ES2349885T3

ES2349885T3 - Análisis de la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos.

Info

Publication number: ES2349885T3
Application number: ES07717805T
Authority: ES
Inventors: John Kunich; Cheng Liu
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2006-01-04
Filing date: 2007-01-04
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2027-01-04
Also published as: CA2636183A1; IL192546A0; EP2246700A1; KR20080085080A; PL1977241T3; BRPI0706420A2; MX2008008700A; AU2007204777A1; PT1977241E; DE602007008357D1; CN101395471A; EP1977241A2; HK1116253A1; EP1977241B1; IL192546A; RU2409816C2; US20090155821A1; RU2008131931A; AU2007204777B2; ATE477486T1

Abstract

Un método para evaluar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC), que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, en donde opcionalmente el anticuerpo se deriva de un paciente con un trastorno autoinmune.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente solicitud se relaciona con métodos para analizar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC por sus siglas en inglés) y, en algunas modalidades, se relaciona con métodos que permiten que se pueda analizar en tiempo real la ADCC sin necesidad de células marcadas. ANTECEDENTES DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

La ADCC es un componente de la respuesta inmunológica en la cual los anticuerpos IgG se enlazan con antígenos sobre la superficie de células objetivo, patógenas o tumorogénicas, que las identifica por destrucción por medio de células efectoras NK. Las células efectoras que portan al receptor Fc gamma (FcγR) reconocen y enlazan la región Fc de los anticuerpos enlazados a la célula objetivo. Los anticuerpos confieren así especificidad a la célula asesina objetivo, que es mediada por células efectoras formando un puente entre los dos tipos de células y posteriormente liberando gránulos líticos.

Algunos anticuerpos terapéuticos logran su actividad biológica promoviendo ADCC. Por ejemplo, Herceptin®, un anticuerpo humanizado utilizado para tratamiento de cáncer de seno, promueve ADCC por enlazamiento del antígeno HER-2 sobre la superficie de células cancerosas. Igualmente, Rituxan®, un anticuerpo quimérico utilizado para tratamiento de linfoma no Hodgkin, promueve ADCC por enlazamiento de antígenos CD20 sobre la superficie de las células de linfoma.

Las tecnologías para determinar si un anticuerpo induce ADCC típicamente implican etiquetar células objetivo con un material radioactivo, tal como Cr51 como se describe por ejemplo en US-A-5840313 o EP-A-1176195, o un colorante fluorescente, tal como Calceína AM. Se incuban las células etiquetadas con el anticuerpo y células efectoras tales como células NK o las PBMC, y se detecta la muerte de células objetivo por medio de ADCC por la liberación de radioactividad o fluorescencia. El etiquetado de células objetivo en tales ensayos requiere de la separación de células adherentes para etiquetado. Después del etiquetado, se lleva a cabo el análisis con las células objetivo en suspensión, que no es un estado normal para células adherentes. Además, el grado de muerte celular mediada por ADCC generalmente se determina en un solo momento varias horas después de la mezcla de las células objetivo con células efectoras y el anticuerpo. Se ha desarrollado un ensayo libre de etiquetas, en el cual se determina la muerte celular midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) a partir del citoplasma de células lisadas en el sobrenadante libre de células. Sin embargo, el método de la LDH no es un ensayo en tiempo real, y no distingue entre muerte de células objetivo y muerte de células efectoras ya que ambos tipos de células liberarán LDH en la lisis.

En vista del número de productos de anticuerpos terapéuticos que se encuentran hoy en día en el mercado o en desarrollo, existe la necesidad de ensayos in vitro que permitan determinar la actividad de ADCC de anticuerpos. En particular, existe la necesidad de un ensayo de ADCC de alto rendimiento libre de etiquetas que permita monitorear ADCC en tiempo real y que no requiera la separación de células adherentes. RESUMEN

La presente solicitud proporciona métodos para analizar ADCC in vitro. Los métodos son libres de etiquetas o requieren de niveles reducidos de etiquetas, y por lo tanto son más fáciles y seguros de llevar a cabo que los ensayos que requieren células etiquetadas. Los métodos se realizan sobre células adherentes, en vez de sobre células en suspensión. Además, se pueden llevar a cabo los métodos en tiempo real, permitiendo seguir la cinética de las reacciones de ADCC de tal manera que se puedan comparar las cinéticas de ADCC de diferentes anticuerpos. Los métodos suministrados aquí son más sensibles también que los ensayos estándar de ADCC, permitiendo detectar diferencias menores en la cinética de ADCC de diferentes anticuerpos. Además, en algunas modalidades la simplicidad de los métodos suministrados aquí significa que son más rápidos que los análisis estándar de ADCC, y también tienen el potencial para ser optimizados por selección de alto rendimiento de la actividad de ADCC.

Los métodos suministrados aquí comprenden (a) el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo. Una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de ADCC que ha sido efectuada en el medio de ensayo. Un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo pueden ser indicativos de que no ha sido efectuada la función de ADCC en el medio de ensayo.

En un aspecto, la presente solicitud presenta un método para analizar la citotoxicidad celular

que depende de anticuerpos (ADCC), que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y (b) la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo. El método puede incluir la medición de la impedancia a intervalos regulares. El método puede incluir derivar un Índice de Células (CI) a partir de cada medición de impedancia y determinar si se presenta un cambio en el Índice de Células, en donde el Índice de Células se deriva a partir de cada medición de impedancia utilizando la fórmula

imagen1

en donde Rb(f) y Rcélula(f) son las resistencias de electrodo que dependen de la frecuencia sin células o con células presentes, respectivamente, y N es el número de los puntos de frecuencia en los cuales se mide la impedancia. El método se puede realizar utilizando el sistema RT-CES®. Las mediciones de impedancia se pueden tomar cada 15 minutos.

El método puede sembrar además en placa las células objetivo. Las células objetivo pueden ser sembradas en placa 18 a 24 horas antes de la adición del anticuerpo y las células efectoras. Las células objetivo pueden ser sembradas en placa con una densidad entre 2 K y 100 K por pozo (por ejemplo, entre 15K y 25K por pozo, o aproximadamente 20 K por pozo). La proporción de células efectoras con relación a las células objetivo (E:T) puede ser de 25:1. La proporción E:T puede ser mayor a 10:1, mayor a 50:1, o mayor a 100:1.

Se puede añadir el anticuerpo en una concentración entre 1 y 100 µg/ml, entre 1 y 50 µg/ml,

: o entre 2 y 8 µg/ml. Puede incluir la adición al medio de ensayo dos o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, tres o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o cuatro o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo. El anticuerpo puede provenir de un paciente con un trastorno autoinmune.

