir la activación de una o más secuencias de ácidos nucleicos, tales como un locus CRISPR, repeticiones CRISPR, espaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, combinaciones funcionales de genes o proteínas cas y repeticiones CRISPR o incluso combinaciones de los mismos.

Apropiadamente, pueden insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en por lo menos un locus CRISPR.

En una forma de realización, la modificación no interrumpe uno o más genes cas de por lo menos un locus CRISPR. En otra forma de realización, el gen o genes cas permanecen intactos.

En una forma de realización, la modificación no interrumpe una o más repeticiones CRISPR de por lo menos un locus CRISPR. En una forma de realización, la repetición o repeticiones CRISPR permanece intacta.

Apropiadamente, puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en por lo menos un locus CRISPR.

Apropiadamente, puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en el extremo 5' de por lo menos un locus CRISPR.

En una forma de realización, la modificación comprende insertar por lo menos un espaciador de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en una célula, tal como una célula receptora. En otra forma de realización, la modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR de una célula, tal como una célula receptora.

En una forma de realización, la modificación comprende insertar por lo menos un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en la célula. En otra forma de realización, la modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) uno

o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de una célula.

En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de la célula.

En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) una o más repeticiones CRISPR, preferentemente dos

o más repeticiones CRISPR de la célula. En la presente forma de realización de la invención resulta preferido que por lo menos una combinación funcional de repetición CRISPR-cas permanezca intacta en la célula.

En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, en (por ejemplo para modificar o sustituir) el mismo espaciador de CRISPR o espaciadores de CRISPR diferentes de la célula.

En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, contiguamente (por ejemplo para modificar o sustituir) uno o más espaciadores de CRISPR o espaciadores de CRISPR de la célula.

En el contexto de la presente invención, el término "contiguo" se refiere a "a continuación de" en su sentido más amplio e incluye "directamente contiguo". De esta manera, en una forma de realización puede insertarse uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo "de manera directamente contigua" a uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de la célula, es decir, el espaciador o espaciadores de CRISPR o espaciador o espaciadores de CRISPR se insertan de manera que no existan nucleótidos intermedios entre los espaciadores.

En otra forma de realización, el espaciador o espaciadores de CRISPR o el espaciador o seudoespaciadores de CRISPR se insertan de manera que existan por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 10.000, 100.000 ó incluso

1.000.000 ó más nucleótidos intermedios entre los espaciadores.

En otra forma de realización, el nucleótido intermedio puede denominarse secuencia líder. Estas expresiones se utilizan intercambiablemente en la presente memoria. La secuencia líder puede ser de una longitud diferente en diferentes bacterias. Apropiadamente, la secuencia líder presenta una longitud de por lo menos 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400 ó 500 ó más nucleótidos. Apropiadamente, la secuencia líder se encuentra entre el último gen cas (en el extremo 3') y la primera repetición CRISPR (en el extremo 5') del locus CRISPR.

En una forma de realización, la secuencia líder puede presentar una longitud comprendida entre aproximadamente 20 y 500 nucleótidos.

En una forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR de la célula.

En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a uno o más genes cas de la célula.

En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, contiguamente a los mismos o diferentes espaciadores de la célula receptora.

En otra forma de realización, se insertan uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, cada uno insertado contiguamente a los mismos genes cas o diferentes genes cas de la célula receptora.

En otra forma de realización, uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, se insertan cada uno contiguamente a los mismos genes cas o en diferentes genes cas de la célula receptora.

En otra forma de realización, dos o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR, tal como dos o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo donante, se insertan cada uno contiguamente a espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR y/o genes cas iguales o diferentes de la célula receptora.

En otra forma de realización, la secuencia del espaciador de CRISPR, tal como uno o más espaciadores de CRISPR de un organismo donante, de la célula receptora se modifica de manera que el espaciador de CRISPR presente homología respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante.

En otra forma de realización, se modifica la secuencia del espaciador de la célula de manera que presente homología respecto al espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR del organismo.

En una forma de realización, el espaciador de CRISPR presenta una homología de 100% respecto al espaciador de CRISPR del organismo donante.

El espaciador o espaciadores CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden comprender ADN o ARN de origen genómico, sintético o recombinante.

El espaciador o espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden ser de doble cadena o de una cadena, representando la cadena de sentido o la cadena antisentido o combinaciones de las mismas.

El espaciador o espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR pueden prepararse mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN recombinante) tal como se describe en la presente memoria.

La modificación puede comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, que es sustancialmente resistente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo en uno o más loci CRISPR de una célula sustancialmente sensible.

La modificación puede comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR de un organismo, tal como un organismo donante, que son sustancialmente resistentes a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo en (por ejemplo entre) una combinación funcional de por lo menos dos repeticiones CRISPR y por lo menos un gen cas en una célula sustancialmente sensible.

La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más genes cas en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los genes cas pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, las repeticiones CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen una o más combinaciones funcionales de cas-repetición CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, pueden clonarse las combinaciones funcionales de cas-repetición CRISPR en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforma en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

La modificación incluso puede comprender la modificación (por ejemplo la mutación) del ADN de una célula (por ejemplo una célula receptora), tal como ADN de plásmido o ADN genómico, de manera que se creen uno o más espaciadores de CRISPR en el ADN de la célula. A título de ejemplo adicional, los espaciadores de CRISPR pueden clonarse en un constructo, plásmido o vector y similar que después se transforman en la célula, utilizando métodos tales como los descritos en la presente memoria.

En una forma de realización, un espaciador de CRISPR se encuentra flanqueado por dos repeticiones CRISPR. En otras palabras, un espaciador de CRISPR presenta por lo menos una repetición CRISPR en cada lado.

Apropiadamente, la modificación comprender insertar uno o más espaciadores de CRISPR (por ejemplo espaciadores de CRISPR heterólogos) en la vecindad de (por ejemplo contiguos, apropiadamente, directamente contiguos a) uno o más genes cas y/o la secuencia líder. Apropiadamente, según la presente forma de realización de la presente realización, la organización del locus CRISPR natural se mantiene tras la inserción de uno

o más espaciadores de CRISPR.

AGRUPACIÓN

Inesperadamente también se ha descubierto que no resulta posible únicamente intercambiar combinaciones de repetición CRISPR-cas entre cualquier célula (por ejemplo cualquier cepa, especie o género de células) debido a que se cree que esto no resultará necesariamente en combinaciones funcionales de repetición CRISPR-cas.

Por el contrario, para que la combinación o combinaciones de repetición CRISPRcas resulten funcionales deberían ser compatibles. De acuerdo con lo anterior, se cree que no resulta posible intercambiar genes cas o repeticiones CRISPR entre diferentes loci CRISPR a menos que pertenezcan a la misma agrupación.

Resulta todavía más inesperado que las agrupaciones no sigan la filogenia del "organismo". Específicamente, dentro de un organismo, puede existir más de un CRISPR. Este CRISPR o CRISPR pueden pertenecer a diferentes agrupaciones, aunque se encuentren presentes en el mismo organismo. En consecuencia, se cree que una combinación funcional de repetición CRISPR-cas requiere que la combinación se intercambie dentro de una agrupación y no dentro de un organismo.

Para evitar dudas, el término "agrupación" tal como se utiliza en la presente memoria no se refiere a una agrupación de genes situada en el mismo locus (típicamente formando un operón) sino al resultado del análisis de comparación de secuencias, tal como el análisis de comparación de múltiples secuencias y/o de múltiples alineaciones de secuencias y/o el análisis de gráficos de puntos. De acuerdo con lo expuesto anteriormente, puede llevarse a cabo el análisis de agrupaciones de los loci CRISPR utilizando diversos métodos que son conocidos en la técnica, tales como el análisis de gráfico de puntos tal como se enseña posteriormente en la presente memoria, por ejemplo, o múltiples alineaciones seguido del cálculo de un dendrograma.

Ventajosamente, la utilización de una o más combinaciones de repetición CRISPRcas presentes simultáneamente de manera natural permite el intercambio de la combinación tanto dentro como entre una especie dada, permitiendo de esta manera manipular la resistencia de una cepa utilizando la combinación de una cepa diferente.

La agrupación puede ser una clase, familia o grupo de secuencias.

DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA

En un aspecto adicional se proporciona un método para determinar el perfil de resistencia de una célula frente a un ácido nucleico diana. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "perfil de resistencia" se refiere a una o más entidades contra las que es sensible o resistente la célula. De acuerdo con lo anterior, el perfil de resistencia de una célula puede ser que la célula sea resistente a un primer bacteriófago, sensible a un segundo bacteriófago, resistente a un primer elemento genético móvil y sensible a un primer gen resistente a antibióticos, etc.

Pueden detectarse o secuenciarse uno o más genes o proteínas cas y/o una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y/o uno o más espaciadores de CRISPR, etc. dentro de una célula, de manera que se predice/determinar el perfil de resistencia probable de una célula particular.

Apropiadamente, se detectan o se secuencian uno o más espaciadores de CRISPR dentro de una célula, de manera que se predice/determinar el perfil de resistencia probable de una célula particular.

Entre los métodos de detección adecuados pueden incluirse PCR, hibridación ADN-ADN (o la hibridación ADN-ARN, es decir, utilizando sondas de ADN o ARN que podría ser sintéticas, oligonucleótidos marcados, por ejemplo). También pueden utilizarse micromatrices de ADN.

Pueden detectarse o secuenciarse una o más combinaciones funcionales de casrepetición CRISPR y/o uno o más espaciadores de CRISPR dentro de una célula, de manera que se predice/determina el perfil de resistencia probable de una célula particular. A título de ejemplo, resulta posible predecir/determinar el perfil de resistencia probable de una célula bacteriana particular frente a uno o más bacteriófagos que puede utilizarse

para predecir el lisotipo para la selección microbiana.

Pueden secuenciarse uno o más genes cas y/o una o más repeticiones CRISPR además de uno o más espaciadores de CRISPR con el fin de verificar la compatibilidad del a combinación de gen cas-repetición CRISPR o incluso para identificar nuevas parejas compatibles de cas/repetición.

CÉLULA RECEPTORA

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula receptora" se refiere a cualquier célula en la que se modula o debe modularse la resistencia frente a un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En una forma de realización, la célula receptora se refiere a cualquier célula que comprende el ácido nucleico recombinante según la presente invención.

La célula receptora puede comprender una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y uno o más genes o proteínas cas. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR y los genes o proteínas cas forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.

La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR modificadas y/o uno o más genes o proteínas cas modificadas. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR modificadas y/o los genes o proteínas cas modificados forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.

La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR genéticamente manipuladas y/o uno o más genes o proteínas cas genéticamente manipulados. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR genéticamente manipuladas y/o los genes o proteínas cas genéticamente manipulados forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.

La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR recombinantes y/o uno o más genes o proteínas cas recombinantes. Apropiadamente, las repeticiones CRISPR recombinantes y/o los genes o proteínas cas recombinantes forman una combinación funcional en la célula receptora, tal como se describe en la presente memoria.

La célula receptora puede comprender una o más repeticiones CRISPR naturales y por lo menos un gen o proteína cas natural. Apropiadamente, la repetición o repeticiones CRISPR y dicho por lo menos un gen o proteína cas forman una combinación funcional.

La expresión "de origen natural" se refiere a que existe naturalmente en la Naturaleza.

La célula receptora incluso puede comprender combinaciones de una o más repeticiones CRISPR naturales o recombinantes modificadas, manipuladas genéticamente, y uno o más genes o proteínas cas modificados, manipulados genéticamente, recombinantes o naturales. Apropiadamente, el espaciador o espaciadores CRISPR modificados, manipulados genéticamente, recombinantes o naturales, o por lo menos un gen o proteína cas modificado, manipulado genéticamente, recombinante o natural, forman una combinación funcional.

Apropiadamente, la célula receptora es una célula procariótica.

Apropiadamente, la célula receptora es una célula bacteriana. Se indican en la presente memoria las células bacterianas adecuadas.

La célula bacteriana puede seleccionarse de una especie de bacteria del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacterium, una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo especies de Enterococcus, especies de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y especies de Oenococcus.

Entre las especies adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus y Lactobacillus casei.

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada par ala fermentación de la carne (incluyendo de vaca, de cerdo y de ave de corral), incluyendo, aunque sin limitación, bacterias del ácido láctico, Pediococcus cerevisiae, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, especies de Micrococcus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus curvatus, Pediococcus pentosaceus, Staphylococcus xylosus y Staphylococcus vitulinus y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 538-39

(D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 210-34 (2a edición, 1979); patente US nº 2.225.783).

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de verduras (por ejemplo zanahorias, pepinos, tomates, pimientos y col), incluyendo, aunque sin limitación, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 540 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 153-209 (2a edición, 1979); patentes US nº 3.024.116, nº 3.403.032, nº 3.932.674 y nº 3.897.307).

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de masa formada a partir de cereales (por ejemplo trigo, centeno, arroz, avena, cebada y maíz).

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser un célula bacteriana utilizada para la producción de vino. Típicamente, esto se consigue mediante la fermentación de jugo de fruta, típicamente mosto.

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de la leche para producir queso, tal como Lactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Bifidobacteria y Enterococci, etc., y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods 135-51 (2a edición, 1979)).

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación de la leche para producir queso, tal como Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Lactococci, Bifidobacteria y Enterococci, etc., y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 530 (D. Knorr, editor, 1987); C. Pederson, Microbiology of Fermented Foods, 135-51 (2a edición, 1979)). La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una célula bacteriana utilizada para la fermentación del huevo, tal como Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum y mezclas de los mismos (Food Biotechnology 538-39 (D. Knorr, editor, 1987)).

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una bacteria que comprende naturalmente uno o más loci CRISPR. Se han identificado loci CRISPR en más de 40 procariotas (Jansen et al. 2002b, Mojica et al. 2005, Haft et al. 2005), incluyendo, aunque sin limitación, Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Halocarcula, Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thermoplasma, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifex, Porphyromonas, Chlorobium, Thermus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Clostridium, Thermoanaerobacter, Mycoplasma, Fusobcterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myxococcus, Campylobacter, Wolinella, ACinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pasteurella, Photobacterium, Salmonella, Xanthomonas, Yersinia, Treponema y Thermotoga.

La célula en la que debe modularse la resistencia puede ser una bacteria para la utilización en composiciones cosméticas o farmacéuticas. Dicha composiciones pueden comprender un cultivo microbiano y/o una bacteria marcada y/o un cultivo celular según la presente invención. De esta manera, el cultivo microbiano y/o la bacteria marcada y/o un cultivo celular según la presente invención pueden ser compatibles en cosmética, o en farmacia o en terapia.

ORGANISMO DONANTE

En una forma de realización, la expresión "organismo donante" se refiere a un organismo o célula a partir del que son derivables la repetición CRISPR y/o el gen cas y/o una o más combinaciones de los mismos y/o espaciadores de CRISPR (preferentemente se derivan). Éstas pueden ser iguales o diferentes.

En una forma de realización, la expresión "organismo donante" se refiere a un organismo o célula a partir de la que son derivables (preferentemente se derivan) una o más, preferentemente dos o más repeticiones CRISPR y/o uno o más genes cas y/o una o más combinaciones de los mismos y/o espaciadores de CRISPR. Pueden ser iguales o diferentes.

En una forma de realización, el espaciador de CRISPR o seudoespaciador de CRISPR se deriva sintéticamente.

En una forma de realización, el organismo o célula donante comprende uno o más espaciadores de CRISPR, que proporciona la inmunidad específica contra un ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

En una forma de realización, el organismo o célula donante a partir del que es derivable (preferentemente que se deriva) el gen cas y/o la repetición de CRISPR y/o combinación de los mismos también es la célula/organismo receptor para el locus CRISPR recombinante. Pueden ser iguales o diferentes.

En una forma de realización, el organismo o célula donante a partir de la que es derivable (preferentemente que se deriva) el espaciador de CRISPR también es la célula/organismo receptor para el locus CRISPR recombinante. Pueden ser iguales o diferentes.

En el caso de que el organismo donante sea una célula bacteriana, el organismo donante típicamente comprende un espacidor de CRISPR que proporciona la inmunidad específica contra el ´cido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

El organismo puede ser una célula bacteriana o un bacteriófago.

Apropiadamente el organismo es un bacteriófago.

CÉLULAS HUÉSPED

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "célula huésped" se refiere a cualquier célula que comprende la combinación, el constructo o el vector y similar según la presente invención.

Las células huésped pueden transformarse o transfectarse con una secuencia de nucleótidos contenida en un vector, por ejemplo un vector de clonación. Dicha secuencia de nucleótidos puede encontrarse en un vector para la replicación y/o expresión de la secuencia de nucleótidos. Las células se seleccionan para que resulten compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células procarióticas (por ejemplo bacterianas).

Algunos aspectos de la presente invención también se refieren a células huésped que comprenden la combinación, el constructo o el vector de la presente invención. El constructo o el vector puede comprender una secuencia de nucleótidos para la replicación y la expresión de la secuencia. Las células se seleccionan para resultar compatibles con el vector y pueden ser, por ejemplo, células procarióticas (por ejemplo bacterianas).

CONSTRUCTO

En un aspecto adicional, se proporciona un constructo que comprende una o más de las secuencias de ácidos nucleicos indicadas en la presente memoria.

El término "constructo", que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido", incluye una secuencia de nucleótidos directa o indirectamente unida a otra secuencia, tal como una secuencia reguladora (por ejemplo un promotor). A título de ejemplo, la presente invención comprende un constructo que comprende una secuencia de nucleótidos operablemente ligada a dicha secuencia reguladora. La expresión "operablemente ligado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes indicados se encuentran en una relación que permite que funcionen de la manera pretendida. Una secuencia reguladora "operablemente ligada" a una secuencia codificante se encuentra ligada de manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

La expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores e intensificadores y otras señales de regulación de la expresión.

El término "promotor" se utiliza en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión de ARN polimerasa.

El constructo incluso puede contener o expresar un marcador, que permite la selección del constructo de secuencia de nucleótidos en, por ejemplo, una bacteria. Existen diversos marcadores que pueden utilizarse, por ejemplo los marcadores que proporcionan resistencia a antibióticos, por ejemplo resistencia a antibióticos bacterianos, tales como eritromicina, ampicilina, estreptomicina y tetraciclina.

