ES2349804T3 - Procedimiento para diagnosticar enfermedades basado en niveles de anticuerpos anti-glicanos. - Google Patents

Procedimiento para diagnosticar enfermedades basado en niveles de anticuerpos anti-glicanos. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento útil en el diagnóstico de la enfermedad de Crohn en un sujeto, comprendiendo el procedimiento identificar en una muestra para análisis de un sujeto con síntomas de la enfermedad de Crohn un anticuerpo dirigido contra glicanos específico, en el que dicho anticuerpo dirigido contra glicanos específico es un anticuerpo anti-GlcNAc(& 946;,1-4)GlcNAc(& 946;) o un anticuerpo antiGlc(& 946;,1-3)Glc(& 946;), en el que la identificación de niveles elevados de dicho anticuerpo en dicha muestra para análisis respecto a una muestra de control indica que es probable que el sujeto padezca la enfermedad de Crohn.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere en general a un procedimiento para diagnosticar enfermedades mediante la detección de anticuerpos de glicanos en un sujeto. Más concretamente, la invención se refiere a procedimientos útiles para diagnosticar enfermedades digestivas tales como la enfermedad de Crohn (EC).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que se produce en todo el mundo y afecta a millones de personas, es el término colectivo usado para describir dos trastornos gastrointestinales de etiología desconocida: la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU). La EII y el síndrome del intestino irritable (SII) afectarán a la mitad de los estadounidenses durante su vida, con un coste de varios miles de millones de dólares. El factor determinante principal de estos elevados costes médicos es la dificultad de diagnóstico de las enfermedades digestivas. El coste asociado con EII y al SII se ve aumentado debido a la pérdida en la productividad, puesto que las personas que padecen estos trastornos faltan a su trabajo una media de al menos ocho días más al año que las personas que no padecen estos trastornos.
El resto de síntomas asociados a la EC incluyen, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea crónica, sangrado rectal, pérdida de peso y retortijones. Estos síntomas también se producen en el síndrome del intestino irritable y otras enfermedades inflamatorias intestinales. Esto hace que el diagnóstico definitivo de la EC sea extremadamente difícil. De hecho, sólo se ha diagnosticado la enfermedad a aproximadamente una décima parte de los varios millones de personas que posiblemente padezcan la EC. La dificultad en el diagnóstico diferencial de la EC respecto a otras enfermedades digestivas como la CU y el SII obstaculiza el tratamiento temprano y eficaz de estas enfermedades.
La EC (ileítis regional o ileítis terminal) puede afectar a cualquier parte del intestino, siendo el íleon y el colon los lugares más habitualmente afectados. En la EC, la inflamación es asimétrica y segmentaria, con áreas de tejido tanto sano como enfermo. En contraposición, la CU (proctocolitis idiopática hemorrágica) está caracterizada por una inflamación simétrica -restringida a la mucosa y la submucosa -que asciende de forma ininterrumpida desde el recto hasta el colon.
La EC generalmente se diagnostica usando endoscopia GI superior o inferior y/o mediante examen con rayos X del intestino delgado, incluyendo el íleon. En la EC no se observa ninguna imagen endoscópica típica, mientras que en la CU el patrón típico detectado es una mucosa roja inflamada con sangrado. Las muestras de biopsias con EC revelan además inflamación transmural con linfocitos, macrófagos y células plasmáticas, mientras que es típica de la CU una inflamación de la mucosa/submucosa con granulocitos, eosinófilos y células plasmáticas. Cuando la inflamación se limita al colon, puede ser muy difícil diferenciar entre CU y CU restringida al colon (también conocida como colitis por EC).
El síndrome antifosfolipídico (SAP) está caracterizado por trombosis venosa o arterial, abortos recurrentes y trombocitopenia, que es un bajo número de plaquetas en sangre, lo que puede producir sangrado, que se observa como hematomas y pequeños puntos rojos sobre la piel. Los pacientes con SAP también pueden experimentar síntomas de derrame cerebral tales como ataques isquémicos transitorios (AIT).
El síndrome antifosfolipídico generalmente se diagnostica en base a estas manifestaciones clínicas y a los resultados de análisis clínicos. Se analiza una muestra de sangre en busca de la presencia de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes de forma natural complejadas con fosfolípidos. Éstos se denominan anticuerpos antifosfolípidos o anticuerpos anticardiolipina (cardiolipina es un tipo de fosfolípido usado en análisis clínicos). A veces, estos anticuerpos se denominan anticoagulantes lúpicos cuando se usan ensayos de coagulación para su detección.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los pacientes con la enfermedad de Crohn (EC) o el síndrome antifosfolipídico (SAP) tienen elevados niveles en suero de determinados anticuerpos isotipos IgG, IgA e IgM específicos para determinadas estructuras de glicanos, en comparación con tales niveles en individuos sanos o en individuos con otros tipos de enfermedades gastrointestinales.
En concreto, la presente invención proporciona un procedimiento útil para diagnosticar la enfermedad de Crohn en un sujeto, comprendiendo el procedimiento
identificar, en una muestra para análisis de un sujeto con síntomas de la enfermedad de Crohn, un anticuerpo dirigido contra glicanos específico, en el que dicho anticuerpo dirigido contra glicanos específico es un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) o un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β),
en el que la identificación de niveles elevados de dicho anticuerpo en dicha muestra para análisis respecto a una muestra de control indica que es probable que el sujeto padezca la enfermedad de Crohn.
Entre las ventajas de la revelación se encuentra un procedimiento de análisis serológico de elevada sensibilidad para distinguir sin duda la EC de otras enfermedades digestiva, incluso cuando la inflamación se limita al colon. Los ensayos de detección primaria de elevada sensibilidad de la descripción proporcionan a los médicos una forma barata de diferenciar rápidamente individuos con la EC de individuos no enfermos o individuos con CU o con el SII. Esto facilita una intervención terapéutica más temprana y adecuada y minimiza la incertidumbre de los pacientes y sus familias. Según un aspecto, la descripción proporciona un procedimiento de diagnóstico de la EC en un sujeto proporcionando una muestra para análisis del sujeto y detectando en la muestra para análisis al menos uno de los siguientes anticuerpos anti-glicanos: un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato, un anticuerpo antidextrano, un anticuerpo anti-xilano, un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal 3-sulfato (β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-3)GalNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,13)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Gal(α), un anticuerpo anti-Gal(β), un anticuerpo anti-GalNAc(α), un anticuerpo anti-Glc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,1-6)Gal(β), o un anticuerpo anti-GlcNAc(β,16)GalNAc(α). La presencia de uno o más de los anticuerpos en la muestra para análisis identifica el sujeto como que padece la EC.
En algunas realizaciones, los niveles del anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos en la muestra para análisis se comparan con los niveles de anticuerpos anti-glicanos en una muestra de control. La muestra de control se elige de un grupo que incluye uno o más individuos de los que se tiene conocimiento de que padecen o no un trastorno gastrointestinal, o de que padecen o no un trastorno gastrointestinal diferente a la EC. Cuando la muestra de control es de un individuo o individuos que no padecen la EC, o que padecen una enfermedad gastrointestinal diferente a la EC, los elevados niveles en la muestra para análisis respecto a la muestra de control identifican al sujeto como que padece la EC.
En algunas realizaciones, la muestra de control es de uno o más individuos con un trastorno gastrointestinal que es el síndrome del intestino irritable, colitis ulcerosa u otras enfermedades digestivas. En algunas realizaciones, la muestra de control es de uno o más individuos que no padecen un trastorno gastrointestinal.
En diversas realizaciones, se detectan al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o la totalidad de estos anticuerpos.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además la determinación de si la muestra para análisis tiene un anticuerpo anti-manano, que también se conoce como un anticuerpo anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA). La presencia del anticuerpo anti-manano en la muestra identifica el sujeto como que padece la EC.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además la determinación de si la muestra para análisis tiene anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA). La presencia de ANCA indica que el sujeto no padece la EC, pero puede padecer colitis ulcerosa.
La muestra para análisis puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen, por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, fluido medular, orina o saliva.
En algunas realizaciones, se detectan uno, dos, tres, cuatro o los cinco de un anticuerpo antiGlc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), anticuerpos anti-Man(α,1-3) [Man(α,16)]Man(a) y anticuerpos anti-Man(α) y/o anti-manano.
El procedimiento puede incluir opcionalmente la determinación del isotipo del anticuerpo. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir la determinación de si el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgM, IgA o IgG. En algunas realizaciones, el procedimiento se usa para identificar y comparar uno o más de un anticuerpo anti-Glc(β) IgG, un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β) IgG, un anticuerpo anti-Glc(β,14)Glc(β) IgG, un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato IgG, un anticuerpo anti-Man(α) IgG, un anticuerpo anti-Man(α,1-3) [Man (α,1-6)] Man(β) IgG, un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α) IgG, un anticuerpo anti-manano IgG, un anticuerpo anti-manano IgA, un anticuerpo anti-xilano IgG o un anticuerpo antiMan(α,1-2)Man(α) IgG.
En algunas realizaciones, se considera que un sujeto padece la EC si la muestra para análisis tiene niveles elevados de anticuerpos IgG anti-Glc(β,1-3)Glc(β), IgG anti-Man(α,1-3) Man(α), IgG antimanano (ASCA), o anticuerpos IgA anti-manano (ASCA), pero no tiene niveles elevados de ANCA respecto a los niveles de una muestra de control.
En algunas realizaciones, se considera que un sujeto padece una EII si la muestra para análisis tiene niveles elevados de anticuerpos IgG anti-Glc(β,1-3)Glc(β), IgG anti anti-Man(α,13)Man(α), IgG anti-manano (ASCA), anticuerpos IgA anti-manano (ASCA) o ANCA respecto a los niveles de una muestra de control tomada de un sujeto que se sabe que no padece la EC.
En algunas realizaciones, se considera que un sujeto padece una enfermedad digestiva que no es una EII si la muestra para análisis tiene niveles elevados de IgA anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)y bajos niveles de anticuerpos anti-manano (ASCA) respecto a una muestra de control.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos se detectan usando un anticuerpo fluorescente o se detectan usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La muestra para análisis puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen, por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, fluido medular, orina o saliva.
El procedimiento puede incluir opcionalmente la determinación del isotipo del anticuerpo. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir la determinación de si el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgM, IgA o IgG.
Según otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento útil en el diagnóstico de la EC en un sujeto. El procedimiento incluye proporcionar una muestra para análisis de un sujeto y determinar si un anticuerpo dirigido contra glicanos está presente en la muestra para análisis. Al menos un anticuerpo dirigido contra glicanos es un anticuerpo IgG Glc(β,1-3)Glc(β) o un anticuerpo IgG antiGlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β). La presencia de al menos un anticuerpo en la muestra para análisis identifica al sujeto como que padece la EC.
En algunas realizaciones, los niveles de anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos en la muestra para análisis se comparan con los niveles de anticuerpos anti-glicanos en una muestra de control. La muestra de control se elige de un grupo que incluye uno o más individuos de los que se tiene conocimiento de que padecen o no un trastorno gastrointestinal, o de que padecen o no un trastorno gastrointestinal diferente a la EC. Cuando la muestra de control es de un individuo o individuos que no padecen la EC o que padecen una enfermedad gastrointestinal diferente a la EC, los elevados niveles en la muestra para análisis respecto a la muestra de control identifican al sujeto como que padece la EC.
En algunas realizaciones, la muestra de control es de uno o más individuos con un trastorno gastrointestinal que es el síndrome del intestino irritable o colitis ulcerosa u otras enfermedades digestivas. En algunas realizaciones, la muestra de control es de uno o más individuos que no padecen un trastorno gastrointestinal.
Según otro aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para diagnosticar de forma diferencial la EC o una EII en un sujeto. El procedimiento incluye proporcionar una muestra para análisis de un sujeto y determinar si la muestra tiene un anticuerpo que sea un anticuerpo anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA), un anticuerpo IgG anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un IgG ASCA y/o IgA ASCA. La ausencia de ANCA y la presencia de al menos uno de los anticuerpos IgG anti-Glc(β,13)Glc(β), IgG ASCA e IgA ASCA en la muestra para análisis indica que el sujeto padece la EC, y la presencia de al menos uno de los anticuerpos en la muestra para análisis indica que el sujeto padece una EII.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos se detectan usando un anticuerpo fluorescente o se detectan usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La muestra para análisis puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen, por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, fluido medular, orina o saliva.
