ES2349172T3 - Polipéptidos y ácidos nucleicos que los codifican. - Google Patents

Abstract

Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos, cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y cuya secuencia de ácidos nucleicos (a) hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y/o (b) tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 de al menos un 48%, como se determina por el programa align usando la matriz de identidad por defecto, una penalización de -16 para el primer residuo de un espacio y penalizaciones de -4 para posteriores residuos de un espacio; con la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos no sea de la SEC ID NO:3, no sean los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO:3, y no sean los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 estando los polinucleótido operativamente vinculados a una o más secuencias de control que dirijan la producción del polipéptido en una célula huésped de Bacillus, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

Description

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Polipéptidos y ácidos nucleicos que los codifican.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso no terapéutico de determinados polipéptidos aislados en pienso, por ejemplo para mejorar el Coeficiente de Conversión de Alimentos (FCR) y/o para modular la microflora intestinal. Un ejemplo de un polipéptido de la invención es la así llamada proteína L12 de Bacillus licheniformis ATCC 14580, la cual tiene aquí la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos +1 a +85 de la SEC ID NO:2 (en cuanto a que sigue a los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2). La invención también se refiere al uso probiótico no terapéutico en pienso de cepas de Bacillus las cuales producen proteínas relacionadas con L12.

Antecedentes de la invención Estado de la técnica

WO 960739 expone el uso de una combinación de (i) una xilanasa, (ii) una proteasa, y opcionalmente una \beta-glucanasa en aditivos alimenticios. En el aditivo la proporción de actividad xilanasa por g de aditivo alimenticio con respecto a la actividad \beta-glucanasa por g de aditivo alimenticio es de 1:0-0,25. En WO 960739 se afirma que la inclusión de este aditivo alimenticio enzimático mejora la digestión del animal.

WO 03/093453 expone, en el Ejemplo 1, el diseño de una célula huésped de Bacillus licheniformis mejorada la cual no produce una pequeña proteína extracelular codificada por los nucleótidos 601 a 978 de la SEC ID NO:133 de WO 03/093453, teniendo la proteína la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:134 de WO 03/093453. Las SEC ID Nos. 133 y 134 de WO 03/093453 están incluidas en el presente listado de secuencias como las SEC ID Nos. 3 y 4, respectivamente. La secuencia de aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 aquí es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí. WO 03/093453 no revela un polipéptido aislado teniendo los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2. WO 03/093453 tampoco revela una secuencia de ácidos nucleicos aislada teniendo los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1.

La accesión GenPept nº. YP_081375 es una proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580. La accesión GenPept nº. YP_081375 es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí. La secuencia de la proteína hipotética BL00275 de Bacillus licheniformis ATCC 14580 también se ha introducido en UniProtKB/TrEMBL con el número de accesión primario Q65CU4. Esta secuencia también es idéntica a los aminoácidos -41 a +85 de la SEC ID NO:2 aquí.

La secuencia de nucleótidos codificando YP_081375 tiene la accesión GenBank nº. NC_006270. La accesión GenBank no. NC_006270 es idéntica a los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 aquí.

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que los polipéptidos relacionados con parte de esta secuencia hipotética de Bacillus licheniformis, es decir, los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, tienen un gran potencial para su uso en pienso.

La accesión SWISSPROT no. Q8DQM5 es una proteína spr0600 hipotética de 115 aminoácidos de Streptococcus pneumoniae (cepa ATCC BAA-255/R6). La secuencia también se describe en "Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6" por Hoskins et al, J. Bacteriol. 183:5709 (2001). Q8DQM5 no comprende una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2.

Martinez et al, Microbiology (1999), vol. 145, págs. 3155-3161 revela, en la Fig. 3, la secuencia de 91 aminoácidos deducida de la prebacteriocina lactococcin 972 con una parte madura predicha C-terminal de 66 aminoácidos. El porcentaje de identidad de cada uno de los prepolipéptidos y los polipéptidos maduros con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es inferior al 33%.

Una búsqueda de bases de datos de nucleótidos con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 (la cual codifica los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2) reveló un fragmento de ADN con un 47% de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1. Este fragmento es parte de una secuencia resultante de un proyecto de secuenciación aún en curso. El organismo del cual deriva el fragmento se llama cepa 10 de Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus. El trabajo de secuenciación se hace en la Universidad de Oklahoma (http://www.genome.ou.edu/.bstearo.html). No hay ninguna publicación de alguna de las secuencias de aminoácidos correspondiendo potencialmente a este fragmento de ADN, y por lo tanto tampoco ninguna indicación de alguna utilidad potencial de cualquier secuencia de aminoácidos codificada.

Un producto probiótico mezclado con la comida designado como BioPlus^{TM}2B está a la venta a través de Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Allé, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca. El producto contiene una cepa de Bacillus licheniformis la cual no obstante no produce una proteína relacionada con L12 (véase el Ejemplo 6 aquí).

Es un objetivo de la presente invención el proporcionar cepas especiales de Bacillus, así como métodos no terapéuticos para el uso de los polipéptidos y de las cepas de Bacillus en pienso.

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Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso no terapéutico de polipéptidos aislados seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 (b) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%; como se ha determinado por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y (c) un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); (c) dentro de pienso.

La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huésped comprendiendo las secuencias de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos en pienso.

La presente invención además se refiere al uso en pienso de una cepa de Bacillus la cual es positiva en la prueba del Ejemplo 6 aquí, es decir, el ADN del cual, cuando se recoge y se usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID Nos: 6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

Descripción detallada de la invención El Polipéptido, sus Características, y Uso

La invención se refiere al uso no terapéutico en pienso de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos con un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c)

un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii) así como el uso de cualquiera de estas en la preparación de una composición para su uso en pienso. Estos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y/o modulando la microflora intestinal.

Un polipéptido a usar en la presente invención puede ser un polipéptido bacteriano o fúngico. En una segunda forma de realización particular, el polipéptido es un polipéptido bacteriano Gram positivo tal como un polipéptido de Bacillus o una variante del mismo, por ejemplo un polipéptido de Bacillus licheniformis por ejemplo derivado de Bacillus licheniformis ATCC 14580, que es la cepa tipo de Bacillus licheniformis y está disponible bajo pedido a través de la American Type Culture Collection, ATCC. Cepas preferidas de Bacillus licheniformis son positivas en la prueba del ejemplo 6 aquí, tal como las siguientes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, y ATCC 53757.

El polipéptido mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y/o modulando la microflora intestinal. En formas de realización alternativas, el polipéptido mejora la digestibilidad del pienso, y/o mantiene la salud del animal ayudando a una digestión apropiada y/o manteniendo la función del sistema inmunológico.

El FCR se puede determinar en base a una prueba de crecimiento del pollo de engorde comprendiendo un primer tratamiento en el cual el polipéptido se añade al pienso en una concentración de 5 mg por kg de pienso, y un segundo tratamiento (control) sin adición del polipéptido en el pienso, consistiendo cada tratamiento en 8 grupos de 6 pollos machos, siendo alimentados los pollos con gránulos de una dieta de maíz/SBM48 ad libitum, calculándose el FCR como el consumo de pienso en g/ave en relación al aumento de peso en g/ave durante los días 8-29 de la prueba, mejorando el FCR del primer tratamiento en relación al FCR del segundo tratamiento. En una forma de realización particular la prueba de crecimiento es una prueba en jaula. Para más detalles, véase el Ejemplo 5.

El FCR también se puede determinar en base a una prueba de crecimiento de pollos de engorde comprendiendo un primer tratamiento en el cual el polipéptido se añade al pienso en una concentración de (i) 2,5, (ii) 5,0, ó (iii) 7,5 mg por kg de pienso, y un segundo tratamiento (control) sin adición del polipéptido en el pienso, consistiendo cada tratamiento en 10 grupos de 6 pollos machos, siendo alimentados los pollos con una dieta de maíz/SBM48 ad libitum, calculándose el FCR como el consumo de pienso en g/ave en relación al aumento de peso en g/ave al día 8-29 de la prueba, mejorándose el FCR para el primer tratamiento en relación al FCR del segundo tratamiento. En una forma de realización particular la prueba de crecimiento es una prueba en jaula. Para más detalles, véase el ejemplo 9.

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El FCR también se puede determinar en base a una prueba de crecimiento de pollos de engorde comprendiendo un primer tratamiento en el cual el polipéptido se añade al pienso en una concentración de 7,5 mg por kg de pienso, y un segundo tratamiento (control) sin adición del polipéptido en el pienso, consistiendo cada tratamiento en 12 grupos de 20 pollos (6 grupos de 20 hembras, 6 grupos de 20 machos), alimentándose los pollos con gránulos de una dieta basada en trigo, centeno y harina de soja ad libitum, calculándose el FCR como el consumo de pienso en g/ave en relación al aumento de peso en g/ave durante los días 1-36 de la prueba, mejorándose el FCR para el primer tratamiento en relación al FCR del segundo tratamiento. En una primera forma de realización particular los pollos se alojan en gallineros con el suelo cubierto de virutas de madera. En una segunda forma de realización particular los pollos se alimentan con una dieta de iniciación en el periodo de los días 1-22 y una dieta de engorde en el periodo de los días 22-36, ambas basadas en trigo, centeno y harina de soja, y con una composición como se muestra en la Tabla 9. Para más detalles, véase el Ejemplo 12.

Como se conoce generalmente, un FCR mejorado es inferior al FCR de control. En formas de realización particulares, el FCR se mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control en al menos un 1,0%, preferiblemente al menos un 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, o al menos un 2,5%. En otras formas de realización particulares, el FCR se mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control en al menos un 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, o al menos un 3,0%. En otras formas de realización particulares, el FCR se mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control

\hbox{en al menos un 3,1%, 3,2%,
3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%,  o al menos un 3,8%.}

El término "intestino" como se usa aquí designa el tracto gastrointestinal o digestivo (también referido como el tubo digestivo) y éste se refiere al sistema de órganos dentro de animales pluricelulares que toma alimentos, los digiere para extraer energía y nutrientes, y expele los residuos restantes. El intestino se puede dividir en tracto gastrointestinal superior e inferior, el primero comprendiendo la boca y el estómago, y el segundo comprendiendo los intestinos. Los intestinos se pueden dividir en intestino delgado y grueso. Los componentes básicos del intestino delgado, no obstante con diferencias entre las especies animales, son duodeno, yeyuno, e íleon. Los componentes básicos del intestino grueso son intestino ciego, colon y recto (cloaca).

El término "microflora" intestinal como se usa aquí se refiere a los cultivos microbianos naturales residiendo en el intestino y manteniendo la salud ayudando en la digestión apropiada y/o manteniendo la función del sistema inmunológico.

El término "modular" como se utiliza en este caso en relación con la microflora intestinal generalmente significa cambiar, manipular, alterar, o ajustar la función o estado de la misma en un animal saludable y con funciones normales, es decir un uso no terapéutico. La modulación es en respuesta a los polipéptidos y/o las cepas de Bacillus de la invención.

Los siguientes son ejemplos particulares no limitativos del efecto de la modulación de la microflora intestinal obtenido por el polipéptido de la invención (cambios en comparación con un control sin el polipéptido) - para más detalles, véase el Ejemplo 8:

(i)

un aumento en el número total de bacterias anaeróbicas facultativas in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de engorde, preferiblemente determinado después del cultivo de contenidos ileo-rectales y/o cecales, respectivamente, en Brucella agar suplementado con un 5% vol/vol de sangre de oveja tras incubación en una cámara anaeróbica a 37ºC durante cinco días;

(ii)

un aumento en el número de Escherichia coli in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de engorde, preferiblemente determinado después del cultivo de contenidos ileo-rectales y/o cecales, respectivamente, en medios cromogénicos Coli-ID, aeróbicamente, a 37ºC durante 24 horas;

(iii)

ningún cambio sustancial, o un aumento, en el total de bacterias de ácido láctico in vivo, por ejemplo en lechones y/o pollos de engorde, preferiblemente determinado después del cultivo de contenidos ileo-rectales y/o cecales, respectivamente, en MRS agar, en una cámara anaeróbica, a 37ºC durante 48 horas;

(iv)

ningún cambio sustancial en el total de Lactobacillus spp. in vivo, por ejemplo en lechones, preferiblemente determinado después del cultivo de contenidos ileo-rectales en Rogosa agar, en una cámara anaeróbica a 37ºC durante 48 horas;

(v)

una reducción en el número de otras Enterobacteriaceae (diferentes de E. coli) in vivo, por ejemplo en lechones, preferiblemente determinada después del cultivo de contenidos ileo-rectales en un medio cromogénico de Coli-ID, aeróbicamente, a 37ºC durante 24 horas;

(vi)

una reducción en el número de Enterococcus spp. in vivo, por ejemplo en lechones, preferiblemente determinada después del cultivo de contenidos ileo-rectales en un Enterococci agar, aeróbicamente, a 37ºC durante 48 horas; y/o

(vii)

una reducción en la frecuencia con la cual ocurre el Clostridium perfringens in vivo, por ejemplo en lechones, preferiblemente determinada después del cultivo de contenidos ileo-rectales en TSN agar después del calentamiento de la muestra a 80ºC durante 10 min, en una cámara anaeróbica a 46ºC durante 24 horas.