VECTOR

El constructo puede ser un vector (por ejemplo un plásmido) o incluirse en el mismo.

De esta manera, en un aspecto adicional se proporciona un vector que comprende uno o más de los constructos o secuencias indicadas en la presente memoria.

El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación y vectores lanzadera.

La expresión "vector de transformación" se refiere a un constructo que puede ser transferido de una entidad a otra entidad, que puede ser de la especie o de una especie diferente. En el caso de que el constructo pueda ser transferido de una especie a otra, el vector de transformación en ocasiones se denomina "vector lanzadera".

Los vectores pueden transformarse en una célula adecuada (por ejemplo una célula huésped), tal como se indica posteriormente.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plásmido o fágicos proporcionados con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor.

Los vectores pueden contener una o más secuencias de nucleótidos de marcador seleccionable. Los sistemas de selección más adecuados para los microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requiere

una mutación en el organismo huésped.

Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN, o utilizarse para transfectar o transformar una célula huésped.

De esta manera, pueden incorporarse polinucleótidos en un vector recombinante (típicamente un vector replicable), por ejemplo un vector de clonación o de expresión. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible.

TRANSFECCIÓN

La introducción de un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o un vector) en una célula puede llevarse a cabo mediante diversos métodos. Por ejemplo, puede utilizarse la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAEdextrano, la transfección mediada por lípidos catiónicos, la electroporación, la transducción o la infección. Dichos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Las células que contiene ácidos nucleicos (por ejemplo un constructo o un vector) pueden seleccionarse mediante la utilización de, por ejemplo, eritromicina para células transfectadas con un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o vector) que incluye un marcador de resistencia seleccionable.

TRANSFORMACIÓN

Las enseñanzas sobre la transformación de las células se encuentran bien documentadas en la técnica, por ejemplo ver Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1995.

Una célula puede transformarse con un ácido nucleico (por ejemplo un constructo o vector). Las células transformadas con la secuencia de nucleótidos pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas para la replicación o expresión de la secuencia de nucleótidos.

INTRODUCCIÓN

En el contexto de la introducción de un ácido nucleico en una célula, en una forma de realización resulta preferente que el término "introducción" se refiera a uno o más de entre transformación, transfección, conjugación o transducción.

CULTIVOS INICIADORES

Los cultivos iniciadores se utilizan extensivamente en la industria alimentaria en la preparación de productos fermentados, incluyendo productos lácteos, tales como yogur y queso, productos cárnicos, productos de panadería, vino y productos vegetales.

Entre los cultivos iniciadores utilizados en la preparación de muchos productos de leche fermentada, queso y mantequilla se incluyen cultivos de bacterias, generalmente clasificados como bacterias del ácido láctico. Dichos cultivos iniciadores bacterianos proporcionan características específicas a diversos productos lácteos mediante la realización de varias funciones.

Los cultivos no concentrados comerciales de bacterias se denominan en la industria "cultivos madre" y se propagan en el sitio de producción, por ejemplo lechería, antes de añadirlas a un material de partida comestible, tal como leche, para la fermentación. El cultivo iniciador propagado en el sitio de producción para la inoculación en un material de partida comestible se denomina "iniciador en masa".

Entre los cultivos iniciadores adecuados para la utilización en la presente invención pueden incluirse cualquier organismo que resulta útil en la industria alimentaria, cosmética

o farmacéutica.

Por ejemplo, el cultivo iniciador puede resultar adecuado para la utilización en la industria lechera. En el caso de que se utilice en la industria lechera, el cultivo iniciador puede seleccionarse de entre una especie de bacteria del ácido láctico, una especie de Bifidobacterium, una especie de Brevibacterium, una especie de Propionibacerium. Entre los cultivos iniciadores adecuados del grupo de las bacterias del ácido láctico se incluyen cepas utilizadas comúnmente de una especie de Lactococcus, una especie de Streptococcus, una especie de Lactobacillus, incluyendo Lactobacillus acidophilus, una especie de Enterococcus, una especie de Pediococcus, una especie de Leuconostoc y una especie de Oenococcus.

Los cultivos de bacterias del ácido láctico se utilizan comúnmente en la preparación de productos de leche fermentada, tales como suero de leche, yogur o nata amarga, y en la preparación de mantequilla o queso, por ejemplo Brie o Harvati. Entre las especies de Lactococcus se incluyen el ampliamente utilizado Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris.

Entre otras bacterias del ácido láctico se incluyen Leuconostoc sp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Lactobacillus helveticus. Además, entre las especies probióticas, tales como las especies de Lactococcus, se incluyen el ampliamente utilizado Lactococcus lactis, incluyendo Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris. Se utilizan comúnmente cultivos mesofílicos de bacterias del ácido láctico en la preparación de productos de leche fermentada, tales como suero de leche, yogur o nata amarga, y en la preparación de mantequilla y queso, por ejemplo Brie o Harvati. Entre otras especies de Lactococcus se incluyen Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc sp., Lactococcus lactis subsp. lactis biovar, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbruecki subsp. bulgaris y Lactobacillus helveticus. Además, pueden añadirse cepas probióticas, tales como Bifidobacterium lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilus casei durante dicha preparación para intensificar el sabor o para promover la salud.

Entre los cultivos de bacterias del ácido láctico utilizados comúnmente en la preparación de los quesos cheddar y Monterrey Jack se incluyen Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris o combinaciones de los mismos.

Entre los cultivos termofílicos de bacterias del ácido láctico utilizados en la preparación de quesos italianos, tales como queso de pasta filata o parmesano, se incluyen Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Pueden añadirse otras especies de Lactobacillus, tales como Lactobacillus helveticus, durante la preparación con el fin de obtener un sabor deseado.

Ventajosamente, el organismo de cultivo iniciador puede comprender o consistir de una cepa modificada genéticamente (preparada según los métodos deseados en la presente memoria) de entre las cepas de bacterias del ácido láctico indicadas anteriormente o de cualquier otra cepa de cultivo iniciador.

La selección de organismos para el cultivo iniciador de la invención dependerá del tipo particular de productos que debe prepararse y tratarse. De esta manera, por ejemplo para la preparación de queso y mantequilla, se utilizan ampliamente cultivos mesofílicos de especies de Lactococcus, especies de Leuconostoc y especies de Lactobacillus, mientras que para el yogur y otros productos de leche fermentada, típicamente se utilizan cepas termofílicas de especies de Streptococcus y de Lactobacillus.

El cultivo iniciador incluso puede ser un cultivo iniciador seco.

El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador concentrado.

El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador concentrado utilizado en una inoculación directa.

El cultivo iniciador puede ser un cultivo iniciador congelado.

El cultivo iniciador puede consistir de una cepa bacteriana, es decir, un cultivo puro. En este caso, sustancialmente la totalidad, o por lo menos una parte significativa del cultivo iniciador bacteriano, generalmente comprendería la misma bacteria.

Alternativamente, el cultivo iniciador puede comprender varias cepas bacterianas, es decir, un cultivo mixto definido.

BACTERIAS DEL ÁCIDO LÁCTICO

Los cultivos iniciadores particularmente adecuados, en particular cultivos iniciadores secos, para la utilización en la presente invención comprenden bacterias del ácido láctico.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "bacterias del ácido láctico" se refiere a bacterias microaerofílicas o anaeróbicas Gram-positivas que fermentan el azúcar con producción de ácidos, incluyendo ácido láctico como el ácido producido predominantemente, ácido acético, ácido fórmico y ácido propiónico. Las bacterias del ácido láctico industrialmente más útiles se encuentran entre las especies de Lactococcus, tales como Lactococcus lactis, especies de Lactobacillus, especies de Bifidobacterium, especies de Streptococcus, especies de Leuconostoc, especies de Pediococcus y especies de Propionibacterium.

Los cultivos iniciadores de la presente invención pueden comprender una o más especies de bacterias del ácido láctico, tales como Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus o combinaciones de los mismos.

Los cultivos iniciadores de bacterias del ácido láctico se utilizan comúnmente en la industria alimentaria en forma de cultivos de una mezcla de cepas que comprenden una o más especies. Para varios cultivos de mezcla de cepas, tales como los cultivos iniciadores de yogur que comprenden cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus thermophilus, existe una relación simbiótica entre las especies, en la que la producción de ácido láctico es mayor que la de los cultivos de una única cepa de bacteria del ácido láctico (Rajagopal et al., J. Dairy Sci. 73:894-899, 1990).

PREPARACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES

Pueden prepararse cultivos iniciadores mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las dadas a conocer en la patente US nº 4.621.058. A título de ejemplo, pueden prepararse cultivos iniciadores mediante la introducción de un inóculo, por ejemplo una bacteria, en un medio de crecimiento para producir un medio inoculado y madurar el medio inoculado para producir un cultivo iniciador.

PREPARACIÓN DE CULTIVOS INICIADORES SECOS

Los cultivos iniciadores secos pueden prepararse mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las que se comentan en las patentes US nº 4.423.079 y nº 4.140.800.

Los cultivos iniciadores secos para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en forma de preparaciones sólidas. Entre los ejemplos de preparaciones sólidas están comprendidos de manera no limitativa, comprimidos, pellets, cápsulas, polvos, gránulos y triturados que pueden ser humectables, secados por atomización, secados por congelación o liofilizados.

Los cultivos iniciadores secos para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en una forma de pellet ultracongelado o en forma de polvos secados por congelación. Los cultivos iniciadores secos en un pellet ultracongelado o en forma de polvos secados por congelación pueden prepararse según los métodos conocidos en la técnica.

Los cultivos iniciadores para la utilización en la presente invención pueden encontrarse en forma de concentrados que comprenden una concentración sustancialmente alta de una o más bacterias. Apropiadamente, los concentrados pueden diluirse con agua o resuspenderse en agua u otros diluyentes adecuados, por ejemplo un medio de crecimiento apropiado o aceites minerales o vegetales, para la utilización en la presente invención. Los cultivos iniciadores secos de la presente invención en forma de concentrados pueden prepararse según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante centrifugación, filtración o una combinación de dichas técnicas.

PRODUCTO

Entre los productos adecuados para la utilización en la presente invención se incluyen, aunque sin limitación, alimentos, productos cosméticos o productos farmacéuticos.

Cualquier producto que se prepare a partir de un cultivo, o que comprenda el mismo, se encuentra contemplado según la presente invención. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, frutas, legumbres, cultivos de pienso y verduras, incluyendo productos derivados, cereales y productos derivados de cereales, alimentos lácteos y productos derivados lácteos, carne, aves de corral, marisco, productos cosméticos y farmacéuticos.

El término "alimento" se utiliza en un sentido amplio e incluye piensos, productos alimentarios, ingredientes alimentarios, suplementos alimentarios y alimentos funcionales.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ingrediente alimentario" incluye una formulación que se añade o puede añadirse a alimentos, e incluye formulaciones que pueden utilizarse a niveles bajos en una amplia diversidad de productos que requieren, por ejemplo, la acidificación o la emulsión.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "alimento funcional" se refiere a un alimento que puede proporcionar no sólo un efecto nutricional y/o una satisfacción del gusto, sino que también puede proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Aunque no existe ninguna definición legal de alimento funcional, la mayoría de partes interesadas en este área concuerdan en que existen alimentos que se comercializan como presentando efectos específicos sobre la salud.

El término "alimento" cubre alimentos para los seres humanos, así como alimentos para animales (es decir, un pienso), un suplemento alimentario o un alimento funcional.

El alimento puede encontrarse en la forma de una solución o de un sólido, dependiendo de la utilización y/o modo de aplicación y/o modo de administración.

Las células indicadas en la presente memoria pueden utilizarse en la preparación de productos alimentarios tales como uno o más de entre: productos de confitería, productos lácteos, productos cárnicos, productos de aves de corral, productos de pescado y productos de panadería.

A título de ejemplo, la bacteria puede utilizarse como ingrediente para bebidas refrescantes, un zumo de fruta o una bebida que comprende proteínas de suero, tés dietéticos, bebidas de cacao, bebidas lácteas y bebidas de bacterias del ácido láctico, yogur, yogur líquido y vino.

También se proporciona un método para preparar un alimento, comprendiendo el método la mezcla de células según la presente invención con un ingrediente alimentario (tal como un material de partida para un alimento). El método para preparar un alimento también es otro aspecto de la presente invención.

Apropiadamente, un producto tal como se describe en la presente memoria es un producto lácteo. Más preferentemente, un producto lácteo tal como se describe en la presente memoria es uno o más de los siguientes: un yogur, un queso (tal como un queso cuajado láctico, un queso duro, un queso semiduro, un queso cottage), un suero de mantequilla, quark, una nata amarga, kéfir, una bebida fermentada basada en suero, un koumiss, una bebida láctea y una bebida de yogur.

En la presente memoria, el término "alimento" se utiliza en un sentido amplio, y cubre alimentos para seres humanos así como alimentos para animales (es decir, un pienso). En un aspecto preferente, el alimento es para el consumo humano.

El término pienso tal como se utiliza en la presente memoria incluye material vegetal crudo y procesado y material no vegetal. El pienso puede ser cualquier pienso adecuado para el consumo por un animal, incluyendo pienso (animal) para ganado, por ejemplo pienso para aves de corral, pienso para peces o pienso para crustáceos, por ejemplo.

VARIANTES/HOMÓLOGOS/DERIVADOS/FRAGMENTOS

La presente invención comprende la utilización de variantes, homólogos, derivados y fragmentos de los mismos, incluyendo variantes, homólogos, derivados y fragmentos de loci CRISPR, espaciadores de CRISPR, seudoespaciadores de CRISPR, genes o proteínas cas, repeticiones CRISPR, combinaciones funcionales de repetición CRISPR-gen cas y secuencias diana de ácidos nucleicos o productos de transcripción de los mismos.

El término "variante" se utiliza para referirse a un polipéptido natural o secuencias de nucleótidos que difieren de una secuencia de tipo salvaje.

El término "fragmento" indica que un polipéptido o secuencia de nucleótidos comprende una fracción de una secuencia de tipo salvaje. Puede comprender una o más secciones contiguas grandes o una pluralidad de secciones pequeñas. La secuencia también puede comprender otros elementos de secuencia, por ejemplo puede ser una proteína de fusión con otra proteína. Preferentemente, la secuencia comprende por lo menso 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje.

Preferentemente, el fragmento conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, o más preferentemente 98%, más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

Preferentemente, un espaciador de CRISPR o un seudoespaciador de CRISPR comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, un espaciador de CRISPR conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

Preferentemente, un gen cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, un gen cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, más preferentemente 60% o más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos de tipo salvaje.

Preferentemente, una proteína Cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, una proteína Cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98% o más preferentemente 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

Preferentemente, una repetición CRISPR comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la actividad del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje. Preferentemente, una repetición CRISPR retiene una actividad de 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o todavía más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

Preferentemente, una combinación funcional de repetición CRISPR-cas comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, la combinación funcional de repetición CRISPR-cas conserva 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98% o más preferentemente 99% del polipéptido o secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico diana comprende por lo menos 50%, más preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos 80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos 97%, más preferentemente por lo menos 98%, todavía más preferentemente por lo menos 99% de la secuencia de tipo salvaje. Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico diana retiene una actividad de 50%, más preferentemente 60%, más preferentemente 70%, más preferentemente 80%, más preferentemente 85%, más preferentemente 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente 96%, más preferentemente 97%, más preferentemente 98%, o todavía más preferentemente 99% del polipéptido o la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje.

El fragmento puede ser un fragmento funcional.

La expresión "fragmento funcional" de una molécula se refiere a un fragmento que conserva o que presenta sustancialmente la misma actividad biológica que la molécula intacta. En todos los casos, un fragmento funcional de una molécula conserva por lo menos 10%, y por lo menos aproximadamente 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de la actividad biológica de la molécula intacta.

El término "homólogo" se refiere a una entidad que presenta una determinada homología con las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de la base de datos. En la presente memoria el término "homología" es equivalente a "identidad".

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de la invención. Aunque también puede considerarse la homología en términos de similitud (es decir, residuos aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de la invención. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos aminoácidos que presentan propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención resulta preferido expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de homología pueden llevarse a cabo visualmente, o más habitualmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.

El % de homología puede calcularse en secuencias contiguas, es decir, una secuencia alineada con otra secuencia, y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina alineación "sin huecos". Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se llevan a cabo únicamente a lo largo de únicamente un número relativamente reducido de residuos.

Aunque el anterior es un método muy simple y consistente, no considera que, por ejemplo, en una pareja de secuencias de otro modo idéntica, una inserción o una deleción provocará que los residuos aminoácidos siguientes se encuentren desalineados, resultando potencialmente de esta manera en una gran reducción del % de homología al llevar a cabo la alineación global. En consecuencia, la mayoría de métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que consideran posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación global de homología. Lo expuesto anteriormente se consigue mediante la inserción de "huecos" en la alineación de las secuencias para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, dichos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se observa en la alienación, de manera que, para el mismo número de aminoácidos idénticos (una alineación de secuencias con el mínimo número de huecos, que refleja un grado de relación más alto entre las dos secuencias comparadas), alcanzará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Típicamente se utilizan "costes de huecos afines" que cargan un coste relativamente alto a la existencia de un hueco y una penalización más pequeña a cada residuo posterior en el hueco. Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más comúnmente. Evidentemente las penalizaciones de hueco elevadas producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de programas de alienación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, resulta preferido utilizar los valores por defecto al utilizar este tipo de software para las comparaciones de secuencias. Por ejemplo, al utilizar el paquete GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para las secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y de -4 por cada extensión.

Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología en primer lugar requiere la producción de una alineación óptima, considerando las penalizaciones de hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo dichas alineaciones es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., Nucleic Acids Research 12:387, 1984). Entre los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencias se incluyen, aunque sin limitación, el paquete BLAST (ver Ausubel et al., ibid, capítulo 18, 1999), FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 403-410, 1990), el conjunto GENEWORKS de herramientas de comparación, y CLUSTAL. Tanto BLAST como FASTA se encuentran disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (ver Ausubel et al., ibid, páginas 7-58 a 7-60, 1999). Sin embargo, para algunas aplicaciones, resulta preferido utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta denominada BLAST 2 Sequences también se encuentra disponible para comparar secuencias de proteínas y de nucleótidos (ver FEMS Microbiol. Lett. 174(2):247-50, 1999; FEMS Microbiol. Lett. 177(1):187-8, 1999).

