ES2348404T3

ES2348404T3 - Mutantes de factores de crecimiento con actividad biologica aumentada.

Info

Publication number: ES2348404T3
Application number: ES06723209T
Authority: ES
Inventors: Frank Ploger; Stefan Mundlos; Jens Pohl; Michael Kruse; Petra Knaus
Original assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH; Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Current assignee: Biopharm Gesellschaft zur Biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH; Charite Universitaetsmedizin Berlin; Freie Universitaet Berlin
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2010-12-03
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: CA2600951A1; DE602006016406D1; WO2006094722A2; ATE478943T1; AU2006222283B2; US9012401B2; EP1856249B1; JP2008538073A; EP1698691A1; WO2006094722A3; EP1856249A2; AU2006222283A1; DK1856249T3; US20080260830A1

Abstract

Proteína recombinante que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana como se muestra en los aminoácidos 400-501 de FIG. 1 o SEQ ID NO 1, en donde a) en dicha proteína recombinante, el aminoácido en la posición correspondiente a argi- nina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es alanina, valina, leucina, isoleucina o metionina, y/o b) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a aspa- ragina 445 (N445) de GDF5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es serina o treonina.

Description

La presente invención se refiere a nuevos mutantes de factores de crecimiento biosintéticos recombinantes que exhiben actividad biológica aumentada. Dicha actividad proteínica au-mentada se consigue por la sustitución de aminoácidos específicos de las proteínas factores de crecimiento originales que existen naturalmente de la superfamilia β de factores de cre-10 cimiento transformantes de moléculas de señalización. Las proteínas recombinantes pro-porcionadas en esta invención son particularmente adecuadas para regeneración, estimulación y diferenciación del crecimiento de diversas células, tejidos y órganos. La in-vención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos mutantes proteínicos recombinantes, vectores de expresión y células hospedadoras que contienen las 15 moléculas de ácido nucleico, anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas mutantes, com-posiciones farmacéuticas y métodos para la producción de los mutantes de factores de cre-cimiento.

La superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) com-prende más de 35 miembros que incluyen TGF-betas, proteínas morfogenéticas óseas 20 (BMPs), activinas, inhibinas y factores de crecimiento/diferenciación (GDFs). Las proteínas de la superfamilia TGF-beta promueven la proliferación y diferenciación celular así como la formación de tejido y son relevantes para una extensa gama de métodos y aplicaciones de tratamiento médico. Estas moléculas dímeras actúan a través de complejos receptores es-pecíficos que están compuestos por quinasas receptoras serina/treonina de tipo I y tipo II. 25 Las quinasas receptoras activan subsiguientemente proteínas Smad, que propagan luego las señales hasta el núcleo a fin de regular la expresión de los genes diana. Caminos de señalización independientes de Smad son iniciados también por estos receptores y dan como resultado la inducción del camino de las quinasas MAP. Las Smads son una familia singular de moléculas de transducción de señales que pueden transmitir señales directa-30 mente desde los receptores de la superficie celular al núcleo, donde las mismas regulan la transcripción por interacción con parejas de fijación de DNA y coactivadores y correpresores de la transcripción.

Los miembros de esta familia de proteínas se sintetizan inicialmente como proteínas precur-soras heterogéneas grandes que sufren subsiguientemente escisión proteolítica en un con-35 junto de residuos básicos de aproximadamente 110-140 aminoácidos del término C, liberando así las partes de proteína madura C-terminales del prodominio N-terminal. Todos los polipéptidos maduros están relacionados estructuralmente y contienen un dominio bioac-

tivo conservado que comprende seis o siete residuos cisteína canónicos que son responsa-bles del motivo tridimensional característico "nudo de cisteína" de estas proteínas.

Los diversos miembros de la superfamilia pueden clasificarse ulteriormente en subfamilias y subgrupos distintos, basados en la extensión de homología/identidad de su motivo núcleo de cisteína. Se sabe que las unidades solapantes de proteínas morfogenéticas óseas y fac-5 tores de crecimiento/diferenciación (GDFs) juegan una serie diversa de papeles en el siste-ma esquelético y otros tejidos (véase, a saber, Ducy y Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214 para una revisión). Especialmente la GDF-5 humana (la proteína se conoce también como MP52, CDMP-1 o a veces como BMP-14), GDF-6 (CDMP-2, BMP13) y GDF-7 (CDMP-3, BMP-12) han sido agrupadas como un grupo por varios autores debido a sus 10 propiedades biológicas comparables y al grado extraordinariamente alto de identidad de secuencia de aminoácidos (véase p.ej. Mikic 2004, Annals of Biomedical Engineering 32, 466-476; Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330).

Además de las funciones prominentes del subgrupo GDF-5/-6/-7 en la formación de novo de hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Set-15 tle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130), se ha demostrado repetidas veces que los miembros de este subgrupo son también inductores y reguladores importantes de tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330), tejido nervioso (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabe et al. 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464), ligamento periodontal y dientes (Sena et al 2003, J. Dent. Res. 82, 166-20 171; Morotome et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 8590), y otros tejidos.

Las estructuras de genes y proteínas de diversos(as) BMPs/GDFs existentes naturalmente, con inclusión de GDF-5, GDF-6 y GDF-7 han sido esclarecidas previamente. Pudieron iden-tificarse varios mutantes de pérdida de función de GDF-5 que, conducen v.g. al acortamien-to de los dedos de las manos y los pies (braquidactilia tipo C) y otras anormalidades 25 esqueléticas tales como braquipodismo en animales (Storme et al. 1994, Nature 368, 639-643) y displasias acromesomélicas en el hombre (Thomas et al. 1996, Nature Gen. 12, 315-317). Con respecto a estos mutantes se ha encontrado que sustituciones específicas de aminoácidos en las posiciones 173, 204, 400, 438, 441 y 498 de GDF-5 humana reducen o anulan por completo la función de la proteína (Schwabe et al. 2004, Amer. J. Med. Genet. 30 124A, 356-363). En contraste, únicamente muy pocos mutantes de GDF con actividad bio-lógica incrementada se conocen hasta la fecha. Un ejemplo raro se describe en WO 01/11041 y se refiere a GDF-5 monómera activa que carece del residuo cisteína normal-mente responsable de la dimerización.

WO 95/04810 describe una proteína de la familia TGF-β así como el DNA que codifica esta 35 proteína y una composición farmacéutica que contiene esta proteína.

La búsqueda de las moléculas responsables de la actividad inductora de hueso, cartílago, y otros tejidos ha conducido al descubrimiento de una serie de moléculas denominadas facto-

res de crecimiento/diferenciación. Debido a sus actividades singulares inductoras de tejido, estas proteínas han sido aplicadas con éxito en investigación terapéutica y cirugía regenera-tiva en la cual las mismas promueven y coadyuvan al proceso de curación natural de tejidos deteriorados, sea solas o en combinación con materiales específicos portadores y/o de ma-triz. Sin embargo, existe una gran necesidad de desarrollar formas mejoradas y más eficien-5 tes de estas proteínas para tales propósitos.

Este objeto se resuelve de acuerdo con la invención por proporcionar nuevas proteínas re-combinantes derivadas de proteínas afines a GDF-5 que exhiben actividad biológica mejo-rada como se describe en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas.

Algunos términos utilizados frecuentemente en esta memoria se definen e ilustran como 10 sigue:

El término "dominio de nudo de cisteína", como se utiliza en esta memoria, significa la re-gión bien conocida y conservada de aminoácidos rica en cisteína que está presente en las partes maduras de las proteínas de las superfamilia TGF-beta tales como GDF-5 humana y que forma una estructura de proteína tridimensional conocida como nudo de cisteína. En 15 este dominio, es importante la localización respectiva de los residuos cisteína unos respecto a otros, y sólo está permitido que varíe ligeramente a fin de no perder la actividad biológica. Secuencias de consenso para dominios de nudo de cisteína se conocen en la técnica ac-tual. De acuerdo con la definición dada en esta memoria, el dominio de nudo de cisteína de una proteína comienza con el primer residuo cisteína que participa en el nudo de cisteína de 20 la proteína respectiva y termina con el residuo que sigue a la última cisteína que participa en el nudo de cisteína de la proteína respectiva. Por ejemplo, el dominio de nudo de cisteína de la proteína precursora de GDF-5 humana (SEQ ID NO. 1) comprende los aminoácidos 400-501 (véase también Fig. 1).