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Además, también en relación al efecto de la modulación de la microflora intestinal, y con referencia a un control sin el polipéptido de la invención, el polipéptido preferiblemente:

(iix)

es más activo in vitro contra cocos Gram positivos que contra bacterias Gram negativas, es decir, exhibiendo una reducción más fuerte de lo primero, por ejemplo para cocos Gram positivos y bacterias Gram negativas aisladas a partir de contenido intestinal de lechones y/o pollos de engorde;

(ix)

es más activo in vitro contra Clostridium spp., por ejemplo Clostridium perfringens, que contra bacterias Gram negativas, es decir, exhibiendo una reducción más fuerte del primero, por ejemplo para Clostridium perfringens y bacterias Gram negativas aisladas a partir de contenido intestinal de lechones y/o pollos de engorde;

(x)

no influye sustancialmente sobre el crecimiento in vitro de microorganismos provechosos, tales como bacterias, por ejemplo como las aisladas a partir de contenido intestinal de lechones y/o pollos de engorde; y/o (xi) influye sustancialmente, por ejemplo reduce, el crecimiento in vitro de microorganismos nocivos, tales como bacterias, por ejemplo como las aisladas a partir de contenido intestinal de lechones y/o pollos de engorde.

Para detalles en relación a las formas de realización (iix)-(xi), por favor véase la última parte del Ejemplo 8.

En la forma de realización (x), los microorganismos provechosos se seleccionan preferiblemente de Lactobacillus spp., tales como Lactobacillus salivarius DSM 18070, para el cual el MIC_{90} es al menos 1.000 microgramos/ml, preferiblemente al menos 2.000, 3.000, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, o al menos 7.000 microgramos/ml, en particular al menos 4.170 microgramos/ml.

Por consiguiente, el polipéptido tiene un MIC_{90} contra Lactobacillus salivarius DSM 18070 de al menos 1.000 microgramos/ml, preferiblemente al menos 2.000, 3.000, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, o al menos 7.000 microgramos/ml, en particular al menos 4.170 microgramos/ml.

En la forma de realización (xi), los microorganismos nocivos se seleccionan preferiblemente de Enterococcus, Stafilococcus, Clostridium (preferiblemente Clostridium perfringens); tales como Enterococcus faecalis DSM 18047, para el cual el MIC_{90} es menor de 4.000 microgramos/ml, preferiblemente menor de 3.000, 2.000, 1.000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, o menor de 70 microgramos/ml, preferiblemente un MIC_{90} de 50-80, más preferiblemente 60-70 microgramos/ml.

Por consiguiente, el polipéptido tiene un MIC_{90} contra Enterococcus faecalis DSM 18047 menor de 4.000 microgramos/ml, preferiblemente menor de 3.000, 2.000, 1.000, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, o menor de 70 microgramos/ml, preferiblemente un MIC_{90} de 50-80, más preferiblemente 60-70 microgramos/ml.

MIC_{90} designa la concentración inhibitoria mínima requerida para la inhibición del crecimiento del 90% de los organismos. Para los presentes objetivos, MIC_{90} se define como la concentración del polipéptido que se requiere para reducir la densidad del cultivo, determinada como OD_{595}, en un 90% en relación a un control sin el polipéptido. OD_{595} se determina tras la incubación bajo condiciones de incubación apropiadas (que dependen del organismo en cuestión, como se muestra en la Tabla 5 del Ejemplo 8). La determinación de MIC_{90} se puede hacer mediante un método de dilución de caldo por microtitulación, usando aproximadamente 10^{5} CFU/ml de las bacterias puras en caldo de tripticasa-soja, añadiendo el polipéptido en series de diluciones de 2 capas, usando agua como control. Para más detalles, véase el Ejemplo 8. MIC_{90} se indica aquí generalmente en las unidades de microgramos del polipéptido puro por ml (microgramos/ml).

En otras formas de realización particulares, el polipéptido:

(xii)

tiene un MIC_{90} para un bacteria Gram negativa, tal como una cepa de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Salmonella enteritidis, salmonella typhimurium, o Proteus mirabilis, la cual es al menos un 50% mayor que un MIC_{90} para un coco Gram positivo, tal como una cepa de Enterococcus o Estafilococcus, por ejemplo Enterococcus faecalis, preferiblemente Enterococcus faecalis DSM 18047 - en sub-formas de realización preferidas de lo mismo, el MIC_{90} del primero es preferiblemente al menos un 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, o al menos un 500% mayor que el MIC_{90} del último.

En una cuarta forma de realización particular (véase el Ejemplo 11 para más detalles), el polipéptido en su forma nativa (es decir, no desnaturalizada), no está degradado por (i) pepsina (pH 3.5, 40ºC, 2 horas); (ii) pancreatina (pH 7.0, 40ºC, 4 horas); y/o (iii) pepsina-seguida-por-pancreatina (pepsina a pH 3.5, 40ºC, 2 horas - seguida de pancreatina a pH 7.0, 40ºC, 4 horas) - para todas las formas de realización (i)-(iii) como se considera por SDS-PAGE (véase el Ejemplo 10).

En una quinta forma de realización particular (véase el Ejemplo 7 para más detalles), el polipéptido tiene las siguientes temperaturas de desnaturalización, como se determina por Calorimetría por análisis diferencial (DSC): (i) al menos 54ºC a pH 2.5, (ii) al menos 68ºC a pH 4.0, y/o (iii) al menos 59ºC a pH 7.0; preferiblemente (iv) 55ºC a pH 2.5; (v) 69ºC a pH 4.0; y/o (vi) 60ºC a pH 7.0.

Identidad e Hibridación, Fragmentos y Variantes

La relación entre dos secuencias de aminoácidos se describe por el parámetro "identidad".

Para objetivos de la presente invención, la alineación de dos secuencias de aminoácidos se determina usando el programa Needle del paquete EMBOSS (http://emboss.org) versión 2.8.0. El programa Needle implementa el algoritmo de alineación global descrito en Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. mol. Biol. 48, 443-453. La matriz de sustitución usada es BLOSUM62, la penalización de abertura de espacio es 10, y la penalización de extensión de espacio es 0,5.

El grado de identidad entre una secuencia de aminoácidos para su uso según la presente invención ("secuencia de la invención"; por ejemplo los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, y una secuencia de aminoácidos diferente ("secuencia extraña") se calcula como el número de correspondencias exactas en una alineación de las dos secuencias, dividido por la longitud de la "secuencia de la invención" o la longitud de la "secuencia extraña", la que sea más corta. El resultado se expresa en identidad en porcentaje.

Una correspondencia exacta ocurre cuando la "secuencia de la invención" y la "secuencia extraña" tienen residuos de aminoácidos idénticos en las mismas posiciones del recubrimiento (en el ejemplo de alineación de debajo se representa mediante "I"). La longitud de una secuencia es el número de residuos de aminoácidos en la secuencia (p. ej. la longitud de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es de 85).

En el ejemplo de alineación puramente hipotético de debajo, el recubrimiento es la secuencia de aminoácidos "HTWGER-NL" de la Secuencia 1; o la secuencia de aminoácidos "HGWGEDANL" de la Secuencia 2. En el ejemplo un espacio se indica mediante un "-".

Ejemplo de alineación hipotético:

1

El porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido con, o hacia, los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 se determina i) alineando las dos secuencias de aminoácidos usando el programa Needle, con la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5; ii) contando el número de correspondencias exactas en la alineación; iii) dividiendo el número de correspondencias exactas por la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos, y iv) convirtiendo el resultado de la división de iii) en porcentaje. En el ejemplo hipotético de arriba, el número de correspondencias exactas es 6, la longitud de la más corta de las dos secuencias de aminoácidos es 12, por consiguiente el porcentaje de identidad es un 50%.

Como alternativa, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, al igual que el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, se determina por el programa "Align" el cual es una alineación Needleman-Wunsch (es decir, una alineación global). El programa se usa para la alineación de polipéptidos, al igual que de secuencias de nucleótidos. La matriz de puntuación por defecto BLOSUM50 se usa para alineaciones de polipéptidos, y la matriz de identidad por defecto se usa para alineaciones de nucleótidos. La penalización para el primer residuo de un espacio es de -10 para polipéptidos y de -16 para nucleótidos. Las penalizaciones para otros residuos de un espacio son de -2 para polipéptidos, y de -4 para nucleótidos. "Align" es parte de la versión v20u6 del paquete FASTA (véase W. R. Pearson y D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis" PNAS 85:2444- 2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology 183:63-98). Los alineamientos de proteínas FASTA usan el algoritmo Smith-Waterman sin limitación en el tamaño de espacio (véase "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith y M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197). Véase también Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17.

En formas de realización preferidas, el grado de identidad para los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es de al menos un 35%, o al menos un 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, o al menos un 99%. Los polipéptidos con cualquiera de estos grados de identidad para los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 se refieren como polipéptidos homólogos. En una forma de realización alternativa, el grado de identidad para los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es del
32%.

En formas de realización particulares, los polipéptidos comprenden (o tienen, o consisten en) una secuencia de aminoácidos que difiere por (i) 57, 55, 50, 45, 40, 35, 30, ó 25 aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o por (ii) 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, ó 11 aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o por (iii) 10, 9, 8, 7, 6, ó 5 aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2. En otra forma de realización particular, los polipéptidos comprenden (o tienen, o consisten en) una secuencia de aminoácidos que difiere por 4, 3, ó 2 aminoácidos, o por 1 aminoácido de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2.

Un fragmento de, por ejemplo, los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 es un polipéptido teniendo uno o más aminoácidos delecionados del terminal amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. En una forma de realización un fragmento contiene al menos 30, 35, 40, 45, 50, o al menos 55 aminoácidos. En otra forma de realización un fragmento contiene al menos 65 residuos de aminoácidos, o al menos 70 residuos de aminoácidos, o al menos 75 residuos de aminoácidos, o al menos 80 residuos de aminoácidos, o al menos 81 residuos de aminoácidos, o al menos 82 residuos de aminoácidos, o al menos 83 residuos de aminoácidos, o al menos 84 residuos de aminoácidos.

Una variante alélica denota cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen ocupando la misma localización cromosómica. La variación alélica surge naturalmente a través de mutación, y puede resultar en un polimorfismo dentro de poblaciones. Las mutaciones genéticas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos teniendo secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

La presente invención también se refiere al uso de polipéptidos aislados que están codificados por secuencias de ácidos nucleicos que hibridizan bajo condiciones de astringencia medias, o medias-altas, o altas, o muy altas con una sonda de ácidos nucleicos que hibridiza bajo las mismas condiciones con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i), o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York). En una forma de realización particular la sonda de ácidos nucleicos se selecciona de entre las secuencias de ácidos nucleicos de (i), (ii), o (iii) de arriba.

La subsecuencia de los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 puede ser de al menos 100 nucleótidos, o en otra forma de realización de al menos 50, 150, ó 200 nucleótidos.

La secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 o una subsecuencia de la misma, al igual que la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma, se puede usar para diseñar un sonda de ácido nucleico para identificar y clonar ADN codificando polipéptidos teniendo un potencial para el uso en pienso de cepas de diferente género o especie según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo procedimientos de Southern blotting estándares, con el fin de identificar y aislar el gen correspondiente aquí. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 35 nucleótidos de longitud. También se pueden usar sondas más largas. Se pueden usar ambas sondas de ADN y ARN. Las sondas están típicamente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S, biotina, o avidina). Tales sondas están comprendidas por la presente invención.

Así pues, una biblioteca genómica de ADN o ADNc preparada a partir de tales otros organismos se puede seleccionar para ADN que hibridice con las sondas anteriormente descritas y que codifique un polipéptido teniendo la actividad deseada. El genómico u otro ADN a partir de tales otros organismos se puede separar por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado se puede transferir a e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEC ID NO:1 o una subsecuencia de la misma, el material portador se usa en una Southern blot. Para los objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucleicos hibridiza a un sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEC ID NO:1, su cadena complementaria, o una subsecuencia de la misma, bajo condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico hibridiza bajo estas condiciones se detectan usando una película radiográfica.

En una forma de realización particular, la sonda de ácidos nucleicos es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, o subsecuencias de las mismas. En otra forma de realización, la sonda de ácido nucleico es de los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 (la región codificante de polipéptidos maduros de la SEC ID NO:1).

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, condiciones de astringencia de muy bajas a muy altas se definen como prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X de SSPE, 0,3% de SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y o bien 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, 35% de formamida para astringencias medias y medias-altas, o 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, siguiendo los procedimientos Southern blotting estándares.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador finalmente se lava tres veces cada vez durante 15 minutos usando 2 X de SSC, 0,2% de SDS preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta), y de la forma más preferible al menos a 70ºC (astringencia muy alta).

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridación, hibridación, y lavando de post-hibridación a entre 5ºC y 10ºC por debajo de la T_{m} calculada usando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl a pH 7.6, 6 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, 1X de solución de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP, y 0,2 mg de levadura ARN por ml siguiendo procedimientos de Southern blotting estándar.

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador se lava una vez en 6X de SSC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces de 15 minutos cada una usando 6X de SSC a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada.

La presente invención también se refiere al uso de variantes del polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 por una inserción o deleción de uno o más residuos de aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por diferentes residuos de aminoácidos. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos son de una naturaleza menor, puesto que son las sustituciones de aminoácido conservador las que no afectan significativamente al desarrollo y/o a la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina de amino-terminal; un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina.

Ejemplos de sustituciones conservadoras están en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Por consiguiente, por ejemplo, la invención se refiere a un polipéptido teniendo, o comprendiendo, una secuencia como la que se expone en la SEC ID NO:2, preferiblemente la parte madura de la misma, donde las sustituciones de aminoácidos conservadoras comprenden reemplazos, uno por otro, entre los aminoácidos básicos (arginina, lisina y histidina), entre los aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), entre los aminoácidos polares (glutamina y asparagina), entre los aminoácidos hidrofóbicos (alanina, leucina, isoleucina, y valina), entre los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y entre los aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina), o cualquier combinación de los mismos, o fragmento activo de los mismos.

