ES2348975T3 - Composicion de péptido inmunógeno para la prevencion y tratamiento de la enfermedad de alzehimer. - Google Patents
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Abstract
Un péptido inmunógeno representado por una de las siguientes fórmulas: en donde cada A es independientemente un aminoácido; (A)n-(fragmento N-terminal del péptido Aß1-42)-(B)o-(Th)m-X ó (A)n-(Th)m-(B)o-(fragmento N-terminal del péptido Aß1-42)-X; Th es el epítope de la célula T de SEC ID NO: 1; el fragmento N-terminal del péptido Aß1-42 es el péptido de SEC ID NO: 67; cada B es un grupo de enlace seleccionado del grupo que consiste de gly-gly, (alfa, épsilon-N)Lys, Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa- Pro; X es un alfa-COOH o alfa-CONH2 de un aminoácido; n es desde 0 a aproximadamente 10; m es desde 1 a aproximadamente 4 y o es desde 0 a aproximadamente 10.
Description
Composición de péptido inmunógeno para la
prevención y tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se refiere a una
composición que comprende un péptido inmunógeno útil para la
prevención y tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. Más
particularmente, el péptido inmunógeno comprende un sitio de
regulación/funcional, un fragmento N-terminal del
péptido Amiloide \beta (A\beta) unido a un epítope de la célula
T del auxiliar (Th) teniendo múltiples sitios de enlace MHC de clase
II. El péptido inmunógeno produce una respuesta inmune en sitio
dirigida en contra del sitio regulador/funcional principal del
péptido A\beta y genera anticuerpos, que son altamente reactivos
en forma cruzada para el péptido A\beta_{1-42}
soluble y las placas amiloides formadas en el cerebro de los
pacientes con Enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos producidos
siendo reactivos en forma cruzada al péptido
A\beta_{1-42} soluble, promueven la disgregación
fibril e inhiben la agregación fibrilar que conduce a la
inmunoneutralización de las toxinas derivadas del A\beta
soluble'' y siendo reactivos en forma cruzada a las placas
amiloides, aceleran el despeje de estas placas del cerebro. Además,
la composición de la invención que comprende el péptido inmunógeno
es útil para la prevención y el tratamiento de la Enfermedad de
Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una
enfermedad neurodegenerativa crónica caracterizada por una pérdida
de la habilidad cognoscitiva y severas anormalidades del
comportamiento en un paciente que conduce a la muerte eventual del
paciente. Existen actualmente 2.5 a 4.0 millones de pacientes con EA
en los Estados Unidos y 17 a 25 millones en todo el mundo. Es la
cuarta causa que conduce a la muerte en las culturas occidentales,
precedida solamente por enfermedades coronarias, cáncer y apoplejía.
El ARICEPT®, in inhibidor de la acetilcolinestereasa se ha aprobado
por la FDA para la desacelerar la proporción del decline en
pacientes con Alzheimer. Sin embargo, es solamente efectivo por un
periodo de tiempo limitado y en algunos pacientes. Hasta la fecha no
es un tratamiento definitivo o cura para esta enfermedad
devastadora.
Dos depósitos microscópicos, es decir ovillos
neurofibrilares (ONF) y placas amiloides seniles, se identificaron
por Alois Alzheimer como sellos distintivos de la enfermedad. Los
ovillos neurofibrilares consisten de dos filamentos de 10 nm de
ancho entrelazados alrededor uno del otro, referidos como filamentos
helicoidales en par (FHP), un componente principal de loas cuales
es el tau fosforilado. La fosforilación de serina en el aminoácido
262 de la proteína tau representa una etapa crucial que conduce a la
disfunción fisiológica de tau. Los FHP son intracelulares y se
encuentran en la mayoría de los procesos axonales y dendríticos
anormales o neuritas que componen la periferia de las placas
amiloides seniles. Las placas amiloides seniles consisten de
filamentos neurofílicos desorganizados en un área de más de 150
\mum en la sección transversal con un centro
extra-celular del depósito amiloide. Las placas
amiloides son ultraestructuralmente distintas de los FHPs y
consisten de filamentos de 4-8 nm de ancho que no se
encuentran torcidas juntas en pares. El centro de la placa consiste
de agregados de un péptido, inicialmente referido como A4, con una
masa molecular relativa (M) de aproximadamente 4,000 (Masters et
al., Proc Natl Acad Sci EUA, 1985,
82:4245-4249).
Una secuencia de aminoácidos parcial de A4,
ahora renombrada péptido \beta amiloide (o
A\beta_{1-42}), muestra que es similar a la
proteína \beta amiloide aislada de los vasos sanguíneos cerebrales
de los pacientes con enfermedad de Alzheimer o el síndrome de Down
(Glenner y Wong, Biochem Biophys Res Comm, 1984;
120:885-890; 122:1131-1135).
El A\beta_{1-42} se ha
hipotetizado para relacionarse a la EA por un número de razones.
Primeramente, en la amiloidosis periférica, es decir la enfermedad
de cadena primaria ligera o la amiloidosis secundaria AA, las
cargas amiloides largas se correlacionan fuertemente con el tejido y
la disfunción orgánica. Secundariamente, la densidad de la placa
amiloide positivamente se correlaciona con las señales de demencia
post-mortem en EA. Tercero, la deposición
A\beta_{1-42} es el marcador neuropatológico más
temprano en la EA y las enfermedades relacionadas tales como el
síndrome de Down, en donde puede proceder la formación ONF por
2-3 décadas. Cuarto, la
\beta-amiloidosis es relativamente específica para
la EA y las enfermedades relacionadas. Quinto, el
A\beta_{1-42} es tóxico para las neuronas
(Yankner et al., Science, 1990; 250:279-282).
Por último, las mutaciones sin sentido en el gen proteína
precursora amiloide estructural (PPA) causa inicios tempranos de EA
familiar (Goate et al., Nature, 1991;
349:704-706; Mullan et al., Nature Genetics,
1992; 1:345-347). Notablemente, dicha mutación
causa sobreproducción de A\beta_{1-42} dramática
(Citron et al., Nature, 1992;
360:672-674).
En 1987, Kang et al. (Nature,
1987; 325:733-737) y otros tres grupos (ver 1987
reportes de estado por Anderton, Nature, 1987;
325:658-659 y Barnes, Science, 1987;
235:846-847) independientemente clonó el gen del
cual A\beta_{1-42} se derivó. Este gen, ahora
conocido como la proteína precursora amiloide (PPA), codifica una
proteína de los residuos de 695 aminoácidos con un MW de
aproximadamente 79,000 que se expresa virtualmente en todos los
tejidos. Existen al menos cinco variantes de unión del PPA, cuatro
de las cuales contienen la secuencia del péptido
\beta-amiloide.
Cuatro genes se han implicado en las formas
familiares de la EA. Tres de los genes, \betaPPA, presenilin
I y presenilin 2, cuando se mutan causan las formas
tempranas dominantes autosomales de la EA. El cuarto gen, la
Apoliproteína E tiene una forma polimórfica de ocurrencia natural,
ApoE4, que representa un factor de riesgo genético principal para
del desarrollo de la enfermedad. El concepto de que las alteraciones
en varios genes distintos puede conducir a un desequilibrio entre
la producción A\beta_{1-42} y su claro, con la
agregación resultante del primer residuo 42 y posteriormente el
péptido del residuo 40 en las placas citotóxicas, se soporta por la
evidencia disponible. La evidencia sugiere fuertemente que los
defectos en cada uno de estos cuatro genes predispone el fenotipo
EA por (1) mejorar la producción y/o la deposición de los péptidos
A\beta_{1-42} o (2) mediante disminuir el claro
del ApoE4 del tejido (Selkoe, J Biol. Chem, 1996;
271:18295-18298).
De los datos disponibles, parece que los
péptidos A\beta_{1-42} agregados pero no
monoméricos pueden inducir la disfunción celular y la muerte in
vitro por un rango de mecanismos presumiblemente
interrelacionados. Estos incluyen el daño oxidativo (Thomas et
al., Nature, 1996; 380:168-171; Bel et al.,
Cell, 1994; 77:817-827), las alteraciones en la
homeostasis de calcio intracelular (Arispe et al., Proc Natl Acad
Sci EUA, 1993; 90:567-571) y la reorganización
citoesqueletal (Busciglio et al., Neuron, 1995;
14:879-888). Ha surgido conocimiento suficiente de
algunas etapas principales en la cascada amiloide inducida, incluso
aunque la hipótesis es vehementemente contestada.
Los avances farmacológicos de identificación de
moléculas pequeñas que podrían inhibir una u otra etapa de la
cascada inducida por amiloides ahora esta en curso. Existen dos
avances de interés particular: intentos de interferir con la
agregación de los péptidos A\beta_{1-42}
mediante la disminución de la secreción de los péptidos
A\beta_{1-42} de las células de la glía y
neuronales o inhibe la toxicidad que estos agregados extracelulares
que se producen en las neuronas y las células de la glía y sus
procesos. Un tercer alcance tentativo para controlar la respuesta
inflamatoria especializada que parece impulsarse por el
A\beta_{1-42} agregado (incluyendo la
estimulación microglial, activación de la cascada del complemento
clásico, liberación de citoquina y astrocitosis reactiva) puede
probar ser benéfico para los pacientes con Alzheimer.
Además de los alcances farmacológicos
anteriormente mencionados para la intervención de la EA, las
intervenciones inmunológicas también se han intentado. Soloman
et al. (Proc Natl Acad Sci. 1996;
93:452-455; Proc Natl Aca Sci. 1997;
94:4109-4112) mostró que tres anticuerpos
monoclonales específicos dirigidos hacia un sitio en la región
N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} humano se une en varios grados a
las fibrilas preformadas que conducen a su disgregación e
inhibición de su efecto neurotóxico. También se encontró que los
anticuerpos previenen la formación del
A\beta_{1-42} fibrilar. Solomon et al.