La expresión "proteína afín a GDF-5" como se utiliza en esta memoria, significa cualquier 25 proteína existente naturalmente o creada artificialmente que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nu-do de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana (aminoácidos 400-501 de Fig. 1/SEQ ID NO. 1) y que lleva residuos arginina, serina y asparagina en posiciones equivalentes a los residuos arginina 438 (R438), serina 439 (S439) y asparagina 445 (N445) de GDF-5 humana. Se 30 incluyen proteínas pertenecientes al grupo de proteínas GDF-5, GDF-6 y GDF-7 de espe-cies de vertebrados o mamíferos así como variantes recombinantes de las mismas con tal que estas proteínas cumplan el requerimiento arriba mencionado.

Ejemplos no limitantes de proteínas afines a GDF-5 son GDF-5 humana (descrita como MP52 en WO95/04819 y en Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-35 652), GDF-5/MP52 humana recombinante (WO96/33215), GDF-5 de ratón (US 5.801.014), CDMP-1 (WO96/14335), HMW humana MP52s (WO97/04095), GDF-5 de conejo (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), GDF-6/BMP-13 humana (US 5.658.882), GDF-6

bovina (no. de acceso NCBI P55106), GDF-6 de ratón (no. de acceso NCBI_NP 038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), GDF-7/BMP-12 humana (US 5.658.882), GDF-7 de ratón (no. de acceso NCBI AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WO96/143335), GDF-5 de pollo (no. de acceso NCBI NP_989669), GDF-5 de Xenopus laevis (no. de acceso NCBI AAT99303), GDF-5, -6 y -7 monómera (WO 01/11041 y WO99/61611), como se muestra en FIG. 3 y 4. 5

La expresión "mutante RSN" como se utiliza en esta memoria, significa una proteína recom-binante derivada de una proteína afín a GDF-5 en la cual, después de alineación con GDF-5 humana como se describe en esta solicitud, el aminoácido equivalente a la arginina 438 (R438) de GDF-5 humana (SEQ ID NO 1) no es arginina (R) y/o en el cual el aminoácido equivalente a la serina 439 (S439) de GDF-5 humana no es serina (S), y/o en la cual el ami-10 noácido equivalente a la asparagina 445 (N445) no es asparagina (N).

La expresión "actividad biológica aumentada" como se utiliza en esta memoria, se refiere a una actividad biológica de un mutante RSN que asciende al menos a 120% de la actividad de la proteína respectiva no mutada.

La expresión "actividad biológica" denota las actividades biológicas de una proteína afín a 15 GDF-5. Por ejemplo, esta actividad puede medirse por uno o más de los ensayos siguien-tes:

a) la actividad osteogénica y condrogénica puede medirse por un ensayo in vitro de fosfata-sa alcalina (ALP), v.g. como se describe en Takuwa et al. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797-E803); 20

b) la actividad neurotrófica puede determinarse por la supervivencia aumentada de las neu-ronas dopaminérgicas como ha sido descrito por ejemplo por Krieglstein et al. 1995 (J. Neu-roscience Res. 42, 724-732) o por Sullivan et al. 1997 (Neuroscience Letters 233, 73-76);

c) el crecimiento excesivo de fibras nerviosas puede medirse a partir de retina embrionaria como se describe, a saber, en WO 97/013188; 25

d) el potencial angiogénico de estas proteínas puede determinarse por ejemplo en un mode-lo de microbolsa corneal in vivo como se describe en Yamashita et al. 1997 (Exp. Cell Re-search 235, 218-226);

e) los efectos de proteínas afines a GDF-5 sobre la diferenciación terminal de los mioblastos han sido descritos v.g. por Inada et al. 1996 (Biochem Biophys Res Commun. 222, 317-30 322);

f) tests in vivo que miden el potencial inductor de tales proteínas concernientes a tendones y ligamentos v.g., se describen en Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330;

g) la medida de la cascada de transducción de señales por la activación de Smads utilizan-do un ensayo de genes informadores basado en los elementos de fijación de Smad que 35 preceden al gen de luciferasa de luciérnaga, v.g., se han descrito previamente en Nohe et al., 2002, J Biol Chem. 277, 5330-5338.

El término "variante" como se utiliza en esta memoria significa cualquiera de los polipéptidos siguientes:

a) fragmentos biológicamente activos de una proteína

b) constructos proteínicos que contienen secuencias adicionales en exceso respecto a la secuencia original de la proteína 5

c) cualquier combinación de a) y b)

El grupo GDF-5-/6-/-7 de proteínas de la superfamilia TGF-beta, que comprende GDF-5 como su miembro mejor caracterizado, está fuertemente conservado entre las especies de vertebrados/mamíferos (Ducy y Karsenty 2000, Kiney Int. 57, 2207-2214). Varios residuos en estas proteínas están presentes en todos los miembros del grupo y se cree por tanto 10 comúnmente que son críticos para la función biológica de la proteína, a saber los 13 ami-noácidos equivalentes a aa 435-447 de GDF-5 humana (véase Fig. 2). Estudios previos han confirmado una pérdida de la funcionalidad de la proteína si los aminoácidos presentes en esta región se reemplazan. Por ejemplo, la sustitución del residuo arginina en la posición 438 por cisteína (mutación R438C, Polinkovsky et al. 1997, Nat Genet. 17, 18-19) y susti-15 tución de leucina 441 por prolina (Fayaz-UI Haque et al. 2002, Clin. Genet. 61, 454-458) anula la función de la proteína.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente, por estudios de mutación y otros experimen-tos, que los residuos de aminoácidos que corresponden a la arginina 438 (R438), serina 439 (S439) y asparagina 445 (N445) de GDF-5 humana pueden sustituirse por otros aminoáci-20 dos especificados sin efectos negativos en la función de la proteína. Además, estas sustitu-ciones aumentan incluso significativamente la actividad biológica de las proteínas.

Así pues, la presente invención se refiere a una proteína recombinante que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana (aminoácidos 400-501 de Fig. 25 1/SEQ ID NO 1), en donde

a) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a argi-nina 438 (R438) de la GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) es alanina, vali-na, leucina, isoleucina o metionina, y/o

b) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a aspa-30 ragina 445 (N445) de la GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) es serina o treonina.

La proteína recombinante en la cual el aminoácido de la posición correspondiente a serina 439 (S439) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) es alanina, valina, leucina, isoleucina, glicina, asparagina o metionina se da para comparación. 35

Esta realización de la invención se ilustra adicionalmente por las figuras 1, 2 y 3. FIG. 1 muestra la proteína precursora de GDF-5 humana (Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 646-652) que está constituida por un dominio de 381 aa (aa 1-381 con

inclusión de aa 1-27, letras en negrilla) y una parte madura de 120 aa (aa 382-501). Única-mente la parte madura y especialmente el dominio de nudo de cisteína (aa 400-501, subra-yada) son importantes para la función biológica de la proteína. Los residuos R438, S439 (para comparación) y N445 (recuadros en gris) están localizados dentro de este dominio de nudo de cisteína. Los residuos arginina, serina y asparagina correspondientes en los domi-5 nios de nudo de cisteína de otras proteínas afines a GDF-5 se muestran en FIG. 2 y FIG. 3 (marcados por flechas). Los residuos correspondientes en proteínas no representadas en estas figuras pueden ser fácilmente determinados por una alineación de secuencias con GDF-5 humana.

Se ha encontrado en proteínas afines a GDF-5 que cuando el residuo arginina en una posi-10 ción correspondiente a arginina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) se reemplaza con un aminoácido seleccionado de alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, la proteína recombinante resultante tiene una actividad biológica aumentada. Los datos relativos a glicina y asparagina se dan para comparación.

En una realización preferida, el aminoácido seleccionado es leucina para la posición R438. 15

Para comparación, se ha encontrado también que cuando el residuo serina en posiciones correspondientes a la serina 439 (S439) de la GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) se reemplaza con un aminoácido seleccionado de ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, leucina o isoleucina, sea independientemente, o en combinación con un reemplazamiento de R438, la proteína recombinante resultante tiene una actividad biológica aumentada. 20

Adicionalmente, se ha encontrado que (sic) el residuo asparagina en las posiciones corres-pondientes a asparagina 445 (N445) de la GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) se reemplaza con un aminoácido seleccionado de serina y treonina, sea independientemente o en combinación con cualquiera o ambos reemplazamientos de R438 y S439, la proteína recombinante resultante tiene actividad biológica aumentada. 25

En una realización preferida, el aminoácido seleccionado es treonina para la posición N445.