Tal y como se define aquí, un polipéptido "aislado" o "puro" es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos, por ejemplo, al menos un 80% puro, preferiblemente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, o al menos un 90% puro, más preferiblemente al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, o al menos un 96% puro, como se determina por la SDS-PAGE (p. ej., por coloración de Coomassie y el escaneo posterior por métodos conocidos en la técnica - véanse los Ejemplos 2 y 4). La pureza también se puede determinar por HPLC, preferiblemente por RP-HPLC (p. ej., usando una columna Waters \mu-Bondapak C18, Fase móvil A: 0,1% de TFA, Fase móvil B: Acetonitrilo + 0,1% de TFA, detección a 280 nm - véase el Ejemplo 10). La pureza de SDS-PAGE, al igual que la pureza de HPLC, se refiere a la cantidad del polipéptido de la invención, en relación a la cantidad de proteína. En formas de realización alternativas, el polipéptido puede ser al menos un 20%, 40%, 60%, o al menos un 70% puro.

La cantidad de proteína se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14ma ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC), y la cantidad del polipéptido de la invención se puede determinar por SDS-PAGE y el escaneo posterior, también por métodos conocidos en la técnica.

Los polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles a los cuales otros polipéptidos se fusionan en el N-terminal o el C-terminal del polipéptido o fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) codificando otro polipéptido a una secuencia de ácidos nucleicos (o una parte de la misma) codificando un polipéptido a usar según la presente invención. Técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación codificando los polipéptidos de tal manera que éstas no sufran cambios en el marco de lectura y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo el control del/de los mismo(s) promotor(es) y terminador.

En una forma de realización específica, el polipéptido es una variante hipoalergénica, diseñada para invocar una respuesta inmunológica reducida cuando se expone a animales, incluyendo el hombre. El término respuesta inmunológica se debe entender como cualquier reacción por parte del sistema inmunológico de un animal expuesto al polipéptido. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica conduciendo a niveles aumentados de IgE en el animal expuesto. Se pueden preparar variantes hipoalergénicas usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo el polipéptido se puede conjugar con partes de protección de fracciones de polímero o epítopos del polipéptido implicados en una respuesta inmunológica. La conjugación con polímeros puede implicar el acoplamiento químico in vitro del polímero al polipéptido, por ejemplo como se describe en WO 96/17929, WO98/30682, WO98/35026, y/o WO99/00489. La conjugación puede además o de forma alternativa implicar el acoplamiento in vivo de polímeros al polipéptido. Tal conjugación se puede conseguir por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido. Otra manera de proporcionar variantes hipoalergénicas es por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos codificando el polipéptido para causar que los polipéptidos se auto-oligomericen, efectuando que los monómeros de polipéptido puedan proteger a los epítopos de otros monómeros de polipéptido y así reduciendo la antigenicidad de los oligómeros. Tales productos y su preparación se describen por ejemplo en WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica se pueden identificar por varios métodos tales como el método de exposición en fago descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el enfoque aleatorio descrito en EP 561907. Una vez se ha identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos se puede alterar para producir propiedades inmunológicas alteradas del polipéptido por técnicas de manipulación genética conocidas tales como la mutagénesis sitio-dirigida (véase por ejemplo WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede realizarse en proximidad suficiente al epítopo para que el polímero proteja al epítopo.

Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas

La invención se refiere al uso no terapéutico en pienso de una cepa de Bacillus, el ADN del cual, cuando se cosecha y se usa como un patrón de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb. Este test sirve para identificar cepas con un gen tipo L12, véase el Ejemplo 6 aquí. Estas cepas de Bacillus también se pueden usar en la preparación de una composición para uso no terapéutico en pienso. Estos usos, por ejemplo, tienen el propósito de mejorar el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y/o de modular la microflora intestinal.

En una primera forma de realización particular, la cepa de Bacillus es un microorganismo probiótico. El término "probiótico" generalmente se refiere a una bacteria no patógena dada como alimento a animales, incluyendo aves, como un modo de prevenir la colonización por bacterias patógenas. El concepto básico es alentar la colonización de superficies mucosas como una manera de bloquear la colonización por patógenos serios. Los probióticos también se pueden definir como microorganismos vivos, o vivibles, que beneficiosamente afectan al equilibrio intestinal de seres humanos y animales saludables y con un funcionamiento normal, preferiblemente aumentando así la ganancia de peso y/o mejorando la conversión de alimentos.

En una segunda forma de realización particular, la cepa de Bacillus se usa en forma de esporas. Las esporas pueden ser exosporas o, preferiblemente, endosporas. Una endospora es cualquier espora que se produzca dentro de un organismo (normalmente una bacteria). Las endosporas pueden sobrevivir a períodos de estrés medioambiental, y son por lo tanto capaces de sobrevivir al paso de un entorno agresivo (ácido) del tracto intestinal del gastro superior, mientras que sólo ejercita su efecto una vez éste alcanza los intestinos, donde se formarán células vegetativas normales.

En una tercera forma de realización particular, el fragmento de PCR, purificado y secuenciado codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2. Las formas de realización particulares del primer aspecto de la invención (el uso no terapéutico en pienso del polipéptido) también son aplicables a este aspecto de la invención.

En otras formas de realización particulares, la cepa de Bacillus es una cepa de Bacillus licheniformis, preferiblemente seleccionada de las siguientes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, y ATCC 53757. Un subgrupo preferido incluye Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375), y Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785).

En otras formas de realización particulares, la cepa de Bacillus para el uso según la invención no es (i) Bacillus licheniformis DSMZ 5749, (ii) no es Bacillus subtilis DSMZ 5750, y/o (iii) no es Bacillus licheniformis FERM BP-266. Las cepas de (i) y (ii) se incluyen en el producto BioPlus^{TM}2B, véase, por ejemplo, EP 1472933. la cepa de (iii) se describe en GB 2138023.

Podemos encontrar una clasificación e identificación taxonómica de referencias de bacterias en el Manual of Systematic Bacteriology (Manual de Bacteriología Sistemática) de Bergey (1986), vol 2; ISBN0-683-0783; véase por ejemplo la sección 13 de la pág. 1104, "Endospore forming Gram positive rods and cocci" (Bastoncillos y cocos Gram positivos formadores de endosporas); "Genus Bacillus" en la p. 1105; descripción del género en las págs. 1105-1129; descripción de la especie individual Bacillus de las págs. 1130-1138, por ejemplo en Bacillus licheniformis en la p. 1132). Como alternativa se puede usar el bien conocido análisis de secuencia 16SrRNA (véase por ejemplo Johansen et al, Int. J. Syst. Bacteriol, 1999, 49, 1231-1240, en particular la sección "Methods" en la p. 1.233, 2a columna); o se puede consultar a expertos de taxonomía, por ejemplo de DSMZ u otros institutos depositarios reconocidos.

Cepas de Bacillus, tales como cepas de Bacillus licheniformis, se conocen en la técnica y están disponibles a través de, por ejemplo, colecciones de cultivos como la ATTC mencionada arriba, o se pueden aislar de la naturaleza. Las preparaciones de células de Bacillus vivas, o vivibles, se pueden preparar de la manera en que se conoce en la técnica. Son ejemplos de tales células las células vegetativas, y las esporas tales como las endosporas. En una forma de realización se usa un extracto de fermentación de la cepa de Bacillus, por ejemplo en forma de una solución de fermentación secada por atomización.

El test del ejemplo 6 es una reacción de PCR, en este ejemplo llevado a cabo con ADN aislado a partir de varias cepas de Bacillus licheniformis. En una forma de realización particular de este test, el ADN usado como patrón para la reacción de PCR es ADN cromosómico que se puede aislar por métodos conocidos en la técnica. El resultado del test del Ejemplo 6 es positivo cuando se obtiene un fragmento de PCR del tamaño adecuado. En el Ejemplo 6, el tamaño adecuado se indica como 0,4 kb. En una forma de realización particular, el tamaño adecuado es de entre 0,35 kb y 0,44 kb (=350 bp-440 bp). En formas de realización alternativas, el tamaño adecuado es de 330-430 bp, 340-420 bp, 350-410 bp, 360-400 bp, 370-390 bp, o 385-395 bp. El tamaño de la secuencia codificante (CDS) de la SEC ID NO:1 es de aproximadamente 380 bp (es decir, 378 bp).

Secuencias de ácidos nucleicos

La invención también se refiere al uso no terapéutico de un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucleicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos, la cual hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

La identidad y la hibridación se definen en una sección precedente.

En una primera forma de realización particular, la secuencia de ácidos nucleicos codifica un polipéptido, el uso del cual mejora la utilización de pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y/o modulando la microflora intestinal.

Una secuencia de ácidos nucleicos particular es los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, ésta correspondiente a la región de codificación de polipéptidos madura. Otras secuencias de ácidos nucleicos particulares son aquellas que codifican el polipéptido de los aminoácidos 1-85 de cualquiera de las SEC ID NOs:2, 8, 9, y 10.

La presente invención también comprende el uso no terapéutico de fragmentos de la SEC ID NO:2 codificados por secuencias de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido teniendo la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, los cuales difieren de las partes correspondientes de la SEC ID NO:1 con ayuda de la degeneración del código genético. Esto incluye las subsecuencias de la SEC ID NO:1 las cuales codifican fragmentos de la SEC ID NO:2.

Una subsecuencia de la SEC ID NO:1 es un secuencia de ácidos nucleicos comprendida por la SEC ID NO:1 excepto porque uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' se ha(n) delecionado. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 150 nucleótidos, más preferiblemente al menos 165, 180, 195, 210, 225, 240, 270, 285, 300, 315, 330, o de la forma más preferible al menos 345 nucleótidos.

La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos los cuales comprenden una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido y los cuales tienen un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 de al menos un 48%. Para determinar el grado de identidad de nucleótidos, se usa el programa "align" al que se hace referencia arriba.

En formas de realización preferidas, el grado de identidad para los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 es de al menos un 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, o al menos un 99%. En formas de realización alternativas, el grado de identidad para los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 es de al menos un 32%, o al menos un 35%, 37%, 40%, 42%, 45%, o al menos un 47%.

Tales nucleótidos también incluyen secuencias de ácidos nucleicos mutantes comprendiendo al menos una mutación en los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, en la cual la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste de los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, o (ii) es una variante de la secuencia de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de la secuencia de (i), o (iv) es un fragmento de la secuencia de (i).

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, la preparación a partir de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de tal ADN genómico se puede efectuar, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o la selección de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Véase, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación en base a una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia de ácidos nucleicos se puede clonar a partir de una cepa de Bacillus, preferiblemente Bacillus licheniformis, u otro o un organismo relacionado y de este modo, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especies de la región de codificación del polipéptido de la secuencia de ácidos nucleicos.

El término "secuencia de ácidos nucleicos aislada" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, al menos aproximadamente un 20% pura, preferiblemente al menos aproximadamente un 40% pura, más preferiblemente al menos aproximadamente un 60% pura, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente un 80% pura, y de la forma más preferible al menos aproximadamente un 90% pura como se determina por electroforesis de agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada se puede obtener por procedimientos de clonación estándar usados en la ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucleicos desde su ubicación natural a un sitio diferente donde ésta se reproducirá. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácidos nucleicos deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula de vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde se replicarán múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos puede ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de los
mismos.

La modificación de una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido usado en la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas de origen no natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera en su creación del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en termostabilidad, estabilidad de pH, estabilidad hacia enzimas digestivas, alergenicidad, o similares. La secuencia variante se puede construir en base a la secuencia de ácidos nucleicos presentada como la parte de codificación del polipéptido de la SEC ID NO:1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótido que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificadas por la secuencia de ácidos nucleicos, pero que corresponde al uso de codón del organismo huésped destinado para la producción del polipéptido, o por introducción de sustituciones de nucleótidos la cual puede dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de sustitución de nucleótidos véase, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. Los polipéptidos hipoalergénicos se pueden preparar por ejemplo ser preparado como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de un polipéptido codificado por unas secuencias de ácidos nucleicos aisladas comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido y el cual hibrida bajo condiciones de astringencia medias, preferiblemente condiciones de astringencia medias-altas, más preferiblemente condiciones de astringencia altas, y más preferiblemente condiciones de astringencia muy altas con un sonda de ácido nucleico que hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria; o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, supra), tal y como se define aquí.

La presente invención también se refiere al uso no terapéutico de polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por (a) hibridación de un ADN bajo condiciones de astringencia medias, medias-altas, altas, o muy altas con (i) nucleótidos de los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i), o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y por (b) aislamiendo de la secuencia de ácidos nucleicos. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tales como una secuencia que codifica un fragmento de polipéptido.

La presente invención además se refiere a métodos para producir una secuencia de ácidos nucleicos mutante, comprendiendo la introducción de al menos una mutación en la secuencia de codificación del polipéptido madura de la SEC ID NO:1 o una subsecuencia de la misma, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido se puede realizar por mutagénesis dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Es particularmente útil el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos conteniendo la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario para cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación cíclica de la temperatura mediante Pfu ADN polimerasa. En la incorporación de los cebadores, se genera un plásmido mutado conteniendo cortes en bisel. Tras la variación cíclica de la temperatura, el producto se trata con Dpnl el cual es específico para ADN metilado y hemimetilado para digerir el patrón de ADN parental y para seleccionar ADN sintetizado conteniendo mutación. También se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica.

Constructos de ácido nucleico

La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos operativamente vinculada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en un huésped de expresión adecuado. Huéspedes de expresión adecuados son células huésped de Bacillus, el ADN de los cuales, cuando se recoge y usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, como se describe en el Ejemplo 6, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

Ejemplos de células huésped adecuadas se mencionan en la sección de abajo titulada "Células huésped". La expresión se entenderá por incluir cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a, transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.