(WO 01/18169) también intentó preparar un despliegue fago de un
epítope del péptido A\beta_{1-42} y administrar
el epítope del fago desplegado o el péptido que contiene el epítope
intraperitonialmente para los ratones que producen los anticuerpos
para el péptido A\beta_{1-42}. La prueba in
vitro con el fenocromocitoma de ratas mostró que una dilución
1:5 de antisuero previene la toxicidad de
A\beta_{1-42}. El antisuero en una dilución de
1:5 y 1:20 también mostró la interrupción de la estructura fibrilar
de A\beta in vitro con el deterioro extensivo de la
morfología fibrilar. Sin embargo, el adyuvante usado para la primera
inyección fue el Adyuvante de Freund Completo con el Adyuvante
Freund incompleto para la segunda inyección. Los adyuvantes usados
son completamente inapropiados para usarse en humanos. Por otra
parte, los niveles de anticuerpos generados fueron muy bajos para
ser efectivos a pesar del uso de estos adyuvantes ásperos.
Subsecuentemente, Schenk et al.
(Nature, 1999; 400:173-177) mostró que la
inmunización con el péptido A\beta_{1-42}
inhibe la formación de las placas amiloides y las neuritas
distróficas asociadas en un modelo de ratón de EA. Sin embargo,
debido a la baja inmunogenicidad del péptido
A\beta_{1-42}, el método empleado requirió
administraciones repetidas del antígeno con un adyuvante de
formación de lesión áspera para obtener los niveles más altos de
los anticuerpos
anti-placa-A\beta_{1-42}
para afectar la formación de la placa. Además, se advirtió que la
inmunización con A\beta_{1-42} puede inducir más
acumulación del amiloide tóxico por si mismo (Araujo, DM &
Cotman, CW, Brain Res, 1992; 569,
141-145).
A pesar de estas críticas, estudios adicionales
en los modelos de ratón EA transgénicos a través de la inmunización
similar han dejado la creencia de los avances de inmunoprofilaxis e
inmunoterapéuticos para ED. Janus et al. (Nature,
2000; 408: 979-982) describió la inmunización del
péptido A\beta_{1-42} en un modelo de ratón
para EA que redujo el deterioro del comportamiento y las placas.
Morgan et al. (Nature, 2000,
48:982-985) describió que la vacuna del péptido
A\beta_{1-42} previene la pérdida de la memoria
en el modelo de ratón.
El soporte directo para la efectividad de la
terapia inmune llega de la observación que la administración
periférica de los anticuerpos, monoclonal o policlonal, en contra de
la carga amiloide reducida del péptido A\beta (WO 99/27944; Bard
et al, Nature Medicine, 2000; 6:916-919). A
pesar de los niveles de suero relativamente modestos, estos
anticuerpos pasivamente administrados, el monoclonal 3D6
(anti-A\beta_{1-5}) y el 10D5
(anti-A\beta_{1-12}) o el
policlonal anti-A\beta_{1-42},
fueron capaces de ingresar al sistema nervioso central. Ahí, los
anticuerpos se unen a las placas e inducen el despeje de las placas
amiloides existentes. Bard et al., reportó que cuando se
examinó en una prueba ex vivo con las secciones cerebrales
de los ratones PDPPA (es decir, ratones transgénicos para un minigen
PPA conducido por un promotor del factor de crecimiento derivado de
las plaquetas) o un tejido cerebral de un paciente EA, los
anticuerpos en contra de las células microgliales para despejar las
placas a través de la fagocitosis y la degradación del péptido
subsecuente. Este estudio demostró que los anticuerpos pasivamente
administrados en contra del péptido
A\beta_{1-42} y la región del término N
A\beta_{1-42} redujo la extensión de la
deposición de la placa en un modelo de ratón de EA y esos
anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales producidos por
las vacunas dirigidas en sitio son capaces de ingresar al CNS en
niveles terapéuticamente relevantes.
No obstante a los hallazgos prometidos de la
intervención inmunológica en el modelo de ratón para EA, una vacuna
en contra de la EA apropiada para los humanos continua muy lejos
(Chapman, Nature, 2000; 408:915-916). Los
obstáculos principales residen en el trabajo extensivo necesario
para diseñar y formular una composición inmunogénica que es útil en
los humanos antes de que pueda lograrse una vacuna práctica para la
EA. Algunos de los tejidos que cuentan con datos experimentales
para las guías son: (1) Cual es el sitio blanco específico para el
reconocimiento del anticuerpo dentro del A\beta? (2) En que forma
deberá presentarse el inmunogen? (3) Que otros sitios se necesitan
incluir antes de que el inmunogen logre producir un nivel
terapéutico del anticuerpo? (4) Que es un sistema de suministro de
vacuna efectivo que emplea un adyuvante clínicamente aceptable para
los humanos?.
Un hueco principal existe entre lo que se ha
descrito en la literatura y lo que permanece para hacerse. Cual es
el sitio de blanco específico apropiado (es decir, la placa
A\beta_{1-42} polimerizado o el péptido
A\beta_{1-42} monomérico soluble) y como el
sitio específico se fraguo par la intervención inmunogénica. No
obstante de algunas 5,000 publicaciones en
A\beta_{1-42} en la década pasada, la hipótesis
de la cascada amiloide se debate vehementemente y el tejido: la
forma en la cual A\beta_{1-42} deberá usarse
para la intervención que continua contencioso. En el corazón del
problema, discutido por Terry y sus colegas, es la débil
correlación entre la carga amiloide fibrilar y las medidas de
disfunción neurológica (The Neuropathology of Alzheimer Disease
and the Structure Basis of its Alterations, Ed. Por Terry et
al., Alzheimer Disease, p187-206, Lippincott
Williams y Wilkins, 1999).
En los pacientes con EA, los depósitos amiloides
comúnmente se forman en una distancia desde el sitio del daño del
neuron. La mejor correlación con la demencia patológica es la
pérdida de las terminales sinápticas. Sin embargo, la pérdida de
las terminales sinápticas se correlaciona pobremente con la carga
amiloide. Si las manifestaciones de la enfermedad se correlacionan
débilmente con la carga amiloide, entonces cual es el rol de
A\beta? El artículo por Klein et al, titulado ``Blanco de
oligómeros pequeños A\beta_{1-42}: la solución
a un enigma de la enfermedad de Alzheimer? (Trends in Neurosciences,
2001; 24:219-224) sugiere que las fibrilas no son
solamente una forma tóxica del A\beta y tal vez la neurotoxina no
es más relevante para la EA. Los oligómeros y fotofibrilos también
llamados como ligandos difusibles derivados de
A\beta_{1-42} (LDDAs) también pueden tener
potente actividad neurológica tóxica.
Una vacuna EA par la intervención inmunológica
exitosa requiere un inmunogen designado para producir anticuerpos de
alta afinidad dirigida en sitio que se unen a las placas seniles en
el tejido del cerebro para acelerar el desalojo de la placa mediante
las células Gliales e inmunoneutralizar las toxinas derivadas de
A\beta.
El problema de elevar los anticuerpos dirigidos
en sitio de alta afinidad en contra de los péptidos de sitio
específico pobremente inmunogénicos se ha conocido por décadas. Los
inmunólogos y los especialistas en el desarrollo de vacunas
comúnmente frecuentan el acercamiento del conjugado de proteína del
portador [péptido] hapten clásico como se demuestra en WO 99/27944.
Para el desarrollo de una vacuna dirigida en sitio en contra de EA,
Frenkel et al. intentó la inmunización en contra de las
placas A\beta_{1-42} a través de la
administración del fago "EFRH" (Proc Natl Acad Sci 2000;
97:11455-11459, WO 01/18169) como se mencionó
anteriormente.
Las aproximaciones: usando el agregado péptido
A\beta_{1-42} o los conjugados de la proteína
del cargador del fragmento péptido
A\beta_{1-42} (WO99/27944) y que usa el fago
filamentoso desplegando el "péptido EFRH" como los agentes
para inducir las respuestas inmunes en contra de un depósito
amiloide en un paciente, son enfadosas e inefectivas. Por ejemplo,
después de la cuarta inmunización de 10^{11} fagos desplegando el
epítope EFRH, >95% de los anticuerpos en el suero inmundo de los
conejillos de indias en contra de los fagos. Solamente una
población pequeña (<5%) de los anticuerpos está en contra del
péptido A\beta_{1-42} soluble (Frenkel et
al., Vaccine 2001, 19:2615-2619; WO
01/18169).
Se describieron métodos menos enfadosos en la
Patente Europea EP 526,511 y la WO 99/27944, que describe la
administración del péptido A\beta_{1-42} para
tratar a pacientes con EA pre-establecida y la
administración de A\beta_{1-42} u otros
inmunógenos a un paciente bajo condiciones que generan una respuesta
inmune "benéfica" en el paciente con EA. Sin embargo, una
revisión de WWO99/27944 muestra que existen deficiencias principales
en el diseño de vacuna descritos en este documento.
En particular, el problema reside en la falta de
un sistema de distribución de una vacuna efectiva y
farmacéuticamente aceptable. WO99/27944 describe el
A\beta_{1-42} o fragmentos activos de
A\beta_{1-42} conjugado a una molécula
portadora tal como la toxina del cólera como el componente de la
vacuna activa. Ver la página 4 de WO 99/27944. Aunque la página 5
enseña que una composición farmacéutica que comprende el inmunogen
deberá estar libre del Adyuvante de Freund Completo [AFC], los
ejemplos que solamente muestran la eficacia de la vacuna
A\beta_{1-42} para el tratamiento de EA en los
ratones transgénicos emplearon grandes dosis del péptido
A\beta_{1-42} agregado en AFC. No obstante la
relación repetitiva de los adyuvantes preferidos que son para
usarse con los agentes inmunogénicos descritos para mejorar la
respuesta inmune, los datos experimentales mostraron que solamente
las formulaciones que emplean AFC/IAFC proporcionan una
concentración de una solución suficientemente alta de anticuerpos.