Estos mutantes RSN (arginina/serina/treonina) de proteínas afines a GDF-5 en las cuales los equivalentes de R438 y/o N445 están sustituidos con los aminoácidos arriba especifica-dos, exhiben una actividad biológica que sobrepasa notablemente a la actividad de las pro-teínas no mutadas respectivas. 30

Como ejemplo, FIG. 5 muestra la capacidad del mutante RSN hGDF-5 R438L para inducir fosfatasa alcalina in vitro. La proteína mutante exhibe una actividad biológica entre 145,6% (a 75 nM) y 177,4% (a 35 nM) de la actividad de la proteína de tipo salvaje (rh-GDF-5) en este ensayo (valor medio de dos experimentos). La actividad mínima medida para el mutan-te a una sola concentración de proteína y en un único experimento era 120% de la actividad 35 de la proteína de tipo salvaje.

Así pues, la invención abarca mutantes RSN que exhiben una actividad biológica aumenta-da que asciende hasta al menos 120% de la actividad de la proteína no mutada respectiva.

Se prefieren especialmente mutantes RSN relacionados con GDF-5 con actividades biológi-cas aumentadas de al menos 130%, más preferiblemente al menos 135%, más preferible-mente al menos 140%, más preferiblemente al menos 150%, más preferiblemente al menos 160%, más preferiblemente al menos 170%, más preferiblemente al menos 180%, más pre-feriblemente al menos 200% de la actividad biológica de la proteína no mutada respectiva. 5

Las actividades biológicas de proteínas afines a GDF-5 y mutantes RSN de las mismas a saber en el campo de la inducción de hueso, cartílago y tejido conectivo tal como p.ej. liga-mento periodontal pueden ser determinadas fácilmente con la ayuda de sistemas de test establecidos. Muy útil y preferido es un test común in vitro conocido como ensayo de la fos-fatasa alcalina (ALP) (Takuwa et al., 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803) que se describe 10 en el Ejemplo 2/FIG 5. Se ha demostrado que las proteínas afines a GDF-5 aumentan la actividad de fosfatasa alcalina, p.ej. en células osteoprogenitoras ROB-C26 (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) como se describe en WO 95/04819, en células embrionarias ATDC5 (Riken Gene Bank, ROB 0565), en células estromales de ratón MCHT-1/26, y en células de ligamento periodontal (HPDL) como se muestra en Nakamura et al. 15 2003, J. Periodontal Res. 38, 597-605.

Las proteínas afines a GDF-5 como se definen en esta memoria comprenden un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más prefe-riblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, respecto al dominio de nudo 20 de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana. Este valor limitante es muy adecuado para sepa-rar miembros del grupo de proteínas GDF-5/-6/-7 así como variantes del mismo, de proteí-nas adicionales tales como otras GDFs y BMPs. Una comparación de los dominios de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humano, GDF-6 humana y GDF-7 humana (FIG. 2) revela el alto grado de identidad de aminoácidos entre estas proteínas. La GDF-6 humana compar-25 te 87 (85%) y la GDF-7 humana 83 (81%) de residuos idénticos con el dominio de nudo de cisteína de la GDF-5 humana. Los dominios respectivos de las moléculas GDF-5/-6/-7 de otros vertebrados y otras especies de vertebrados y mamíferos que se han identificado has-ta la fecha muestran también porcentajes de identidad muy altos, de al menos 75% (entre 79% y 99%), cuando se comparan con GDF-5 humana (FIG. 4). En contraste, las GDFs y 30 BMPs no pertenecientes al subgrupo GDF-5/-6/-7 exhiben valores de identidad de secuen-cia mucho menores, inferiores a 60%.

La determinación de posiciones de aminoácidos correspondientes en las secuencias de aminoácidos afines así como el cálculo de los porcentajes de identidad entre (sic) puede realizarse con ayuda de algoritmos de alineación bien conocidos y opcionalmente progra-35 mas de computadora que utilizan estos algoritmos. Las identidades de aminoácidos en esta solicitud de patente se han calculado por alineación de secuencias con el programa de soft-ware gratuito ClustalX (versión 1.81) con parámetros por efecto y recuento subsiguiente de

los residuos idénticos a mano. Los ajustes por defecto para alineación apareada (lenta-segura) son: parámetro de abertura de laguna: 10,00; parámetro de extensión de laguna 0,10; matriz de peso de proteínas: Gonnet 250. El programa ClustalX se describe en detalle en:

Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G. 5

(1997)

La interfaz de Windows de ClustalX: estrategias flexibles para alineación múltiple de se-cuencias ayudada por herramientas de análisis de calidad.

Nucleic Acis Research 24: 4876-4882.

ClustalX es una interfaz de Windows para el programa de alineación de secuencias múlti-10 ples ClustalW y está disponible, v.g., de diversas fuentes, p.ej. por FTP anónimo de
ftp-igbmc.u-strasbg.fr ,
ftp.embl-heidelberg.de ,
ftp.ebi.ac.uk o por descarga de la página web siguiente:
http://www-
igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/ . El programa y el algoritmo ClustalW se describen también en detalle en:

Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J. (1994) 15

CLUSTALW: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680.

Los mutantes RSN de proteínas afines a GDF-5 de acuerdo con la invención son general-mente aplicables en cualquier indicación en la cual sean útiles también proteínas afines a 20 GDF-5 tales como GDF-5, GDF-6 y GDF-7. Se ha demostrado que las proteínas afines a GDF-5 son inductores y reguladores/diferenciadores importantes de p.ej. hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130), tejido conectivo tal como tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330), tejido nervioso (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236, 25 120-122; Watakabe et al. 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464), células madre (Shimaoka et al. 2003, J. Biomed. Materials Res. Part A 68A, 168-176; Bai et al. 2004, Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 453-460) y/ ligamento periodontal y dientes (Sena et al 2003, J. Dent. Res. 82, 166-171; Morotorne et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 85-90).

En una realización preferida, el mutante RSN comprende una secuencia que coincide con 30 una o más de las secuencias genéricas de aminoácidos siguientes

imagen1

o

5

y en donde

cada X denota cualquier aminoácido,

Z1 denota alanina (A), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) o valina (V),

Z2 denota ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) leucina (L) o isoleu- cina (I) 5

Z3 denota serina (S) o treonina (T)

En una realización más preferida, el mutante RSN comprende una secuencia que coincide con una de las secuencias genéricas de aminoácidos arriba mencionadas y en donde

X1 denota asparagina (N) o serina (S)

X2 denota arginina (R) o lisina (K) 10

X3 denota alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S)

X4 denota asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X5 denota arginina (R) o lisina (K)

X6 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X7 denota leucina (L) o metionina (M) 15

X8 denota isoleucina (I) o valina (V)

X9 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X10 denota histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X11 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X12 denota leucina (L), metionina (M) o valina (V) 20

X13 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X14 denota isoleucina (I) o leucina (L)

X15 denota isoleucina (I) o valina (V)

X16 denota leucina (L) o metionina (M)

X17 denota alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D) 25

X18 denota arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S)

X19 denota alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T)

X20 denota alanina (A), metionina (M) o treonina (T)

X21 denota alanina (A) o prolina (P) 30

X22 denota serina (S) o treonina (T)

X23 denota alanina (A), serina (S) o treonina (T)

X24 denota arginina (R) o lisina (K)

X25 denota serina (S) o treonina (T)

X26 denota fenilalanina (F) o tirosina (Y) 35

X27 denota isoleucina (I) o treonina (1)

X28 denota alanina (A) o serina (S)

X29 denota alanina (A) o glicina (G)

X30 denota asparagina (N) o lisina (K)

X31 denota ácido glutámico (E) o glutamina (Q)

X32 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E),

X33 denota alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T)

Z1 denota alanina (A), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) o valina (V) 5

Z2 denota ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G), leucina (L) o isoleucina (I)

Z3 denota serina (S) o treonina (T)

Estas secuencias genéricas se han recopilado a partir de una comparación de los dominios de nudo de cisteína de secuencias de vertebrados GDF-5, GDF-6 y GDF-7 de acuerdo con 10 FIG. 3. Las posiciones que no son idénticas en la totalidad de las proteínas alineadas se designan con una X en las secuencias genéricas. Las posiciones que están mutadas de acuerdo con la presente invención se denotan con una Z.

En otra realización preferida, la proteína mutante RSN de acuerdo con la invención es una proteína mutante RSN de una proteína GDF-5 de vertebrado o recombinante o una variante 15 de la misma. Son muy preferidos los mutantes RSN de una proteína GDF-5 de mamífero o variantes de la misma. Ejemplos de proteínas GDF-5 de vertebrados y mamíferos son: GDF-5 humana (descrita como MP52 en WO95/04819 y como GDF-5 humana en Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), GDF-5/MP52 humana recombi-nante (WO96/33215), GDF-5 monómera recombinante (WO 01/11041 y WO99/61611), 20 MP52s HMW humana (WO97/04095), CDMP-1 (WO96/14335), GDF-5 de ratón (Mus mus-culus) (US 5.801.014), GDF-5 de conejo (Oryctolagus cuniculus) (Sanyal et al. 2000, Mol

Biotechnol. 16, 203-210), GDF-5 de pollo (Gallus gallus) (no. de acceso NCBI NP_989669), GDF-5 de rana africana con pinzas (Xenopus laevis) (no. de acceso NCBI AAT99303).

Incluidos en estas realizaciones se encuentran también mutantes RSN de regiones alélicas 25 de los genes/proteínas arriba mencionados así como mutantes RSN de las proteínas de vertebrado, mamífero y recombinantes o variantes de las mismas que tienen mutaciones adicionales tales como sustituciones, adiciones y deleciones, con tal que estas mutaciones adicionales no tengan efecto esencial alguno sobre la actividad de las proteínas.

En general, se espera que el mutante RSN de la proteína GDF-5 de vertebrado o mamífero 30 o recombinante o variante de la misma exhiba todas las actividades ya descritas de GDF-5 y pueda aplicarse en todas las ocasiones en que se han utilizado con éxito las formas GDF-5 de tipo salvaje y recombinantes arriba mencionadas. Por ejemplo, se considera que GDF-5 es un promotor muy eficaz de formación de hueso y cartílago así como formación de tejido conectivo (véase por ejemplo WO 95/04819, Hötten et al. 1996, Growth Factors 13, 65-74; 35 Storm et al. 1994, Nature 368, 639-643; Chang et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 28227-28234) y formación de uniones de tejido conectivo (EP 0 831 884). En este contexto, GDF-5 es útil para aplicaciones que conciernen a las articulaciones entre elementos esqueléticos

(véase por ejemplo Storm & Kingsley 1996, Development 122, 3969-3979). Un ejemplo para tejido conectivo es tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330; Aspenberg & Forslund 1999, Acta Orthop Scand 70, 51-54; WO 95/16035). La proteína es útil para reparación de menisco y discos espinales/intervertebrales (Walsh et al. 2004, Spine 29, 156-63) y aplicaciones de fusión espinal (Spiro et al. 2000, Biochem Soc Trans. 28, 362-5 368). GDF-5 puede aplicarse ventajosamente en aplicaciones de la dentadura (dentales y periodontales) (véase por ejemplo WO 95/04819; WO 93/16099; Morotome et al. 1998, Bio-chem Biophys Res Comm 244, 85-90) tales como la regeneración de dentina o ligamento periodontal.

GDF-5 es útil también en la reparación de heridas de cualquier clase. Es también beneficio-10 sa por promover el crecimiento de tejido en el sistema neuronal y la supervivencia de v.g. neuronas dopaminérgicas. En este contexto, puede utilizarse GDF-5 para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos como v.g. enfermedad de Parkinson y posiblemente también enfermedad de Alzheimer o tejidos de la corea de Huntington (véase por ejemplo WO 97/03188; Krieglstein et al., (1995) J. Neurosci Res. 42, 724-732; Sullivan et al., (1997) 15 Neurosci Lett 233, 73-76; Sullivan et al. (1998), Eur. J. Neurosci 10, 3681-3688). GDF-5 permite el mantenimiento de la función nerviosa o la retención de la función nerviosa en tejidos ya dañados. Por consiguiente, se considera que GDF-5 es un factor neurotrófico de aplicación general.

La misma es útil también para enfermedades de los ojos, en particular retina, córnea y ner-20 vio óptico (véase por ejemplo WO 97/03188, You et al. (1999), Invest Opthamol Vis Sci 40, 296-311), para crecimiento del cabello y para el tratamiento y diagnosis de trastornos rela-cionados con la piel (WO 02/076494; Battaglia et al. 2002, Trans. Orthop. Res. Soc. 27, 584), y para la inducción de la angiogénesis (Yamashita et al. 1997, Exp. Cell Res. 235, 218-26). 25

Por una parte, se encuentra la prevención o terapia de enfermedades asociadas con el de-terioro de hueso y/o cartílago o que afectan a la enfermedad de hueso y/o cartílago o en general situaciones en las cuales es deseable la formación de hueso y/o cartílago o para fusión medular, y por otra parte se encuentra la prevención o terapia de tejidos deteriorados o enfermos asociados con tejido conectivo con inclusión de tendón y/o ligamento, tejido 30 periodontal o dental con inclusión de implantes dentales, tejido neural con inclusión de tejido del CNS y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, corazón, vasos sanguíneos, tejido renal, ejido uterino y tiroideo, piel, membranas mucosas, endotelio, epitelio, para promoción o inducción de crecimiento de los nervios, regeneración de tejidos, angiogénesis, curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, 35 lesiones o injertos de piel, inducción de la proliferación de células progenitoras o células de la médula ósea, para mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación, para el tratamiento o la preservación de tejidos o células para trasplante de órganos o tejidos, para

integridad del revestimiento gastrointestinal, y para el tratamiento de alteraciones de la ferti-lidad.

Enfermedades concernientes a órganos sensoriales tales como el ojo deben incluirse tam-bién en la indicación preferida de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Como enfermedades neuronales pueden citarse de nuevo como ejemplos las enfermedades 5 de Parkinson y Alzheimer.

El Ejemplo 3 y FIG. 6 describen los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina con GDF-5 humana recombinante (WO 96/33215) y el mutante RSN R438L (arginina sustituida por leucina) de GDF-5 humana recombinante (rhGDF-5). Se utilizó GDF-5 humana recombinan-te como estándar/control con 100% de actividad biológica. La proteína mutante exhibe una 10 actividad biológica entre 145,6% (a 75 nM) y 177,4% (a 35 nM) de la actividad de la proteína de tipo salvaje (rh-GDF-5) en este ensayo (valor medio de dos experimentos). La actividad mínima medida por el mutante a una sola concentración de proteína y en un solo experi-mento fue 120% de la actividad de la proteína de tipo salvaje. Así, en una realización prefe-rida, los mutantes RNS con actividad biológica aumentada que están abarcados por la 15 invención tienen actividades biológicas de al menos 120% de la actividad de la GDF-5 humana o GDF-5 humana recombinante (WO 96/33215) si se determina in vivo por el ensa-yo ALP. Son especialmente preferidos mutantes RSN relacionados con GDF-5 con activida-des biológicas aumentadas de al menos 130%, más preferiblemente al menos 135%, más preferiblemente al menos 140%, más preferiblemente al menos 150%, más preferiblemente 20 al menos 160%, más preferiblemente al menos 170%, más preferiblemente al menos 180%, más preferiblemente al menos 200% de la actividad biológica de la proteína no mutada res-pectiva.

Los mutantes RSN de acuerdo con la invención pueden producirse fácilmente en diversos sistemas de expresión procariotas y eucariotas, en particular por expresión en procariotas y 25 renaturalización/replegamiento subsiguientes de acuerdo con métodos conocidos (véase p.ej. WO 96/33215).

Una materia objeto adicional de la presente invención es un ácido nucleico que codifica un mutante RSN de acuerdo con la invención. El ácido nucleico tiene una secuencia tal que se realiza una sustitución de un residuo equivalente a R438 o dos residuos equivalentes a 30 R438 y S439 de GDF-5 humana con uno de los aminoácidos especificados en esta solicitud. Los tripletes de bases que codifican estos aminoácidos y la degeneración del código genéti-co son generalmente conocidos. El ácido nucleico puede ser una secuencia de DNA y/o una secuencia de RNA, con tal que la proteína de acuerdo con la invención pueda obtenerse a partir de este ácido nucleico por expresión en un sistema adecuado. 35

Vectores de expresión son una materia objeto adicional de la presente invención, en donde el ácido nucleico se inserta en un sistema vector adecuado, seleccionándose el sistema vector de acuerdo con la expresión deseada de la proteína. El sistema vector puede ser un

sistema vector eucariota, pero preferiblemente se trata de un sistema vector procariota, con el cual las proteínas pueden producirse de una manera particularmente fácil y pura. Un vec-tor de expresión adecuado se describe v.g. en WO 96/33215. El vector de expresión puede ser también un vector viral que puede utilizarse p.ej. en métodos de terapia génica.

Células hospedadoras son también una materia objeto de la presente invención. Las células 5 hospedadoras se caracterizan porque contienen un ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo con la invención y porque las mismas son capaces de utilizar la información presente en los ácidos nucleicos y en el vector de expresión, respectivamente, para la ex-presión de mutantes RSN de acuerdo con la invención. Células hospedadoras adecuadas son preferiblemente células procariotas, en particular cepas de E. coli. Cepas hospedadoras 10 particularmente útiles son descendientes de E. coli W3110 como se muestra v.g. en WO 96/33215. En una realización preferida, las células hospedadoras, preferiblemente de origen humano, pueden ser útiles también para trasplante a pacientes que se encuentran en nece-sidad de ello.

Otra materia objeto de la presente invención son anticuerpos contra los mutantes RSN. Es-15 tos anticuerpos de acuerdo con la presente invención son específicos para los mutantes RSN recombinantes reivindicados. Preferiblemente, los mismos son específicos para las regiones de nudo de cisteína de proteínas afines a GDF-5 que contienen uno o más de los reemplazamientos de aminoácidos descritos en esta memoria. Preferiblemente, los anti-cuerpos son específicos para una región de una proteína recombinante derivada de una 20 proteína afín a GDF de acuerdo con la invención que abarca los aminoácidos 400-495, pre-feriblemente 420-450, más preferiblemente 425-440, más preferiblemente los aminoácidos 438-445. Estos anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden generarse por utilización de aquellos fragmentos de la proteína de la invención arriba descritos como in-munógenos para generar anticuerpos por métodos conocidos. Los anticuerpos pueden ser 25 monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier isotipo. Están comprendidos también fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab o Fab2. Los anticuerpos pueden ser también anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos, etc.

Materias objeto adicionales de la presente invención son composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un mutante RSN o una proteína afín a GDF-5 o un ácido nucleico o 30 un vector o célula hospedadora de acuerdo con la invención. Son adecuadas en general todas las composiciones farmacéuticas que han sido ya publicadas en contexto con proteí-nas afines a GDF-5. Un vector de expresión o una célula hospedadora pueden considerarse ventajosos como sustancias activas en una composición farmacéutica y/o diagnóstica. Asi-mismo pueden utilizarse combinaciones de una proteína de acuerdo con la invención con 35 otras proteínas en composiciones farmacéuticas preferidas. Especialmente preferidas para aplicaciones neuronales son combinaciones con otras proteínas de la superfamilia TGF-beta tales como p.ej. GDNF (véase WO 97/03188). Para aplicaciones concernientes a cartílago

y/o hueso, es útil la combinación con BMPs en general o con una proteína inductora de mantenimiento de cartílago tal como BMP-9 (véase v.g. WO 96/39170). Son también posi-bles combinaciones con otras proteínas tales como p.ej. NGF, BDNF, EGF, PDGF, NT-3, -4, -5, cordina y/o proteínas de erizo (véase p.ej. WO 97/03188). Por supuesto, esta invención comprende también composiciones farmacéuticas que contienen sustancias adicionales 5 como v.g. sustancias adyuvantes y vehículos farmacológicamente aceptables. La formula-ción puede incluir antioxidantes, conservantes, colorantes, saborizantes y agentes emulsio-nantes, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes de aumento de volumen, tampones, vehículos de suministro, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Por ejemplo, un portador o vehículo adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica, 10 o una solución salina mezclada con una proteína vehículo adecuada tal como seroalbúmina. Un antioxidante preferido para la preparación de la composición de la presente invención es ácido ascórbico.

Composiciones cosméticas conocidas en la técnica, preferiblemente hipoalérgicas y de pH controlado, son especialmente preferidas, e incluyen aguas de tocador, paquetes, lociones, 15 leches dermatológicas o lociones lechosas. Dichas preparaciones contienen, además del compuesto activo, componentes empleados usualmente en tales preparaciones. Ejemplos de tales componentes son aceites, grasas, ceras, agentes tensioactivos, humectantes, agentes espesantes, antioxidantes, estabilizadores de la viscosidad, agentes quelantes, tampones, conservantes, perfumes, tintes, alcanoles inferiores, y análogos. Si se desea, 20 pueden incorporarse en las composiciones ingredientes adicionales, v.g. agentes antiinfla-matorios, antibacterianos, antifúngicos, desinfectantes, vitaminas, filtros solares, antibióti-cos, u otros agentes anti-acné.

El disolvente o diluyente de la composición farmacéutica puede ser acuoso o no acuoso y puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables que son capaces de modi-25 ficar y/o mantener un pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, escala, esterilidad, estabi-lidad, tasa de disolución u olor de la formulación. Análogamente, pueden incluirse otros componentes en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención a fin de modificar y/o mantener la tasa de liberación de la sustancia farmacéuticamente eficaz. Tales componentes modificadores son sustancias empleadas usualmente en la técnica a fin de 30 formular dosificaciones para administración parenteral en forma unitaria o de multidosis. La composición farmacéutica y/o diagnóstica formulada finalmente, preparada de acuerdo con la presente invención, puede almacenarse en viales estériles en forma de una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Estas formulaciones pueden guardarse sea en una forma lista para ser utilizada o en una forma, v.g., en el caso 35 de un polvo liofilizado, que requiere reconstitución antes de la administración. Las formula-ciones farmacéuticas adecuadas anteriores y otras se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (edición 18ª, Mac Publishing Co.,

Eastern, Pa., 1990, 1435-1712). Tales formulaciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y la tasa de aclaramiento in vivo del componente farmacéuticamente eficaz. Otras formas de administración eficaz comprenden formulaciones parenterales de liberación lenta, es decir retardada, nebulizaciones de inhalación, o formu-laciones oralmente activas. Por ejemplo, una formulación de liberación lenta puede com-5 prender proteínas fijadas a o incorporadas en preparaciones particuladas de compuestos polímeros (tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc.) o liposomas. La composi-ción farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede formularse también para administración parenteral, v.g., por infusión o inyección, y puede incluir también formulacio-nes de liberación lenta o circulación sostenida. Tales composiciones terapéuticas adminis-10 tradas por vía parenteral se encuentran típicamente en la forma de soluciones acuosas farmacéuticamente aceptables exentas de pirógenos, que comprenden el o los componen-tes farmacéuticamente eficaces en un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica puede comprender un material matriz, a saber en los casos en que se pretende regeneración de hueso o cartílago. Es ventajoso que la proteína, el ácido 15 nucleico, el vector de expresión o la célula hospedadora se apliquen en y/o sobre un mate-rial matriz biocompatible. El material matriz, tal como se utiliza en esta memoria, significa un portador o matriz que actúa como entramado para reclutamiento de células, fijación, prolife-ración y diferenciación y/o como un dispositivo potencial de suministro y almacenamiento para los mutantes RSN. En contraste con las matrices sólidas, los portadores están consti-20 tuidos por materiales amorfos que no tienen superficie definida alguna y que carecen de una forma específica, a saber alquilcelulosas, Pluronics, gelatinas, polietilenglicoles, dextrinas, aceites vegetales, azúcares y otras sustancias líquidas y viscosas.

Los usos de proteínas afines a GDF-5 o morfógenos similares tales como BMPs en combi-nación con materiales matriz se han publicado y descrito extensamente, como por ejemplo 25 en WO 98/21972. Estos materiales matriz son igualmente adecuados para mutantes RSN de acuerdo con la presente invención. El material matriz puede trasplantarse al paciente, v.g. por vía quirúrgica, en donde la proteína o el DNA que codifica la proteína pueden libe-rarse lentamente del material matriz y ser eficaces luego a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Todos los tipos de materiales matriz son útiles de acuerdo con la presente in-30 vención, con tal que los mismos sean biocompatibles y se seleccionen para el área o indica-ción de uso propuesta. El material matriz puede ser un material natural, un material natural modificado y un material sintético. Están abarcadas todas las matrices ya conocidas para proteínas morfogenéticas. Ejemplos de materiales naturales son v.g. materiales de hueso autólogo, heterólogo o xenólogo, colágeno, v.g. colágeno tipo I y III, o metales como titanio. 35 Pueden utilizarse también otros componentes de la matriz extracelular. La matriz extracelu-lar comprende por ejemplo los diversos colágenos, tales como por ejemplo los tipos I, II, V, IX, X, XI y XIII, y adicionalmente proteoglucanos y glucosaminoglucanos, como por ejemplo

condroitinsulfato, biglucano, decorina y/o ácido hialurónico, o proteínas no colagenosas como por ejemplo osteopontina, laminina, fibronectina, vitronectina, trombospondina, proteí-na de matriz del cartílago y la fosfoproteína de la dentina. Todos los materiales naturales mencionados pueden utilizarse también en formas modificadas artificialmente. Ejemplos de materiales naturales modificados son hueso desmineralizado, mineral de hueso termocalci-5 nado, hueso sinterizado o ácido hialurónico reticulado químicamente (hidrogel), o aleaciones metálicas. Ejemplos de materiales sintéticos son polímeros como ácido poliglicólico, polilac-tida y derivados de polilactida tales como v.g. ácido poliláctico, poli(lactida-co-glicolida), ácido poliláctico-polietilenglicol o copolímeros glicolida-L-lactida, y adicionalmente polifosfa-tos, polietilenglicol, copolímeros polioxietileno-polioxipropileno o materiales que contienen 10 fosfatos de calcio tales como fosfato beta-tricálcico (Ca3(PO4)2), fosfato alfa-tricálcico e hidroxil-apatito. Ejemplos adicionales de otros materiales útiles de matriz pertenecientes a uno de los grupos arriba mencionados son Ca(OH)2, coral, mineral de hueso natural, quiti-na, partículas de hueso no desmineralizadas, partículas de hueso cerámicas, dentina cerá-mica, chips de hueso esponjoso irradiados, yeso calcinado, vidrio bioactivo y cerámica de 15 vidrio que contiene apatito-wollastonita. Asimismo una combinación de los vehículos y/o matrices arriba mencionados puede formar el material matriz como por ejemplo la combina-ción de hidroxi-apatito y colágeno (v.g. Healos, disponible anteriormente de Orquest, Inc., CA, EE.UU., [actualmente DePuy Acromed, MA, EE.UU.]), una combinación de ácido poliglicólico y ácido poliláctico o derivados de polilactida, o composiciones coral-colágeno. Para una lista 20 no limitante de vehículos y matrices útiles véase adicionalmente, a saber, Kirker-Head 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92.

Los ejemplos no limitantes siguientes junto con las figuras y los protocolos de secuencias tienen por objeto ilustrar adicionalmente la invención.

SEQ ID NO 1 muestra la secuencia de DNA y de proteínas del precursor de GDF-5 humana. 25 En los mutantes de la proteína GDF-5 humana preferidos con actividad biológica aumenta-da, el residuo arginina en la posición 438 y/o el residuo serina en la posición 439 (para com-paración) y/o el residuo asparagina en la posición 445 están sustituidos con otros aminoácidos.

FIG. 1 muestra características adicionales de la proteína precursora humana GDF-5 de 30 acuerdo con SEQ ID No: 1:

aa 001-381 pre-prodominio (letras en negrilla)

aa 382-501 parte de la proteína madura

aa 400-501 dominio de nudo de cisteína (subrayado)

aa 438-439 residuos arginina 438 y serina 439 (recuadro gris) 35

aa 445 residuo asparagina 445 (recuadro gris)

FIG. 2 muestra una comparación de los dominios de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana (SEQ ID NO 1), GDF-6 humana (secuencia 2 de la patente US 5.658.882) y GDF-7

humana (secuencia 26 de la Patente US 5.658.882). Los residuos de aminoácidos que son idénticos en las tres moléculas están resaltados en negro. Los residuos R438, S439 (para comparación) de GDF-5 humana y residuos equivalentes de GDF-6 y GDF-7 humanas están encuadrados y marcados por flechas.

FIG. 3 muestra una comparación de los dominios de nudo de cisteína de 102 aa de las se-5 cuencias GDF-5, -6 y -7 de vertebrados del género Homo, y adicionalmente Cercopithecus, Macaca, Bos, Mus, Gallus Danio y Xenopus, que están disponibles en la base de datos de proteínas del NCBI "Entrez" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/) bajo los números de acce-so que se muestran en la figura. Los residuos R438 y S439 de GDF-5 humana y residuos equivalentes de las otras proteínas están marcados por flechas. 10

FIG. 4 muestra una tabla con las identidades de secuencia de los dominios de nudo de cis-teína de BMPs y GDFs conocidos con el dominio de nudo de cisteína de GDF-5 humana.

FIG. 5 muestra los resultados de un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) con GDF-5 humana recombinante (rh-GDF-5) y el mutante RSN R438L de hGDF-5 (como se describe en el Ejemplo 2). 15

FIG. 6 muestra la formación ectópica de hueso en un modelo subcutáneo de rata como se describe en el Ejemplo 3. La calcificación visible (flecha) se detectó únicamente en la bolsa subcutánea llena con el mutante R438L de rhGDF-5 a 75 µg/implante.

FIG. 7 muestra los registros de cantidad de hueso que se describen en el Ejemplo 3.

FIG. 8 muestra un ejemplo histológico de nueva formación de hueso como se induce con 75 20 µg/por implante del mutante R432L de rhGDF-5 de acuerdo con el Ejemplo 3.

FIG. 9 muestra la inducción de producción de cartílago después de infección de células de micromasas con virus de tipo salvaje y mutantes que expresaban GDF-5 (véase el Ejemplo 4). La producción de cartílago viene indicada por el aumento en la tinción con azul Alcian y ALP. (A) Cultivos de micromasas de pollo ensayados después de 4 días en cuanto a pro-25 ducción extracelular de matriz y analizados después de 7 días respecto a actividad de ALP. Las células se infectaron con virus que contenían secuencias de tipo salvaje o mutantes y co-infección o no con el antagonista de BMP Noggin. La coinfección con Noggin (Nog) re-prime por completo la condrogénesis con indiferencia de la variante de GDF5 expresada. (B) Incorporación de azul Alcian en la matriz extracelular de los cultivos de micromasas que 30 reflejaban la producción de una matriz cartilaginosa rica en proteoglucanos medida el día 4. (C) Actividad de ALP de los cultivos de micromasas el día 7.

FIG. 10 muestra la sobreexpresión de GDF-5 de tipo salvaje así como del mutante R438L de DGF-5 en embriones de pollo de acuerdo con el Ejemplo 5. La tinción con azul Alcian se utilizó para visualizar el cartílago. Para comparación, se muestra un miembro no infectado. 35

Ejemplo 1: Creación, expresión y purificación de los mutantes RSN

DNAs codificantes de las partes maduras de las proteínas GDF-5 humana, GDF-6 humana y GDF-7 humana han sido aislados de células osteoprogenitoras humanas ROB-

C26 (Yamaguchi et al., 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) por la técnica RT-PCR y se han ligado subsiguientemente a vectores de plásmidos procariotas. Con objeto de identificar los residuos de aminoácidos funcionalmente importantes en las partes maduras de GDF-5, -6 y -7, se han introducido diversas mutaciones simples en estas secuencias por mutagéne-sis orientada. Todas las mutaciones individuales se crearon utilizando el kit de mutagénesis 5 orientada QuickChangeTM con la DNA-polimerasa PfuTurboTM y la endonucleasa DPN I de Stratagene de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante.

Utilizando la cepa bacteriana W3110BP transformada con los plásmidos e inducida con IPTG, se expresaron las proteínas en cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se aislaron utilizando un tampón de homogeneización (Tris HCl 25 mM de pH 7,3, EDTA NaOH 10 10 mM pH 8, urea 8M) y tampón de lavado (urea 1M, Tris HCl 20 mM, pH 8,3, EDTA NaOH 10 mM, pH 8,0) de acuerdo con procedimientos estándar. La purificación ulterior se llevó a cabo en un equipo de columna de fase inversa Aquapore Octyl (Applied Biosys, CV = 7,8 ml) 100 x 10, 20 µ, No. 186.470) con un gradiente desde 100% de Eluyente A (0,1% TFA, HPLC H2O) hasta 100% Eluyente B (0,1% TFA, 90% CH3N, HPLC H2O) en 104 minutos 15 (caudal: 3 ml/min). Después de un control por transferencia Western, las fracciones que contenían la proteína mutante se agruparon y liofilizaron.

Las proteínas mutantes se disolvieron en tampón de disolución (guanidina HCl 6M, Tris 50 mM, NaCl 150 mM, DTT 3 mM, pH = 8,0), ajustándose exactamente la concentración de proteínas a 2,6 mg/ml y ajustándose el pH entre 8 y 9. Después de 2 h de incubación a la 20 temperatura ambiente, se añadió tampón de replegamiento (NaCl 1M, Tris 50 mM, EDTA 5 mM, GSSG 1 mM, GSH 2 mM, Chaps 33 mM, pH = 9,5) bajo agitación moderada hasta alcanzar una concentración final de 0,16 mg/ml.

La solución se incubó luego durante 48 horas a 22ºC y se detuvo el replegamiento por cambio del pH a 3-4 mediante adición de HCl al 18%. Después de centrifugación, el monó-25 mero no replegado se separó de la zona dímera por realización de una segunda RT-HPLC en las mismas condiciones. Las fracciones que contenían la proteína dimerizada se agrupa-ron, liofilizaron y guardaron a -70ºC.

Ejemplo 2: Medida de la actividad biológica de los mutantes RSN in vitro por el ensayo ALP

Se incubaron 1 x 104 células ATDC-5 durante una noche en placas de 96 pocillos en 30 medio de cultivo de células (alfa-MEM, penicilina/estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 10% FCS) a 37ºC, 5% CO2, saturado con agua. Al día siguiente, se estimularon las células con las proteínas análogas a GDF-5 y mutantes de las mismas durante 72 horas con las con-centraciones de ligando indicadas. Las células se lavaron subsiguientemente con PBS (so-lución salina tamponada con fosfato). La lisis celular se realizó en 100 µl de tampón de lisis 35 alcalino 1 (glicina 0,1M, pH 9,6, NP-40 1%, MgCl2 1 mM, ZnCl2 1mM) durante 1 hora a la temperatura ambiente. Se añadieron a continuación 100 µl de tampón de lisis alcalino 2 (0,1M glicina, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1mM ZnCl2 + 2 mg/ml de PNPP). Las placas se incuba-

ron a 37ºC, 5% CO2, saturado con agua. La reacción de ALP se paró después con 100 µl de NaOH de concentración 30 g/l y finalmente se midió la densidad óptica con un lector de microplacas automático a 405 nm teniendo en cuenta la sustracción del valor en blanco.

Como ejemplo, se muestran en FIG. 5los resultados (valores medios de 2 experimentos independientes) concernientes al mutante R438L de hGDF-5. Se han utilizado en este en-5 sayo 4 concentraciones de proteína diferentes (10 nM, 35 nM, 50 nM y 75 nM). La proteína mutante exhibe una actividad biológica promedio entre 145,6% (2168,5/1489 a 75 nM) y 177,4% (2061,5/1162 a 35 nM) de la actividad de la proteína de tipo salvaje (rh-GDF-5) en este sistema de ensayo.

Ejemplo 3: Formación ectópica de hueso en un modelo de rata subcutáneo 10

En este estudio, se comparó el mutante R438L de GDF-5 con GDF-5 de tipo salvaje y con BMP-2 en un modelo de implante subcutáneo de rata respecto a potencial de formación ectópica de hueso. Se distribuyeron aleatoriamente 54 ratas macho Sprague-Dawley repro-ducidas por exogamia de 4-5 semanas de edad en 9 grupos (n = 6 por grupo). Cada animal se implantó con material de test y un control contralateral. Se prepararon materiales de injer-15 to antes de la cirugía como sigue: se liofilizaron rhBMP-2 (R&D Systems), rhGDF-5 (Biopharm GmbH, Heidelberg, Alemania) o rhGDF-5 R438L (Biopharm GmbH, Heidelberg, Alemania) sobre esponjas de Colágeno Tipo I de 5x5x5mm (Helis-tat, Integra LifeSciences Corp). Se utilizó Helistat solo como controles contralaterales en cada animal. Los implantes se descongelaron antes de la implantación. 20

Se evaluaron los materiales de test y cantidades de morfógeno siguientes:

Material de Test: Dosis, µg/implante (µg/cc)

rhBMP-2: 1 (7) 2 (13) 7,5 (50)

rhGD-5 tipo salvaje: 7,5 (50) 15 (100) 75 (500)

rhGDF-5 R438L: 7,5 (50) 15 (100) 75 (500)

Se crearon dos bolsas subcutáneas en la región torácica ventral de cada rata. Se llenó una bolsa con uno de los nueve grupos de tratamiento, mientras que la otra se llenó con Helistat solo. Veintiún días después de la cirugía, se sacrificaron todas las ratas por 25 eutanasia y se tomaron radiografías ordinarias del área torácica. Se retiraron los explantes y se les asignó una clasificación (0 = muy blando hasta 3 = duro) basada en observación gro-sera, y se cortaron por la mitad. Una mitad de cada explante se introdujo en un tubo y se congeló a -80ºC para análisis de la fosfatasa alcalina, mientras que la otra mitad se fijó en formalina tamponada neutra al 10% para análisis histológico. Se realizaron análisis histo-30

morfométricos sobre todas las muestras. Resumidamente, la cantidad de hueso, la fibrosis y la inflamación se evaluaron de 0 a 4, basado en el porcentaje de tejido presente (0 = 0%; 1 = hasta 25%; 2 = entre 25% y 50%; 3 = entre 50% y 75%; y 4 = entre 75% y 100%).

Resultados: Todos los animales sobrevivieron perfectamente a los procedimientos y com-pletaron el periodo post-operatorio de 21 días. Por observación grosera, ninguno de los 5 implantes que contenían 1 µg o 2 µg de rhBMP-2 se clasificaron como firmes. En cambio, 5 de 6 implantes que contenían 7,5 µg de rhBMP-2 eran firmes. En el grupo de R438L de rhGDF-5, 5 de 6 muestras del grupo de 7,5 µg se clasificaron como firmes. Las seis mues-tras en los grupos de 15 µg y la totalidad de las seis muestras en los grupos de 75 µg se consideraron firmes. Las evaluaciones radiográficas mostraban calcificación visible sólo en 10 los animales implantados con R438L de rhGDF-5 a 75 µg/implante (FIG. 6). Los análisis histomorfométricos demostraron registros de hueso máximos para R438L de rhGDF-5, así como implantes para la dosis de 75 µg de rhGDF-5 de tipo salvaje y 7,5 µg de rhBMP-2 (véase FIG. 7 y FIG. 8). Adicionalmente, se observó actividad de fosfatasa alcalina in vivo principalmente en cinco grupos: en los implantes que contenían R438L de rhGDF-5 (para 15 todas las dosis evaluadas), 75 µg de rhGDF-5 y 7,5 µg de rhBMP-2.

Ejemplo 4: Análisis funcional de las proteínas mutantes GDF-5 en cultivo de micromasas

Para analizar las consecuencias funcionales de las mutaciones de GDF-5 se infecta-ron cultivos de micromasa de pollo con los virus RCAS que expresaban GDF-5 de tipo sal-vaje y mutada. La diferenciación celular y la producción de matriz cartilaginosa se 20 determinaron por medida de fosfatasa alcalina (ALP) y azul Alcian. La incorporación de azul Alcian en la matriz extracelular de los cultivos de micromasas refleja la producción de matriz cartilaginosa rica en proteoglucanos. Resumidamente, la secuencia codificante de GDF-5 de pollo se clonó en pSLAX-13 y se utilizó como molde para la generación de las mutaciones R438L y L441P correspondientes a las mutaciones humanas. Se realizó una mutagénesis in 25 vitro utilizando el kit QuickChange (Stratagene) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La clonación en el vector RCAS se realizó como se ha descrito previamente (Hughes, S.H., Greenhouse, J.J., Petropoulos, C.J., Y Sutrave, P. 1987. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61:3004-3012). RCAS-Nog era un obsequio amable de A. Vortkamp. Se 30 realizaron cultivos de micromasas como se ha descrito previamente (Lehmann, K., See-mann, P., Stricker, S., Sammar, M., Meyer, B., Suring, K., Majewski, F., Tinschert, S., Grzeschik, K.H., Muller, D., et al. 2003. Mutations in bone morphogenetic protein receptor 1B cause brachydactyly type A2. Proc Natl Acad Sci USA 100:12277-12282) con modificaciones menores. Resumidamente, se obtuvieron huevos fertilizados de pollo de 35 Tierzucht Lohmann (Cuxhaven, Alemania) y se incubaron a 37,5ºC en una incubadora de huevos humidificada durante aproximadamente 4,5 días. Se retiró el ectodermo y se aisla-ron células de los primordios de las patas en la etapa HH23/24 por digestión con 0,1 de

colagenasa tipo Ia y 0,1% de tripsina. Los cultivos de micromasas se extendieron en placas a una densidad de 2 x 105 células por gota de 10 µl. La infección se realizó con 1 µl de los sobrenadantes virales concentrados, RCASBP-A que contenía el cDNA codificante de chGdf5 de tipo salvaje, R438L-chGdf5 y RCASBP-B que contenía el cDNA codificante de chNog. El medio de cultivo (DMEM-F12, 2% suero de pollo, L-glutamina 4 mM, pe-5 nicilina (1000 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml)) se reemplazó cada dos días.