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"Constructo de ácido nucleico" se define aquí como una molécula de ácido nucleico, o bien única o bicatenaria, la cual se ha aislado de un gen de origen natural o se ha modificado para contener segmentos de ácido nucleico combinados y superpuestos de tal manera que de lo contrario no existirían en la naturaleza. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo del término casete de expresión cuando el constructo de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante para un polipéptido a usar para los objetivos no terapéuticos de la presente invención. El término "secuencia codificante" se define aquí como una secuencia de ácidos nucleicos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteínico. Los límites de la secuencia de codificación se determinan generalmente por un sitio de unión de ribosoma (procariotas) o por el codón de inicio ATG (eucariotas) localizados justo corriente arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNM y una secuencia del terminador de transcripción localizada justo corriente abajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNM. Una secuencia codificante puede incluir, pero no está limitada a, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes.

Una secuencia de ácidos nucleicos aislada codificando un polipéptido a usar para los objetivos no terapéuticos de la presente invención se puede manipular en una variedad de maneras para proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucleicos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinantes se conocen bien en la técnica.

El término "secuencias de control" se define aquí por incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido a usar para los objetivos no terapéuticos de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, pero no están limitadas a, una secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptidos, promotora, secuencia de péptidos señal, y terminador de transcripción, líder. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las secuencias de control se pueden proporcionar con enlazadores para el propósito de introducir sitios de restricción específicos para facilitar la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido. El término "enlazado operativamente" se define aquí como una configuración en la cual una secuencia de control está apropiadamente colocada en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirige la expresión de un polipéptido.

La secuencia promotora, es decir una secuencia de ácidos nucleicos que se reconoce por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncado, e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifiquen polipéptidos extracelulares o intracelulares bien homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped de Bacillus licheniformis que sean positivos en el test del Ejemplo 6 aquí son los promotores obtenidos a partir del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amilo), el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), un promotor CriIIIA (véase WO 99/43835), al igual que el promotor L12 endógeno de cualquiera de las células huésped de Bacillus licheniformis específicas mencionadas abajo.

La secuencia de terminador de transcripción, es decir una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción, está operativamente vinculada al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

Los terminadores preferidos para las células huésped de Bacillus licheniformis anteriormente mencionadas son los terminadores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amilo), y el terminador L12 endógeno de cualquiera de estas células huésped.

La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no traducida de un ARNM que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia guía está operativamente vinculada al terminal 5' de la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido. Cualquier secuencia guía que sea funcional en la célula huésped de elección se puede utilizar en la presente invención.

La región de codificación del péptido señal codifica una secuencia de aminoácidos vinculada al amino terminal de un polipéptido que dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. En una forma de realización preferida, la región de codificación del péptido señal son los nucleótidos 1-123 de la SEC ID NO:1 que codifica los aminoácidos -41 a -1 de la SEC ID NO:2.

Según el software SignaIP Versión 3.0, el péptido señal predicho de la SEC ID NO:2 es los aminoácidos -41 a -2. Esto significa que la proteína madura predicha comienza en el aminoácido -1 de la SEC ID NO:2, es decir, Ala. No obstante, según el Ejemplo 2 aquí, el N-terminal de la proteína madura comienza con el aminoácido +1 de la SEC ID NO:2, es decir, Trp, lo cual significa que la parte de péptido señal abarca los aminoácidos -41 a -1 de la SEC ID NO:2, el cual es un aminoácido más largo de lo predicho.

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Por lo tanto los aminoácidos -1 a +85 de la SEC ID NO:2 son una forma madura alternativa de la proteína L12, el uso de la cual para objetivos no terapéuticos en pienso también es parte de la presente invención. Por consiguiente, cualquier reivindicación y cualquier declaración aquí en referencia a los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 puede por lo tanto también, o de forma alternativa, referirse a los aminoácidos -1 a +85 de la SEC ID NO:2. Lo mismo sucede para cualquier reivindicación y cualquier declaración aquí refiriéndose a la parte correspondiente de la SEC ID NO:1: Los nucleótidos 121-378 de la SEC ID NO:1 se puede referir a además de, o como alternativa a, los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1.

Asimismo, cualquier referencia aquí a la parte de señal de la SEC ID NO:2 también puede, o como alternativa, ser para los aminoácidos -41 a -2 de la SEC ID NO:2. La parte correspondiente de la SEC ID NO:1 es los nucleótidos 1-120 de la SEC ID NO:1. Cualquier reivindicación y cualquier balance aquí en referencia a la parte de péptido señal puede por lo tanto también, o de forma alternativa, referirse a los nucleótidos 1-120 de la SEC ID NO:1.

El método SignaIP V. 3.0 se describe en Bendtsen et al en Journal of Molecular Biology 2004, 340(4), págs. 783-95. Véase también Nielsen et al en Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, págs 122-130, 1998 (V. 2.0); y Nielsen et al en Protein Engineering 10, 1-6 (1997) (V. 1.1).

Vectores de expresión

La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos, tal como vectores de expresión recombinantes comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido a usar según la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcionales y traduccionales. Las diferentes secuencias de ácidos nucleicos y de control descritas arriba se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que pueda incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido en tales sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucleicos se puede expresar por inserción de la secuencia de ácidos nucleicos o un constructo de ácidos nucleicos comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de tal manera que la secuencia codificante está operativamente vinculada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que se pueda someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinantes y pueda provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La elección del vector típicamente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la cual se introducirá el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados.

El vector puede ser un vector de replicación autónomo, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que, introducido en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica con el/los cromosoma(s) en el/los que/cuales se ha integrado. Además, se puede utilizar un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que contengan juntos el ADN total a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia biocida o vírica, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tales como resistencia a ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma.

Para la integración en el genoma de célula huésped, el vector puede basarse en la secuencia de ácidos nucleicos codificando el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una(s)
ubicación(es) precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 1.500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1.500 pares de bases, y de la forma más preferible de 800 a 1.500 pares de bases, los cuales son altamente homólogos a la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden no estar codificando o estar codificando secuencias de ácidos nucleicos. En cambio, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación permitiendo al vector replicarse de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACiC177, y pACiC184 permitiendo la replicación en E. coli, y pUB110, pE194, pTA1060, y pAM\beta1 permitiendo la replicación en Bacillus. El origen de replicación puede ser uno teniendo una mutación que hace su funcionamiento termosensible en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 1433).

Se puede insertar más de una copia de una secuencia de ácidos nucleicos en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. Se puede obtener un aumento en el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácidos nucleicos donde las células conteniendo copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto copias adicionales de la secuencia de ácidos nucleicos, se puede seleccionar cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos arriba para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

El polipéptido también se puede coexpresar junto con al menos otro componente de interés para el pienso, tal como un polipéptido con una actividad enzimática deseada para su uso en pienso. El polipéptido y al menos otro polipéptido se pueden coexpresar a partir de distintos vectores, de un vector, o usando una mezcla de ambas técnicas.

Células huésped

La invención además se refiere al uso para objetivos no terapéuticos en pienso de un célula huésped de Bacillus recombinante comprendiendo un constructo de ácidos nucleicos de la invención y/o un vector de expresión de la invención. El ADN de la célula huésped, cuando se recoge y usa como un patrón de ADN en una reacción PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

En una forma de realización particular, el fragmento de PCR, purificado y ordenado codifica una secuencia de aminoácidos teniendo al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2.

Las formas de realización particulares (en particular las descritas en las secciones tituladas "El Polipéptido, sus Características, y Uso" e "Identidad e Hibridización, Fragmentos y Variantes") también son aplicables a las células huésped de la invención. Por ejemplo, en otras formas de realización particulares de la célula huésped de Bacillus de la invención, el fragmento de PCR, purificado y ordenado, codifica una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 35%, o al menos un 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, o al menos un 99%.

En otras formas de realización particulares, la célula huésped de Bacillus es una célula huésped de Bacillus licheniformis, preferiblemente seleccionada a partir de las siguientes cepas de Bacillus licheniformis: ATCC 14580 (=NCIB 9375), NCIMB 6346 (=DSM 8785), NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, y ATCC 53757. Un subgrupo preferido incluye Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375), y Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785).

Estas células huésped se usan ventajosamente en la producción recombinante de los polipéptidos. Un vector comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos codificando un polipéptido a usar según la presente invención se introduce en la célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosomal que se duplica como se describe anteriormente. El término "célula huésped" comprende cualquier descendiente de la célula parental que no sea idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988 Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (véase, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

Métodos de producción

La invención también se refiere a unos métodos para producir un polipéptido a usar según la invención, comprendiendo el método (a) cultivar una célula huésped recombinante de la invención para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

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La invención además se refiere a un método para la producción de tal polipéptido comprendiendo (a) cultivar una cepa de Bacillus, el ADN de la cual, cuando se recoge y usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb; y (b) recuperar el polipéptido.

Ejemplos de células huésped se mencionan en la sección anterior titulada "Células huésped".

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido a usar según la presente invención comprendiendo (a) cultivar una célula huésped recombinante de Bacillus licheniformis ATCC 14580 (=NCIB 9375) o Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucleicos mutante comprendiendo al menos una mutación en los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, donde la secuencia de ácidos nucleicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste en los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, o (ii) es una variante de la secuencia de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de la secuencia de (i), o (iv) es un fragmento de la secuencia de (i).

En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar por cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, en flujo, en flujo discontinuo, en flujo discontinuo repetido, o en estado sólido) en laboratorio o fermentadores industriales en un medio adecuado y bajo condiciones permitiendo al polipéptido expresarse y/o aislarse. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Medios adecuados están disponibles a través de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, éste se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, éste se puede recuperar a partir de lisatos de célula.

Los polipéptidos se pueden detectar usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos; el análisis de gel SDS-PAGE revelando una banda de un peso molecular relativo, Mr, de aproximadamente 12 kDa; y/o la determinación de la secuencia N-terminal, en muestras purificadas y/o en la banda de un Mr de 12 kDa, como recorte del gel de SDS-PAGE. En este caso, el N-terminal debería tener preferiblemente una identidad con la SEC ID NO:5 de al menos un 33%, o al menos un 35%, 37%, 40%, 42%, 45%, 47%, 50%, 52%, 55%, 57%, 60%, 62%, 65%, 67%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, o al menos un 99%, el porcentaje de identidad siendo determinado como se describe generalmente arriba).

El polipéptido resultante se puede recuperar por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitándose a, centrifugado, filtración (tal como ultrafiltración y/o diafiltración), extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.

Los polipéptidos se pueden purificar por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (p. ej., intercambio iónico, afinidad, cromatoenfoque hidrofóbico, y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).

Composiciones y Usos

En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a composiciones comprendiendo un polipéptido y/o una cepa de Bacillus de la presente invención.

Las composiciones de polipéptidos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición de polipéptidos puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. Los polipéptidos a incluir en la composición se pueden estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.

Ejemplos particulares de composiciones de la invención son los siguientes:

Un aditivo para pienso comprendiendo (a) i) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 y/o ii) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tenga un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5; y (b) al menos una vitamina liposoluble, (c) al menos una vitamina hidrosoluble, (d) al menos un oligoelemento, y/o (e) al menos un macromineral;

una composición de pienso teniendo un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y comprendiendo i) un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4 y/o ii) un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como está determinado por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5;

un aditivo para pienso comprendiendo (a) una cepa de Bacillus tal y como se define en la sección titulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas"; y (b) al menos una vitamina liposoluble, (c) al menos una vitamina hidrosoluble, (d) al menos un oligoelemento, y/o (e) al menos un macromineral; y

una composición de pienso teniendo un contenido de proteína cruda de 50 a 800 g/kg y comprendiendo una cepa de Bacillus tal y como se define en la sección titulada "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas".

Las así llamadas premezclas son ejemplos de aditivos para pienso de la invención. Una premezcla designa una mezcla preferiblemente uniforme de uno o más micro-ingredientes con diluyente y/o portador. Las premezclas se utilizan para facilitar la dispersión uniforme de micro-ingredientes en una mezcla más grande.

Arriba se dan ejemplos de usos preferidos según la invención (en las secciones tituladas "El Polipéptido, sus Características, y Usos" y "Cepas bacterianas; Cepas de Bacillus probióticas"), y se dan más detalles abajo.

Pienso

El término animal incluye a todos los animales. Son ejemplos de animales los no rumiantes, y los rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras, y ganado bovino, por ejemplo vaca como ganado bovino para carne y vaca lechera En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen los animales mono-gástricos; por ejemplo el cerdo o puerco (incluyendo, pero no limitándose a, lechones, cerdos de crecimiento, y puercos); aves tales como pavos, patos y pollos (incluyendo pero no limitándose a pollos de engorde, gallinas ponedoras); pescado (incluyendo pero no limitándose a salmón, trucha, tilapia, siluro y carpa); y crustáceos (incluyendo pero no limitándose a gamba y cigala).

El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada para la ingestión por un animal.

En el uso según la invención el polipéptido y/o la cepa de Bacillus se puede dar al animal antes, después, o simultáneamente con la dieta. Se prefiere a última.

En una forma de realización particular, el polipéptido, en la forma en la que se añade al pienso, o estando incluido en un aditivo para pienso, está bien definido. El término bien definido significa que la preparación de polipéptidos es al menos un 50% pura, determinado como se describe previamente, o por Cromatografía de exclusión de tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares la preparación de polipéptidos bien definida es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos un 95% pura.

Una preparación de polipéptidos bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el pienso un polipéptido que esté esencialmente a salvo de interferir o contaminar otros polipéptidos. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y a la capacidad de optimizar la dosificación en base al efecto deseado.

Para el uso en pienso, no obstante, el polipéptido no necesita ser tan puro; éste por ejemplo puede incluir otros polipéptidos tales como enzimas de pienso, en cuyo caso esto se podría denominar como una preparación de polipéptidos.

A la preparación de polipéptidos se puede (a) añadir directamente al pienso (o usar directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) ésta se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimenticios o premezclas que se añadirán posteriormente al pienso (o se usarán en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de polipéptidos original, tanto si se usa según (a) o (b) arriba.