Ver la página 25 de WO 99/2794. En el ejemplo 1, la eficacia
profiláctica de A\beta_{1-42} en contra de EA
se demostró en los ratones PDAPP. Sin embargo, las formulaciones
administradas consisten de una dosis de 100 ug por ratón del
A\beta_{1-42} agregado emulsificado en el
Adyuvante de Freund Completo [AFC] (p34 de WO 99/27944) seguido por
las múltiples dosis de fomentador del mismo péptido
A\beta_{1-42} emulsificado en el Adyuvante de
Freund Incompleto. En el Ejemplo IX, se estudiaron las respuestas
inmunes en los ratones a los diferentes adyuvantes. Cuando los
adyuvantes: MPL, Alum, QS21 y AFC/IAFC se usaron con el inmunogen
significativamente potente AN1792 (es decir,
A\beta_{1-42} humano agregado), el nivel de los
anticuerpos para el A\beta_{1-4} se redujo en un
nivel estadísticamente significante en comparación con los ratones
que reciben las vacunas AFC/IAFC. Ver, la Tabla 9 y las páginas
59-64 de WO 99/27944.
En el caso en donde los fragmentos del péptido
A\beta_{1-42} se usaron (péptidos
A\beta_{1-42} de loas aminoácidos
1-5, 1-12, 13-28 y
33-42), cada fragmento se conjugó para el IgG
anti-ratón de oveja como el portador de proteína.
En una descripción posterior, la eficacia de los anticuerpos para
los fragmentos del péptido A\beta solamente podrían mostrarse por
la inmunización pasiva con los anticuerpos monoclonales (Bard et
al., Nature Medicine 2000; 6:916-919). La
eficacia de estos fragmentos conjugados para el IgG
anti-ratón de oveja no se mostró. Por lo tanto, el
único inmunogen que mostró ser efectivo fue el péptido
A\beta_{1-42} agregado en AFC/IAFC.
El documento WO 00/72880 A2, entre otras cosas,
hace referencia a métodos para la prevención o el tratamiento de
una enfermedad asociada a depósitos amiloides de A\beta en el
cerebro de un paciente, por ejemplo la enfermedad de Alzheimer o el
Síndrome de Down o el deterioro cognitivo. Tales métodos implican
administrar fragmentos de A\beta o sus análogos, mientras que el
segmento N-terminal de A\beta puede estar enlazado
en su en su C-terminal a un polipétido heterólogo.
Los fragmentos comienzan en el residuo 1-3 de
A\beta y finalizan en los residuos 7-11 de
A\beta, sin embargo, fragmentos que sean de mayor longitud que la
comprendida entre los residuos 1-12 son menos
deseables ya que su actividad en eliminar o prevenir depósitos
amiloides no está clara.
En la actualidad, todas las formulaciones de
vacuna muestran ser efectivas empleando el AFC/IFA como el
adyuvante. Los imunogenes péptidos que señalan el
A\beta_{1-42} hasta el momento han sido
preparados mediante la conjugación de los varios fragmentos
A\beta_{1-42} para la inmunoglobulina
anti-ratón de oveja, la conjugación del
A\beta_{13-28} sintético vía el éster
m-meleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
para el anticuerpo o el péptido A\beta_{1-42}
solo agregado. Estos inmunógenos, es decir el péptido
A\beta_{42} solo o los conjugados de la proteína del portador
del péptido A\beta_{1-42}, se emulsificaron con
el adyuvante de Freund para la primera inmunización seguida por los
fomentadores subsecuentes en el adyuvante de Freund incompleto
(Jonson-Wood et al., Proc Natl Acad Sci USA,
1997; 94:1550-1555; Seubert et al., Nature,
1992; 359:325-327; Schenk et al, Nature,
1999; 400: 173-177; Janus et al., Nature
2000; 408:979-982 y Morgan et al; Nature,
2000; 409:982-985). Las formulaciones descritas en
WO 99/27944 u otros usando AFC e IAFC como adyuvantes causan
lesiones y son muy ásperos para usarse en humanos. Además, ninguna
de las composiciones de vacuna para la EA descrita en el arte
previo es apropiada para usarse en humanos.
En resumen, a pesar de las declaraciones que
sugieren que el potencial del péptido
A\beta_{1-42} para el tratamiento de EA en vista
de las descripciones previas de Kline (EP 526,511), ningún problema
que resuelve las formulaciones de la vacuna se ofreció realmente en
WO99/27944 para dirigirse a este problema clave.
Otra desventaja con los conjugados de la
proteína del portador-péptido y los agregados
A\beta_{1-42} es que estas moléculas son
altamente complejas y son difíciles de caracterizar y es difícil de
desarrollar procedimientos de control de calidad efectiva para el
proceso de fabricación. Una desventaja adicional que el péptido
A\beta_{1-42} o sus fragmentos son sus propias
moléculas cuando se administran a los humanos. Además es necesario
desarrollar formulaciones de vacunas clínicamente aceptables para
la administración en humanos.
Se conoce que los epítopes Th promiscuos pueden
emplearse para evocar la célula T eficiente y pueden combinarse con
los epítopes de la célula B pobremente inmunogénica para
proporcionar los inmunógenos potentes. Se ha mostrado que los
péptidos quiméricos de los epítopes de la célula Th/B promiscuos
bien diseñados son útiles en la producción de respuestas Th y las
respuestas de los anticuerpos resultantes en la mayoría de los
miembros de una población genéticamente diversa que expresa
haplotipos MHC diversos. Se conoce el Th promiscuo de un número de
patógenos, tal como la proteína F del virus del sarampión y el
antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B. Las tablas 1
y 2 listan muchos de los Th promiscuos conocidos que han demostrado
ser efectivos en un péptido potencial pobremente inmunogénico
corto, la hormona del decapéptido LHRH (EUA 5,759,551 y
6,025,468).
Los epítopes Th potentes oscilan en el tamaño de
aproximadamente 15-40 residuos de aminoácidos en
longitud, comúnmente comparten las características estructurales
comunes y pueden contener secuencias de punto destacado específico.
Por ejemplo, una característica común de un Th es que contiene
hélices amfipáticas, estructuras alfa-helicales con
los residuos aminoácidos hidrofóbicos que dominan una fase de la
hélice y con los residuos cargados y polares que dominan las fases
circundantes (Cease et al., Proc Natl Acad Sci EUA, 1987; 84:
4249-4253). Los epítopes frecuentemente contienen
modelos de aminoácidos primarios adicionales tales como un Gly o un
residuo cargado seguido por dos o tres residuos hidrofóbicos
seguidos a su vez pro un residuo pilar o cargado. Este modelo
define cuales son las secuencias llamadas Rothbard. Los epítopes Th
comúnmente obedecen la regla 1, 4, 5, 8, en donde un residuo
potencialmente cargado se sigue mediante los residuos hidrofóbicos
en la cuarta, quinta y octava posiciones después del residuo
cargado. Dado que todas estas estructuras se componen de
aminoácidos polares y cargados, cada estructura puede existir
simultáneamente dentro de un epítope Th simple (Partidos et al.,
J Gen Virol, 1991; 72:1293). La mayoría, si no todos los
epítopes de la célula T promiscua se ajustan en al menos una de las
periodicidades anteriormente descritas. Estas características
pueden incorporarse en los diseños de sitios Th artificiales
idealizados, incluyendo los epítopes Th combinatorios. Con respecto
al diseño de los sitios Th combinatorios, las listas de las
posiciones variables y los aminoácidos preferidos están disponibles
por motivos de unión del MHC (Meister et al., Vaccine, 1995;
13:581-591). Además, un método para producir el Th
combinatorio se ha descrito para los péptidos de biblioteca
combinatoria llamados biblioteca de antígeno sintético estructurado
(Wang et al., WO 95/11998). Además, la regla 1, 4, 5, 8
puede aplicarse junto con los motivos de enlace MHC combinatorios
conocidos para asignar las posiciones degenerativas e invariantes
en un sitio Th combinatorio y para seleccionar los residuos para los
sitios de degeneración para alargar en forma vasta el rango de la
conformidad de un Th artificial. Ver la Tabla 2, WO 99/66957 y WO
95/11998.
Wang et al (US 5,759,551) sugirió que el
uso de elementos inmunoestimulantes para hacer la proteína propia
Amilina inmunogénica. Wang et al. sugirió la administración
de los péptidos amilina sintéticos inmunogénicos como vacunas para
el tratamiento de la diabetes mellitus insulina no dependiente
(DMIND), una enfermedad amiloidogénica causada por la
sobreproducción de Amilina (columna 19, líneas 9-39,
US 5,759,551). La amilina es una hormona del péptido de los
residuos de 37 aminoácidos producida por las células \beta en las
isletas de Langerhans. La sobreproducción de la amilina resultará
en la deposición del amiloide insoluble que conduce a la enfermedad
amiloidogénico en el páncreas. Similar a la sobreproducción de la
Amilina, la sobreproducción del péptido
A\beta_{1-42} conducirá a la deposición del
amiloide insoluble en el cerebro de los pacientes con EA. Sin
embargo, existe la homología de secuencia limitada entre la Amilina
y el péptido A\beta_{1-42}. Solamente una corta
extensión de los residuos de los aminoácidos, VGSN de la
Amilina32-35 corresponde a
A\beta_{24-27}. Los anticuerpos producidos en
contra del péptido Amilina no se espera que sea reactivo en forma
cruzada para los péptidos A\beta_{1-42}
solubles que no aceleran el despeje de las placas amiloides en el
cerebro en vista de los estudios por Soloman et al. y Schenk
et al., que muestran que la secuencia EFRH es
crítica.
crítica.
Es el objeto de la invención desarrollar un
inmunogen que habilitaría la generación de altos niveles de
anticuerpos de alta afinidad en contra del sitio funcional
N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} con alta reactividad cruzada para
las placas seniles en el cerebro de los pacientes EA. Los
anticuerpos generados mediante el enlace al péptido
A\beta_{1-42} y las placas seniles se esperan
que aceleren el despeje de estas placas del cerebro, promueven la
disgregación fibril, inhiben la agregación fibrilar y la
inmunoneutralización de las "toxinas derivadas de A\beta
solubles" [también llamadas ligandos difusibles
A\beta-derivadas o LDDAs].