Aunque el % final de homología puede medirse en términos de identidad, el

5 procedimiento de alineación típicamente no se basa en una comparación de parejas de todo-o-nada. Por el contrario, generalmente se utiliza una matriz de escala de puntuaciones de similitud que asigna puntuaciones a cada comparación por parejas basada en la similitud química o en la distancia evolutiva. Un ejemplo de este tipo de matriz que se utiliza comúnmente es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para el

10 conjunto BLAST de programas. Los programas de GCG Wisconsin generalmente utilizan los valores por defecto públicos o una tabla de comparaciones de símbolos personalizados en caso de que se proporcione (ver el manual para el usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones resulta preferido utilizar los valores por defecto públicos para el paquete de GCG, o en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como

15 BLOSUM62.

Tras producir el software una alineación óptima, resulta posible calcular el % de

homología, preferentemente el % de identidad de secuencias. El software típicamente

lleva a cabo lo anterior como parte de la comparación de secuencias y genera un

20 resultado numérico.

En el caso de que se utilicen penalizaciones por hueco al determinar la identidad de secuencia, apropiadamente se utilizan los parámetros siguientes:

PARA BLAST

APERTURA DE HUECO

0

EXTENSIÓN DE HUECO

0

PARA CLUSTAL

ADN PROTEÍNA

TAMAÑO DE PALABRA

2 1 K triple

PENALIZACIÓN POR HUECO

10 10

EXTENSIÓN DE HUECO

0,1 0,1

Para la comparación de secuencias de polipéptido, pueden utilizarse los ajustes

siguientes: penalización por creación de HUECO de 3,0 y penalización por extensión de

HUECO de 0,1. Apropiadamente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de

30 aminoácidos se determina a lo largo de por lo menos 5 aminoácidos contiguos, se determina a lo largo de por lo menos 10 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 15 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 20 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 30 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 40 aminoácidos contiguos, a lo largo de por lo menos 50 aminoácidos contiguos, o a lo largo de por lo

35 menos 60 aminoácidos contiguos.

Las secuencias también pueden presentar deleciones, inserciones o sustituciones

de residuos aminoácidos, que produce un cambio silencioso y resulta en una sustancia

funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones deliberadas de aminoácidos

40 basándose en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos, con la condición de que se conserve la actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, entre los aminoácidos cargados negativamente

5

10

15

20

25

30

35

40

-83

se incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; entre los aminoácidos cargados positivamente se incluyen lisina y arginina; y entre los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que presentan valores de hidrofilicidad similares se incluyen leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.

Pueden realizarse sustituciones conservadoras, por ejemplo según la Tabla a continuación. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y apropiadamente en la misma fila en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

ALIFÁTICOS

No polares G A P

I L V

Polares no cargados

C S T M

N Q

Polares cargados

D E

K R

AROMÁTICOS

H F W Y

La presente invención también comprende la sustitución homóloga (en la presente memoria se utiliza tanto el término sustitución como el término reemplazamiento para hacer referencia al intercambio de un residuo aminoácido existente pro un residuo alternativo), es decir, la sustitución de igual por igual, tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La sustitución no homóloga también puede producirse, es decir, de una clase de residuo por otra, o alternativamente implicando la inclusión de aminoácidos no naturales, tales como la ornitina (en adelante denominada Z), la ornitina ácido diaminobutírico (en adelante denominada B), ornitina norleucina (en adelante denominada O), pirilalanina, tenilalanina, naftilalanina y fenilglicina.

También pueden realizarse sustituciones por aminoácidos no naturales, incluyendo: aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos, aminoácidos N-alquilo*, ácido láctico*, derivados haluro de aminoácidos naturales, tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*; L-alil-glicina*; β-alanina*; ácido L-α-aminobutírico*; ácido L-γ-aminobutírico*; ácido L-α-aminoisobutírico; ácido L-ε-aminocaproico#; ácido 7amino-heptanoico*; L-metionina-sulfona#'; L-norleucina*; L-norvalina*; p-nitro-Lfenilalanina*; L-hidroxiprolina#; L-tioprolina*; derivados metilo de fenilalanina (Phe), tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe(4-amino)#, L-Tyr(metil)*, L-Phe(4-isopropil)*; ácido L-Tic(1,2,3,4-tetrahidroisoquinolín-3-carboxilo)*; ácido L-diaminopropiónico# y LPhe(4-bencilo)*. La notación * se ha utilizado con el fin indicado en el comentario anterior (referente a la sustitución homóloga o no homóloga) para indicar la naturaleza hidrofóbica del derivado, mientras que # se utiliza para indicar la naturaleza hidrofílica del derivado, # indica características anfipáticas.

Entre las secuencias de aminoácidos variantes se incluyen grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre dos residuos aminoácidos cualesquiera de la secuencia, incluyendo grupos alquilo, tales como grupos metilo, etilo o propilo, además de aminoácidos espaciadores, tales como residuos glicina o β-alanina. Una forma adicional de variación incluye la presencia de uno o más residuos aminoácidos en forma peptoide que será bien entendido por el experto en la materia. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para referirse a residuos de aminoácidos variantes en los que el grupo sustituyente del carbono α se encuentra en el átomo de nitrógeno del residuo y no en el carbono α. Los procedimientos para preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la técnica, por ejemplo de Simon R.J. et al., PNAS 89(20):9367-9371, 1992, y de Horwell D.C., Trends Biotechnol. 13(4): 132-134, 1995.

Las secuencias de nucleótidos para la utilización en la presente invención pueden incluir nucleótidos sintéticos o modificados. Son conocidos en la técnica varios tipos diferentes de modificación de los oligonucleótidos. Entre ellos se incluyen los esqueletos de metilfosfonato y de fosforotioato y/o la adición de acridina o cadenas de polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. En el contexto de la presente invención debe apreciarse que las secuencias de nucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible de la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para incrementar la actividad in vivo o periodo de vida de las secuencias de nucleótidos que resultan útiles en la presente invención.

TÉCNICAS GENERALES DE LA METODOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE

La presente invención utiliza, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran comprendidas dentro de las capacidades de un experto ordinario en la materia. Dichas técnicas se explican en la literatura (ver, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, volúmenes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel F.M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, capítulos 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; M.J. Gait (editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, y D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, Methods of Enzymology: DNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press, 1992). Cada uno de estos textos generales se incorpora como referencia a la presente memoria.

A continuación se describe con mayor detalle la invención mediante Ejemplos, que se proporcionan como ayuda para el experto ordinario en la materia para la puesta en práctica de la invención y de manera no limitativa del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Inserción de un espaciador específico de fago en un CRISPR funcional existente para proporcionar resistencia frente al fago correspondiente.

Cepa -Streptococcus thermophilus ST0089

Phago -2972

Streptococcus thermophilus ST0089 es una cepa industrialmente importante utilizada en la fabricación del yogur, puede manipularse genéticamente y es susceptible al fago virulento 2972. La secuencia genómica completa para el fago 2972 ha sido determinada recientemente.

Se determinaron los loci CRISPR en la cepa ST0089. Éstas se determinaron preferentemente mediante secuenciación del genoma completo de ST0089. Alternativamente, se identificaron los loci CRISPR mediante PCR utilizando conjuntos de cebadores con secuencias idénticas a los elementos CRISPR de S. thermophilus previamente identificados.

Tras la identificación, se determinaron las secuencias de los loci de CRISPR, así como las regiones proximales, que deberían contener los genes cas relevantes.

Se seleccionó por lo menos un locus CRISPR-cas particular para la manipulación adicional. Se determinó la funcionalidad de este locus mediante análisis in silico de las regiones espaciadoras y sus homologías con las secuencias de ADN fágicas (es decir, la ausencia y/o presencia de secuencias de espaciador y la correlación con la infectividad fágica con la cepa ST0089). En ausencia de esta correlación, se supuso la funcionalidad basándose en la presencia de todos los elementos documentados (es decir, repeticiones, espaciadores, secuencias líder, genes cas, putativamente codificantes de proteínas de longitud completa).

Se seleccionaron una o más secuencias de espaciador adecuadas del genoma del fago 2972. Los criterios de los espaciadores seleccionados se basaron en: 1) la longitud de los espaciadores dentro del locus CRISPR seleccionado, 2) una identidad de aproximadamente 100% con la secuencia fágica, 3) puede seleccionarse teóricamente cualquier secuencia fágica.

En el ejemplo más simple, se sintetiza químicamente una unidad CRISPR que consiste de una secuencia espaciadora de fago 2972, flanqueada por dos elementos repetidos (idénticos al locus CRISPR seleccionado). Por definición, esta "unidad CRISPR" sintética presenta una longitud aproximada de 100 pb y es excesivamente corta para garantizar la integración en el locus CRISPR.

Por lo tanto, se construyó ADN flanqueante adicional conjuntamente con la unidad CRISPR. Un mínimo de 500 pb de ADN homólogo, idéntico al locus CRISPR diana flanquea la unidad CRISPR sintética, para facilitar la integración.

Existen por lo menos dos enfoques. Un constructo imita la adición de un nuevo espaciador al CRISPR existente. Alternativamente, se sustituye el locus CRISPR completo con la unidad CRISPR sintética.

El integrante CRISPR resultante se verifica mediante secuenciación de ADN del locus CRISPR antes del ensayo biológico.

Se sometieron a ensayo los patrones de sensibilidad fágica del integrante CRISPR contra el fago 2972 y se compararon con la cepa parental.

El integrante CRISPR construido demuestra con éxito la correlación directa entre la presencia de un espaciador específico dentro del contexto correcto de CRISPR-cas.

Ejemplo 2

Se insertó un espaciador homólogo a un ADN fágico en una célula, tal como una célula receptora. La célula adquiere resistencia al fago. En un locus CRISPR dentro de la cepa seleccionada, se diseñó un nuevo espaciador de CRISPR a partir de ADN fágico (con 100% de identidad respecto al ADN fágico) dentro del gen antirreceptor y se inserta en la célula. La diana es el gen antirreceptor debido a que se ha encontrado que los espaciadores de CRISPR de otras cepas muestran similitud a genes antirreceptor fágicos. Cuatro cepas portadoras de espaciadores que muestran identidad a genes antirreceptor fágicos son resistentes al fago particular. Se expone el mutante a fago y adquiere resistencia al mismo.

Ejemplo 3

Se preparó un plásmido que comprendía un espaciador de CRISPR, y se demostró que este plásmido no podía transferirse al interior de una célula que contenía el mismo espaciador, mientras que el plásmido sin el espaciador podía transformarse en la célula.

Ejemplo 4

Se insertó un espaciador en un huésped original, pero no en un locus CRISPR, y el mutante resultante conservaba su sensibilidad frente al fago, mostrando que el espaciador requiere encontrarse dentro de un ambiente particular dentro de un CRISPR y genes cas.

Ejemplo 5

Se insertó una combinación completa de repetición CRISPR-cas en una célula, tal como una célula receptora, para proporcionar inmunidad frente a un ácido nucleico entrante.

Ejemplo 6

Para una combinación particular de repetición CRISPR-cas presentes en dos cepas diferentes, el "intercambio" de espaciadores modificaba sus fenotipos (sensibilidad/resistencia frente al fago).

Ejemplo 7

Se delecionaron uno o más genes cas (de una unidad funcional de CRISPR-cas). Los genes cas resultan necesarios para proporcionar inmunidad. Los mutantes de cas todavía son sensibles al fago, a pesar de la presencia del espaciador idéntico al ADN fágico.

Ejemplo 8

Se clonaron los genes cas delecionados en un plásmido. Resultó posible proporcionar los genes cas en trans al huésped. En el caso de que se desactive el gen cas, se restaura la inmunidad.

Ejemplo 9

Se prepararon diferentes combinaciones de cas-repetición CRISPR. No sólo resultan necesarios los genes o proteínas cas, sino también resultan necesarias parejas específicas de cas-repetición CRISPR para obtener funcionalidad. En el caso de que se proporcionen genes o proteínas cas de otro locus CRISPR, la cepa sigue siendo sensible al fago.

Ejemplo 10

En el caso de que se delecione un espaciador de CRISPR particular de un locus CRISPR natural, se elimina la inmunidad frente a un fago dado y el huésped se convierte en sensible (pierde la resistencia) al fago respecto al que es homólogo el espaciador.

Ejemplo 11

La integración de un espaciador de CRISPR en el locus CRISPR de una bacteria proporciona resistente frente a un bacteriófago al que muestra identidad el espaciador de CRISPR.

(A) Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH1

Streptococcus thermophilus

Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710 (depositada en la "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" francesa bajo el número CNCM I-2423) presente por lo menos 3 loci CRISPR: CRISPR1, CRISPR2 y CRISPR3. En las cepas CNRZ1066 y LMG18311 para las que se conoce la secuencia genómica completa (Bolotin et al., 2004), CRISPR1 se encuentra localizado en el mismo locus cromosómico: entre str0660 (o stu0660) y str0661 (o stu0661).

En la cepa DGCC7710, CRISPR1 también se encuentra localizado en el mismo locus cromosómico, entre genes altamente similares. CRISPR1 de la cepa DGCC7710 contiene 33 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y, de esta manera, 32 espaciadores.

Todos dichos espaciadores son diferentes entre sí. La mayoría de estos espaciadores son nuevos (no descritos todavía dentro de los loci CRISPR), aunque cuatro espaciadores próximos a la secuencia remolque de CRISPR1 son idénticos a espaciadores de CRISPR1 ya conocidos:

-

el espaciador nº 28 de DGCC7710 es 100% idéntico al espaciador nº 31 de CRISPR1 de la cepa CNRZ1575 (GenBank nº de acceso DQ072991),

-

el espaciador nº 30 de DGCC7710 es 100% idéntico al espaciador nº 27 de CRISPR1 de la cepa CNRZ703 (GenBank nº de acceso DQ072990),

-

el espaciador nº 31 de DGCC7710 es 100% idéntico al espaciador nº 28 de

CRISPR1 de la cepa CNRZ703 (GenBank nº de acceso DQ072990),

-el espaciador nº 32 de DGCC7710 es 100% idéntico al espaciador nº 30 del espaciador de CRISPR1 de la cepa CNR1703 (GenBank nº de acceso DQ072990).

Bacteriófago virulento

D858 es un bacteriófago perteneciente a la familia Siphoviridae de virus. Su secuencia genómica ha sido determinada por completo pero no ha sido publicada todavía. Este fago es virulento frente a S. thermophilus cepa DGCC7710.

Mutante resistente a fago

Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH1 ha sido aislado como mutante naturalmente resistente a fago utilizando DGCC7710 como cepa parental, y el fago D858 como fago virulento.

CRISPR1 de la cepa DGCC7710-RH1 contiene 34 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y, de esta manera, 33 espaciadores. En comparación con la secuencia de CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710, la secuencia de CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH1 presenta un nuevo espaciador adicional (y evidentemente una repetición adicional que flanquea el nuevo espaciador) en un extremo del locus CRISPR (es decir, próximo a la secuencia líder, en el extremo 5' del locus CRISPR).

La totalidad de los demás espaciadores del locus CRISPR1 no resulta modificada.

La secuencia de CRISPR1 (5'-3') de la cepa DGCC7710-RH1 es:

imagen1

imagen2

Leyenda Secuencia líder: 5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3' Secuencia integrada que comprende una repetición CRISPR, en mayúscula, y un

espaciador de CRISPR (es decir, la secuencia de etiqueta), en minúscula.

Repeticiones CRISPR:

Repetición terminal: 5' gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3'

Secuencia remolque: 5' ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'

La secuencia del nuevo espaciador se encuentra presente dentro del genoma

fágico de D858 y se encuentra representada en la presente memoria como SEC ID nº 534.

La secuencia del espaciador se encuentra entre las posiciones 31921 y 31950 pb (es decir, en la cadena positiva) del genoma de D858 (y presenta una identidad de 100% respecto a la secuencia genómica de D858 a lo largo de 30 nucleótidos):

imagen2

El nuevo espaciador que se encuentra integrado en el locus CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH1 proporciona a esta cepa resistencia frente al fago D858, tal como se representa en la figura 5 y en la Tabla 1.

(B) Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710RH2

Se ha aislado Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 ha sido aislado en forma de un mutante natural resistente a fagos utilizando Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710 como la cepa parental y el fago D858 como el fago virulento.

CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 contiene 34 repeticiones (incluyendo la repetición terminal) y de esta manera, 33 espaciadores. En comparación con la secuencia CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710, la secuencia CRISPR1 de Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 presenta un nuevo espaciador adicional (y evidentemente una repetición adicional que flanquea al nuevo espaciador) en un extremo del locus CRISPR (es decir, próximo al líder, en el extremo 5' del locus CRISPR). Todos los demás espaciadores del locus CRISPR1 no han sido modificados.

La secuencia CRISPR1 (5'-3') de la cepa DGCC7710-RH2 es:

imagen3

Leyenda

15 Secuencia líder: 5'caaggacagttattgattttataatcactatgtgggtataaaaacgtcaaaatttcatttgag3' Secuencia integrada que comprende una repetición CRISPR, en mayúscula, y un

20 espaciador CRISPR (es decir, la secuencia de etiquetado), en minúscula. Repeticiones CRISPR: Repetición terminal: 5' gtttttgtactctcaagatttaagtaactgtacagt 3' Secuencia remolque: 5' ttgattcaacataaaaagccagttcaattgaacttggcttt 3'

Se ha demostrado que la secuencia del nuevo espaciador se encuentra presente 5 dentro del genoma del fago D858.

La secuencia del espaciador (representado en la presente memoria como SEC ID nº 535) se encuentra entre las posiciones 17.215 y 17.244 pb (es decir, en la cadena positiva) del genoma de D858 (y presenta una identidad de 100% respecto a la secuencia

10 genómica de D858 a lo largo de 30 nucleótidos):

imagen2

El nuevo espaciador que se encuentra integrado en el locus CRISPR1 de

15 Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 proporciona a Streptococcus thermophilus cepa DGCC7710-RH2 una resistencia frente al fago D858, tal como se representa en la figura 6 y en la Tabla 1.

20 Ejemplo 12

Integración y desactivación de constructo

Materiales y métodos 25 Cepas y plásmidos

Cepa parental Streptococcus thermophilus DGCC7710, sensible a los fagos 858 y 2.972

Streptococcus thermophilus

DGCC77778 con CRISPR mutante, resistente a 858

Streptococcus thermophilus

DGCC7778cas1KO

Streptococcus thermophilus

DGCC7778cas4KO

Streptococcus thermophilus

DGCC7778RT

Streptococcus thermophilus

DGCC7778RT'

Streptococcus thermophilus

DGCC7710R2 con CRISPR mutante, resistente a 2.972

Streptococcus thermophilus

DGCC7710R2S1S2

Escherichia coli EC1.000 proporciona pORI28 (Russell y Klaenhammer, 2001). 30 Escherichia coli pCR2.1TOPO proporciona pTOPO (Invitrogen nº de catálogo K4500-01)

pTOPO es un plásmido utilizado para la subclonación de los diversos constructos 35 pTOPOcas1ko contiene un fragmento integral de cas1.

pTOPOcas4ko contiene un fragmento integral de cas4.

pTOPOS1S2 contiene el constructo de espaciador S1S2. pTOPORT contiene el constructo de repetición terminal RT. 5 pORI28 es un plásmido utilizado para la integración de los diversos constructos en el cromosoma de las cepas de Streptococcus thermophilus. pORIcas1ko contiene un fragmento integral de cas1.

10 pORIcas4ko contiene un fragmento integral de cas4. pORIS1S2 contiene el constructo de espaciador S1S2. purist contiene el constructo de repetición terminal RT.

15 Cebadores

Cas1

5’-caaatggatagagaaacgc-3’ and 5’-ctgataaggtgttcgttgtcc-3’

Cas4

5’-ggagcagatggaatacaagaaagg-3’ and 5’-gagagactaggttgtctcagca-3’

S1S2 y RT

P15’-acaaacaacagagaagtatetcattg-3’ P2 5’-aacgagtacactcactatttgtacg-3’ P3 5’tccactcacgtacaaatagtgagtgtactcgtttttgtattctcaagatttaagtaactgtacagtttgattcaacataaaaag-3’ P4 5’-ctttccttcatcctcgctttggtt-3’

Se obtuvieron las cepas y fagos de la Danisco Culture Collection, o de material de

referencia (Russell y Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67:43691

4364, 2001; Levesque et al., Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068,

20 2005).

La preparación, purificación y ensayos de fagos se llevaron a cabo utilizando los

métodos descritos anteriormente (Duplessis et al., Virology 340:192-208, 2005; Levesque

et al., Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068, 2005).

25 Se cultivaron cepas de Streptococcus thermophilus a 37ºC o a 42ºC en M17 (Difco Laboratories) suplementado con lactosa o sacarosa al 0,5%. Para la infección por fagos, se añadió CaCl2 10 mM al medio previamente a la infección por fagos, tal como se ha descrito anteriormente (Duplessis et al., Virology 340:192-208, 2005; Levesque et al.,

30 Applied and Environmental Microbiology 71:4057-4068, 2005).

Los enzimas utilizados para llevar a cabo las digestiones de restricción y la PCR se

obtuvieron de Invitrogen y se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. Las PCR

se llevaron a cabo en un termociclador de gradiente Eppendorf Mastercycler tal como se

35 ha descrito anteriormente (Barrangou et al., Applied and Environmental microbiology 68:2877-2884, 2002).

La inactivación génica y la inserción de plásmido específica de sitio mediante recombinación homóloga en el cromosoma de Streptococcus thermophilus se llevaron a cabo mediante subclonación en el sistema pCR2.1TOPO de Invitrogen, la clonación posterior en el sistema pORI utilizando Escherichia coli como huésped y los constructos se purificaron finalmente y se transformaron en Streptococcus thermophilus tal como se ha descrito anteriormente (Russell y Klaenhammer, Applied and Environmental Microbiology 67:43691-4364, 2001).

(1) Integración del constructo RT

Utilizando el constructo RT construido tal como se muestra en la figura 17, se insertó el constructo inmediatamente después de cas4, tal como se muestra en la figura

18.

La cepa parental DGCC7778 es resistente al fago 858.

La cepa parental presentaba dos espaciadores (S1 y D2) que eran idénticos al ADN del fago 858.

La cepa resultante (RT) perdía resistencia frente al fago 858, tal como se muestra en la Tabla 1. Esto demuestra que resulta necesario que los genes cas sean inmediatamente contiguos al espaciador o espaciadores para proporcionar resistencia.

(2) Desactivación de cas1

Tal como se muestra en la figura 12, se manipuló la cepa parental DGCC7778 de manera que se interrumpiese el gen cas1. Tal como se muestra en la Tabla 1, lo anterior resultó en una pérdida de resistencia, lo que significa que cas1 resulta necesario para proporcionar resistencia.

(3) Desactivación de cas4

Tal como se muestra en la figura 12, se manipuló la cepa parental DGCC7778 de manera que se interrumpiese el gen cas4.

(4) Integración del constructo S1S2

Tal como se muestra en las figuras 14 a 16, el constructo S1S2 se encuentra integrado en la cepa parental DGCC7710.

SUMARIO

Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas) (también conocidas como SPIDR, repeticiones directas intercaladas por espaciadores) constituyen una familia de loci de ADN recientemente descritos ampliamente distribuidos en los genomas procarióticos. Se encuentran constituidos por repeticiones palindrómicas de ADN cortas y altamente conservadas que se encuentran uniformemente espaciadas por secuencias altamente polimórficas de aproximadamente la misma longitud. Además, los genes cas (genes asociados a CRISPR) habitualmente se encuentran presentes contiguamente a las secuencias de CRISPR. En la literatura, todavía no se ha atribuido ninguna función fisiológica clara a las secuencias CRISPR o a los genes cas.

En la presente memoria se sugiere que las secuencias de CRISPR en combinación con genes cas pueden utilizarse para proporcionar resistencia frente al ácido nucleico entrante. En particular, se propone que los espaciadores dentro de los loci CRISPR proporcionan la especificidad para la inmunidad frente al ácido nucleico entrante. En consecuencia, se sugiere que los genes cas en asociación con las secuencias CRISPR se utilicen para proporcionar a las células resistencia frente a secuencias particulares de ácidos nucleicos, tales como bacteriófagos, plásmidos, trasposones y secuencias de inserción. Además, estos elementos pueden manipularse para generar inmunidad dirigida contra secuencias particulares de ácidos nucleicos, tales como componentes fágicos, genes de resistencia a antibióticos, factores de virulencia, secuencias nuevas, elementos no deseables y similares. De esta manera, el simple conocimiento de, inter alia, secuencias de espaciadores de CRISPR para una cepa bacteriana dada resultaría una ventaja para determinar su lisotipo (el lisotipo define la resistencia/sensibilidad de una bacteria dada frente a diversos bacteriófagos) y para predecir su capacidad de sobrevivir a la exposición a secuencias de ácidos nucleicos definidas. En consecuencia, la caracterización de los loci CRISPR en bacterias podría ayudar a determinar, predecir y modificar la interacción huésped-fago. La aplicación particular de manipulación genética de CRISPR, mediante adición, deleción o modificación de secuencias de espaciador podría conducir a variantes bacterianas resistentes a fagos.

Los CRISPRS (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y uniformemente espaciadas), también conocidos como SPIDR (repeticiones directas intercaladas por espaciadores) forman una nueva familia de secuencias repetidas que han sido identificadas en secuencias genómicas completas, en numerosos procariotas, mayoritariamente en cromosomas aunque también en plásmidos (Mojica et al. 2000; Jansen et al. 2002a). Los loci CRISPR están constituidos por repeticiones de ADN cortas y altamente conservadas (24 a 40 pb, repetidas entre 1 y 140 veces) que son parcialmente palindrómicas. Aunque existen determinados límites a la degeneración de las bases entre repeticiones de diferentes loci y especies, no existe ninguna secuencia absolutamente conservada en todas las repeticiones observadas. Además, las repeticiones aparentemente se encuentran orientadas dentro de un locus particular con respecto a los genes vecinos. Entre estas secuencias repetidas (habitualmente específicas para una especie) se encuentran intercaladas secuencias polimórficas de longitud constante (20 a 58 pb dependiendo del CRISPR) que se denominan "espaciadores". Se han encontrado hasta 20 loci CRISPR diferentes dentro de un solo cromosoma. La figura 1 describe uno de los CRISPR identificados en Streptococcus thermophilus CNRZ1066.

Por ejemplo, el genoma de S. thermophilus LMG18311 contiene 3 loci CRISPR. Las secuencias repetidas de 36 pb son diferentes en CRISPR1 (34 repeticiones), CRISPR2 (5 repeticiones) y CRISPR3 (una única secuencia); sin embargo, se encuentran perfectamente conservadas dentro de cada locus. Las repeticiones CRISPR1 y CRISPR2 se encuentran, respectivamente, espaciadas por 33 y 4 secuencias de 30 pb de longitud. Todos dichos espaciadores son diferentes entre sí (aparte de excepciones menores: unos pocos espaciadores pueden encontrarse presentes dos veces dentro de un locus CRISPR dado). También son diferentes de los observados en otras cepas, tales como CNRZ1066 (41 espaciadores dentro de CRISPR1) o LMD-9 (16 espaciadores dentro de CRISPR1 y 8 dentro de CRISPR3), que son cepas de S. thermophilus que presentan genomas muy similares.

Aunque la función biológica de los loci CRISPR es desconocida, se han propuesto algunas hipótesis. Por ejemplo, se ha propuesto que podrían encontrarse implicados en la unión del cromosoma a una estructura celular, o en la replicación cromosómica y en la distribución de replicones, aunque no se ha informado de ninguna demostración experimental que confirme estas hipótesis.

Generalmente los loci CRISPR son inmediatamente contiguos a un grupo de 4 a 7 genes que se han denominado genes cas (asociados a CRISPR) (Jansen et al. 2002b). En la actualidad no se ha asignado ninguna función fisiológica clara a las proteínas Cas, aunque, para algunas de ellas, la presencia de motivos proteicos particulares sugiere que podrían actuar como una ADN girasa o como una ADN polimerasa. Estas agrupaciones de 4 a 7 genes cas, originadas de diferentes loci dentro de un genoma dado u originadas de diferentes microorganismos, pueden distinguirse y agruparse en diferentes tipos basándose en la similitud entre secuencias. Uno de los resultados principales en el contexto de la presente invención es que un conjunto dado de genes cas siempre se asocia a una secuencia repetida dada dentro de un locus CRISPR particular. En otras palabras, los genes cas [o las proteínas Cas] aparentemente son específicos para una repetición de ADN dada, implicando que los genes cas [o las proteínas Cas] y la secuencia repetida podrían formar una pareja funcional. Los análisis de gráficos de puntos indican que las agrupaciones y los grupos obtenidos al analizar las secuencias de las proteínas Cas son similares a las obtenidas al analizar las repeticiones CRISPR (tal como se muestra en la figura 2).

En S. thermophilus, una especie bacteriana para la que se han secuenciado varios genomas fágicos, los espaciadores de 30 pb con frecuencia son idénticos al ADN fágico (figura 3). Esta observación también se ha realizado para las secuencias de espaciadores de muchos otros géneros y especies de bacterianas para las que se conocen las secuencias de ADN fágico. Además, se ha mencionado anteriormente en por lo menos dos publicaciones recientes (Pourcel et al. 2005; Mojica et al. 2005). Por otra parte, la ausencia de una similitud de secuencias significativa para el resto de secuencias de espaciador podría explicarse por el hecho de que únicamente se encuentran disponibles actualmente unos pocos genomas fágicos. Basándose en similitudes de secuencias de ADN muy altas entre algunos espaciadores de CRISPR y secuencias de bacteriófagos, se propone que la especificidad de los espaciadores de CRISPR participa en la determinación del lisotipo de cepa. En apoyo de la propuesta de un efecto de las secuencias de espaciador de CRISPR sobre la inmunidad bacteriana frente a bacteriófagos, se encontró una proporción significativa de apareamientos de espaciadores con secuencias de genoma bacteriofágico dentro de genes probablemente implicados en la especificidad de huésped (ver la figura 3). Otra hipótesis sería que las secuencias de espaciador son reconocidas por la bacteria como ADN foráneo. De esta manera, la bacteria podría eliminar la molécula de ácido nucleico que porta dicha secuencia en el momento en que entra en la célula. Un argumento que apoya esta idea es la peculiar estructura deducida de CRISPR. En efecto, se propone que los elementos repetidos proporcionan una característica estructural, mientras que los espaciadores que contienen la secuencia proporcionan inmunidad específica contra ácidos nucleicos entrantes. Las repeticiones palindrómicas presentan el potencial de formar estructuras de horquilla (tallobucle) muy estables (ver la figura 4) y se encuentran separadas por espaciadores cuya tamaño corresponde a aproximadamente 3 vueltas de la hélice de ADN (aunque puede variar entre 2 y 5). De esta manera, cualquier locus CRISPR podría encontrarse altamente estructurado en una serie de horquillas de ADN uniformemente espaciadas.

Ventajosamente, el lisotipo de una cepa bacteriana dada puede modificarse mediante la generación natural de derivados resistentes (mutantes insensibles a bacteriófagos) o mediante manipulación genética. Específicamente, pueden diseñarse soluciones de manipulación genética mediante, por ejemplo, adición, deleción o modificación de las secuencias de espaciador o incluso de un locus CRISPR completo.

Entre los ejemplos de aplicaciones de la presente invención se incluyen, aunque sin limitación:

(i)

Resistencia a fagos. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR particulares derivados de ADN de bacteriófago, dentro de un locus CRISPR de huésped bacteriano con el fin de proporcionar resistencia frente a dicho bacteriófago particular, impidiendo de esta manera el ataque fágico. Además, pueden ser dianas regiones particulares dentro del genoma fágico (proteínas de especificidad de huésped) que proporcionan el reconocimiento de fago particular-huésped, o que se encuentran altamente conservadas dentro del ADN fágico, tales como secuencias de los genes de helicasa o primasa, proteínas estructurales de cabeza y cola, o proteínas con dominios conservados (por ejemplo helicasa, holina, lisina y otras) o secuencias conservadas entre genes fágicos importantes.

(ii)

Resistencia a la transferencia de plásmido. Los espaciadores de CRISPR particulares derivados del ADN de elemento genético móvil pueden ser añadidos en un locus de CRISPR bacteriano para proporcionar resistencia contra este plásmido particular, previniendo así la transferencia de ADN extraño en el microbio. Específicamente, las regiones particulares en el ADN de plásmido pueden ser direccionadas para proporcionar inmunidad contra el ADN de plásmido, tales como las secuencias dentro del origen de replicación de plásmido.

(iii) Resistencia a elementos genéticos móviles. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR particulares derivados de ADN de elemento genético móvil dentro de un locus CRISPR bacteriano de manera que se proporcione resistencia frente a elementos genéticos móviles, tal como elementos trasponibles y secuencias de inserción, impidiendo de esta manera la transferencia de ADN foráneo y la deriva genética. Específicamente, pueden ser dianas regiones particulares dentro de trasposones y secuencias de inserción de manera que se proporcione inmunidad frente a elementos genéticos móviles. Por ejemplo, entre las dianas pueden incluirse trasposones conjugativos (Tn916), trasposones de clase II (Tn501) o secuencias de inserción (IS26).

(iv)

Resistencia a genes de resistencia a antibióticos. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR particulares derivados de genes codificantes de resistencia a antibióticos, dentro de un locus CRISPR bacteriano con el fin de impedir la transferencia de genes que proporcionan resistencia a antibióticos en el huésped

bacteriano, reduciendo de esta manera el riesgo de adquisición de marcadores de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, entre las dianas pueden incluirse vanR, un gen que proporciona resistencia a la vancomicina, o tetR, un gen que proporciona resistencia a la tetraciclina, o inhibidores de la beta-lactamasa.

(v)

Resistencia a genes codificantes de factores de virulencia. Pueden añadirse espaciadores de CRISPR particulares derivados de genes codificantes de factores de virulencia, dentro de un locus CRISPR bacteriano con el fin de proporcionar resistencia frente a la transferencia de genes que proporcionan virulencia a la bacteria. Por ejemplo, pueden ser dianas los factores que contribuyen comúnmente a la virulencia en patógenos microbianos, tales como toxinas, internalinas y hemolisinas.

(vi)

Diagnósticos. Los espaciadores de CRISPR dentro de una bacteria particular pueden detectarse o secuenciarse con el fin de predecir/determinar la sensibilidad probable de microbios particulares a bacteriófagos, y de esta manera utilizarse como modo de predicción del lisotipo para la selección microbiana.

(vii) Resistencia a secuencias nuevas. Pueden sintetizarse de novo secuencias de espaciador nuevas, manipuladas e integradas en un CRISPR dentro de un huésped bacteriano seleccionado con el fin de proporcionar resistencia a una secuencia nueva e idéntica particular presente en una molécula de ADN infecciosa.

Debido a que los CRISPR se encuentran ampliamente distribuidos entre especies bacterianas, las aplicaciones anteriormente mencionadas podrían utilizarse en una amplia diversidad de organismos. Se han descrito loci CRISPR en varias bacterias Grampositivas (incluyendo bacterias del ácido láctico) y Gram-negativas. De esta manera, los loci CRISPR asociados a genes cas pueden utilizarse para caracterizar/modificar el lisotipo de cepa y generar resistencia a un ácido nucleico en un amplio abanico de bacterias. Además de las aplicaciones potencias para la resistencia a fagos, se ha mencionado en la literatura que las secuencias de CRISPR muestran cierta homología con elementos genéticos móviles, tales como plásmidos y trasposones (Mojica et al. 2005).

En un aspecto adicional, se proporciona la utilización de una combinación de un locus CRISPR y uno o más genes cas para proporcionar resistencia frente a un ácido nucleico definido.

Apropiadamente, el ácido nucleico es ADN.

Apropiadamente, el ácido nucleico es ARN.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un fago.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de plásmido.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un elemento genético móvil.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un trasposón (Tn).

5 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una secuencia de inserción (IS).

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de elementos genéticos diana no deseables. 10 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de un gen de resistencia a antibiótico.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir 15 de un factor de virulencia.

Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una isla de patogenicidad.

20 Apropiadamente, el ácido nucleico es derivable (preferentemente derivado) a partir de una secuencia nueva, con el fin de proporcionar resistencia frente a entidades portadoras de dicha molécula particular.

En un aspecto adicional se proporciona la utilización de CRISPR para la 25 identificación y tipado.

En un aspecto adicional se proporciona la utilización de uno o más genes cas y uno

o más elementos CRISPR (por ejemplo una o más repeticiones CRISPR y/o espaciadores

de CRISPR) para modular la resistencia en una célula frente a un ácido nucleico diana o 30 un producto de transcripción del mismo.

TABLA 1

Fago 2972

Fago 858

Cepas

BIM en1 Sensibilidad al fago2 Homología de fago-espaciador3 Sensibilidad al fago 2 Homología de fago-espaciador3

DGCC7710

- S Ctrl S Ctrl

DGCC7778

858 s > 10 SNP R 100% (2 espaciadores)

DGCC7710-RH1

858 R 100% R 100%

DGCC7710-RH2

858 R 100% R 100%

DGCC7778RT

858 S > 10 SNP S 100% pero no próxima a cas

DGCC7778RT’

858 S > 10 SNP S Sin espaciadores

DGCC7778cas1

858 S > 10 SNP S 100% (2 espaciadores) pero cas1 KO

DGCC7778cas4

858 S > 10 SNP R 1,00% (2 espaciadores) pero cas4 KO

DGCC7710-R2

2972 R 100% (1 espaciador) S 5 SNP

DGCC7710-R2S1S2

2972 S 100% pero no próxima a cas R S1S2 es 100% idéntica al fago 858

1 Fago utilizado para generar mutantes insensibles a bacteriófagos (BIM)

2 Sensibilidad a fagos de la cepa, S = sensible, R = resistente según se determina mediante ensayos de mancha y de plaqueo.

3 Homología entre el nuevo espaciador del mutante y la secuencia de ADN del fago utilizado para generar el mutante

Los fagos retuvieron la capacidad de adsorberse a los mutantes.

REFERENCIAS
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Jansen R, Van Embden JDA, Gaastra W, & LM Schouls (2002b). Identification of genes that are associated with ADN repeats in prokaryotes. Molecular Microbiology 43:1565-1575
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Mojica FJM, Diez-Villasenor C, Soria E, & G Juez (2000). Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Molecular Microbiology 36:244-246
Mojica FJM, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, & E Soria (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of Molecular Evolution 60:174-182
Pourcel C, Savignol G, & G Vergnaud (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis aquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage ADN and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 151:653-663
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5 Mongodin EF, Hance IR, DeBoy RT, Gill SR, Daugherty S, Huber R, Fraser CM, Stetter K, & KE Nelson (2005). Gene transfer and genome plasticity in Thermotoga maritima, a model hyperthermophilic species. Journal of Bacteriology 187:4935-4944
Peng X, Brugger K, Shen L, She Q, & RA Garrett (2003). Genus-specific protein 10 binding to the large clusters of ADN repeats (Short Regularly Spaced Repeats) present in Sulfolobus genomes. Journal of Bacteriology 185: 2410-2417

(a)

SECUENCIAS

(b)

(I) REPETICIONES CRISPR

(a)

SEC ID nº 1

36 ADN

(b)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC

(c)

SEC ID nº 2 36 ADN

(d)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTATTCTGAAGATTTAAGTAACTGTACAGT

(e)

SEC ID nº 3 36 ADN

(f)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAGT

(g)

SEC ID nº 4 36 ADN

(h)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACCGTACAAC

(i)

SEC ID nº 5 36 ADN

(j)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTGCAAC

(k)

SEC ID nº 6 36 ADN

(l)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAGCTGTACAGT SEC ID nº 7 36 ADN

(m)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATATAAGTAACTGTACAAC

(n)

SEC ID nº 8 36 ADN

(o)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATCTAAGTAACTGTACAAC

(p)

SEC ID nº 9 36 ADN

(q)

Streptococcus thermophilus GTTTTTGTACTCTCAAGATGTAAGTAACTGTACAAC

(r)

SEC ID nº 10 36 ADN

(s)

Streptococcus thermophilus GTCTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAC

(t)

SEC ID nº 11 36 ADN

(u)

Streptococcus thermophilus AAAAAAGTCCCCTCTCGAGGTAATTAGGTTTATATC

(v)

SEC ID nº 12 36 ADN

(w)

Streptococcus thermophilus GTTTCCGTCCCCTCTCGAGGTAATTAGGTTTATATC

(x)

SEC ID nº 13 36 ADN

(y)

Streptococcus agalactiae GTTTTAGAGCTGTGTTGTTTCGAATGGTTCCAAAAC

(z)

SEC ID nº 14 36 ADN

(aa) Streptococcus agalactiae, GTTTTAAAGCTGTGCTGTTATTATGCTAGGGCACCA
(bb) SEC ID nº 15 36 ADN
(cc) Streptococcus agalactiae GTTTTAGAGCTGTGCTGTTTCGAATGGTTCCAAAAC
(dd) SEC ID nº 16 36 ADN
(ee) Streptococcus agalactiae GTTTTAGAGCTGTGCTGTTATTATGCTAGGACATCA
(ff) SEC ID nº 17 36 ADN
(gg) Streptococcus mutans GTTTTAGAGCCATGTTAGTTACTGATTTACTAAAAT
(hh) SEC ID nº 18 36 ADN
(ii) Streptococcus pyogenes GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAAC
(jj) SEC ID nº 19 36 ADN
(kk) Streptococcus pyogenes GTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCTCCATTC
(ll) SEC ID nº 20 ADN
(mm) Streptococcus pyogenes CTTTCAATCCACTCACCCATGAAGGGTGAGACG
(nn) SEC ID nº 21 33 ADN (oo) Streptococcus pyogenes ATTTCAATCCACTCACCCATGAAGGGTGAGACT
(pp) SEC ID nº 22 33 ADN
(qq) Streptococcus pyogenes ATTTCAATCCACTCACCCATGAAGGGTGAGACC
(II) CRISPR SPACERS
SEC ID nº 23 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGAACGTATTCCAAAACCTCTTTACGATTA
SEC ID nº 24 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAACTGTTATCAAAATGATAAGATAGTCT
SEC ID nº 25 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTTGATGTTTATTCAAGTAAAATAATTAA
SEC ID nº 26 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCTTTCACGGGTAGCACACTAACATACAC
SEC ID nº 27 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTTGGCAATGCAAACAACCTTTATGAACCG
SEC ID nº 28 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTATTTCCTTGCGATAACGTTCCACCTTT
SEC ID nº 29 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGATTATAAGGAACACAACCAACTATATAG
SEC ID nº 30 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACGACATCAAGCTGATTGTCTTCTACATAA
SEC ID nº 31 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGGAATACTGAATGTTTTACTGAAAATC
SEC ID nº 32 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACACCACTATCTTTTCCTCCTGAAAATGAA
SEC ID nº 33 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTAATTCCACGAAATTATCAACCTTATGCA
SEC ID nº 34 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGGAGGATTGCCCCATATTCCCAAGAGT
SEC ID nº 35 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAGACGCGTTAAATATAGAAATGCAAGATT
SEC ID nº 36 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTAACGTCATCAGTCCACCGCCTTAAAT
SEC ID nº 37
ADN
Streptococcus thermophilus
CACCTCTTTCGATGGAAAGGTATCCTTCTA
SEC ID nº 38 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GACCAAAGTTTGATTATAGAGCTATACACC
SEC ID nº 39 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACCATCATTCTTACCATTACAACTGTAATG
SEC ID nº 40 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATACGAATTCGGTTCGCACAATTACAATTC
SEC ID nº 41 32 ADN
Streptococcus thermophilus
TATCAACGCAATCATTACAACAACTTCAAACA
SEC ID nº 42 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATCTACGTGTCAATACATATCACAAAACAG
SEC ID nº 43 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTTTAGAAATTTCTGATATAATAATGA
SEC ID nº 44 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGTTGGAACAAGGACGACTTGGTAAACTA
SEC ID nº 45 ADN
Streptococcus thermophilus
CATATTAAGCTGACTGGGCCTAATGCTTTT
SEC ID nº 46 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTCATAGCATACCGTAGTTGTAAAATCTAT
SEC ID nº 47 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATTTAGGGAATGAAATTGATAAGACTG
SEC ID nº 48 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATGAGAAACTGTAGAAAACAAGCAATA
SEC ID nº 49 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGTGAAGATGGCAGTCATAAATGGCACATT
SEC ID nº 50 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGGGTTGAAAAATGTTGGTATATCAAACG
SEC ID nº 51 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTCTGGTAGTGGATTTAGTCAAACAGATGT
SEC ID nº 52 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCATAGAGCGTCTTAAACAAAGAATAGTC
SEC ID nº 53 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTATGATTGAATGACATGGTTGTATAAGTA
SEC ID nº 54 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTCTTTAGGAATACCAGGGAGTTCAGCTT
SEC ID nº 55 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGCAGAGATTACACAGCAACGGAAACAGC
SEC ID nº 56 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GGGTATCATTGTATCTAGTGATGGACCTGA
SEC ID nº 57 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTGAAAAATGCACAACAGCGTTTGATAG
SEC ID nº 58 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAGCTACCAGCTACCCCGTATGTCAGAGAG
SEC ID nº 59 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTTCCTTTTTTCAAGGTAATCTTTGAAAG
SEC ID nº 60 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGTCCGTAAGCACCAGTTCCAATCGTCAT
SEC ID nº 61 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGAATACCAATGCCAGCTTCTTTTAAGGC SEC ID nº 62 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACCTCATACATGGGGAAAATTGGTAAGTA
SEC ID nº 63 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACTTCATTAGTGTAGTTGTAATTAGCAT
SEC ID nº 64 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAGCTACCCAAATATCTTCTGTTTTCCAA
SEC ID nº 65 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAGTTTTCAATATTGGCACAGGAGACAATT
SEC ID nº 66 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGATACTATTTTAGTCAGATATGAAATATC
SEC ID nº 67 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TCATCAATGTTTAAAGCCCAACAATACATGA
SEC ID nº 68 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGATTTAATCAGTAATGAGTTAGGCATAA
SEC ID nº 69 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGGAAAATAGCATGAGCGTACAACAATCTA
SEC ID nº 70
ADN
Streptococcus thermophilus
TGTCTATCACGCTTCCTAAGTGCATGAAAA
SEC ID nº 71 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGTCACCAATCACTAAAGAACCTACGCTG
SEC ID nº 72 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATCTTCCTCTCCGATTGCAAATAGTGC
SEC ID nº 73 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CATATTTGGTGCCCGTTCGATAAAGAGTA
SEC ID nº 74 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATTAAATCGCTTGAAGCAGACATTGAAGC
SEC ID nº 75 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GACTTATCTTGGAAGGTAGTGAAGGCACTT
SEC ID nº 76 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCTTGCCATCTGCACTGTAAGCCCAAGCA
SEC ID nº 77 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGTACGCATAATCAATTCATCAAGCTTGA
SEC ID nº 78 ADN
Streptococcus thermophilus
GTAGTGACCCAAAATTCTATGACCTTGAAA
SEC ID nº 79 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGATTGTGGTGCTTACGGAAAATTCCTTGT
SEC ID nº 80 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGCAAGAAGTGTAAGAGATGCAATGGATA
SEC ID nº 81 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTATTATCATTATTCTTCTTCCCAAGCGT
SEC ID nº 82 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTATAGAATTTGGTGGTGAACTTTTCA
SEC ID nº 83 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AATGGGTCACAGATTGCCATAATAAGGAG
SEC ID nº 84 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCGAGGTCACTTTAGAACCCACAAAATAAG
SEC ID nº 85 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGAGAGAACACAGTATAGACCCTGATACA
SEC ID nº 86 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGTATTAATGAGGTTTGGGTGGTCATTCC
SEC ID nº 87 31 ADN
Streptococcus thermophilus
CCATACTCTCTATCAGTTCATTTAATTCTTC
SEC ID nº 88 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAATATGTCGCTCTACTGATTCCAAAACGG
SEC ID nº 89 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGAATTACATTCATGATTTTATCGAGTTT
SEC ID nº 90 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTGCCATTGTTTCGGTCGGACGTGGGCA
SEC ID nº 91 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTTCTAAGTTGAATTAAATTCAAGTTTTG
SEC ID nº 92 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCGCTACTATGGTTAACGATGAGGAACTCT
SEC ID nº 93 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGCAACTTTAAAACTAAAAGAGCTACTTGA
SEC ID nº 94 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAACCCTACACAGTGTGTGAGATGTGTCA SEC ID nº 95 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATGGGTCACAGATTGCCATAATAAGGAGG
SEC ID nº 96 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTTTAAAATCCGTCATGCTATACTATAT
SEC ID nº 97 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATTCAAACTTTCTCCAATAATACCCTCCA
SEC ID nº 98 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATGCTTTCAGTTAATAAGACGTGGGACTA
SEC ID nº 99 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGAAGGGGTGTCTAGTGAAGAAATTGTCG
SEC ID nº 100 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTCGAAGCGCTTCATTGCCCTATTCCTTTC
SEC ID nº 101 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGTCTAAGGTATCCACTCGTGAAATCAT
SEC ID nº 102 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATTAATGGAAATTTCATTCAAACGCAGT SEC ID nº 103 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGAGAGTTTATATCCTGATGGAATCGATG
SEC ID nº 104 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGCGAATTAGAGAGCCAATGGCAAGCAAG
SEC ID nº 105 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGAAGACCAATAAACTTGAGAAAAAGCAAG
SEC ID nº 106 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGGTCGTTTAATTGTTAATGTCAAAGC
SEC ID nº 107 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAATTGATTCTAAAATGCTTGGTACACGTA
SEC ID nº 108 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTTCGTGTTATCACAGCTTCTACACGTTG
SEC ID nº 109 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAATCTCATTGAAACCAACTTCAAGACCA
SEC ID nº 110 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTTGGTAGTTGATGCACTGCATTAGTAA
SEC ID nº 111
30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATGTACCGGAATAGCGTTACATTGCACAT
SEC ID nº 112 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTCATAAATTCTCACTTTTCCTTGCTATTC
SEC ID nº 113 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTCGAAAAAATTACCTAGTCACGACAGAC
SEC ID nº 114 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAACAATTACTTATGCATTAGGAACATCTG
SEC ID nº 115 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATTCGTGAAAAACAATAAAAACAAAAAAA
SEC ID nº 116 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACATTTCTGTCCATTTCTTCCTTGATGC
SEC ID nº 117 28 ADN
Streptococcus thermophilus
CAAGGCAACTCAACCAACCAAATTGACC
SEC ID nº 118 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTAAAATCGTAAATGGTAAGTTGCACGATG
SEC ID nº 119
ADN
Streptococcus thermophilus
AACGTAAGGAGTTTTTTTATTTCTTTGTTA
SEC ID nº 120 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTGGAAAATTTCACACCCTACATATATCAA
SEC ID nº 121 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCTCTGCTAATGACTTAAACGGCTCGTTTT
SEC ID nº 122 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAATCAAAGTTTTGGGTTTGTCTACGTTG
SEC ID nº 123 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATGTACATACCTAAAGAAAACACGGGCA
SEC ID nº 124 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTTGTCAAAATATGTGATTACTTTGTATT
SEC ID nº 125 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCATAGCTGTAATGTTGTTTGTGACTGCTT
SEC ID nº 126 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGCTAAGTTTGGCTTTAAGTATAACAAGCT
SEC ID nº 127 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAGTACGCTTCAAGGCAGGTTGAAGACAT
SEC ID nº 128 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTTTTAACGTGTTAGCGTGTTTAGCTTTG
SEC ID nº 129 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGGCTTCGTGAATAATTTTTAAAACGCAT
SEC ID nº 130 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTTGAATCAATACGCTGAAACACACTCCC
SEC ID nº 131 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTTATCAGTTGAAAGTTTCAACTCGTAAG
SEC ID nº 132 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAAACTAGTTGGCATCTATGCTCCAGGAAG
SEC ID nº 133 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGACCACCATAGCCGAGTTGTCTTTTTCG
SEC ID nº 134 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACATCCCACTTTCTGGGTTTTTTAGCCATG
SEC ID nº 135 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGTATGGCTATTGTCCTGATACTCATCCAC
SEC ID nº 136 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGCTCTTGACGTGGCTGGTGACATCTACGC
SEC ID nº 137 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAGTACATGGAGTTTCTGCTAGATACACTA
SEC ID nº 138 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TAAGTTATGAAATATAAAGTTATTGTCTA
SEC ID nº 139 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACGTTATGACATTTAGGAGCTTCCAAATT
SEC ID nº 140 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AACACAGCAAGACAAAAGGATGACACTTT
SEC ID nº 141 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAACCATAACTTAGGCATCAGGTACATCTG
SEC ID nº 142 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ACACGCGCTTACCTCGTATATCAAATTCA
SEC ID nº 143 30 ADN .
Streptococcus thermophilus
TGCCCGCAAACTAGCGATACACAACAGCAT SEC ID nº 144 31 ADN
Streptococcus thermophilus
CTCAAGCTCTTCATCTGTGATAGGTGTTTTG
SEC ID nº 145 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATCACTCTTTGATAGTATCTCAAACGCTGG
SEC ID nº 146 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAACAGTCAGACCAGCTAATTCGCCAATT
SEC ID nº 147 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATTTCGAAAGATACAAGGACACTTACAC
SEC ID nº 148 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCGGATGAAACACAACTTCAATTGTATTCA
SEC ID nº 149 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAATGCTACATCTCAAAGGATGATCCCAGA
SEC ID nº 150 31 ADN
Streptococcus thermophilus
ACGTCTGTCTAACTGGAAAGTACCTGCTAAT
SEC ID nº 151 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGTTCTCTAATCGAGAGGCGCGTGATTGA SEC ID nº 152 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAACCTCACTAGTCACTTAGTGCGGTTAGG
SEC ID nº 153 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTAAGTTTAGTCCCAGGTTTCTTATCGT
SEC ID nº 154 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAACCAATAAACATACCGATTGCTGCCAAT
SEC ID nº 155 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCAAACGTTAGCCCAGGAAAGCATCATGAA
SEC ID nº 156 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGAGCAAAAAATAACTCTAGCTCTCGTCC
SEC ID nº 157 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGAAACCTCTAAGTTGAGCATTTAATGAT
SEC ID nº 158 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATAGTTTTAAACTTTCTTGACCTTCTG
SEC ID nº 159 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ACGTTGATGAATATTGTTGATAAACTTTA
SEC ID nº 160
30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAAGAAGTGAACAAAGTACACGCTGGAAGT
SEC ID nº 161 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GACAGCAAGATACACGTAGTTGATGAATTG
SEC ID nº 162 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAAGAAATCAACGCAGATTTTTAGCCAACA
SEC ID nº 163 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACCCAATAATTACAGTGAAGCACAATAG
SEC ID nº 164 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGGCGTAAGGTATGCTAATTATAACGAT
SEC ID nº 165 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCTATCGAACTAATAGCTTAGAGGAACTCA
SEC ID nº 166 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTGGAATATTAAGCCCGAATTGTTGCAGCA
SEC ID nº 167 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTGCAATATTTGCGTTTGGGAAACCTTC
SEC ID nº 168 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTCTGTCTAACTGGAAAGTACCGGCTAAT
SEC ID nº 169 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAGAGATGTACCCATCCATTCTAACAGGT
SEC ID nº 170 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GGGGAGTTGATTTCTTACATCAAAACAATG
SEC ID nº 171 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATCAAAGTTGAAAAGGACTACAACAGCCC
SEC ID nº 172 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTAAATTTAGAGCGTGGGATCTTGAATAT
SEC ID nº 173 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATACCGATGGCACATCTGAAACTGGCTG
SEC ID nº 174 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACTCATATGTATCTTGACCAACTATTTT
SEC ID nº 175 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATAGCACCTCTAAGCGTTAATGGTATTC
SEC ID nº 176 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATATCTACAGGTCACTACAAAGCTACGCT
SEC ID nº 177 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTTGGGGTGTGTTTGTAACGGCGTATGCTA
SEC ID nº 178 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCAATCAGGTGACGGTGATGCTTATATTAA
SEC ID nº 179 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATACATGATAGTTTGTCAACACTTTTGAT
SEC ID nº 180 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCAGCATTTGGTTTACATGACCCACGTCTG
SEC ID nº 181 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAATCAACAGGTTTGACTGATTATAACGGT
SEC ID nº 182 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGCTACACATGAATTTTATTACAATGGTG
SEC ID nº 183 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATG
SEC ID nº 184 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAAAAAAGGGCCTTTCTCTAAATCAAGTA SEC ID nº 185 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTGAACGTATCTGTCCACTGTGTGGCCA
SEC ID nº 186 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCGTTCTTCAAACGTTAAATTCCAAGGTGT
SEC ID nº 187 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCTGCGATTATGACAATGCTGTCTGTAAGG
SEC ID nº 188 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAGAATTTATTAATAAAGATGGTTCTGCT
SEC ID nº 189 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGGCAGAAAAGAAGTATTTTGGTAAGTATG
SEC ID nº 190 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGGTTTATCGACAAGAAAATGAAGCT
SEC ID nº 191 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCAAATTTGCATTATACAAAACGCTCCTTC
SEC ID nº 192 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATCCTAACTGCTTTGCTAACTACATCATGG SEC ID nº 193 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACAAGATAAGATTAGCGTCTTCAACAT
SEC ID nº 194 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAGCCTATGTTTGCCCACTTTGTGGAAG
SEC ID nº 195 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTCACTTTCTCTTTCTGGGTTGTGCCAAT
SEC ID nº 196 31 ADN
Streptococcus thermophilus
CATACTTTTCCATCTGTTTGTTGTTTGAAAA
SEC ID nº 197 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGAGAGTGTCTGATGGATTTATTGGCAGCC
SEC ID nº 198 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GGGGTTATTTTCCATTTTACCGTCTATCTA
SEC ID nº 199 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATCACGCCCATTTTCATTTCGCCATCTGT
SEC ID nº 200 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATTTTAATATAATTTCTAAATCTATTG
SEC ID nº 201
30 ADN
Streptococcus thermophilus
TACAAAATTCCTTCAAACGCTATTTATTGA
SEC ID nº 202 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AGAGTTTGAAAATTATTTTTCAGTTTCTA
SEC ID nº 203 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTCCTCATCTTTCTCCGCTTTTGCTAGCTT
SEC ID nº 204 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGAGCGTTCTAGTGTGTGGCTTGTAATGAA
SEC ID nº 205 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGAAAGAAATACAATACAACGATAATGACC
SEC ID nº 206 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTAGTTTTAAGAGATAGCTCTCTAAGTAGG
SEC ID nº 207 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATTCGACATAAGCACTACAGTTATATT
SEC ID nº 208 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTATTTTCGAGAGAACGTCAGTCATTTTAA
SEC ID nº 209 ADN
Streptococcus thermophilus
GTGCTAACTATATCAGTCGCATCAATAACA
SEC ID nº 210 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAGCGGTGATTGGAATAGAATAAGCGAAT
SEC ID nº 211 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTCTACAGCAGTTTAAGACACATTATCAT
SEC ID nº 212 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTATCGAAAACGGCGATAATCCAACAGT
SEC ID nº 213 31 ADN
Streptococcus thermophilus
CAATACCTTTTTTTAATTCATCTTGATAAGT
SEC ID nº 214 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAAGAACAATATCATCAATACGACTTTCA
SEC ID nº 215 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATCTATCAAATTCAAATTCGGATAAACTA
SEC ID nº 216 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGAGAGTGTCTGATGGATTTATTGGTAACC
SEC ID nº 217 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ACCTCATACATGGGGAAAACTTGTAAGTA
SEC ID nº 218 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTTCACGAATTTCTACACTTTTCAACCT
SEC ID nº 219 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGAAACCTTGTTTTGAAGCGCTTGGAAGT
SEC ID nº 220 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTCAATTGATACTGCAATCTCTTTAACATT
SEC ID nº 221 31 ADN
Streptococcus thermophilus
ACTTCAATATGGTCAACATCTTGATCACCGA
SEC ID nº 222 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAAACTCGACAAAAGCACTACATGAATATT
SEC ID nº 223 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTTTTAAGGAAAGGAGGAAAATAATATA
SEC ID nº 224 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTTCAA.AACAGCGAAAACTTAACCCTAAC
SEC ID nº 225 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATTAAGTCGCTTGAGGCAGACATTGAAGC SEC ID nº 226 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCAAACTCAAATTGTCTATAATAATAACCG
SEC ID nº 227 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATCTCTATTTCAGGTGGTTTAAAACATTC
SEC ID nº 228 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAACGAAGATGGAAGGGTTGATGTTTATTC
SEC ID nº 229 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GATTGCATTTGCCAGTATTTCTTTTGATTA
SEC ID nº 230 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TGAAGACAACGGAAACAATCAACCTATTA
SEC ID nº 231 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACTTCTTTTTTAATGTCATCTAAGACAATA
SEC ID nº 232 30 ADN Streptococcus thermophilus GCCAATGATGTTCAATTCGTTAATGGAATT
SEC ID nº 233 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCAACATGGGATATTTCGTTGGTCAGGATG
SEC ID nº 234 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATGGCTCTCTTGTTGGAATAAAGATGATT
SEC ID nº 235 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAACATAGCAGTCTATTTCTTTGCTGATG
SEC ID nº 236 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTTACCACGCGCCCTACTGTATTAGTGGAG
SEC ID nº 237 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TACATACCCAAGGTTGTAAGTCGTTAAATT
SEC ID nº 238 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTAAGTAGTCAATATTCACTTCTGATAAC
SEC ID nº 239 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GATAGCAATAGCTTTCTTGACCTAAAAGAC
SEC ID nº 240 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAGGTCTGTAATTTCATTCCCTCGTAATCT
SEC ID nº 241 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAGGTTTCTCTAAACACATGCGGAATAT
SEC ID nº 242
ADN
Streptococcus thermophilus
GTCATAGTACCAAGCACAAATAACGTTAGT
SEC ID nº 243 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTGTATTTAGTAATGGTGATTTTTTAAATT
SEC ID nº 244 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATTCATTTTTTATATATCAATAAAACTTT
SEC ID nº 245 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GGGGATTCTTATTTCACTGTAGTTACGATG

SEC ID nº 246 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAAAAATTGATGTCACAATTAATAAAGGTG
SEC ID nº 247 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTATTTCTGACAATGGTTGAAATTGTGTTC
SEC ID nº 248 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATTAATTTATCGTAAGCAA
SEC ID nº 249 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACAAACTTATGAGAACGGTTGAACGGCTT
SEC ID nº 250 ADN
Streptococcus thermophilus
AGCCCGCTTATTGCTTCAGTTGGTTTATAT
SEC ID nº 251 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGAGCAACAAGAATGATTAACTCTAATGC
SEC ID nº 252 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGATGGATATCATTGATAAACTATACGA
SEC ID nº 253 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAACGAAAGCAATACCAATCGTGCTAAAGC
SEC ID nº 254 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTCCTATGGTCGATATTCGAACAGTCAA
SEC ID nº 255 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGGGGACAAGGACTTTGACCCAACAGAAG
SEC ID nº 256 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGAAACACCTAATGGTCTCTTAGAACCCGA
SEC ID nº 257 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGAAGTTAAAGACAACTTTGTTAAAGACT
SEC ID nº 258 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAAAAGCATCCATGATAGTGCTTAGACCT SEC ID nº 259 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGGAATGGTATAAAGAATACAAAGAAAACG
SEC ID nº 260 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CCAAGTATCACGCAAAGAAATCAACGAGA
SEC ID nº 261 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGACCTGTTTATCCTTGTTAACTAGAATAG
SEC ID nº 262 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGAGCACTAGCATACTGTTTAGTCCGAACG
SEC ID nº 263 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGGCAAGGTATTTGATCCAACAGAAGCCAA
SEC ID nº 264 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CATGATTTACAACCACGCGCTAGACCAAG
SEC ID nº 265 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACCTAGAAGCATTTGAGCGTATATTGATTG
SEC ID nº 266 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATTTTGCCCCTTCTTTGCCCCTTGACTAG SEC ID nº 267 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAATAGTTTACCAAATCGTCCTTGTTCCAA
SEC ID nº 268 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACCATTAGCAATCATTTGTGCCCATTGAGT
SEC ID nº 269 31 ADN
Streptococcus thermophilus
ACGTCTGTCTAACTGGAAAGTACCTGTTAAT
SEC ID nº 270 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTTATACTTTGGGTAATTACAAAATAG
SEC ID nº 271 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGAAAGAAATATTCTAGATATAGATATAA
SEC ID nº 272 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAACGACCAACACAACAACTAAAGTTACTG
SEC ID nº 273 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGATTATGGGTGTTAAACAAGGAGCTTATG
SEC ID nº 274 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGAGTGGTAAGTACAAATACGCAGGACTGA
SEC ID nº 275
30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTATTTCCTCCTTTCCTTAAAAAAATTAGA
SEC ID nº 276 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GGATGTATCTGTTGAAAGAGGTGTGTATAT
SEC ID nº 277 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATAGGTGAAAAATATGCAAGTCACACAAA
SEC ID nº 278 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAATGGCATTAAAAATTAACATAGGAATA
SEC ID nº 279 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATCAGCTCGTAAATGTTCGATAGACTCTT SEQ 280 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTCCATTAACGTATTTGACTTCACTAGCT
SEC ID nº 281 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGTTACCGATCCAAGAGCAGACATCATAC
SEC ID nº 282 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGAAGCGGTTAAATGCTTCAACTGAATAG
SEC ID nº 283 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATTGCTAAACATCTAAAAGACTTAACGGG SEQ 284 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GATGAAGATTTGACTGATGATAAAGAGAAA
SEC ID nº 285 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GACATCAGAAAGCAGTTTATAAATATTTTA SEQ 286 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGAATTTAACAACCTTGATTTTGATATC
SEC ID nº 287 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TGATACGGTCAAAGTTTTTCCACTAATAGCG
SEC ID nº 288 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGGTTTTCATTTCCTGAACCCCTAAGAGG
SEC ID nº 289 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGTTATTGAAAAACGCCAACATGATGAGT
SEC ID nº 290 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATAAGTCCTCCTATTAATATCCACAATA
SEC ID nº 291 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGCCTCAAGAGATCCTGCTTGTTGCCAAG SEC ID nº 292 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCCATAGTTTTAATGAGTCGGTTAACTTA
SEC ID nº 293 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTGTACTAAAAGTGTGCTAAGTTCATAAGG
SEC ID nº 294 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATATAGTGATTGTATCCAGCTGCGGCGTAG
SEC ID nº 295 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAGCAAATCGCGAGTATAAAGGATATA SEQ 296 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTAATTGATCTAGACACCCTATGAAATA
SEC ID nº 297 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACAGAGGAGAGAAACCATGGCTATTTTAGA
SEC ID nº 298 29 ADN
Streptococcus thermophilus
TGGCAGCAGTGAATTCGATGCCGAGCAAT
SEC ID nº 299 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCAAGGAATACCAGGTCCTAAAGGTGCCGA
SEC ID nº 300 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CTAAATGAACTACAACAACAGCTTGATGA
SEC ID nº 301 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TACCTTAACATTTTCGATATTTTTCAAATT
SEC ID nº 302 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGACTGCTTTTTTATCTGAATTGTAATT
SEC ID nº 303 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGTAACCTAAAGCTCTATCAAGCCTATTT
SEC ID nº 304 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGTCAAGCTGACAGACCTTGACAACAAATC
SEC ID nº 305 29 ADN
Streptococcus thermophilus
AGGCATAAATAACATTGATAACCCTAACA
SEC ID nº 306 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCCAACGAGGTCAAATATGTCAACGGCATT
SEC ID nº 307 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAATAGGAACTTCAAAGGTAATTTCTTTA
SEC ID nº 308 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTAGAGCAAGGAAAGCAGTACATCATTA
SEC ID nº 309 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGTAATCATTTTTAAATCAGGATTATCAA
SEC ID nº 310 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTAAATGTATCCTAGTATTTTTGTACTATA SEQID311 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCATCAGCCAACTGTATCGGCTACTTTCTA
SEC ID nº 312 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGCTCTTGGCGACTATCTCATGGAGCGTG
SEC ID nº 313 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AGGAAAAAACCCAAACAACCCAAAATGTTA
SEC ID nº 314 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTAATTCTGTCACCACGACTATATCGCCA
SEC ID nº 315 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATCTGTGTGGGAAGTAAAGATTGAAGATG
SEC ID nº 316 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAGTTTGTTAAGTCATACCCATTAAATTG SEQID317 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCCACATGATTACAAAGCCACGCAAGACCT
SEC ID nº 318 29 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAGACCAAAATTTGACAATGAGTCCTGC
SEC ID nº 319 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTATATTTAAGTTGTAAATGTTGCTTTTC
SEC ID nº 320 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCAGACATTGGCTCAACAAGTGATTATGAA
SEC ID nº 321 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTTCTCATAAATTGCCTTTCCTTTTTATG
SEC ID nº 322 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTATCAAACATCAAGGATTGTAGATGAGG
SEC ID nº 323 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTTCATTAGTAGCTTGATAAATGTTTCTA
SEC ID nº 324 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAAATACTATACTTTAAAAGAAATTTTAA
SEC ID nº 325 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTCCTCCGACATAATCTTTTGTCTTTCCG
SEC ID nº 326 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ACAAAAGCACTGCCACCTATAGAAGCATTT
SEC ID nº 327 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAACTTTATGCTATCCGTGTCAGTATAT
SEC ID nº 328 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTCAATGATTGAAAGCCCATAACTAACA
SEC ID nº 329 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTTCATAGTTGTTACGAAATGTTTGGCAT
SEC ID nº 330 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGATTTGCAATATGATGATATTGATGAATT
SEC ID nº 331 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTAGATGCTAGTCCTAAGACTGTAGAGAC
SEC ID nº 332 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GTAATCAAGCGTATATAAGTCAGGACTATC
SEC ID nº 333 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAACAGAAGGAGTAGGGGACGTAGGCGCG SEC ID nº 334 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTATTTGATAGGAATGTCAGTAATTTTTGA
SEC ID nº 335 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AACATTTCAGCGCTTACTTATCAATCTAAT
SEC ID nº 336 29 ADN
Streptococcus thermophilus
GTATTAGTAGGCATACGATTATGGAAGTA
SEC ID nº 337 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GATATATATATATATATTTATTTTAAATAT
SEC ID nº 338 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTGTCATAATAATTAAATCCAATAGGACTT
SEC ID nº 339 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAAATTTCTGTTGTGTTCTTAATATTAGC
SEC ID nº 340 30 ADN
Streptococcus vestibularis
GTACTTCAAAGGTTCTAACTACATAACACA
SEC ID nº 341 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TAAAACCAGATGGTGGTTCTTCTGATACTA SEC ID nº 342 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CATTTTCTTCAGTCAATTCGTTCTCAAGCG
SEC ID nº 343 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AAAGGACGGGGGCAATGAACAAACGACAAC
SEC ID nº 344 29 ADN
Streptococcus vestibularis
TAATATCATTGATAGCTTCATCAAAGGCT
SEC ID nº 345 29 ADN
Streptococcus vestibularis
TAAATTGTTCCTTGACTCCGAACTGCCCT
SEC ID nº 346 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AAACAATCGTTTATCTATCCTCAAAGGATG
SEC ID nº 347 30 ADN
Streptococcus vestibularis
ATAAAAAAACGCCTCAAAAACCGAGACAAC
SEC ID nº 348 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TGGAAATCCCTTATATCGACAAATACGTTA
SEC ID nº 349 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TTCCCAGTCGTTGATTTTTATTGAATACCC
SEC ID nº 350
ADN
Streptococcus vestibularis
GGACATCGAACAAGTCAATGCCGTAAGCTT
SEC ID nº 351 30 ADN
Streptococcus vestibularis
AATCTTTAACCGGATTGTAGAACCGTTCGG
SEC ID nº 352 30 ADN
Streptococcus vestibularis
TGCCTTTAAAATAACTAGATTTTACCATCA
SEC ID nº 353 29 ADN
Streptococcus vestibularis
GAGCAAGCACAAGCAAGCTTTACTATCCT
SEC ID nº 354 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CAGATTGGTTTATCGAACAAGGTCGCAAGT
SEC ID nº 355 31 ADN
Streptococcus vestibularis
CAAAAGCTGTTGGTTAACGGTGCTTTGGGCA
SEC ID nº 356 30 ADN
Streptococcus vestibularis
CTTGTTTTTCCTCTGGGGTCTCTGCGACTT
SEC ID nº 357 30 ADN
Streptococcus vestibularis
GAAATAAACTGCCCAAACATTTTTATTTTC
SEC ID nº 358 ADN
Streptococcus vestibularis
TGAGTAAGCGACAAGCTAGAAATCAAGTCA
SEC ID nº 359 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAGCTAAGATGGAAGAAGCATCAAGCACC
SEC ID nº 360 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAGTATCTCAAACGCTGGATACAACAAGAT
SEC ID nº 361 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCTACTCAGTGGACACCTGCAATTGAAGAC
SEC ID nº 362 29 ADN
Streptococcus thermophilus
CGATTGGAACGGGTGCTTATGGCCTTAAC
SEC ID nº 363 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCGAACAATTGAATTTGTTAGAAAATGTCG
SEC ID nº 364 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAAGCATTTATTAATATAGATGGTTCTGCT
SEC ID nº 365 28 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTGACGTATCTGTCCACTGTGTGCCA
SEC ID nº 366 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTTATACTTTGGGTAAATTACAAAATAG
SEC ID nº 367 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TCAAGGTGTCGCCTTATGGAAAAGATGCTTG
SEC ID nº 368 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TGTAAAAATTTCTAGACGTTTAGACACTTTA
SEC ID nº 369 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGATGATTGAATGCTTGAGATAGCAGT
SEC ID nº 370 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AATAAGAAGTTCTTGACGACCAACCGACAT
SEC ID nº 371 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCGTCAACGTCGATACAGAACAACGTGCTT
SEC ID nº 372 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TGATTAGCAAATTTAAAACAGGATATTTGG
SEC ID nº 373 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAGACAAGCCCAAGGGATTGAACTAGCAA
SEC ID nº 374 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGAACAGTTGGCGAGAAATCCGTCTGGCGT SEC ID nº 375 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTACATTATTGATCATGTTTTTTCTCCTGT
SEC ID nº 376 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGAAGGCTCTGGAAATACAAAGCAATTCT
SEC ID nº 377 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGAAGGCTCTGGTAAATACAAAGCAATTCT
SEC ID nº 378 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TCTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 379 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 380 31 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTTGATGGCTCTTGGTAGGGAACTGGATAT
SEC ID nº 381 29 ADN
Streptococcus thermophilus
ACAGAACAAAATGGTAGAATATATCATCT
SEC ID nº 382 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCCTGGACAAGCTATCAGCACATATCCTTG SEC ID nº 383 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CGCTGTTGATGTAACCCGCTTTATATATAT
SEC ID nº 384 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GAATGAATGTATTAGAGCAAGCACTTGACC
SEC ID nº 385 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TAGACGAAAAGGAAGGAAAATAGCATGAGC
SEC ID nº 386 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATAACTCGATTGCTAACTTAAGCAAGCAGT
SEC ID nº 387 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTGCATGTGTAACCATGACTTCTTCGTCGT
SEC ID nº 388 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTCGCTGGAAACTTCGTAGTCATACATAC
SEC ID nº 389 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGACCGCTGTACTGGTTGGTATTCGTACC
SEC ID nº 390 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAACCAAGCGAACACAGCAGTAGCACCGCA
SEC ID nº 391
29 ADN
Streptococcus thermophilus
ATGATGATGAAGTATCGTCATCTACTAAC
SEC ID nº 392 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CTTCACCTCAAATCTTAGAGATGGACTAAA
SEC ID nº 393 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAAAGGTGCGTATGAAACTCATCCCAGCGG
SEC ID nº 394 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGGGTTTAAGTCCTTCATAGAGTGGAAAA
SEC ID nº 395 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCTCAAAGCTTAAAATTGGGCTGAAGTAGA
SEC ID nº 396 30 ADN
Streptococcus thermophilus
GCAATTTATTCGCTTGATGTACTCACGTTT
SEC ID nº 397 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTTATTGCAAATGGTTACCATATTTTTA
SEC ID nº 398 30 ADN
Streptococcus thermophilus
TATTTTAGCACTACGGTATCAGCGTATCTC
SEC ID nº 399 ADN
Streptococcus thermophilus
TGCTACGTGCTCTGGACGGGCGCTATCAGC
SEC ID nº 400 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAATGAACAGACAAGAAGCAACAGAAATTG
SEC ID nº 401 30 ADN
Streptococcus thermophilus
AAGTTGATCGTATCTATTTAGAATATCGCA
SEC ID nº 402 30 ADN
Streptococcus thermophilus
ATTCACTTTGACAGATACTAATGCTACATC
SEC ID nº 403 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTATATGTTAA
SEC ID nº 404 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CATAGTATAGCCGTCTTCTTTGATTGATTG
SEC ID nº 405 30 ADN
Streptococcus thermophilus
CCATGGGTGCTAAAGGTGATGACTACCGCT
SEC ID nº 406 36 ADN
Streptococcus thermophilus
TTTCTAGGAATGGGTAATTATAGCGAGCTAGAAAGC
SEC ID nº 407 38 ADN
Streptococcus thermophilus
AGTTGGGAAGGTCTTGGAAAATCTATGGCAAAAAACCT
SEC ID nº 408 35 ADN
Streptococcus thermophilus
TATATGGTTCAAATGCGATTCAAAGACTATTCAAA
SEC ID nº 409 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAATTGCCAATGCTTACAATATCTTCGTCA
SEC ID nº 410 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATGTTCTGAATTACCTTTCTCGACACTCCG
SEC ID nº 411 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACCATCAAGGCTCTTATCTGCAGATTGTTA
SEC ID nº 412 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAATGGTTGCCAATGACTTTCTAGAGTGAT
SEC ID nº 413 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACAAAATCTTTTGTTGCTCCTGGACGTATT
SEC ID nº 414 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATGTAAGGTATTGTAAAACTTCTTCTTGCG
SEC ID nº 415 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACTGTTCCTATAATTAAAATAAAAGAGGTA SEC ID nº 416 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGTTCCAGTAAAAAGTAATTTTAAAGCATT
SEC ID nº 417 30 ADN
Streptococcus agalactiae
CGCTCGATTGATGCTATCAACTATATTGAA
SEC ID nº 418 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTCTTCAAGAGAACTTGTAGAACAGCTTCA
SEC ID nº 419 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAGGTACTTTTAGCTTGTTCTTGTGGTGTT
SEC ID nº 420 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ACAGCTACTGTAAATTCTGCTTTTACGGTT
SEC ID nº 421 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAGTGCAGTTGTCAAGGAGATTGTGAGCGA
SEC ID nº 422 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTAACCTTTGAAAATGTGAAAGGCTCGTA
SEC ID nº 423 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GCGATGATGGTAAGTCATCATGGACAGCGT SEC ID nº 424 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTTACACACGATGTCAGATATAATGTCAA
SEC ID nº 425 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGTACTGCACTAGGAATTGTAGAGATCAAA
SEC ID nº 426 30 ADN
Streptococcus agalactiae
CGTACCATCTATCAATTTACCGCAAGCTGT
SEC ID nº 427 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTAAAAGATTTAAACTATCAAGCGTCAATT
SEC ID nº 428 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TTCTAAATGCTGGTGACTGCTTTGCATAAA
SEC ID nº 429 31 ADN
Streptococcus agalactiae
TTGCTGCTAGACCCAAACAGTTTATTTTTAG
SEC ID nº 430 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TCCTTTTTTAGATAATGTGCGATCACGGAC
SEC ID nº 431 29 ADN
Streptococcus agalactiae
TTTTACCAATGCTTCCATATCGCTTATAT
SEC ID nº 432
30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGGTTATACATTTACTAATCCATCAGCATT
SEC ID nº 433 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAGCTAATTCTCATCTCACCGAGATGGATA
SEC ID nº 434 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAAAACTCTTACCACTTACATACATGTATG
SEC ID nº 435 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GCTGGAGATTTTACAAGCAGTTTGAATTTC
SEC ID nº 436 30 ADN
Streptococcus agalactiae
ATCACACCAGTCGTTATGATGGATGACTAT
SEC ID nº 437 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGTCAACAGTACGTGAGACGAGTGTGTAGG
SEC ID nº 438 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TGAAGTTGATGGATATGTTGATTTAGAGCT
SEC ID nº 439 30 ADN
Streptococcus agalactiae
TAATCATTTTATGAGAGATACCGCCTCAAG
SEC ID nº 440
ADN
Streptococcus agalactiae
TTTAAAGAGATATCTGTTTCATCTTGCGGA
SEC ID nº 441 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AATCACTTCTGCATAAATATCTTTTACTTC
SEC ID nº 442 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AAACATCCGCAACGGGATAAATAAAGCTAG
SEC ID nº 443 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGTTTCTTGTGGGTTAGCTTGTCCACCGTA
SEC ID nº 444 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GAACATGAAAGATTTTAAAAAAGAACATTT
SEC ID nº 445 30 ADN
Streptococcus agalactiae
AGAGGGGAAAATATCAATGCCGAATGCTGA
SEC ID nº 446 30 ADN
Streptococcus agalactiae
GATGGTACAAAATCATTTGTTGGTACTGAT
SEC ID nº 447 30 ADN
Streptococcus mutans
AAAAGGAAACGCCATTAATTAATATGGTGA
SEC ID nº 448 30 ADN
Streptococcus mutans
GATTGAACCAGCTAGCGCAGTTAGTGCTCT
SEC ID nº 449 30 ADN
Streptococcus mutans
CGCTAAAAGCTGTTGTGTCATCATAGTTAG
SEC ID nº 450 30 ADN
Streptococcus mutans
TAAATATTTTCAATTAGACAATAGACAAAC
SEC ID nº 451 30 ADN
Streptococcus mutans
TGCCTATGTATTCGGACATGACTTGCCACA
SEC ID nº 452 30 ADN
Streptococcus mutans
ATGTGAAAAGAAAGTAACTACTACATTTGA
SEC ID nº 453 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TGCGCTGGTTGATTTCTTCTTGCGCTTTTT
SEC ID nº 454 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TTATATGAACATAACTCAATTTGTAAAAAA
SEC ID nº 455 30 ADN
Streptococcus pyogenes
AGGAATATCCGCAATAATTAATTGCGCTCT
SEC ID nº 456 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TAAATTTGTTTAGCAGGTAAACCGTGCTTT SEC ID nº 457 30 ADN
Streptococcus pyogenes
TTCAGCACACTGAGACTTGTTGAGTTCCAT
SEC ID nº 458 33 ADN
Streptococcus pyogenes
CTGTGACATTGCGGGATGTAATCAAAGTAAAAA
SEC ID nº 459 32 ADN
Streptococcus pyogenes
AAAGCAAACCTAGCAGAAGCAGAAAATGACTT
SEC ID nº 460 34 ADN .
Streptococcus pyogenes
TGATGTAATTGGTGATTTTCGTGATATGCTTTTT
(c) (III) CAS
SEC ID nº 461 5849 ADN
Streptococcus thermophilus imagen2 imagen4 imagen4
SEC ID 462 10 3387
ADN
Streptococcus thermophilus imagen4 imagen2
SEC ID 463 5 912
ADN
Streptococcus thermophilus imagen3
SEC ID 464 324 ADN
Streptococcus thermophilus imagen2 imagen2
SEC ID 465 1053
5 ADN Streptococcus thermophilus imagen2

10

SEC ID 466

4123

ADN

Streptococcus thermophilus

15

imagen2 imagen4 imagen2
SEC ID 467 5 624
ADN
Streptococcus thermophilus imagen3
SEC ID 468 396 ADN
Streptococcus thermophilus imagen2
SEC ID 469 20 273
ADN
Streptococcus thermophilus imagen2
SEC ID 470 663 ADN
Streptococcus thermophilus imagen3
SEC ID 471 900
15 ADN Streptococcus thermophilus imagen5
SEC ID 472 1074 ADN
Streptococcus thermophilus imagen2

10

SEC ID 473

5832

ADN

Streptococcus thermophilus

15

imagen2 imagen4 imagen4
SEC ID 474
3369 ADN
Streptococcus thermophilus imagen6 imagen2
SEC ID 475 912 ADN
Streptococcus thermophilus imagen3

SEC ID 476 15 324

ADN

Streptococcus thermophilus

imagen2

SEC ID 477 1053

5 ADN Streptococcus thermophilus

imagen3

SEC ID 478 7900 ADN

Streptococcus thermophilus

imagen2

imagen4

imagen4

imagen4

SEC ID 479 624

10 ADN Streptococcus thermophilus

imagen2

SEC ID 480 396

5 ADN Streptococcus thermophilus

imagen2

SEC ID 481 330 ADN

Streptococcus thermophilus

imagen7

SEC ID 482 732 ADN

Streptococcus thermophilus

imagen2

SEC ID 483 5 2277

ADN

Streptococcus thermophilus

imagen3

imagen2

SEC ID 484 5 381

ADN

Streptococcus thermophilus

imagen2

10

SEC ID 485

663

ADN

Streptococcus thermophilus

15

imagen2

SEC ID 486 20 900

ADN

Streptococcus thermophilus

imagen4

SEC ID 487 1074

10 ADN Streptococcus thermophilus

imagen7

SEC ID 488 1074

ADN

Streptococcus agalactiae

imagen6

imagen4

imagen2

SEC ID 489 4113 ADN

Streptococcus agalactiae

imagen3

imagen4

imagen2

SEC ID 490 870

5 ADN Streptococcus agalactiae

imagen3

SEC ID 491 327 ADN

Streptococcus agalactiae

imagen2

SEC ID 492 666

20 ADN Streptococcus agalactiae

imagen2

SEC ID 493 5 5995

ADN

Streptococcus agalactiae

imagen3

imagen4

imagen4

SEC ID 494 4134 ADN

Streptococcus agalactiae

imagen2

imagen4

imagen2

SEC ID 495 5 870

ADN

Streptococcus agalactiae

imagen2

SEC ID 496 342

ADN

Streptococcus agalactiae

imagen4

SEC ID 497 666 ADN

Streptococcus agalactiae

imagen2

SEC ID 498 15 6580

ADN

Streptococcus mutans

imagen2

imagen4

imagen4

imagen2

SEC ID 499 4038 ADN

Streptococcus mutans

imagen3

imagen4

imagen2

SEC ID 500 867

5 ADN Streptococcus mutans

imagen2

10

SEC ID 501

330

ADN

Streptococcus mutans

15

imagen2

SEC ID 502 573

20 ADN Streptococcus mutans

imagen2

imagen2

SEC ID 503 378

5 ADN Streptococcus mutans

imagen2

10 SEC ID 504 5966 ADN

Streptococcus pyogenes

15

imagen2

imagen2

imagen4

imagen4

SEC ID 505 4107

10 ADN Streptococcus pyogenes

imagen4

imagen4

SEC ID 506 870 ADN

Streptococcus pyogenes

imagen2

imagen2

SEC ID 507 342

5 ADN Streptococcus pyogenes

imagen2

SEC ID 508 663 ADN

Streptococcus pyogenes

imagen7

SEQ TD 509 8020

20 ADN Streptococcus pyogenes

imagen2

imagen4

imagen4

imagen4

SEC ID 510 2409 ADN

Streptococcus pyogenes

imagen3

imagen2

SEC ID 511 729

5 ADN Streptococcus pyogenes

imagen2

10

SEC ID 512

1896

ADN

Streptococcus pyogenes

15

imagen2

imagen2

SEC ID 513 5 849

ADN

Streptococcus pyogenes

imagen2

10

SEC ID 514

675

ADN

Streptococcus pyogenes

15

imagen2

SEC ID 515 5 1026

ADN

Streptococcus pyogenes

imagen3

SEC ID 516 294 ADN

Streptococcus pyogenes

imagen2

SEC ID 517 5966

5 ADN Streptococcus pyogenes

imagen3

imagen4

imagen2

SEC ID 518 5 4107

ADN

Streptococcus pyogenes

imagen2

imagen4

imagen2

SEC ID 519 5 871

ADN

Streptococcus pyogenes

imagen2

10

SEC ID 520

327

ADN

Streptococcus pyogenes

15

imagen2

SEC ID 521 663

5 ADN Streptococcus pyogenes

imagen2

10 (IV) FUNCTIONAL COMBINATIONS

By way of example only, the following functional combinations may be used in accordance with the present invention.