Las preparaciones de polipéptidos con purezas de este orden de magnitud son obtenibles en particular usando métodos recombinantes de producción, mientras que éstas no son tan fácilmente obtenibles y también se someten a una variación por lotes mucho mayor cuando el polipéptido se produce por métodos de fermentación tradicionales.

En el presente contexto, el término coeficiente de conversión de alimentos, o FCR, se usa como sinónimo para el término conversión de alimentos. El FCR se calcula como el consumo de pienso en g/animal en relación al aumento de peso en g/animal, véase por ejemplo la Tabla 2 en el Ejemplo 5.

El polipéptido se puede añadir al alimento en cualquier forma, estar en forma de un polipéptido relativamente puro, o en combinación con otros componentes destinados para su adición al pienso, es decir en forma de aditivos para pienso, tales como las así llamadas premezclas para pienso.

Aparte del polipéptido y/o la cepa de Bacillus, los aditivos para pienso de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina soluble en agua, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.

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Otros ingredientes opcionales de aditivo para pienso son agentes colorantes, por ejemplo carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina, y luteína; compuestos aromatizantes; estabilizadores; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados; especies reactivas generadoras de oxígeno; y/o al menos una enzima seleccionada de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (EC 3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6). En una forma de realización particular estas otras enzimas están bien definidas (como se define arriba para las preparaciones de polipéptidos).

Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP's) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehren, 2000), Plectasinas, y Estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, al igual que variantes o fragmentos de lo anterior que retengan la actividad antimicrobiana.

Ejemplos de polipéptidos antifungicidas (AFP's) son los péptidos Aspergillus giganteus, y Aspergillus niger, al igual que variantes y fragmentos de los mismas que retengan la actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.

Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como el ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico.

Ejemplos de especies reactivas generadoras de oxígeno son productos químicos tales como perborato, persulfato, o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.

Normalmente las vitaminas lipo- e hidrosolubles, al igual que oligoelementos forman parte de una así llamada premezcla destinada a su adición al pienso, mientras que los macrominerales normalmente se añaden por separado al pienso. Cualquiera de estos tipos de composición, al enriquecerse con un polipéptido o una cepa de Bacillus de la invención, es un aditivo para pienso de la invención.

En una forma de realización particular, el aditivo para pienso de la invención se destina a estar incluido (o prescrito como teniendo que incluirse) en dietas o alimentación de animales a niveles del 0,01 al 10,0%; más particularmente del 0,05 al 5,0%; o del 0,2 al 1,0% (% significado g de aditivo por 100 g de pienso). Este es así en particular para las premezclas.

Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3.

Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son vitamina B12, biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato.

Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto.

Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.

Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se catalogan en la Tabla A de WO 01/58275. Requisito nutritivos significa que estos componentes deberían proporcionarse en la dieta en las concentraciones indicadas.

Como alternativa, el aditivo para pienso de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificos en la Tabla A de WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro, etc. hasta un total de trece, o hasta un total de quince componentes individuales. Más especificamente, éste al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal para proporcionar una concentración en alimento en el rango indicado en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la Tabla A.

Las composiciones de pienso o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de proteínas. Las dietas de aves y cerdo pueden estar caracterizadas como se indica en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se indica en la columna 4 de esta Tabla B. Además tales dietas para peces normalmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg.

Una composición de pienso según la invención tiene un contenido bruto de proteína de 50-800 g/kg, y además comprende al menos un polipéptido y/o al menos una cepa de Bacillus como se describe y/o reivindica aquí.

Además, o como alternativa (al contenido de proteína cruda indicado arriba), la composición de pienso de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.

En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de los rangos 2, 3, 4 ó 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).

La proteína cruda se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, Proteína cruda (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14ma ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

La energía metabolizable se puede calcular basándose en los NRC publication Nutrient requirements in swine (requisitos de nutrientes en cerdos de la publicación de NRC) novena edición corregida de 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council (subcomisión sobre la nutrición en cerdos, comisióm sobre nutrición en cerdos, tabla de agricultura, consejo de investigación nacional). National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la Tabla europea de valores de energía para alimentos para aves, centro Spelderholt para la investigación de aves y extensión, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas para animales completas se calcula basándose en tablas de alimentos tales como la Veevoedertabel de 1997, gegevens sobre chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

En una forma de realización particular, la composición de pienso de la invención contiene al menos una proteína vegetal o fuente de proteína. También puede contener proteína animal, tal como harina de carne y hueso, y/o harina de pescado, típicamente en una cantidad del 0-25%. El término proteínas vegetales como se usa en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de o originada de un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteína. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de al menos el 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p).

Las proteínas vegetales pueden estar derivadas de fuentes de proteína vegetal, tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupino y harina de semilla de colza.

En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo semilla de soja, altramuz, guisante, o alubia.

En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son la semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón, y repollo.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (mazorca), arroz, triticale, y sorgo.

En otras formas de realización particulares, la composición de pienso de la invención contiene un 0-80% de maíz; y/o un 0-80% de sorgo; y/o un 0-70% de trigo; y/o un 0-70% de cebada; y/o un 0-30% de avena; y/o un 0-30% de centeno; y/o un 0-40% de harina de soja; y/o un 0-25% de harina de pescado; y/o un 0-25% de harina de carne y hueso; y/o un 0-20% de lactosuero.

Las dietas para animales se pueden fabricar por ejemplo como alimento en puré (no granulado) o alimento granulado. Típicamente, se mezclan los materiales alimenticios truturados y se agregan cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales según las especificaciones para la especie en cuestión. El/los polipéptido(s) y/o la cepa de Bacillus se pueden agregar como formulaciones sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de polipéptido sólida se agrega típicamente antes o durante la etapa de mezclado; y una preparación de polipéptido líquida se agrega típicamente después de la etapa de granulación. El polipéptido también se puede incorporar en forma de aditivo para pienso o premezcla.

La concentración de polipéptidos final en la dieta está en el rango de 0,01-200 mg de proteína por kg de dieta, por ejemplo en el rango de 0,1-20 mg de proteína por kg de dieta animal.

El polipéptido y/o la cepa de Bacillus debería añadirse por supuesto en una cantidad eficaz, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la conversión del alimento.

En el presente se contempla que el polipéptido se administre en una o más de las siguientes cantidades (rangps de dosificación): 0,01-200, 0,01-100, 0,5-100, 1-50, 5-100, 10-100, 0,05-50, 1-10 o 0,10-10, siendo todos estos rangos en mg de proteína de polipéptido por kg (ppm) de pienso. En una forma de realización particular, el rango de dosificación es 1-9, 1-8, 2-7, 2-6, ó 2-5 ppm. Ejemplos de rangos de dosificación particularmente preferidos son; 0,5-15,0, 1,0-12,5, 1,5-10,0, y 2,5-7,5 ppm. La cantidad del polipéptido se determina como se describe para la proteína L12 en el Ejemplo 10.

En el presente se contempla que la cepa de Bacillus se administre en una o más de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 10 E2-14, 10 E4-12, 10 E6-10, 10 E7-9, preferiblemente 10 E8 CFU/g de pienso (la designación E significa exponente, es decir., por ejemplo, 10 E2-14 significa 10^{2}-10^{14}).

Para determinar los mg de proteína de polipéptido por kg de pienso, el polipéptido se purifica a partir de la composición de pienso, y se calcula la dosificación en mg de proteína de polipéptido por kg de alimento, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 10. Los mismos principios se aplican para determinar los mg de proteína de polipéptido en aditivos alimenticios.

Depósito de material biológico

El siguiente material biológico, el cual se aisló a partir de contenido intestinal de pollos para asar, como se describe en el Ejemplo 8, se ha depositado según las condiciones del tratado de Budapest con la DSMZ (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) y ha recibido los siguientes números de registro:

2

Las depósitos se hicieron por Novozymes A/S, Krogshoejvej 36; DK-2880, Dinamarca.

Ejemplos

Ejemplo 1

Fermentación en matraz de agitación de Bacillus licheniformis

Se propagó Bacillus licheniformis ATCC 14580 durante toda la noche a 37ºC en medio de agar TY (caldo TY solidificado con un 2% de agar) y se inoculó en un matraz de agitación conteniendo 100 ml de caldo TY con la siguiente composición: triptona: 20 g/l, extracto de levadura: 5 g/l, FeCl_{2}, 4H_{2}O: 7 mg/l, MnCl_{2}, 4H_{2}O: 1 mg/l, MgSO_{4}, 7H_{2} O: 15 mg/l, pH 7.3. El matraz de agitación se incubó a 37ºC durante 20 horas con una velocidad de agitación de 225 r.p.m. Las células se eliminaron por centrifugado.

La electroforesis de gel de poliacrilamida SDS del sobrenadante reveló una banda de un peso molecular relativo de 12 kDa correspondiente al polipéptido deseado. El polipéptido se denomina como "la proteína L12" debido a su peso molecular relativo de 12 kDa, por SDS-PAGE (no obstante, el peso molecular teórico se puede calcular en 9591.56 Da).

Ejemplo 2

Purificación de la fermentación en matraz de agitación de Bacillus licheniformis

El caldo de fermentación del Ejemplo 1 se centrifugó (20000 x g, 20 min) y los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente de los precipitados. Los sobrenadantes combinados se filtraron a través de una placa Seitz EKS para eliminar las células de Bacillus. El filtrado de EKS se ultrafiltró y diafiltró en casetes recortados Filtron 3k para concentrar las proteínas y reducir la conductividad en el filtrado de Seitz EKS. El concentrado de Filtron se filtró a través de otra placa Seitz EKS.

El pH del concentrado se ajustó a pH 4.5 con un 20% de CH_{3}COOH. Algo (no la proteína L12) en la solución se precipitón durante ajuste de pH y este precipitado se eliminó por filtración a través de una placa Seitz K-250. El filtrado K-250 se aplicó a una columna de 100 ml de SP-sefarosa FF equilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, y se ajustó a pH 4.5 con NaOH. Después del lavado de la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteína L12 se eluyó con un gradiente de NaCl lineal (0 - -> 0,5M) en el mismo tampón. La proteína L12 conteniendo fracciones se identificó por análisis de SDS-PAGE y estas fracciones se agruparon y diluyeron 10 veces con agua desmineralizada para reducir la conductividad del conjunto. El conjunto se añadió a una columna SOURCE S de 8 ml equilibrada en el mismo tampón de equilibrado (20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, ajustado a pH 4.5 con NaOH) y después de lavar la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteína L12 se eluyó con un gradiente de de NaCl lineal (0 - -> 1.0M) en el mismo tampón.

Se analizaron fracciones de la columna por análisis SDS-PAGE y la proteína L12 conteniendo fracciones se agrupó, el pH se ajustó a pH 8 con un 3% de NaOH y la agrupación se dejó en la cámara fría hasta el día siguiente. El ajuste a pH 8 provocó que la L12 proteína se precipitara, y el día siguiente el precipitado de L12 se recogió por centrifugado (5000 x g, 10 min).

El precipitado de proteína L12 se lavado con 20 mM de Tris/HCl, a pH 8 para aumentar la pureza de la proteína L12 precipitada. Después de un segundo centrifugado (5000 x g, 10 min) el precipitado de proteína L12 se disolvió en un volumen mínimo de (20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, 100 mM de NaCl, ajustados a pH 4.5 con NaOH) y se añadió a un columna de exclusión de tamaño Superdex 75 300 ml equilibrada en el mismo tampón.

La columna Superdex 75 se eluyó con el mismo tampón y se analizaron fracciones de la columna por Análisis SDS-PAGE. Las fracciones, donde sólo se veía una banda en el gel de SDS-PAGE manchada de Coomassie, se agruparon como la preparación proteína L12 purificada. Se añadió glicerol a las fracciones de L12 agrupadas hasta una concentración final del 50% (p/p).

La proteína L12 formulada de glicerol se almacenó fría en un frigorífico.

La preparación era esencialmente pura como se determinó en un gel de SDS-PAGE manchado de Coomassie (una banda).

Características

El peso molecular relativo como se determinó por SDS-PAGE fue: Mr = 12 kDa.

La secuencia N-terminal fue:

WVNPGYHYQYPSEGG (SEC ID NO:5)

Ejemplo 3

Fermentación de flujo discontínuo de Bacillus licheniformis

Un proceso de fermentación en flujo discontínuo de Bacillus licheniformis ATCC 14580 se llevó a cabo como se describe abajo. Todos los medios se esterilizaron por métodos conocidos en la técnica. A menos que se describiera de otra manera, se usó agua corriente. Las concentraciones de ingrediente referidas a en las recetas de debajo son de antes de cualquier inoculación.

Medios

LB agar: 10 g/l de peptona de caseína (tal como, catálogo Fluka nº. 95039, digestión tríptica de la caseína); 5 g/l de extracto de levadura (fabricada por autolisis de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo el catálogo nº. 9512 de Organotechnie S.A., 27, avenue Jean Mermoz, F-93120 La Courneuve, Francia); 10 g/l de cloruro sódico; 12 g/l de Bacto-agar (LB-agar (Miller), catálogo Merck nº. 110283) ajustado a pH 7.0 +/- 0.2.

Tampón M-9: Di-Sodiumidrogenfosfato, 2H_{2}O 8,8 g/l; potasiodihidrogenfosfato 3 g/l; cloruro sódico 4 g/l; sulfato magnésico, 7H_{2}O 0,2 g/l (en este tampón se usa agua desionizada).

PRK-50: 110 g/l de sémola de soja; Di-Sodiohidrogenfosfato, 2H_{2}O 5 g/l; antiespumante (tal como, por ejemplo, Struktol SB2121, Schill & Seilacher Hamburgo, Alemania) 1 ml/l; pH ajustado a 8.0 con NaOH/H_{3}PO_{4} antes de la esterilización.