Es un objeto adicional de la presente invención
desarrollar una vacuna para el suministro del vehículo que es
apropiada para el uso veterinario y en humanos para la profilaxis y
el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
Las Figuras 1a, 1b, 1c, 1d, 1e y 1f son
fotografías que muestran el marcado de inmunoperoxidasa de secciones
seriales de 2 cerebros EA, usando el método del Complejo del
Anticuerpo Avidin-Biotinilado (CAB) con suero
pre-inmune e inmune en una dilución de 1:100 bajo un
aumento de 10X. Las Figuras 1a y 1d muestran enlace significante de
los anticuerpos para ambas placas seniles y las placas A\beta
(ambas marcadas como "P") en los vasos sanguíneos positivos S
de tioflavina (marcados como "BV"). Los anticuerpos se
generaron en los conejillos de indias usando
A\beta_{1-28}-\varepsilonK-MVF
Th1-16 (SEC ID NO:74) preparada en una emulsión
ISA51 de agua en aceite. Las Figuras 1b y 1e muestran la
reactividad cruzada de los anticuerpos elevados en contra del mismo
péptido inmunógeno en AFC/IAFC. Las Figuras 1c y 1f muestran las
secciones del cerebro usando el suero
pre-inmune.
Las Figuras 2a, 2b, 2c, 2d y 2e son fotografías
que muestran el marcado Inmunoperoxidasa de las secciones en serie
del cerebro EA con suero inmune y pre-inmune en una
dilución de 1:100 y bajo aumento de 40X. Las Figuras 2a y 2d
mostraron que los anticuerpos en los conejillos de indias
inmunizados con
A\beta_{1-28}-\varepsilonK-MVF
Th1-16 (SEC ID NO:74) preparado en una emulsión
ISA51 agua en aceite marcó fuertemente las placas (P) que forman un
modelo de centros. La Figura 2b es una fotografía del modelo de EA
en secciones del cerebro de cerdo usando el mismo inmunogen en la
formulación AFC/IAFC. El anti-suero
predominantemente reaccionado con las placas en los vasos
sanguíneos (VS). La Figura 2c es una fotografía de una sección de
cerebro del conejillo de indias con suero preinmune y no mostró
coloración. La Figura 2e muestra la sección del cerebro con suero
hiperinmune generado mediante la inmunización con el péptido
A\beta_{1-28} solo en AFC/IAFC mostrando un
modelo de coloración sorpresivamente débil a pesar de la fuerte
reactividad con A\beta_{1-28} por ELISA.
La presente invención se refiere a una
composición inmunogénica que comprende péptidos sintéticos capaces
de inducir los anticuerpos en contra del sitio regulador/funcional
principal del péptido A\beta con alta reactividad cruzada ambos
para el péptido soluble A\beta_{1-42} y las
placas en el cerebro de pacientes con la Enfermedad de Alzheimer
(EA). La composición inmunogénica cuando se administra a una
paciente con EA o una persona predispuesta a EA se espera que
acelere el despeje de las placas amiloides y la inmunoneutralización
de las toxinas A\beta derivadas solubles en el cerebro para
prevenir y tratar el EA. En particular, un péptido inmunógeno de
esta invención comprende el epítope Th de SEC ID NO: 1 unido a un
fragmento corto del péptido A\beta_{1-42}
N-terminal que comprende EFRH del péptido
A\beta_{1-42,} SEC ID NO: 65. El fragmento del
péptido A\beta_{1-42} es la SEC ID NOS: 67.
Opcionalmente, puede incluir espaciadores del aminoácido que
separan los dominios inmunogénicos. Los elementos del dominio
inmunogénico separados por los espaciadores pueden unirse
covalentemente en cualquier orden proporcionando que la
inmunoreactividad del péptido hapten se preserva sustancialmente o
que la inmunoreactividad para el fragmento del péptido
A\beta_{1-42} y las placas se generan.
La presente invención además proporciona una
composición inmunogénica que comprende una cantidad
inmunológicamente efectiva de una composición del péptido en una
formulación de vacuna farmacéuticamente aceptable que comprende un
adyuvante o un emulsificador seleccionado del grupo que consiste de
liposina, saponina, escualeno, L121, lípido monofosfirilo emulsigen
A (MPL), polisorbato 80, QS21, Montanido ISA51, ISA35, ISA206 e
ISA720, así como los otros adyuvantes y emulsificantes eficaces.
\global\parskip0.850000\baselineskip
La presente invención además proporciona un
medicamento útil para la inducción del despeje acelerado de las
placas amiloides y la inmunoneutralización de las toxinas
A\beta-derivadas solubles en el cerebro para
prevenir y tratar la Enfermedad de Alzheimer en un mamífero
mediante administrar uno o más péptidos inmunogénicos al mamífero
por un tiempo y bajo condiciones suficientes para inducir los
anticuerpos dirigidos en contra del sitio funcional/regulador del
péptido A\beta_{1-42}. Un ejemplo típico de una
vacuna de la presente invención es una composición del péptido que
comprende 5-1000 \mug del péptido inmunógeno en
una vacuna formulada como una emulsión de agua en aceite en un
adyuvante y/o portador farmacéuticamente aceptable. Un método típico
de la administración de la vacuna es para inyectar
intramuscularmente la formulación de vacuna en 0.5-2
ml por dosis en un programa de inmunización en intervalos de 0, 4 y
8 semanas.
Un factor importante que afecta la
inmunogenicidad de un péptido sintético para un inmunogen del
fragmento A\beta_{1-42}
N-terminal es su presentación para el sistema inmune
por los epítopes celulares del asistente T (Th). Dicha T se
suministra más confiablemente al péptido inmunógeno mediante los
epítopes Th extranjeros en un elemento de dominio del péptido Th
separado que son extrínsecos para el péptido A\beta blanco. Dichos
inmunógenos pueden producirse como polipéptidos híbridos mediante
la expresión ADN recombinante. También puede ser más simple y menos
costoso suministrarlos como un péptido inmunógeno sintético que
comprende el sitio celular del hapten B blanco del péptido A\beta
y los epítopes T auxiliares (Th) apropiados para el huésped. Dichos
péptidos reaccionan con los receptores de la célula T auxiliar y las
moléculas MHC clase II, además de los sitios de enlace del
anticuerpo (Babbitt et al., Nature, 1985; 317:359) y además
estimula estrechamente una respuesta del anticuerpo de sitio
específico. Previamente dicho Th se suministró para los inmunógenos
del péptido A\beta_{1-42} que es trabajable por
el Th intrínseco para el péptido A\beta de longitud completa
agregada (WO 99/66957; WO 1999/27944; Janus et al., 2000,
Morgan et al., 2000) pueden suministrarse por la proteína
portadora. Un péptido inmunógeno completamente sintético disfruta
de las siguientes ventajas sobre los agregados del péptido
A\beta_{1-42}, los conjugados del portador y los
polipéptidos recombinantes en ese producto que se define
químicamente para el fácil control de la calidad. El péptido
inmunógeno sintético es estable. Ni el procedimiento descendente
elaborado ni una instalación de fabricación elaborada se necesita.
La respuesta inmune está en sitio específico y se enfoca en el
blanco A\beta y no el portador. Además, las respuestas indeseables
tales como la supresión epitópica se evitan.
La inmunogenicidad de los inmunógenos del
péptido A\beta en sitio funcional N-terminal
sintéticos pueden optimizarse por (1) combinar el fragmento del
péptido A\beta1-42 N-terminal con
los sitios Th promiscuos extranjeros seleccionados al cual la
mayoría de una población es sensible y (2) combinar el fragmento
A\beta del péptido con el Th cuyo repertorio se prolonga a través
de la química combinatoria y por lo tanto acomoda la responsabilidad
inmune variable de una población genéticamente diversa.
Se ha encontrado que la composición de los
péptidos de la presente invención es efectiva en estimular la
producción de anticuerpos en contra del sitio regulador/funcional
principal del péptido A\beta, con las reactividades cruzadas para
el A\beta_{1-42} soluble y las placas en los
cerebros de los pacientes con EA. Con base en los datos de
inmunogenicidad obtenidos en los conejillos de indias y los
mandriles y los datos obtenidos del marcado de inmunoperoxidasa de
las placas amiloides presentes en las secciones del cerebro con EA
humano mediante el suero inmune específico obtenido, se espera que
los inmunógenos del péptido de la presente invención formulados
apropiadamente son efectivos en los humanos. Se nota que los datos
obtenidos en los mandriles son significativamente significantes en
que estos son una especie cuya respuesta inmune es cercanamente
parecida a la de los humanos.
La invención se dirige a una composición de
péptidos novedosa para la generación de anticuerpos policlonales de
alta concentración de solución con especificidad para el sitio
funcional/regulador principal del péptido A\beta, con
reactividades cruzadas para el A\beta_{1-42}
soluble y las placas en el cerebro de los pacientes con Enfermedad
de Alzheimer (EA). Los anticuerpos generados por la composición del
péptido son altamente de sitio específico y se unen a los péptidos
A\beta y las placas amiloides en el cerebro. Además, la presente
invención proporciona un método efectivo para acelerar el despeje de
las placas amiloides y la inmunoneutralización de toxinas A\beta
derivadas en los cerebros para la prevención y el tratamiento de
EA.
Los fragmentos del péptido
A\beta_{1-42} N-terminal
seleccionados del grupo que consiste de 10 a 28 aminoácidos en
donde cada fragmento comprende EFRH del péptido
A\beta_{1-42} (SEC ID NO:65) son péptidos
lineales cortos que por si mismos no son inmunogénicos. Los
fragmentos del péptido A\beta_{1-42} cortos
pueden ser inmuno-potenciados mediante el
acoplamiento químico para una proteína portadora, por ejemplo, la
hemocianina de lapa de ojo de cerradura (HLO) o mediante la fusión
a un polipéptido portador a través de la expresión ADN
recombinante, por ejemplo, el antígeno de la superficie de la
hepatitis B. La deficiencia de dichas vacunas de "proteína del
portador del (de los) péptido(s) A\beta" es una porción
principal de anticuerpos generados que no son anticuerpos no
funcionales dirigidos en contra de la proteína del portador.