La descripción proporciona adicionalmente un procedimiento útil en el diagnóstico diferencial de la colitis por EC y la colitis ulcerosa en un sujeto. El procedimiento implica la determinación de al menos un anticuerpo dirigido contra glicanos en una muestra de un sujeto. El anticuerpo dirigido contra glicanos puede ser uno o más de un anticuerpo IgG anti-Gal(α,1-4)GlcNAc(α), un anticuerpo IgG anti-Gal(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo IgG anti-GalNAc(α), un anticuerpo IgG anti-Glc(α), un anticuerpo IgG anti-Glc(β), un anticuerpo IgG anti-GlcNAc(β,6-sulfato), un anticuerpo IgG antiGlcNAc(β), un anticuerpo IgG anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α), un anticuerpo IgA anti-Gal(α,1-3)Gal(β,14)GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo IgA anti-Gal(α,1-4)Gal(β,1-4) Glc(β), un anticuerpo IgA anti-Gal(β), un anticuerpo IgA anti-Gal(β,1-3)[GlcNAc(β,1-6)]GalNAc(α), un anticuerpo IgA antiGal(β,1-3)GlcNAc(β), un anticuerpo IgA anti-Gal(β,1-6)Gal(β), un anticuerpo IgA anti-GalNAc(α), un anticuerpo IgA anti-GalNAc(β), un anticuerpo IgA anti-Glc(β), un anticuerpo IgA anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo IgA anti-GlcNAc(β), un anticuerpo IgA anti-GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo IgA anti-GlcNAc(β,1-3)GalNAc(α), un anticuerpo IgA anti-GlcNAc(β,1-4)Glc-NAc(β), un anticuerpo IgA anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α) o un anticuerpo IgA anti-Xyl(β). La presencia de al menos un anticuerpo en la muestra para análisis indica que el sujeto padece colitis por EC.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además comparar los niveles de al menos un anticuerpo dirigido contra glicanos en la muestra para análisis con los niveles de al menos un anticuerpo dirigido contra glicanos en una muestra de control, de forma que la muestra de control es de uno o más individuos de los que se tiene conocimiento de que padecen o no colitis por enfermedad de Crohn, o de uno o más individuos de los que se tiene conocimiento de que padecen o no colitis ulcerosa (CU).
En algunas realizaciones, el procedimiento implica la determinación de si hay presentes en la muestra un anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos adicionales. El anticuerpo dirigido contra glicanos adicional es uno o más de un anticuerpo IgG anti-Gal(α), un anticuerpo IgG anti-Man(α), un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo IgA anti-Man(α), un anticuerpo IgA anti-Man(α,12)Man(α), un anticuerpo IgA anti-Man(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo IgA anti-Man(β,13)Man(α), un anticuerpo IgA anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo IgA anti-Man(β) o un anticuerpo IgA anti-X(α). La presencia del anticuerpo o anticuerpos adicionales en la muestra para análisis identifica al sujeto como que padece colitis por EC.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o anticuerpos adicionales es un anticuerpo IgA antiGlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) y/o un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α).
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye la detección de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o doce de los anticuerpos.
En algunas realizaciones, la muestra para análisis es un fluido biológico (por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, orina o saliva).
También se proporciona un procedimiento para el diagnóstico diferencial de una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) o una enfermedad digestiva que no es una EII (NIC) en un sujeto. El procedimiento implica proporcionar una muestra para análisis de un sujeto con síntomas de NIC o EII y determinar si hay presentes anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido (GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)) (ACCA) y anticuerpos anti-manano (ASCA) en la muestra. La presencia de anticuerpos ACCA y la ausencia de anticuerpos ASCA en la muestra identifican al sujeto como que padece una NIC.
En algunas realizaciones, los niveles de anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido (GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)) (ACCA) y/o anticuerpos anti-manano (ASCA) se determinan comparando los niveles de los anticuerpos con tales niveles en una muestra de referencia de un sujeto que se sabe que padece una EII. Un nivel mayor de anticuerpos ACCA y un nivel menor de anticuerpos ASCA en la muestra para análisis respecto a la muestra de referencia identifican al sujeto como que padece una NIC.
En algunas realizaciones, el procedimiento incluye además la determinación de si la muestra para análisis tiene anticuerpos anti-carbohidrato laminarobiósido (Glc(β,1-3)Glc(β)) (ALCA), de forma que la ausencia de anticuerpos ALCA en la muestra identifica el sujeto como que padece una NIC.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o anticuerpos anti-glicanos se detectan usando un anticuerpo fluorescente o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
La muestra para análisis puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen, por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, fluido medular, orina y saliva.
La descripción proporciona adicionalmente reactivos para detectar anticuerpos anti-glicanos que revelan la presencia de la EC. Los reactivos incluyen uno o más carbohidratos que reaccionan específicamente con un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato, un anticuerpo anti-Man(α,1-2)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anti-Man(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α), un anticuerpo anti-manano, un anticuerpo anti-dextrano, un anticuerpo anti-xilano, un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal 3sulfato(β), un anticuerpo anti-aGlcNAc(β,1-3)GalNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-3)Gal(β,14)Glc(β) y/o un anticuerpo anti-Gal(α,1-3)Gal(β,1-4)GlcNAc(β). En algunas realizaciones, los reactivos están fijados a una fase sólida.
También dentro de la descripción hay matrices que incluyen reactivos (preferiblemente reactivos carbohidratos) que detectan específicamente los anticuerpos de detección de la enfermedad desvelados en el presente documento. Por ejemplo, una matriz útil para detectar la EC puede incluir uno o más reactivos que detecten un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato, un anticuerpo anti-Man(α,12)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anti-Man(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α), un anticuerpo anti-manano, un anticuerpo antidextrano, un anticuerpo anti-xilano, un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal 3-sulfato(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-3)GalNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,13)Gal(β,1-4)Glc(β) o un anticuerpo anti-Gal(α,1-3)Gal (β,1-4)GlcNAc(β).
En algunas realizaciones, los reactivos que se usan para unirse específicamente a y detectar los anticuerpos anti-glicanos son las estructuras específicas de los glicanos. En otras realizaciones, los reactivos son moléculas o macromoléculas que incluyen la estructura específica del glicano. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β) se puede detectar usando el polisacárido β-D(1-3) glucano, un polímero de unidades glucosa unidas por un enlace (β,1-3) glicosídico. Por tanto, el propio glicano se puede usar para detectar el correspondiente anticuerpo o anticuerpos, como se puede hacer con cualquier carbohidrato, péptido, proteína o cualquier otra estructura molecular que incluya el glicano.
En algunas realizaciones, los reactivos que se usan para unirse específicamente y detectar los anticuerpos anti-glicanos de la invención son péptidos que imitan los antígenos carbohidratos de la invención. Los péptidos se pueden usar para identificar anticuerpos anti-glicanos específicos.
La matriz puede incluir adicionalmente un reactivo o reactivos, por ejemplo, un reactivo o reactivos carbohidratos, que detecten un anticuerpo anti-manano (ASCA) o un ANCA.
En algunas realizaciones, los glicanos están unidos a la matriz mediante un ligador. Un ligador adecuado incluye al menos un derivado de etilenglicol, al menos dos derivados de cloruro cianúrico y un grupo anilino.
En alguna realización, al menos dos del reactivo o reactivos se proporcionan en la misma ubicación en la matriz direccionable.
En algunas realizaciones, la matriz incluye un reactivo, por ejemplo, un reactivo glicano, que detecta un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc (β) y/o un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α).
Otras matrices proporcionadas en el presente documento incluyen matrices útiles para el diagnóstico diferencial de CU o una EII en un sujeto. La matriz incluye uno o más reactivos (por ejemplo, reactivos glicanos o péptidos) que detectan un anticuerpo anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un ASCA; o un ASCA. En algunas realizaciones, la matriz incluye uno, dos o tres de estos reactivos.
La descripción proporciona adicionalmente una matriz de reactivos (por ejemplo, reactivos glicanos o péptidos) útil para el diagnóstico diferencial de la colitis por EC y la colitis ulcerosa en un sujeto. Las matrices incluyen uno o más reactivos que detectan un anticuerpo anti-Gal(α,14)GlcNAc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GalNAc(α), un anticuerpo anti-Glc(α), un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,6-sulfato), un anticuerpo antiGlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-6)Gal-NAc(α), un anticuerpo anti-Gal(α,1-3)Gal(β,14)GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Gal(α,1-4)Gal(β,1-4) Glc(β), un anticuerpo antiGal(β), un anticuerpo anti-Gal(β,1-3)[GlcNAc(β,1-6)]GalNAc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,13)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal(β,1-6)Gal(β), un anticuerpo anti-GalNAc(α), un anticuerpo antiGalNAc(β), un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo antiGlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,13)GalNAc(α), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α)
o un anticuerpo anti-Xyl(β). En algunas realizaciones, la matriz incluye reactivos que se unen a 2, 3, 4, 6, 6, 7, 8, 9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23 o 24 de estos anticuerpos.
La matriz puede incluir adicionalmente un reactivo, por ejemplo, un reactivo glicano o péptido, que detecte un anticuerpo anti-Gal(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,13)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo anti-Man(α,13)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-2)Man(α), un anticuerpo antiMan(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo anti-Man(β,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,16)Man(α), un anticuerpo anti-Man(β) y/o un anticuerpo anti-X(α). En algunas realizaciones, la matriz incluye reactivos que se unen a 2, 3, 4, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de estos anticuerpos.
La matriz puede incluir adicionalmente un reactivo (por ejemplo, un reactivo glicano o péptido) que detecte un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) y/o un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α). En la descripción también se proporciona una matriz útil para el diagnóstico diferencial de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) o una enfermedad digestiva que no es una EII (NIC). La matriz incluye un reactivo (por ejemplo, un reactivo glicano o péptido) que detecta anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido (GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)) (ACCA) y/o anticuerpos anti-manano (ASCA). La matriz puede incluir opcionalmente un reactivo que detecte anticuerpos anti-carbohidrato laminarobiósido (Glc(β,13)Glc(β)) (ALCA).
La descripción proporciona adicionalmente kits que incluyen reactivos para detectar anticuerpos anti-glicanos que revelan la presencia de la EC. Los kits incluyen uno o más reactivo(s) carbohidratos que reaccionan específicamente con un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,14)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato, un anticuerpo anti-Man(α,1-2)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anti-Man(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α), un anticuerpo anti-manano, un anticuerpo anti-dextrano, un anticuerpo anti-xilano, un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal 3-sulfato(β), un anticuerpo anti-aGlcNAc(β,1-3)GalNAc (β), un anticuerpo antiGlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), y/o un anticuerpo anti-Gal(α,1-3)Gal(β,1-4)GlcNAc(β). Los kits se pueden proporcionar en uno o más envases. En algunas realizaciones, los kits contienen directrices para usar los kits para llevar a cabo los procedimientos descritos en el presente documento. Los kits pueden incluir opcionalmente reactivos para detectar los isotipos de los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos IgA, IgG o IgM).
En algunas realizaciones, los kits incluyen reactivos que se usan para unirse específicamente y detectar los anticuerpos anti-glicanos que son las estructuras específicas de los glicanos. En otras realizaciones, los reactivos de los kits son moléculas o macromoléculas que incluyen la estructura específica del glicano. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β) se puede detectar usando el polisacárido β-D(1-3) glucano, un polímero de unidades glucosa unidas por un enlace (β,1-3) glicosídico. Por tanto, el propio glicano se puede usar para detectar el correspondiente anticuerpo o anticuerpos, como se puede hacer con cualquier carbohidrato, péptido, proteína o cualquier otra estructura molecular que incluya el glicano.
En algunas realizaciones, los kits incluyen reactivos que se usan para unirse específicamente y detectar ASCA y/o ANCA.
En la descripción también se proporcionan kits útiles para el diagnóstico diferencial de CU o EC en un sujeto. El kit incluye uno o más reactivos (por ejemplo, reactivos glicanos o péptidos) que detectan un anticuerpo anticitoplasmático de neutrófilos (ANCA), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un ASCA, o un ASCA. En algunas realizaciones, el kit incluye uno, dos o tres de estos reactivos.