Medio de composición: Triptona (hidrolizado de Caseína tal como, por ejemplo, digestión pancreática de Triptona Bacto^{TM} del catálogo de caseína nº. 211699) 30 g/l; sulfato magnésico, 7H_{2}O 4 g/l; di-potasiohidrogenfosfato 7 g/l; di- sodiohidrogenfosfato, 2H_{2}O 7 g/l; di-amoniosulfato 4 g/l; ácido cítrico 0,78 g/l; vitaminas (tiamina-diclorida 34,2 mg/l; riboflavina 2,9 mg/l; ácido nicotínico 23 mg/l; calcio D-pantotenato 28,5 mg/l; piridoxal-HCl 5,7 mg/l; D-biotina 1,1 mg/l; ácido fólico 2,9 mg/l); metales traza (MnSO_{4}, H_{2}O 39,2 mg/l; FeSO_{4}, 7H_{2}O 157 mg/l; CuSO_{4}, 5H2 O 15,6 mg/l; ZnCl_{2} 15,6 mg/l); antiespumante (Struktol SB2121, véase arriba) 1,25 ml/L; pH ajustado a 6.0 con NaOH/H_{3}PO4 antes de la esterilización. Se añadieron 24 ml/L de monopropileno glicol (MPG) 28 y 47 horas después de la inoculación (es decir, después de aproximadamente 1 y 2 días, respectivamente), se añadieron en total 48 ml/l de MPG. Medio de alimento: Glucosa,1H_{2}O 820 g/l.

Procedimiento de fermentación

Se cultivó Bacillus licheniformis ATCC 14580 en sesgos de LB agar durante un día a 37ºC. El agar se lavó entonces con tampón M-9, y se midió la densidad óptica (OD) a 650 nm de la suspensión celular resultante. Los matraces de agitación de inóculo (con 100 ml de medio PRK-50) se inocularon con un inóculo de OD (650 nm) x ml suspensión celular = 0,1 (lo cual significa que la cantidad requerida de inóculo en ml se obtiene dividiendo 0,1 por el OD (650 nm) de la suspensión celular de inóculo). Los matraces de agitación se incubaron a 37ºC a 300 r.p.m. durante 20 hr.

Los fermentadores usados fueron fermentadores lab estándar equipados con un sistema de regulación de temperatura, control de pH con agua amoniacal y ácido fosfórico, electrodo de oxígeno disuelto para medir >20% de saturación de oxígeno durante toda la fermentación.

La fermentación en el fermentador principal (tanque de fermentación) se inició inoculando el fermentador principal con el cultivo de crecimiento de un matraz de agitación de inóculo. El volumen inoculado fue el 10% del medio de composición (80 ml para 720 ml del medio de composición, dando como resultado 800 ml de caldo inicial después de la inoculación).

Los parámetros de fermentación fueron: temperatura 41ºC; pH entre 6.8 y 7.2 (usando agua amoniacal y ácido fosfórico, control 6.8 (agua amoniacal), 7.2 ácido fosfórico). Aireación: 1,5 litro/min/kg del peso del caldo de fermentación, agitación: 1500 r.p.m.

Se añadió medio de alimento de la siguiente manera: Velocidad inicial de alimento 0,05 g/min/kg al principio de la fermentación, aumentando linealmente a 0,16 g/min/kg después de 8 horas, y permaneciendo a 0,16 g/min/kg hasta el final de la fermentación (por referencia al peso inicial del caldo de fermentación, justo después de la inoculación).

Después de 3 días (70 horas) el caldo de fermentación se recogió y purificó como se describe en el ejemplo 4 abajo.

Ejemplo 4

Purificación de la fermentación en flujo discontínuo de Bacillus licheniformis

El caldo de fermentación del Ejemplo 3 se centrifugó (20000 x g, 20 min) y los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente de los precipitados. Los sobrenadantes combinados se filtraron a través de una placa Seitz K-250 y después a través de una placa Seitz EKS para eliminar el resto de las células huésped de Bacillus. La conductividad del filtrado EKS fue de 10 mS/cm. 100 ml de filtrado de EKS se diluyeron 10x en 20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, se ajustaron a pH 4.5 con NaOH y el pH del filtrado de EKS diluido se ajustó a pH 4.5 con un 20% de CH_{3}COOH. El filtrado de EKS diluido se añadió a una columna de SP-sefarosa FF de 19 ml equilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, y ajustada a pH 4.5 con NaOH. Después del lavado de la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteína L12 se eluyó con un gradiente de NaCl lineal (0 - -> 0.5M) en el mismo tampón. Fracciones conteniendo la proteína L12 se identificaron por análisis SDS-PAGE y se agruparon y diluyeron 10 veces con agua desmineralizada para reducir la conductividad de la agrupación. La agrupación se añadió a una columna SOURCE S 8 ml equilibrada en el mismo tampón de equilibrado (20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 1 mM de CaCl_{2}, ajustada a pH 4.5 con NaOH) y después del lavado de la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteína L12 se eluyó con un gradiente de NaCl lineal (0 - -> 1.0M) en el mismo tampón. Se analizaron fracciones de la columna por análisis SDS-PAGE y las fracciones conteniendo la proteína L12 se agruparon y añadieron a una columna de exclusión por tamaño Superdex 75 de 120 ml equilibrada en 20 mM de CH_{3}COOH, 50 mM de H_{3}BO_{3}, 100 mM de NaCl, 1 mM de CaCl_{2}, ajustada a pH 4.5 con NaOH. La columna Superdex 75 se eluyó con el mismo tampón y las fracciones de la columna se analizaron por análisis SDS-PAGE. Las fracciones que originaron una banda fuerte a 12 kDa en el gel de SDS-PAGE manchado de coomassie se agruparon como la preparación de proteína L12 purificada. La preparación fue al menos un 90% pura según lo observado en un gel de SDS-PAGE manchado de coomassie, y el peso molecular relativo según se determinó por SDS-PAGE

\hbox{fue de Mr = 12 kDa. La secuencia
 N-terminal fue: WNVPGYHYQY (aminoácidos
1-10 de la SEC ID NO:5).}

Ejemplo 5

Rendimiento en pienso in vivo (prueba en jaula)

El rendimiento de la proteína L12 en pienso se evaluó en una prueba de crecimiento de pollos de engorde con los siguientes parámetros:

Prueba de crecimiento:

Día 8 a día 29 (día 0 = día de escotilla)

Tratamientos:

A: Control;

\quad

B: 5 mg de proteína L12 purificada por kg de pienso

Dietas:

Maíz/dieta SBM48 (véase composición de pienso, Tabla 1)

Después de mezclar el alimento éste se granuló a aproximadamente 70ºC (3 x 25 mM). La proteína L12 se diluyó en 500 ml de agua y se pulverizó sobre los gránulos. Para el tratamiento de control se pulverizó la misma cantidad de agua sobre los gránulos.

Réplicas:

8 grupos de 6 pollos varones, ROSS PM3, por tratamiento

Alimentación:

Gránulos ad libitum.

TABLA 1 Composición de pienso de la dieta experimental

\vskip1.000000\baselineskip

6

\newpage

\global\parskip0.890000\baselineskip

TABLA 2 Rendimiento de los pollos de engorde varones; promedio \pm stdev

8

Ejemplo 6

Cepas de Bacillus con genes tipo L12, como se identifica por PCR

Los genes similares al gen que codifica a la proteína L12 (SEC ID NO:1) se identificaron en un número de otras cepas de Bacillus licheniformis por PCR. El ADN para su uso como un patrón para la reacción PCR se aisló a partir de once cepas de Bacillus licheniformis diferentes cultivadas durante toda la noche a 37ºC en placas de agar TY (para la fórmula, véase el Ejemplo 1). Un tubo de inoculación con células de cada cepa se suspendieron en 0,1 ml de H_{2}O y se hirvieron durante 10 min, se centrifugaron, y 5 microlitros de sobrenadante de cada uno se usaron como patrón de ADN en reacciones PCR como se describe abajo.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en "Pure TaqTM Ready-To GoTM PCR Beads" (perlas de PCR Pure TaqTM Ready-To GoTM) de Amersham Biosciences: 5 microlitros de patrón de ADN + 2 x 1 microlitros de cebador Pep481 (SEC ID NO:6) y Pep482 (SEC ID NO:7) + 18 microlitros de H_{2}O.

Programa de PCR: 1) 95ºC 3 min; 2) 95ºC 10 seg; 3) 65ºC 30 seg -1ºC pr. ciclo; 4) 72ºC 1 min; 5) Go To 2) 9 veces; 6) 95ºC 10 seg; 7) 55ºC 30 seg; 8) 72ºC 1 min; 9) Go To 6) 19 veces; 10) 72ºC 5 min; 11) 4ºC siempre, lo cual significa que tras la etapa 10) la temperatura se reduce a 4ºC.

Cebadores

Pep481

AATTACGCGTGTTGGTGCGATAGTAGTAACG-3' (SEC ID NO:6)

Pep482

TTAAGAATTCGAATGAAAGAGGAGGAATG-3' (SEC ID NO:7)

El fragmento PCR 0,4 kb resultante a partir de cinco cepas positivas (positivas significando dando una banda de ADN del tamaño adecuado) se purificó y se usó en un experimento de secuenciación de ADN, usando otra vez como cebadores de secuencia los cebadores Pep481 (SEC ID NO:6) y Pep482 (SEC ID NO:7).

Tres de las cinco cepas positivas dieron la misma secuencia de ADN: Bacillus licheniformis ATCC 14580, Bacillus licheniformis NCIMB 6346 (=DSM 8785) y la cepa de Bacillus licheniformis 712, dando como resultado la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En los cambios en el ADN de la cepa de Bacillus licheniformis 470 resultaron dos cambios aminoácidos (SEC ID NO:9), no obstante no se dió ningún cambio en el péptido maduro. En los cambios en el ADN de la cepa de Bacillus licheniformis 009 resultaron quince cambios aminoácidos (SEC ID NO:8), ocho de los cuales se dieron en el péptido maduro. Además, una secuencia de consenso (SEC ID NO:10) se derivó de las SEC ID NOs:2, 8 y 9.

Nótese que, en este experimento, los nucleótidos codificando los siete aminoácidos C-terminales de la SEC ID NO:2 se incluyen en el cebador Pep481 (SEC ID NO:6), y los siete residuos de aminoácidos C-terminales de las SEC ID NOs:8-9 pueden por lo tanto no ser correctos. No obstante la exactitud de las SEC ID NOs:8-9 se confirmó más tarde.

Una cepa de Bacillus licheniformis que se aisló del producto probiótico añadido en el pienso designada BioPlus^{TM}
2B (ofrecida por Chr. Hansen A/S, 10- 12 Boege Allé, DK-2970 Hoersholm, Dinamarca) se incluyó entre las once cepas testadas pero fue negativa.

Además, otras 44 cepas de Bacillus licheniformis se testaron como se ha descrito anteriormente. Se obtuvo una respuesta de PCR positiva en 27 de estas cepas. Ejemplos de cepas adicionales de Bacillus licheniformis públicamente disponibles que resultaron ser L12 positivas tienen los siguientes números de depósito: NCTC 1024, NCTC 1025, NCTC 2120, NCTC 7589, NCTC 9932, ATCC 21424, NCIMB 10689, ATCC 53757. NCTC es la National Collection of Type Cultures. ATCC es la American Type Culture Collection. NCIMB es la National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria.

Ejemplo 7

Termoestabilidad

La calorimetría por análisis diferencial (DSC) se usó para determinar la estabilidad a la temperatura de la proteína L12 a pH 2.5, 4.0 y 7.0. Se dializó L12 purificada en una concentración de aproximadamente 2 mg/ml durante la noche a 4ºC con un tampón apropiado y se llevó a cabo con un instrumento VP-DSC (MicroCal) con una tasa de barrido constante de 1,5ºC/min de entre 20 y 90ºC. La manipulación de datos se realizó usando el software Microcal Origin (versión 4.10), y la temperatura de desnaturalización se definió como temperatura en el ápice del valor máximo de entalpía. Se descubrió que la L12 tenía una temperatura de desnaturalización de 55ºC en 10 mM de ácido cítrico, 50 mM de cloruro sódico, a pH 2.5. En 10 mM de acetato sódico, 50 mM de NaCl, a pH 4.0, la L12 se desnaturalizó a 69ºC, y en 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de NaCl, a pH 7.0 la temperatura de desnaturalización fue de 60ºC.

Ejemplo 8

Modulación de la microflora intestinal in vivo e in vitro

La influencia de la proteína L12 en la microflora intestinal se evaluó a) in vivo, en lechones y cerdos de engorde; e b) in vitro, en microorganismos aislados de la microflora intestinal.

Estudio en lechones

Este estudio, el cual se realizó según los Reglamentos legales franceses para los experimentos con animales vivos, se hizo para evaluar el efecto de 5 ppm de L12 (5 mg de L12 purificada por kg de pienso) en microflora intestinal de lechón.

Diez lechones (híbridos de Large-White, Landrace, y Piétrain, obtenidos de GAEC Leclerc, Ostheim, Francia) de un peso corporal inicial de 25,3\pm1,3 kg se sometieron a anastomosis ileo-rectal (conectando el íleon terminal al extremo del recto, desviando el intestino ciego y el colon). En tales cerdos, la microflora del íleon terminal se puede recoger en el nivel de ano y es representativa de la población bacteriana de todas las partes digestivas consecutivas de los intestinos. Después de la cirugía, durante la recuperación de la misma, y durante el periodo experimental se colocó a los animales en jaulas metabólicas permitiendo un muestreo simple del contenido ileo-rectal.