3 Las células objetivo pueden expresar antígenos apicales. El método puede incluir una etapa preliminar de selección de las células objetivo para expresión del antígeno apical. Las células objetivo pueden ser células cancerosas o células infectadas con virus. Las células cancerosas pueden ser de una línea celular. Las células cancerosas pueden ser células SKBR3 o células MG63. Las células efectoras pueden incluir células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas o neutrófilos. 30. La etapa (b) del método puede incluir la adición a las células objetivo de sangre entera que ha sido parcialmente enriquecida por las células efectoras. La etapa (b) del método puede incluir la adición de sangre entera a las células efectoras, en donde la sangre entera incluye las células efectoras. En otro aspecto, la presente solicitud presenta un método de selección de un anticuerpo candidato por la capacidad para inducir ADCC contra células objetivo, que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en el medio del ensayo; y (b) la adición de células efectoras y el anticuerpo candidato que se enlaza a las células objetivo en el medio del ensayo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la capacidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la inhabilidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo. En otro aspecto, la presente solicitud ofrece un método para identificar un paciente que tiene una enfermedad asociada con células objetivo que es adecuado para tratamiento con un anticuerpo candidato que es capaz de modular ADCC, en donde las células objetivo son 1) células sanas asociadas con una enfermedad autoinmune, 2) células infectadas con virus o 3) células cancerosas, comprendiendo el método: (a) el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad; (b) la adición de PBMC aisladas del paciente y el anticuerpo candidato a las células objetivo; y (c) la determinación de si un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato se presenta después de la adición de las PBMC y el anticuerpo, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de lo adecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo, y en donde un incremento

: o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el anticuerpo es indicativo de lo inadecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo.

En aún otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un método para seleccionar un compuesto candidato por la capacidad para modular ADCC, que comprende:

(a) el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en el medio del ensayo; (b) la adición al medio del ensayo de células efectoras y un anticuerpo, en presencia y en ausencia del compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y (c) la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en ausencia del compuesto candidato, en donde un cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato que es mayor que cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato tiene la capacidad para modular

4 ADCC. Opcionalmente, el compuesto que va a ser seleccionado puede modular la ADCC relacionada con autoinmunidad. La presente solicitud también cuenta con un método como se describe aquí que es un ensayo de alto rendimiento, en donde el sustrato no conductor incluye dos o más pozos de microtitulación, incluyendo cada pozo al menos dos electrodos, y el monitoreo de la impedancia entre los electrodos en cada pozo. En otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende: (a) el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio del ensayo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; en done una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa d que el anticuerpo es adecuado para ser librado para uso en la inducción de ADCC, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativo de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC. En aún otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende: (a) el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; (b) la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio del ensayo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y (c) la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo con cualquier cambio en la impedancia para una muestra de control después de la adición de las células efectoras y un anticuerpo de control; en done una disminución en la impedancia después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC, y en donde la carencia de una disminución en la impedancia después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC. En el ensayo de control de calidad, una disminución en la impedancia después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo que es al menos 25% mayor que la disminución en la impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control puede ser indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC. La presente solicitud también cuenta con un método para seleccionar un compuesto candidato para uso como agente terapéutico contra una enfermedad autoinmune, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo son células sanas; (b) añadir al medio de ensayo células efectoras y un anticuerpo, con y sin el compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde las células efectoras son PBMC de un individuo diagnosticado con la enfermedad autoinmune; y (c) comparar cualquier cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato, en donde una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea mayor que cualquier disminución en la impedancia

5 en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune, y en donde la falta de una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea superior a cualquier disminución en la impedancia en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato no es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune. En otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un método para determinar si un anticuerpo candidato es adecuado para tratar a un individuo que tiene una enfermedad autoinmune, que comprende: (a) monitorear la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad autoinmune; y (b) añadir el anticuerpo candidato y las PBMC aisladas del individuo a las células objetivo; y (c) determinar si se presenta un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el anticuerpo candidato, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para el tratamiento del individuo, y en donde la falta de una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para el tratamiento del individuo. En aún otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un método para determinar una concentración óptima de un anticuerpo para inducir una respuesta de ADCC, que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de dos o más muestras de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) añadir células efectoras y un anticuerpo a las dos o más muestras de células objetivo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde se añade el anticuerpo en diferentes concentraciones a las dos o más muestras de células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la función de ADCC que se ha efectuado en el medio de ensayo, y en donde se determina que la concentración de anticuerpo que resulta en la mayor disminución en impedancia es la concentración óptima. En otro aspecto, la presente solicitud cuenta con un método para determinar si un anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre una célula objetivo, que comprende: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) añadir células efectoras y el anticuerpo a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre las células objetivo. A menos que se defina otra cosa, todos los términos científicos y técnicos utilizados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona ordinariamente capacitada en el arte a la cual pertenece esta invención. Los detalles de una o más modalidades de la invención están expuestos en los dibujos acompañantes y en la descripción que se da más adelante. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y de los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 describe un gráfico del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 que fueron sembradas en placa en diluciones seriadas dos veces de 40 K, 20 K, 10 K, ó 5 K por pozo, como ya se indicó. La FIG. 2 describe un gráfico del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 sembradas en placa que fueron tratadas después de 20 horas con medio fresco adicional

6 ("solamente las células"), o con Triton X-100 ("células + Triton") para inducir la muerte de las células. La FIG. 3 describe una gráfica del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 sembradas en placa que fueron tratadas después de 20 horas con medio fresco ("Solamente las objetivo"), Herceptin ("Objetivo + Herceptin"), o anticuerpo de control IgG ("Objetivo + IgG"). La FIG. 4 describe una gráfica del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 solas ("objetivo") o PBMC ("efectoras"). La FIG. 5 describe una gráfica del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 solas, PBMC solas, o células SKBR3 que fueron tratadas con PMBC después de 20 horas. La FIG. 6 describe una gráfica del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 solas, células SKBR3 tratadas con PBMC después de 20 horas, o células SKBR3 tratadas con PBMC y Herceptin® después de 20 horas. La FIG. 7 describe una gráfica que muestra la lisis de células (T) objetivo SKBR3 en el transcurso del tiempo por parte de PBMC efectoras (E) en una proporción E:T de 50:1 o de 12.5:1, con y sin mAB Herceptin® como se indicó. La FIG. 8A describe una gráfica del porcentaje de lisis determinado utilizando un método como el descrito aquí para células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC solas, células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC más las concentraciones indicadas de Herceptin®, o células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC más IgG de control. La FIG. 8B describe una gráfica del porcentaje de lisis determinado utilizando un ensayo estándar de Calceína-AM para células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC solas, células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC más las concentraciones indicadas de Herceptin®, o células objetivo SKBR3 tratadas con PBMC más IgG de control. La FIG. 9 describe una gráfica del Índice de Células en función del tiempo para células SKBR3 y MG63. La FIG. 10A describe una gráfica del Índice de Células para células MG63 tratadas a las 18 -20 horas con PBMC solas, PBMC con anticuerpo específico objetivo RX1, o PMBC con anticuerpo IgG de control. La FIG. 10B describe una gráfica del Índice de Células para células SKBR3 tratadas a las 18 -20 horas con PBMC solas, PBMC con anticuerpo específico objetivo Herceptin®, o PMBC con anticuerpo IgG de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente solicitud proporciona métodos para detector ADCC por medio de la medición de la impedancia entre electrodos localizados en la superficie sobre los cuales se siembran en placa las células. Se puede utilizar cualquier dispositivo adecuado para medir la impedancia. En algunas modalidades, se puede detectar ADCC utilizando un dispositivo que tiene un sustrato no conductor que tiene una pluralidad de arreglos de electrodos posicionados sobre él, estando los arreglos conectados a un analizador de impedancia. Por ejemplo, se puede medir ADCC utilizando un dispositivo que tiene un arreglo de electrodos posicionado sobre un sustrato en una cámara inferior, estando la cámara inferior separada de la cámara superior por una membrana. Tal dispositivo también puede ser utilizado para detector la migración de células dese la cámara superior hasta la cámara inferior, en donde se detecta la adherencia al sustrato en la cámara inferior por medio de un incremento en impedancia entre los electrodos en los arreglos en la cámara inferior. Tales dispositivos son divulgados, por ejemplo en WO2004/010103 y en W02004/010102.