15 Functional combination #1 cas sequences: SEC ID 461 to SEC ID 465, and SEC ID 473 to SEC ID 477 repeat sequences: SEC ID 1 to SEC ID 10

Functional combintaion #2 20 cas sequences: SEC ID 466 to SEC ID 472, and SEC ID 478 to SEC ID 487 repeat sequences: SEC ID 11 and SEC ID 12

Functional combination #3 cas sequences: SEC ID 488 to SEC ID 508, and SEC ID 517 to SEC ID 521 25 repeat sequences: SEC ID 13 to SEC ID 19

Functional combination #4 cas sequences: SEC ID 509 to SEC ID 516 repeat sequences: SEC ID 20 and SEC ID 22

30

(V) FURTHER CRISPR SPACERS

SEC ID 522 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CAACACATTCAACAGATTAATGAAGAATAC

SEC ID 523 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCCACTCACGTACAAATAGTGAGTGTACTC

SEC ID 524 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCCCTTCTAATTGGATTACCTTCCGAGGTG

SEC ID 525 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTCAGTCGTTACTGGTGAACCAGTTTCAAT

SEC ID 526 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATTGTCTATTACGACAACATGGAAGATGAT

SEC ID 527 31 ADN

Streptococcus thermophilus

GAGTTTCTTTGTCAGACTCTAACACAGCCGC

SEC ID 528 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTACTAGAGCGTGTCGTTAACCACTTTAAA

SEC ID 529 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTCGTTAAAGTCACCTCGTGCTAGCGTTGC

SEC ID 530

30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAACGGTAGCAAATATAAACCTGTTACTG

SEC ID 531 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GAAGTAGCCATACAAGAAGATGGATCAGCA

SEC ID 532 29 ADN

Streptococcus thermophilus

ATGTCACTGAGTGTCTAAGCATTGCGTAC

SEC ID 533 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGAATAAGCAGTTCTTGACGACCAACCGAC

SEC ID 534 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCAACAATTGCAACATCTTATAACCCACTT

SEC ID 535 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTACGTTTGAAAAGAATATCAAATCAATGA

SEC ID 536 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTCTACGACTTCTTCCACGAGTTCCTGCC

SEC ID 537 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AACACAGCAAGACAAGAGGATGATGCTATG

SEC ID 538

ADN

Streptococcus thermophilus

AAGTAGTTGATGACCTCTACAATGGTTTAT

SEC ID 539 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATAATTTATGGTATAGCTTAATATCATTG

SEC ID 540 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATCAATACGACAAGAGTTAAAATGGTCTT

SEC ID 541 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATCGTTCAAATTCTGTTTTAGGTACATTT

SEC ID 542 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATGACGAGGAGCTATTGGCACAACTTACA

SEC ID 543 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATTAAGGGCATAGAAAGGGAGACAACATG

SEC ID 544 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ACAATTCTTCATCCGGTAACTGCTCAAGTG

SEC ID 545 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ACACTTGGCAGGCTTATTACTCAACAGCGA

SEC ID 546 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAAACTATGAAATTTTATAATTTTTAAGA

SEC ID 547 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAACTGAAGGATAGGAGCTTGTAAAGTCT

SEC ID 548 29 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAATGCCGTTGAATTACACGGCAAGTCA

SEC ID 549 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CAACCAACGGTAACAGCTACTTTTTACAGT

SEC ID 550 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CATAGAGTGGAAAACTAGAAACAGATTCAA

SEC ID 551 29 ADN

Streptococcus thermophilus

CGACACAAGAACGTATGCAAGAGTTCAAG

SEC ID 552 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CGATATTTAAAATCATTTTCATAACTTCAT

SEC ID 553 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CGATTTGACAATCTGCTGACCACTGTTATC

SEC ID 554 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTGTTCCTTGTTCTTTTGTTGTATCTTTTC

SEC ID 555 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GAGCGAGCTCGAAATAATCTTAATTACAAG

SEC ID 556 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCAGTATCAGCAAGCAAGCTGTTAGTTACT

SEC ID 557 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTGGCGAGGAAACGAACAAGGCCTCAACA

SEC ID 558 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTAGCTGTCCAATCCACGAACGTGGATG

SEC ID 559 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GGCGTCCCAATCCTGATTAATACTTACTCG

SEC ID 560 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTTCGCTAGCGTCATGTGGTAACGTATTTA

SEC ID 561 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCTATATCGAGGTCAACTAACAATTATGCT

SEC ID 562 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGCATCGAGCACGTTCGAGTTTACCGTTTC SEC ID 563 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGTTTGACAGCAAATCAAGATTCGAATTGT

SEC ID 564 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTCATTCTTCCGT=GTRTGCGAATCCT

SEC ID 565 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGACTTAGCGAATTTAATCGCTAAGATATC

SEC ID 566 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTTATACTTTATCTTTTTAAAGAATGTATT

SEC ID 567 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CCTAAAATCATTTTCAACGAGTTGCGATAC

SEC ID 568 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATAAATTGCTATGATACAGCGTACCGATA

SEC ID 569 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGCTCTCTATGCGATTGGACGTCTGTCTAA

SEC ID 570 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AAGAAAGATAAGAAAAAAGTAACACTACTT SEC ID 571 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCTCTTTCCATCGGTACTGGTATATCTCAT

SEC ID 572 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATTGGTAGCCAAGTAAATATCACCATTGAT

SEC ID 573 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTCTTCAAATTCACCGACTGCAAAATTACA

SEC ID 574 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTCCTAAGTGCATGAAAATCGCAAACGG

SEC ID 575 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TATACCTGTCTATGTAAGGGAATTTAACTC

SEC ID 576 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GGTGTAGGTGCTGTTGGTAAGTTGTTTAAT

SEC ID 577 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTGAAACAGGTTATCAAAAAACGTATATTG

SEC ID 578 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTATTCTTGGAATTATTACAGACCCTACTA

SEC ID 579

30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTTCATTATATCACTTACTCATAAATCT

SEC ID 580 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TAATCACCCCTTTTTCTAGCTCTTGATTGA

SEC ID 581 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CAAGCAGTGTAAAGGTGGTTTAAATGTTAA

SEC ID 582 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AACCCGCGTGGTTATGGGCTTGAGGAGTGT

SEC ID 583 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATATTAATAGCGATTCTATGCTACAACGTG

SEC ID 584 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCATCTTCTAAGTAAATACCACTGTCAGGG

SEC ID 585 29 ADN

Streptococcus thermophilus

TTTTCGCAAAGTAAGCGAAGCTCTACGTG

SEC ID 586 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTCTGTAGCCACTCCGTGGATGCCTTCAGC

SEC ID 587

ADN

Streptococcus thermophilus

TTCTTTAGTTCGGACACCCTCAACACCTAT

SEC ID 588 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTTGATTGGACGGAAAATGGTATCCCTG

SEC ID 589 . 31 ADN

Streptococcus thermophilus

TTCCTCATCTTTCTCCGCTTTTGCTAGACTT

SEC ID 590 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTAGACCAGATGGACAGATATTCTTCATCG

SEC ID 591 31 ADN

Streptococcus thermophilus

TCATCAGAGTCAACAATCACGGGAAAGACCT

SEC ID 592 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ACACTCATCCTTATCCTGTAGTTCAAAACA

SEC ID 593 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CAGCACTAGCCGCAAGCCCTTGTATATTAA

SEC ID 594 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TAGAAATCAAGGAACTTGGATGAAAAGTAA

SEC ID 595 ADN

Streptococcus thermophilus

ATATGAAAGGGAAATGATATGAAGAATGAA

SEC ID 596 31 ADN

Streptococcus thermophilus

TTTTGGGATACAACACGCAGTCGTTGACTTG

SEC ID 597 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTTTGAGATGCCAATGTTTTTCAATCCTTG

SEC ID 598 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTATCAAAAGACGCATTCATGAAGCGAGCT

SEC ID 599 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AAAAACAATTGAAATTCATAATCAGCGCTT

SEC ID 600 29 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTTTAACGTTTTAAGAGAATACCCTCT

SEC ID 601 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTGACGCTGCAATGACTTGCCATAGTAATT

SEC ID 602 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATACTGGTATATAGTAATTCATACTTCATC

SEC ID 603 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TTGGTTTCATATTTACTCCTTTGTGTTTTG SEC ID 604 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTGATTTGGTCTTGTTCTTTTGTCCCTTTT

SEC ID 605 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCAGCAGTTGAGAACTTTAGCGTCCAGTGG

SEC ID 606 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGCTACTATGAAGGACGCTGTTGATACTTT

SEC ID 607 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCTTCTTTAATCTTTTTTAACGTCAACGTT

SEC ID 608 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GTATCCATTAATATAGTAGCATTTCTATCA

SEC ID 609 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATTCATTAATATCTGCAAGGATGTCTTGTT

SEC ID 610 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GAGAAAGTAGCCCATTCGGCCCATTCGGGG

SEC ID 611 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TACTTGAGTTAGCTCTGGAAGTCATTTATC SEC ID 612 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTGCATTTGTAACCATGACTTCTTCGTCGT

SEC ID 613 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATTTGTCATCGACATCTACCAACGCCCAG

SEC ID 614 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAAAATTATGCCACGTTTTGGCACTAGAT

SEC ID 615 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATGTCTCTGAGGCTGTAGTAATTTACTTGT

SEC ID 616 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTTTAAAGAGTTGATTAAGTGCGTTACTGT

SEC ID 617 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AAATGGGTTATGCTGTTCAATATGCGTCCC

SEC ID 618 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AAACTGAAAACAACACAGACAATTCAACAA

SEC ID 619 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GCCCAAAATGCTAGACGTTTGAATGACGGC

SEC ID 620

30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATGAAGAACGTGATTCACCTACGGTATGCT

SEC ID 621 31 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTTTGCAGAATTGTCTCCAGTGCCGATTT

SEC ID 622 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGTACTCTATTGATTGCTTCATCTTTATTA

SEC ID 623 31 ADN

Streptococcus thermophilus

CTTTCAAGATACTCATCAACCATTGATGTCA

SEC ID 624 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTATGTCTTTACTGTTCTTCCAAAACCACC

SEC ID 625 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGCTACGTGCTCTGTACGGGCGCTATCAGC

SEC ID 626 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CGTGGCAGCGTGGTCGGGTTTAATAGCCCG

SEC ID 627 29 ADN

Streptococcus thermophilus

AAGCCCAAGTCAGAGCATCCGTCCAAGCC

SEC ID 628

ADN

Streptococcus thermophilus

ATTGGGTTTCGGTAAGAACTAAACATACCA

SEC ID 629 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CACAAAATAATTCGGTAGTTTTTACTAACT

SEC ID 630 29 ADN

Streptococcus thermophilus

TTTGACCGTTTATTTAGACGTGCTAAAGT

SEC ID 631 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTTCACCTCAAATCTTAGAGCTGGACTAAA

SEC ID 632 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATGTCTGAAAAATAACCGACCATCATTACT

SEC ID 633 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GAAGCTCATCATGTTAAGGCTAAAACCTAT

SEC ID 634 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TAGTCTAAATAGATTTCTTGCACCATTGTA

SEC ID 635 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATTCGTGAAAAAATATCGTGAAATAGGCAA

SEC ID 636 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCTAGGCTCATCTAAAGATAAATCAGTAGC

SEC ID 637 31 ADN

Streptococcus thermophilus

TAAAAACATGGGGCGGCGGTAATAGTGTAAG

SEC ID 638 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ACAACCAGCAAAGAGAGCGCCGACAACATT

SEC ID 639 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TATAACACAGGTTTAGAGGATGTTATACTT

SEC ID 640 31 ADN

Streptococcus thermophilus

CTAGAAGCTCAAGCGGTAAAAGTTGATGGCG

SEC ID 641 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTTTGAGGGCAAGCCCTCGCCGTTCCATTT

SEC ID 642 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AACTACCAAGCAAATCAGCAATCAATAAGT

SEC ID 643 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTATAAGTGACAATCAGCGTAGGGAATACG

SEC ID 644 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATCAGTGCGGTATATTTACCGTAGACGCTA SEC ID 645 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AACAGTTACTATTAATCACGATTCCAACGG

SEC ID 646 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AATTAGGGCGTCTTCCTTTATTCCGTGGTT

SEC ID 647 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAGCTTCATTGCGCTTTTTAATTTGACCT

SEC ID 648 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AACAACAAAGCAAATACAACAGTAACAACC

SEC ID 649 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTAAACTACGTTTGAAGGTCTCAACTCCGT

SEC ID 650 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GAGGTTGAATAGTGAGTGCACCATGTTTGT

SEC ID 651 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AGTAGAGAGACCAGCACACTACTGTACTAC

SEC ID 652 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTTCGCACGAAAGTTTATTAGACAACTCGC SEC ID 653 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGATAGAGCTAGAATTGTCTTTTTTACCGA

SEC ID 654 30 ADN

Streptococcus thermophilus

AGATACTCTTGCTCGCCTCTGAACAACCAG

SEC ID 655 30 ADN

Streptococcus thermophilus

GGTGAAAAAGGTTCACTGTACGAGTACTTA

SEC ID 656 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TCAATGAGTGGTATCCAAGACGAAAACTTA

SEC ID 657 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CCTTGTCGTGGCTCTCCATACGCCCATATA

SEC ID 658 30 ADN

Streptococcus thermophilus

TGTTTGGGAAACCGCAGTAGCCATGATTAA

SEC ID 659 32 ADN

Streptococcus thermophilus

ACAGAGTACAATATTGTCCTCATTGGAGACAC

SEQ TD 660 30 ADN

Streptococcus thermophilus

CTCATATTCGTTAGTTGCTTTTGTCATAAA

SEC ID 661

30 ADN

Streptococcus thermophilus

AGAACTTTATCAAGATAAAACTACTTTAAA

SEC ID 662 30 ADN

Streptococcus thermophilus

ATAGTATTAATTTCATTGAAAAATAATTGT

SEC ID 663 36 ADN

Streptococcus thermophilus

GCTTTCTAGCTCGCTATAATTACCCATTCCTAGAAA

SEC ID 664 40 ADN

Streptococcus thermophilus

TCAAAATATGTTATTACCTTGTATTTCATAATTCAATTAA

SEC ID 665 39 ADN

Streptococcus thermophilus

CCACTTGCTGTGTACATCCTACCAGTTCCGCCTATGATG

Claims (32)

1. Reivindicaciones

   1.

   Utilización de uno o más genes o proteínas cas (asociados a CRISPR) para modular la resistencia en una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

2. 2.

   Utilización según la reivindicación 1, en la que se utilizan dichos uno o más genes o proteínas cas en combinación con dos o más repeticiones CRISPR.

3. 3.

   Utilización según la reivindicación 2, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas y/o dichas dos o más repeticiones CRISPR proceden o son derivables a partir de la misma célula.

4. 4.

   Utilización según la reivindicación 2 ó 3, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas y dichas dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente en la misma célula.

5. 5.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos uno o más genes o proteínas cas son utilizados en combinación con uno o más espaciadores de CRISPR.

6. 6.

   Utilización según la reivindicación 5, en la que el espaciador o espaciadores de CRISPR proceden o son derivables de un organismo que es diferente a la célula de la que proceden o son derivables dichos uno o más genes o proteínas cas y/o dos o más repeticiones CRISPR.

7. 7.

   Utilización según la reivindicación 6, en la que el espaciador se obtiene a partir de una célula que es resistente a un ácido nucleico diana.

8. 8.

   Utilización según la reivindicación 5, en la que el espaciador de CRISPR es una secuencia de ácido nucleico sintético.

9. 9.

   Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que el espaciador o los espaciadores CRISPR presentan homología al ácido nucleico diana.

10. 10.

    Utilización según la reivindicación 9, en la que el espaciador o los espaciadores de CRISPR presentan una identidad de 100% respecto al ácido nucleico diana a lo largo de por lo menos la longitud del núcleo del espaciador de CRISPR.

11. 11.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho por lo menos un gen o proteína cas se utiliza en combinación con por lo menos uno o más espaciadores de CRISPR y por lo menos dos o más repeticiones CRISPR.

12. 12.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable (preferentemente derivado) de ADN de bacteriófago.

13. 13.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de ADN de plásmido.

14. 14.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un elemento genético móvil.

15. 15.

    Utilización según la reivindicación 14, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un elemento trasponible o una secuencia de inserción.

16. 16.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un gen de resistencia a antibióticos.

17. 17.

    Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo procede o es derivable de un ácido nucleico codificante de un factor de virulencia.

18. 18.

    Utilización según la reivindicación 17, en la que el factor de virulencia se selecciona de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos codificantes de una toxina, de una internalina y de una hemolisina.

19. 19.

    Utilización según la reivindicación 1 de una secuencia de ácidos nucleicos recombinantes que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con por lo menos un espaciador de CRISPR, en la que por lo menos un espaciador de CRISPR es heterólogo respecto a por lo menos un gen cas y/o por lo menos dos repeticiones CRISPR, para modular la resistencia frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

20. 20.

    Método para modular la resistencia de una bacteria frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

    (i)

    identificar una secuencia en un organismo;

    (ii)

    preparar un espaciador de CRISPR que es homólogo de la secuencia identificada;

    (iii) preparar un ácido nucleico que comprende por lo menos un gen cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con el espaciador de CRISPR; y

    (iv) introducir dicho ácido nucleico en una célula, para convertir así a la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o producto de transcripción del mismo.

21. 21.

    Método para modular la resistencia de una bacteria frente a un ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo, que comprende las etapas siguientes:

    (i)

    identificar uno o más espaciadores de CRISPR o seudoespaciadores de CRISPR en un organismo resistente al ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo;

    (ii)

    preparar un ácido nucleico recombinante que comprende por lo menos un gen o proteína cas y por lo menos dos repeticiones CRISPR conjuntamente con dichos uno o más espaciadores identificados; e

    (iii) introducir dicho ácido nucleico recombinante en una célula, para la conversión así de la célula en resistente a dicho ácido nucleico diana o a un producto de transcripción del mismo.

22. 22.

    Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que los uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR proceden o son derivables de la misma célula.

23. 23.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que los espaciadores proceden o son derivables a partir de un organismo que es diferente de la célula que comprende los uno o más genes o proteínas cas y/o las dos o más repeticiones CRISPR.

24. 24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que dicho uno

    o más genes o proteínas cas y las dos o más repeticiones CRISPR se encuentran presentes simultáneamente de manera natural en la misma célula.

25. 25.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que dicha modificación comprende insertar uno o más espaciadores de CRISPR y/o seudoespaciadores de CRISPR en la célula.

26. 26.

    Método según la reivindicación 25, en el que el espaciador de la célula presenta una homología de 100% respecto al espaciador de CRISPR o el seudoespaciador de CRISPR del organismo.

27. 27.

    Método según la reivindicación 25 ó 26, en el que dicha modificación comprende la ingeniería genética del espaciador de CRISPR de la célula.

28. 28.

    Método según la reivindicación 27, en el que la totalidad o parte del espaciador en la célula ha sido modificado.

29. 29.

    Método según la reivindicación 27 ó 28, en el que dicha modificación comprende la modificación de un espaciador recombinante.

30. 30.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que dicha modificación se produce mediante mutación espontánea o mutagénesis.

31. 31.

    Método para modular la resistencia de una bacteria que comprende por lo menos uno o más genes o proteínas cas y dos o más repeticiones CRISPR frente a un ácido nucleico diana o un producto de transcripción del mismo, que comprende modificar dichos uno o más genes o proteínas cas en la célula.

32. 32.

    Método según la reivindicación 31, en el que dichos uno o más genes o proteínas cas en la célula se delecionan.