Durante el periodo experimental de seis semanas, los lechones se alimentaron cada uno y de forma alternativa (en un diseño cuadrado latino doble, para reducir el efecto de variación individual y también cualquier influencia potencial de la secuencia de los tratamientos) con una dieta básica suplementada o no con compuestos de prueba. Las dietas estuvieron compuestas de la siguiente manera:

Dieta A: KLIBA, disponible a través de Provimi-Kliba, Kaiseraugst, Suiza, con un 18% de harina de soja, un 53% de maíz, un 13% de cebada, un 6% de comida de avena, un 5,4% de salvado de trigo, un 1% de aceite de soja, un 3,6% de minerales, vitaminas y aminoácidos sintéticos (p/p).

Dieta E: Dieta A con la adición de 5 mg/kg de la proteína L12.

Dietas B, C y D incluyeron otros compuestos de prueba sin relevancia para la presente invención.

Los compuestos de prueba (incluyendo L12) se incorporaron en las dietas en un mezclador Buhlen (Buhlen, Aschwill, Suiza). Las dietas experimentales se prepararon y administraron a los animales en una forma triturada.

Se permitió dar las dietas experimentales a los animales en el nivel de 2 kg al día distribuidos en dos comidas iguales a las 8:00 y a las 15:30.

Se tomaron muestras de contenido ileo-rectal de cada animal en el dos últimos días de cada periodo de tratamiento, y se determinaron las concentraciones de sustancia seca y de los diferentes ingredientes de la microflora.

Los animales no mostraron ningún síntoma de toxicosis o de enfermedad durante el experimento. Su aumento de peso diario durante la observación fue de 1,14+/-0,1 kg el cual es un rendimiento zootécnico muy bueno. Al final del experimento se eutanasió a los animales por inyección letal después de tranquilizarlos.

El contenido de la materia seca de las muestras se determinó tras secarla durante toda la noche a 105ºC, 1 g de muestra, según el procedimiento estándar de la Association of Official Analytical Chemists (AOAC) (1009) (Association of Official Analytical Chemists. (1990). (Official methods of analysis. 15ma edición. Association of Official Analytical Chemists. Arlington).

El análisis de la microflora se realizó de la siguiente manera:

Inmediatamente después de la emisión, 10 g de contenido ileo-rectal se transfirieron y homogeneizaron en matraces conteniendo 100 ml de caldo peptonado de cloruro sódico (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 10582).

Habiéndo pasado menos de 5 min entre las emisiones y la eliminación del contenido ileal el cual se transfirió rápidamente a una cámara anaeróbica (AES Cheminex, Combourg, Francia). Posteriormente, las muestras se diluyeron en serie en 10 etapas usando caldo peptonado de cloruro sódico de 10-^{1} a 10-^{8} (p/vol). Todas las cuentas bacterianas se consiguieron con dos placas de replicación.

El total de las cuentas anaeróbicas facultativas representa el número medio de colonias que crecieron en Brucella agar (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 10490) suplementado con sangre de oveja (5% vol/vol, suministrado por AES Cheminex, Combourg, Francia). Las placas se incubaron en un armario anaeróbico a 37ºC durante 5 días.

Las bacterias de ácido láctico se enumeraron en MRS agar (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 110660) y el Lactobacillus spp. en Rogosa agar (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 105413). Ambas placas se incubaron en un recipiente anaeróbico a 37ºC durante 48 h.

Las enterobacteriacae se contaron en V.R.B.D agar (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 110275). Escherichia coli y otras Enterobacteriacae se analizaron en un medio cromogénico Coli-ID (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia, catálogo nº. 42017). Este medio contiene dos sustratos cromogénicos: Uno para la detección de beta D-glucuronidasa (E. coli) produciendo colonias rosas, y uno para la detección de galactosidasa (otras Enterobacteriaceae) produciendo colonias azules. Ambas placas se incubaron aeróbicamente a 37ºC durante 24 h.

El Enterococcus spp. se evaluó en Enterococci agar (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 65009), y el Estafilococo spp. en Baird Parken agar (AES Cheminex, Combourg, Francia, catálogo nº. AEB150302) después de la incubación aeróbica a 37ºC durante 48 h.

Después del calentamiento de la muestra al baño maría a 80ºC durante 10 min, el Clostridium perfringens se aisló usando TSN agar (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia, catálogo nº. 51048) incubado en una cámara anaerobia a 46ºC durante 24 horas.

Las identidades de colonias representativas se confirmaron además por examen microscópico después coloración Gram y la prueba bioquímico usando el sistema API apropiado (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia).

Para cada grupo de prueba, el análisis estadístico de los datos implicó el cálculo de la desviación media y estándar de la media al igual que un análisis de variación seguido del Test "t" de estudiante para valorar la importancia de las diferencias entre los grupos.

Las cuentas bacterianas respectivas (número de unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de sustancia seca de contenido ileal (DM), +/- la desviación típica (SD) se presentan en la tabla 3 abajo, la cual también muestra la enmienda en las cuentas bacterianas respectivas provocadas por la adición de 5 ppm de L12, en relación al control.

TABLA 3 Contenido bacteriano de microflora Ileo-rectal de lechón

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En este ensayo, no se encontraron diferencias significantes en las cuentas bacterianas, sólo se observaron efectos numéricos, pero algunas veces estos fueron muy marcados.

Un efecto positivo de L12 se vió en la media del total de bacterias anaeróbicas facultativas, donde las cuentas aumentaron en un 49% en relación al control.

Un efecto neutral de L12 se vio en el total de bacterias de ácido láctico y en el total de Lactobacillus spp., las cuales son representativas de las bacterias beneficiosas de la microbiota intestinal. Lo mismo sucede con el total de Enterobacteriaceae. El componente principal de la población de Enterobacteriaceae en la microflora del lechón, Escherichia coli, aumentó en un 19% mientras que el grupo de otras Enterobacteriaceae (diferente de E. coli) las cuales son potencialmente patógenas se redujo fuertemente.

Un efecto negativo de L12 se vio en la población de Enterococcus spp.

Se encontró Clostridium perfringens en trece de las veinte muestras de control (Dieta A), mientras que éste sólo se encontró en seis de las veinte muestras con dieta suplementada con L12 (Dieta E). Por tanto esta población de bacterias patógenas se redujo fuertemente (en un 99%) con L12.

Estudio con pollos de engorde

En la prueba de crecimiento de pollos de engorde descrita en el ejemplo 5, también se evaluó el efecto de L12 (5 mg de L12 purificada por kg de alimento) en la microflora intestinal de los pollos de engorde.

El análisis de la microflora de doce animales por grupo se realizó como se describe anteriormente (el estudio del lechón), usando contenido de cecal, después del sacrificio de los pollos de engorde, como material inicial.

Los resultados de las cuentas de población bacteriana en el contenido cecal de los pollos de engorde se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Contenido bacteriano de la microflora cecal de pollos de engorde

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Se vio un efecto positivo de L12 en la flora anaeróbica facultativa total la cual aumentó estadísticamente de forma significativa en un 178%.

Esta variación se podría explicar por el aumento (digital) observado del total de bacterias de ácido lático observadas en el grupo suplementado con L12. El total de bacterias de ácido láctico representa la población principal de la flora anaerobia facultativa anaeróbica total y están compuestas principalmente por especies de Lactobacillus que jugan un papel importante en los beneficios impartidos por la microbiota normal para la salud del hués-
ped.

Las cuentas de escherichia coli aumentaron numéricamente, pero no significativamente de forma estadística, en el grupo suplementado con L12. Este es consistente con el aumento en las cuentas de los otros dos grupos de microorganismos. Todos los animales implicados en este experimento tenían una microflora cecal saludable y equilibrada y no se observó ninguna enfermedad diarreica en los animales durante la prueba, sugeriendo que fueron las cepas de escherichia coli comensales las que podían haber aumentado.

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Modulación de la microflora intestinal in vitro

El efecto de L12 en la microflora se evaluó posteriormente in vitro. Las bacterias representativas de microorganismos beneficiosos y nocivos de la microbiota intestinal se aislaron del contenido intestinal del lechón y del pollo de engorde. Sus identidades se confirmaron por examen microscópico después de la coloración Gram y la prueba bioquímica usando el sistema API apropiado (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia).

El efecto de L12 sobre el crecimiento bacteriano de estas bacterias se determinó por el método de dilución en caldo por microtitulación midiendo la absorbancia a 595 nm. Todos estos ensayos in vitro se realizaron en placas esterilizadas de 96 pocillos (placas de microtitulación Falcon 353072, Becton Dickinson Labware, Meylan, Francia) en un volumen final de 110 microlitros como sigue: 100 microlitros de suspensión conteniendo aproximadamente 10^{5} CFU/mL de las bacterias puras en caldo de soja tríptica (Merck, Darmstadt, Alemania, catálogo nº. 105459) se añadieron a 10 microlitros de agua conteniendo L12 en diluciones de 2 etapas en serie o a 10 microlitros de agua como control. La inhibición del crecimiento se determinó midiendo la absorbancia a 595 nm con un Multiskan Ascent (TermoLabsystems, Helsinki, Finlandia) después del tiempo apropiado de incubación a la temperatura apropiada para el crecimiento óptimo de las bacterias puras, véase la Tabla 5.

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TABLA 5 Condiciones de incubación

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La reducción en la densidad del cultivo se determinó substrayendo el OD595 del cultivo de prueba después de 24 ó 48 horas (según la Tabla 5) a partir del OD_{595} del cultivo de control. La reducción en la densidad del cultivo se normalizó expresando ésta como un porcentaje del OD_{595} del cultivo de control y el MIC_{90} correspondió a la concentración de L12 requerida para reducir la densidad de cultivo en un 90%, significando inhibir el crecimiento en un 90% del organismo testado (MIC_{90} estando definido como la Concentración Inhibitoria Mínima requerida para inhibir el crecimiento del 90% de los organismos).

Los resultados de estas evaluaciones se muestran en la Tabla 6.

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TABLA 6 MIC_{90} contra bacterias aisladas de contenido intestinal de lechón y pollo de engorde

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L12 es más activa contra cocos Gram positivos y clostridia aislada a partir del contenido del cerdo y del pollo de engorde que las bacterias Gram negativas aisladas a partir del mismo.

Estos resultados explicaron al menos parcialmente la influencia de L12 en la microbiota gastro-intestinal:

El efecto observado de L12 in vitro en Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium confirmó la reducción observada de Enterococcus spp. observada in vivo en los lechones.

El efecto observado de L12 in vitro en la especie Lactobacillus confirmó los resultados de los estudios in vivo del lechón y el pollo de engorde de que L12 no tiene una influencia negativa in vivo sobre la especie Lactobacillus de cerdos y aves.

El efecto observado de L12 in vitro en Clostridium perfringens aislada a partir de contenido intestinal de pollo de engorde confirmó la fuerte reducción de esta población observada in vivo en lechones.

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Ejemplo 9

Rendimiento en pienso in vivo (prueba en jaulas) - diferentes dosificaciones

El rendimiento de la proteína L12 en pienso se evaluó en una prueba de crecimiento de pollo de engorde con los siguientes parámetros:

Prueba crecimiento:

día 8 a día 29 (día 0 = día de incubación)

Tratamientos:

A: control; B: 2,5, 5,0, y 7,5 mg de proteína L12 purificada por kg de pienso

Dietas:

Maíz/dieta SBM48 (véase composición de pienso, Tabla 7).

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Después de mezclar el pienso se granuló a aproximadamente 70ºC (3 x 25 mm). La proteína L12 se disolvió en 500 ml de agua y se pulverizó sobre los gránulos. Para el tratamiento de control se pulverizó la misma cantidad de agua sobre los gránulos.

Réplica:

10 grupos de 6 pollos machos, ROSS PM3, por tratamiento

Alimentación:

Gránulos ad libitum.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Composición de pienso de la dieta experimental

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TABLA 8 Rendimiento de pollos de engorde machos; promedio \pm stdev

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Ejemplo 10

Determinación de concentración

Se usó una preparación de proteína L12 purificada como un estándar de proteína L12. Se preparó como se describe en el Ejemplo 4, y se formuló con glicerol como se describe en el Ejemplo 2. La pureza fue de más del 96%, según se midió por HPLC (usando un módulo de separación Waters 2690 y un detector de UV Waters 2487, detectando a 280 nm, usando las columnas ACE C18 5 \mum 100A 150x3,0 mm y Waters \mu-Bondapak C18 20x3,9 mm (columna de dispositivo de seguridad), una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, un volumen de inyección de 10 microlitros, fase móvil A: H2 O 18M_ + 0,1% de TFA (Ácido acético Triflúor), fase móvil B acetonitrilo + 0,1% de TFA).

La concentration de L12 del estándar fue de 3,6 mg de proteína pura/ml por, según se determina por Análisis de Aminoácidos (como se describe abajo).

La pureza y la concentración de varias otras muestras de L12 se determinó por un método de gel de SDS-PAGE como también se describe abajo, por referencia a este estándar.

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Análisis de Aminoácidos (AAA) - concentración del estándar de proteína L12

Los enlaces peptídicos de la muestra estándar de proteína L12 se sometieron a hidrólisis ácida, seguida de la separación y la cuantificación de los aminoácidos liberados en un Analizador de Aminoácidos Biochrom 20 Plus, disponible comercialmente a través de Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Dinamarca, según las instrucciones del fabricante. Para la hidrólisis ácida, la muestra de proteína se secó en un centrifugador de vacío, resuelto en un 18,5% (vol/vol) de HCl + 0,1% (vol/vol) de fenol y se incubó durante 16 hr a 110ºC. Tras la incubación, la muestra se secó otra vez en el centrifugador de vacío, se resolvió en un tampón de carga (0,2 M de Na-Citrato, a pH 2.2) y se cargó sobre el Analizador de Aminoácidos Biochrom 20 Plus.