Tales dispositivos también pueden ser utilizados para evaluar la citotoxicidad de un compuesto sobre células allí. Por ejemplo, se puede añadir un compuesto a las células que se cultivan sobre un sustrato que contiene electrodos, y se puede monitorear el efecto del compuesto sobre la impedancia entre los electrodos, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de muerte celular. Ver, por ejemplo, W02005/77104 y WO2005/047482. Ver, también, la Publicación Estadounidense No. 2005/0112544, que divulga métodos que incluyen la medición de la impedancia para evaluar la citotoxicidad celular inducida por Tamoxifeno.

Ninguna de las anteriores referencias divulga allí el uso de dispositivos para evaluar ADCC. WO 2006/015387 divulga el uso de sistemas RT-CES para seleccionar toxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC). Este documento es sin embargo un documento que cae bajo el Art 54 (3) EPC.A diferencia de los ensayos de citotoxicidad convencionales, que simplemente involucran la adición de un compuesto candidato a una célula objetivo, los ensayos de ADCC involucran la adición de (a) un anticuerpo que se enlazará a la célula objetivo, y (b) células efectoras que se enlazarán con el anticuerpo. No se esperaría que las mediciones de impedancia suministraran una indicación precisa del número de células objetivo en un análisis de ADCC ya que se esperaría las células objetivo, las células efectoras, y el anticuerpo se adhirieran al sustrato. Por lo tanto, una lectura de impedancia alta podría ser debida a: i) células objetivo que se adhieren al sustrato ya que el anticuerpo y las células efectoras no habían inducido ADCC; o ii) células efectoras y anticuerpos que se adhieren al sustrato después de matar células objetivo por ADCC. No se esperaría por lo tanto que dispositivos tales como aquellos divulgados anteriormente fueran útiles en un ensayo de ADCC.

Sorprendentemente, sin embargo, los inventores han encontrado que se pueden utilizar dispositivos tales como aquellos descritos en WO2005/77104 y WO2005/047482 en ensayos para ADCC. En particular, los inventores han encontrado que las células efectoras no se adhieren significativamente al sustrato que contiene el electrodo, y que con números adecuados de células objetivo, proporciones de células efectoras con respecto a células objetivo (E:T), y concentraciones de anticuerpo, los cambios en impedancia entre electrodos sobre el sustrato pueden suministrar una indicación precisa del número de células objetivo.

El ensayo de ADCC por medio de la detección de cambios en impedancia entre electrodos en un sustrato sobre el cual se cultivan las células objetivo tiene un número significativo de ventajas sobre los ensayos estándar de ADCC. A diferencia de la mayoría de ensayos estándar de ADCC, en algunas modalidades los métodos suministrados aquí son libres de etiquetas. En algunas modalidades, los métodos no involucran marcación de células con una etiqueta radioactivo o de otro tipo, haciendo más fáciles y seguros de realizar los ensayos que los ensayos que requieren células marcadas. Además, como se discutió anteriormente, en ensayos estándar de ADCC, se desprenden células adherentes de la superficie sobre la cual están creciendo de tal manera que puedan ser marcadas y se lleva a cabo el ensayo de ADCC en suspensión. Ya que los métodos suministrados aquí son libres de etiquetas, no existe la necesidad de separar células, eliminando por lo tanto una fuente potencial de error debido a perturbación de las células adherentes. En vez de eso, los ensayos de ADCC se llevan a cabo con las células unidas al sustrato.

Además, a diferencia de la mayoría de los ensayos estándar de ADCC, en algunas modalidades los métodos suministrados aquí permiten seguir el número de células en tiempo real, midiendo la impedancia en diferentes momentos después de la adición del anticuerpo y de células efectoras. Los métodos suministrados aquí permiten seguir la cinética de la reacción de ADCC de tal manera que se pueda comparar la cinética de ADCC de diferentes anticuerpos. En algunas modalidades los métodos son más sensibles que los ensayos estándar ADCC, permitiendo detectar pequeñas diferencias en la cinética de ADCC de diferentes anticuerpos. Además, significa que los métodos establecidos aquí son mucho más rápidos que los ensayos estándar de ADCC, y tienen el potencial para ser optimizados para selección de alto rendimiento de la actividad de ADCC.

8 Los métodos establecidos aquí se pueden llevar a cabo utilizando un dispositivo descrito en W02004/010102, W02004/010103, W02005/077104 o WO2005/047482, o un dispositivo con base en estos diseños. En algunas modalidades, se pueden llevar a cabo los métodos establecidos aquí utilizando el sistema RT-CES® fabricado por ACEA Biosciences (San Diego, CA). El sistema ACEA RT-CES® incluye tres componentes: un analizador con sensor electrónico, un dispositivo a modo de estación, y una placa de microtitulación de 16 pozos. El lector se dará cuenta que variantes menores de taller de este sistema estarán dentro del ámbito de la persona entrenada. Por ejemplo, el dispositivo puede tener una placa de microtitulación de 96 pozos o una placa de microtitulación de 256 pozos, en lugar de una placa de microtitulación de 16 pozos, para permitir llevar a cabo más ensayos en forma simultánea. Se pueden fabricar arreglos de sensores de microelectrodos sobre portaobjetos de vidrio utilizando métodos litográficos de microfabricación, y se pueden ensamblar los portaobjetos que contienen electrodos a bandejas plásticas para formar pozos que contienen electrodos. El dispositivo a modo de estación puede recibir la placa del microtitulador (por ejemplo, la placa de microtitulación de 16 pozos, 256 pozos, o de 96 pozos), y puede ser capaz de conmutar electrónicamente cualquiera de los pozos con el analizador con sensor para medición de la impedancia. En operación, se pueden conectar dispositivos con células cultivadas en los pozos con el dispositivo a modo de estación y colocarlos en una incubadora. Cables eléctricos pueden conectar al dispositivo a modo de estación con el analizador con sensor. Utilizando el control del programa RTCES®, el analizador con sensor puede seleccionar automáticamente los pozos que van a ser medidos, y puede llevar a cabo en forma continua mediciones de impedancia. Se pueden transferir los datos de impedancia del analizador a un ordenador, analizados, y procesados por el programa integrado. La impedancia medida entre electrodos en un pozo individual depende típicamente de la geometría del electrodo, de la concentración iónica en el pozo, y de si hay células unidas a los electrodos. En ausencia de células, se determina la impedancia del electrodo principalmente por medio del ambiente iónico en la interfaz solución/electrodo y en el volumen de la solución. En presencia de células, las células unidas a las superficies del electrodo sensor pueden alterar el ambiente iónico local en la interfaz solución/electrodo, conduciendo a un incremento en la impedancia. Entre más células haya sobre los electrodos, mayor el incremento en la impedancia célula-electrodo. Para cuantificar las células con base en la impedancia medida célula-electrodo, se deriva un parámetro llamado Índice de Células (CI), de acuerdo con la fórmula:

imagen1

donde Rb(f) es la resistencia del electrodo que depende de la frecuencia (un componente de la impedancia)sin células, Rcélula(f) es la resistencia del electrodo que depende de la frecuencia con células presentes, y N es el número de los puntos de frecuencia en los cuales se mide la impedancia.

