ES2348607T3 - Procedimiento de detección de patogenos con uso de balizas moleculares. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección de la presencia de al menos un patógeno que comprende poner en contacto un ácido nucleico obtenido de una muestra con un conjunto que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueada por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico del patógeno, en la que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.
Description
La presente invención se refiere a diagnósticos específicamente para organismos asociados con enfermedades de transmisión sexual y más particularmente a la detección de genotipos del virus del papiloma humano (VPH), de forma particular genotipos del virus del papiloma humano genital. Virus del papiloma humano y su importancia
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), el cáncer de cuello uterino es la segunda causa más común de muerte por cáncer en mujeres. La presencia de infección por VPH se ha visto implicada en más del 99% de los cánceres de cuello uterino en todo el mundo. Según estimaciones, más de 500.000 mujeres en todo el mundo desarrollan cáncer de cuello uterino cada año, y más de 273.000 de los casos son fatales. Incluso con programas de seguimiento Pap un número significativo de mujeres fallecen de cáncer de cuello uterino cada año.
La infección por VPH es la enfermedad de transmisión sexual (ETS) más frecuente en todo el mundo y hasta el 60% de las mujeres sexualmente activas serán infectadas por VPH en el tracto genital una vez en su vida. Independientemente del estado de infección por VPH, menos de 1 de 10.000 mujeres desarrollarán cáncer de cuello uterino invasivo. De hecho la mayoría de las mujeres infectadas con VPH no desarrollan anormalidades citológicas o el cáncer resalta la importancia de factores que modulan la progresión de la enfermedad de cuello uterino a cáncer en mujeres infectadas con VPH. Estos factores pueden incluir el genotipo de VPH y variante molecular, la carga viral de VPH, persistencia de la infección por VPH, coinfección con otros agentes de ETS, el estado inmune del huésped y factores ambientales tales como fumar.
Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN que infectan las células epiteliales de mamíferos, que provocan lesiones proliferativas epiteliales que pueden ser benignas, por ejemplo, fibropapilomas (verrugas), o que pueden ser malignas. Todos los virus del papiloma son similares en cuando comparten tamaño del genoma, organización, marcos de lectura abiertos y funciones de proteínas. Muchas, pero no todas, las regiones del genoma se conservan entre los diversos virus del papiloma.
Debido a la estrecha asociación entre el ciclo de vida del virus del papiloma y el estado de diferenciación de la célula huésped, los detalles del ciclo de vida del virus del papiloma no se han elucidado por completo. Se sabe que los virus del papiloma infectan células basales del epitelio del huésped, donde los genomas virales comienzan a establecerse y se mantienen como episomas de bajo número de copias que se replican en coordinación con la replicación de la célula huésped. Debido a que las células infectadas se diferencian en queratinocitos, el ADN viral es amplificado, los últimos genes son inducidos y continúa la replicación vegetativa del virus del papiloma.
Los virus del papiloma infectan una amplia variedad de animales, incluyendo seres humanos. Los virus del papiloma humano (VPH) (incluyendo la familia de virus del papiloma, alfa-, beta-, gama-, delta-, mu-papiloma y virus de papiloma no clasificados) son causas comunes de enfermedad de transmisión sexual. Se han identificado varios tipos de VPH con datos de secuencia de ADN, y se han secuenciado completamente hasta la fecha 96 genotipos de VPH. La genotipificación de VPH se basa en secuencias de ADN de los genes L1, E6 y E7. Una diferencia del 10% en la secuencia con respecto a las cepas establecidas previamente es suficiente para definir nuevo tipo de virus.
La heterogeneidad del grupo de virus del papiloma humano se describe en general en deVilliers, 1989, J. Virology 63: 4898-4903. Se han secuenciado y/o caracterizado los genomas de numerosos tipos de VPH.
Los VPH son virus de tumor de ADN cuyo genoma está organizado en tres regiones: las regiones de gen temprano (E1 a E7), las regiones del gen tardío (L1 y L2) y la región reguladora superior (RRS) o la región de control de longitud (RCL). La RRS posee sitios de unión para muchos represores y activadores de transcripción, lo que sugiere que puede jugar un papel en la determinación del conjunto de huéspedes para tipos de VPH específicos. Entre tanto, E1 y E2, codifican proteínas que son vitales para la replicación extracromosomal de ADN y para completar el ciclo de vida viral. El E2 codifica dos proteínas: una que inhibe la transcripción de la región temprana; y la otra, que aumenta la transcripción de la región temprana. Un rasgo distintivo de carcinoma de cuello uterino asociado a VPH es la pérdida de la expresión de las proteínas E2 virales. Recientemente se describió una nueva proteína E2 constituida por el producto del ORF (marco de lectura abierto) de E8 pequeña con la parte de la proteína E2. Esta proteína es capaz de reprimir tanto la replicación como la transcripción viral, y por tanto se cree que tiene un papel principal en la latencia viral.
La proteína E4 se expresa en las fases últimas de la infección se están ensamblando cuando viriones completos y no se conoce que tengan propiedades de transformación; sin embargo se considera que juegan un importante papel para la maduración y replicación del virus. La proteína E4 también induce el colapso de la red de citoqueratina citoplásmica en queratinocitos humanos, una situación que puede ayudar a la liberación de viriones de la célula infectada.
El marco de lectura abierto (ORF) de E5, entre tanto, se elimina frecuentemente en células de carcinoma de cuello uterino, lo que indica que podría no ser esencial en el mantenimiento de la transformación maligna de la célula huésped. Cuando está presente la E5 interacciona con diversas proteínas transmembranales como los receptores del factor de crecimiento epidérmico, factor β de crecimiento derivado de las plaquetas, y factor de estimulación de colonias. Un estudio que usa células infectadas con VPH 16 encontró que la proteína E5 posee débil actividad de transformación.
En carcinogénesis, los ORF (marcos de lectura abiertos) de E6 y E7 se considera que juegan el papel más importante. Estas dos unidades codifican oncoproteínas que permiten la replicación del virus y la inmortalización y transformación de la célula que hospeda el ADN de VPH.
Las unidades de la región tardía, L1 y L2 codifican las proteínas de la cápsida viral durante las últimas fases del ensamblaje del virión. La proteína codificada por L1 se conserva ampliamente entre las diferentes especies del virus del papiloma. La proteína de la cápsida menor codificada por L2 tiene más variaciones de secuencia que la de la proteína L1.
VPH puede infectar las células basales de epitelio de la piel o revestimientos tisulares internos y se categorizan, de acuerdo con esto, como de tipo cutáneo o de tipo mucosal (anogenital).
El ADN de VPH es normalmente extracromosal o episomal en lesiones de precursor de cuello uterino benignas. No obstante, en muchas células de cáncer de cuello uterino así como también en líneas de células de cáncer de cuello uterino y queratinocitos humanos transformados con VPH in vitro, el ADN de VPH se integra en el genoma del huésped.
Los tejidos de cáncer pueden contener tanto ADN de VPH episomal como integrad al mismo tiempo, si bien la integración parece tener lugar más frecuentemente en cáncer de cuello uterino asociado con VPH 18 que en cáncer de cuello uterino asociado con VPH 16. El VPH 16 integrado está presente en algunas lesiones premalignas pero no está siempre presente en carcinomas. Durante la integración de ADN de VPH el genoma viral se rompe normalmente en la región E1/E2. La ruptura conduce normalmente a la pérdida de las regiones E1 y E2. La pérdida de E2, que codifica proteínas incluyendo una que inhibe la transcripción de las regiones E6 y E7, se sabe que da lugar a expresión no controlada y mayor de las proteínas oncogénicas E6 y E7. Entre tanto, se ha observado que la mayor expresión de E6 y E7 conduce a la transformación maligna de las células huésped y a formación de tumor. La integración viral de VPH en el ADN genómico del huésped se asocia con progresión del estado policlonal al monoclonal en neoplasia intraepitelial de cuello uterino (NIC), y estos eventos juegan un papel fundamental en la progresión de neoplasia de cuello uterino de bajo grado a alto grado.
Los modelos de desequilibrio de número de copia de ADN (CNI) son característicos del grado de lesión intraepitelial escamosa (LIE) de cuello uterino, estado del virus del papiloma humano (VPH) y recurrencia post-operatoria. Aunque algunos CNI se observaron a frecuencias similares en LIE-GA (LIE de grado alto) y LIE-GB (LIE de grado bajo), otros, incluyendo ganancia en 1q, 3q y 16q, se encontraron frecuentemente en LIE-GA pero no en LIE-GA. Había significativamente más CNI por caso en LIE-GA que muestra pérdida del gen E2 de VPH16 y en LIE-GA que recurría subsiguientemente. Los datos son coherentes con la adquisición secuencial de CNI en progresión de LIE de cuello uterino. Mayor frecuencia de CNI junto con la pérdida del gen de E2 soporta la evidencia in vitro de que la integración de VPH de alto riesgo está asociada con inestabilidad genómica.
En base a los datos moleculares, clínicos y epidemiológicos disponibles, un subconjunto de VPH son inequívocamente los agentes etiológicos de cánceres de cuello uterino y sus precursores. Los VPH se han detectado en aproximadamente 90% de los adenocarcinomas de cuello uterino y carcinomas de células escamosas. La mayoría de las infecciones con VPH son eliminadas espontáneamente, pero se ha encontrado la infección persistente con ADN de VPH en metástasis que surge de tumores de cuello uterino. Sin embargo tipos de VPH de alto riesgo (u oncogénicos) conocidos son un factor de riesgo significativo para cáncer de cuello uterino y se reconocen de forma creciente por su papel en otros cánceres. Virtualmente todos los cánceres de cuello uterino (99%) contienen los genes de VPH de alto riesgo, los tipos más comunes 16, 18, 31 y 45. Otros tipos de alto riesgo incluyen tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, y 73. Los VPH 31, 33, 35, 51 y 52 se designan a veces como “de riesgo intermedio” debido a que son más comunes en lesiones displásticas leves o graves que en carcinomas. Entre las cepas de alto riesgo, VPH 16 y 18 son las más estrechamente asociadas con carcinoma de cuello uterino. El ADN de VPH 16 se ha encontrado en más del 50% de carcinomas de células escamosas, mientras que el ADN del VPH 18 se ha encontrado en más del 50% de adenocarcinomas. No obstante la gran mayoría de VPH anogenitales presentan potencial oncogénico.
La interacción de VPH con células huésped presenta dos consecuencias biológicas principales:
a) todos los VPH anogenitales inducen lesiones escamosas de bajo grado, que son la
correlación morfológica de una infección productiva y los fenotipos de inmortalización
ejercidos por expresión de E6 y E7 normales. La inmortalización es una estrategia
inherente de los virus del papiloma para movilizar recursos para la replicación de ADN y
producir nueva progenia.
b) Raramente los VPH inducen un fenotipo epitelial proliferativo reconocido como una
lesión de alto grado y este es el precursor citohistológico próximo de carcinoma de
cuello uterino invasivo, que podría implicar expresión de E6, E7 no controlada.
Hasta la fecha las enfermedades clínicas que están asociadas con infecciones de VPH y el campo potencial de aplicaciones de detección de VPH y procedimientos de tipificación incluyen condyloma acuminatum (condilomas), lichen sclerosus, hiperplasia de células escamosas, neoplasia intraepitelial vulvar, carcinoma de células escamosas, neoplasia intraepitelial de cuello uterino, carcinoma de cuello uterino, adenocarcinoma del cuello uterino, neoplasia intraepitelial anal, neoplasia intraepitelial del pene, adenocarcinoma de la laringe, papilomatosis respiratoria recurrente y epidermodisplasias verruciforme. Evidencias recientes sugieren que VPH puede jugar igualmente un papel en el desarrollo del cáncer de próstata en hombres.
Se ensayan lesiones de precursor de cáncer de cuello uterino (lesiones intraepiteliales)
o anormalidades citológicas usando tinte de Papanicolau, conocido también como la prueba Pap (Pap Smear) según el inventor George Papanicolaou. La técnica implica untar raspaduras de cuello uterino en una placa de vidrio y tintar las células obtenidas del tracto anogenital con hematoxilina, un tinte nuclear. La prueba Pap, no obstante, presenta una falta de repetibilidad y no es suficientemente predictiva para impedir neoplasias inducidas por VPH. Se ha demostrado que el 25% de los pacientes con carcinoma in situ avanzado pueden presentar pruebas Pap normales unos años antes del diagnóstico o al menos la última citología negativa era uniformemente positiva en cáncer de cuello uterino tras re-examinación. Un problema crecientemente que prevalece es la ocurrencia de cáncer invasivo a los 3 años de una prueba Pap negativa.