La invención proporciona adicionalmente un kit de reactivos (por ejemplo, reactivos glicanos o péptidos) útil para el diagnóstico diferencial de la colitis por EC y la colitis ulcerosa en un sujeto. Los kits incluyen uno o más reactivos que detectan un anticuerpo anti-Gal(α,1-4)GlcNAc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GalNAc(α), un anticuerpo anti-Glc(α), un anticuerpo antiGlc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,6-sulfato), un anticuerpo anti-GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc (α), un anticuerpo anti-Gal(α,1-3)Gal(β,1-4)GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Gal(α,1-4)Gal(β,1-4) Glc(β), un anticuerpo anti-Gal(β), un anticuerpo anti-Gal(β,13)[GlcNAc(β,1-6)]GalNAc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,1-3)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal(β,16)Gal(β), un anticuerpo anti-GalNAc(α), un anticuerpo anti-GalNAc(β), un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,13)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-3)GalNAc(α), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,14)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α) o un anticuerpo anti-Xyl(β). En algunas realizaciones, el kit incluye reactivos que se unen a 2, 3, 4, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 de estos anticuerpos.
El kit puede incluir adicionalmente un reactivo, por ejemplo, un reactivo glicano o péptido, que detecta un anticuerpo anti-Gal(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α,16)Man(β), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α,1-6)Man(β), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-2)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α,16)Man(β), un anticuerpo anti-Man(β,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo anti-Man(β) y/o un anticuerpo anti-X(α). En algunas realizaciones, el kit incluye reactivos que se unen a 2, 3, 4, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de estos anticuerpos.
El kit puede incluir adicionalmente un reactivo (por ejemplo, un reactivo glicano o péptido) que detecte un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) y/o un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α).
En la descripción también se proporciona un kit útil para el diagnóstico diferencial de una enfermedad inflamatoria intestinal (EII) o una enfermedad digestiva que no sea una EII (NIC). El kit incluye un reactivo (por ejemplo, un reactivo glicano o péptido) que detecta anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido (GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)) (ACCA) y/o anticuerpos anti-manano (ASCA). El kit puede incluir opcionalmente un reactivo que detecte anticuerpos anti-carbohidrato laminarobiósido (Glc(β,1-3)Glc(β)) (ALCA).
También se desvela un procedimiento de diagnóstico del síndrome antifosfolipídico en un sujeto, proporcionando una muestra para análisis de un sujeto y detectando en la muestra para análisis un anticuerpo anti-quitobiosa. Los niveles de anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) en la muestra para análisis se comparan con los niveles de anticuerpo en una muestra de control. La muestra de control puede ser de uno o más individuos de los que se tenga conocimiento de que padecen o no padecen el síndrome antifosfolipídico. Cuando la muestra de control es de uno o más individuos que no padecen el SAP, un elevado nivel de anticuerpos anti-lcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) en la muestra para análisis en comparación con la muestra de control identifica al sujeto como que padece el SAP.
En algunas realizaciones, el procedimiento también incluye detectar la unión a una β-2 glicoproteína y comparar el nivel de unión a la β-2 glicoproteína en la muestra para análisis con el nivel de unión a la β-2 glicoproteína en la muestra de control. Una mayor unión a la β-2 glicoproteína en la muestra para análisis respecto a una muestra de control tomada de un individuo o individuos sin SAP indica que el sujeto padece el SAP.
La muestra para análisis puede ser, por ejemplo, un fluido biológico. Ejemplos de fluidos biológicos incluyen, por ejemplo, sangre completa, suero, plasma, fluido medular, orina o saliva.
El procedimiento puede incluir opcionalmente la determinación del isotipo del anticuerpo. Por ejemplo, el procedimiento puede incluir la determinación de si el anticuerpo es un anticuerpo tipo IgM, IgA o IgG. Dentro de la descripción también hay una matriz que incluye un reactivo (preferiblemente, un reactivo carbohidrato) que detecta específicamente un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)y
(opcionalmente) un reactivo que detecta una β-2 glicoproteína para detectar el SAP.
La descripción proporciona adicionalmente kits para el diagnóstico del SAP que incluyen reactivos para detectar un anticuerpo anti-quitobiosa y (opcionalmente) una β-2 glicoproteína. En algunas realizaciones, los kits contienen directrices para usar los kits para llevar a cabo los procedimientos descritos en el presente documento.
Cualquiera de los kits descritos en el presente documento puede estar provisto de instrucciones para usar el kit. Además, en algunas realizaciones, los kits están provistos de reactivos que detectan específicamente un isotipo de anticuerpo, por ejemplo, el kit puede incluir uno, dos o tres reactivos que detecten anticuerpos IgA, IgG, IgD o IgM.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el habitualmente entendido por una persona de conocimientos ordinarios en la materia a la cual pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y reivindicaciones siguientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
la fig. 1
es un gráfico que muestra una curva de características operativas del receptor
(ROC) para la diferenciación entre individuos con EC e individuos con otras en
fermedades digestivas para los anticuerpos IgGb3Gb e IgG manano;
la fig. 2A
es un gráfico de caja y bigotes de la diferencia entre grupos con colitis por EC y
con CU para los niveles de algunos anticuerpos IgG anti-glicanos;
la fig. 2B
es un gráfico de caja y bigotes de la diferencia entre grupos con colitis por EC y
con CU para los niveles de algunos anticuerpos IgA anti-glicanos;
las figs. 3A-3C
son gráficos de caja y bigotes que muestran los niveles de ASCA (IgG), ALCA
(IgG) y ACCA (IgA) en pacientes con EC, CU y NIC;
la fig. 4A
es una curva de características operativas del receptor (ROC) de IgA ACCA
(GNb4GNb), IgG ALCA (Gb3Gb) e IgG ASCA (manano) para la diferenciación
entre la EC y la CU;
la fig. 4B
es una curva de características operativas del receptor (ROC) de IgA ACCA
(GNb4GNb), IgG ALCA (Gb3Gb) e IgG ASCA (manano) para la diferenciación
entre una NIC y la CU;
la fig. 5A
es un gráfico que muestra la correlación entre ASCA IgG y ALCA IgG en pacien
tes con la EC;
la fig. 5B
es un gráfico que muestra la correlación entre ASCA IgG y ACCA IgA en pacien
tes con la EC;
la fig. 5C
es un gráfico que muestra la correlación entre ALCA IgG y ACCA IgA en pacien
tes con la EC;
las figs. 6A y 6B
son histogramas que muestran la unión de anticuerpos anti-glicanos a los glica
nos indicados en sueros de pacientes con el síndrome antifosfolipídico (SAP);
la fig. 7
es una curva de características operativas del receptor que compara la discrimi
nación entre pacientes con la EC y CU en base a los niveles de ALCA IgG y AC
CA IgA (EC, enfermedad de Crohn; CU, colitis ulcerosa; ALCA, anticuerpos anti
carbohidrato laminarobiósido; ACCA, anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósi
do).
las figs. 8A y 8B
son histogramas que muestran la distribución de anticuerpos ALCA IgG (A) y
ACCA IgG (B) en pacientes con EC (n=72), CU (n=56) y pacientes de control sa
nos (n=41). Los gráficos de caja y bigotes incluyen señales del 50% para la po
blación de pacientes pertinentes. El valor de la mediana se indica dentro de la
caja. El borde inferior representa el percentil 25 y el borde superior representa el
percentil 75. Los bigotes por encima y por debajo de la caja indican los percenti
les 90 y 10. EC, enfermedad de Crohn; CU, colitis ulcerosa; ALCA, anticuerpos
anti-carbohidrato laminarobiósido; ACCA, anticuerpos anti-carbohidrato quito
biósido;
la fig. 9
es un gráfico que muestra la relación entre ALCA, ACCA y ASCA en la cohorte
de EC ensayado mediante presencia frente a ausencia.
La enfermedad de Crohn (EC), el síndrome de intestino irritable (SII) y el síndrome antifosfolipídico (SAP) se diagnostican examinando una muestra para análisis de un sujeto en busca de anticuerpos a uno o más glicanos específicos. La presencia de los anticuerpos en la muestra para análisis identifica al sujeto como que padece la EC o el SAP. En algunas realizaciones, niveles elevados de glicanos en una muestra para análisis del sujeto en comparación con tales niveles en una muestra de referencia de un sujeto que no padece la EC identifican al sujeto como que padece la EC. Los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar para distinguir la presencia de la EC en un sujeto de otras enfermedades inflamatorias intestinales (incluyendo colitis ulcerosa).
En la tabla 1 se puede encontrar una correspondencia entre la sintaxis de LinearCode™ usada para describir la estructura de los glicanos y la nomenclatura de la IUPAC. Los glicanos se representan bien en la forma abreviada de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) para la representación de la nomenclatura de carbohidratos o bien con la sintaxis LINEARCODE®; para los principios de la sintaxis de código lineal, véase (Banin y col., Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 14:127-37, 2002). La correspondencia entre LINEARCODE® y la representación de la IUPAC se encuentra en la tabla 1. Todas las estructuras de glicanos que se analizan en la descripción, a menos que se indique lo contrario, están unidas con la anomericidad indicada α o β a otra estructura molecular, ligador o fase sólida.
Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad inflamatoria intestinal” es sinónimo de “EII” y es un término colectivo que se refiere tanto a la enfermedad de Crohn como a la colitis ulcerosa. Por tanto, un individuo que padece bien la enfermedad de Crohn o bien colitis ulcerosa se define en el presente documento como que padece una EII. Por el contrario, un individuo que no padece ni colitis ulcerosa ni la enfermedad de Crohn no padece una EII tal como se define en el presente documento. El término “enfermedad inflamatoria intestinal” distingue la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa de cualquier otro trastorno, síndrome o anomalía del tracto gastrointestinal, incluyendo el síndrome del intestino irritable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “enfermedad no inflamatoria intestinal” es sinónimo de “no EII” y es un término colectivo que se refiere a cualquier otro trastorno, síndrome o anomalía del tracto gastrointestinal, incluyendo el síndrome del intestino irritable (SII).
Los procedimientos para el diagnóstico de una EII pueden incluir adicionalmente la determinación de si una muestra es positiva para anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA). Los anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos que producen un patrón de tinción perinuclear (pANCA) son elevados, el 60-80%, en pacientes con CU y, menos frecuentemente, para la EC y otros trastornos del colon. Los valores en suero de ANCA son elevados en pacientes con CU independientemente de su estado clínico y, por tanto, no reflejan la actividad de la enfermedad. También persisten elevados niveles de ANCA en suero en pacientes con CU cinco años después de una colectomía. Aunque los pANCA se encuentran solo muy raramente en adultos y niños sanos, los familiares sanos de pacientes con CU presentan con mayor frecuencia pANCA, indicando que los pANCA puede ser un indicador de sensibilidad inmunogenética. La reactividad a los ANCA también está presente en una pequeña porción de pacientes con la EC. La prevalencia estudiada de la EC varía, indicando la mayoría de los estudios que del 10 al 30% de pacientes con la EC expresan ANCA (Saxon y col., J. Allergy Clin. Immunol. 86:202-210 (1990); Cambridge y col., Gut 33:668-674 (1992); Pool y col., Gut 3446-50 (1993); y Brokroelofs y col., Dig. Dis. Sci. 39:545-549 (1994)).
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo anticitoplasmáticos de neutrófilos” es sinónimo de “ANCA” y significa anticuerpos a los componentes citoplasmáticos de un neutrófilo. Los ANCA, tales como ANCA en suero o saliva, se pueden detectar usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas con neutrófilos fijados con alcohol. Tal como se desvela en el presente documento, la actividad de los ANCA se divide en varias categorías amplias: tinción de perinuclear a nuclear o tinción citoplasmática con resaltado perinuclear (pANCA); tinción citoplasmática de los neutrófilos sin resaltado perinuclear (cANCA); y tinción difusa con moteado en todo el neutrófilo (SAPPA). El término ANCA, tal como se usa en el presente documento, abarca todas las variedades de reactividad anticitoplasmáticos de neutrófilos, incluyendo pANCA, cANCA y SAPPA. De forma similar, el término “ANCA” abarca todos los isotipos de inmunoglobulina incluyendo, por ejemplo, inmunoglobulina A y G.
La determinación de si una muestra es positiva para ANCA usando medios no histológicos se realiza usando un antígeno específico para ANCA usando procedimientos descritos, por ejemplo, en la patente US No. 6.218.129. Antígenos específicos para ANCA incluyen, por ejemplo, neutrófilos completos fijados; extracto de neutrófilos no purificados o parcialmente purificados; antígeno CU pANCA purificado, tal como una proteína, fragmento de proteína o péptido sintéticamente fabricado; anticuerpo idiotípico anti-ANCA; o similares. Antígenos especialmente útiles específicos para ANCA son péptidos, que se pueden sintetizar químicamente o expresar en la superficie de un fago. Antígenos purificados específicos para ANCA pueden ser, por ejemplo, histona H1 o un fragmento reactivo a ANCA de histona H1, como se describe, por ejemplo, en la patente US No. 6.074.835; un antígeno de la vesícula secretora de pANCA en colitis ulcerosa o un fragmento reactivo a ANCA del mismo; o un antígeno CU pANCA microbiano, tal como un antígeno tipo histona H1, antígeno porina, antígeno bacteroides o fragmento reactivo a ANCA de los mismos, como se describe, por ejemplo, en la patente US No. 6.033.864. Un experto en la materia comprenderá que se pueden identificar antígenos específicos adicionales para ANCA, incluyendo fragmentos antigénicos y péptidos reactivos a ANCA, por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal CU pANCA representativo.
Generación de un perfil de anticuerpos anti-glicanos
Para llevar a cabo los procedimientos de la invención, se obtuvo previamente, es decir, antes de los procedimientos, una muestra para analizar del sujeto objeto de diagnóstico. El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento, significa cualquier muestra biológica obtenida de un individuo que contiene anticuerpos. Una muestra puede ser, por ejemplo, sangre completa, plasma, saliva u otro fluido o tejido corporales que tengan anticuerpos, preferiblemente una muestra de suero. Las muestras se pueden diluir, si se desea, antes de su análisis en busca de anticuerpos antiglicanos. El sujeto puede ser, por ejemplo, un humano, un primate no humano (incluyendo un chimpancé, mono, gorila, primate del viejo mundo), vaca, caballo, perro, gato, cerdo, cabra, oveja o roedor (incluyendo, por ejemplo, un ratón, rata o cobaya). Los perfiles anti-glicanos se pueden determinar usando procedimientos conocidos en la técnica para la identificación de anticuerpos a glicanos, incluyendo los desvelados en, por ejemplo, los documentos WO00/49412, WO02/064556 o Schwarz y col., Glycobiology 13:749-54, 2003.
Estos procedimientos se realizan habitualmente usando reactivos que se unen específica-mente a los anticuerpos anti-glicanos. Los reactivos pueden ser, por ejemplo, las estructuras específicas de los glicanos. Alternativamente, los reactivos pueden ser otras moléculas o macromoléculas que incluyan la estructura específica del glicano. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β) se puede detectar usando el polisacárido β-D(1-3) glucano, un polímero de unidades glucosa unidas por un enlace (β,1-3) glicosídico. Por tanto, el propio glicano se puede usar para detectar el correspondiente anticuerpo o anticuerpos, como se puede hacer con cualquier carbohidrato, péptido, proteína o cualquier otra estructura molecular que incluya el glicano.
Si se desea, se pueden usar péptidos que imitan antígenos carbohidratos en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento. Los péptidos se pueden usar para identificar anticuerpos anti-glicanos específicos. Se pueden identificar péptidos que imitan estructuras reconocidas por los anticuerpos anti-glicanos usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, cribando una librería de péptidos aleatorios expresados en fagos filamentosos (Zhan y col., Biochem Biophys Res Commun. 308:19-22,2003; Hou y col., J Immunol. 17:4373-79, 2003).
Los antígenos glicanos usados para identificar diferentes anticuerpos anti-glicanos se pueden obtener de diversas otras fuentes siempre que el antígeno sea capaz de unirse específicamente al anti-glicano dado. La unión a anticuerpos anti-glicanos se pueden realizar usando diversos otros formatos de inmunoensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar formatos de inmunoensayos competitivos y no competitivos (Self y Cook, Curr. Opin. Biotechnol. 7:60-65 (1996)).
Otros ensayos incluyen inmunoensayos, tales como ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). Un enzima tal, como peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina (AP), β-galactosidasa o ureasa, se puede unir a un anticuerpo secundario selectivo para un anticuerpo dirigido contra glicanos primario de interés. Se puede usar un sistema de detección con peroxidasa de rábano picante, por ejemplo, con el sustrato cromogénico tetrametilbencidina (TMB), que proporciona un producto soluble en presencia de peróxido de hidrógeno que es detectable a 450 nm. Se puede usar un sistema de detección con fosfatasa alcalina con el sustrato cromogénico fosfato de pnitrofenilo, por ejemplo, que proporciona un producto soluble fácilmente detectable a 405 nm. De forma similar, se puede usar un sistema de detección con β-galactosidasa con el sustrato cromogénico o-nitrofenil-a β-D-galactopiranosida (ONPG), que proporciona un producto soluble detectable a 410 nm, o se puede usar un sistema de detección con ureasa con un sustrato tal como urea-púrpura de bromocresol (Sigma Immunochemicals, St. Louis, Mo.). Se puede obtener un anticuerpo secundario útil unido a un enzima de varias fuentes comerciales; por ejemplo, se puede adquirir fosfatasa alcalina IgG anti-humano F(ab’)2 de cabra en Jackson Immuno-Research (West Grove, Pa.).
Los inmunoensayos abarcan inmunoensayos basados en electroforesis capilar (CEIA) y se pueden automatizar si se desea. Los inmunoensayos también se pueden usar en conjunción con fluorescencia inducida por láser (véase, por ejemplo, Schmalzing y Nashabeh, Electrophoresis 18:2184-93 (1997)); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-80 (1997)).
También se pueden usar inmunoensayos con liposomas, tales como inmunoensayos por inyección de flujo de liposomas e inmunonsensores de liposomas (Rongen y col., J. Immunol. Methods 204:105-133 (1997)).
También se puede usar un radioinmunoensayo para determinar si una muestra es positiva para un anticuerpo dirigido contra glicanos o para determinar el nivel de anticuerpos anti-glicanos en una muestra. La invención abarca un radioinmunoensayo usando, por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado con yodo125 (Harlow y Lane, Antibodies A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory: New York, 1988).
Alternativamente, se puede marcar un anticuerpo secundario con un marcador quimioluminiscente. Un anticuerpo secundario quimioluminiscente es adecuado para una detección sensible y no radiactiva de anticuerpos anti-glicanos y se puede obtener comercialmente de diversas fuentes, tales como Amersham Lifesciences, Inc. (Arlington Heights, III.).
También se puede marcar con un fluorocromo un reactivo detectable. Fluorocromos adecuados incluyen, por ejemplo, DAPI, fluoresceína, Hoechst. 33258, R-ficocianina, B-ficoeritrina, Rficoeritrina, rodamina, rojo Texas o lisamina. Un fluorocromo especialmente útil es la fluoresceína o la rodamina. Anticuerpos secundarios unidos a fluorocromos se pueden obtener comercialmente. Por ejemplo, FITC IgG anti-humano F(ab’)2 de cabra está disponible en Tago Immunologicals (Burlingame, Calif.).
Se puede analizar una señal del reactivo detectable, por ejemplo, usando un espectrofotómetro para detectar color en un sustrato cromogénico; un contador de radiación para detectar radiación, tal como un contador gamma para la detección de yodo125; o un fluorómetro para detectar fluorescencia en presencia de luz de una determinada longitud de onda. Para la detección de reactivos ligados a enzimas se puede realizar un análisis cuantitativo de la cantidad de anticuerpos anti-glicanos usando un espectrofotómetro tal como un lector de microplacas EMAX (Molecular Devices, Menlo Park, Calif.) según las instrucciones del fabricante. Si se desea, los ensayos de la invención se pueden automatizar o realizar robóticamente y se puede detectar simultáneamente la señal de múltiples muestras.
Otros procedimientos incluyen, por ejemplo, citometría de flujo (incluyendo inmunoensayos basados en lecho) y tecnología de expresión en fagos para expresar un antígeno recombinante específico para un anticuerpo dirigido contra glicanos. Las partículas de fagos que expresan el antígeno específico para un anticuerpo dirigido contra glicanos deseados se pueden anclar, si se desea, a una placa multi-pocillos usando un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal anti-fagos (Felici y col., "Phage-Displayed Peptides as Tools for Characterization of Human Sera" en Abelson (Ed.), Methods in Enzymol. 267, San Diego: Academic Press, Inc. (1996)).
Los anticuerpos anti-glicanos se puede detectar adecuadamente analizando simultáneamente múltiples muestras en busca de la presencia de uno o más anticuerpos anti-glicanos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden detectar usando una matriz de reactivos que se pueden unir específicamente a los anticuerpos anti-glicanos. Preferiblemente, cada reactivo se proporciona en una ubicación diferente con una dirección definida en la matriz. Exponiendo la muestra a esta matriz, se pueden detectar todos los anticuerpos anti-glicanos que se unen al reactivo de la matriz en un solo ensayo. Matrices adecuadas que incluyen reactivos (preferiblemente reactivos carbohidratos) que detectan específicamente los anticuerpos de detección de la EC desvelados en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo anti-Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,13)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato, un anticuerpo anti-Man(α,1-2)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-3)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α,1-6)Man(α), un anticuerpo anti-Man(α), un antiMan(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α), un anticuerpo anti-manano, un anticuerpo anti-dextrano, un anticuerpo anti-xilano, un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), un anticuerpo anti-Gal 3-sulfato(β), un anticuerpo anti-aGlcNAc(β,1-3)GalNAc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-Gal(α), un anticuerpo anti-Gal(β), un anti-GalNAc(α), un anticuerpo anti-Glc(α), un anticuerpo anti-Gal(β,1-6)Gal(β), un anti anti-GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α) o un anticuerpo anti-Gal(α,13)Gal(β,1-4)GlcNAc(β) para el diagnóstico de la EC.
En algunas realizaciones, los reactivos que se usan para unirse específicamente a y detectar esos anticuerpos anti-glicanos son las estructuras específicas de los glicanos. En otras realizaciones, los reactivos son moléculas o macromoléculas que incluyen la estructura específica del glicano. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β) se puede detectar usando el polisacárido β-D(1-3) glucano, un polímero de unidades glucosa unidas por un enlace (β,1-3) glicosídico. Por tanto, el propio glicano se puede usar para detectar el correspondiente anticuerpo o anticuerpos, como se puede hacer con cualquier carbohidrato, péptido, proteína o cualquier otra estructura molecular que incluya el glicano.
La matriz puede incluir adicionalmente un reactivo o reactivos, por ejemplo, un reactivo o reactivos carbohidratos, que detecten un anticuerpo anti-manano o un ANCA. En algunas realizaciones, los glicanos están unidos a la matriz mediante un ligador. Un ligador adecuado incluye al menos un derivado de etilenglicol, al menos dos derivados de cloruro cianúrico y un grupo anilino.
Matrices útiles para el diagnóstico de la EAP es un reactivo (preferiblemente un reactivo carbohidrato) que detecte específicamente un anticuerpo anti-quitobiosa y, opcionalmente, un reactivo que detecte específicamente una β-2 glicoproteína.
Si se desea, se pueden usar péptidos que imitan antígenos carbohidratos en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento. Los péptidos se pueden usar para identificar anticuerpos anti-glicanos específicos. Se pueden identificar péptidos que imitan estructuras reconocidas por anticuerpos anti-glicanos usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, cribando una librería de péptidos aleatorios expresados en fagos filamentosos (Zhan y col., Biochem Biophys Res Commun. 308:19-22,2003; Hou y col., J Immunol. 17:4373-79, 2003).
Interpretación de los datos de unión a anticuerpos anti-glicanos
Típicamente, la unión de anticuerpos anti-glicanos a glicanos en una muestra se compara con una población de referencia y se comparan las diferencias en los niveles de anticuerpos anti-glicanos en las dos muestras. El umbral para determinar si una muestra para análisis es considerada positiva para la EC o la EAP, o una enfermedad que no sea una EII, en base a su perfil de anticuerpos antiglicanos se puede modificar dependiendo de la sensibilidad o especificidad deseadas. Los parámetros clínicos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo y concordancia global se calculan usando verdaderos positivos, falsos positivos, falsos negativos y verdaderos negativos. Una muestra “verdadero positivo" es una muestra positiva para la EC según análisis colonoscópicos y/o histológicos, que es diagnosticada también como positivo según un procedimiento de la invención. Una muestra “falso positivo" es una muestra negativa para la EC según análisis colonoscópicos, radiológicos y/o histológicos, que es diagnosticada como positivo según un procedimiento de la invención. De forma similar, un “falso negativo" es una muestra positiva para la EC según análisis colonoscópicos, radiológicos y/o histológicos, que es diagnosticada como negativo según un procedimiento de la invención. Un “verdadero negativo" es una muestra negativa para la EC según análisis colonoscópicos, radiológicos y/o histológicos y también negativa para la EC según un procedimiento de la invención. Véase, por ejemplo, Mousy (Ed.), Intuitive Biostatistics New York: Oxford University Press (1995).
Tal como se usa en el presente documento, el término “sensibilidad” significa la probabilidad de que un procedimiento clínico proporcione un positivo en presencia de la EC. La sensibilidad se calcula como el número de resultados verdaderos positivos dividido por la suma de verdaderos positivos y falsos negativos. La sensibilidad básicamente es una medida de cómo de bien un procedimiento identifica correctamente a aquellos con la enfermedad. En un procedimiento de la invención, los valores de anticuerpos anti-glicanos se pueden seleccionar de forma que la sensibilidad de diagnóstico de un individuo sea de al menos aproximadamente el 60% y puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente el 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%.
Tal como se usa en el presente documento, el término “especificidad” significa la probabilidad de que un procedimiento proporcione un negativo en ausencia de la EC. La especificidad se calcula como el número de resultados verdaderos negativos dividido por la suma de verdaderos negativos y falsos positivos. La especificidad es básicamente una medida de cómo de bien un procedimiento excluye a aquellos que no padecen la EC. El valor de corte de anti-glicanos se puede seleccionar de forma que, cuando la sensibilidad es al menos del 70%, la especificidad de diagnóstico de un individuo esté en el intervalo de 30-60%, por ejemplo, 35-60%, 40-60%, 45-60% o 50-60%.
El término “valor predictivo positivo”, tal como se usa en el presente documento, es sinónimo de “VPP” y significa la probabilidad de que a un individuo al cual se le ha diagnosticado la EC realmente padezca la enfermedad. El valor predictivo positivo se puede calcular como el número de verdaderos positivos dividido por la suma de verdaderos positivos y falsos positivos. El valor predictivo positivo se determina según las características del procedimiento de diagnóstico así como la prevalencia de la enfermedad en la población analizada. En un procedimiento de la invención, los valores de corte de anticuerpos anti-glicanos se pueden seleccionar de forma que el valor predictivo positivo del procedimiento en una población que tenga una prevalencia de enfermedad de la EC del 15% sea al menos de aproximadamente el 5% y puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente el 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 40%.
Tal como se usa en el presente documento, el término “concordancia global” significa la precisión con la cual un procedimiento diagnostica un estado de enfermedad. La concordancia global se calcula como la suma de verdaderos positivos y verdaderos negativos dividida entre el número total de resultados de muestras y está afectada por la prevalencia de la EC en la población analizada. Los valores de corte de anticuerpos anti-glicanos se pueden seleccionar de forma que la concordancia global de un procedimiento de la invención en una población de pacientes que tenga una prevalencia de enfermedad de la EC del 15% sea al menos de aproximadamente el 45% y puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente el 50%, 55% o 60%.
La invención se ilustrará en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1. Niveles comparativos de anticuerpos anti-glicanos en el suero de pacientes con la enfermedad de Crohn y pacientes con otras enfermedades digestivas.
Se obtuvo un perfil de anticuerpos anti-glicanos para IgG, IgA y IgM en el suero de los pacientes usando matrices GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat No. 9100). Las matrices se construyeron usando los procedimientos descritos en el documento Schwarz y col. Glycobiology, 13: 74954, 2003. Se compararon los perfiles de anticuerpos anti-glicanos de 45 pacientes con la EC y 27 pacientes con otras enfermedades digestivas.
Todas las muestras de suero se ensayaron usando matrices GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat No. 9100), que son matrices de mono-y oligosacáridos unidos covalentemente a una placa de microtitulación de 384 pocillos de reducido volumen. Los mono y oligosacáridos expresados en la matriz se enumeran en la tabla 1. En la tabla 1 se presenta una correspondencia entre la sintaxis de LinearCode™ usada para describir la estructura de los glicanos y la nomenclatura de la IUPAC.
Los sueros de pacientes voluntarios que habían firmado un formulario de consentimiento informado fueron recogidos por el doctor Iris Dotan del Instituto de Gastroenterología y Enfermedades Hepáticas del Hospital Tel Aviv Sorasky, Israel. El doctor Iris Dotan realizó el diagnóstico de todos los pacientes. Los sueros se recogieron en tubos vaciados que contenían gel recubiertos con silicio (Estar Technologies Cat. nº 616603GLV). Los sueros se separaron de las células sanguíneas y se mantuvieron congelados a -25ºC hasta su uso. El volumen de todas las disoluciones añadido a la matriz de glicanos fue de 10 µl/pocillo. Los sueros se diluyeron (1:20; concentración de saturación) en Tris-HCl 0,15 M, pH 7,2, Mg2SO4 0,085 M, Tween 20 (TBST) al 0,05% que contenía el 1% de BSA (Sigma), suministrado a las placas de matrices de glicanos usando un sistema de manipulación automatizado Tecan Genesis Workstation 200 y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron entonces con 250 µL/pocillo de tampón fosfato salino con Tween 20 (PBST, Sigma) al 0,05% en un lavador automático de placas (Tecan, POWERWASHER™). En ese momento, se añadieron los siguientes reactivos, diluidos en TBST con el 1% de BSA, usando un suministrador Multidrop 384 (Thermo Labsystems) y se incubaron durante 60 min a 37ºC: para la determinación de IgG, IgA e IgM -el respectivo anticuerpo Ig anti-humano de cabra biotinilado específico para las sub-clases (Jackson, PA, EEUU), 2,8 µg/ml, 3 µg/ml y 0,9 µg/ml, respectivamente. Después del lavado con PBST, se añadió europio conjugado con estreptavidina (0,1 µg/ml) diluido en TBST con BSA al 1% a cada pocillo, seguido de incubación durante 30 min a 37ºC en oscuridad y lavado con PBST. Se añadió entonces una disolución intensificadora DELFIA™ a los pocillos y las placas se incubaron durante de 30 a 45 min en oscuridad a temperatura ambiente. La fluorescencia de los pocillos se leyó con un lector de placas Victor 1420 (Wallac, Finlandia) usando unos ajustes de fluorescencia resuelta en tiempo de 340/612 nm (excitación/emisión).
Se realizaron ensayos en algunos pacientes en busca de presencia de anticuerpos a anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos perinucleares (pANCA) y anti-Saccharomyces cerevisiae (ASCA) IgG e IgA usando kits comerciales fabricados por INOVA, San-Diego, CA Cat. No. 708290, 708865, 708870, respectivamente, según las instrucciones del fabricante.
Las tablas 2, 3 y 4 presentan los niveles de los anticuerpos anti-glicanos tipo IgG, IgA e IgM que se detectaron con niveles significativamente diferentes entre la población con la EC y la población con otras enfermedades digestivas. Las tablas muestran las señales fluorescentes procedentes de la unión de los anticuerpos IgG a diferentes glicanos en pacientes con la EC y pacientes sin la EC. Los glicanos se presentan en LINEARCODE®. Los valores presentados para IgG e IgA son valores absolutos. Los valores presentados para IgM son valores absolutos después de reducción de la señal de fondo. La señal de fondo se midió como la señal recibida de los pocillos con p-nitrofenol unido covalentemente. Si el resultado era negativo la señal fue considerada cero.
La comparación de los valores de la media y la mediana de los anticuerpos anti-carbohidratos en poblaciones con la EC y con otras enfermedades digestivas revela un significativo aumento en la mayoría de los anticuerpos anti-glicanos en el grupo con la EC en comparación con el grupo que contenía individuos con el otro grupo de enfermedades digestivas. Ninguno de los pacientes con la EC dio positivo para anticuerpos pANCA. Todos los niveles de anti-glicanos que se muestran en las tablas 2, 3 y 4 muestran diferencias estadísticamente significativas (α=0,05; p<0,05) entre los grupos con la EC y el grupo con otras enfermedades digestivas o normal. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las medianas de las señales de la población con EC y la población con otras enfermedades digestivas y la población normal para los anticuerpos unidos a los glicanos siguientes: Glc(β), Glc(β,1-4)Glc(β), Glc(β,1-3)Glc(β), GlcNAc(β) 6-sulfato, Man(α,1-2)Man(α), Man(α,13)Man(α), Man(α,1-6)Man(α), Man(α), Man(α,1-3) [Man(α,1-6)]Man(a), manano, dextrano, xilano, GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β), Gal 3-sulfato(β), GlcNAc(β,1-3)GalNAc(β), GlcNAc(β,1-3)Gal(β,1-4)Glc(β), Gal(α), Gal(β), GalNAc(α), Glc(α), Gal(β,1-6)Gal(β), GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α) y Gal(α,1-3)Gal(β,14)GlcNAc(β).
La tabla 5 muestra la especificidad y sensibilidad de los diferentes anti-glicanos IgG para la diferenciación entre la EC y otras enfermedades digestivas usando diferentes valores de corte. Los valores de corte de cada glicanos se fijaron en el percentil 89 del grupo sin la EC.
Estos resultados revelan un conjunto de antígenos glicanos químicamente definidos que son útiles para el diagnóstico de la EC. Los niveles de anticuerpos a esos glicanos son mayores en la población con la EC que en la población de individuos normales o individuos con otras enfermedades digestivas. Los anticuerpos que mostraron la mayor diferenciación entre la EC y otras enfermedades digestivas en estos estudios son un conjunto de anticuerpos a fragmentos de glicanos basados en manosa así como anticuerpos a Glc(β), Glc(β,1-4) Glc(β), Glc(β,1-3)Glc(β). Los anticuerpos a Glc(β,13)Glc(β), Man(α,1-3)Man(α) y Man(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α) fueron especialmente capaces de diferenciar entre la EC y otras enfermedades digestivas con una sensibilidad del 57-62% y una especificidad del 89%-93%. La separación de esas estructuras fue mejor que la que se logró con manano (ASCA), 47% de sensibilidad y 89% de especificidad. La tabla 6 demuestra que es posible usar diferentes niveles de corte y lograr mayor sensibilidad pero menor especificidad. La tabla 6 describe la sensibilidad, especificidad, verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) y el valor predictivo positivo (VPP) para diferentes valores de corte para diferenciar entre la EC y otras enfermedades digestivas según el nivel de anti Glc(β,1-3)Glc(β), IgG y anti manano IgG. La figura 1 es una curva de características operativas del receptor (ROC) para la diferenciación entre individuos con la EC e individuos con otras enfermedades digestivas según los niveles de anticuerpos anti Glc(β,1-3)Glc(β), IgG y anti manano IgG.
Usando una combinación de uno o más glicanos es posible mejorar la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Por ejemplo, estableciendo valores de corte de 2000.000 para anti-Glc(β,13)Glc(β) y 2.400.000 para anti-manano y estableciendo los criterios para la identificación de la EC como aquellos individuos que están por encima de los niveles de corte para cualquiera de los anticuerpos es posible lograr el 82% de sensibilidad con el 70% de especificidad. Lograr esta sensibilidad para cada uno de los anticuerpos individuales requeriría puntos de corte inferiores, pero estos puntos de corte inferiores conducirían a poca especificidad (por ejemplo, una especificidad del 37% para Glc (β,1-3)Glc(β)).
Ejemplo 2. Niveles comparativos de anticuerpos anti-glicanos en el suero de pacientes con colitis por la enfermedad de Crohn (EC) y pacientes con colitis ulcerosa (CU)
Se obtuvo un perfil de anticuerpos anti-glicanos para IgG e IgA en el suero de los pacientes usando matrices GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat No. 9100). Las matrices se construyeron usando los procedimientos descritos en el documento Schwarz y col., Glycobiology 13: 749-54, 2003. Se compararon los perfiles de anticuerpos anti-glicanos de 6 pacientes con colitis por la EC y 19 pacientes con CU. Todas las muestras de sueros se recogieron y ensayaron como se describe en el ejemplo 1.
Las tablas 7 y 8 muestran los niveles de los anticuerpos anti-glicanos tipo IgG e IgA, respectivamente, que se detectaron con niveles significativamente diferentes entre la población con colitis por la EC y la población con CU. Los glicanos se presentan en LINEARCODE®. Los valores presentados para IgG e IgA son valores absolutos. La comparación de los valores de la media y la mediana de anticuerpos anti-carbohidratos en pacientes con colitis por la EC y CU revela un significativo aumento en la mayoría de los anticuerpos anti-glicanos en el grupo con la EC en comparación con el grupo que contenía individuos con el otro grupo de enfermedades digestivas. Todos los niveles de antiglicanos que se muestran en las tablas 7 y 8 muestran diferencias estadísticamente significativas (α=0,05; p<0,05) entre el grupo con colitis por la EC y el grupo con CU, excepto para anti-manano (ASCA) IgA e IgG. La diferencia más significativa entre los niveles de anticuerpos de la clase IgG se encontró en los niveles de anti Man(α,1-3)Man(α), mientras que para la clase IgA la diferencia más significativa se encontró entre los niveles de anticuerpos anti GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β). En estos estudios no se detectó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de anti manano (IgG o IgA) entre las poblaciones de pacientes con colitis por la EC y pacientes con CU. La figura 2 es un gráfico de caja y bigotes de la diferencia entre los grupos con colitis por la EC y con CU para los niveles de algunos anticuerpos IgG e IgA anti-glicanos.
Ejemplo 3. Niveles comparativos de anticuerpos anti-glicanos en el suero de pacientes con la enfermedad de Crohn (EC), pacientes con colitis ulcerosa (CU) y pacientes con el síndrome del intestino irritable (SII).
Se compararon los niveles de anticuerpos anti-glicanos en el suero de pacientes con la EC, CU yel SII.
Se obtuvo un perfil de anticuerpos anti-glicanos para IgG e IgA en el suero de los pacientes usando matrices GlycoChip® (Glycominds, Ltd., Lod, Israel, Cat No. 9100). Las matrices se construyeron usando los procedimientos descritos en el documento Schwarz y col. Glycobiology 13:749-54, 2003. Se midieron los niveles de los siguientes anticuerpos anti-glicanos: anticuerpos anti-carbohidrato laminarobiósido (Glc(β,1-3)Glc(β)) (ALCA); anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido (GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β)) (ACCA); y anti-manano (antígeno anti-Saccromyces cerevisiae (ASCA)). Esos anticuerpos se midieron en el suero de 70 pacientes con la EC, 56 pacientes con CU y 19 pacientes de control con enfermedades digestivas que no son una EII (NIC) y también se compararon. Todas las muestras de sueros se recogieron y ensayaron usando placas GlycoChip® (Glycominds Ltd., Lod, Israel, Cat No. 9100) como se describe en el ejemplo 1.
En la figura 3 se presenta un resumen de los resultados. Los pacientes con la EC tienen mayores niveles estadísticamente significativos de ASCA, ALCA y ACCA que los pacientes con CU. Los pacientes con CU tenían menores niveles estadísticamente significativos de ASCA, ALCA y ACCA que los pacientes con una NIC. Los pacientes con una NIC tenían mayores niveles estadísticamente significativos de IgA ACCA que los pacientes con CU.
La curva ROC de la figura 4A demuestra que los tres marcadores se pueden usar para diferenciar entre la EC y la CU. La curva ROC de la figura 4B demuestra que los ACCA posibilitan la diferenciación entre una NIC y la CU y muestra la sensibilidad y especificidad para diferentes niveles de corte. Las figuras 5A-C que aparecen más abajo muestran una correlación baja o nula entre los niveles de marcador IgG ASCA e IgG ALCA o IgA ACCA en pacientes con la EC. Está claro que cada marcador reconoce distintos sub-grupos de pacientes con la enfermedad de Crohn.
La tabla 9 resume la sensibilidad y especificidad para cada tipo de enfermedad usando las combinaciones de los marcadores: una muestra que da ASCA (+) o ALCA (+) indica que el paciente del cual se obtuvo la muestra padece la EC y no CU. Un paciente que da IgA ACCA (+) y ASCA (-) padece una enfermedad digestiva que no es una EII.
Estos datos demuestran que los marcadores ASCA, ACCA y ALCA se pueden usar para diagnosticar de forma diferencial una EII (que incluye la EC y EII) de todas las otras enfermedades intestinales (NIC), incluyendo el síndrome del intestino irritable (SII). La presencia de anticuerpos a IgA ACCA y la ausencia de anticuerpos a ASCA indican que un sujeto padece una NIC. Un sujeto también se diagnostica con NIC si también hay ausencia de anticuerpos ALCA en la muestra.
Ejemplo 4. Niveles de anticuerpos anti-glicanos en el suero de pacientes con síndrome antifosfolipídico (SAP) y pacientes con otras enfermedades digestivas.
Se fraccionó una combinación de muestras de suero de pacientes con el SAP en una columna de β-2 glicoproteína y se ensayó en busca de la presencia de anticuerpos anti-glicanos.
La unión a los anticuerpos se examinó usando sustratos GLYCOCHIP™ como se describe en el documento WO00/49412. Los pocillos se bloquearon con H2O dd/BSA al 2,5%. La muestra de suero se diluyó al 1:2 en TBST/BSA al 1%. Se diluyeron muestras de anti-IgA, IgG e IgM al 1:100 en TBST/BSA al 1%. La tinción Alexa 633 (Molecular Probes, Eugene, OR, nº S-20992) se diluyó al
1:150 en TBST/BSA al 1:150. Las muestras se inyectaron usando un programa Tescan HS4800. Las matrices con tinción se escanearon usando un escáner Affymetrix 428 y las imágenes se analizaron usando el software ’ArrayPro’. Los valores numéricos se exportaron a Excel y se analizaron. Para la determinación de isotipos, fragmento específico Fc gamma de IgG anti-humano\Biotina (cabra); Jackson; Cat nº 109-065-008, fragmento específico Fc 5mu de IgM anti-humano\Biotina (cabra); Jackson; Cat nº 109-065-043, y suero IgA anti-humano\biotina (cabra); Jackson; Cat nº 109-065-011.
La muestra de suero se purificó por afinidad en una columna de β-2 glicoproteína y, a continuación, se aplicó a un GlycoChip que contenía múltiples glicanos. La magnitud total (0-2,5x107) del perfil de interacción de las inmunoglobulinas y los anticuerpos anti-glicanos ensayados en el Glyco-Chip se muestran en la figura 6A. En la figura 6B se muestra una escala menor (0-5x106) de la unión.
Los niveles más elevados de anticuerpos se observaron para anticuerpos frente a GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) para cada una de las subclases IgA, IgG e IgM. También se observaron elevados niveles de IgG frente a LPS de Salmonella typhimurium, Man(α,1-6)Man(α), GlcNAc(α), GlcNAc(β) y Gal(β,1-4)Glc(β) (lactosa).
Los niveles más elevados de IgA fueron frente a GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) y relativamente elevados frente a Gal(β,1-4)Glc(β) y LPS de Salmonella. Los niveles más elevados de IgM fueron frente a GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) y relativamente elevados frente a LPS de E. coli O26:B6, derivados de glucosa tales como Glc(α), Glc(α,1-4)Glc(α), Glc(α,1-4)Glc(β), Glc(β,1-3)Glc(β) y Glc(β,1-4)Glc(β), GlcNAc(α), Rha(α) así como Man(α,1-6)Man(α), GalA(β), GlcA(β) y LPS de Salmonella. Se detectaron niveles relativamente bajos de Ig frente a la preparación de manano usada sobre el sustrato Glyco-Chip.
Estos resultados demuestran que niveles elevados de anticuerpos a GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) en la sangre pueden servir como un marcador para el diagnóstico del SAP y/o la gravedad de la enfermedad.
Ejemplo 5. Los anticuerpos en suero frente a laminarobiósido y quitobiósido son marcadores de la enfermedad de Crohn.
Para investigar los anticuerpos anti-glicanos como potenciales marcadores serológicos en una EII, se usó una matriz de azúcares (mono-, di-y tri-sacáridos) para caracterizar el perfil de anticuerpos anti-glicanos en muestras de suero de pacientes con la EC, pacientes con CU y donantes de sangre sanos.
Materiales y procedimientos
Pacientes
Se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por un comité de ética local. Los pacientes con una EII se identificaron en base a criterios clínicos, radiológicos, endoscópicos e histológicos aceptados (tabla 10). Se obtuvieron muestras de sangre en el Departamento de Gastroenterología y Enfermedades Hepáticas del Hospital Tel Aviv Sorasky y se recogieron en tubos vaciados que contenían gel recubiertos con silicio (Estar Technologies, Israel). Tras la coagulación de la sangre, el suero se separó por centrifugación, se recogió y se mantuvo congelado a -25°C hasta su uso. Las evaluaciones clínicas se realizaron de forma blindada.
Obtención de perfiles de anticuerpos anti-glicanos usando una matriz de glicanos
La obtención de perfiles de anticuerpos anti-glicanos en todas las muestras de suero se realizó usando una matriz GLYCOCHIP®, una matriz de glicanos en el formato de placas de microtitulación de 384 pocillos como se ha descrito (Schwarz y col., Glycobiology 13:749-54, 2003). Brevemente, los sacáridos p-nitrofenilo se unieron covalentemente a la superficie con un ligador (oligómero de 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano; Sigma, St. Louis, MO). Los polisacáridos ensayados se detallan en la tabla 12.
El volumen de todas las disoluciones añadido a la matriz de glicanos fue de 10 µL/pocillo. Los sueros se diluyeron al 1:40 en Tris-HCl 0,15 M, pH 7,2, Mg2SO4 0,085 M, Tween-20 (TBST) al 0,05% que contenía el 1% de albumina de suero bovino (BSA, Sigma, MO, EEUU), suministrados a los chips de las matrices de glicanos usando un sistema de manipulación automatizado Tecan Genesis Workstation 200 (Tecan, Suiza), y se incubaron durante 60 min a 37ºC. Las placas se lavaron entonces con 250 µL/pocillo de tampón fosfato salino (PBS) con Tween-20 (PBST, Sigma) al 0,05% en un lavador automático de placas (PowerWasher™, Tecan). En ese momento, para la determinación de IgG, IgA e IgM, se añadió el respectivo anticuerpo Ig anti-humano de cabra biotinilado específico para las sub-clases (Jackson Laboratories, PA, EEUU) diluido en TBST con BSA al 1% y las placas se incubaron durante 60 min a 37ºC. Después del lavado con PBST, se añadió europio conjugado con estreptavidina (Perkin-Elmer, CA, EEUU, 0,1 µg/mL) diluido con BSA al 1% a cada pocillo, seguido de incubación durante 30 min a 37ºC en oscuridad y lavado con PBST. Se añadió entonces una disolución intensificadora Delfia™ (Perkin-Elmer) a los pocillos y los chips se incubaron durante 30-45 min en oscuridad a temperatura ambiente. La fluorescencia de los pocillos se leyó con un contador multi-marcadores Victor™ 1420 (Perkin-Elmer) usando unos ajustes de fluorescencia resuelta en tiempo de 340/612 nm (excitación/emisión).
Determinación de pacientes IgG ALCA positivos e IgA ACCA positivos
Las reactividades de ALCA IgG y ACCA IgA se determinaron usando valores de corte de 2,5*106 unidades de fluorescencia relativa (UFR) y 0,74*106 UFR, respectivamente. Estos valores de corte se determinaron usando las curvas de características operativas del receptor (ROC) (figura 7) para proporcionar valores predictivos positivo y negativo óptimos para la diferenciación entre pacientes con la EC y con CU (ACCA IgA, 38% de sensibilidad, 95% de especificidad; ALCA IgG, 28% de sensibilidad, 91% de especificidad).
Determinación de IgG ASCA
Los niveles en suero de IgG ASCA se determinaron mediante un kit QUANTA LiteTM ASCA
(S. cerevisiae) IgG (Inova Diagnostics Inc., Calif. EEUU) según el protocolo del fabricante. Los resultados se presentaron en unidades arbitrarias y se calcularon dividiendo la densidad óptica media de la muestra entre la densidad óptica media del bajo positivo en ASCA IgG mediante ELISA. El resultado se multiplicó por el número de unidades asignadas al bajo positivo en ASCA IgG mediante ELISA. Los resultados se expresaron como negativos (<20 U), indeterminados (entre 20 y 25 U) o positivos (> 25 U).
Análisis estadístico
Se usó estadística descriptiva para las características de la población y subgrupos. Para la comparación entre los grupos de estudio se usó ANOVA de un factor, en la que un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Para los resultados obtenidos usando los GlycoChip®, se calcularon las curvas ROC, generadas representando la sensibilidad frente a 1-especificidad, para los datos de los GlycoChip®. Las curvas se usaron para determinar los valores de corte proporcionando valores predictivos positivos y negativos óptimos.
Resultados
Características de los pacientes
Se obtuvieron muestras de suero de pacientes con la EC (n=72), pacientes con CU (n=56) y donantes de sangre sanos (n=41). Los pacientes con CU tras proctocolectomía restauradora y anastomosis ileoanal con reservorio fueron excluidos. No había diferencias significativas en los parámetros demográficos entre los grupos estudiados (tabla 10). Las operaciones intestinales eran significativa-mente más frecuentes en el grupo con la EC frente al grupo con CU (p<0,0001) y el uso de 5-ASA (p=0,0001) y tratamientos biológicos (Infilixmab, p=0,049) era significativamente más frecuente en el grupo con la EC.
Anticuerpos anti-glicanos en pacientes con EC, CU y pacientes de control sanos
Inicialmente se cribaron muestras de suero para 49 glicanos diferentes (tabla 11). Los anticuerpos frente a manano y residuos de manano y 5 anticuerpos anti-glicanos IgG y 2 IgA eran significativamente elevados en los pacientes con la EC frente a pacientes con CU (p<0,001) (tablas 12-13). Los anticuerpos más destacados fueron Anti-Glc(β1,3)Glc(β) (Laminarobiósido) IgG y antiGlcNAc(β1,4)GlcNAc(β) (quitobiósido) IgA, mostrando la mayor media de UFR el grupo con la EC y los valores p más significativos entre los pacientes con la EC y con CU. Los anti-Glc(β1,3)Glc(β) (Laminarobiósido) IgG también fueron significativamente más elevados en los pacientes con la EC frente a los pacientes de control sanos (p=0,05), mientras que los anti-GlcNAc(β1,4)GlcNAc(β) (quitobiósido) IgA eran comparables entre los pacientes con la EC y los pacientes de control sanos (p=0,15). Estos anticuerpos se designaron, por tanto, como ALCA = anticuerpos anti-carbohidrato laminarobiósido y ACCA = anticuerpos anti-carbohidrato quitobiósido. La distribución de ALCA IgG y ACCA IgA en los pacientes con la EC, los pacientes con CU y los pacientes de control sanos se describe en la figura 8. Las especificidades de unión de los ALCA IgG y ACCA IgA se verificaron mediante estudios de inhibición usando un antígeno soluble.
Las curvas ROC que describen la capacidad de los ALCA IgG, ACCA IgA y ASCA IgG de discriminar entre pacientes con la EC y con CU se muestran en la figura 2.
Ningún anticuerpo dirigido contra glicanos era elevado en los pacientes con CU frente a los pacientes con la EC o pacientes de control sanos. No había anticuerpos anti-glicanos IgM significativamente elevados en los grupos estudiados.
Correlación entre anticuerpos frente a manano usando una matriz de glicanos y un ensayo de ASCA comercial
Para comparar las lecturas de los GlycoChip® con un ensayo de anticuerpos anti-glicanos validado, se ensayaron muestras de suero con los GlycoChip® y mediante un kit de ASCA comercial (Inova Diagnostics, San Diego, CA). Los resultados de ASCA se compararon con los niveles de unión de los anticuerpos frente a residuos de manano en la matriz de glicanos GlycoChip®. Los dos ensayos mostraron una correlación de R=0,76, validando adicionalmente el ensayo con GlycoChip®.
Falta de correlación entre anticuerpos carbohidratos anti-laminarobiósido o anti-quitobiósido (ALCA y ACCA) y anticuerpos anti-manano
Se evaluó la correlación entre las seroactividades de la cohorte de pacientes con la EC al manano, laminarobiósido y quitobiósido, puesto que diferentes seroactividades sugerirían no solo diferentes epítopos sino también la posibilidad de diferentes sub-poblaciones de pacientes. Había una correlación débil entre los niveles de anticuerpos frente a manano (IgG) y laminarobiósido (IgG) (R2=0,26), manano (IgG) y quitobiósido (IgA) (R2=0,18) y laminarobiósido (IgG) y quitobiósido (IgA) (R2=0,03). Esto sugiere que existe un solape mínimo entre los pacientes con la EC con anticuerpos frente al glicano laminarobiósido basado en glucosa y el glicano quitobiósido basado en quitina, y los anticuerpos anti-glicanos pueden definir diferentes serotipos de EC.
Doce de los 27 (44%) pacientes con la EC que dieron negativo en ASCA fueron positivos en ALCA IgG o ACCA IgA (figura 9). El uso combinado de los tres antígenos puede aumentar la sensibilidad de diferenciación entre la EC y la CU hasta el 79%, manteniendo a la vez la especificidad por encima del 90%.
OTRAS REALIZACIONES
Se debe sobreentender que aunque la invención se ha descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que está definida por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.
Glicano
IUPAC LINEARCODE® Nombre común
0
p-Nitrofenol pNP-0
1
Gal(α) Aa
2
Gal(β) Ab
3
Gal(β,1-3)GalNAc(α) Ab3ANa
4
Gal(β,1-3)GlcNAc(β) Ab3GNb
5
Gal(β,1-4)Glc(β) Ab4Gb Lactosa
6
Gal(β,1-6)Gal(β) Ab6Ab
7
GalNAc(α) ANa
8
GalNAc(β) ANb
9
Fuc(α) Fa
10
Fuc(β) Fb
11
Glc(α) Ga
12
Glc(α,1-4)Glc(α) Ga4Ga Maltosa
13
Glc(α,1-4)Glc(β) Ga4Gb
14
Glc(β) Gb
15
Glc(β,1-4)Glc(β) Gb4Gb Celobiosa
16
Glc(β,1-4)Glc(β,1-4)Glc(β) Gb4Gb4Gb Celobiosa
17
GlcNAc(α) GNa
18
GlcNAc(β) GNb
19
GlcNAc(β,1-3)GalNAc(α) GNb3ANa
20
GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) GNb4GNb Quitobiosa
21
L-Rha(α) Ha
22
GalA(β) Lb
23
Man(α) Ma
24
Man(β) Mb
25
Neu5Ac(α) NNa
26
L-Araf(α) Ra
27
GlcA(β) Ub
28
X(α) Xa
29
X(β) Xb
30
Gal(β,1-3)[GlcNAc(β,1-6)]GalNAc(α) Ab3(GNb6)ANa
31
Gal(β,1-4)GlcNAc(α) Ab4GNa
32
Gal(α,1-3)Gal(β,1-4)GlcNAc(β) Aa3Ab4GNb B-2 lineal
33
Gal(β,1-3)Gal(β,1-4)GalNAc(β) Ab4GNb
34
Man(β,1-4)GlcNAc(β) Mb4Gb
35
GlcNAc(β,1-6)GalNAc(α) GNb6ANa
36
Fuc(α,1-2)Gal(β) Fa2Ab
37
Man(α,1-3)Man(α) Ma3Ma
38
GlcNAc(β) 6-sulfato GN[6S]b
39
Glc(β,1-3)Glc(β) Gb3Gb
40
Gal(β) 3-sulfato A[3S]b
41
Man(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(β) Ma3(Ma6)Mb
42
GlcNAc(β,1-3)Gal(α,1-4)Glc(β) GNb3Ab4Gb Lacto-3
43
Gal(α,1-4)Gal(β,1-4)Glc(β) Aa4Ab4Gb antígeno Pk
44
Man(α,1-6)Man a Ma6Ma
45
Man(α,1-2)Man a Ma2Ma
46
Dextrano Dextrano
47
Manano Manano
48
Xilano Xilano
imagen1
imagen1
imagen1
Tabla 5: Especificidad y sensibilidad de los diferentes anti-glicanos IgG para la diferenciación entre la EC y otras enfermedades digestivas usando diferentes valores de corte. Los valores de corte para cada glicano se han fijado en el percentil 89 del grupo con otras enfermedades digestivas. Los glicanos se presentan en LINEARCODE®.
Nivel de corte
Anticuerpos anti-glicanos IgG
Gb
Gb3Gb Gb4Gb GGN Ma Ma3 (Ma6)Mb MMa3Ma Manano Xilano Ma2Ma
Percentil 65 de no EC
Sensibilidad para la EC % 76 73 62 62 58 60 71 78 58 71
Especificidad para la EC %
70 63 67 70 67 78 70 67 63 67
Percentil 75 de no EC
Sensibilidad para la EC % 62 71 58 60 71 60 64 73 62 71
Especificidad para la EC %
74 74 78 78 52 78 78 74 74 78
Percentil 85 de no EC
Sensibilidad para la EC % 56 64 51 49 49 56 62 67 40 62
Especificidad para la EC %
81 81 81 81 85 85 81 81 81 85
Percentil 90 de no EC
Sensibilidad para la EC % 49 62 33 42 44 56 60 47 36 40
Especificidad para la EC %
89 89 89 89 89 93 89 89 89 89
Tabla 6: Sensibilidad, especificidad, verdaderos positivos (VP), verdaderos negativos (VN), falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) y valor predictivo positivo (VPP) para diferentes valores de corte para diferenciar entre la EC y otras enfermedades digestivas según el nivel de anti-Glc(β,1-3)Glc(β) IgG.
IgG Gb3Gb (anomalía por encima del nivel de corte)
Sensibilidad Especificidad VP VN FP FN VPP
-
100,0% 0,0% 45 0 27 0 62,5
0
95,6% 0,0% 43 0 27 2 61,43
6.963
95,6% 3,7% 43 1 26 2 62,32
27.235
93,3% 3,7% 42 1 26 3 61,76
27.402
91,1% 3,7% 41 1 26 4 61,19
82.662
88,9% 3,7% 40 1 26 5 60,61
78.554
88,9% 7,4% 40 2 26 5 61,54
86.949
88,9% 11,1% 40 3 24 5 62,5
87.267
88,7% 11,1% 39 3 24 6 61,9
108.535
86,7% 14,8% 39 4 23 6 62,9
133.683
88,7% 18,5% 39 5 22 6 63,93
159.547
88,7% 22,2% 39 6 21 6 65
174.695
86,7% 25,9% 39 7 20 6 66,1
241.622
84,4% 25,8% 38 7 20 7 65,52
242.565
84,4% 29,6% 38 8 19 7 66,67
312.940
84,4% 33,3% 38 9 18 7 67,86
317.476
84,4% 37,0% 38 10 17 7 69,09
744.750
82,2% 37,0% 37 10 17 8 68,52
371.507
80,0% 37,0% 36 10 17 9 67,92
371.648
80,0% 40,7% 36 11 16 9 69,23
378.722
77,8% 40,7% 35 11 16 10 68,63
379.003
77,6% 44,4% 35 12 15 10 70
430.129
77,8% 48,1% 35 13 14 10 71,43
441.239
77,8% 51,9% 35 14 13 10 72,92
454.736
75,8% 51,9% 34 14 13 11 72,34
489.733
75,6% 55,6% 34 15 12 11 73,91
525.203
73,3% 55,6% 33 16 72 12 73,33
526.443
73,3% 59,3% 33 16 11 12 75
546.432
73,3% 63,0% 33 17 10 12 76,74
612.367
73,3% 68,7% 33 18 9 12 78,57
851.962
73,3% 70,4% 33 19 8 12 80,49
979.509
71,1% 70,4% 32 19 8 13 80
1.209.892
71,1% 74,1% 32 20 7 13 82,05
1.266.954
71,1% 77,8% 32 21 6 13 84,21
1.317.083
68,9% 77,8% 31 21 6 14 83,78
1.378.957
66,7% 77,8% 30 21 6 15 83,33
1.378.223
66,7% 81,5% 30 22 5 15 85,71
1.425.185
64,4% 81,5% 29 22 5 16 85,29
1.461.919
64,4% 85,2% 29 23 4 16 87,88
1.560.904
82,2% 85,2% 28 23 4 17 87,5
1.574.353
82,2% 88,9% 28 24 3 17 90,32
1.705.604
60,0%
88,9%
27
24
3
18
90
1.722.429
67,8%
68,9%
26
24
3
19
89,66
1.732.725
57,8%
92,6%
28
25
2
19
92,86
1.817.947
55,6%
92,6%
25
25
2
20
92,59
1.825.788
53,3%
92,6%
24
25
2
21
92,31
1.869.774
51,1%
92,6%
23
25
2
22
92
1.880.984
48,9%
92,6%
22
25
2
23
91,67
1.994.899
46,7%
92,6%
21
25
2
24
91,3
2.067.775
44,4%
92,6%
20
25
2
25
90,91
2.154.175
42,2%
92,6%
19
25
2
26
90,48
2.324.221
40,0%
92,6%
18
25
2
27
90
2.467.429
37,8%
92,6%
17
25
2
28
89,47
2.551.776
35,6%
92,6%
16
25
2
29
88,89
2.703.085
35,6%
96,3%
16
28
1
29
94,12
2.850.072
33,3%
98,3%
15
26
1
30
93,75
3.096.078
31,1%
96,3%
14
26
1
31
93,33
3.186.273
28,9%
96,3%
13
26
1
32
92,86
3.441.678
28,9%
100,0%
13
27
0
32
100
3.511.076
26,7%
100,0%
12
27
0
33
100
3.559.430
24,4%
100,0%
71
27
0
34
100
3.578.889
22,2%
100,0%
10
27
0
35
100
4.137.076
20,0%
100,0%
9
27
0
36
100
4.327.530
17,8%
100,0%
8
27
0
37
100
5.107.549
15,6%
100,0%
7
27
0
38
100
5.545.432
13,3%
100,0%
6
27
0
39
100
5.640.050
11,1%
100,0%
5
27
0
40
100
5.724.798
8,9%
100,0%
4
27
0
41
100
6.708.583
6,7%
100,0%
3
27
0
42
100
6.891.638
4,4%
100,0%
2
27
0
43
100
7.209.245
22%
100,0%
1
27
0
44
100
7.299.442
0,0%
100,0%
0
27
0
45
####
imagen1
imagen1
Tabla 9 Tabla 11
Indicación
Ensayos Sensibilidad, % Especificidad, %
EC vs CU
Anti manano (ASCA) (+) o ALCA (+) 71 91
No EII (NIC) vs EII (CU+EC)
ACCA (+) y Anti manano (ASCA) (-) 20 99

Tabla 10. Características de los pacientes
EC (n=72)
CU (n=56) Controles sanos (n=41)
Edad, año (intervalo)
35,5 (19-70) 40,9 (14-89) 38,9 (18-78)
Mujer, n (%)
31 (43) 28 (50) 21 (51)
Duración media de la enfermedad, años (intervalo)
9,1 (1-54) 7,9 (1-39) -
Edad media en el momento del diagnóstico, años (intervalo)
26,6 (8-63) 33 (10-87) -
Cirugía intestinal (incluyendo apendectomía), n (%)
28 (38,9) 3 (5,4) -
Síntomas extraintestinales, n (%)
28 (38,9) 14 (25,0) -
Tratamiento:
5-ASA, n (%)
48 (66,7) 53 (94,6) --
Antibióticos, n (%)
15 (20,8) 4 (7,1) --
Esteroides, n (%)
23 (31,9) 15(26,7) -
6MP/AZA, n (%)
22 (30,5) 12 (21,4) -
MTX, n (%)
5(6,9) 0 (0) --
Infliximab, n (%)
9 (12,5) 0 (0) -
Sin tratamiento, n (%)
0 (0) 0 (0) -
EC, enfermedad de Crohn; CU, colitis ulcerosa; CS, donantes de sangre de control sanos.
Número de glicano
Nomenclatura de la IUPAC Número de glicano Nomenclatura de la IUPAC
1
Gal(β) 3-sulfato 26 GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Glc(β)
2
Gal(α) 27 GlcNAc(β1-6)GalNAc(α)
3
Gal(β) 28 L-Rha(α)
4
Gal(β1,3)[GlcNAc(β1,6)]GalNAc(α) 29 GalA(β)
5
Gal(β1-3)GalNAc(α) 30 Man(α)
6
Gal(β1-3)GlcNAc(β) 31 D-Manp(α1-3)D-Manp(α)
7
Gal(β-4)Glc(β) 32 Man(β)
8
Gal(β1-4)GlcNAc(α) 33 D-Manp(β1-4)D-Glcp(β)
9
Gal(β1-3)Gal(β1-4)GalNAc(β) 34 Neu5Ac(α)
10
Gal(β1-6)Gal(β) 35 L-Araf(α)
11
GalNAc(α) 36 GlcA(β)
12
GalNAc(β) 37 X(α)
13
Fuc(α) 38 X(β)
14
L-Fucp(α1-2)D-Galp(β) 39 PNP
15
Fuc(β) 40 Gal(α1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β)
16
Glc(α) 41 Gal(α1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal (β1-4)Glc(β)
17
Glc(α1-4)Glc(α) 42 Gal(α1-4)Gal(β1-4)Glc(β)
18
Glc(α1-4)Glc(β) 43 Glc(β1-4)Glc(β)
19
Glc(β) 44 Man(α1-2)Mana
20
Glc(β1-3)Glc(β) 46 Man(α1-3)[Man(α1-6)]Man(β)
21
GlcNAc(β) 6-sulfato 46 Man(α1-6)Mana
22
GlcNAc(α) 47 Manano
23
GlcNAc(β) 48 Xilano
24
GlcNAc(β1-3)GalNAc(α) 49 Dextrano
25
GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β)
Señal UFR*106 Media (SD)
Antígeno azúcar
EC CU Control sano
Glc(β1,3)Γλχ(β)
2,26 (1,99) 0,91 (1,13)** 1,56 (1,39)*
α-Man
1,35 (0,70) 0,62 (0,30)** 0,62 (0,29)*
Man(α1,3)[Man(α1,6)]Man(β)
1,24 (0,84) 0,46 (0,18)** 0,53 (0,25)
Man(α1,3) Man(α)
1,42(0,98) 0,50 (0,22)** 0,66 (0,57)
Manano
4,91 (2,34) 1,91 (1,28)** 1,97 (1,28)**
GlcNAc(β) 6-sulfato
1,24 (0,66) 0,65 (0,28)** 0,89 (0,77)
UFR, unidades de fluorescencia relativa; EC, Enfermedad de Crohn; CU, colitis ulcerosa; SD, desviación estándar. * <0,05 frente a EC ** <0,001 frente a EC

Tabla 13: Anti-glicanos IgA
Señal UFR*106
EC
CU Control sano
Antígeno azúcar
GlcNAc(β1,4)ΓλχNAχ(β)
0,68 (0,48) 0,39 (0,30)** 0,50 (0,33)
GlcNAc(β1,3)Γαλ(β1,4)Γλχ(β)
0,61 (0,51) 0,39 (0,30) 0,50 (0,33)
Manano
2,32 (1,89) 0,97 (0,22)* 1,27 (0,41)
UFR, unidades de fluorescencia relativa; EC, Enfermedad de Crohn; CU, colitis ulcerosa; SD, desviación estándar. * <0,05 frente a EC ** <0,001 frente a EC

Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento útil en el diagnóstico de la enfermedad de Crohn en un sujeto, comprendiendo el procedimiento identificar en una muestra para análisis de un sujeto con síntomas de la enfermedad de Crohn un anticuerpo dirigido contra glicanos específico, en el que dicho anticuerpo dirigido contra glicanos específico es un anticuerpo anti-GlcNAc(β,1-4)GlcNAc(β) o un anticuerpo antiGlc(β,1-3)Glc(β),
    en el que la identificación de niveles elevados de dicho anticuerpo en dicha muestra para análisis respecto a una muestra de control indica que es probable que el sujeto padezca la enfermedad de Crohn.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además comparar los niveles de dicho anticuerpo dirigido contra glicanos específico en dicha muestra para análisis con los niveles de dicho anticuerpo dirigido contra glicanos específico en una muestra de control, en el que la muestra de control se selecciona del grupo constituido por uno o más individuos de los que se sabe que padecen o no padecen un trastorno gastrointestinal diferente a la enfermedad de Crohn.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha muestra de control es de uno o más individuos con un trastorno gastrointestinal que es el síndrome del intestino irritable o colitis ulcerosa.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha muestra de control es de uno o más individuos que no padecen un trastorno gastrointestinal.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la determinación de si dicha muestra para análisis tiene un anticuerpo anti-manano (ASCA), en el que la evaluación del sujeto es que padece la enfermedad de Crohn si dicho anticuerpo anti-ASCA está presente en dicha muestra.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la determinación de si dicha muestra para análisis tiene anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA), en el que la evaluación del sujeto es que no padece la enfermedad de Crohn si dichos anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA) están presentes en dicha muestra.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende además la determinación de si dicha muestra para análisis tiene anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA), en el que la evaluación del sujeto es que no padece la enfermedad de Crohn si dichos anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA) están presentes en dicha muestra.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además identificar uno, dos o tres de un anticuerpo anti-Man(α,1-3) Man(α), un anticuerpo antiMan(α,1-3)[Man(α,1-6)]Man(α), un anti-Man(α,1-2)Man(α), un anti-Man(α,1-6)Man(α) o un anticuerpo anti-manano (ASCA) en dicha muestra.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra para análisis es un fluido biológico.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho fluido biológico es sangre completa, suero, plasma, orina o saliva.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho fluido biológico es suero.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además determinar el isotipo de dicho anticuerpo.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo isotipo IgM.
  14. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo isotipo IgA.
  15. 15.
    Los procedimientos de la reivindicación 12, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo isotipo IgG.
  16. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo IgG es un anticuerpo antiGlc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-3)Glc(β), un anticuerpo anti-Glc(β,1-4)Glc(β), un anticuerpo anti-GlcNAc(β) 6-sulfato o un anticuerpo anti-xilano.
  17. 17.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo dirigido contra glicanos se identifica con un anticuerpo fluorescente.
  18. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo dirigido contra glicanos se identifica con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
  19. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo antiGlc(β,1-3)Glc(β).
  20. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho procedimiento comprende la detección de un anticuerpo IgG anti-Glc(β,1-3)Glc(β) en dicha muestra.
  21. 21.
    El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho procedimiento comprende además la identificación de un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α) en dicha muestra.
  22. 22. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho procedimiento comprende además la 5 identificación de un anticuerpo IgG anti-Man(α,1-3)Man(α) en dicha muestra.
  23. 23. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho procedimiento comprende además la determinación de si dicha muestra tiene un anticuerpo IgG anti-manano o IgA anti-manano, en el que la evaluación de dicho sujeto es que padece la enfermedad de Crohn si dicho anti
    10 cuerpo IgG anti-manano o IgA anti-manano está presente en dicha muestra.
  24. 24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicho procedimiento comprende la determinación de si dicha muestra tiene un anticuerpo IgG anti-manano.
    15 25. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicho procedimiento comprende la determinación de si dicha muestra tiene un anticuerpo IgA anti-manano.
  25. 26. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicho procedimiento comprende además determinar si dicha muestra tiene anticuerpos anticitoplasmáticos de neutrófilos (ANCA), en el
    20 que la evaluación del sujeto es que padece la enfermedad de Crohn si dichos ANCA están ausentes en dicha muestra.
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