Por lo tanto, Índice de Células es una medida cuantitativa de las células en un pozo que contiene un electrodo. Bajo las mismas condiciones fisiológicas, más células unidas sobre los electrodos conducen a un mayor valor de Rcélula(f), conduciendo a un mayor valor del Índice de Células.

Los métodos establecidos aquí pueden incluir la medición de la impedancia a intervalos regulares y derivar un Índice de Células a partir de estas mediciones de impedancia de acuerdo con la fórmula dada anteriormente, permitiendo por lo tanto seguir la reacción de ADCC. Los intervalos a los cuales se toman las mediciones de impedancia pueden depender de cuán cerca se desea seguir la cinética de la reacción. Por ejemplo, pueden ser preferibles intervalos cortos si se desea seguir la cinética de ADCC de un anticuerpo que se sabe que induce ADCC, mientras que pueden ser satisfactorios intervalos más largos si el objetivo principal de llevar a cabo el ensayo es determinar si un anticuerpo dado no puede inducir ADCC en absoluto. Los métodos pueden incluir tomar mediciones de impedancia por ejemplo cada 30 minutos, cada 15 minutos, cada 10 minutos, cada 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ó 2 minutos, cada minuto, o más frecuentemente.

Los métodos descritos aquí pueden incluir además el cultivo en placa de células objetivo sobre el sustrato antes de la adición de células efectoras y anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sembrar en placa células objetivo sobre el sustrato y permitir que crezcan durante un período de tiempo antes de la adición of células efectoras y anticuerpo. La siembra en placa de células objetivo antes de la adición de anticuerpo y de células efectoras puede permitir que las células objetivo se unan al sustrato y crezca, resultando en un incremento en impedancia que pueda facilitar la detección de una disminución en impedancia después de la adición of células efectoras y anticuerpo. Típicamente no se debe permitir que las células objetivo crezcan demasiado, sin embargo, como las células objetivo unidas al sustrato pueden volverse inaccesibles para el anticuerpo debido al crecimiento de células por encima de ellas. En tal caso, no sería posible detectar ADCC. Está dentro de las capacidad de un experto llevar a cabo experimentos para determinar el período óptimo de tiempo que las células objetivo deben ser sembradas en placa antes de la adición de células efectoras y anticuerpo. En algunas modalidades, se pueden sembrar en placa células objetivo sobre el sustrato 10 -30 horas antes de la adición de células efectoras y anticuerpo. Por ejemplo, se pueden sembrar en placa células objetivo sobre el sustrato 18 -24 horas (por ejemplo, 19 -21 horas) antes de la adición de células efectoras y anticuerpo.

La densidad a la cual se siembran en placa las células objetivo puede depender del tamaño de las células y la velocidad a la cual ellas crecen. El sistema de detección tiene típicamente un límite máximo, por encima del cual es incapaz de detector un crecimiento adicional de las células. Las células objetivo deben ser sembradas en placa por lo tanto con una densidad por debajo de este límite para permitir cambios en impedancia debido a la muerte de las células que se van a detectar. Sin embargo, las células objetivo también deben ser sembradas en placa con una densidad que sea lo suficientemente alta para permitir que las células tengan un efecto sobre la impedancia durante el período inicial de crecimiento, de tal manera que pueda ser detectada cualquier disminución en impedancia después de la adición de células efectoras y de anticuerpo. En algunas modalidades, se pueden sembrar células objetivo con una densidad entre 2 K y 100 K en un pozo estándar de 19,6 mm2 (por ejemplo, una densidad entre 10 K y 60 K en un pozo estándar de 19,6 mm2, una densidad entre 15 K y 25 K en un pozo estándar de 19,6 mm2, o una densidad alrededor de 20 K en un pozo estándar de 19,6 mm2).

El período de tiempo durante el cual se hacen las mediciones de impedancia, es decir, la duración del ensayo, puede variar dependiendo del período entre la siembra en placa de las células objetivo y la adición de células efectoras y anticuerpo. Generalmente se puede detectar una reducción en impedancia debido a ADCC en el lapso de un par de horas después de la adición de anticuerpo y células efectoras. En algunos casos, sin embargo, puede ser deseable continuar monitoreando la impedancia durante un período de tiempo después del inicio de la muerte de las células por ADCC, para determinar el grado de muerte celular y para comprobar si y cuando se presenta cualquier nuevo crecimiento de células. Los métodos establecidos aquí pueden incluir por lo tanto tomar mediciones de impedancia, sin limitación, durante 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas, 100 horas, 200 horas, o más de 200 horas después de la siembra en placa de las células objetivo.

10 Los métodos establecidos aquí pueden emplear cualquier cantidad de células efectoras y cualquier cantidad de células objetivo, teniendo en cuenta, como se discutió más arriba, que el número de células objetivo no sea tan alto como para impedir una detección precisa de ADCC. Los métodos pueden emplear más células efectoras que células objetivo. La proporción de células efectoras con relación a las células objetivo (E:T) puede ser, por ejemplo, superior a 10:1, superior a 20:1, superior a 50:1, superior a 100:1, o alrededor de 25:1. Se debe añadir el anticuerpo a las células objetivo en una cierta concentración. Por ejemplo, se puede añadir el anticuerpo a las células objetivo sembradas en placa en una concentración, por ejemplo, entre 1 y 1000 µg/ml, entre 1 y 500 µg/ml, entre 1 y 100 µg/ml, entre 1 y 75 µg/ml, entre 1 y 50 µg/ml, entre 1 y 25 µg/ml, entre 1 y 10 µg/ml, entre 2 y 8 µg/ml, o entre 4 y6 µg/ml. En algunas modalidades, se pueden utilizar los métodos descritos aquí para determinar la concentración óptima de un anticuerpo que induce una respuesta de ADCC en comparación con la respuesta de ADCC obtenida utilizando diferentes concentraciones de anticuerpo. Por ejemplo, un método puede incluir (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporte el crecimiento de dos o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, o más de cinco) muestras de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) añadir células efectoras y un anticuerpo a las dos o más muestras de células objetivo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde se añade el anticuerpo en diferentes concentraciones a las dos o más muestras de células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado una función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde se determina que la concentración de anticuerpo que resulta en la mayor disminución en impedancia es la concentración óptima. Se pueden añadir células efectoras y anticuerpo al medio con células objetivo al mismo tiempo o en forma separada. Por ejemplo, se pueden añadir células efectoras al medio antes del anticuerpo, o se puede añadir anticuerpo antes de las células efectoras. Los métodos descritos aquí pueden emplear cualquier combinación de células objetivo, células efectoras, y anticuerpos, y la selección de células objetivo, células efectoras, y anticuerpos utilizados en los métodos puede depender del propósito del ensayo. Los ejemplos de células objetivo, células efectoras y anticuerpos adecuados para uso en los métodos establecidos aquí se discuten más adelante, como son las posibles aplicaciones de ensayos que emplean estas células objetivo, células efectoras y anticuerpos. Las células objetivo son células adherentes. En algunas modalidades las células objetivo expresan antígenos apicales. Muchas células están polarizadas, y expresan diferentes antígenos sobre sus superficies apicales y basolaterales (Nelson y colaboradores. (2003) Nature 422: 766 -774). Por ejemplo, las células epiteliales expresan diferentes antígenos apicales y basolaterales. Cuando se lleva a cabo un ensayo estándar de ADCC en suspensión, el anticuerpo puede enlazarse tanto a antígenos apicales como basolaterales. En los métodos establecidos aquí, sin embargo, donde las células se adhieren al sustrato, el anticuerpo puede enlazarse únicamente con antígenos apicales. La habilidad de un anticuerpo para inducir ADCC demuestra por lo tanto que el anticuerpo se enlaza con un antígeno apical sobre las células objetivo. Los métodos establecidos aquí se pueden utilizar por lo tanto para determinar si un anticuerpo particular se enlaza con un antígeno apical sobre las células objetivo. Por ejemplo, un método puede incluir: (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) añadir células efectoras y el anticuerpo a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo se enlaza con un antígeno apical sobre las células objetivo. Algunos anticuerpos