La tasa aceptable actual de negativos falsos (es decir, mujeres que tienen displasia de acuerdo con un conjunto de expertos de patólogos que observan biopsias de tejido más que las muestras de tinción, pero que no diagnostican de ese modo durante el seguimiento por tinción rutinario) es a groso modo 5-10% pero estudios recientes sugieren que la tasa actual puede ser mucho mayor. Además en aproximadamente 7-8% de los casos, la prueba Pap demuestra células escamosas atípicas de importancia no determinada (CEAIND). En un 20-30% adicional de los casos, la prueba Pap puede ser insuficiente para la interpretación debido a la presencia de células inflamatorias. En el caso del cuello uterino, verrugas planas (visualizadas por colposcopía) son lesiones premalignas sospechosas. Se ha descrito bien la progresión histopatológica de verrugas planas a carcinoma in situ y cáncer de cuello uterino.
Las lesiones intraepiteliales son eventos tempranos comunes entre mujeres con infección por VPH incidente y el intervalo entre infección con VPH-16 o VPH-18 incidente y NIC confirmado por biopsia de grado 2-3 parece ser relativamente corto. Sin embargo estudios han demostrado que la infección con tipos de VPH de alto riesgo es normalmente transitoria. La persistencia de infección con VPH aumenta sustancialmente el riesgo de progresión a lesiones intraepiteliales de alto grado y enfermedad invasiva.
La progresión de la enfermedad es variable y está asociada con la pérdida de persistencia de VPH. Son muchas las lesiones displásticas que revierten espontáneamente, otras fracasan al progresar, mientras que unas pocas progresan rápidamente.
Como consecuencia del papel preferencial de genotipos de alto riesgo en cáncer de cuello uterino y debido a los modelos de tipo consecuencial y característico diferentes para las otras afecciones patológicas, tanto la identificación como la tipificación de VPH es de gran importancia. Adicionalmente diferentes tipos de VPH de alto riesgo poseen diferentes riesgos para los individuos afectados. Por ejemplo, VPH16 y VPH18 se han identificado más consistentemente en grados superiores de displasia de cuello uterino y carcinoma que en otros tipos de VPH. El VPH16 es también más prevalente en casos de carcinoma de células escamosas y VPH18 es más prevalente en casos de adenocarcinoma. Diagnósticos de VPH
Desde 1980 se han clonado varios genomas virales y se han usado como sondas específicas de tipo en el diagnóstico de VPH. Se han usado técnicas de hibridación con filtro para detectar ADN de VPH en raspaduras de cuello uterino recogidas en pararelo con muestras para citología rutinaria. Las sondas de ADN de VPH se han usado en diferentes ensayos basados en hibridación tales como ensayos Southern y Dot/Southern híbrido para detectar ADN de VPH en muestras de tejido obtenidas clínicamente. Adicionalmente se ha detectado ADN de biopsia purificado e hibridaciones in situ en especímenes de tejido conservado, es decir, localización directa dentro de la célula intacta de las secuencias complementarias con las sondas de ácido nucleico.
Se ha descrito un procedimiento para la detección de tipos de ADN de VPH que usa un procedimiento por técnica blot inversa. El procedimiento implica la formación de una membrana a la que se unió ADN genómico de cuatro tipos de VPH diferentes y luego se hibridiza ADN etiquetado de una muestra biológica con el ADN unido a la membrana.
Se han desarrollado numerosos procedimientos para detectar tipos de virus del papiloma humano usando reacción específica del tipo, detectando un tipo de VPH cada vez. Se ha usado la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) para amplificar y detectar la presencia de ADN de VPH16 y VPH18, de forma particular para detectar VPH16 en biopsias orales y de cuello uterino. Se ha descrito una mezcla de cebadores para la amplificación específica por RCP de secuencias de VPH en tipos 1a, 5, 6a, 8, 11, 16, 18 y 33. Las patentes de Estados Unidos números 4.683.195 y 4.683.202 describen RCP y el uso de RCP para detectar la presencia o ausencia de secuencia de ácido nucleico en una muestra.
La patente de Estados Unidos número 5.447.839 describe un procedimiento para la detección y tipificación de VPH. En este procedimiento las secuencias de ADN de VPH en una muestra son amplificadas por RCP usando cebadores de consenso que amplifican tanto los tipos de VPH oncogénicos como no oncogénicos. Por tanto la presencia de VPH en la muestra viene indicada por la formación de productos de amplificación. El VPH se tipifica luego usando las sondas de ADN específicas del tipo que se hibridan con la región amplificada de ADN. Las sondas de hibridación específicas del tipo en esta patente son capaces de identificar y distinguir entre cinco tipos oncogénicos conocidos de VPH, a saber, VPH-6, VPH-11, VPH-16, VPH-18 y VPH-33.
Se han divisado una variedad de procedimientos para detectar tipos de VPH de alto riesgo. Muchos de estos descansan en la detección de secuencias únicas en el genoma del VPH. Por ejemplo, se han descrito sondas de ADN o ARN complementarias con una porción de los genes de una cepa de VPH de alto riesgo particular en la técnica, como útiles en el seguimiento de la presencia de una capa particular de VPH de alto riesgo en muestras de pacientes (patente de Estados Unidos número 4.849.332, patente de Estados Unidos número 5.705.627, describe el uso de RCP para amplificar y detectar ADN de VPH usando cebadores degenerados o de consenso mixtos, seguido de tipificación usando una mezcla de sondas de ADN específicas del genotipo. Se pueden encontrar otros ejemplos de uso de cebadores de consenso en la patente de Estados Unidos nº 5.364.758, y en Kleter, B. y col., Am. J. of Pathology, vol. 153, nº 6, 1731-39 (1998).
Hay un procedimiento comercial disponible que se basa en la hibridación y amplificación de señal (Hybrid Capture II, Digene Corp.). No obstante este procedimiento presenta problemas de especificidad debido a la alta homología de secuencia de algunas partes de los genomas de VPH.
Los procedimientos basados en amplificación consisten en una parte responsable de la sensibilidad (amplificación), que se separa de aquellas partes responsables de la especificidad (detección por hibridación). Estas técnicas difieren en la sección del genoma amplificado, el número de cebadores y las técnicas de detección. Los procedimientos de amplificación más frecuentemente usados son GP5+-GP6+ (cebador general -GP), MY9-MY11, PGMY, SPF, L1C y las reacciones RCP específicas del tipo. Las técnicas de detección más frecuentemente usadas son hibridación específica de secuencia, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (PLFR) y ensayo de sonda en línea (ESeL). A veces, pero raramente, se aplican procedimientos de secuenciación u otros. Las propiedades analíticas de las amplificaciones varían dentro de un amplio intervalo y se caracterizan por el número de genotipos que se pueden amplificar, la sensibilidad analítica, la especificidad de la amplificación / detección de genotipos y también por las diferencias de sensibilidades entre genotipos. RCP a tiempo real de VPH
La carga viral del virus de papiloma humano 16 (VPH-16) podría ser un biomarcador predictivo de la presencia de lesiones de cuello uterino de grado alto. Se han desarrollado varios ensayos de RCP a tiempo real para medir exactamente la carga viral de VPH-16 (L1 de VPH-16, E6 de VPH-16, y E6 PG de VPH-16). Los procedimientos nos indican cómo llevar a cabo la detección de VPH a tiempo real, pero sólo la detección de un genotipo de una vez.
Se llevó a cabo la identificación de ADN de VPH en pacientes con papilomatosis respiratoria recurrente de comienzo juvenil usando RCP a tiempo real SYBR® Green. Se usa el procedimiento para detectar múltiples genotipos del virus del papiloma humano en una reacción RCP a tiempo real. Sin embargo el procedimiento de amplificación es diferente del descrito en la presente invención. El amplicón producido en más largo (aproximadamente 450 pb) de lo aceptado para un procedimiento de amplificación a tiempo real basado en sonda en la técnica. La longitud preferida es 150 pb o menos. El procedimiento de detección es inespecífico e incapaz de diferenciar los genotipos de forma fiable, por lo que necesita subsiguientemente tipificación viral usando RCP a tiempo real con cebadores específicos del tipo para tipos de VPH 6, 11, 16, 18, 31, y 33. De nuevo esto detecta los tipos de virus del papiloma humano de forma aislada, pero sólo un genotipo de cada vez.
De forma similar otros usaron un procedimiento en el que se usaba reacción anidada en un tubo único (single-tube nested reaction) para detectar genotipos del virus del papiloma humano de una forma general. Sin embargo no se describió la detección específica de grupos.
Se usó otro procedimiento para detectar ADN del virus del papiloma humano en modelos de sexo de nuevo usando un enfoque de dos etapas para evaluar tanto los genotipos como los datos de carga viral. El procedimiento usa reacción en cadena de la polimerasa (RCP) GP5+/6+, seguida de análisis blot en línea inverso. Se usó para la detección de 45 tipos de VPH en muestras de raspaduras de cuello uterino y pene. Se determinaron subsiguientemente cargas virales en muestras de raspaduras positivas para tipos de VPH 16, 18, 31 y 33 mediante un ensayo de RCP a tiempo real basado en LightCycler. La RCP GP5+/GP6+ genera un amplicón de 150 pb de longitud, lo que permite la aplicación de los procedimientos basados en sonda a tiempo real. Sin embargo el procedimiento no puede detectar múltiples genotipos o grupos en una reacción.
Se ideó un procedimiento de detección y cuantificación a tiempo real homogéneo de amplificación de ácido nucleico usando digestión de enzima por restricción. En este sistema homogéneo la detección es mediada por un cebador que contiene un resto reportero y desactivante en su término 5’ separado por una sección corta de ADN que codifica una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción. En la forma de hebra simple la señal del reportero fluorescente se desactiva debido a la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (TERF). Sin embargo ya que el cebador comienza a incorporarse en un amplicón de doble hebra, un enzima de restricción presente en la reacción escinde la unión de ADN al reportero y desactivante, permitiendo la fluorescencia no restringida del reportero. Este sistema se ensayó usando un cebador específico para el gen E6 del virus del papiloma humano (VPH) 16 combinado con la etiqueta de transferencia de energía escindible y se usó para amplificar el ADN positivo en VPH16. El procedimiento no se puede usar para la detección de múltiples genotipos o grupos.
Se ha descrito también un sistema basado en RCP a tiempo real para cuantificación simultánea de tipos del virus del papiloma humano asociados con alto riego de cáncer de cuello uterino. Se desarrollo un ensayo de RCP a tiempo real para la detección y cuantificación de VPH16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -52, -58, y -67. El ensayo se basa en tres RCP a tiempo real en paralelo de cada muestra de paciente: (i) la reacción 1 detecta y cuantifica VPH16, -31, -18, y -45 (VPH18 y -45 fueron detectados y cuantificados juntos usando una sonda) con tres fluoróforos diferentes; (ii) la reacción 2 detecta y cuantifica VPH33, -35, -39, -52, -58, y -67 (VPH33, -52, -58, y -67 fueron detectados y cuantificados juntos), de nuevo con tres fluoróforos diferentes y sólo se usaron tres muestras diferentes; y (iii) la reacción 3 detecta y cuantifica la cantidad de un gen de copia simple humano (HMBS, hidroximetilbilano sintasa de Homo sapiens; nº de acceso GenBank M95623.1). La reacción 1 incluye un total de siete cebadores de RCP y tres sondas, la reacción 2 incluye un total de siete cebadores de RCP y tres sondas, y la reacción 3 incluye dos cebadores de RCP y una sonda simple. El procedimiento aplica sondas de RCP a tiempo real TaqMan hidrolizables. Se describe el uso de sólo tres sondas en una reacción que detecta un máximo de 6 genotipos en la misma reacción. El procedimiento no se puede usar como una indicación general para concebir reacciones que detectan múltiples genotipos de VPH debido a que las identidades de secuencia entre genotipos son limitadas. La extensión de la reacción se restringe con el uso de las identidades de secuencia entre genotipos.
Se desarrolló previamente un procedimiento para la detección y cuantificación del virus del papiloma humano (VPH) oncogénico usando el ensayo de la exonucleasa 5’ fluorescente. El procedimiento se basa en la amplificación de un fragmento de 180 pb de la parte 3’ del marco de lectura abierto E1 en una RCP simple con sondas específicas del tipo para tipos de VPH 16, 18, 31, 33, y 35. Se pueden usar las sondas por separado o en combinaciones de hasta tres sondas por ensayo. El procedimiento se limitó a tres sondas por ensayo.
Se ha descrito también una estrategia para la detección y genotipificación del virus del papiloma humano con reacción en cadena de la polimerasa SybrGreen y baliza molecular. El ensayo conlleva la detección de VPH general por reporte SybrGreen de amplicones de ADN de VPH, y genotipificación de siete tipos de VPH prevalentes (VPH-6, -11, -16, -18, -31, -33, -45) mediante RCP con baliza molecular a tiempo real. El procedimiento de dos etapas usa tres balizas moleculares etiquetadas de forma diferente en una reacción RCP.
Se ha descrito también otro procedimiento: se usó un cebador fluorescente de auto-sondeo de VPH degenerado conocido como Scorpion y una mezcla de Scorpions junto con un cebador general con cola. Usando un cebador con cola fue posible introducir un sitio de consenso que permite a un Scorpion simple reconocer muchos amplicones de VPH diferentes. Esto es un procedimiento en dos etapas que puede detectar teóricamente más de 40 tipos de VPH diferentes. Se usaron 10 cebadores de tipificación de Scorpion en este estudio (VPH6, 11, 16, 18, 31, 33, 39, 45, 51, 56). La secuencia del cebador de cada Scorpion es específica del tipo y se localiza en la misma posición de secuencia que el del cebador GP6+ de Jacobs y col. El procedimiento muestra un procedimiento de detección general para detectar la presencia de VPH y un procedimiento de detección específico del tipo usando para tipificar las muestras positivas. No resuelve el problema del seguimiento con sondas múltiples que conduce a reactividad cruzada de sonda. De hecho el procedimiento evita el uso de sondas múltiples en una reacción.
Los procedimientos de detección de VPH basados en RCP a tiempo real usando los ensayos LightCycler™ y TaqMan™ a tiempo real se han comparado con RCP GP5+/6+ / inmunoensayo de enzima (IEE) para evaluar la carga de virus del papiloma humano en especímenes de raspadura de cuello uterino. Ambos ensayos de RCP a tiempo real determinaron la carga de VPH16 en especímenes de raspadura de forma similar, pero había poco acuerdo entre estos ensayo y el RCP GP5+/6+ / IEE, lo que sugiere que este último procedimiento no es adecuado para la cuantificación de ADN de VPH. Se han determinado también cargas de ADN de VPH6/11 y VPH16/18 mediante RCP cuantitativa fluorogénica a tiempo real que detectan los dos tipos de genes de VPH de una vez. Procedimientos de diseño de cebador de consenso
Se pueden diseñar cebadores y sondas que se usan para detectar sólo una molécula de ácido nucleico del virus del papiloma humano, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica una parte del L1, usando, por ejemplo, un programa informático tal como OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.) o Primer3. También se conocen características apropiadas de estos oligonucleótidos por parte de los especialistas en la técnica. Hay extensa bibliografía en relación a los principios generales del diseño de cebador de RCP que han llevado a un número de aplicaciones de software, lo más reseñable Primer3 y diversas extensiones. Se ha desarrollado también un lenguaje de programación dinámico rápido para probar cebadores en relación a la compatibilidad en pares. La aplicación de RCP múltiple ha aumentado constantemente en la pasada década, lo que requiere protocolos de selección de cebador más sofisticados. Diferentes algoritmos pueden favorecer determinados objetivos, o se pueden diseñar para plataformas de tecnología particular. En general el problema de identificar pares de cebador para maximizar el nivel multiplexo de un único ensayo ha demostrado ser de NP completo. Se ha presentado un algoritmo de aproximación que elimina la base 3’ complementariamente que conlleva a la vez la reducción del tamaño del producto.
El procedimiento de la invención se refiere al problema de diseñar ensayos por RCP múltiple, de forma particular al diseño de cebadores de consenso. El enfoque general de este problema es diseñar cebadores de consenso para amplificar numerosas dianas con menos pares de cebador que el número de dianas. Además el diseño tendría en cuenta las reglas de diseño de ensayos por RCP múltiple igualmente, ejemplificadas por un virus del herpes de consenso.
Se desarrolló un enfoque particular para identificar secuencias de genes distantemente relacionadas basado en cebadores de oligonucleótidos híbridos de consenso degenerado (CODEHOP). Se pueden representar regiones cortas de proteínas con altos niveles de conservación como bloques sin huecos de secuencias de proteínas alineadas de forma múltiple. Los CODEHOP se derivan de estos bloques de secuencia conservados y se usan en RCP para amplificar la región entre ellos. Un cebador CODEHOP para RCP consiste en un conjunto de cebadores que contiene cada uno una secuencia diferente en al región del núcleo degenerado en 3’ donde cada cebador proporciona una de las posibles combinaciones de codón que codifica un motivo de aminoácido conservado en 3-4 dentro del bloque de secuencia. Además cada cebador en el conjunto presenta una región de empalme consenso en 5’ idéntica derivada del nucleótido más probable en cada posición que codifica los aminoácidos conservados que flanquea el motivo pretendido. La amplificación se inicia mediante hibridación y extensión de cebadores en el conjunto con la mayor similaridad en el núcleo degenerado en 3’ con el templado diana. La hibridación es estabilizada por el empalme de consenso en 5’ que coincide parcialmente con el templado diana. Una vez se incorpora el cebador, este hace que el templado comience ciclos de amplificación subsiguientes. Debido a que todos los cebadores son idénticos en la región de empalme de consenso en 5’, todos estos se hibridarán con alta escasez durante las rondas de amplificación subsiguientes. Este procedimiento también se ha usado en el campo de viriología. Este enfoque es diferente del procedimiento de la invención en cuanto a que se usan bloques de secuencia específicos para alcanzar amplificación eficiente de secuencias relacionadas. El programa Codehop encuentra cebadores para amplificación de dianas desconocidas pero trabaja con alineamientos de secuencia de proteína en lugar de secuencias de ADN.
Hay numerosos procedimientos que comparten el diseño de cebadores de consenso/degenerados, pero no usan en general algoritmos diferentes para resolver básicamente el mismo problema: identificar el conjunto de cebador que mejor se ajusta para amplificación eficiente de las secuencias diana relacionadas. No se tiene en cuenta la cooperación entre cebadores:
Otro enfoque es el programa PriFi (http://cgi-www.daimi.au.dk/csi-chili/PriFi/main). Este diseña pares de cebadores útiles para amplificación por RCP de ADN genómico en especies donde previamente la información de secuencia no está disponible.
El programa funciona con un alineamiento de secuencias de ADN de especies relacionadas filogenéticamente y pone de manifiesto una lista de pares de cebadores degenerados posibles que cumplen un número de criterios tal que los cebadores tienen una gran probabilidad de amplificar secuencias ortólogas en otras especies relacionadas filogenéticamente. Sin embargo el programa no usa el concepto de cooperación entre cebadores.
El programa Amplicon para diseño de cebadores de RCP en grupos alineados de secuencias de ADN es un procedimiento similar. La aplicación más importante para Amplicon es el diseño de conjuntos de cebadores para RCP “específicos del grupo” que amplifican una región de ADN de un grupo taxonómico dado pero no amplifican regiones ortólogas de otros grupos taxonómicos. De nuevo la cooperación entre cebadores no se tuvo en cuenta.
El diseño de cebadores para reacción de amplificación para detección mediante direccionamiento de numerosas dianas de amplificación relacionadas no tiene reglas íntegras en la bibliografía. Sin embargo se acepta por lo general que las interacciones no predecibles entre cebadores y la competición para fuentes de amplificación reducen la sensibilidad de la reacción y más cebadores significa una mayor probabilidad de pérdida de cebadores que genera productos no específicos que compiten adicionalmente por las fuentes.
El papel potencial de VPH que se ensaya en el seguimiento del carcinoma de cuello uterino es muy dependiente de los recursos existentes. En medios clínicos en los que se encuentra un programa basado en citología, bien organizado, efectivo, la decisión es si el ensayo de VPH se incorpora al programa existente saliendo a la palestra cuestiones de efectividad de costes, control de calidad y valor añadido. Por el contrario las configuraciones en las que el seguimiento no existe o es inefectivo debido a la citología de poca calidad o limitaciones inherentes debidas a la alta tasa de tinciones inflamatorias, se vuelven primordiales las cuestiones más básicas de sensibilidad y simplicidad de procedimientos de ensayo.
La técnica de RCP a tiempo real ofrece características que cumplen e incluso exceden los requerimientos en ambos escenarios descritos anteriormente. Un estudio reciente determinó la cantidad de ADN de VPH para algunos de los tipos de VPH de alto riesgo más frecuentes que determina la progresión a enfermedades malignas de cuello uterino (CIS). El intervalo de números de copia por célula no difiere entre tipos de VPH pero la relación de probabilidades de CIS en el percentil con mayor carga viral es sustancialmente mayor para VPH 16 (OR = 36,9; 95% CI = 8,9-153,2) que para VPH 31 (OR = 3,2; 95% CI = 1,1-9,1) o VPH 18/45 (OR = 2,6; 95% CI = 1,0-6,4). Por tanto, la carga viral de VPH puede ser predictiva de riesgo futuro de CIS de cuello uterino en una fase cuando las raspaduras son negativas en lo relativo a anormalidades de células escamosas. Las técnicas a tiempo real ofrecen las premisas para determinar la carga viral más exactamente que los procedimientos de detección de VPH existentes. La técnica a tiempo real ofrece varias ventajas frente a los procedimientos existentes. No obstante no se han desarrollado procedimientos de amplificación y detección a tiempo real que puedan detectar más de tres tipos de virus del papiloma humano en una reacción. Tampoco se ha desarrollado procedimiento alguno que pueda detectar más de tres tipos virus del papiloma humano en una reacción. Tampoco se ha desarrollado procedimiento alguno para detectar grupos clínicamente importantes del virus, por ejemplo, virus del papiloma humano de bajo riesgo o alto riesgo en grupos en una reacción.
Un ensayo de VPH con auto-muestreo exacto podría tener enormes implicaciones. Un ensayo de este tipo abre hasta la posibilidad de evaluar mujeres que por otra parte no desean
o son incapaces de someterse a exámenes pélvicos. En zonas subdesarrolladas esto ofrecería una ventaja frente a la práctica actual. En zonas donde el seguimiento organizado se encuentra establecido, el auto-muestreo ofrece un enfoque adicional para llegar a mujeres que rechacen tener seguimiento convencional y también pueden tener un papel en la supervivencia o el control tras el tratamiento de mujeres con citología negativa positivas en VPH, en el que se necesita el ensayo de seguimiento a intervalos cortos. El enfoque auto-muestreo con capacidades de ensayo próximas al paciente mejoran la calidad y accesibilidad de los programas de seguimiento.
Un ensayo de VPH que se dirige tanto al mercado de seguimiento convencional como al primario, debería satisfacer todas estas necesidades. La técnica de RCP a tiempo real es especialmente adecuada para cumplir estos requerimientos tecnológicamente. La simplicidad inherente de la técnica ayuda a reducir barreras de infraestructuras y esto también es efectivo en costes frente a otras técnicas. Por otra parte las técnicas de RCP a tiempo real podrían reforzar la sensibilidad analítica y de forma más importante la especificidad de la detección de VPH, lo que proporciona una base más sólida de la mejora de las contrapartidas clínicas de estos parámetros. El control interno ayuda a las capacidades de control de calidad para el sistema.
En la aplicación de proximidad al paciente de detección de VPH las técnicas a tiempo real son las opciones más factibles. El ensayo de proximidad al paciente sería la siguiente frontera en el seguimiento primario y las técnicas a tiempo real son ya de atención significativamente atrayente en este campo en el caso de otros patógenos y podrían proporcionar valor añadido en la práctica.
La mayor sensibilidad de RCP a tiempo real en comparación con otros procedimientos, así como también las mejoras de característica proporcionadas por RCP a tiempo real incluyendo contención y detección a tiempo real del producto amplificado indican la factibilidad de implementación de esta técnica de diagnóstico rutinario de infecciones por virus del papiloma humano en el laboratorio clínico.
Tsourkas y col. (Briefings in functional genomics and proteomics, vol. I., nº 4, 372-384 2003) describen el uso de balizas moleculares en la detección e identificación de patógenos. Las balizas descritas comprenden de forma típica de cuatro a seis troncos de pares de bases.
En el primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de detección de la presencia de al menos un patógeno que comprende poner en contacto un ácido nucleico obtenido de una muestra con un conjunto que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de patógeno flanqueada por cuatro o cinco pares de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico de un patógeno, en el que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de un patógeno provoca un cambio en la señal detectada.
Como se usa en el presente documento “ácido nucleico” se refiere a ADN y ARN en sus diversas formas tales como ARNm y ARNhn. El ácido nucleico puede ser de hebra simple o de hebra doble.
Tal como se usa en el presente documento un “patógeno” significa un agente biológico que alterna la fisiología normal de un animal, que provoca o está asociado con enfermedad. El patógeno puede ser un agente causante, es decir, la infección de un paciente con el patógeno produce la enfermedad ya sea sólo, o en presencia de otro cofactor.
Preferiblemente el patógeno es un organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual. Tal como se usa en esta invención el término “organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual” se refiere con un organismo que está presente en pacientes que sufren de la enfermedad de transmisión sexual. Ejemplos de organismos asociados con una enfermedad de transmisión sexual incluyen Chlamydia trachomatis que está asociado con chlamydia, Neisseria gonorrhoeae que está asociado con gonorrea, virus del herpes simple (VSH) que está asociado con herpes genital, virus del papiloma humano que está asociado con verrugas genitales y Treponema pallidum que está asociado con sífilis. El organismo es preferiblemente un virus, más preferiblemente un virus del papiloma humano (VPH). El procedimiento se usa preferiblemente para detectar la presencia de uno o más genotipos de VPH.
Si bien el procedimiento de la presente invención se refiere a la detección de un patógeno, este procedimiento se puede usar para detectar la presencia o ausencia de cualquier organismo, de forma particular organismos que contienen más de una subespecie, u organismos relacionados. Tal como se usa en esta invención, “organismos relacionados” se refiere a organismos que son de la misma clase, género o especie, y tienen un alto nivel de similaridad genética, preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente 90%. Los organismos relacionados son preferiblemente virus, más preferiblemente virus del papiloma humano.
Cada una de las sondas tiene preferiblemente la estructura general 3’ – tronco – F – secuencia complementaria del VPH – F’ – tronco’ – 5’
F y F’ son secuencias de unión opcionales que unen las secuencias complementarias con los pares de bases de flanqueo, tronco y tronco’. Tronco y tronco’ son las secuencias formadas por los pares de bases complementarios que forman una estructura troncal de doble hélice en la solución. Estas secuencias son preferiblemente palindrómicas. Hay preferiblemente 4 bases en cada extremo de la sonda. Las bases que constituyen el tronco comprenden preferiblemente pares C-G, preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 pares C-G. El tronco preferiblemente tiene la secuencia CGCG.
Se determinó en nuestros experimentos que las balizas moleculares de tronco de cuatro pares de bases no interactúan entre ellas provocando señal de amplificación falsa no previsible en el tiempo en ausencia de ADN diana detectable, que parece depender de la tasa on-off de la estructura troncal. Ocasionalmente se necesita usar balizas moleculares de tronco de cinco pares de bases para optimizar la reacción. Balizas con troncos más largos tanto en detección simple como múltiple ejecutaron señales de amplificación falsas no controlables. Balizas troncales más cortas normalmente tienen temperaturas de fusión demasiado bajas para ser útiles en reacción de amplificación a tiempo real.
El término “etiqueta de interacción” como se usa en esta invención se refiere a una de un par de etiquetas que coopera con el otro par de etiquetas. Esta cooperación tiene lugar cuando las etiquetas se encuentran en estrecha proximidad, tal como cuando las sondas tienen una estructura en bucle troncal. Cuando la sonda se hibridiza con un ácido nucleico complementario la cooperación entre las etiquetas se ve disminuida, o eliminada por completo cuando la distancia entre ellas ve en aumento. Las etiquetas se unen a las sondas en cada extremo de la sonda, preferiblemente en o adyacente a las bases complementarias que forman la estructura en bucle troncal. No presenta importancia cuando se unan las etiquetas, procurando que se pueda detectar un cambio en la señal cuando la sonda cambia de una conformación a la otra, es decir, abrirse el bucle troncal. El cambio en la señal puede ser un aumento de señal cuando la sonda está en la posición abierta, es decir, cuando se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos complementaria, por ejemplo, cuando una etiqueta que interacciona desactiva la señal de la segunda etiqueta que interacciona. De forma alternativa el cambio en la señal se pueden una disminución en la señal cuando estando la sonda en la posición abierta, se hibrida con una secuencia de ácidos nucleicos complementaria, por ejemplo, cuando la primera etiqueta que interacciona provoca una señal para ser emitida desde la segunda señal que interacciona.
En una realización preferida las etiquetas que interaccionan son un donador TERF y un aceptor TERF correspondiente.
La técnica TERF (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.996.143, 5.565.322, 5.849.489 y 6.162.603) se basa en el hecho de que cuando un donador y un resto fluorescente aceptor correspondiente se posicionan dentro de una cierta distancia uno del otro, tiene lugar la transferencia de energía entre los dos restos fluorescentes que se puede visualizar o bien detectar y/o cuantificar. Tal como se usa en esta invención, el formato de la técnica TERF usa técnicas de baliza molecular para detectar la presencia o ausencia de un virus del papiloma humano. La técnica de baliza molecular usa una sonda de hibridación etiquetada con un resto fluorescente donador y un resto fluorescente aceptor. Las etiquetas fluorescentes se localizan típicamente en cada extremo de la sonda. La técnica de baliza molecular usa un oligonucleótido sonda que tiene secuencias que permiten la formación de estructura secundaria (por ejemplo, un prendedor de pelo). Como consecuencia de la formación de la estructura secundaria dentro de la sonda, ambos restos fluorescentes se encuentran en proximidad espacial cuando la sonda está en solución. Tras la hibridación con los ácidos nucleicos diana (es decir, el ácido nucleico del genotipo VPH), la estructura secundaria de la sonda se ve alterada y el resto fluorescente comienza a separarse uno del otro tal que después de la excitación con luz de una longitud de onda adecuada, la emisión del primer resto fluorescente es diferente al detectado en ausencia de un ácido nucleico de un genotipo de VPH.
Tal como se usa en esta invención con respecto a restos fluorescentes donador y de aceptor correspondiente, “correspondiente” se refiere a un resto fluorescente aceptor que presenta un espectro de emisión que solapa el espectro de excitación del resto fluorescente donador. El máximo de longitud de onda del espectro de emisión del resto fluorescente aceptor debería ser al menos preferiblemente 100 nm mayor que el máximo de longitud de onda del espectro de excitación del resto fluorescente donador. De acuerdo con lo anterior se puede producir transferencia de energía no radiactiva eficiente entre ellos.
Se seleccionan en general restos donadores y aceptores fluorescentes para (a) transferencia de energía de Forster con alta eficiencia; (b) un gran desplazamiento de Stokes final (>100 nm); (c) desplazamiento de la emisión tan lejos como sea posible en la parte del rojo del espectro visible (>600 nm); y (d) desplazamiento de la emisión a una longitud de onda mayor que la emisión fluorescente en agua Raman producida por excitación a la longitud de onda de excitación del donador. Por ejemplo, se puede seleccionar un resto fluorescente donador tal que tenga su máximo de excitación cerca de una línea láser (por ejemplo, heliocadmio 442 nm o Argon 488 nm), un coeficiente de excitación alto, un rendimiento cuántico alto, un buen solapamiento de su emisión fluorescente con el espectro de excitación del resto fluorescente aceptor correspondiente. Se puede seleccionar un resto fluorescente aceptor correspondiente que tenga un coeficiente de excitación alto, un alto rendimiento cuántico, un buen solapamiento de su excitación con la emisión del resto fluorescente donador y emisión en la zona del rojo del espectro visible (> 600 nm).
Restos fluorescentes donadores representativos que se pueden usar con diversos restos fluorescentes aceptores en técnica TERF incluyen fluoresceína, amarillo Lucifer, Bficoeritrina, 9-acridinaisotiocianato, amarillo Lucifer VS, ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatoestilbeno-2,2’-disulfónico, 7-dietilamino-3-(4’-isotiocianatofenil)-4-metilcoumarina, 1pirenobutirato de succinimidilo, derivados de ácido 4-acetamido-4’-isotiocianatoestilbeno-2,2’disulfónico, pirenos opcionalmente sustituidos, antracenos, naftalenos, acridinas, estilbenos, indoles, bencindoles, oxazoles, benzoxazoles, tiazoles, benzotiazoles, 4-amino-7-nitrobenz-2oxa-1,3-diazoles, cianinas, carbocianinas, carboestirilos, porfirinas, salicilatos, antranilatos, azulenos, perilenos, piridinas, quinolinas, coumarinas, poliazaindacenos, xantenos, oxazinas, benzoxazinas, carbazinas, fenalenonas, benzofenalenonas, carbazinas, oxazinas, 4-bora3a,4a-diaza-s-indacenos, fluoroforesceínas, rodaminas, rodoles, 5-carboxifluoroforesceínas (FAM), ácidos 5-(2’-aminoetil) aminonaftalen-1-sulfónicos (EDANS), antranilamidas, quelatos de terbio, rojo 4 reactivo, rojos de Texas, tintes ATTO, tintes EVO, tintes DYO, tintes Alexa y tintes BODIPY.
Restos fluorescentes aceptores representativos, en función del resto fluorescente donador usado, incluyen LC.TM.-RED 640 (éster LightCycler.TM.-Red 640-Nhidroxisuccinimida), LC.TM.-RED 705 (LightCycler.TM.-Red 705-fosforamidita), tintes de cianina tales como CY5 y CY5.5, cloruro de lisamina rodamina B sulfonilo, isotioacianato de tetrametilrodamina, isotiocianato de rodamina x, isotiocianato de eritrosina, fluoresceína, pentaacetato de dietilentriamina u otros quelatos de iones lantánidos (por ejemplo, europio o terbio). Se pueden obtener restos fluorescentes donadores y aceptores, por ejemplo, en Molecular Probes (Junction City, Oreg.) o Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.).
Preferiblemente el resto fluorescente aceptor es un desactivante. Tal como se usa en esta invención un desactivante es un resto que reduce la fluorescencia emitida por la etiqueta fluorescente. Esto incluye inhibición completa y parcial de la emisión de la fluorescencia. El grado de inhibición no es importante en tanto se puede detectar un cambio en la fluorescencia una vez se elimina el desactivante.
El resto desactivante se selecciona preferiblemente del grupo constituido por fenilos opcionalmente sustituidos, naftilos, antracenilos, benzotiazoles, benzoxazoles, o bencimidazoles, pirenos, antracenos, naftalenos, acridinas, estilbenos, indoles, bencindoles, oxazoles, benzoxazoles, tiazoles, benzotiazoles, 4-amino-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazoles, cianinas, carbocianinas, carboestirilos, porfirinas, salicilatos, antranilatos, azulenos, perilenos, piridinas, quinolinas, coumarinas, poliazaindacenos, xantenos, oxazinas, benzoxazinas, carbazinas, fenalenonas, benzofenalenonas, carbazinas, oxazinas, 4-bora-3a,4a-diaza-sindacenos, fluoroforesceínas, rodaminas, rodoles, ácidos 5-carboxifluoroforesceínas (FAM), ácidos 5-(2’-aminoetil) aminonaftaleno-1-sulfónicos (EDANS), antranilamidas, quelatos de terbio, rojo 4 reactivo, dabcilos, nitrotirosinas, verdes malaquita, rojos de Texas, dinitrobencenos, tintes ATTO, tintes EVO, tintes DYO, tintes Alexa y tintes BODIPY.
La selección de pares adecuados de donadores y aceptores TERF o desactivantes se encuentra dentro del conocimiento del especialista en la técnica.
Por lo general cuando se detecta TERF en una cantidad que es estadísticamente diferente de la cantidad de TERF en una muestra que le falta la molécula de ácido nucleico del virus del papiloma humano indica la presencia de una infección por virus del papiloma humano en el individuo. La hibridación de la sonda con el ácido nucleico aumenta la distancia entre el resto donador y aceptor, y por tanto se reduce la interacción de TERF. El cambio en longitud de onda de emisión detectado puede ser un aumento en emisión o emisión a una longitud de onda diferente, tal como cuando se usa un desactivante. De forma alternativa puede haber una reducción en emisión o emisión a una longitud de onda diferente cuando se usa un aceptor donador no desactivante.
Se puede llevar a cabo el análisis fluorescente usando, por ejemplo, un sistema de microscopio epifluorescente de conteo de fotones (que contiene el espejo dicroico apropiado y filtros para controlar la emisión fluorescente en el intervalo determinado), un sistema fotomultiplicador de conteo de fotones, o un fluorómetro. La excitación para iniciar la transferencia de energía se puede llevar a cabo con láser de ión argon, una lámpara de arco de mercurio (Hg) de alta intensidad, una fuente de luz de fibra óptica, u otra fuente de luz de alta intensidad filtrado de forma apropiada para excitación en el intervalo deseado.
Los restos fluorescentes donador y aceptor están unidos preferiblemente a la sonda en las secuencias de unión. Los restos fluorescentes donador y aceptor se pueden unir al oligonucleótido de sonda apropiado mediante un brazo conector. La longitud de cada brazo conector también es importante ya que los brazos conectores afectarán a la distancia entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptor. La longitud de un brazo conector para el fin de la presente invención es la distancia en Angstroms (ANG) desde la base del nucleótido al resto fluorescente. Por lo general, un brazo conector es de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 ANG. El brazo conector puede ser del tipo descrito en el documento WO 84/03285. El documento WO 84/03285 también describe procedimientos para la unión de brazos conectores a bases de nucleótidos particulares, y también para la unión de restos fluorescentes a un brazo conector.
La sonda debe tener un nivel suficiente de identidad con el ácido nucleico del patógeno u organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual de modo que se pueda hibridar con ácido nucleico de uno o más patógenos u organismos asociados con una enfermedad de transmisión sexual en condiciones adecuadas. Se indica que un ácido nucleico de hebra simple se hibrida con otro si se forma un dúplex entre ellos. Esto tiene lugar cuando un ácido nucleico contiene una secuencia que es la inversa complementaria de la otra (esta misma disposición da lugar a la interacción natural entre las hebras en sentido y antisentido de ADN en el genoma y subyace la configuración de la hélice doble). No se requiere complementaridad completa entre las regiones de hibridación con el fin de formarse un dúplex; es sólo necesario que el número de bases emparejadas sea suficiente para mantener el dúplex bajo las condiciones de hibridación usadas. Es frecuentemente deseable tener una o más discrepancias entre la secuencia de la sonda y la del genoma del patógeno. Esto es necesario para evitar la formación de estructuras secundarias no deseadas dentro de la sonda. Por tanto en una realización preferida la secuencia única para el patógeno dentro de la sonda contiene al menos una discrepancia con la secuencia genómica del patógeno. Las condiciones de hibridación adecuadas son bien conocidas por el especialista en la técnica. Por ejemplo, 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 42º C (para condiciones de escasez moderadas); y 0,1 x SSC a 68º C. (para condiciones de alta escasez). Se puede llevar a cabo el lavado usando sólo una de las condiciones dadas, o se puede usar cada una de las condiciones (por ejemplo, lavado durante 10 a 15 minutos cada una en el orden listado anteriormente). Se puede repetir cualquiera o todos los lavados. Las condiciones óptimas variarán y se pueden determinar empíricamente por el especialista en la técnica.
El grado de identidad entre la sonda y el ácido nucleico del patógeno variará dependiendo de la función de la sonda. Por ejemplo, se puede usar la sonda para identificar la presencia de todas las subespecies del patógeno, por ejemplo, todos los genotipos de VPH, en cuyo caso la sonda tendrá una secuencia que se hibridará con una secuencia de una región del ácido nucleico que es altamente conservada entre todas las subespecies, tal como genotipos de VPH.
Se puede usar una sonda para detectar la presencia de patógenos, por ejemplo, genotipos de VPH, de un cierto grupo de riesgo, por ejemplo, genotipos de riesgo alto o riesgo bajo u otros. La secuencia de la sonda se diseñará de acuerdo con lo anterior. Por ejemplo se puede diseñar una sonda para detectar genotipos de alto riesgo que pueden unirse a tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y 73, pero no ácidos nucleicos de otros genotipos. Estos se denominan como “sondas de grupo de riesgo”.
De forma alternativa cada sonda puede tener una secuencia que presenta un alto nivel de similaridad con una región variable de un genotipo específico, de modo que se hibrida sólo con un ácido nucleico de ese genotipo. Tales sondas se denominan “específicas de genotipo”. Los miembros de las sondas específicas de tipo de virus del papiloma humano pueden hibridarse dentro de regiones específicas del genotipo definidas, preferiblemente aquellas que comprenden los nº ID SEC 53 a 103 en el ADN amplificado. Las sondas específicas del genotipo de VPH comprenden preferiblemente una secuencia seleccionada de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117. Estas secuencias forman todo o parte de la secuencia única con el patógeno.
El conjunto de sondas comprende al menos cuatro sondas, preferiblemente 5, 10, 15 ó 20 sondas diferentes. La sondas son diseñadas cuidadosamente de modo que la secuencia contenida con el “bucle” de la estructura de bucle troncal, no sólo se hibrida con la secuencia deseada en el ácido nucleico que se va a detectar, sino que no forma estructuras secundarias con secuencias en los bucles de otras sondas. Por tanto las secuencias para la parte del bucle de las sondas no son por lo general una secuencia que sea 100% complementaria con la secuencia en el genoma que se va a detectar. Preferiblemente las sondas específicas del tipo de virus del papiloma humano pueden hibridarse con regiones específicas de tipo definidas, preferiblemente aquellas que comprende nº ID SEC 53 a 103 o nº ID SEC 105 a 117. En una realización preferida cada una de las sondas comprende una secuencia seleccionada de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117. En una realización particularmente preferida el conjunto de sondas comprende: 5’TET-CGGCGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAGCCG-Dabcil-3’ 5’TET-CGGCGGGACATCCATATTACTCTATCAAAGCCG-Dabcil-3’ 5’TET-CGCGGGTCACCCTTATTACTCTATTACAAAACGCG-Dabcil-3’ 5’TET-CCGGCACCCATATTTCCCCCTTAAACCGG-Dabcil-3’ 5’TET-CCGGACGACCAGCAAACAAGACACCCGG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCCAATAACAAAATATTAGTTCCTAAAGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CCGGTATCCTGCTTATTGCCACCCCGG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCCATACCTAAATCTGACAATCCGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-GCCGTTTTTTAGCGTTAGTAGGATTTTTCGGC-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCAAAACAAGATTCTAATAAAATAGCAGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCTTAAAGTGGGTATGAATGGTTGGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CCGGGCTGTTCCTAAGGTATCCGCCGG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCAGCACGCGTTGAGGTTTTAGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CCGGAGTTTTAGTTCCCAAGGTGTCCCGG-Dabcil-3’ 5’FAM-CCCGCTGTGACTAAGGACAATACCAAACGGG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCTTCCATCAAAAGTCCCAATAACGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCAAAGGTGGTAATGGTAGACAGGGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCAATCTGGTACCAAAACAAACATCGCCG-Dabcil-3’ 5’FAM-CGGCTTAAGGTTCCTATGTCTGGGGGCCG-Dabcil-3’ y 5’(rojo Texas)-TTTTTT-(fluoresceína)-GGCTGACATAGATCCCCATAGACAGTTGCCG-Dabcil3’
La presencia de patógenos de un grupo de riesgo determinado se puede detectar de dos formas. En primer lugar se pueden usar sondas del “grupo de riesgo”. Preferiblemente el conjunto de sondas contiene más de un tipo de sonda del grupo de riesgo, en el que cada tipo está etiquetado de forma diferente. Por ejemplo, se puede distinguir una sonda del grupo de riesgo alto de una sonda de riesgo bajo. Por tanto se puede detectar la presencia de un patógeno, tal como VPH, de cualquier grupo de riesgo. De forma alternativa el conjunto de sondas puede comprender sondas específicas del genotipo, en las que todas las sondas para genotipos de un cierto grupo de riesgo, por ejemplo, genotipos de riesgo alto se etiquetan todas ellas con las mismas etiquetas de interacción. Por tanto, no se puede determinar la identidad de los genotipos específicos presentes, pero se puede confirmar la presencia de un genotipo de un cierto grupo.
En una realización preferida el procedimiento comprende además la determinación de la temperatura de fusión de la molécula de ácido nucleico de doble hebra formada por una de dichas sondas y ácido nucleico complementario obtenido de dicha muestra. Debido a que cada una de las sondas presenta una cierta secuencia de ácido nucleico, la temperatura de fusión de la molécula de ácido nucleico de doble hebra formada por las sondas y el ácido nucleico complementario obtenido de dicha muestra es única para cada sonda. Por tanto se puede detectar el patógeno o genotipo específico presente. Por ejemplo se puede usar un conjunto de sondas específicas del genotipo para un cierto grupo de riesgo para averiguar si cualquier genotipo de ese grupo está presente. La temperatura de fusión se puede determinar luego para identificar qué genotipos específicos están presentes.
El procedimiento de detección de tipos de VPH se puede llevar a cabo individualmente una vez se haya llevado a cabo el procedimiento para detectar familias, géneros o grupos o concurrencia del virus del papiloma humano con el procedimiento para detectar virus del papiloma humano.
Si se usa más de una sonda estas se pueden distinguir preferiblemente unas de otras, es decir, cada sonda emite una señal que se puede detectar de forma diferente cuando se excita a una cierta longitud de onda. Por tanto si se usan dos sondas una emitirá a una longitud de onda cuando se hibrida con ácido nucleico del patógeno que se puede distinguir de ambas sondas en solución (es decir, no se hibrida con el ácido nucleico del patógeno tal como el genotipo de VPH) y la otra sonda cuando se hibrida con el ácido nucleico del patógeno. Esto permite que la presencia de ambas sondas hibridadas con el ácido nucleico sea visualizada al mismo tiempo. De forma alternativa las dos sondas son etiquetadas con diferentes etiquetas de interacción, por ejemplo, donadores TERF, que se excitan a diferentes longitudes de onda. Esto puede conseguirse usando diferentes combinaciones de etiquetas de interacción, tales como donadores y aceptores TERF. La selección de combinaciones adecuadas de etiquetas de interacción es rutinaria para el especialista en la técnica.
El procedimiento detecta preferiblemente la presencia de cuatro o más patógenos o genotipos, usando cuatro o más sondas. Preferiblemente las sondas están unidas con una fase sólida tal que cada tipo de sonda está en una localización definida espacialmente que es distinguible de las localizaciones de la otra sonda. Esto permite que las sondas etiquetadas con las mismas o similares etiquetas de interacción que producen una señal en la mismo o similar longitudes de onda que se van a usar, mientras se proporciona un medio para distinguir la señal producida por cada sonda. De forma alternativa las sondas se pueden etiquetar de modo que se producen diferentes señales por cada tipo de sonda. El especialista en la técnica entenderá que son de uso común un intervalo de posibles soportes sólidos en la zona de las disposiciones y se puede usar cualquiera de estos “sustratos” en la producción de disposiciones de sondas de la presente invención.
En una realización preferida se proporciona un procedimiento para la construcción de una reacción para la detección dirigida a numerosas dianas de detección relacionadas usando al menos cuatro sondas de balizas moleculares a tiempo real en una reacción. El procedimiento incluye la selección de sitios de unión de sonda, que determinan la secuencia de sondas que satisfacen los criterios normalmente aplicados en sondas (por ejemplo, comprobación de las sondas contra un programa informático en Primer3 como completamente complementarias) y adición de bases, preferiblemente cuatro o cinco bases, con la secuencia de la sonda, en ambos extremos, haciendo que sean complementarias y capaces de formar troncos de doble hebra que implican exactamente los dos extremos de los mismos oligonucleótidos. Estas estructuras se denominan en general balizas moleculares de cuatro troncos. Adicionalmente el punto de fusión de la secuencia de sonda debería ser mayor que el punto de fusión de la estructura troncal, cuando se mide a tasas de calentamiento y enfriamiento próximas al equilibrio. Las cuatro balizas moleculares de base-tronco son generalmente ventajosas frente a otras longitudes de tronco que tienen tasas on-off más cortas que los troncos más largos, y presentan temperatura de fusión mayor que las balizas moleculares de tronco más cortas.
En general los miembros de las mezclas de sonda se hibridan con el producto de amplificación dentro de una cierta región de tipo específico definida. Las sondas se etiquetan de forma típica con un resto fluorescente donador en un extremo y en el otro extremo están etiquetadas típicamente con un resto fluorescente aceptor o desactivante correspondiente. En algunas realizaciones el resto fluorescente donador puede contener un complejo específico de tintes fluorescentes, que incluyen los denominados tintes cosechadores, para desplazar la longitud de onda de la emisión de la sonda para proporcionar una señal fluorescente única para la detección. El procedimiento incluye adicionalmente la detección de la presencia, ausencia o cambio en transferencia de energía por resonancia fluorescente (TERF) entre el resto fluorescente donador y el resto fluorescente aceptor o desactivante. La presencia de o cambio en TERF es indicativo de la presencia de virus del papiloma humano en la muestra biológica, mientras que la ausencia de TERF es indicativo de la ausencia de virus del papiloma humano en la muestra biológica.
En general, el ácido nucleico se hibrida con la sonda y se excita a una longitud de onda absorbida por el resto fluorescente donador. La presencia o ausencia de la sonda de unión se detecta visualizando y/o midiendo la longitud de onda emitida por el resto fluorescente aceptor
o desactivante. De forma alternativa se puede detectar mediante cuantificación el TERF.
En una realización preferida el ácido nucleico obtenido de una muestra se amplifica antes de ponerse en contacto con dicho conjunto de sondas. Preferiblemente la amplificación se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). La reacción de amplificación puede ser RCP (véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números
4.683.195 y 4.683.202, e Innis y col, editors, RCP Protocols, (Academic Press, Nueva York, 1989; Sambrook y col, Molecular Cloning, segunda edición, (Cold Spring Harbour Laboratory, Nueva York 1989)). Se podrá usar también RCP cuando se ha aislado y transformado ARN, preferiblemente mediante transcripción inversa, en ADNc. Preferiblemente se lleva a cabo la RCP usando Taq ADN polimerasa, por ejemplo Amplitaq™ (Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.). Se puede obtener también Taq polimerasa en MBI Fermentas, Perkin Elmer, Boehringer Mannheim and Beckman Instruments. Se puede usar también un ADN polimerasa equivalente, preferiblemente termoestable, en el procedimiento de la presente invención, tal como Tf1 (Thermus flavus) polimerasa (Gut y col, Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999)).
De forma alternativa la reacción de amplificación puede ser RCP de fase inversa (Yajima y col, Clin. Chem, 44(12): 2441-2445 (1998); Martell y col, J. Clin. Microbiol., 37(2): 327-332 (1999); Gut y col, Virol. Methods 77(1): 37-46 (1999); Predhomme y col, Leukemia, 13(6): 957-964 (1999)), en la que se transcribe inversamente ARN en ADNc que se somete a amplificación por RCP.
Como bien se sabe RCP implica la extracción y desnaturalización (preferiblemente con calor) de una muestra de ADN (o ARN). Se añade un exceso molar de cebadores de oligonucleótidos junto con una polimerasa que puede ser termoestable, y dNTPs para la formación de la secuencia amplificada. Los cebadores de oligonucleótidos se diseñan para hibridarse en extremos opuestos de la secuencia deseada para amplificación. En la primera ronda de amplificación, la polimerasa replica el ADN para producir dos “productos largos” que comienzan con los respectivos cebadores. El ADN total, que incluye los dos productos largos y las dos hebras originales, se desnaturaliza luego y se lleva a cabo una segunda ronda de polimerización (por ejemplo, reduciendo la temperatura). El resultado de la segunda ronda es las dos hebras originales, los dos productos largos de la primera ronda, dos nuevos productos largos (producidos de las hebras originales), y dos “productos cortos” producidos en los productos largos. Estos productos cortos tienen la secuencia de la secuencia diana (en sentido a en antisentido) con un cebador en cada extremo. Para cada ronda de amplificación adicional, el número de productos cortos crece exponencialmente, cada ronda produce dos productos largos adicionales y un número de productos cortos igual a la suma de los productos largos y cortos que quedan en el extremo de la ronda previa.
Se pueden sintetizar cebadores de oligonucleótidos mediante un número de enfoques, por ejemplo, Ozaki y col, Nuc. Acids Res. 20: 5205-5214 (1992); Agrawal y col, Nuc. Acids Res.
18: 5419-5423 (1990) o similar. De forma conveniente las sondas de oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador de ADN automatizado, por ejemplo, sintetizador de ADN/ARN modelo 392 o 394 de Applied Biosystems, Inc, Foster City, California, usando química convencional tal como química de la fosforamidita (Beaucage and Iyer, Tetrahedron 48: 22232311 (1992), patentes de Estados Unidos nº 4980460, 4725677, 4415732, 4458066 y 4973679). Se pueden usar también químicas alternativas, incluyendo grupos esqueleto no naturales tales como fosforotioato y fosforoamidato, procurando que las eficiencias de hibridación de los oligonucleótidos resultantes no se vean afectadas de forma adversa. La longitud exacta y secuencia de los cebadores de ADN dependerá del polinucleótido diana que se va a amplificar. Preferiblemente la longitud de los cebadores de ADN se encuentra en el intervalo de 10 a 60 nucleótidos y más preferiblemente en el intervalo de 15 a 30 ó 25 nucleótidos.
Preferiblemente la producción del ácido nucleico amplificado se controla de forma continua. Tal como se usa en esta invención “controlado de forma continua” significa que la cantidad de producto amplificado se mide en una base regular. Por ejemplo, se puede emprender una lectura tras el primer ciclo de amplificación, y después de esto tras cada uno, dos o cinco ciclos. De forma alternativa las medidas de la cantidad de producto amplificado presente se pueden tomar tras un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, cada uno, dos, cinco o diez segundos. Esto permite que el procedimiento sea controlado a “tiempo real”. El especialista en la técnica entendería que el nivel de señal producida con las sondas unidas fluctuará cuando los ciclos pasan a través de las diversas fases de hibridación, amplificación y desnaturalización.
Se pueden usar procedimientos de RCP convencionales junto con técnica TERF para poner en práctica los procedimientos de la invención. En una realización se usa un termociclador rápido tal como el instrumento LIGHTCYCLER™. Se puede encontrar una descripción detallada del sistema LIGHTCYCLER™ y control a tiempo real y en línea de RCP en el sitio web de Roche. Las siguientes solicitudes de patente describen RCP a tiempo real como se usan en la técnica LIGHTCYCLER™: documentos WO 97/46707, WO 97/46714 y WO 97/46712. El instrumento LIGHTCYCLER™ es un termociclador rápido combinado con un fluorímetro de microvolumen que usa ópticas de alta calidad. Esta técnica de termociclado usa cubetos de vidrio fino como recipientes de reacción. El calentamiento y enfriamiento de la cámara de reacción se controlan alternando aire calentado y a temperatura ambiente. Debido a la baja masa de aire y a la alta relación de área de superficie a volumen de los cubetos se pueden conseguir velocidades de intercambio de temperatura muy altas dentro de la cámara térmica. El instrumento permite controlar la RCP a tiempo real y en línea. Además los cubetos sirven como un elemento óptico para la recogida de señal (similar a las ópticas de fibra de vidrio), concentrando la señal en la punta del cubeto. El efecto es de iluminación eficiente y control fluorescente de muestras de microvolumen. El carrusel que aloja los cubetos se puede retirar del instrumento. Por tanto las muestras se pueden cargar fuera del instrumento (en una sala limpia para RCP, por ejemplo). Además esta característica permite que el carrusel de muestras sea limpiado y esterilizado fácilmente. El fluorímetro, como parte del aparato, aloja la fuente de luz. La luz emitida se filtra y focaliza con una lente de iluminación epi en la parte superior del cubeto. La luz fluorescente emitida desde la muestra se focaliza luego con las mismas lentes, pasa a través de un espejo dicroico, se filtra de forma apropiada y se focaliza en fotohíbridos de recogida de datos. La unidad óptica en el instrumento incluye preferiblemente tres filtros de paso de banda (530 nm, 640 nm, y 710 nm), procurando la detección de seis colores y diversas opciones de adquisición de fluorescencia. La presente invención, no obstante, no se ve limitada por la configuración de un instrumento comercialmente disponible. Las opciones de recogida de datos incluyen una vez por control de etapa de ciclado, adquisición de muestra simple completamente continua para análisis de curva de fusión, muestreo continuo (en el que la frecuencia de muestreo es función del número de muestra) y/o medida por etapas de todas las muestras tras intervalo de temperatura definido. El termociclador se hace funcionar preferiblemente usando una estación de trabajo PC y puede usar un sistema operativo Windows NT. Se obtienen secuencialmente señales de las muestras cuando la máquina posiciona las capilaridades sobre la unidad óptica. El software puede mostrar las señales de fluorescencia a tiempo real inmediatamente después de cada medida. El tiempo de adquisición de fluorescencia es de 10 a 100 mseg. Después de cada etapa de ciclado se puede actualizar de forma continua una visualización cuantitativa de fluorescencia vs número de ciclo para todas las muestras. Los datos generados se pueden conservar para análisis posterior.
En una realización preferida el ácido nucleico se amplifica usando al menos un cebador seleccionado de nº ID SEC 1 a 32, más preferiblemente usando una mezcla de cebador que comprende nº ID SEC 1 a 32.
En una realización preferida el procedimiento usa un ADN de control interno artificial o natural, preferiblemente por señal de detección o emisión de TERF a una longitud de onda diferente o distinguible o independientemente de las longitudes de onda de emisión usadas detectando, los cambios de emisión en una localización espacialmente distinguible de sondas unidas a fases sólidas.
Los procedimientos descritos anteriormente pueden incluir adicionalmente la prevención de la amplificación de ácidos nucleicos contaminantes de reacciones de amplificación previas. La prevención de tal amplificación no deseada puede incluir realizar la etapa de amplificación en presencia de uracilo y tratamiento de la muestra biológica con uracil-ADN glicosilasa antes de una primera etapa de amplificación. Además la etapa de ciclado se puede llevar a cabo en una muestra de control por separado para confirmar las condiciones de amplificación apropiadas. Una muestra de control puede incluir una porción de la molécula de ácido nucleico del virus del papiloma humano. De forma alternativa tal muestra de control se puede amplificar usando un par de cebadores de control e hibridarse usando un par de sondas de control. Se produce un producto de amplificación de control si el templado de control está presente en la muestra, y las sondas de control se hibridan con el producto de amplificación de control.
Los procedimientos de la presente invención se llevan cabo en ácidos nucleicos obtenidos de una muestra biológica. Muestras biológicas representativas incluyen raspadura, biopsia, secciones de tejido en tinte o parafina de cuello uterino, otras raspaduras de sitios anatómicos donde la infección por virus del papiloma humano tenga lugar y orina. Preferiblemente la muestra se selecciona de muestras citológicas, raspaduras o biopsias de aspiratos bronquiales, orina, músculo masetero de la próstata, eyáculo, sangre y cuello uterino, vulva, ano, genitales, piel o laringe.
En un segundo aspecto la presente invención proporciona un conjunto de sondas que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flaqueada por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico de un patógeno, en el que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta de interacción y una segunda etiqueta de interacción tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.
Las realizaciones preferidas del primer aspecto relativo a las sondas aplican al segundo aspecto.
Como se describe anteriormente, las secuencias que forman la parte del “bucle” de la sonda se seleccionan de modo que no sólo se hibridan con la secuencia deseada en el organismo diana, sino que tampoco forman estructuras secundarias con las regiones bucle de otras sondas. Así pues en el tercer aspecto la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende una cualquiera de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105-117. Se pueden usar estas secuencias de ácido nucleico en otros procedimientos para detectar la presencia de uno o más genotipos de VPH. Por tanto la presente invención también proporciona el uso de un ácido nucleico de la invención para la detección de la presencia o ausencia de al menos un genotipo de VPH. Preferiblemente el ácido nucleico se usa en un procedimiento que controla continuamente la amplificación de ácido nucleico obtenido de una muestra.
Tales procedimientos incluyen técnica TAQMAN™, el uso de las secuencias como parte de un Scorpion molecular y otros procedimientos basados en RCP.
La técnica TAQMAN™ detecta la presencia o ausencia de un producto de amplificación y de ahí la presencia o ausencia de virus del papiloma humano. La técnica TAQMAN™ usa una sonda de hibridación de hebra simple etiquetada con dos restos fluorescentes. Cuando se excita un primer resto fluorescente con luz de una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se transfiere a un segundo resto fluorescente de acuerdo con los principios de PRET. El segundo resto fluorescente es en general una molécula desactivante. Durante la etapa de hibridación de la reacción RCP, la sonda de hibridación etiquetada se une al ADN diana y se degrada con la actividad de exonucleasa en 5’ a 3’ de la Taq polimerasa durante la fase de elongación subsiguiente. Como resultado el resto fluorescente excitado y el segundo resto fluorescente comienzan a separarse espacialmente uno del otro. Como consecuencia tras excitación del primer resto fluorescente en ausencia del segundo resto fluorescente, la emisión de fluorescencia del primer resto fluorescente se ve alterado de forma detectable. Por ejemplo si el segundo resto fluorescente en un desactivante, la emisión fluorescente del primer resto fluorescente aumenta y así se puede detectar. A modo de ejemplo un sistema de detección de secuencia ABI PRISM™ 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) usa técnica TAQMAN™, y es adecuado para llevar cabo los procedimientos de detección del virus de papiloma humano. Se puede encontrar información sobre amplificación y detección por RCP usando un sistema ABI PRISM™ 7700 en el sitio web de Applied Biosystem.
En un sexto aspecto la presente invención proporciona un procedimiento de identificación de un conjunto mínimo de cebadores que amplifican secuencias de ácidos nucleicos de dos o más organismos relacionados que comprende:
- (a)
- identificación de los sitios de unión del cebador que tienen al menos 30% de identidad entre dichos organismos;
- (b)
- diseño de un conjunto de cebadores capaz de iniciar la amplificación en los sitios del cebador identificados en (a), en la que cada uno de dichos cebadores tiene no más de 3 discrepancias con un sitio de unión del cebador en al menos uno de
dichos organismos y en el que cada uno de dichos cebadores difiere de cada
uno de dichos cebadores en 4 o menos nucleótidos;
- (c)
- determinación del menor número de cebadores requeridos para detectar el mayor número posible de dichos organismos;
- (d)
- determinación de la cantidad relativa de cada cebador requerida en dicho conjunto de cebador para asegurar igual amplificación de las secuencias ácido nucleico de todos los organismos citados.
Tal como se usa en el presente documento, “organismos relacionados se refiere a organismos que son de la misma clase, género o especie, y que tienen un alto nivel de similaridad genética, preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad. Los organismos relacionados son preferiblemente virus, más preferiblemente virus del papiloma humano. Los cebadores amplifican preferiblemente la región L1 del virus del papiloma humano.
El porcentaje de identidad de dos secuencias de ácido nucleico viene determinada por el alineamiento de las secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en la primera secuencia para mejor alineamiento con la secuencia) y comparar los nucleótidos en posiciones correspondientes. El “mejor alineamiento” es un alineamiento de dos secuencias que da lugar a la mayor identidad en porcentaje. La identidad en porcentaje viene determinada por el número de nucleótidos idénticos en las secuencias que se comparan (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas / número total de posiciones x 100).
La determinación de la identidad en porcentaje entre dos secuencias se puede llevar a cabo usando un algoritmo matemático conocido por los especialistas en la técnica. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparación de dos secuencias en el algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como en Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y col. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 han incorporado un algoritmo de este tipo. Se pueden realizar búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, valoración = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas con moléculas de ácido nucleico de la invención. Para obtener alineamientos con huecos para fines comparativos se pueden usar BLAST ahuecados como se describe en Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. De forma alternativa se puede usar PSI-Blast para llevar a cabo una búsqueda iterativa que detecta interrelaciones entre moléculas (Id.). Cuando se usa BLAST, BLAST ahuecado y programas PSI-Blast, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Otro ejemplo de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). El programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencia CGC ha incorporado un algoritmo de este tipo. Otros algoritmos para análisis de secuencia conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en Torellis y Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5; y FASTA descrito en Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda.
Un conjunto mínimo de cebadores es un conjunto de cebadores que contiene el menor número de cebadores requeridos para amplificar secuencias de ácido nucleico de tantos organismos relacionados como sea necesario. El conjunto de cebadores puede contener opcionalmente un cebador de corrección que se usa para controlar diferencias de cebado entre los cebadores en un sitio de unión del cebador determinado. Los cebadores de corrección no deberían tener más de tres discrepancias con el sitio de unión del cebador donde son designados para actuar. La adición de cebadores de corrección ayuda a producir un nivel de sensibilidad en la detección que es al menos dos órdenes de magnitud o más para todos los organismos que se pretende detectar, por ejemplo, todos los virus del papiloma humano.
Tal como se usa en el presente documento “discrepancia” se refiere a cuando una base en un cebador no forma una par de bases de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick con una base correspondiente en el sitio de unión del cebador. Se forma una discrepancia cuando las dos bases correspondientes no son acordes a los criterios de Watson-Crick por ejemplo, C-T, G-A. Las discrepancias se encuentran preferiblemente en la mitad del cebador más cercana al extremo 5’, más preferiblemente forma los 3 nucleótidos antes del extremo 5’ del cebador. Cada uno de los cebadores en el primer conjunto sólo difiere de cada uno de los otros cebadores en el conjunto de cuatro o menos nucleótidos. Por tanto si los cebadores son todos de 15 nucleótidos de longitud entonces 11 nucleótidos en un cebador son idénticos a 11 nucleótidos en cada uno de los otros cebadores. Los nucleótidos idénticos son preferiblemente no continuos.
En una realización preferida se proporciona un procedimiento para construir una reacción múltiple muy compleja para amplificación del virus del papiloma humano. El procedimiento incluye la selección de sitios de unión del cebador conservados (menos del 70% de variabilidad) en una proximidad apropiada. Los sitios de unión del cebador deberían localizarse a una distancia uno del otro que asegure que se genere un amplicón del tamaño apropiado. Preferiblemente se genera un amplicón de 30 a 160 nucleótidos de longitud, más preferiblemente 40-120, 50-100, 60-90 ó 70-80 nucleótidos de longitud. Son particularmente preferidos amplicones entre 130 y 160 nucleótidos de longitud. Los cebadores forman parte del amplicón generado. Los cebadores son preferiblemente de 10-30 nucleótidos de longitud, más preferiblemente 12-25, 15-22 ó 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos de longitud. Se determina luego la secuencia de un conjunto completo de cebadores cuando los cebadores satisfacen los criterios aplicados normalmente para cebadores (por ejemplo, comprobación de los cebadores frente a un programa informático a complementaridad total como Primer3), y se designan el menor número posible de cebadores que tengan sólo tres discrepancias, preferiblemente en un extremo del cebador, más preferiblemente el extremo 5’, para todos los organismos relacionados, tal como tipos de virus del papiloma humano, que se pretende amplificar. Adicionalmente los cebadores deberían unirse en un número casi igual de tipos con no más de tres discrepancias. Se controlan más diferencias de amplificación cambiando la concentración relativa de los cebadores. La sensibilidad de detección resultante se encuentra preferiblemente dentro de al menos dos magnitudes para todos los organismos relacionados, tal como los tipos del virus de papiloma humano, que se pretenden detectar.
Esto es un logro significativo frente a las técnicas de la técnica anterior, donde se siguen adición secuencial de los cebadores y procedimientos de ensayo y error. El procedimiento revelado mantiene la competición en un mínimo. Hay eficiencias de cebado corregidas frente a todas las dianas, dando lugar a sensibilidades de amplificación igualmente altas. Además la probabilidad de error de cebado se reduce manteniendo los cebadores preferiblemente variables en el extremo 5’ de los mismos.
La mezcla de cebadores es capaz de amplificar al menos una región de tipo L1 del virus de papiloma humano, que comprende preferiblemente nº ID SEC 53 a 103. Esta incluye preferiblemente al menos un cebador delantero del grupo de nº ID SEC 1 a 16 y al menos un cebador inverso del grupo nº ID SEC 17 a 32.
En un séptimo aspecto la presente invención proporciona un conjunto de cebadores obtenibles mediante el procedimiento del sexto aspecto que comprende al menos un cebador seleccionado de nº ID SEC 1 a 32. Preferiblemente comprende al menos un cebador delantero del grupo nº ID SEC 1 a 16 y al menos un cebador inverso del grupo nº ID SEC 17 a 32. Más preferiblemente comprende nº ID SEC 1 a 32.
En un aspecto adicional la presente invención proporciona un kit para la detección de uno o más patógenos que comprende un conjunto de sondas como se definen en el segundo aspecto. El kit comprende además preferiblemente un conjunto de cebadores identificados de acuerdo con el procedimiento del sexto aspecto.
Además la invención proporciona un kit para la detección de uno o más patógenos que comprende un conjunto de cebadores identificados de acuerdo con el procedimiento del sexto aspecto.
Preferiblemente los kits se pueden usar para detectar uno o más organismos asociados con una enfermedad de transmisión sexual, preferiblemente genotipos de VPH. Preferiblemente las sondas comprenden una secuencia seleccionada de nº ID SEC 17-33. El conjunto de cebadores comprende preferiblemente al menos una secuencia seleccionada de nº ID SEC 1 a 32, más preferiblemente al menos una seleccionada de nº ID SEC 1 a 16 y al menos una seleccionada de ID SEC 17-32. Los más preferiblemente la mezcla de cebador comprende los cebadores de nº ID SEC 1-32.
Preferiblemente los kits comprenden adicionalmente un control interno.
El kit también puede incluir una etiqueta de paquete o inserción en paquete que de instrucciones sobre el mismo para uso de la(s) mezcla(s) de cebadores y par(es) de sondas para detectar la presencia o ausencia del virus del papiloma humano en una muestra biológica.
Los kits pueden comprender además otros componentes, tales como reactivos requeridos para RCP. Estos reactivos incluyen tampones, un ADN polimerasa adecuado, y dNTP tales como dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Los componentes del kit se pueden presentar en un número de viales u otros recipientes. Los reactivos se pueden liofilizar para reconstitución posterior antes del uso. De forma alternativa los componentes se pueden proporcionar en soluciones tamponadas adecuadas listas para uso. Tales soluciones pueden contener conservantes adecuados.
A menos que se defina de otra forma todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que habitualmente se entiende por parte de un especialista en la técnica a la que pertenece esta invención.
La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de los dibujos y descripción detallada y de las reivindicaciones. Ejemplo 1 Detección por RCP a tiempo real de ADN de VPH de alto riesgo y bajo riesgo
El volumen de reacción total fue de 20 µI, incluyendo los siguientes componentes: 2 µI (aprox. 0,2 pg) de ADN de VPH clonado, 18 µI de tampón de polimerasa (concentración final: TRIS-HCl 90 mM (pH=8,0), DTT 1mM, KCl 50 mM, MgCl2 7 mM, Tween-20 al 1% (SIGMA), Ficoll al 1%, PVP al 1%, 250 µM de cada uno de los dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega), 0,28 µM de cada uno de los cebadores: nº ID SEC: 1-32, 0,18 µM de cada una de las balizas moleculares nº ID SEC: 33-52, y 7,5 U de AmpliTaq Gold ADN polimerasa (ROCHE)). Se llevó a cabo la reacción en ciclador término para RCP 2.0, con los siguientes parámetros:
Etapa 1: 10 minutos a 95º C;
Etapa 2: 5 minutos a 55º C;
Etapa 3: ciclos 1-37: 30 segundos a 95º C, 60 segundos a 42º C – modo de detección simple, y 30 segundos a 72º C;
Los genotipos de VPH de alto riesgo se detectaron mediante balizas moleculares nº ID SEC: 38-51. Se recogieron los datos de fluorescencia a 530 nm.
Los genotipos de VPH de bajo riesgo se detectaron mediante balizas moleculares nº ID SEC: 33-37. Se recogieron los datos de fluorescencia a 560 nm.
Se detectó el control interno de reacción mediante baliza molecular nº ID SEC 52. Se recogieron los datos de fluorescencia a 610 nm.
Se detectaron exitosamente los siguientes genotipos: bajo riesgo (6, 11, 42, 43, 44/55), alto riesgo (16, 18, 31, 33 ,35, 39, 45, 51 ,52, 56, 58, 59, 66, 68) y control interno. Ejemplo 2 Detección por RCP a tiempo real de ADN de VPH16, VPH18 y VPH6, VPH11 VPH
El volumen de reacción total fue de 20 µI, incluyendo los siguientes componentes: 2 µI (aprox. 0,2 pg) de ADN de VPH clonado, 18 µI de tampón de polimerasa (concentración final: TRIS-HCl 90 mM (pH=8,0), DTT 1 mM, KCl 50 mM, MgCl2 7 mM, Tween-20 al 1% (SIGMA), Ficoll al 1%, PVP al 1%, 250 µM de cada uno de los dNTP (ATP, CTP, GTP, TTP) (Promega), 0,28 µM de cada uno de los cebadores: nº ID SEC: 1-32, 0,18 µM de cada una de las balizas moleculares nº ID SEC: 33, 34, 38, 39, 52 y 7,5 U de AmpliTaq Gold ADN polimerasa (ROCHE)). Se llevó a cabo la reacción en ciclador término para RCP 2.0, con los siguientes parámetros:
Etapa 1: 10 minutos a 95º C;
Etapa 2: 5 minutos a 55º C;
Etapa 3: ciclos 1-37: 30 segundos a 95º C, 60 segundos a 42º C – modo de detección simple, y 30 segundos a 72º C;
Los genotipos de VPH16 y VPH18 se detectaron mediante balizas moleculares nº ID SEC: 38-39. Se recogieron los datos de fluorescencia a 530 nm.
Los genotipos de VPH6 y VPH11 se detectaron mediante balizas moleculares nº ID SEC: 33-34. Se recogieron los datos de fluorescencia a 560 nm.
Se detectó el control interno de reacción mediante baliza molecular nº ID SEC 52. Se recogieron los datos de fluorescencia a 610 nm.
Se detectaron exitosamente los siguientes genotipos: bajo riesgo (6, 11), alto riesgo (16, 18) y control interno. Apéndice 1 Cebadores delanteros:
Cebadores inversos:
Secuencias de sonda:
Nº ID SEC: 56 10 >VPH11
Nº ID SEC: 57 >VPH13
Nº ID SEC: 58 >HPV16
Nº ID SEC: 59 >VPH18
Nº ID SEC: 60 >VPH26
Nº ID SEC: 61 >VPH27
Nº ID SEC: 62 >VPH28
Nº ID SEC: 63 >VPH29
Nº ID SEC: 64 >VPH30
Nº ID SEC: 65 >VPH31
Nº ID SEC: 66 >VPH33
Nº ID SEC: 67 >VPH34
Nº ID SEC: 68 >VPH35
Nº ID SEC: 69
Nº ID SEC: 70 >VPH40
Nº ID SEC: 71 15 >VPH42
Nº ID SEC: 72 >VPH43
Nº ID SEC: 74
Nº ID SEC: 75 >VPH51
Nº ID SEC: 76 >VPH52
Nº ID SEC: 77 >VPH53
10 Nº ID SEC: 78
>VPH54
Nº ID SEC: 79
Nº ID SEC: 80 >VPH56
Nº ID SEC: 82 >VPH58
Nº ID SEC: 83 25 >VPH59
Nº ID SEC: 84 >VPH61
Nº ID SEC: 85 >VPH62
Nº ID SEC: 86
Nº ID SEC: 87 >VPH67
Nº ID SEC: 88 15 >VPH68
Nº ID SEC: 89 >VPH69
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Nº ID SEC: 93 >VPH74
Nº ID SEC: 94
Nº ID SEC: 95 >VPH82
Nº ID SEC: 96 15 >VPH83
Nº ID SEC: 97 >VPH84
Nº ID SEC: 99 >VPH86
Nº ID SEC: 100 >VPH87
Nº ID SEC: 101 >VPH89
Nº ID SEC: 102
Nº ID SEC: 103 >VPH91
Nº ID SEC: 104 15 VPH-IC
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> kit Genoid Jeney, Csaba Hart, Deborah M Takacs, Tibor
<120> Procedimiento
<130> P38434WO
<150> US 60/737006
<151> 2005-11-15
<150> GB 0523250.9
<151> 2005-11-15
<160> 117
<170> Patentin versión 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
<400> 1
<210> 2
<211> 20
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<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> Cebador
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<213> Artificial
<220>
<223> Cebador
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<211> 21
<212> ADN
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<220>
<223> Sonda
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<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<211> 25
<212> ADN
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<220>
<223> Sonda
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<220>
<223> Sonda
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<220>
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<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 48
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<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 49
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<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
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<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 51
- 10
- <210> 52
- <211> 24
- <212> ADN
- <213> Artificial
- 15
- <220>
- <223> Sonda
<210> 53
<211> 135
<212> ADN 25 <213> VPH2a
<400> 53
<211> 138
<212> ADN
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5 <210> 55
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<212> ADN
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10 <400> 55
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<211> 132 15 <212> ADN
<213> VPH11
<400> 56
- 20
- <210> 57
- <211> 132
- <212> ADN
- <213> VPH13
- 25
- <400> 57
<210> 58
<211> 138
<212> ADN
<213> VPH16
<400> 58
- 10
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- <211> 138
- <212> ADN
- <213> VPH18
- 15
- <400> 59
- <210>
- 60 20 <211> 135
<212> ADN
<213> VPH26
<210> 61
<211> 138
<212> ADN
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<400> 61
- <210>
- 62 10 <211> 138
<212> ADN
<213> VPH28
<210> 63
<211> 138
- <212>
- ADN 20 <213> VPH29
<400> 63
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<211> 138
<212> ADN
<213> VPH30
<210> 65
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- <212>
- ADN 10 <213> VPH31
<400> 65
15 <210> 66
<211> 140
<212> ADN
<213> VPH33
20 <400> 66
<210> 67
<211> 141 25 <212> ADN
<213> VPH34
<400> 67
<210> 68
<211> 137
<212> ADN
<213> VPH35
<400> 68
- 10
- <210> 69
- <211> 138
- <212> ADN
- <213> VPH39
- 15
- <400> 69
- <210>
- 70 20 <211> 135
<212> ADN
<213> VPH40
<210> 71
<211> 135
<212> ADN
<213> VPH42
<400> 71
- <210>
- 72 10 <211> 135
<212> ADN
<213> VPH43
<210> 73
<211> 132
<212> ADN 20 <213> VPH44
<400> 73
25 <210> 74
<211> 141
<212> ADN
<213> VPH45
<400> 74
<210> 75
5 <211> 135
<212> ADN
<213> VPH51
<400> 75
10
<210> 76
<211> 147 15 <212> ADN
<213> VPH52
<400> 76
- 20
- <210> 77
- <211> 132
- <212> ADN
- <213> VPH53
- 25
- <400> 77
<210> 78
<211> 135
<212> ADN
<213> VPH54
<400> 78
10 <210> 79
<211> 132
<212> ADN
<213> VPH55
15 <400> 79
- <210>
- 80 20 <211> 135
<212> ADN
<213> VPH56
<210> 81
<211> 138
<212> ADN
<213> VPH57
<400> 81
- <210>
- 83 15 <211> 138
- 5
- <210> 82
- <211> 141
- <212> ADN
- <213> VPH58
- 10
- <400> 82
<212> ADN
<213> VPH59
<210> 84
<211> 144 25 <212> ADN
<213> VPH61
<400> 84
<210> 85
<211> 138
<212> ADN
<213> VPH62
<400> 85
- 10
- <210> 86
- <211> 135
- <212> ADN
- <213> VPH66
- 15
- <400> 86
- <210>
- 87 20 <211> 141
<212> ADN
<213> VPH67
<400> 87
<210> 88
<211> 138
<212> ADN
<213> VPH68
<400> 88
- <210>
- 90 20 <211> 138
<212> ADN
<213> VPH70
<210> 91
<211> 141
<212> ADN
<213> VPH72
<400> 91
- <210>
- 92 10 <211> 138
25
- 10
- <210> 89
- <211> 134
- <212> ADN
- <213> VPH69
- 15
- <400> 89
<212> ADN
<213> VPH73
<210> 93
<211> 132
<212> ADN 20 <213> VPH74
<400> 93
25 <210> 94
<211> 141
<212> ADN
<213> VPH81
<400> 94
<210> 95
<211> 135
<212> ADN
<213> VPH82
<400> 95
- 10
- <210> 96
- <211> 141
- <212> ADN
- <213> VPH83
- 15
- <400> 96
- <210>
- 97 20 <211> 150
<212> ADN
<213> VPH84
<210> 98
<211> 138
<212> ADN
<213> VPH85
<400> 98
- <210>
- 99 10 <211> 153
<212> ADN
<213> VPH86
<210> 100
<211> 147
<212> ADN 20 <213> VPH87
<400> 100
25 <210> 101
<211> 141
<212> ADN
<213> VPH89
<400> 101
<210> 102
<211> 141
<212> ADN
<213> VPH90
<210> 103
<211> 135
<212> ADN 15 <213> VPH91
<400> 103
<211> 140
<212> ADN
<213> VPH-IC
<210> 105
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 105
<210> 106
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 106
<210> 107
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<210> 108
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 108
<210> 109
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<210> 110
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 110
<210> 111
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<210> 112
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 112
<210> 113
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 113
<210> 114
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 114 <210> 115
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<210> 116
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 116
<210> 117
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sonda
<400> 117
Claims (49)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento de detección de la presencia de al menos un patógeno que comprende poner en contacto un ácido nucleico obtenido de una muestra con un conjunto que comprende al menos cuatro sondas en las que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueada por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico del patógeno, en la que dicha sonda está etiquetada con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.
-
- 2.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, en el que dicha primera etiqueta que interacciona y dicha segunda etiqueta que interacciona son un donador TERF y aceptor TERF.
-
- 3.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 2, en el que dicho aceptor TERF es un desactivante.
-
- 4.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno está conectada con dicho(s) par(es) de bases complementarias en cualquier extremo mediante secuencias de unión.
-
- 5.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos pares de bases complementarias comprenden pares C-G.
-
- 6.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 5, en el que dicha sonda comprende la secuencia
-
- 7.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la secuencia única para el patógeno dentro de la sonda contiene al menos una discrepancia con la secuencia genómica del patógeno.
-
- 8.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada una de dichas sondas se puede distinguir de una de las otras citadas sondas.
-
- 9.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que cada una de dichas sondas está unida a un sustrato sólido en una localización definida.
-
- 10.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos 10, al menos 15 o al menos 20 sondas.
-
- 11.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho procedimiento comprende además la determinación de la temperatura de fusión de la molécula de ácido nucleico de doble hebra formada por una de dichas sondas y ácido nucleico complementario obtenido de dicha muestra.
-
- 12.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho ácido nucleico obtenido de una muestra se amplifica antes de ponerse en contacto con dicho conjunto de sondas.
-
- 13.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 12, en el que dicha amplificación se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa (RCP).
-
- 14.
- El procedimiento de la reivindicación 12 o reivindicación 13, en el que la producción de ácido nucleico amplificado es controla de forma continua.
-
- 15.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho ácido nucleico amplificado se pone en contacto con dicho conjunto de sondas después de un ciclo de amplificación.
-
- 16.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicho ácido nucleico amplificado se pone en contacto con dicho conjunto de sondas después de cada ciclo de amplificación.
-
- 17.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicha amplificación se lleva a cabo en presencia de dicho conjunto de sondas.
-
- 18.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, en el que dicho procedimiento comprende además la amplificación de un control interno.
-
- 19.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18, en el que se evita la amplificación del ácido nucleico contaminante.
-
- 20.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 19, en la que dicha amplificación de ácido nucleico contaminante se evita llevando a cabo la amplificación en presencia de uracilo.
-
- 21.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 20 que comprende además el tratamiento de dicho ácido nucleico con uracil-ADN glicosilasa antes de las amplificación.
-
- 22.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que dicha muestra se selecciona de aspirados bronquiales, orina, músculo masetero de próstata, eyáculo, sangre y muestras citológicas, raspaduras o biopsias de cuello uterino, vulva, ano, genitales, piel o laringe.
-
- 23.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para la detección de un organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.
-
- 24.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23 para la detección de la presencia de al menos un genotipo de VPH.
-
- 25.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 24 para la detección de genotipos de VPH de alto riesgo o bajo riesgo.
-
- 26.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 24 o reivindicación 25, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos una sonda que comprende al menos una de las secuencias seleccionadas de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 177.
-
- 27.
- El procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que dicho ácido nucleico obtenido de dicha sonda se amplifica usando al menos un cebador seleccionado de nº ID SEC 1 a 32.
-
- 28.
- El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 27, en el que el ácido nucleico obtenido de dicha muestra se amplifica usando una mezcla de cebador que comprende nº ID SEC 1 a 32.
-
- 29.
- Un conjunto de sondas que comprende al menos cuatro sondas, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno flanqueado por cuatro partes de bases complementarias, en las que dichas bases forman una estructura troncal en ausencia de hibridación con un ácido nucleico de patógeno, en el que dicha sonda se etiqueta con una primera etiqueta que interacciona y una segunda etiqueta que interacciona tal que la hibridación de dicha sonda con un ácido nucleico de dicho patógeno provoca un cambio en la señal detectada.
-
- 30.
- El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 29, en el que dicha primera etiqueta que interacciona y dicha segunda etiqueta que interacciona son un donador TERF y aceptor TERF.
-
- 31.
- El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 30, en la que dicho aceptor TERF es un desactivante.
-
- 32.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, en el que dicha secuencia complementaria con una secuencia de un patógeno está unida a dicho(s) par(es) de bases complementarias en cualquier extremo mediante secuencias de unión.
-
- 33.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32, en las que dichos pares de bases complementarias comprenden pares C-G.
-
- 34.
- El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 33, en el que cada una de dichas sondas comprende la secuencia
secuencia 3’-CGCG-F única para patógeno F’-CGCG-5’, en la que F y F’ son secuencias de unión opcionales. -
- 35.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, en el que la secuencia única para el patógeno dentro de la sonda contiene al menos una discrepancia con la secuencia genómica del patógeno.
-
- 36.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35, en el que cada una de dichas sondas se puede distinguir de cada una de las otras citadas sondas.
-
- 37.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36, en el que cada una de dichas sondas está unida a un soporte sólido en una localización definida.
-
- 38.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 37, en el que dicho patógeno es un organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.
-
- 39.
- El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 38, en el que dicho organismo es un virus.
-
- 40.
- El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 39, en el que dicho virus es virus del papiloma humano.
-
- 41.
- El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 40, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH.
-
- 42.
- El conjunto de sondas como se reivindica en la reivindicación 41, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH de alto riesgo.
-
- 43.
- El conjunto de sondas como se reivindican en la reivindicación 41, en el que cada una de dichas sondas comprende una secuencia que es complementaria con un genotipo de VPH de bajo riesgo.
-
- 44.
- El conjunto de sondas como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en el que dicho conjunto de sondas comprende al menos una sonda que comprende al menos una de las secuencias seleccionadas de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117.
secuencia 3’-CGCG-F única para patógeno F’-CGCG-5’ en la que F y F’ son secuencias de unión opcionales.5 45. El conjunto de sondas de la reivindicación 44, en el que cada sonda de dicho conjunto de sondas comprende una secuencia selecciona de nº ID SEC 33 a 52 o nº ID SEC 105 a 117. -
- 46.
- El conjunto de sondas de la reivindicación 44 o reivindicación 45, en el que cada sonda de dicho conjunto de sondas comprende una secuencia seleccionada de nº ID SEC 33 a 52.
-
- 47.
- Un kit para la detección de uno o más patógenos que comprenden un conjunto de sondas como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 46.
10 - 48. Un kit como se reivindica en la reivindicación 47, en el que dicho patógeno es un 15 organismo asociado con una enfermedad de transmisión sexual.
- 49. Un kit para la detección de uno o más genotipos de VPH que comprende un conjunto de sondas como se reivindican en una cualquiera de las reivindicaciones 29 a 46.20 50. El kit como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49 que comprende además un control interno.
- 51. El procedimiento de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la etapa decalentar a aproximadamente 55º C durante aproximadamente 5 minutos antes de la 25 amplificación.
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