Los inmunógenos de la presente invención son
inmunógenos de péptido completamente sintéticos que comprenden un
fragmento N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} de SEC ID NO: 67 que comprende
EFRH del péptido A\beta_{1-42} unido
covalentemente a los epítopes Th promiscuos de SEC ID NO: 1. Los
inmunógenos de la invención educen la producción de los anticuerpos
de sitio específico que se unen al péptido
A\beta_{1-42} y sus agregados y son reactivos
en forma cruzada con las placas amiloides en el cerebro para
proporcionar el despeje acelerado de las placas amiloides y la
inmunoneutralización de las toxinas A\beta derivadas en el
cerebro. Además, el inmunogen de la presente invención es útil en
prevenir y tratar la EA.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Son generados los resultados del
anti-suero de los animales inmunizados con los
péptidos del inmunogen de la presente invención demuestran esos
anticuerpos reactivos del péptido A\beta de sitio dirigido
potentes en una población de huésped genéticamente diversa.
El péptido inmunogénico sintético de la presente
invención comprende:
- (i)
- un epítope (Th) de la célula T de SEC ID No: 1;
- (ii)
- un fragmento N-terminal del péptido A\beta_{1-42} de SEC ID NO: 67, que comprende EFRH del péptido A\beta_{1-42}; y
- (iii)
- opcionalmente un espaciador para separar los dominios inmunogénicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido Th se une covalentemente al término N
o C del fragmento N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} opcionalmente con un espaciador
(es decir Gly-Gly, \varepsilon-N
Lys).
El péptido inmunógeno de esta invención se
representa por uno de la siguiente fórmula:
- \quad
- (A)_{n}-(fragmento N-terminal del péptido A\beta_{1-42})-(B)_{o}-(Th)_{m}-X {}\hskip0.5cm ó
- \quad
- (A)_{n}-(Th)_{m}-(B)_{o}-(fragmento N-terminal del péptido A\beta_{1-42})-X;
en
donde
cada A es independientemente un aminoácido;
cada B es un grupo de enlace seleccionado del
grupo que consiste en Gly-Gly, (\alpha,
\varepsilon-N)Lys,
Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro
(SEC ID NO: 77).
Th es un epítope colaborador de la célula T de
SEC ID NO: 1;
(el fragmento N-terminal del
péptido A\beta_{1-42}) es el péptido de SEC ID
NO: 67.
X es un \alpha-COOH o
\alpha-CONH_{2} de un aminoácido
n es desde 0 a aproximadamente 10;
m es desde 1 a aproximadamente 4 y
o es desde 0 a aproximadamente 10.
\vskip1.000000\baselineskip
De preferencia, m = 1, n = 1 y o = 1 ó 2.
Cuando A es un aminoácido, es un aminoácido de
ocurrencia natural o de ocurrencia no natural. Los aminoácidos de
ocurrencia no natural incluyen pero no se limitan a
\varepsilon-N lisina,
\beta-alanina, ornitina, norleucina, norvalina,
hidroxiprolina, tiroxina, ácido \gamma-amino
butírico, homoserina, citrulina y los similares. Los aminoácidos de
ocurrencia natural incluyen alanina, arginina, asparagina, ácido
aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina,
histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina,
prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina, cuando m
es mayor que uno y dos o más de A son aminoácidos, entonces cada
aminoácido puede ser independientemente el mismo o diferente.
(A)_{n} puede incluir un espaciador, es decir,
Gly-Gly, \varepsilon-N Lys.
Cada B es independientemente el mismo o
diferente. B también pueden proporcionar un espaciador, es decir,
Gly-Gly, \varepsilon-Lys o lisina
entre el epítope Th promiscuo y el fragmento
N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} (SEC ID NO: 67). Además, al
separar físicamente el epítope Th del epítope celular B, es decir el
fragmento N-terminal del péptido
A\beta_{1-42}, el Gly-Gly o el
espaciador \varepsilon-Lys puede interrumpir
cualquier estructura secundaria instrumental creada por la unión
del epítope Th con un fragmento N-terminal del
péptido A\beta_{1-42} y por lo tanto elimina la
interferencia entre las respuestas de la célula B y/o Th. B también
pueden formar un espaciador que actúa como una bisagra flexible que
mejora la separación del fragmento N-terminal del
péptido A\beta_{1-42}. Se encuentran ejemplos de
secuencias de bisagras flexibles de codificación en la región de
bisagra de cadena pesada de inmunoglobulina. Las secuencias de
bisagra flexible son comúnmente ricas en prolina. Una bisagra
flexible particularmente útil se proporciona por la secuencia
Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro
(SEC ID NO:77), en donde Xaa es cualquier aminoácido, y
preferentemente ácido aspártico. La separación conformacional
proporcionada por B permite interacciones más eficientes entre el
péptido inmunógeno presentado y las células B y las células Th
apropiadas para mejorar las respuestas inmunes ante el epítope Th y
el epítope de producción de anticuerpos o sus análogos
inmunológicamente funcionales.
Th es una secuencia de aminoácidos (aminoácidos
no naturales o naturales) que comprende un epítope Th. Un epítope
Th puede ser un epítope continuo o discontinuo. En un epítope Th
discontinuo, no es necesario cada aminoácido de Th. Un epítope Th
es capaz de mejorar o estimular la respuesta inmune para el
fragmento N-terminal del péptido
A\beta_{1-42}. Los epítopes que son
inmunodominantes y promiscuos son altamente y ampliamente reactivos
de forma cruzada con las poblaciones humanas y animales con tipos
MHC ampliamente divergentes (Partidos et al., 1991; US
5,759,551). Un segmento Th comprende una porción contigua de un
epítope Th que es suficiente para mejorar o estimular una respuesta
inmune para el fragmento N-terminal del péptido
A\beta_{1-42}.
Los epítopes de la presente invención es
derivado de un patógeno (SEC ID No: 1).
En los péptidos sintéticos de esta invención, el
epítope Th se une covalentemente a través del espaciador B para el
término N o el término C del fragmento terminal N del péptido
A\beta_{1-42}.
Los inmunógenos del péptido de esta invención
pueden hacerse mediante métodos de síntesis químicos que son bien
conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Fields
et al., Capítulo 3 en Synthetic Peptides: A User's
Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., Nueva York, 1992, p.
77. De aquí, los péptidos pueden sintetizarse usando las técnicas
Merrifield automatizadas de la síntesis de fase sólida con el
\alpha-NH_{2} protegido por la química
t-Boc o F-moc usando los aminoácidos
protegido por la cadena lateral en, por ejemplo, un Modelo
Sintetizador del Péptido de Biosystems Applied 430A ó 431. La
preparación de las construcciones de péptidos comprenden los
péptidos de biblioteca combinatorios para los epítopes Th que pueden
llevarse a cabo mediante proporcionar una mezcla de aminoácidos
alternativos para acoplarse en una posición variable dada. Después
del montaje completo del péptido inmunógeno deseado, la resina se
trató de conformidad con los procedimientos estándares para
penetrar el péptido de la resina y desbloquear los grupos
funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos. El péptido
libre se purifica mediante HPLC y es bioquímicamente caracterizado
por ejemplo, mediante el análisis de aminoácidos o mediante
secuenciación. Los métodos de caracterización y purificación para
los péptidos son bien conocidos por un experto en la técnica.
El inmunogen de la presente invención también
puede prepararse como un polímero ramificado mediante la síntesis
del péptido deseado construida directamente en una resina de centro
poli-lisil ramificado (Wang et al., Science,
1991; 254:285-288).
Alternativamente, los inmunógenos del péptido
sintéticos más grandes pueden sintetizarse mediante las técnicas de
ADN recombinante bien conocidas. Dichas técnicas se proporcionan en
manuales estándares bien conocidos con protocolos detallados. Para
construir un gen que codifica un péptido de esta invención, la
secuencia de aminoácidos se traduce inversamente para obtener una
secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de
aminoácidos, de preferencia con codones que son óptimos para el
organismo en los cuales el gen se expresa. Después, se hace un gen
sintético, típicamente mediante los oligonucleótidos de
sintetización que codifican el péptido y cualquier elemento
regulador, si es necesario. El gen sintético se inserta en un vector
de clonación expresado y se transfiere a una célula huésped. El
péptido posteriormente se expresa bajo condiciones apropiadas
adecuadas para el sistema de expresión seleccionada y el huésped. El
péptido se purifica y se caracteriza por métodos estándares.
La eficacia de la composición de péptidos de la
presente invención puede establecerse mediante la inyección en un
animal, por ejemplo, los conejillos de indias con una composición
inmunogénica que comprende los péptidos de la invención. Ver la
Tabla 4, SEC ID NOS: 70-75. La respuesta inmune
humoral para el fragmento N-terminal del péptido
A\beta y el péptido A\beta_{1-42} soluble se
monitorean. Una descripción detallada de los procedimientos usados
se proporciona en los Ejemplos posteriores en este documento.
Otro aspecto de esta invención proporciona una
composición del péptido que comprende una cantidad inmunológicamente
efectiva de uno o más inmunógenos del péptido de esta invención en
un sistema de distribución farmacéuticamente aceptable. Por
consiguiente, la composición del péptido sujeto puede formularse
como una vacuna usando adyuvantes farmacéuticamente aceptables,
portadores u otros ingredientes rutinariamente empleados en las
formulaciones de vacunas. Entre los ingredientes que pueden usarse
en esta invención están los adyuvantes o emulsificadores que
incluyen alumbre, liposina, saponina, escualeno, L212, lípido A
monofosfiril emulsigen (LMF), polisorbato 80, QS21, Montanido
ISA51, ISA35, ISA206 e ISA720, así como los otros adyuvantes y
emulsificadores eficientes. La composición puede formularse para la
liberación inmediata o liberación sostenida. La composición también
puede formularse para la inducción de inmunidad sistémica, es decir,
mediante atraparla en o en la coadministración con las
micropartículas. Dichas formulaciones son rápidamente disponibles
por un experto en la
técnica.
técnica.
Los inmunógenos de la presente invención pueden
administrarse vía cualquier ruta convencional, tales como la ruta
subcutánea, oral, intramuscular, parenteral o enteral. Los
inmunógenos pueden administrarse en una sola dosis o en dosis
múltiples. Un programa de inmunización apropiada se determina
rápidamente y está disponible para cualquier experto en la
técnica.
La composición del péptido de la presente
invención comprende una cantidad efectiva de uno o más inmunógenos
del péptido de la presente invención y un portador farmacéuticamente
aceptable. Dicha composición en una forma de dosis unitaria
apropiada generalmente contiene aproximadamente 0.25 \mug a
aproximadamente 500 \mug del inmunogen por kg por peso corporal.
Cuando se envía en dosis múltiples, la cantidad efectiva puede
dividirse convenientemente por unidad de dosis. Por ejemplo, una
dosis inicial, es decir 0.0025-0.5 mg por kg de peso
corporal; de preferencia 1-50 \mug por kg de peso
corporal del péptido inmunógeno es para administrarse mediante
inyección, de preferencia intramuscularmente, seguido por dosis
(fomentadoras) repetidas de una cantidad similar. Las dosis
dependerán de la edad, el peso y la salud en general del sujeto que
son bien conocidas en las técnicas terapéuticas y de vacunación.
La respuesta inmune de los inmunógenos del
péptido A\beta_{1-42} sintéticos pueden
mejorarse mediante el suministro a través de atraparla o en
micropartículas biodegradables del tipo descrito por O'Hagan et
al. (Vacuna, 1991; 9: 768-771). Los
inmunógenos pueden encapsularse con o sin un adyuvante en
micropartículas biodegradables para las respuestas inmunes
potenciales y para proporcionar la liberación de tiempo controlado
para las respuestas periódicas o sostenidas y para la administración
oral (O'Hagan et al., 1991 y Eldridge et al., 1991;
28:287-294).
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
ilustrar la invención. El alcance de la invención no se limita a
los inmunógenos del péptido específico y las composiciones
proporcionadas. Los ejemplos demuestran que los inmunógenos del
péptido de la presente invención son útiles para producir los
anticuerpos en sitio dirigidos para ambos fragmentos
A\beta_{1-10} y
A\beta_{1-14} así como los anticuerpos reactivos
en forma cruzada para los péptidos
A\beta_{1-42} tan pronto como 4 semanas después
de la inmunización inicial.
\vskip1.000000\baselineskip
(Solamente que
referencia)
Los inmunógenos listados en la Tabla 4 (SEC ID
NOS: 70-76) se sintetizaron individualmente por la
técnica de síntesis de fase sólida Merrifield en los sintetizadores
de péptidos automatizados de Applied Biosystems (Modelos 430, 431 y
433A) usando química Fmoc. La preparación de los inmunógenos del
péptido comprenden una biblioteca combinatoria Th, es decir sitio de
Th artificial idealizado tal como MvF derivado de
Th1-8 (SEC ID NOS: 38-40), que puede
llevarse a cabo mediante proporcionar una mezcla de los aminoácidos
deseados para el acoplamiento químico en una posición dada como se
especifica en el diseño. Después de montaje completo del péptido
deseado, la resina se trató de conformidad con el procedimiento
estándar usando ácido trifluoroacético para penetrar el péptido de
la resina y desbloquear los grupos de protección en las cadenas
laterales del aminoácido. Los péptidos lavados, extraídos y
penetrados se purificaron mediante HPLC y se caracterizaron por
espectrometría de masa y HPLC de fase inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inmunógenos del péptido A\beta derivados
se evaluaron en grupos de los conejillos de indias como se
especificó por el protocolo de inmunización experimental
posteriormente señalado y mediante las pruebas serológicas para la
determinación de la inmunogenicidad.
Diseño Experimental Estándar:
- Inmunógenos:
- (1) péptido inmunógeno individual o
- \quad
- (2) una mezcla de inmunógenos del péptido molar igual como se especifica en cada ejemplo.
- Dosis:
- 100 \mug en 0.5 ml por inmunización a menos que se especifique de otra manera
- Ruta:
- intramuscular a menos que se especifique de otra manera
- Adyuvantes:
- Adyuvante de Freund Completo (AFC)/Incompleto Adyuvante (IFA) o agua en emulsiones de aceite a menos que se especifique de otra manera. Los grupos AFC/IFA recibieron AFC en la semana 0, IFA en las semanas subsecuentes.
- Programa de dosis:
- 0, 3 y 6 semanas o especificado de otra manera.
- Programa de sangrado:
- semanas 0, 5, 8 o especificado de otra manera.
- Especies:
- conejillos de indias Duncan-Hartley o especificados de otra manera.
- Prueba:
- ELISAs específicas para cada actividad anti-péptido del suero inmune. El sustrato de fase sólida fue el fragmento del péptido A\beta es decir A\beta_{1-14} o la longitud completa del A\beta_{1-42} (SEC ID NOS: 67 y 65). La sangre se colectó y se proceso en el suero y se almaceno antes de ELISA con los péptidos blanco.
\vskip1.000000\baselineskip
Las inmunoreactividades de los anticuerpos
producidos en contra de los péptidos A\beta y en contra de los
péptidos A\beta_{1-42} solubles se determinaron
por ELISAs (pruebas inmunosorbentes de enzima unida) usando placas
de microconcentración de fondo plano de 96 pozos que se cubren con
los fragmentos del péptido A\beta_{1-42}, SEC ID
NOS: 67 ó 65 como el inmunosorbente. Las alícuotas (100 \muL) de
la solución del péptido inmunógeno en una concentración de 5
\mug/ml se incubaron por 1 hora en 37ºC. Las placas se bloquearon
mediante otra incubación a 37ºC por 1 hora con una solución de 3% de
gelatina/PBS. Las placas bloqueadas posteriormente se secaron y
usaron para la prueba. Las alícuotas (100 \mul) del suero inmune
de prueba, iniciando con una dilución de 1:100 en un estabilizador
de la dilución de muestra y diez veces la dilución en serie, se
agregaron a las placas cubiertas del péptido. Las placas se
incubaron por 1 hora a 37ºC.
Las placas se lavaron seis veces con
estabilizador PBS/Tween® al 0.05%. 100 \mul del anticuerpo
específico de las especies anti-cabra marcado con
peroxidasa de rábano agregado en diluciones apropiadas en
estabilizador de la dilución del conjugado (estabilizador de fosfato
que contiene 0.5 M de NaCl y suero de cabra normal). Las placas se
incubaron por 1 hora en 37ºC antes de ser lavadas como se estableció
anteriormente. Las alícuotas (100 \mul) de la solución del
sustrato de o-fenilenodiamina posteriormente se
agregaron. El color se permitió desarrollarse por
5-15 minutos antes de que se detuviera la reacción
de color enzimático mediante la adición de 50 \mul de 2N
H_{2}SO_{4}. El A_{492 \ nm} de los contenidos de cada pozo se
leyó en un lector de placas. Las concentraciones de ELISA se
calcularon con base en el análisis de regresión lineal de los
absorbentes con el corte del juego A_{492 \ nm} en 0.5. El valor
de corte seleccionado fue riguroso con los valores de las muestras
de control normal diluidas siendo menos de 0.15.
\vskip1.000000\baselineskip
Para diseñar una vacuna sintética total que
genere un alto nivel de los anticuerpos de alta afinidad en contra
de los péptidos A\beta con alta reactividad cruzada para los
péptidos A\beta_{1-42} soluble y las placas en
el cerebro de pacientes con EA, las inmunogenicidades relativas del
A\beta_{1-42} y sus fragmentos
N-terminal se caracterizaron inicialmente. Para
determinar las propiedades inmunológicas relativas de varias
regiones dentro del péptido A\beta_{1-42}, un
adyuvante suave apropiado para el uso con humanos, el alumbre se
empleó en el primer estudio. Las inmunogenicidades del péptido
A\beta_{1-42} y el fragmento
N-terminal del mismo, el
A\beta_{1-28} se comparó. La evaluación de la
inmunogenicidad se llevó a cabo de conformidad con los
procedimientos descritos en el Ejemplo 2. Inesperadamente, el
A\beta_{1-28} se encontró que era más
inmunogénico que el péptido A\beta_{1-42},
indicando que existe inmunosupresión dentro del fragmento
C-terminal A\beta_{29-42} (Tabla
5).
Subsecuentemente, las inmunogenicidades de
A\beta_{1-28} se compararon a
A\beta_{1-14}, un fragmento
N-terminal de A\beta_{1-42}. Un
adyuvante más potente apropiado para el uso humano (Montanide ISA51,
Seppic, Paris, FR) se empleó para la preparación de una emulsión de
agua en aceite para la formulación de la vacuna. Con base a los
datos obtenidos como se muestran en la Tabla 6, las
inmunogenicidades relativas para los tres péptidos A\beta (es
decir A\beta_{1-14},
A\beta_{1-28} y
A\beta_{1-42}) se alinearon
A\beta_{1-28} >
A\beta_{1-42} >
A\beta_{1-14}. Sorpresivamente, la pérdida de la
terminal C 14mer de A\beta_{1-42} mejoró más que
reducir la inmunogenicidad. La respuesta del anticuerpo en contra
del A\beta se dirigió primeramente a la región
N-terminal, particularmente el fragmento
N-terminal de A\beta_{1-14} como
se muestra por los datos de ELISA (Tabla 6). Sin embargo, un
acortamiento adicional del fragmento A\beta1-28 de
la terminal C para formar el fragmento
A\beta_{1-14} resultó en una pérdida en la
inmunogenicidad.
El fragmento A\beta_{1-14}
contiene el sitio regulatorio/funcional principal EFRH, ubicado en
las posiciones 3-6 del péptido
A\beta_{1-42} como se reportó por Solomon et
al. El bloqueo de este epítope por los anticuerpos modulo los
dinámicos de la agregación así como la resolubilización de los
agregados recientemente formados (Soloman et al., Proc
Natl Acad. Sci, 1996; 93:452-455; Proc Natl
Aca Sci 1997; 94:4109-4112). La mayoría de los
anticuerpos anti-A\beta_{1-28} y
A\beta_{1-42} se dirigen en contra del fragmento
N-terminal del péptido
A\beta_{1-42} que contiene este epítope (Tabla
6). Sin embargo, el fragmento A\beta_{1-14} por
si mismo fue pobremente inmunogénico. Los resultados de este
experimento sugieren la presencia de un epítope Th intrínseco dentro
del segmento A\beta_{15-28}. Este epítope Th
intrínseco cuenta para las inmunogenicidades modestas de los
péptidos A\beta_{1-28} y
A\beta_{1-42} en los conejillos de indias.
La presencia de un epítope Th en el fragmento
A\beta_{15-28} es deseable. Sin embargo, es
deseable ser capaz de producir un inmunogen más potente para una
vacuna humana exitosa cuando se enfrentó con la limitación de una
molécula MHC humana restringida, el número de dosis apropiadas y el
tipo de adyuvantes permitidos para el uso humano. Por consiguiente,
se intenta la unión de un Th extrínseco o extranjero tal como aquel
derivado del HBV Th (SEC ID NO: 1) para la terminal C del péptido
A\beta_{1-28} (SEC ID NO:66). El epítope pH
extrínseco mejoró significativamente la inmunogenicidad del
fragmento A\beta_{1-28} como se muestra en la
Tabla 6. La respuesta del anticuerpo al inmunogen producido por
ingeniería con el fragmento A\beta_{1-28}
permanece dirigido al fragmento N-terminal funcional
del péptido inmunógeno (SEC ID NO: 70) marcando este para construir
un mejor inmunogen que el fragmento
A\beta_{1-28} o el fragmento
A\beta_{1-42} solo. Este péptido inmunógeno (SEC
ID NO:70) representa un péptido inmunógeno con la fórmula:
(A)_{n} (fragmento
N-terminal del péptido
A\beta)-(B)_{o}-(Th)_{m}
en
donde:
A es \alphaNH_{2} con
A\beta_{1-28} siendo un fragmento
N-terminal del
A\beta_{1-42};
B es glicina;
Th es un epítope de la célula T auxiliar
derivada de un patógeno extranjero,
HbsAg Th (SEC ID NO. 1) y en donde n es 1, m es
1 y o es 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Dado Que el sitio regulador/funcional principal
que comprende los residuos EFRH se ubica en las posiciones
3-6 del péptido A\beta_{1-42}
(Soloman et al. Proc Natl Acad. Sci, 1996;
93:452-455; Proc Natl Aca Sci, 1997;
94:4109-4112) fue útil para explorar el fragmento
N-terminal más corto del péptido
A\beta_{1-42} como un sitio blanco de la célula
B óptimo en el A\beta para la incorporación en el inmunogen
sintético de la presente invención.
Cada uno de los varios fragmentos
N-terminales no inmunogénicos cortos de A\beta,
A\beta_{1-10},
A\beta_{1-12}, A\beta_{1-14}
junto con A\beta_{1-28} se incorpora en los
inmunógenos designados con un Th idealizado artificial
representativo (SEC ID NO:51). La unión se hizo a través de un
espaciador \varepsilonN-Lys. Las construcciones
producidas por ingeniería se formularon con fuertes adyuvantes
debido a la baja inmunogenicidad esperada de los fragmentos A\beta
cortos. Las tres construcciones sintéticas se formularon en el
adyuvante de Freud incompleto y completo y se probaron para sus
inmunogenicidades con base en los procedimientos descritos en el
Ejemplo 2. Como se muestra en la Tabla 7, todos los cuatro
inmunógenos del péptido fueron altamente inmunogénicos con las
concentraciones de ELISA Log_{10} en el rango de 4.3 a 5.6 [es
decir 10^{4.3} para 10^{5.6}] con altas reactividades cruzadas
para el péptido de longitud completa
A\beta_{1-42} después de solamente cuatro
semanas de la inmunización inicial. Los fragmentos más importantes
tan pequeños como el A\beta_{1-10},
A\beta_{1-12} y el
A\beta_{1-14}, cada uno unido al Th artificial
idealizado (SEC ID NO:51) se encontraron para ser altamente
inmunogénicos después de la unión de un epítope Th artificial
descrito (Tabla 7). Estos inmunógenos del péptido se designaron de
conformidad con la fórmula:
(A)_{n}-(fragmento
terminal N del péptido
A\beta)-(B)_{o}-(Th)_{m}
en
donde:
A es \alphaNH_{2}, en donde el fragmento
N-terminal es A\beta_{1-10},
A\beta_{1-12}, A\beta_{1-14}
o A\beta_{1-28};
B es \varepsilon-N lisina, un
espaciador unido a través de su grupo epsilon al siguiente
aminoácido;
Th es un epítope de la célula T auxiliar
derivada de un Th artificial idealizado, MVF Th1-16
(SEC ID NO:51), en donde n es 1, m es 1 y o es 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que la reducción adicional en la
longitud del fragmento N-terminal de A\beta para
disminuir más de 10mer resultaría en más limitada además de
inmunogenicidad indeseable. Parece que los péptidos más pequeños que
los 10 aminoácidos son problemáticos para el reconocimiento del
receptor mediante las moléculas MHC clase II (Immunology,
quinta edición, ed. Roitt et al., 1998; Mosby International
Ltd. Londres, pp88-89).
Con base a este estudio de A\beta, el sitio de
la célula B útil derivado de A\beta_{1-42}
debería estar en el rango de tamaño de aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 28 residuos.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento N-terminal no
inmunogénico tal como el A\beta_{1-14} del
péptido A\beta se unió a través de un espaciador
\varepsilonN-lisina para un péptido Th artificial
designado como MVF Th 1-16 (SEC ID NO:51) o a través
de un procedimiento de acoplamiento químico estándar para una
proteína portadora convencional HLO. Las dos construcciones
inmunogénicas se evaluaron en los conejillos de indias para sus
inmunogenicidades en "sitio dirigidas" relativas al péptido
A\beta y la reactividad respectiva resultante de los anticuerpos
hacia sus portadores respectivos, el epítope Th artificial o la
proteína portadora HLO, de conformidad con los procedimientos
descritos en el Ejemplo 2. El péptido
A\beta_{1-14} solo como un inmunogen de control
y las dos construcciones inmunogénicas se formularon en una emulsión
agua en aceite que contiene el adyuvante ISA51, una formulación que
es apropiada para el uso humano. Como se muestra en la Tabla 8, el
fragmento A\beta_{1-14}
N-terminal por si mismo no es inmunogénico como se
esperaba. El inmunogen sintético que comprende el fragmento
A\beta_{1-14} y el Th artificial (SEC ID NO:73)
se encontró que era altamente inmunogénico en la producción de
anticuerpos en sitio dirigidos para el
A\beta_{1-14}. Los anticuerpos también se
encontraron para ser altamente reactivos en forma cruzada para el
péptido A\beta_{1-42} soluble tan pronto como 4
semanas después de la inmunización inicial respectivamente). Cuando
estos sueros inmunes de la concentración alta reactiva A\beta se
probaron mediante ELISA en la placa cubierta con el péptido MVF
Th1-16 (SEC ID NO:51), se encontraron para ser
negativos (concentración Log_{10} de 0.038 y 0.064 por 4 a 6
semanas post inmunización inicial respectivamente) mostrando que no
se produjeron anticuerpos irrelevantes. Los datos obtenidos como se
muestran en la Tabla 8 claramente demostraron la característica de
sitio dirigida altamente específica del péptido inmunógeno de la
presente invención.
Los inmunógenos con la proteína portadora HLO se
encontraron para ser altamente inmunoreactivos con el conjugado de
la proteína portadora del péptido convencional (es decir
concentraciones Log_{10} de 4.903 y 5.018 por 4 a 6 semanas post
inmunización inicial respectivamente). Sin embargo, los anticuerpos
producidos fueron solamente moderadamente reactivos en forma cruzada
con el péptido A\beta_{1-42} soluble (es decir
con las concentraciones Log_{10} de 3.342 y 2.736 para 4 y 6
semanas post inmunización inicial respectivamente). Esto es
aproximadamente 10X para 100X menos que la SEC ID NO:73.
Inesperadamente, lo inmunógeno del péptido de la presente invención
fueron altamente enfocado y en sitio dirigidos. Solamente los
anticuerpos funcionalmente importantes hacia los sitios de
anti-agregación y disgregación en el fragmento
N-terminal del péptido A\beta se generaron más que
hacia los sitios portadores irrelevantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cerebros en pacientes con EA con placas y
ovillos y vasos sanguíneos positivos S de tioflavina (VSST) que
contienen las placas amiloides se usaron para la evaluación de las
reactividades cruzadas para las placas seniles poliméricas del suero
inmune elevado en conejillos de indias y mandriles en contra de los
inmunógenos del péptido A\beta. Las placas y las reactividades
VSST se detectaron mediante el marcado de inmunoperoxidasa usando el
método del Complejo del anticuerpo Avidina Biotinilado (CBA) o
mediante el marcado de inmunofluorescencia usando el fragmento Fab
conjugado de rodamina de las especies específicas
anti-IgG. Todo el suero de los conejillos de indias
se probó en una dilución de 1:100 con las concentraciones del punto
terminal determinadas por algunas de las muestras. Todo el suero de
los mandriles se probó en una dilución de 1:50. La evaluación del
suero inmune y preinmune fue benignamente realizada bajo código por
el Dr. Gaskin como se describió (Gaskin et al., J. Exp Med.
165:245, 1987).
En la Figura 1, las secciones transversales
seriales de los cerebros de los 2 pacientes con EA fueron examinados
inicialmente en un aumento de 10X. Las secciones (a), (b) y (c) son
del Cerebro del paciente 1 con EA y (d), (e) y (f) fueron del
cerebro del paciente 2 con EA. El suero inmune y el suero normal
preinmune de los conejillos de indias se colectaron en las 6 semanas
post inmunización inicial y se probaron mediante el marcado con
inmunoperoxidasa en las secciones criostato de la corteza temporal
de EA rica en placas y ovillos de neurofilamentos (NFT). El suero
inmune usado en el primer estudio mostrado en las diapositivas de
las Figuras 1a y 1d se obtuvieron de los animales inmunizados con
A\beta_{1-28}-\varepsilonK-MvF
Th1-16 (SEC ID NO:74) preparado en una emulsión agua
en aceite ISA51. Los resultados mostraron enlace significativo en
ambas placas seniles y las placas amiloides en los vasos sanguíneos
S positivos de tioflavina (VSST). Las reactividades cruzadas del
suero inmune elevadas en contra del inmunogen equivalente preparados
en el AFC/IAFC se mostraron en las diapositivas de las Figuras 1b y
1d. Inesperadamente, en contraste con los resultados obtenidos con
la vacuna formulada con ISA51, el enlace preferencial para las
placas A\beta_{1-28} en los vasos sanguíneos
(VSST) se observaron para el suero elevado en contra de la vacuna
AFC/IAFC. Esto significa que los anticuerpos producido por la vacuna
formulada con ISA51 es distinguible de los anticuerpos elevados por
la vacuna formulada en AFC/IAFC. Además, los anticuerpos generados
por las vacunas formuladas de conformidad con la presente invención
proporcionaron anticuerpos que tienen más alta reactividad cruzada
para las placas seniles en el tejido del cerebro. El suero
pre-inmune no proporcionó el macado en
correspondencia con las secciones seriales mostradas en las
diapositivas de las Figuras 1c y 1f.
El marcado de Inmunoperoxidasa adicional de las
secciones transversales en serie del cerebro 1 con EA con suero
inmune y preinmune en la dilución 1:100 se muestran en las Figuras
2a a 2e en un aumento de 40X. El suero obtenido de los animales
inmunizados con
A\beta_{1-28}-\varepsilonK-MVF
Th1-16 (SEC ID NO:74) preparado en emulsión de agua
en aceite ISA 51 marcó fuertemente las placas que forman un modelo
de centros como se muestra en las diapositivas de las Figuras 2a y
2d. De nuevo, sorpresivamente el marcado con el suero inmune
preparado en contra de la formulación AFC/IAFC correspondiente
proporcionó un modelo de marcado diferente en esas reactividades con
las placas que estuvieron predominantemente en los vasos sanguíneos
como se muestran en la Figura 2b más que con las placas en el tejido
del cerebro. El suero preinmune no marcó las secciones como se
muestra en la Figura 2c. El suero hiperinmune generado por la
inmunización con el péptido A\beta_{1-42} solo
en AFC/IAFC a pesar de sus fuertes reactividades con
A\beta_{1-28} por ELISA, proporcionó un modelo
de marcado sorpresivamente débil en la sección mostrada en la Figura
2e.
El inmunomarcado similar del tejido cerebral con
EA se realizó con el suero preinmune e inmune agrupado en 11
obtenido de loas conejillos de indias se inmunizó con varias
formulaciones de vacuna descritas en los Ejemplos 3, 4 y 5. Estos
sueros también se evaluaron para sus reactividades de anticuerpos
con el sitio funcional por ELISA A\beta_{1-14} y
con el A\beta_{1-42} soluble mediante ELISA
A\beta_{1-42} (Tabla 9). En general, se
encontraron tendencias paralelas con el suero probado en todas las
tres pruebas. Como se muestra en la Tabla 9, las reactividades del
anti-péptido del suero pre-inmune y
el suero elevado en contra del péptido
A\beta_{1-14} corto formulado solo en la
emulsión de agua en aceite ISA51 por ELISA fueron bajas y las
reactividades cruzadas de las placas fueron insignificantes. Las
reactividades modestas se encontraron con el suero de loas animales
vacunados con el péptido A\beta_{1-28} solo
formulado con Alumbre y en ISA51 y el
A\beta_{1-14} conjugado con HLO y formulado en
ISA51. Puesto que, las reactividades dirigidas en sitio
significantes para el sitio A\beta_{1-14}
funcional para el A\beta soluble y para las placas y el VSST en
las secciones de tejido cerebral en pacientes con EA se encontraron
con el suero de los animales inmunizados con los inmunógenos
Th/A\beta sintéticos de la presente invención. Los resultados
obtenidos de estos estudios, por lo tanto demostraron excelente y
útil inmunogenicidad de los inmunógenos del péptido que comprende el
fragmento N-terminal del
A\beta_{1-42} teniendo aminoácidos de
1-28 a aproximadamente 1-10 unido a
los epítopes Th extranjeros. Además, los resultados mostraron que la
presencia de un epítope Th extranjero mejora la inmunogenicidad de
los inmunógenos del péptido de la presente invención a una extensión
sorprendente. Los inmunógenos del péptido de la presente invención
en las formulaciones de la vacuna clínicamente aceptables para
usarse en los anticuerpos generados por los humanos que tienen la
reactividad cruzada deseada para las placas seniles en los tejidos
cerebrales de los pacientes con EA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se colectó un inmunogen sintético
representativo,
A\beta_{1-28}-\varepsilon-K-MvF
Th1-16 (SEC ID NO:74), formulado en la emulsión agua
en aceite ISA51 en los niveles de dosis de 25 ug/0.5 ml, 100 ug/0.5
ml y 400 ug/0.5 ml se les dieron a tres mandriles Y299, X398, X1198
en un programa de 0, 3 y 6 semanas post inmunización inicial (spi).
Por comparación a un cuarto mandril X798 se le dieron dosis de 100
ug/0.5 ml de una mezcla equimolar de los péptidos libres
A\beta_{128} y A\beta_{1-42} formulados en
alumbre, el adyuvante estándar aprobado para el uso humano. El suero
preinmune se usó como el control negativo.
El suero de todos los cuatro animales
inmunizados se colectó y se evaluó por sus reactividades al
anticuerpo con el sitio funcional mediante ELISA
A\beta_{1-14} y para las reactividades con el
A\beta_{1-42} mediante
A\beta_{1-42} (para el suero colectado en 0, 5 y
8 spi). Las reactividades cruzadas del anti-suero
(solamente 8 spi) con las placas seniles y las placas en los vasos
sanguíneos S positivos de tioflavina se evaluaron por el
inmunomarcado como se describió en el Ejemplo 6. En lugar de usar el
Ig anti-mandril, el detector de anticuerpos usado es
un fragmento Fab del IgG anti-humano que reconoce
todos los isotipos humanos y es reactivo en forma cruzada con el IgG
de mandril.
De nuevo las tendencias paralelas se encontraron
con el suero probado en todas las tres pruebas. Como se muestra en
la Tabla 10, el suero pre-inmune fue negativo. Las
reactividades de ELISA modestas se encontraron con el suero del
animal X798 activado con A\beta_{1-28} y
A\beta_{1-42} formulado en Alumbre. Sin embargo,
la reactividad de este suero fue débil para el reconocimiento de las
placas seniles. En contraste, las reactividades en sitio dirigidas
significantes para el sitio funcional de
A\beta_{1-14} para el
A\beta_{1-42} y las placas y VSST en secciones
cerebrales de pacientes con EA se encontraron con el suero colectado
en las 8 semanas post inmunización inicial de los animales
inmunizados con la composición representativa de la invención (SEC
ID NO:74) en ambas dosis de 100 ug/0.5 ml y 400 ug/0.5 ml formuladas
con ISA51. Los resultados obtenidos de este estudio en mandriles,
por lo tanto demostró la utilidad del inmunogen de la presente
invención en una formulación de vacuna apropiada para los humanos.
La mejora en la inmunogenicidad (incremento de 10 a 100X en las
concentraciones del anticuerpo específico para el sitio funcional de
A\beta) es muy significante en comparación con la vacuna del
péptido del arte previo con la sensibilidad inmune en los mandriles
muy parecido con la de los humanos.
Similarmente, una mezcla que contiene dos o tres
inmunógenos sintéticos de la presente invención pueden usarse para
la formulación en las vacunas en desde aproximadamente 25 a 1000 ug
por dosis para producir los anticuerpos
anti-A\beta_{1-14} funcionales
en las poblaciones humanas genéticamente diversas para la prevención
y tratamiento de la EA. Se espera inmunogenicidad amplia en humanos
debido a la presencia de un epítope Th promiscuo en el péptido
inmunógeno de la invención que se proporciona para llevar a cabo el
reconocimiento amplio de MHC.
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<110> Wang, Chang Yi
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<120> Composición de péptido inmunógeno
como vacunas para la prevención y tratamiento del Alzheimer
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<130> 1151-4167
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<140> TBA
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<141>
2001-5-25
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<160> 76
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Virus de la Hepatitis B
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<212> PRT
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<212> PRT
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<213> Pertusaria trachythallina
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<212> PRT
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<213> Virus del Sarampión
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<213> Clostridium tetani
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<213> Diphtheria
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<213> Plasmodium falciparum
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<213> Schistosoma mansoni
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<213> Escherichia coli
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<213> Escherichia coli
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Virus de la Hepatitis B
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<213> Virus del Sarampión
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
<2Í3> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la Hepatitis B
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del Sarampión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
Claims (6)
1. Un péptido inmunógeno representado por una de
las siguientes fórmulas:
- \quad
- (A)_{n}-(fragmento N-terminal del péptido A\beta_{1-42})-(B)_{o}-(Th)_{m}-X {}\hskip0.5cm ó
- \quad
- (A)_{n}-(Th)_{m}-(B)_{o}-(fragmento N-terminal del péptido A\beta_{1-42})-X;
en
donde
cada A es independientemente un aminoácido;
Th es el epítope de la célula T de SEC ID NO:
1;
el fragmento N-terminal del
péptido A\beta_{1-42} es el péptido de SEC ID
NO: 67;
cada B es un grupo de enlace seleccionado del
grupo que consiste de gly-gly, (\alpha,
\varepsilon-N)Lys,
Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro;
X es un \alpha-COOH o
\alpha-CONH_{2} de un aminoácido;
n es desde 0 a aproximadamente 10;
m es desde 1 a aproximadamente 4 y
o es desde 0 a aproximadamente 10.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un péptido inmunógeno de conformidad con la
reivindicación 1, en donde el espaciador es
Gly-Gly.
3. Un péptido inmunógeno de conformidad con la
reivindicación 1, en donde el espaciador es
\varepsilon-N-Lys.
4. Un péptido inmunógeno de conformidad con la
reivindicación 1, en donde el espaciador es
Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro.
5. Una composición que comprende un péptido
inmunógeno de conformidad con la reivindicación 1 a 4 y un adyuvante
y/o portador farmacéuticamente aceptable.
6. El uso de la composición de la reivindicación
5 para la preparación de un medicamento para la prevención o
tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer.
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