Para la cuantificación, la muestra hidrolizada se cargó sobre una columna de la resina de intercambio de catión UltroPac nº. 8, en forma de sodio, la cual está comercialmente disponible a través de Bie & Berntsen A/S, catálogo nº. 80-2104-15. Los tampones de pH variable (pH 1 a pH 8) y fuerza iónica se bombearon a través de la columna según las instrucciones del fabricante referidas arriba, para separar los diferentes aminoácidos. La temperatura de la columna se controló con precisión, también según las instrucciones del fabricante (de 53ºC a 92ºC y de otra vez a 53ºC) para asegurar la separación requerida. El eluyente de columna se mezcló con reactivo de ninhidrina (Bie & Berntsen, catálogo nº. 80-2038-07) y la mezcla se pasó a través de la bobina de reacción de alta temperatura del Analizador de Aminoácidos. En la bobina de reacción, la ninhidrina reaccionó con los aminoácidos para formar compuestos coloreados, la cantidad de la cual era directamente proporcional a la cantidad de aminoácidos presentes.

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Concentración de muestras de proteína L12

La concentración de varios muestras de L12 se determinó por el siguiente procedimiento (todos los productos Novex referidos están disponibles comercialmente a través de Invitrogen, véase www.invitrogen.com):

50 microlitros de solución de L12 (0,1-1,0 mg de L12 por ml) se mezclaron con 5 microlitros al 1% (p/v) de EDTA + 10 microlitros al 6% de PMSF + 10 microlitros de 0,5M de DTT + 25 microlitros de tampón de muestra NuPage LDS (NP0007 de Novex) en un tubo Eppendorf, y el tubo se calentó a 95ºC durante 5 minutos. Se añadieron 10 microlitros de muestra a un 10% de gel prefundido de Tris-Bis (NP0301 BOX de NOVEX). La electroforesis se realizó con un tampón de desplazamiento MES (MES=ácido 2-(N-morfolino) etan sulfónico; NP0002 de NOVEX) + antioxidante (NP0005 de NOVEX) a un voltaje constante de 200 V según las instrucciones del fabricante. Después de la electroforesis, el gel se agitó suavemente en un 10% de ácido acético + un 50% de EtOH durante 10 minutos. El gel se agitó después suavemente con una solución de coloración Colloidal Blue (46-7016 de NOVEX) durante un mínimo de tres horas y se lavó por agitación suave durante 2 a 4 horas con agua destilada con diferentes cambios de agua destilada. El gel mojado se escaneó con un densitómetro calibrado BioRad Calibrated Densitometer GS-800 equipado con el software Quantity One (versión 4.6.0, BioRad) y la proteína L12 se cuantificó según las instrucciones del fabricante. El estándar de L12 anteriormente descrito se usó como un estándar, es decir, en tres-cuatro diluciones en el rango de 0,1-1,0 mg/ml.

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Ejemplo 11

Estabilidad con pepsina y pancreatina

L12 nativa: Proteína L12 purificada, diluida a 1 mg/ml en un tampón de 10 mM de Tris/CH_{3}COOH a pH 4.5.

L12 desnaturalizada: Una muestra de L12 purificada (1 mg/ml en un tampón de 10 mM de Tris/CH_{3}COOH a pH 4.5) se hirvió durante 5 minutos para desnaturalizar la proteína.

Pepsina: pepsina porcina (Sigma P-7000, 453 unidades/mg de sólido). 30000 unidades/ml se disolvieron en 10 mM de ácido succínico a pH 3.0.

Pancreatina: Pancreatina porcina (Sigma P-7545, 8xUSP). 80 mg/ml se suspendieron en tampón de Na-fosfato de 0,5 m a pH 7.0.

Tampón a pH 3: 10 mM de ácido succínico a pH 3.0.

Tampón a pH 7: Tampón de Na-fosfato de 0,5 M a pH 7.0.

Se prepararon las siguientes muestras:

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1) L12 incubada con Pepsina y Pancreatina

278 microlitros de L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de tampón a pH 3 se incubó durante 2 horas a 40ºC con agitación, el pH se midió en 3.5. Entonces se añadieron 400 microlitros de tampón a pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina y después se incubó durante 4 horas a 40ºC con agitación, el pH se midió en 7.0.

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2) L12 incubada con Pepsina

278 microlitros de L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de tampón a pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40ºC con agitación (el pH se midió en 3.5). Luego se añadieron 500 microlitros de tampón a pH 7 (el pH se midió en 7.0).

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3) L12 incubada con Pancreatina

278 microlitros de L12 nativa o desnaturalizada + 222 microlitros de tampón a pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40ºC con agitación. Entonces se añadieron 400 microlitros de tampón a pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina seguido de su incubación durante 4 horas a 40ºC con agitación.

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4) Muestra de control de L12

278 microlitros de L12 nativa o desnaturalizada + 100 microlitros de solución de pepsina + 122 microlitros de tampón a pH 3 + 400 microlitros de tampón a pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina se mezclaron en hielo y se mantuvieron fríos.

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5) Muestra de control de pepsina

100 microlitros de solución de pepsina + 400 microlitros de tampón a pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40ºC con agitación (el pH se midió en 3.5). Entonces se añadieron 500 microlitros de tampón a pH 7.

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6) Muestra de control de pancreatina

500 microlitros de tampón a pH 3 + 400 microlitros de tampón a pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina se incubaron durante 4 horas a 40ºC con agitación (el pH se midió en 7.0).

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7) Muestra de control de Pepsina + Pancreatina

100 microlitros de solución de pepsina + 400 microlitro de tampón a pH 3 se incubaron durante 2 horas a 40ºC con agitación (el pH se midió en 3.5). Luego se añadieron 400 microlitros de tampón a pH 7 + 100 microlitros de suspensión de pancreatina seguido de su incubación durante 4 horas a 40ºC con agitación (el pH se midió en
7.0).

Todas las muestras se analizaron por SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 10. Según el SDS-PAGE, la L12 nativa no fue degradada por pepsina, pancreatina o un tratamiento de pepsina seguido por pancreatina. La L12 desnaturalizada fue degradada extensivamente por pepsina, pancreatina o un tratamiento de pepsina seguido por pancreatina ya que no se detectó ninguna banda de L12 en el gel SDS en las muestras correspondientes.

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Ejemplo 12

Rendimiento del pienso in vivo (prueba en corral)

Este ejemplo evalúa los efectos de la proteína L12 en el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde a lo largo de un ciclo de crecimiento completo de 36 días.

Se realizó una prueba de rendimiento de crecimiento con pollos de engorde del día 1 al día 36.

Los animales se alojaron en corrales cuyo suelo se había cubierto con virutas. Durante el periodo inicial (días 1-22) y durante el periodo del cultivo (días 22-36) los pollos recibieron una dieta a base de trigo, centeno y harina de soja (para composición véase la Tabla 9). Junto a un tratamiento de control no suplementado, se incluyó proteína L12 en una dosificación de 7,5 mg de proteína por kg de alimento.

Prueba de crecimiento:

Día 1 a día 36 (día 0 = día de incubación)

Dietas:

Trigo/centeno/SBM48 dieta (véase la composición alimentaria en la Tabla 9)

Alimentación:

Gránulos ad libitum.

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Después de la mezcla, el pienso se granuló a aproximadamente 70ºC (3 x 25 mm). La proteína L12 se disolvió en 800 ml de agua para el pienso inicial y 1200 ml de agua para el pienso de cultivo, respectivamente, y se pulverizó sobre los gránulos. Para el tratamiento de control se pulverizó la misma cantidad de agua sin la proteína L12 sobre los gránulos, respectivamente.

Tratamientos:

Control, 7,5 mg de proteína L12 por kg de pienso

Réplicas:

6 grupos de 20 pollos por sexo y tratamiento (6 grupos de 20 hembras, 6 grupos de 20 machos).

TABLA 9 Composición de pienso de la dieta experimental

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TABLA 10 Rendimiento de los pollos de engorde; promedio \pm stdev

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La proteína L12 mejoró el aumento de peso de los pollos ligeramente (Tabla 10), sin embargo este efecto no fue significante. El consumo de pienso de los pollos recibiendo la proteína L12 no fue diferente al de los pollos de control. El coeficiente de conversión de alimentos (FCR) mejoró significativamente por la proteína L12 en comparación con el control, es decir, en un 2,7%.

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Ejemplo 13

Pienso y aditivo Aditivo para pienso

Se prepara un aditivo para pienso añadiendo 25 g de un granulado T revestido comprendiendo la proteína L12 purificada en una cantidad de 20 g/kg (preparado como se describe en el Ejemplo 3 de la EP 569468 B1, no obstante con un revestimiento de aprox. un 7% de aceite de palma hidrogenado y aprox. un 13% de CaCO_{3}) a la siguiente premezcla (por kilo de premezcla):

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Pienso

Se prepara una dieta de cultivo para pollos de engorde teniendo la siguiente composición (%, p/p) mezclando los ingredientes. Trigo, centeno y SBM 48 están disponibles a través de Moulin Moderne Hirsinque, Hirsingue, Francia. Después del mezclado, el pienso se granula a una temperatura deseada, por ejemplo a aproximadamente 70ºC (3 x 25 mm).

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El pienso resultante comprende 5,0 mg de proteína L12 purificada por kg (5 ppm).

Pienso adicional y composiciones aditivas para el pienso se preparan de la misma manera, no obstante substituyendo 25 g de granulado L12 CT revestido por kg de la premezcla por 10^{13} unidades formadoras de colonias (CFU), preferiblemente en forma de endosporas, de Bacillus licheniformis ATCC 14580, lo cual resulta en un pienso con aproximadamente 10^{8} CFU por g de la composición de pienso.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Documentos de patente citados en la descripción

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<110> Novozymes A/S

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> Polipéptidos

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 10799.204-WO

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<160> 10

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 381

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<212> ADN

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<213> Bacillus licheniformis ATCC 14580

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(378)

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> mat_peptide

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<222> (124)..(378)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

22

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 126

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<212> PRT

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<213> Bacillus licheniformis ATCC 14580

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

23

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1581

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<212> ADN

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<213> Bacillus licheniformis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

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<222> (601)..(978)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip0,8cm

24

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<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bacillus licheniformis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip0,8cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Bacillus licheniformis ATCC 14580

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N-terminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip0,8cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de cebador 481

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip0,8cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de cebador 482

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip0,8cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Cepa de Bacillus licheniformis 009

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (41)..(125)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

29

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Cepa de Bacillus licheniformis 470

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> mat_peptide

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (42)..(126)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 126

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<212> PRT

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Secuencia de consenso

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<220>

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<221> mat_peptide

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<222> (42)..(126)

\newpage

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<400> 10

\hskip0,8cm

31

Claims (10)

1. Constructo de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos, cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y cuya secuencia de ácidos nucleicos

(a)

hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); y/o

(b)

tiene un grado de identidad con los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1 de al menos un 48%, como se determina por el programa align usando la matriz de identidad por defecto, una penalización de -16 para el primer residuo de un espacio y penalizaciones de -4 para posteriores residuos de un espacio;

con la condición de que la secuencia de ácidos nucleicos no sea de la SEC ID NO:3, no sean los nucleótidos 601-978 de la SEC ID NO:3, y no sean los nucleótidos 1-381 de la SEC ID NO:1 estando los polinucleótido operativamente vinculados a una o más secuencias de control que dirijan la producción del polipéptido en una célula huésped de Bacillus, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

2. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación
1.

3. Célula huésped de Bacillus recombinante comprendiendo el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 1 o el vector según la reivindicación 2, el ADN de cuya célula huésped, al recogerse y usarse como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb.

4. Método para la producción de un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de codificación de polipéptidos del constructo según la reivindicación 1, cuyos polipéptidos mejoran la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), comprendiendo el método (a) cultivar una célula huésped recombinante según la reivindicación 3 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

5. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 4, comprendiendo el método (a) cultivar una cepa de Bacillus, el ADN de la cual, cuando se recoge y se usa como un patrón de ADN en una reacción de PCR con las SEC ID NOs:6 y 7 como cebadores, conlleva a la generación de un fragmento de PCR de un tamaño de aproximadamente 0,4 kb, cuyo fragmento de PCR codifica una secuencia de aminoácidos con al menos un 33% de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y (b) recuperar el polipéptido.

6. Uso en pienso para objetivos no terapéuticos de un polipéptido, lo cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c)

un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

7. Uso en la preparación de una composición para su uso en pienso de un polipéptido, la cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

\newpage

(c)

un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

8. Método no terapéutico para mejorar el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), donde un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), se añade al pienso, estando seleccionado el polipéptido del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c)

un polipéptido que está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de a SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

9. Un aditivo para pienso comprendiendo un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), y al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en vitaminas liposolubles, vitaminas hidrosolubles, oligoelementos, y macrominerales, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c)

un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).

10. Una composición de pienso con un contenido bruto de proteína de 50 a 800 g/kg y comprendiendo un polipéptido, el cual mejora la utilización del pienso mejorando el coeficiente de conversión de alimentos (FCR), seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polipéptido teniendo los aminoácidos 1-126 de la SEC ID NO:4;

(b)

un polipéptido comprendiendo una secuencia de aminoácidos teniendo un grado de identidad con los aminoácidos 1-85 de la SEC ID NO:2 de al menos un 33%, como se determina por el programa Needle, usando la matriz de sustitución BLOSUM62, una penalización de abertura de espacio de 10, y una penalización de extensión de espacio de 0,5 y

(c)

un polipéptido el cual está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que hibridiza bajo condiciones de astringencia medias con (i) los nucleótidos 124-378 de la SEC ID NO:1, (ii) una subsecuencia de (i) de al menos 100 nucleótidos, y/o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii).