ES2348219T3

ES2348219T3 - Vacuna de virus pox recombinante contra el circovirus porcino.

Info

Publication number: ES2348219T3
Application number: ES00938971T
Authority: ES
Inventors: Catherine E. Charreyre; Jennifer M. Perez; Michel Bublot
Original assignee: Merial SAS; Merial Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS; Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 1999-06-10
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2020-06-09
Also published as: ZA200110129B; TWI286937B

Abstract

Composicion inmunogenica que comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molecula de ADN aislada, donde el virus pox es: ALVAC, o un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenua a traves de mas de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometio la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplifico un clon de placa a traves de cinco pases adicionales, y donde la molecula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador.

Description

Descripción CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención se refiere a la utilización de virus pox recombinantes, por ejemplo, virus pox modificados, En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la utilización de virus pox aviar, tal como virus pox de canario, por ejemplo, ALVAC. La presente invención se refiere además a composiciones inmunológicas o vacunas que comprenden virus pox que expresan ORF2 de circovirus porcino 2 (PCV2). La presente invención se refiere además a la utilización de virus pox que inducen una respuesta inmune dirigida a o contra ORF2 de PCV2 y/o PCV2; y, de manera ventajosa, a dichas composiciones que son composiciones inmunológicas, inmunogénicas o de vacuna y/o confieren inmunidad protectora contra la infección por PCV2. La presente invención se refiere además a las utilizaciones y métodos que utilizan dichos vectores y composiciones, así como intermedios de los mismos, y a dichos intermedios.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] El síndrome del desmedro multisistémico post-destete (PMWS) es una enfermedad recientemente reconocida de los cerdos jóvenes. El PMWS se caracteriza clínicamente por una pérdida progresiva de peso y otros síntomas, tales como taquipnea, sipnea e ictericia. Patológicamente, se han observado infiltrados linfocíticos y granulomatosos, linfadenopatía y, más raramente, hepatitis y nefritis linfocíticas y granulomatosas (Clark, 1997; Harding. 1997). [0003] Esta enfermedad se ha descrito en diferentes países europeos, así como en Norteamérica. El tratamiento y la prevención de esta enfermedad no están actualmente disponibles. [0004] Varias líneas de evidencia apuntan hacia el circovirus porcino como el agente etiológico de PMWS (Ellis et al., 1998). Se han recuperado circovirus de credos con PMWS, y se han mostrado anticuerpos para circovirus porcino en cerdos con la enfermedad [0005] Los circovirus son virus de ADN circular monocatenario que se encuentran en una gama de especies de animales y plantas. El circovirus porcino se aisló originalmente como un contaminante de una línea continua de riñón de cerdo. El aislado del cultivo celular se ha designado como PK-15 (Meehan et al., 1997). Más recientemente, el circovirus porcino obtenido de cerdos con PMWS se ha comparado con PK-15. Dichos virus difieren sustancialmente de PK-15 a nivel de secuencia de nucleótidos y proteínas y se han designado como PCV2 (Meehan et al., 1998; Hamel et al., 1998). [0006] Se han identificado hasta trece marcos de lectura abiertos (ORF) en el genoma de PCV2 (COL1 a COL13 en la solicitud de patente francesa 98 03707). Cuatro de estos ORF comparten una homología sustancial con los ORF análogos en el genoma de PK-15. ORFI (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL4 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 398-1342 (GenBank número de acceso AF055392), tiene el potencial de codificar una proteína con un peso molecular previsto de 37,7 kD. ORF2 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL13 en la solicitud de patente francesa 98 03707) que comprende los nucleótidos 13811768 unidos a 1-314 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 27,8 kD. ORF3 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL7 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 1018-704 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 11,9 kD. ORF4 (Meehan et al., 1998; correspondiente a COL10 en la solicitud de patente francesa 98 03707), que comprende los nucleótidos 912-733 (GenBank número de acceso AF055392), puede codificar una proteína con un peso molecular previsto de 6,5 kD. [0007] ORF1 de PCV2 es altamente homólogo (identidad del 86%) con el ORF1 del aislado de PK-15 (Meehan et al., 1998). La proteína ORF1 de PK-15 se ha caracterizado parcialmente (Meehan et al., 1997; Mankertz et al., 1998a). Se sabe que es esencial para la replicación de virus y está probablemente implicado en la replicación del ADN viral. [0008] La identidad en la secuencia de proteínas entre los ORF2 respectivos fue inferior (identidad del 66%) que la de los ORF1, pero cada uno de los ORF2 compartía una región N-terminal básica altamente conservada, similar a la observada en la región N-terminal de la proteína estructural principal del virus de la anemia de pollito (CAV) del circovirus aviar (Meehan et al., 1998). Recientemente, Mankertz et al. (1998b) ha sugerido que el ORF2 del aislado de PK-15 (designado ORF1 en Mankertz et al., 1998b) codifica una proteína de la cápside. [0009] Se observaron mayores diferencias entre los respectivos ORF3 y ORF4 del aislado de PK-15 y PCV2-En cada caso, hubo una deleción de la región C-terminal de ORF4 y ORF3 de PCV2 en comparación con el correspondiente ORF presente en el genoma del aislado de PK-15. La mayor homología en la secuencia de proteínas se observó en las regiones N-terminales de tanto ORF3 como ORF4 (Meehan et al., 1998).

[0010] El análisis de la transcripción del genoma de PCV2 no se ha publicado aún. Los datos recientes obtenidos con el aislado de PK-15 indicaron que el transcrito de ORF2 se corta y empalma (Mankertz et al., 1998b). [0011] Se han utilizado satisfactoriamente virus vaccinia para inmunizar contra la viruela, culminando en la erradicación mundial de la viruela en 1980. Con la erradicación de la viruela, el nuevo papel de los virus pox se ha vuelto importante, el de vector diseñado genéticamente para la expresión de genes exógenos (Panicali y Paoletti, 1982; Paoletti et al., 1984). Los genes que codifican antígenos heterólogos se han expresado en vaccinia, dando lugar a menudo en inmunidad protectora contra la estimulación por el correspondiente patógeno (revisado en Tartaglia et al., 1990). También se ha utilizado una cepa altamente atenuada de vacunas, designada MVA, como vector para vacunas basadas en virus pox. La utilización de MVA se describe en la Patente de Estados Unidos No. 5,185,146. [0012] Dos sistemas de vectores de vacuna adicionales implican la utilización de virus pox limitados a huéspedes naturales, virus pox aviares (avipox). Tanto el virus de la viruela aviar (FPV; Taylor et al. 1988a, b) como el virus pox de canario (CPV; Taylor et al., 1991 & 1992) se han diseñado para expresar de productos génicos exógenos. El virus de la viruela aviar (FPV) es el virus prototipo del género Avipox de la familia de los virus Pox. El virus causa una enfermedad de las aves de corral económicamente importante que ha estado bien controlada desde los años 20 mediante la utilización de vacunas atenuadas vivas. La replicación de los virus avipox está limitada a especies aviares (Matthews, 1982) y no existen informes en la literatura de virus avipox que causen una infección productiva en alguna especie no aviar, incluyendo el hombre. Esta limitación del huésped proporciona una barrera de seguridad inherente para la transmisión de los virus a otra especie y hace de la utilización de vectores de vacunas basadas en virus avipox en aplicaciones veterinaria y humana una proposición atractiva. [0013] Se ha utilizado FPV de manera ventajosa como vector que expresan antígenos de patógenos de aves de corral. La proteína hemaglutinina de un virus de la gripe aviar virulenta se expresó en un FPV recombinante (Taylor et al., 1988c). Después de la inoculación del recombinante en pollitos y pavos, se indujo una respuesta inmune que era protectora contra la estimulación con virus de la gripe homólogo o heterólogo (Taylor et al., 1988c). También se han desarrollado recombinantes de FPV que expresan las glicoproteínas de superficie del Virus de la Enfermedad de Newcastle (Taylor et al., 1990 ; Edbauer et al., 1990). [0014] Se han preparado otros virus pox atenuados mediante modificaciones genéticas de cepas de tipo salvaje del virus. El vector NYVAC, derivado por deleción de genes de virulencia específica y de diversos huéspedes de la cepa Copenhagen de vaccinia (Tartaglia et al., 1992), ha demostrado ser útil como vector recombinante en la obtención de una respuesta inmune protectora contra un antígeno exógeno expresado. [0015] Otro vector de virus pox diseñado en ALVAC, derivado del virus pox de canario. ALVAC no se replica de manera productiva en huéspedes no aviares, una característica que se cree que mejora el perfil de seguridad (Taylor et al., 1991 & 1992). Tanto ALVAC como NYVAC son vectores BSL-1. [0016] Una estrategia para el desarrollo de una vacuna de subunidad PCV2 es la utilización de vectores virales vivos para expresar ORF de PCV2 relevantes. Los virus pox recombinantes se pueden construir en dos etapas conocidas en la técnica y análogas a los métodos para crear recombinantes sintéticos de virus pox, tales como el virus vaccinia y virus avipox descritos en la Patente de Estados Unidos Nos. 4,769,330; 4,722,848; 4,603,112; 5,110,587; 5,174,993; 5,494,807; y 5,505,941. Debe entenderse por tanto que la disposición de un virus pox recombinante de PCV2, y de composiciones y productos de los mismos, particularmente recombinantes de PCV2 de base ALVAC y composiciones y productos de los mismos, especialmente los recombinantes que contienen ORF 1 y/o 2 de PCV2 y composiciones y productos de los mismos, serían un avance altamente deseable sobre el estado de la tecnología actual.

OBJETIVOS Y DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN [0017] Por tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones y métodos para el tratamiento y profilaxis de la infección con PCV2. También es un objetivo proporcionar un medio para tratar o prevenir PMWS. [0018] En un aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es: ALVAC, o un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollitos, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador. [0019] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona la utilización de un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es: ALVAC, o un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de PCV2; para la preparación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune contra PCV2 en un cerdo adulto, un cerdo joven o una cerda gestante. [0020] En otro aspecto, la presente invención proporciona una vacuna comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es: ALVAC, o un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador. [0021] En un aspecto, la descripción se refiere a una composición antigénica, inmunológica, inmunogénica o de vacuna o una composición terapéutica para inducir una respuesta antigénica, inmunogénica o inmunológica en un animal huésped inoculado con la composición. La composición incluye de manera ventajosa un portador o diluyente y un virus recombinante, tal como un virus pox recombinante. El virus o virus pox recombinante contiene y expresa una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un ORF, antígeno, inmunógeno o epítopo de interés de PCV2, o una proteína que produce una respuesta inmunológica contra PCV2 o condiciones provocadas por PCV2, tal como PMWS. Por ejemplo, el virus recombinante puede ser virus o virus pox recombinante modificado; por ejemplo, dicho virus o virus pox que ha inactivado en el mismo funciones genéticas codificadas por el virus, por ejemplo, funciones genéticas codificadas por el virus no esenciales, de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. La descripción también proporciona los virus utilizados en la composición, así como métodos para la fabricación y usos de la composición y virus. [0022] El virus utilizado en la composición según la descripción es de manera ventajosa un virus pox, particularmente un virus vaccinia o un virus avipox, tal como virus de la viruela aviar o virus pox de canario y de manera más ventajosa, ALVAC. El virus recombinante modificado puede incluir, por ejemplo, una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heterólogo que codifica una proteína antigénica, por ejemplo, derivada de ORFs de PCV2, por ejemplo, ORF 1 y/o 2 de PCV2. [0023] En otro aspecto, la descripción se refiere a una composición inmunogénica que contiene un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas por el virus no esenciales inactivadas, de manera que el virus recombinante tiene una virulencia atenuada y una seguridad aumentada. El virus recombinante modificado incluye, por ejemplo, en una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heterólogo que codifica una proteína antigénica (por ejemplo, derivada de ORFs de PCV2, especialmente ORF 1 y/o 2), donde la composición, cuando se administra a un huésped, es capaz de inducir una respuesta inmunológica específica para el antígeno. [0024] En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un virus recombinante modificado que tiene funciones genéticas codificadas por el virus no esenciales inactivadas en el mismo, de manera que el virus tiene una virulencia atenuada, y donde el virus recombinante modificado contiene además ADN de un origen heterólogo, por ejemplo, en una región no esencial del genoma del virus. El ADN puede codificar genes de PCV2, tales como alguno o todos entre ORF1, ORF2, ORF3, o ORF4 de PCV2 (Meehan et al., 1998), o epítopo o epítopos de interés de los mismos. Las funciones genéticas se pueden inactivar mediante la deleción de un marco de lectura abierto que codifica un factor de virulencia o mediante la utilización de virus limitados a huéspedes naturales. El virus utilizado según la descripción es de manera ventajosa un virus pox, por ejemplo, un virus vaccinia o un virus avipox, tal como el virus de la viruela aviar o el virus pox de canario. [0025] De manera ventajosa, el marco de lectura abierto que se elimina del genoma del virus pox o el virus se selecciona del grupo que consiste en J2R, B 13R + B14R, A26L, A56R, C7L -K1L, e I4L (según al terminología indicadas en Goebel et al.,

1990); y la combinación de los mismos. En este aspecto, el marco de lectura abierto comprende un gen de timidina quinasa, una región hemorrágica, una región del cuerpo de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, una región del gen de variedad de huéspedes o una subunidad grande, ribonucleótido reductasa; o, la combinación de los mismos. [0026] Una cepa Copenhagen modificada adecuada del virus vaccinia se identifica como NYVAC (Tartaglia et al., 1992), o un virus vaccinia del que se ha eliminado J2R, B13R+B14R. A26L, A56R, C7L-K11 e I4L o un gen de timidina quinasa, una región hemorrágica, una región del cuerpo de inclusión de tipo A, un gen de hemaglutinina, una región del gen de variedad de huéspedes y una subunidad grande, ribonucleótido reductasa (Véase también la Patente de Estados Unidos No. 5,364,773, 5,494,807, y 5,762,938, con respecto a NYVAC y vectores que tienen deleciones o inactivaciones adicionales de los de NYVAC que son también útiles en la práctica de esta descripción). [0027] Preferiblemente, el vector del virus pox es un ALVAC o un virus pox de canario que se atenuó, por ejemplo, a través de mas de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollitos (cepa de vacuna Rentschler), del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales. (Véase también la Patente de Estados Unidos Nos. 5,756,103 y 5,766,599 con respecto a AT VAC y TROVAC (un virus de viruela aviar atenuado útil en la práctica de esta descripción); y las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,004,777, 5,990,091, 5,770,212, 6,033,904, 5,869,312, 5,382,425, y WO 95/30018, con respecto a vectores que también se pueden utilizar en la práctica de esta descripción, tales como vectores que tienen una mayor expresión, vectores que tienen funciones eliminadas de los mismos y vectores útiles con respecto a huéspedes porcinos (por ejemplo, vectores útiles con huéspedes porcinos pueden incluir, un virus pox, incluyendo un virus vaccinia, un virus avipox, un virus pox de canario y un virus pox de cerdo), así como con respecto a los términos utilizados y enseñanzas de la presente invención, tales como “composición inmunogénica”, “composición inmunológica”, “vacuna”, y “epítopo de interés”, y dosis, rutas de administración, formulaciones, adyuvantes y suso para virus recombinantes y productos de expresión de los mismos). [0028] La descripción en un aspecto adicional se refiere al producto de expresión del virus pox recombinante y los usos para el mismo, tales como para formar composiciones antigénicas, inmunológicas o de vacuna para el tratamiento,

prevención, diagnóstico o análisis; y a ADN del virus pox recombinante que es útil en la construcción de sondas de ADN y cebadores de PCR. [0029] Estas y otras realizaciones se describen o son obvios a partir de la siguiente descripción detallada y están comprendidas por la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0030] Se conseguirá un mejor entendimiento de la descripción haciendo referencia a los dibujos acompañantes, incorporados en la presente invención por referencia, en los que:

•: La figura 1 (SEC ID NO:1) muestra la secuencia de nucleótidos de un fragmento de 3,7 pares de kilobases de ADN de ALVAC que contiene el marco de lectura abierto C6.

•: La figura 2 muestra el mapa del plásmido dador pJP102.

•: La figura 3 (SEC ID NO:8) muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento de 2,5 pares de kilobases del plásmido dador pJP102 desde los sitios de restricción KpnI (posición 653) hasta SacI (posición 3166).

•: La figura 4 muestra el mapa del plásmido dador pJP105.

•: La figura 4 muestra el mapa del plásmido dador pJP107.

•: La figura 6 (SEC ID NO:11) muestra la secuencia de nucleótidos del fragmento de 3,6 pares de kilobases del plásmido dador pJP107 desde los sitios de restricción KpnI (posición 653) hasta SacI (posición 4255).

DESCRIPCIÓN DETALLADA [0031] En un aspecto, la descripción se refiere a un virus recombinante, tal como un virus pox recombinantes, que contiene en el mismo una secuencia de ADN de PCV2, por ejemplo, en una región no esencial del genoma del virus pox. El virus pox es de manera ventajosa un virus avipox, tal como virus de viruela aviar, especialmente un virus de viruela aviar atenuado, o un virus pox de canario, tal como ALVAC. [0032] Según la descripción, el virus pox recombinante expresa productos génicos del gen de PCV2 exógeno. Se insertan ORF específicos de PCV2 en el vector del virus pox y el virus pox recombinante resultante se utiliza para infectar un animal. La expresión en el animal de productos génicos de PCV2 da lugar a una respuesta inmune en el animal a PCV2. De este modo, el virus pox recombinante de la descripción se puede utilizar en una composición inmunológica o vacuna para proporcionar un medio para inducir una respuesta inmune que puede ser, aunque no necesariamente, protectora. [0033] El procedimiento de administración para el virus pox PCV2 recombinante o el producto de expresión del mismo, composiciones de la descripción, tales como composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o composiciones terapéuticas, pueden ser a través de una ruta parenteral (intradérmica, intramuscular o subcutánea). Dicha administración permite una respuesta inmune sistémica o respuestas humorales

: o mediadas por células. [0034] Más generalmente, los virus pox PCV2 recombinantes, las composiciones de virus pox PCV2 antigénicas, inmunológicas o de vacuna o composiciones terapéuticas se pueden preparar según técnicas estándar conocidas por los expertos en el campo farmacéutico o veterinario. Dichas composiciones se pueden administrar en dosis y mediante técnicas conocidas para expertos en el campo farmacéutico o veterinario teniendo en consideración factores tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente particular y la ruta de administración. Las composiciones se pueden administrar solas o se pueden coadministrar o administrar secuencialmente con composiciones, por ejemplo, con “otras” composiciones inmunológicas, antigénicas o de vacuna o terapéuticas, proporcionando así composiciones multivalentes o “cóctel” o de combinación y métodos que las utilizan. De nuevo, los ingredientes y forma de administración (secuencial o coadministración), así como dosis las dosificaciones, se pueden determinar teniendo en consideración factores, tales como la edad, sexo, peso, especie y condición del paciente particular y, la ruta de administración. En este aspecto, se hace referencia a la Patente de Estados Unidos No. 5,843,456, dirigida a composiciones contra la rabia y composiciones de combinación y usos de las mismas. [0035] Entre los ejemplos de composiciones mencionadas en las que se incluyen preparaciones líquidas para orificio, por ejemplo, administración oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular

: o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), tales como suspensiones estériles o emulsiones. En dichas composiciones, el virus pox recombinante o antígenos pueden estar en una mezcla íntima con un portador, diluyente o excipiente, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similar. Las composiciones también se pueden liofilizar. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, adyuvantes, aditivos gelificantes o aumentadores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes, y similares, dependiendo de la ruta de administración y la preparación deseada. Se pueden consultar textos estándar, tales como "REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edición, 1985, para

preparar preparaciones adecuadas, sin mucha experimentación. Las dosis adecuadas también se pueden basar en los siguientes Ejemplos. [0036] Las composiciones pueden contener por lo menos un compuesto adyuvante elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de

5 anhídrido maleico y derivados de alquenilo. [0037] Los compuestos adyuvantes preferidos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos por el término carbómero (Phameuropa Vol. 8, No. 2, Junio 1996). Los expertos en la materia pueden también

10 referirse a la Patente de Estados Unidos No. 2,909,462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene por lo menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de por lo menos tres hidroxilos sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen por lo menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de

15 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener en sí otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados bajo el nombre Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) son particularmente apropiados. Están reticulados con alil sacarosa o con alil pentaeritritol. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol® 974P,

20 934P y 971P. [0038] Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, se prefieren los copolímeros EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados con divinal éter. Se hace referencia a J. Fields et al., Nature, 186 : 778-780, 4 Junio 1960.

25 [0039] Desde el punto de vista de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros EMA® se forman preferiblemente de unidades básicas de la siguientes fórmula: en la que: -R1 y R2, que son idénticos o diferentes, representan H o CH3 -x = 0 ó 1, preferiblemente x = 1 -y= 1 ó 2, con x + y= 2 [0040] Para los copolímeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y =1. [0041] La disolución de estos polímeros en agua conduce a una solución ácida que se neutralizará, preferiblemente hasta pH fisiológico, con el fin de proporcionar la solución adyuvante en la que se incorporará la propia vacuna. Los grupos carboxilo del polímero están entonces parcialmente en forma de COO-. [0042] Preferiblemente, se prepara una solución de adyuvante, especialmente de carbómero, en agua destilada, preferiblemente en presencia de cloruro de sodio, estando la solución obtenida a pH ácido. Esta solución madre se diluye mediante su adición a la cantidad deseada (para obtener la concentración final deseada) o una parte sustancial de la misma, de agua cargada con NaCl, preferiblemente, solución salina fisiológica (NaCl 9 g/l), rápidamente en varias partes con una neutralización concomitante o posterior (pH 7,3 a 7,4), preferiblemente con NaOH. Esta solución a pH fisiológico se utilizará tal cual para mezclarse con la vacuna, la cual se puede almacenar especialmente en forma liofilizada, líquida o congelada. [0043] La concentración del polímero en la composición de vacuna final será de 0,01 a 2% p/v, más particularmente de 0,06 a 1% p/v, preferiblemente de 0,1 a 0,6% p/v. [0044] Las composiciones inmunológicas según la descripción se pueden asociar a por lo menos una vacuna atenuada viva, inactivada, de subunidades o vacuna recombinante (por ejemplo, virus pox como vector o ADN plasmídico) que expresan por lo menos un inmunógeno de otro patógeno de cerdo. [0045] La descripción comprende vectores que codifican y que expresan secuencias de nucleótidos equivalentes, es decir, secuencias que no cambian ni la funcionalidad ni la especificidad de cepa (cepa de tipo 1 y cepa de tipo 2) del gen considerado o aquellas de polipéptidos codificados por este gen. Naturalmente, se incluyen las secuencias que difieren por la degeneración del código. [0046] Las secuencias de PCV-2 utilizadas en los ejemplos se derivan de Meehan et al. (Cepa Imp.1010 nucleótidos de ORF1 398-1342; nucleótidos de ORF2 1381-314; y corresponden respectivamente a ORF4 y ORF13 en la solicitud de Estados Unidos de No. de Serie 09/161,092 de 25 Septiembre 1998 y a COL4 y COL13 en WO-A9918214). Se han publicado otras cepas de PCV-2 y sus secuencias en WO-A-9918214 y se denominan Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 y Imp1011-48121, así como en

imagen1

A.L.: Hamel et al. J. Virol. June 1998, vol 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) y en

I.: Morozov et al. J. Clinical Microb. Sept. 1998 vol. 36, 9: 2535-2541, así como GenBank AF086834, AF086835 y AF086836, y dan acceso a secuencias de ORF equivalentes. Estas secuencias, o ORF de las mismas, o regiones de las mismas que codifican un antígeno o epítopo de interés también se pueden utilizar en la práctica de esta descripción.

[0047] La descripción también comprende las secuencias equivalentes a las utilizadas en la presente invención en los documentos citados aquí; por ejemplo, las secuencias que son capaces de hibridarse a la secuencia de nucleótidos bajo condiciones de astringencia elevada (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989). Entre las secuencias equivalentes, se pueden mencionar los fragmentos génicos que conservan la inmunogenicidad de la secuencia completa, por ejemplo, un epítopo de interés. [0048] La homología de todo el genoma entre los tipos 1 y 2 de PCV es de aproximadamente el 75%. Para ORF1, es de aproximadamente el 86%, y para ORF2, aproximadamente el 66%. Por el contrario, las homologías ente genomas y entre ORF en el tipo 2 están generalmente por encima del 95%.

[0049] Además, las secuencias equivalentes útiles en la práctica de esta descripción, para ORF1, son aquellas secuencias que tienen una homología igual o superior al 88%, de manera ventajosa del 90%, o superior, preferiblemente del 925 ó 95% o superior con el ORF1 de la cepa Imp1010, y para ORF2, son aquellas secuencias que tiene una homología igual o superior al 80%, de manera ventajosa del 85% o superior, preferiblemente del 90% ó 95% o superior con ORF2 de la cepa Imp1010. [0050] ORF1 y ORF2 según Meehan 1998 tiene el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares previstos de 37,7 kD y 27,8 kD respectivamente. ORF3 y ORF4 (según Meehan et al. 1998, corresponden a ORF7 y ORF 10 respectivamente en WOA-9918214) tienen el potencial de codificar proteínas con pesos moleculares previstos de 11,9 y 6,5 kD, respectivamente. Las secuencias de estos ORF también está disponible en Genbank AF 055392. También se pueden incorporar en plásmidos y se pueden utilizar según la descripción sola o en combinación, por ejemplo, con ORF1 y/o ORF2. [0051] Los otros ORF 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 descritos en la solicitud U.S. de No. de Serie 09/161,092 de 25 Septiembre 1998 (COLs 1-3 y 5, 6, 8-9, 11-12 en WO-A9918214), o la región o regiones de los mismos que codifican un antígeno o epítopo de interés, se pueden utilizar en la práctica de esta descripción, por ejemplo, solos o en combinación o, en cualquier caso, entre sí o con ORFs 1 y 2 o la región o regiones de los mismos que codifican el antígeno o antígenos o epítopo o epítopos. [0052] Esta descripción también comprende el uso de secuencias equivalentes; por ejemplo, de ORFs de varias cepas de PCV-2 citadas aquí. Para la homología, se puede determinar que existen secuencias equivalentes que provienen de una cepa de PCV que tiene un ORF2 y/o un ORF1 que tienen una homología tal como se ha definido anteriormente con el correspondiente ORF de la cepa 1010. [0053] Para ORF3 según Meehan, una secuencia equivalente tiene una homología con la misma que es de manera ventajosa, por ejemplo, igual o superior al 80%, por ejemplo 85% o superior, preferiblemente 90% o 95% o superior con ORF3 de la cepa Imp1010. Para ORF4 según Meehan 1998, de manera ventajosa una secuencia equivalente tiene una homología que es igual o superior a un 86%, de manera ventajosa al 90% o superior, preferiblemente a un 95% o superior con ORF4 de la cepa Imp 1010. [0054] A partir de la secuencia de nucleótidos genómica, por ejemplo, las descritas en WO-A-99 18214, es rutinario determinar los ORF utilizando software estándar, tal como MacVector®. Además, la alineación de genomas con los de la cepa 1010 y la comparación con los ORF de la cepa 1010 permite a un experto en la materia determinar fácilmente los ORF del genoma de otra cepa (por ejemplo, otras cepas descritas en WO-A-99 18214 o en otros documentos citados aquí). [0055] La utilización de software o la alineación de secuencias no conllevan una gran experimentación y proporciona un acceso directo a ORF o moléculas de ácido nucleico equivalentes. [0056] La homología en la secuencia de nucleótidos se puede determinar utilizando el programa “Align” de Myers y Miller, (“Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) y disponible en NCBI. Alternativa o adicionalmente, el término “homología” o “identidad”, por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje en la homología de secuencia se puede calcular como (Nref-Ndif)*100/Nref, donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y donde Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una similitud de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif=2). [0057] Alternativa o adicionalmente, "homología" o "identidad" con respecto a las secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias, donde la alineación de las dos secuencias se puede determinar según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur and Lipman, 1983 PNAS USA 80:726), por ejemplo, utilizando una tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos, una penalización por espacio de 4, y se pueden realizar de manera conveniente un análisis asistido por ordenador e interpretación de la secuencia que incluyen la alineación utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Intelligenetics ™Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares, o tienen un grado de identidad u homología de la secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. [0058] Las secuencias de ARN en el alcance de la descripción se pueden derivar de secuencias de ADN, considerando la timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN. [0059] Adicional o alternativamente, la similitud o identidad u homología de la secuencia de aminoácidos se puede determinar utilizando el programa BlastP (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402) y disponible en NCBI. Las siguientes referencias proporcionan algoritmos para comparar la identidad u homología relativa de residuos de aminoácidos de dos proteínas y adicionalmente o alternativamente, con respecto a lo anterior, las enseñanzas en estas referencias se pueden utilizar para determinar el porcentaje de homología o identidad: Needleman SB y Wunsch CD, "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins," J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF y Waterman MS, "Comparison of Bio-sequences " Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS y Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res, 11:2205-2220 (1983); Feng DF y Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25: 351-360, (1987); Higgins DG y Sharp PM, "Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG y Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positionsspecific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res., 22:4673-480 (1994); y, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984). [0060] Esta descripción no sólo permite la administración en cerdos adultos, sino también en los jóvenes y en hembras gestantes; en el último caso, esto hace posible, en particular, conferir inmunidad pasiva a los recién nacidos (anticuerpos maternales). Preferiblemente, las cerdas se inoculan antes de la reproducción; y/o antes de aparearse y/o durante la gestación. De manera ventajosa, se realiza por lo menos una inoculación antes de aparearse y preferiblemente va seguido de una inoculación a realizar durante la gestación, por ejemplo, aproximadamente a la mitad de la gestación (aproximadamente 6-8 semanas de gestación) y/o al final de la gestación (aproximadamente 11-13 semanas de gestación). De este modo, una pauta ventajosa es una inoculación antes de engendrar y/o aparearse y una inoculación de refuerzo durante la gestación. A continuación, puede haber una reinoculación antes de cada apareamiento y/o durante la gestación en aproximadamente la mitad de la gestación y/o al final de la gestación. Preferiblemente, las reinoculaciones son durante la gestación. Los cerdos también se pueden inocular, por ejemplo, antes del apareamiento. [0061] Los lechones, tales como lechones de hembras vacunadas (por ejemplo, inoculadas tal como se describe aquí), se inoculan en las primeras semanas de vida, por ejemplo, inoculación en la semana uno y/o dos y/o tres y/o cuatro y/o cinco de vida. Preferiblemente, los lechones se inoculan en primer lugar en la primera semana de vida

o en la tercera semana de vida (por ejemplo, en el momento del destete). De manera ventajosa, dichos lechones se refuerzan a continuación de dos a cuatro semanas después. [0062] La presente descripción se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes.

EJEMPLOS [0063] La descripción en una realización preferida se refiere a virus pox recombinantes que contienen en el mismo una secuencia de ADN de PCV2 en una región no esencial del genoma de virus pox. Los productos génicos que expresan los virus pox recombinantes del gen PCV2 exógeno. En particular, se aislaron los genes de ORF2 y ORF1 que codifican las proteínas de PCV2, se caracterizaron y se insertaron en recombinantes de ALVAC (vector de pox de canario). Las técnicas de biología molecular utilizadas son las descritas por Sambrook et al. (1989). Cell Lines and Virus Strains. La cepa de PCV2 designada como Imp:1010-Stoon se ha descrito previamente (Meehan et al., 1998). Se aisló a partir de tejidos de nódulos linfáticos mesentéricos de un cerdo enfermo originario de Canadá. La clonación del genoma de PCV2 se describió por Meehan et al. (1998). El plásmido pGem7ZImp1010-Stoon-EcoRI No. 14 contiene el genoma de PCV2 como un fragmento EcoRI insertado en el sitio EcoRI del plásmido pGem-7Z (Promega, Madison, WI). La secuencia de nucleótidos completa de la cepa de PCV-2 Imp.1010-Stoon PCV2 fue determinada por Meehan et al. (1998) y es capaz bajo el número de acceso de GenBank AF055392. [0064] El virus pox de canario parental (cepa Rentschler) es una cepa de vacuna para canarios. La cepa de vacuna se obtuvo de un aislado de tipo salvaje y se atenuó a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollitos. Se sometió una la semilla viral original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar y se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, después de lo cual se utilizó el virus original como virus parental en las pruebas de recombinación in vitro. El aislado de pox de canario purificado en placa se designó como ALVAC. ALVAC se depositó el 14 de noviembre de 1996 bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, ATCC número de acceso VR-2547. [0065] La generación de recombinantes del virus pox implica diferentes etapas: (a) construcción de un plásmido de inserción que contiene secuencias (“brazos”) que flanquean el locus de inserción en el genoma del virus pox, y un sitio de clonación múltiple (MCS) localizado ente los dos brazos flanqueantes (por ejemplo, véase el Ejemplo 1); (2) construcción de plásmidos dadores que consisten en un plásmido de inserción en el MCS en el que se ha insertado un cassette de expresión de genes exógenos (por ejemplo, véase los ejemplos 2 a 5); (3) recombinación in vitro en cultivo celular entre los brazos del plásmido dador y el genoma del virus pox parental que permite la inserción del cassette de expresión de genes exógenos en el locus apropiado del genoma del virus pox, y la purificación en placa del virus recombinante (por ejemplo, véase el ejemplo 6).

[0066] Los inmunógenos recombinantes de PCV2 se pueden utilizar asociados con inmunógenos de PCV1 para la inmunización de animales contra PMWS. En una estrategia menos preferida, se pueden utilizar inmunógenos de PCV1 sin inmunógenos de PCV2. Ejemplo 1 – CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDO DE INSERCIÓN DE POX DE CANARIO EN EL LOCUS C6 [0067] La figura 1 (SEC Id No. 1) es la secuencia de un segmento de 3,7 kb del ADN de pox de canario. El análisis de la secuencia reveló un ORF designado como C6L que se inicia en la posición 377 y termina en la posición 2254. A continuación, se describe un plásmido de inserción de C6 construido mediante la eliminación del ORF de C6 y su sustitución por un sitio de clonación múltiple (MCS) flanqueado por señales de terminación transcripción y traduccional. Se amplificó un fragmento por PCR de 380 pb a partir de ADN genómico de pox de canario utilizando los cebadores de oligonucleótidos C6A1 (SEC ID NO:2) y C6B1 (SEQ ID NO:3). Se amplificó un fragmento por PCR de 1155 pb a partir de ADN genómico de pox de canario utilizando los cebadores de oligonucleótidos C6C1 (SEC ID NO:4) y C6D1 (SEC ID NO: 5). Los fragmentos de 380 pb y 1155 pb se fusionaron mediante su adición como plantilla y amplificación de un fragmento por PCR de 1613 pb utilizando los cebadores de oligonucleótidos C6A1 (SEC ID NO:2) y C6D1 (SEQ ID NO:5). Este fragmento se digirió con SacIy KpnI, y se unión en pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) digerido con SacI/KpnI. El plásmido resultante, pC6L se confirmó mediante análisis de la secuencia de ADN. Consiste en 370 pb de ADN de pox de canario en dirección 5’ de C6 (“brazo izquierdo de C6”), la señal de terminación temprana de vaccinia, los codones de parada de la traducción en seis marcos de lectura, un MCS que contiene los sitios SmaI, PstI, XhoIy EcoRI, señal de terminación temprana de vaccinia, codones de parada de la traducción en seis marcos de lectura y la secuencia de 1156 pb en dirección 3’ del pox de canario ("brazo derecho de C6"). [0068] Se derivó el plásmido pJP099 de pC6L mediante la unión de un cassette que contenía el promotor de vaccinia H6 (descrito en Taylor et al. (1988c), Guo et al. (1989), y Perkus et al. (1989)) acoplado a un gen exógeno en los sitios SmaI/EcoRI de pC6L. Este plásmido pJP099 contiene un sitio EcoRV único y un sitio NruI único localizados en el extremo 3’ del promotor H6 y un sitio SalI único localizado entre el codón de PARADA del gen exógeno y el brazo izquierdo de C6. El fragmento EcoRV/SalIo NruI/SalI de ~4,5 kb de pJP099 contiene por tanto la secuencia del plásmido (pBluescript SK+ ; Stratagene, La Jolla, CA, USA), los dos brazos de C6 y el extreme 5’ del promotor H6 hasta el sitio EcoRV o NruI. Secuencias de los cebadores:

[0069]

Cebador C6A1 (SEC ID NO:2) ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCA.AAAGTCTTAATGAGTT Cebador C6B1 (SEC ID NO:3)

imagen2

Cebador C6C1 (SEC ID NO:4) Cebador C6D1 (SEC ID NO:5) GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG

imagen2

Ejemplo 2 -CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDO DADOR DE ALVAC PARA ORF2 DE PCV2 [0070] Se digirió con EcoRI el plásmido pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRF No. 14, que contenía el genoma de PCV2 como un fragmento de EcoRI en el plásmido pGem-7Z, y se aisló y unión un fragmento de 1768 pb. [0071] Con el fin de insertar el ORF2 de PCV2 en un vector de inserción de ALVAC apropiado; Se utilizaron los cebadores JP760 (SEC ID NO:6) y JP773 (SEC ID NO:7) para amplificar el ORF2 de PCV2 a partir del fragmento de EcoRI unido de 1768 pb (ver anteriormente) que da lugar a J1304 de PCR. El cebador JP760 (SEC ID NO:6) contiene el extreme 3’ del promotor H6 de EcoRV y el extreme 5’ de ORF2 de PCV2. El cebador JP773 (SEC ID NO:7) contiene el extreme 3’ del ORF2 de PCV2 seguido del sitio SalI. El producto de la PCR J1304 se digirió a continuación con EcoRV/SalIy se clonó como un fragmento de ~750 pb en un fragmento de ~4,5 kb EcoRV/SalI de pJP099 (véase anteriormente en el ejemplo 1). El plásmido resultante se confirmó mediante el análisis de secuencia y se designó como pJP102 (véase el mapa de pJP102 en la Figura 2 y la secuencia (SEC ID NO:8) en la Figura 3). La secuencia de ORF2 coincide con la secuencia disponible en GenBank, Número de acceso AF055392. El plásmido dador pJP102 (linealizado con NotI) se utiliza en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el recombinante de ALVAC vCP1614 (véase el ejemplo 6). Secuencia de los cebadores:

[0072]

JP760 (SEC ID NO:6)

imagen2

JP773 (SEC ID NO:7) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC

Ejemplo 3 – CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO DADOR DE ALVAC PARA ORF1 Y ORF2 DE PCV2 [0073] Se amplificó el ORF1 de PCV2 mediante PCR utilizando los cebadores JP774 (SEC ID NO:9) y JP775 (SEC ID NO:10) en el plásmido pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI No. 14 que da lugar a J1311 de PCR. El cebador JP774 (SEC ID NO:9) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de NruI y el extremo 5’ de ORF1 de PCV2. El cebador JP775 (SEC ID NO:10) contiene el extremo 3’ del ORF1 de PCV2 seguido de un sitio SalI. El producto de PCR J1311 (~1Kb) se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante se confirmó mediante análisis de secuencia y se designó como pJP104. La secuencia de ORF1 coincide con la secuencia disponible en el GenBank, Número de Acceso AF055392. Se aisló un fragmento de ~970 pb de NruI/SalI de pJP 104 y se clonó en un fragmento de ~4,5 kb de NruI/SalI de pJP099 (véase el Ejemplo 1), que da lugar a un plásmido que se confirmó mediante análisis por restricción y se designó como pJP105 (véase la figura 4). El plásmido dador pJP105 se pudo utilizar en una prueba de recombinación in vitro (descrita en el ejemplo 6) para generar recombinante de ALVAC que expresa el ORF1 de PCV2. [0074] Se crearon extremos romos de un fragmento BamHI/SalI de pJP102 (ver el Ejemplo 2) utilizando el fragmento Klenow de ADN polimerasa, y se clonó en el sitio EcoRI con extremos romos creados por Klenow de pJP105. Se comprobó la orientación de inserción de los clones mediante el análisis de restricción y se eligió la orientación de cabeza a cabeza. Este plásmido se confirmó mediante el análisis de secuencia y se designó como pJP107 (véase el mapa de pJP107 en la Figura 5 y la secuencia (SEC ID NO:11) en la Figura 6). El plásmido dador pJP107 (linealizado con NotI) no se utilizó en una prueba de recombinación in vitro 5 (IVR) para generar el recombinante de ALVAC vCP1615 (véase el Ejemplo 6). Secuencia de los cebadores:

[0075]

JP774 (SEQ ID NO:9)

imagen2

JP775 (SEQ ID NO:10) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG

Ejemplo 4 -CONSTRUCCIÓN DE PLÁSMIDO DADOR DE ALVAC PARA ORF2 DE PCV1 [0076] Se utilizó el plásmido pPCV1 (B. Meehan et al. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221227), que contenía el genoma de PCV1 como fragmento Pst1en el plásmido pGem-7Z, como plantilla para amplificar el ORF2 de PCV1. [0077] Con el fin de insertar el ORF2 de PCV2 en un vector de inserción de ALVAC apropiado: Se utilizaron los cebadores JP787 (SEC ID NO:12) y JP788 (SEC ID NO:13) para amplificar el ORF2 de PCV1 del plásmido pPCV1 (ver anteriormente) que da lugar a J1315 de PCR. El cebador JP787 (SEC ID NO:12) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de EcoRV y ORF 2 seguido del sitio SalI. El producto de PCR J1315 se digirió a continuación con EcoRV/SalI y se clonó como un fragmento de ~750 pb en un fragmento de ~4,5 kb de EcoRV/SalI de pJP099 (véase anteriormente en el Ejemplo 1). El plásmido resultante se confirmó mediante análisis de secuencia y se designó como pJP113. La secuencia de ORF2 coincide con la secuencia disponible en GenBank, Número de Acceso U49186. El plásmido dador pJP1113 (linealizado con NotI) se utilizó en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el recombinante de ALVAC vCP1621 (véase el Ejemplo 7). Secuencia de los cebadores:

[0078]

JP787 (SEC ID NO:12)

imagen2

JP788 (SEC ID NO:13) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G

Ejemplo 5 -CONSTRUCCIÓN DE UN PLÁSMIDO PARA ORF2 Y ORF1 DE PCV1 [0079] Se digirió con PstI el plásmido pPCV1 (véase el Ejemplo 4 anterior), que contenía el genoma de PCV1 como un fragmento PstI en el plásmido pGem-7Z, y se aisló y ligó un fragmento de 1759 pb. [0080] Los cebadores JP789 (SEC ID NO:1) y JP790 (SEC ID NO:15) se utilizaron para amplificar el ORF1 de PCV1 del fragmento PstI unido de 1759 pb (ver anteriormente), que da lugar a J1316 de PCR. El cebador JP789 (SEC ID NO:14) contiene el extremo 3’ del promotor H6 de NruI y el extremo 5’ de ORF1 de PCV1. El cebador JP790 (SEC ID NO:15) contiene el extremo 3’ de ORF1 de PCV1 seguido de un sitio SalI. El producto de PCR J1316 (~1 Kb) se clonó en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante se confirmó mediante análisis de secuencia y se designó como pJP114. La secuencia de ORF1 coincide con la secuencia disponible en GenBank, Número de Acceso U49186. Se aisló un fragmento NruI/SalI de ~970 pb de pJP114 y se clonó en un fragmento NruI/SalI de ~4,5 kb de pJP099 (véase el Ejemplo 1), que da lugar a un plásmido que se confirmó mediante análisis de restricción y se designó como pJP115. El plásmido dador pJP115 se podría utilizar en una prueba de recombinación in vitro (descrito en el ejemplo 7) para generar un recombinante de ALVAC que expresa el ORF1 de PCV1. [0081] Se crearon extremos romos de un fragmento BamHI/SalI de pJP113 (ver el Ejemplo 4) utilizando el fragmento Klenow de ADN polimerasa, y se clonó en el sitio EcoRI con extremos romos creados por Klenow de pJP115. Se comprobó la orientación de inserción de los clones mediante el análisis de restricción y se eligió la orientación de cabeza a cabeza. Este plásmido se confirmó mediante el análisis de secuencia y se designó como pJP117. El plásmido dador pJP117 (linealizado con NotI) no se utilizó en una prueba de recombinación in vitro (IVR) para generar el recombinante de ALVAC vCP1622 (véase el Ejemplo 7). Secuencia de los cebadores:

[0082]

JP789 (SEC ID NO:1)

imagen2

JP790 (SEC ID NO:15) TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG

Ejemplo 6 – GENERACIÓN DE RECOMBINANTES DE ALVAC-PCV2 [0083] Se linealizaron los plásmidos pJP102 (véase el Ejemplo 2 y la figura 2) y pJP107 (véase el Ejemplo 3 y la figura 5) con NotI y se transfectaron en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el método de precipitación fosfato de calcio descrito anteriormente (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987). Se seleccionaron las placas positivas en base a la hibridación a sondas radiomarcadas de PCV2 específicas y se sometieron a cuatro rondas secuenciales de purificación en placa hasta conseguir una población pura. A continuación, se amplificó una placa representativa de cada IVR y los recombinantes de ALVAC resultantes se designaron como vCP1614 y vCP1615. El virus vCP1614 es el resultado de los casos de recombinación entre ALVAC y el plásmido dador pJP102 y contiene el ORF2 de PCV2 insertado en el locus C6 de ALVAC. El virus vCP1615 es el resultado de los casos de recombinación entre ALVAC y el plásmido dador pJP107, y contiene el ORF2 y ORF1 de PCV2 insertados en el locus C6 de ALVAC en la orientación de cabeza a cabeza. [0084] De una forma similar, un ALVAC recombinante que expresa sólo el ORF1 de PCV2 se puede generar utilizando el plásmido dador pJP105 descrito en el ejemplo 3. [0085] Inmunofluorescencia. Con el fin de determinar si las proteínas de PCV2 se expresaban en las células Vero infectadas con el recombinante de ALVAC, se realizó un análisis de la inmunofluorescencia (IF). Las células Vero infectadas se lavaron con PBS 24 horas después de la infección (m.o.i. de aproximadamente 10) y se fijaron con acetona fría al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se utilizaron cinco preparaciones de anticuerpo monoclonales (MAb) (sobrenadante de hibridoma) específicas para ORF1 de PCV2 (PCV2 199 1D3GA & PCV2 210 7G5GD) o ORF2 de PCV2 (PCV2 190 4C7CF, PCV2 190 2B1BC & PCV2 190 3A8BC) como primer anticuerpo. Estos anticuerpos monoclonales se obtuvieron de Merial-Lyon. Los anticuerpos monoclonales también se pueden obtener siguiendo las enseñanzas de los documentos citados en la presente invención, por ejemplo WO-A-99 18214, 1998, las solicitudes francesas Nos. 97/12382, 98/00873, 98/03707, solicitadas el 3 de octubre de 1997, 22 de enero de 1998, y 20 de marzo de 1998, y WO99/29717. La reacción IF se realizó tal como se describe por Taylor et al. (1990). [0086] La inmunofluorescencia específica de PCV2 con los tres anticuerpos específicos de ORF2 se podía detectar en células infectadas con vCP1614 y las células infectadas con vCP1615. La inmunofluorescencia específica de PCV2 con los dos anticuerpos específicos de ORF1 se podía detectar en células infectadas sólo con vCP1615. Estos resultados indicaban que, tal como se esperaba, el vCP1614 expresa sólo ORF2, mientras que vCP1615 expresa tanto ORF1 como ORF2. No se detectó fluorescencia en células Vero infectadas con ALVAC, ni en células Vero no infectadas.

Ejemplo 7 – GENERACIÓN DE RECOMBINANTES ALVAC-PCV1 [0087] Se linealizaron los plásmidos pJP113 (véase el Ejemplo 4) y pJP117 (véase el Ejemplo 5) con NotI y se transfectaron en células CEF primarias infectadas con ALVAC utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio descrito previamente (Panicali y Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987). Se seleccionaron las placas positivas en base a la hibridación a sondas radiomarcadas de PCV1 específicas y se sometieron a cuatro rondas secuenciales de purificación en placa hasta conseguir una población pura. A continuación, se amplificó una placa representativa de cada IVR y los recombinantes de ALVAC resultantes se designaron como vCP1621 y vCP1622. El virus vCP1621 es el resultado de los casos de recombinación entre ALVAC y el plásmido dador pJP113 y contiene el ORF2 de PCV1 insertado en el locus C6 de ALVAC. EL virus vCP1622 es el resultado de los casos de recombinación entre ALVAC y el plásmido dador pJP117, y contiene el ORF2 y ORF1 de PCV1 insertados en el locus C6 de ALVAC en la orientación de cabeza a cabeza. [0088] De una forma similar, un ALVAC recombinante que expresa sólo el ORF1 de PCV1 se puede generar utilizando el plásmido dador pJP115 descrito en el ejemplo 5. [0089] Inmunofluorescencia. Con el fin de determinar si las proteínas de PCV1 se expresaban en las células Vero infectadas con el recombinante de ALVAC, se realizó un análisis de la inmunofluorescencia (IF). Las células Vero infectadas se lavaron con PBS 24 horas después de la infección (m.o.i. de aproximadamente 10) y se fijaron con acetona fría al 95% durante 3 minutos a temperatura ambiente. Se utilizó un suero policlonal de cerdo anti-PCV1 específico (Allan G. et al. Microbiol. 1999, 66: 115123) como primer anticuerpo. La reacción IF se realizó tal como se describe por Taylor et al. (1990). [0090] La inmunofluorescencia específica de PCV1 se podía detectar en células infectadas con vCP1621 y células infectadas con vCP1622. Estos resultados indicaban que, tal como se esperaba, el vCP1621 y vCP1622 expresan productos específicos de PCV1. No se detectó fluorescencia con suero policlonal de cerdo específico de PCV2 en células infectadas con vCP1621 y en células infectadas con vCP1622. No se detectó fluorescencia en células Vero infectadas con ALVAC parental, ni en células Vero no infectadas.

Ejemplo 8 – FORMULACIÓN DE VIRUS POX DE CANARIO RECOMBINANTES CON CARBOPOL™ 974P [0091] Para la preparación de vacunas, se pueden mezclar virus de pox de canario recombinantes vCP1614 y vCP1615 (Ejemplo 6) con soluciones de carbómero. De la misma manera, los virus pox de canario recombinantes vCP1621 y vCP1622 (Ejemplo 7) se pueden mezclar con soluciones de carbómero. El componente carbómero utilizado para la vacunación de cerdos es el Carbopol™ 974P fabricado por la compañía BF Goodrich (peso molecular de # 3,000,000). Se prepara en primer lugar una solución madre de Carbopol™ 974P al 1,5% en agua destilada que contenía 1 g/l de cloruro sódico. Esta solución madre se utiliza a continuación para fabricar una solución de Carbopol™ 974P de 4 mg/ml en agua fisiológica. La solución madre se mezcla con el volumen requerido de agua fisiológica, ya sea en una etapa o en varias etapas sucesivas, ajustando el valor de pH en cada etapa con una solución de hidróxido de sodio 1 N (o más concentrado) para obtener un pH final de 7,3-7,4. Esta solución de Carbopol™ 974P final es una solución lista para su uso para reconstituir un virus recombinante liofilizado o para diluir una solución madre de virus recombinante concentrado. Por ejemplo, para obtener una suspensión viral final que contenía 10e8 pfu por dosis de 2 ml, se pueden diluir 0,1 ml de una solución madre de 10e9 pfu/ml en 1,9 ml de la solución lista para su uso anterior de Carbopol™ 974P 4 mg/ml. De la misma manera, también se pueden preparar soluciones listas para su uso Carbopol™ 974P 2 mg/ml.

Ejemplo 9 – INMUNIZACIÓN DE CERDOS Y POSTERIOR ESTIMULACIÓN

9.1. INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 1 DÍA DE VIDA [0092] Se colocaron en aisladores grupos de lechones, expulsados por cesárea en el día

0. Los lechones se vacunan mediante ruta intramuscular en el día 2 con varias soluciones de vacunas. Las suspensiones virales de vacunas se preparan mediante dilución de soluciones madre de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl 0,9%). Los intervalos adecuados para suspensiones virales se pueden determinar empíricamente, pero variarán en general desde 106 a 1010 , y preferiblemente aproximadamente 1010 , pfu/dosis. Las soluciones de vacunas también se pueden preparar mezclando la suspensión de virus recombinante con una solución de Carbopol™ 974P, tal como se describe en el Ejemplo 8. [0093] Los lechones se vacunan con: Virus recombinante vCP1614 (Ejemplo 2); Virus recombinante vCP1615 (Ejemplo 3); Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (solución de 4 mg/ml); o virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (solución de 4 mg/ml). [0094] Las suspensiones virales contienen 108 unidades formadoras de placas (pfu) por dosis. Cada suspensión viral se inyecta mediante vía intramuscular bajo un volumen de 1 ml. La inyección intramuscular se administra en los músculos del cuello. [0095] Se administran dos inyecciones de suspensiones virales en el Día 2 y el Día 14 del experimento. Se realiza una estimulación en el Día 21 mediante la administración oronasal de una suspensión viral preparada a partir de un cultivo de una cepa virulenta de PCV-2. Después de la estimulación, se monitorizan los lechones durante 3 semanas por los signos clínicos específicos del síndrome del desmedro multisistémico post-destete. Se valoran los siguientes signos: Temperatura rectal: monitorización diaria durante 2 semanas después de la estimulación, a continuación 2 mediciones de la temperatura rectal durante la tercera semana. Peso: los lechones se pesan justo antes de la estimulación y a continuación semanalmente durante las primeras 3 semanas después de la estimulación. [0096] Se toman muestras en el Día 2, Día 14, Día 21, Día 28, Día 35, y Día 42 del experimento con el fin monitorizar los niveles de viremia y títulos de anticuerpo específico anti-PCV2. Necropsias: en el Día 42, todos los lechones supervivientes se someten a eutanasia de manera humana y se les practica la necropsia para buscar lesiones macroscópicas específicas de PMWS. Las muestras de tejido se preparan a partir de hígado, nódulos linfáticos, bazo, riñones y timo con el fin de buscar lesiones histológicas específicas.

9.2. INMUNIZACIÓN DE LECHONES DE 5-7 SEMANAS DE VIDA [0097] Se vacunan lechones de 5-7 semanas de vida, libres de anticuerpos maternos específicos anti-PCV2, mediante vía intramuscular con varias soluciones de vacunas. Se preparan suspensiones virales de vacunas mediante la dilución de soluciones madre de virus recombinantes en agua fisiológica estéril (NaCl al 0,9%). Las soluciones de vacunas también se pueden preparar mezclando la suspensión de virus recombinantes con una solución de Carbopol™ 974P, tal como se describe en el Ejemplo 8. [0098] Los lechones se vacunan con: Virus recombinante vCP1614 (Ejemplo 2); Virus recombinante vCP1615 (Ejemplo 3); Virus recombinante vCP1614 mezclado con Carbopol (solución de 4 mg/ml); o virus recombinante vCP1615 mezclado con Carbopol (solución de 4 mg/ml). [0099] Las suspensiones virales contienen 108 unidades formadoras de placas (pfu) por dosis. Cada suspensión viral se inyecta mediante vía intramuscular bajo un volumen de 2 ml. La inyección intramuscular se administra en los músculos del cuello. [0100] Se administran dos inyecciones de suspensiones virales en el Día 0 y el Día 21 del experimento. Se realiza una estimulación en el Día 35 mediante la administración oronasal de una suspensión viral preparada a partir de un cultivo de una cepa virulenta de PCV-2. Después de la estimulación, se monitorizan los lechones durante 8 semanas por los signos clínicos específicos del síndrome del desmedro multisistémico post-destete. La monitorización clínica es idéntica a la descrita en el Ejemplo 9.1, a excepción de que la duración total de la monitorización es de 8 semanas en lugar de 3 semanas. [0101] Las necropsias se realizan a través del experimento para lechones que mueren a partir del estímulo y al final del experimento (Día 97) para todos los lechones supervivientes. Las muestras de tejido son las mismas que se han descrito en el Ejemplo 9.1.

9.3. INMUNIZACIÓN DE LECHONES RECIÉN NACIDOS [0102] Se colocan en aisladores grupos de 3 ó 4 lechones expulsados por cesárea en el día 0. En el día 2 se vacunan los lechones con 108 pfu de vCP 1614, vCP 1615 o vector de ALVAC parental en 1 ml de PBS mediante vía intramuscular en la parte del cuello.

Se administra una segunda inyección de vacuna o placebo en el día 14. La vacunación con recombinante de ALVAC es bien tolerada por lechones y no se observa evidencia de reacción adversa a la vacunación. Los lechones se estimulan en el día 21 mediante administración oronasal de una suspensión viral de PCV-2, 1 ml en cada conducto

5 nasal. Se realizan necropsias en el día 45 y se recogen muestras de tejido para el aislamiento del virus. [0103] Resultados de la necropsia:

• El PMWS se caracteriza en general por linfadenopatía y más raramente por hepatitis

o nefritis. De este modo, las observaciones generales en nódulos linfáticos se valoran

10 para cada lechón de la siguiente manera: 0 = no se observa aumento visible de los nódulos linfáticos; 1 = aumento ligero de los nódulos linfáticos, limitado a nódulos linfáticos bronquiales; 2 = aumento moderado de los nódulos linfáticos, limitado a nódulos linfáticos bronquiales; 3 = aumento severo de los nódulos linfáticos, extendido a nódulos linfáticos bronquiales, submandibular prescapular e inguinal. Grupos Valoración [0104] La linfadenopatía bronquial para PCV-2 es una observación general prominente. Se observa una reducción significativa de la lesión de nódulos linfáticos en relación con el grupo de control después de la inmunización con vCP 1614 y vCP 1615 (p ≤0,05).

vCP1614: 0,5

0,0

0,0

1,0

promedio: 0,38

desviación estándar: 0,48

vCP1615: 0,0

0,5

0,5

1,0

promedio: 0,5

desviación estándar: 0,41

Controles: 2,0

2,5

2,5

2,5

promedio: 2,38

desviación estándar: 0,25

REFERENCIAS [0105]

1.: Clark, E.G. Proc. Amer. Assoc. Swine Pract., pp. 499-501 (1997).

2.: Edbauer, C., R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, P. Desmettre y E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1990).

3.: Ellis, J., L. Hassard, E. Clark, J. Harding, G. Allan, P. Willson, J. Strakappe, K. Martin, F. McNeilly, B. Meehan, D. Todd, D. Haines, Can. Vet. J. 39, 44-51(1998).

4.: Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, E. Paoletti, Virology 179, 247-266, 517-563 (1990).

5.: Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and

E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).

6.: Hamel, A.L., L.L. Lin and G. P.S. Nayar, J. Virol. 72, 5262-5267 (1998).

7.: Harding J.C., Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 28, 503 (1997).

8.: Mankertz, A., J. Mankertz, K. Wolf, H.-J. Buhk, Gen. Virol. 79, 381-384 (1998a).

9.: Mankertz, J., H.-J. Buhk, G. Blaess, A. Mankertz, Virus Gene 16,267-276 (1998b).

10.: Matthews, R.E.F., Intervirology 17, 42-44 (1982).

11.: Meehan, B.M., J.L. Creelan, M.S. McNulty, D. Todd, J. Gen. Virol. 78, 221-227 (1997).

12.: Meehan, B.M., F. McNeilly, D. Todd, S. Kennedy, V.A. Jewhurst, J.A. Ellis, L.E. Hassard, E.G. Clark, D.M. Haines, G.M. Allan, J. Gen. Virol. 79,2171-2179 (1998).

13.: Nayar, G.P.S., A. Hamel and L. Lin. Can. Vet. J. 38, 385-386 (1997).

14.: Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

15.: Paoletti, E., B.R. Lipinskaks, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 193-197 (1984).

16.: Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).

17.: Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

18.: Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, In Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press, NY) (1989).

19.: Tartaglia, J., J. Winslow, S. Goebel, G.P. Johnson, J. Taylor, and E. Paoletti, J.

Gen. Virol. 71, 1517-1524 (1990).

20.: Tartaglia, J., Perkus ME, Taylor J, Norton EK, Audonnet JC, Cox WI, Davis SW, van der Hoeven J, Meignier B, Riviere M, and E. Paoletti, Virology 188, 217-32 (1992).

21.: Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, Ph. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988a).

22.: Taylor, J. and E. Paoletti, Vaccine 6, 466-468 (1988b).

23.: Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster and E. Paoletti, Vaccine 6, 504508 (1988c).

24.: Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre and E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

25.: Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and

E. Paoletti, Vaccine 9, 190-193 (1991).

26.: Taylor J, Weinberg R, Tartaglia J, Richardson C, Alkhatib G, Briedis D, Appel M, Norton E, Paoletti E., Virology187, 321-328 (1992).

27.: Todd, D., F.D. Niagro, B.W. Ritchie, W. Curran, G.M. Allan, P.D. Lukert, K.S. Latimer, W.L. Steffens, M.S. McNulty, Arch. Virol. 117, 129-135 (1991). LISTADO DE SECUENCIAS

[0106]

(1): INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTE: Bublot, Michel Perez, Jennifer M. Charreyre, Catherine E.

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Virus pox recombinante del Circovirus Porcino 2

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 13

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: Frommer Lawrence HaugLLP

(B): CALLE: 745 Fifth Avenue

(C): CIUDAD: NY

(D): ESTADO: NY

(E): PAÍS: USA

(F): CP: 10151

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: DISQUETE

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.25

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: 5 (B) FECHA DE SOLICITUD:

(C) CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

(A): NOMBRE: Kowalski, Thomas J.

(B): NÚMERO DE RESGITRO: 32, 147

10 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 4543132511.1

(ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

(A) TELÉFONO: 212-588-0800

(B): TELEFAX: 212-588-0500 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3701 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple 20 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:1:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:2:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:2:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:3:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 73 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:3:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:4:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 72 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:4:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:5:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 45 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:5:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:6:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:6:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:7:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:7:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:8:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 2520 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico 15 (C) CADENA: simple

imagen2

10

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO: 8:

imagen2

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:9:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:9:

imagen2

10 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:10:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:10:

imagen2

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:11: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 3609 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal 25 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:11:

imagen2

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:12:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 53 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi): DESCRIPCIONES DE SECUENCIAS SEC ID NO:12:

(2): INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:13:

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

(B): TIPO: ácido nucleico

(C): CADENA: simple

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEC ID NO:13:

imagen2

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad al respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

•: FR 9803707 [0006] [0086]

•: US 5185146 A [0011]

•: US 4769330 A [0016]

•: US 4722848 A [0016]

•: US 4603112 A [0016]

•: US 5110587 A [0016]

•: US 5174993 A [0016]

•: US 5494807 A [0016] [0026]

•: US 5505941 A [0016]

•: US 5364773 A [0026]

•: US 5762938 A [0026]

•: US 5756103 A [0027]

•: US 5766599 A [0027]

•: US 6004777 A [0027]

•: US 5990091 A [0027]

•: US 5770212 A [0027]

•: US 6033904 A [0027]

•: US 5869312 A [0027]

•: US 5382425 A [0027]

•: WO 9530018 A [0027]

•: US 5843456 A [0034]

•: US 2909462 A [0037]

•: US 16109298 A [0047] [0052]

•: WO 9918214 A [0047] [0051] [0052] [0055] [0086]

•: JP 775 A [0074]

•: FR 9712382 [0086]

•: FR 9800873 [0086]

•: WO 9929717 A [0086]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

•: REMINGTONS PHARMACEUTICAL SCIENCE. 1995 [0035]

•: Phameuropa, June 1996, vol. 8 (2 [0037]

•: J. Fields et al. Nature, 04 June 1960, vol. 186, 778-780 [0038]

•: A.L. Hamel et al. J. Virol., June 1998, vol. 72 (6), 5262-5267 [0047]

•: I. Morozov et al. J. Clinical Microb., September 1998, vol. 36 (9), 2535-2541 [0047]

•: Myers ; Miller. Optimal Alignments in Linear Space. CABIOS, 1988, vol. 4, 11-17 [0057]

•: Wilbur ; Lipman. PNAS USA, 1983, vol. 80, 726 [0058]

•: Altschul et al. Nucl. Acids Res., vol. 25, 3389-3402 [0060]

•: Needleman SB ; Wunsch CD. A general meted applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins. J. Mol. Biol., 1970, vol. 48, 444-453 [0060]

•: Smith TF ; Waterman MS. Comparison of Bio-sequences. Advances in Applied Mathematics, 1981, vol. 2, 482-489 [0060]

•: Smith TF ; Waterman MS ; Sadler JR. Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains. Nucleic Acids Res, 1983, vol. 11, 2205-2220 [0060]

•: Feng DF ; Dolittle RF. Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees. J. of Molec. Evol., 1987, vol. 25, 351-360 [0060]

•: Higgins DG ; Sharp PM. Fast and sensitive múltiple sequence alignment on a microcomputer. CABIOS, 1989, vol. 5, 151-153 [0060]

•: Thompson JD ; Higgins DG ; Gibson TJ. ClusterW: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighing, positionsspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res., 1994, vol. 22, 4673-480 [0060]

•: Devereux J ; Haeberlie P ; Smithies O. A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX. Nucl. Acids Res., 1984, vol. 12, 387-395 [0060]

•: Sambrook et al. Cell Lines and Virus Strains, 1989 [0064]

•: B. Meehan et al. J. Gen. Virol., 1997, vol. 78, 221-227 [0077]

•: Allan G. et al. Vet. Microbiol., 1999, vol. 66, 115-123 [0090]

•: Clark, E.G. Proc. Amer. Assoc. Swine Pract., 1997, 499-501 [0106]

•: Edbauer, C. ; R. Weinberg ; J. Taylor ; A. Rey-Senelonge ; J.F. Bouquet ; P. Desmettre ; E. Paoletti. Virology, 1990, vol. 179, 901-904 [0106]

•: Ellis, J. ; L. Hassard ; E. Clark ; J. Harding ; G. Allan ; P. Willson ; J. Strakappe ; K. Martin ; F. McNeilly ; B. Meehan. Can. Vet. J., 1998, vol. 39, 44-51 [0106]

•: Goebel, S.J. ; G.P. Johnson ; M.E. Perkus ; S.W. Davis ; J.P. Winslow ; E. Paoletti. Virology, 1990, vol. 179, 247-266517-563 [0106]

•: Guo, P. ; S. Goebel ; S. Davis ; M.E. Perkus ; B. Languet ; P. Desmettre ; G. Allen ;

E.: Paoletti. J. Virol., 1989, vol. 63, 4189-4198 [0106]

•: Hamel, A.L. ; L.L. Lin ; G. P.S. Nayar. J. Virol., 1998, vol. 72, 5262-5267 [0106]

•: Harding J.C. Proc. Am. Assoc. Swine Pract., 1997, vol. 28, 503 [0106]

•: Mankertz, A. ; J. Mankertz ; K. Wolf ; H.-J. Buhk. Gen. Virol., 1998, vol. 79, 381384 [0106]

•: Mankertz, J. ; H.-J. Buhk ; G. Blaess ; A. Mankertz. Virus Gene, 1998, vol. 16, 267276 [0106]

•: Matthews, R.E.F. Intervirology, 1982, vol. 17, 42-44 [0106]

•: Meehan, B.M. ; J.L. Creelan ; M.S. McNulty ; D. Todd. J. Gen. Virol., 1997, vol. 78, 221-227 [0106]

•: Meehan, B.M. ; F. McNeilly ; D. Todd ; S. Kennedy ; V.A. Jewhurst ; J.A. Ellis ;

L.E. Hassard ; E.G. Clark ; D.M. Haines ; G.M. Allan. J. Gen. Virol., 1998, vol. 79, 2171-2179 [0106]

•: Nayar, G.P.S. ; A. Hamel ; L. Lin. Can. Vet. J., 1997, vol. 38, 385-386 [0106]

•: Panicali, D. ; E. Paoletti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol. 79, 4927-4931 [0106]

•: Paoletti, E. ; B.R. Lipinskaks ; C. Samsonoff ; S. Mercer ; D. Panicali. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1984, vol. 81, 193-197 [0106]

•: Perkus, M.E. ; K. Limbach ; E. Paoletti. J. Virol., 1989, vol. 63, 3829-3836 [0106]

•: Piccini, A. ; M.E. Perkus ; E. Paoletti. Methods in Enzymology. Academic Press, 1987, vol. 153, 545-563 [0106]

•: Sambrook, J. ; E.F. Fritsch ; T. Maniatis. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0106]

•: Tartaglia, J. ; J. Winslow ; S. Goebel ; G.P. Johnson ; J. Taylor ; E. Paoletti. J. Gen. Virol., 1990, vol. 71, 1517-1524 [0106]

•: Tartaglia, J. ; Perkus ME ; Taylor J ; Norton EK ; Audonnet JC ; Cox WI ; Davis SW ; van der Hoeven J ; Meignier B ; Riviere M. Virology, 1992, vol. 188, 217-32 [0106]

•: Taylor, J. ; R. Weinberg ; B. Languet ; Ph. Desmettre ; E. Paoletti. Vaccine, 1988, vol. 6, 497-503 [0106]

•: Taylor, J. ; E. Paoletti. Vaccine, 1988, vol. 6, 466-468 [0106]

•: Taylor, J. ; R. Weinberg ; Y. Kawaoka ; R. Webster ; E. Paoletti. Vaccine, 1988, vol. 6, 504-508 [0106]

•: Taylor, J. ; C. Edbauer ; A. Rey-Senelonge ; J.F. Bouquet ; E. Norton ; S. Goebel ; P. Desmettre ; E. Paoletti. J. Virol., 1990, vol. 64, 1441-1450 [0106]

•: Taylor, J. ; C. Trimarchi ; R. Weinberg ; B. Languet ; F. Guillemin ; P. Desmettre ; E. Paoletti. Vaccine, 1991, vol. 9, 190-193 [0106]

•: Taylor J ; Weinberg R ; Tartaglia J ; Richardson C ; Alkhatib G ; Briedis D ; Appel M ; Norton E ; Paoletti E. Virology, 1992, vol. 187, 321-328 [0106]

•: Todd, D. ; F.D. Niagro ; B.W. Ritchie ; W. Curran ; G.M. Allan ; P.D. Lukert ; K.S. Latimer ; W.L. Steffens ; M.S. McNulty. Arch. Virol., 1991, vol. 117, 129-135 [0106]

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición inmunogénica que comprende (i) un virus pox

recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de circovirus porcino de tipo 2 (PCV2);

y (ii) un portador.
2.

Composición inmunogénica según la reivindicación 1, donde el virus pox recombinante es un virus pox de canario ALVAC recombinante.
3.

Composición inmunogénica según la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 y PCV2.
4.

Composición inmunogénica según la reivindicación 3, donde dicho ALVAC tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1 y dicho locus C6 se encuentra en una posición de 377 a 2254 de la SEC ID No 1 y donde la molécula de ADN aislada se encuentra en el locus C6 del genoma de virus pox de canario ALVAC.
5.

Composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene un adyuvante.
6.

Composición inmunogénica según la reivindicación 5, donde el adyuvante es un carbómero.
7. Utilización de un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones sucesivas en placa bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales, y donde la molécula de ADN aislada comprende ORF2 de PCV2;

para la preparación de una composición inmunogénica para inducir una respuesta inmune contra PCV2 en un cerdo adulto, un cerdo joven o una cerda gestante.
8. Utilización según la reivindicación 7, donde la composición inmunogénica se administra a una cerda antes de aparearse y de nuevo durante la gestación.
9.

Utilización según la reivindicación 8, donde la composición inmunogénica se administra durante la gestación en aproximadamente las semanas 6-8 de gestación y/o aproximadamente las semanas 11-13 de gestación.
10.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para conferir inmunidad pasiva a un lechón recién nacido.
11.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la composición inmunogénica se administra a una hembra gestante y a continuación a su lechón o lechones después del nacimiento.
12.

Utilización según la reivindicación 7 u 11, donde la composición inmunogénica se administra a un lechón entre el nacimiento y el destete.
13.

Utilización según la reivindicación 12, donde la composición inmunogénica se administra a un lechón en la primera semana de vida o en la tercera semana de vida, y preferiblemente se administra de nuevo de dos a cuatro semanas más tarde.
14.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, donde la composición inmunogénica contiene un adyuvante.
15.

Utilización según la reivindicación 14, donde el adyuvante es un carbómero.
16.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 de PCV2.
17. Vacuna que comprende (i) un virus pox recombinante que comprende una molécula de ADN aislada, donde el virus pox es:

ALVAC, o

un pox de canario atenuado donde dicho virus pox de canario se atenúa a través de más de 200 pases en serie sobre fibroblastos de embriones de pollito, del cual se sometió la semilla original a cuatro purificaciones en placa sucesivas bajo agar, de donde se amplificó un clon de placa a través de cinco pases adicionales,

y donde la molécula de ADN aislada comprende el ORF2 del circovirus porcino de tipo 2 (PCV2); y (ii) un portador.
18. Vacuna según la reivindicación 17, donde el virus pox recombinante es un virus pox de canario ALVAC recombinante.
19. Vacuna según la reivindicación 17 ó 18, donde la molécula de ADN aislada comprende ORF1 de PCV2 y ORF2 de PCV2.
20. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde dicho ALVAC tiene la secuencia mostrada en la SEC ID No. 1 y dicho locus C6 se encuentra en la posición 377 a 2254 de SEC ID No 1 y donde la molécula de ADN aislada se

5 encuentra en el locus C6 del genoma del virus pox de canario de ALVAC.
21.

Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que contiene un adyuvante.
22.

Vacuna según la reivindicación 21, donde el adyuvante es un carbómero.