Como era de esperar, la infección de las células de micromasas con virus que expresaban GDF-5 de tipo salvaje da como resultado una inducción de la producción de cartílago como se indica por el aumento en la tinción con azul Alcian y ALP (FIG. 9). La infección con los mutantes de GDF tales como rhGDF R438L da como resultado una fuerte inducción de azul 10 Alcian y ALP. El tratamiento de los cultivos infectados con el antagonista de la proteína mor-fogenética ósea Noggin inhibe por completo la formación de cartílago tanto en los construc-tos de tipo salvaje como en los constructos mutantes.

Ejemplo 5: Análisis de la expresión durante el desarrollo de las articulaciones y sobreexpre-sión de GDF-5 in vivo 15

La sobreexpresión de GDF-5 de tipo salvaje, así como los mutantes de GDF-5 se realizó en embriones de pollo utilizando el sistema retroviral RCAS. La producción de so-brenadante viral concentrado y la inyección en el campo de las extremidades de embriones de pollo HH10 se realizó como ha sido descrito previamente (Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., y Mundlos, S. 2002. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. 20 Dev Biol 245:95-108). Se utilizaron las mismas preparaciones de virus que en el caso de los cultivos de micromasas. Se recogieron embriones entre las etapas HH32-35 y se tiñeron con azul Alcian para visualizar el cartílago. La hibridación en situ se realizó sobre secciones de 7 µm de extremidades de ratón incrustadas en parafina, etapa E13.5 y E14.5, utilizando ribosondas marcadas con digoxigenina como se ha descrito (Stricker, S., Fundele, R., 25 Vortkamp, A., y Mundlos, S. 2002. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Dev Biol 245:95-108). La dilatación de los elementos esqueléticos y las fusiones de las articulaciones en las extremidades infectadas en la etapa HH32 pudo demostrarse en ex-tremidades infectadas con GDF-5 de tipo salvaje y especialmente con mutantes de GDF-5 (véase por ejemplo R438L en FIG. 10). Para comparación se muestra una extremidad no 30 infectada.

LISTADO DE SECUENCIAS

Mutantes de Factores de crecimiento con Actividad Biológica Aumentada

Biopharm y otros

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Proteína recombinante que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana como se muestra en los aminoácidos 400-501 de FIG. 1 o SEQ ID NO 1, en donde

a) en dicha proteína recombinante, el aminoácido en la posición correspondiente a argi-nina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es alanina, valina, leucina, isoleucina o metionina, y/o

b) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a aspa-ragina 445 (N445) de GDF5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es serina o treonina.
2.- Proteína de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde la misma comprende una secuencia que coincide con una de las fórmulas genéri-cas de aminoácidos siguientes:

o

o

o

o

o

o

en donde X1 a X33 denotan cualquier aminoácido, Z1 denota alanina, valina, leucina, isoleu-cina, o metionina, Z2 denota ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, leucina o isoleucina, y Z3 denota serina o treonina.
3.- Proteína de acuerdo con la reivindicación 2,

en donde

X1 denota asparagina (N) o serina (S)

X2 denota arginina (R) o lisina (K)

X3 denota alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S)

X4 denota asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X5 denota arginina (R) o lisina (K)

X6 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X7 denota leucina (L) o metionina (M)

X8 denota isoleucina (I) o valina (V)

X9 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X10 denota histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X11 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X12 denota leucina (L), metionina (M) o valina (V)

X13 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X14 denota isoleucina (I) o leucina (L)

X15 denota isoleucina (I) o valina (V)

X16 denota leucina (L) o metionina (M)

X17 denota alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X18 denota arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S)

X19 denota alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T)

X20 denota alanina (A), metionina (M) o treonina (T)

X21 denota alanina (A) o prolina (P)

X22 denota serina (S) o treonina (T)

X23 denota alanina (A), serina (S) o treonina (T)

X24 denota arginina (R) o lisina (K)

X25 denota serina (S) o treonina (T)

X26 denota fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X27 denota isoleucina (I) o treonina (1)

X28 denota alanina (A) o serina (S)

X29 denota alanina (A) o glicina (G)

X30 denota asparagina (N) o lisina (K)

X31 denota ácido glutámico (E) o glutamina (Q)

X32 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E),

X33 denota alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T)

Z1 denota alanina (A), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) o valina (V)

Z2 denota ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G), leucina (L) o isoleucina (I)

Z3 denota serina (S) o treonina (T)
4.- Acido nucleico, que codifica

una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores.
5.- Vector de expresión, que comprende

un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.
6.- Célula hospedadora, que contiene

un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.
7.- Composición farmacéutica, que comprende

una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o/y un ácido nu-cleico de acuerdo con la reivindicación 4, o/y un vector de expresión de acuerdo con la rei-vindicación 5, o/y una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6.
8.- Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicio-nalmente sustancias adyuvantes y/o portadoras farmacológicamente aceptables.
9.- Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 y 8,

en donde la proteína y/o el ácido nucleico y/o el vector y/o la célula hospedadora están con-tenidas en o sobre un material matriz biocompatible.
10.- Una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9,

para la prevención o terapia de enfermedades para las cuales estarían indicadas proteínas afines a GDF-5.
11.- Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10,

para la prevención o terapia de lesiones o enfermedades en conexión con hueso deteriora-do, cartílago, tejido conectivo, unión de tejido conectivo, tendón, ligamento, disco espi-nal/intervertebral, menisco, tejido dental, dentina, ligamento periodontal, vasos sanguíneos, piel, cabello o tejido neural.
12.- Un método para la producción de una proteína recombinante de acuerdo con una cual-quiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende preparar de manera recombinante una proteína derivada de una proteína afín a GDF-5 por

a) reemplazamiento del aminoácido de la posición correspondiente a arginina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) con alanina, valina, leucina, isoleucina o me-tionina; y/o

b) reemplazamiento del aminoácido de la posición correspondiente a asparagina 445 (N445) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) con serina o treonina.
13.- Un anticuerpo específico para una proteína de acuerdo con una cualquiera de las rei-vindicaciones 1 a 3.
14.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para diagnosis, prevención y/o terapia de enfermedades asociadas con deterioro de hueso y/o cartílago o que afectan a enfermedades de hueso y/o cartílago.
15.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para promover la formación de cartílago y/o hueso y/o fusión espinal.
16.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la diagnosis, prevención y/o terapia de tejido lesionado o enfermo asociado con tejido conectivo que incluye tendón y/o ligamento, tejido periodontal o dental con inclusión de mutantes dentales, tejido neural con inclusión del tejido del CNS y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, tejido renal, uterino y tiroideo, piel, membra-nas mucosas, endotelio y epitelio.
17.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la inducción del crecimiento

de los nervios, regeneración tisular, angiogénesis, curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones y/o injertos de piel.
18.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la inducción de la prolifera-ción de células progenitoras y/o células de la médula ósea.
19.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación para tratamiento o preservación de tejidos o células para trasplante de órganos o tejidos.
20.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la integridad del revestimien-to gastrointestinal.
21.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para el tratamiento de las perturbaciones en la fertilidad.
22.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para aplicaciones que conciernen a las articula-ciones de los elementos esqueléticos y/o para reparación de menisco y/o disco espinal/intervertebral.
23.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos neudegenerativos tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y enfer-medad de Huntington.
24.- Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la

reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para promoción del crecimiento del cabello.