terapéuticos son capaces únicamente de acceder a antígenos apicales in vivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos son únicamente capaces de acceder y enlazar antígenos apicales expresados sobre la superficie de tumores. La habilidad de un anticuerpo para inducir ADCC por medio de enlazamiento con antígenos apicales puede ser por lo tanto un indicador de la efectividad terapéutica del anticuerpo in vivo.

Los métodos establecidos aquí pueden incluir una etapa preliminar de selección de células objetivo para expresión de antígenos apicales. Tal etapa preliminar puede emplear, por ejemplo, RTPCR o FACS para identificar células objetivo que expresan antígenos apicales que pueden ser adecuados para uso en los métodos establecidos aquí.

Se puede utilizar cualquier célula objetivo adecuada. Los ejemplos de células objetivo que expresan antígenos apicales incluyen, sin limitación, células tumorales y epiteliales tal como aquellas conocidas en el estado del arte. Por ejemplo, glicoproteínas mucinas tales como el antígeno DF3 y MUC1 se expresan sobre la superficie apical de células epiteliales y se sobreexpresan sobre la superficie apical de tumores epiteliales (Snijdewint y colaboradores. (2001) Int. J. Cancer 93: 97 106; y Hayes y colaboradores. (1990) J. Immunol. 145: 962 -970). Además, una variedad de células tumorales expresan un receptor de la superficie de la célula con alta afinidad para ácido fólico sobre sus superficies apicales (Lu y colaboradores. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51: 153 -162).

Las células objetivo pueden ser células enfermas tales como, por ejemplo, células cancerosas

o células infectaras con virus. Estas células objetivo pueden ser líneas de células obtenidas a partir de bancos de líneas de células. Alternativamente, se pueden obtener las células a partir de un individuo que tiene una enfermedad o un trastorno. Por ejemplo, se pueden obtener células objetivo a partir de una biopsia de un tumor de un paciente con cáncer.

Las células cancerosas que pueden ser utilizadas como células objetivo incluyen, pero no se limitan a, células asociadas con la Enfermedad de Hodgkin, linfomas de células B que no son de Hodgkin, linfomas de células T, linfoma maligno, leucemia de linfosarcoma, leucemia linfocítica crónica, mieloma múltiple, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, síndromes mielodisplásicos, trastornos mieloproliferativos, síndrome hipereosinofílico, leucemia eosinofílica, mieloma múltiple, trastornos linfoproliferativos relacionados con X, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático y cáncer de vesícula biliar, cáncer de la corteza adrenal, tumor productor de ACTH, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro (por ejemplo, neuroblastomas y gliomas), sarcoma de Ewing, cáncer de cabeza y cuello (por ejemplo, cáncer de boca y cáncer de laringe), cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales), cáncer de hígado, cáncer de pulmón (por ejemplo, cánceres de pulmón de células pequeñas y no pequeñas), efusión peritoneal maligna, efusión pleural maligna, cánceres de piel (por ejemplo, melanoma maligno, progreso tumoral de queratinocitos de piel humana, carcinoma de células epiteliales, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales), mesotelioma, sarcoma de Kaposi, cáncer óseo (por ejemplo, osteomas y sarcomas tales como fibrosarcoma y osteosarcoma), cánceres del tracto reproductivo femenino (por ejemplo, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de ovario, y cáncer cervical), cáncer de seno, cáncer de próstata, retinoblastoma, cáncer testicular, y cáncer de tiroides.

Las líneas de células cancerosas que pueden ser utilizadas como células objetivo pueden ser cualquiera de las líneas de células adherentes inmortalizadas obtenidas, por ejemplo, a partir de un banco de células. Los ejemplos de líneas de células adherentes inmortalizadas adecuadas incluyen, pero no se limitan a: SKBR3, MG63, CCD-1070Sk, hTERT-HME1 [ME16C], BJ, ATRFLOX [Mutatect], KEL FIB, HT-1197, LL 97A (AlMy), NCI-H510A [H510A; NCI-H510], HT-29, SW756, 293, IMR-90 [IMR90], HIAE-55 [parte de la Wistar Special Collection], SW1417 [SW-1417], Hs 737.T, NCI-H661 [H661], CCD 841 CoN, Hs 792(C).M, Per Sel, NCI-H810 [H810], Panc 05.04, ZR75-30, T-47D, WISH, HBE135-E6E7, ARPE-19/HPV-16, 10.014 pRSV-T, GH354, MDA-MB-436, T98G [T98-G], Calu-6, BEAS-2B, G-292, clon A141B1, Detroit 539, MNNG/HOS C1 #5 [R-1059D], BT-549, NCI-H1915 [H1915], Hs 181.Sk, Hs 839.T, RD, SK-N-MC, 20B8, NCI-H292 [H292], Hs 863.T, Hs 181.Tes, Malme-3M, Hs 617.Mg, JAR, Hs 144.We, Hs 742.Sk, Hs 875.T, TE 161.T, Hs 738.St/Int, Hs 895.T, RWPE-1, TE 130.T, TE 84.T, HCC1008, Hs 894(E).Lu, SK-LMS-1, HFF-1, MRC-5 [MRC5], IRR-MRC-5 [ATCC X-55; ATCC X55; MRC-5 irradiada], WI-38 [WI 38], HeLa, HEK001, FHs 74 Int, Detroit 548, Detroit 573, SW-13, 293T/17, C 211, Amdur II, IMR-32, HeLa [Chang Liver], CHP 3 (M.W.), CHP 4, LL 47 (MaDo), HEL 299, Detroit 562, CCD-11Lu, KB, A549 [A-549], MDA-MB-134-VI, HLF-a, TE 354.T, HeLa 229, HeLa S3, COLO 320DM, clon 1-5c-4 [derivada de Wong-Kilbourne (D) de la conjuntiva de Chang], CCD-13Lu, CCD-8Lu, CCD-19Lu, CCD-16Lu, AV3, Hs888Lu, CCD-25Lu, COLO 320HSR [COLO 320 HSR], DLD-1, COLO 205, COLO 201, HCT-15, SW837 [SW-837], LoVo, SW48 [SW-48], SW1463 [SW 1463; SW-1463], SW 1353 [SW 1353; SW-1353], 1205Lu [parte de la Wistar Special Collection], HCT-8 [HRT-18], AGS, HCT 116, T84, SNU-C2B, SNU-C2A, NCI-H716 [H716], NCI-H747 [H747], NCI-H498 [H498], LS123, NCI-H1688 [H1688], CFPAC-1, L-132, TE 353.Sk, 407 de intestino, FL, Detroit 525, Detroit 510, C32, WI-38 VA-13 sublínea 2RA [parte de la Wistar Special Collection], citrulinemia, Cri du Chat, WI-26 VA4 [parte de la Wistar Special Collection], BeWo, WM35 [parte de la Wistar Special Collection], MSTO-211H, WRL 68, NCI-H295 [H295], MCF 10A, MCF 10F, RWPE2-W99, SVHUC-1, HCC202, C3A [HepG2/C3A; derivada de Hep G2 (ATCC HB-8065)], MCF-10-2A, 293 c18, F.thy 62891, Lei Cap, Sal Mat, HCE-2 [50.B1], A2058, RWPE-2, Am Ric, Lo Ren, Ron Har, H69AR, hFOB 1.19, Mar Vin, SCC-4, Be Sal, Hs27, B-3, Lu Vin, Ma San, El Don, SK-N-AS, NCIH1734 [H1734; H1734], LNZTA3WT4 [LNZTA3p53 WT4; WT4], LNZTA3WT11 [LNZTA3p53 WT11; WT11], Lo Wen, NCI-H2227 [H2227], COLO 829, HKB-11, Ce Ar, 90.74, HRT-18G, Be Ar, Em Ar, Win Mec, Ce Geg, TOV-21G, TOV-112D, OV-90, Ja Bos, Fe Bos, La Bel, Bo Gin, HS-5, Le Ana, Mel Neg, La Bel II, HEP G2/2.2.1, ProPakA.6 [PPA.6 ; ProPak-A.6], LNCaP clon FGC [LNCaP.FGC], HCN-1A, HX [HT1080 xeno], HP [HT1080 poli], 2A, Ne Loc, Jay Sen, Bi Fin, y Ray Hot.

Las células infectadas por virus que pueden ser utilizadas como células objetivo incluyen, por ejemplo, células infectadas con el Virus de Epstein Barr, VIH, virus de la influenza, virus de la polio, virus de la hepatitis A, virus de la Hepatitis B, virus de la Hepatitis C, virus de la Varicela zoster, virus de la Rubeola, virus del sarampión, Virus del Herpes Simple, virus del Dengue, virus de papiloma, virus sincitial respiratorio, o virus de la rabia.

Las células objetivo utilizadas en los métodos establecidos aquí también pueden ser células sanas. La ADCC puede estar involucrada en la muerte de células sanas en pacientes con enfermedades autoinmunes tales como trastornos autoinmune de la tiroides, miastenia grave, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, anemia hemolítica inmune (inducida por penicilina), hepatitis autoinmune (AIH), oftalmopatía de Graves, VIH [agotamiento de CD4], enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, miastenia grave (MG), enfermedad de Behcet, oftalmopatía asociada a la tiroides, tiroiditis autoinmune, miocarditis viral, enfermedad cardíaca autoinmune, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Chagas, vitíligo, enfermedad de Crohn, púrpura trombocitopénica idiopática, neutropenia autoinmune, epilepsia infantil, enfermedad de Kawasaki, hepatitis crónica activa autoinmune, diabetes mellitus, esclerosis múltiple, nefritis anti membrana basal glomerular (GBM), enfermedad activa crónica del hígado (CALD), glomerulonefritis (de complejos inmunes), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), infertilidad masculina sin explicación, y rechazo de trasplantes. El uso de células sanas como células objetivo en los métodos establecidos aquí pueden ser útiles por lo tanto en la investigación de cómo anticuerpos y células efectoras matan células sanas por medio de ADCC en enfermedades autoinmunes o de rechazo de trasplantes. Cuando las células objetivo son células sanas, pueden ser por ejemplo, por ejemplo, líneas de células obtenidas de bancos de células o células obtenidas del tejido de un individuo que tiene una enfermedad autoinmune.

En algunos casos, se puede utilizar más de una combinación de más de un tipo de célula objetivo, por ejemplo, para una replicación más cercana de la situación in vivo donde el anticuerpo puede estar dirigido a órganos y tejidos que comprende diferentes tipos de células. Las células objetivo pueden incluir por lo tanto más de una línea de células o pueden incluir células de más de un tejido. En algunas modalidades, las células objetivo incluyen dos o más, o tres o más tipos de células.

Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para seleccionar cualquier anticuerpo por la habilidad para inducir una respuesta de ADCC. La presente solicitud proporciona por lo tanto métodos para seleccionar un anticuerpo candidato por la habilidad para inducir ADCC contra células objetivo. Los métodos comprenden (a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y (b) añadir al medio de ensayo células efectoras y el anticuerpo candidato (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a las células objetivo); en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo indica la habilidad del anticuerpo candidato para efectuar ADCC contra las células objetivo.

Como se lo utiliza aquí, "una disminución en impedancia" se refiere a cualquier reducción en impedancia entre los electrodos sobre un sustrato que tiene células objetivo sembradas en placa sobre él. Una disminución en impedancia puede ser, por ejemplo, una reducción de aproximadamente 1% o más, aproximadamente 5% o más, aproximadamente 10% o más, aproximadamente 15% o más, aproximadamente 20% o más, aproximadamente 25% o más, aproximadamente 40% o más, aproximadamente 50% o más, aproximadamente 60% o más, aproximadamente 75% o más, aproximadamente 80% o más, aproximadamente 90% o más, o aproximadamente 100% en impedancia comparada con la impedancia previamente determinada.

El anticuerpo o el anticuerpo candidato utilizado en los métodos establecidos aquí puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano. Los anticuerpos que pueden ser utilizados en los métodos descritos aquí también incluyen anticuerpos que han sido identificados por tener potencial terapéutico (por ejemplo, anticuerpos que ya han sido objeto de ensayos clínicos).

Como se lo utiliza aquí, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas intactas así como a fragmentos de los mismos, tales como Fab, F(ab’)2 y Fv, que son capaces de enlazarse a las células objetivo. Por "enlazamiento a células objetivo" se entiende que un anticuerpo es inmunoespecífico para un antígeno de las células objetivo, por ejemplo, un antígeno apical sobre las células objetivo.

El término "inmunoespecífico" significa que el anticuerpo tiene sustancialmente mayor afinidad por el antígeno sobre la célula objetivo que afinidad por otras proteínas (por ejemplo, otras proteína relacionadas).

Por "afinidad sustancialmente mayor" se entiende que un anticuerpo tiene una afinidad mensurablemente superior por un antígeno sobre una célula objetivo comparada con la afinidad por moléculas de reconocimiento de la superficie de la célula que contiene un dominio conocido de inmunoglobulina. Por ejemplo, la afinidad puede ser al menos 1,5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces superior por un antígeno sobre una célula objetivo que por moléculas de reconocimiento de la superficie de la célula que contiene un dominio conocido de inmunoglobulina.

Los métodos establecidos aquí también pueden ser utilizados como ensayos de liberación o estabilidad para propósitos de control de calidad (QC). Por ejemplo, métodos como los descritos aquí pueden ser utilizados para analizar lotes de producción de anticuerpos, en donde se utiliza la presencia de actividad de ADCC o el nivel de actividad de ADCC para certificar que el producto del anticuerpo reúne las directrices de control de calidad (por ejemplo, en GMP (Buenas Prácticas de Manufactura) u otros estándares). En algunos casos, la sola presencia de actividad de ADCC puede ser utilizada como una determinación cualitativa de que un anticuerpo reúne las directrices de control de calidad y es adecuado para liberación. Tales métodos pueden no requerir por lo tanto una interpretación más allá de una determinación de que la impedancia disminuye en presencia del anticuerpo que está siendo analizado. En algunas modalidades, se puede degradar deliberadamente una muestra del lote de un anticuerpo para ADCC que va a ser certificado y utilizarla como control negativo para comparación con el lote de anticuerpo que va a ser liberado. La curva en tiempo real de la lectura de ADCC para las dos muestras puede ser comparada, y se puede establecer un corte cualitativo o cuantitativo para certificación de control de calidad. La respuesta que depende de la concentración exacta y los parámetros del ensayo se pueden determinar por medio de ensayo y error.

En forma similar, se pueden utilizar los métodos descritos aquí para certificar una molécula pequeña u otros inhibidores de la actividad de ADCC para propósitos de QC y estabilidad, monitoreando la disminución en tiempo real de la señal de ADCC en respuesta a su adición a células objetivo.

Los ejemplos de anticuerpos disponibles que pueden actuar a través de ADCC incluyen, sin limitación, anticuerpos para tratamiento de alergia y asma, tales como Daclizumab (Protein Design Labs/Roche) y CAT-354 (Cambridge Antibody Technology); anticuerpos para tratamiento de trastornos autoinmunes, tales como MDX-H210 (Medarex/Novartis), Campath* alemtuzumab (ILEX Oncology), y Daclizumab (Protein Design Labs/Roche); anticuerpos para tratamiento de cáncer, tales como Campath® (ILEX Oncology), R1550 (huHMFG1, Therex, Antisome/Roche), Herceptin® (Genentech), Omnitarg (Genentech), Tastuzumab-DM1 (Genentech/Immunogen), MDX-010 (Medarex), Avastin® (Genentech), Mab-17-I (edrecolomab-IGN101, Igeneon, EDR o Panorex-GSK), labetuzumab, (IMMU 105) (Immunomedics), Tarvacin (Peregrine), Theragyn, Therevex (Pemtumomab) (Antisoma/Roche), TheraCIM hR3 (YM Biosciences/Oncoscience), HuMaxEGFr(Genmab), SGN-40 (Seattle Genetics), SGN-30 (Seattle Genetics), Rituxan® (Rituzan® Genentech/BiogenIdec), HuMax-CD4 (Genmab), MDX-060 (Medarex), Siplizumab (MedImmune), AME-133 (Applied Molecular Evolution/Lilly), galiximab (Anti-CD80 Mab BiogenIdec), HuMaxDC20 (HuMax cd20) (Genmab), LymphoCide™ (epratuzumab, Immunomedics), MDX-010+péptido gp100 (Medarex), MDX-010 +/-quimioterapia (Medarex), MDX-010 + péptidos de melanoma (Medaex), AHM (Roche/Chugai), OvaRex (AltaRex/Unither Pharma-ceuticals), J59I (Biovation/Millennium), Rencarex (WX-G250) (Wilex/Centocor/Johnson & Johnson), WX-G250+IL2/IFN (Wilex), TRAIL-R1mAb (HGS-ETR1 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), Vitaxin (MEDI-522 MedImmune), WX-K931 (Wilex), MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), Erbitux (cetuximab, IMC-C255 Imclone, Bristol-Myers Squibb), MEDI-507 (Medimmune), TRU-015 (un derivado de anticuerpo, Trubion), Matuzumab (EMD-72000, EMD Pharmaceuticals/Merck KGaA), Mab ICR62, CHIR-12.12 (Chiron/XOMA), huG1-M195 (NCI) MOR102 (MorphoSys), Remitogen (1D10, anti-MHC clase II, Protein Design Labs), y IGN312 (Igeneon); anticuerpos para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, tales como ABC-48 (AERES); anticuerpos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tales como MDX-010 (Medarex); anticuerpos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como Humira™ (Cambridge Antibody Technology/Abbott), Anti-CD11a MAb (Biovation), MLN02 (Millennium/Genentech/Roche), Daclizumab (Protein Design Labs), Enbrel (fusión del receptor de TNF e IgG1 (Amgen/Wyeth), Remicade (Centocor), y TRU-016 (un derivado de anticuerpo, Trubion); anticuerpos para el tratamiento de enfermedades del riñón, tales como Humira™ (Cambridge Antibody Technology/Abbott) y Rituxan® (Genentech/BiogenIdec); y otros anticuerpos tales como AMG162 (Amgen) para osteoporosis, Erbitux -C255, BTI-322, Etanercept, y Infliximab.

Donde se utilizan los métodos establecidos aquí para investigar las respuestas de ADCC en enfermedades autoinmunes, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un autoanticuerpo obtenido a partir de un individuo que tiene una enfermedad autoinmune. Tales anticuerpos pueden obtenerse utilizando, por ejemplo, métodos conocidos por aquellos capacitados en el arte (por ejemplo, purificación por afinidad).

En algunos casos, puede ser deseable añadir más de un anticuerpo al medio de ensayo con el propósito de determinar, por ejemplo, si los anticuerpos actúan en forma sinergística o si interfieren entre sí en términos de la habilidad para inducir ADCC. Los métodos establecidos aquí pueden incluir por lo tanto añadir dos, tres, cuatro, cinco, o más de cinco anticuerpos al medio de ensayo.

Las células efectoras utilizadas en los métodos establecidos aquí son típicamente células que expresan uno o más receptores Fcγ. Las células efectoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas, y neutrófilos.

Existen varias familias de receptores Fcγ, y diferentes células efectoras expresan diferentes receptores Fc. Por ejemplo, los neutrófilos comúnmente expresan FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y la isoforma lipídica anclada de FcγRIII (CD16), mientras que las células asesinas naturales (NK) expresan únicamente la isoforma transmembrana de FcγRIII. Además, existen polimorfismos dentro de los receptors Fc. Por ejemplo, los FcγRIII sobre células NK contienen un polimorfismo Phe/Val en la posición 158 que ha demostrado que influye sobre el enlazamiento de IgG. Se pueden seleccionar las células efectoras utilizadas en los métodos descritos aquí con base en el receptor Fc que ellas expresan y, en algunas modalidades, la forma polimórfica del receptor Fc que ellas expresan. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados por lo tanto para determinar si una combinación particular de un anticuerpo y una célula efectora que expresa un receptor Fcγ conocido (por ejemplo, con un polimorfismo particular) es capaz de matar una célula objetivo por medio de ADCC. Tales estudios pueden ser útiles en investigación general del mecanismo de enlazamiento de IgG por receptores Fc, y pueden permitir la identificación de residuos tanto en los receptores Fc como en la región Fc de IgG que son cruciales para el enlazamiento. A su vez, tales estudios pueden permitir el desarrollo de anticuerpos terapéuticos que tengan secuencias de la región Fc que muestren enlazamiento óptimo con receptores Fc sobre células efectoras, maximizando por lo tanto la ADCC. También pueden utilizarse tales estudios para determinar el genotipo óptimo de la célula efectora para un anticuerpo terapéutico existente que sea capaz de inducir una respuesta de ADCC, de tal manera que un futuro paciente pueda ser analizado por la presencia de receptores Fc con el genotipo óptimo.

En algunas modalidades, las células efectoras utilizadas en los métodos descritos aquí son PBMC. Las PBMC son una mezcla de monocitos y linfocitos que pueden ser aislados de la sangre entera utilizando, por ejemplo, protocolos experimentales estándar descritos en el arte y en los Ejemplos más adelante. Se esperaría que la variedad de células encontradas en las PBMC dieran como resultado una confusión en las lecturas de impedancia debido a una adherencia no específica con el sustrato. Sorprendentemente, sin embargo, los inventores han encontrado que un cambio en impedancia o en el Índice de Células después de la adición de un anticuerpo y las PBMC es una indicación precisa de ADCC de células objetivo. La sangre entera, o la sangre que ha sido al menos parcialmente purificada de tal manera que esté enriquecida, o parcialmente enriquecida, por células efectoras (por ejemplo, las PBMC), también puede ser útil en los métodos establecidos aquí.

Los métodos establecidos aquí tienen una amplia variedad de aplicaciones clínicas. Como se discutió anteriormente, existen polimorfismos dentro de receptores Fc humanos que tienen un efecto sobre la habilidad de las células efectoras para enlazarse con un anticuerpo, y que por lo tanto pueden afectar la habilidad de las células efectoras para mediar la ADCC. La habilidad de las células efectoras en un individuo para enlazarse con un anticuerpo terapéutico puede tener un mayor impacto sobre la eficacia clínica del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo IgG anti-CD20 Rituxan® utilizado en el tratamiento de neoplasias malignas linfoproliferativas B puede generar mejores resultados clínicos en pacientes homocigotos para el genotipo FcγRIII158V que en pacientes homocigotos para el genotipo FcγRIII158F, posiblemente debido al hecho de que las células NK que portan FcγRIII158V se enlazan más efectivamente a la región Fc de Rituxan®.

La habilidad para utilizar las PBMC de individuos (por ejemplo, pacientes) como células efectoras significa que los métodos establecidos aquí pueden ser utilizados para determinar si un anticuerpo terapéutico particular es adecuado para el tratamiento de un paciente particular que tiene una enfermedad o trastorno asociado con células objetivo. Por lo tanto, en algunas modalidades las células efectoras pueden ser las PBMC obtenidas de un paciente que tiene una enfermedad asociada con las células objetivo, y el anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico candidato para tratar al paciente. Esta documento establece por lo tanto métodos para identificar un individuo que tiene una enfermedad asociada con células objetivo que es adecuad para tratamiento con un anticuerpo candidato. Los métodos pueden comprender (a) monitorear impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad; (b) añadir las PBMC aisladas del paciente y el anticuerpo candidato a las células objetivo; y (c) determinar si se presenta un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el anticuerpo, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de ADCC y por lo tanto que el paciente es adecuado para tratamiento con el anticuerpo.

En algunas modalidades, las células objetivo pueden ser células asociadas con neoplasias malignas linfoproliferativas B, y el anticuerpo candidato puede ser Rituxan®. De acuerdo con tales modalidades, se pueden utilizar métodos como los establecidos aquí para determinar si un paciente que tiene neoplasias malignas linfoproliferativas B es adecuado para tratamiento con Rituxan®. El método puede, desde luego, ser llevado a cabo con las PBMC de un paciente particular en combinación con cualquiera de los otros anticuerpos y células objetivo descritas aquí para identificar el anticuerpo óptimo para tratamiento del paciente. Además, cuando se identifican las PBMC como capaces de inducir ADCC en combinación con un anticuerpo particular, se puede determinar el genotipo de las PBMC y se pueden analizar las PBMC de otros individuos utilizando métodos estándar de genotipado para establecer si son adecuadas para tratamiento con ese anticuerpo.

Donde se utilizan las PBMC de un individuo como las células efectoras, las células objetivo también pueden ser células del individuo (por ejemplo, células cancerosas obtenidas de una biopsia), de tal manera que el método es un método personalizado para determinar si un anticuerpo candidato particular en combinación con las PBMC del individuo es capaz de matar células objetivo en el paciente por medio de ADCC. Ya que cada vez más productos de anticuerpo se encuentran disponibles, los métodos establecidos aquí permitirán la selección del mejor producto de anticuerpo para optimizar los resultados clínicos en un paciente particular.

Los métodos establecidos aquí también se pueden adaptar a la selección de compuestos por la habilidad para incrementar disminuir la ADCC inducida por medio de diferentes combinaciones de células efectoras y anticuerpos. Por lo tanto, este documento establece métodos para selección de compuestos por la habilidad para modular ADCC. Los métodos pueden incluir (a) monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; (b) añadir el compuesto, células efectoras, y un anticuerpo que se enlaza con las células objetivo al medio de ensayo; y (c) determinar si el compuesto modula la ADCC por medio de la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en presencia del compuesto con cualquier cabio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en ausencia del compuesto.

Como se discutió aquí, una disminución en impedancia después de la adición de células efectoras y anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la ADCC en el medio de ensayo. Una disminución adicional en impedancia observada en presencia de un compuesto que está siendo seleccionado puede ser una indicación de que el compuesto incrementa la ADCC. Por el contrario, un incremento en impedancia en presencia del compuesto puede ser una indicación de que el compuesto disminuye la ADCC. En algunas situaciones, puede ser deseable identificar compuestos que incrementen la ADCC. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos para identificar compuestos que incrementen la respuesta de ADCC inducida por un anticuerpo terapéutico y las PBMC contra células cancerosas. En otras situaciones, puede ser deseable identificar compuestos que disminuyan la ADCC. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos para identificar compuestos que disminuyan la respuesta de la ADCC inducida por anticuerpos y las PBMC de un paciente con una enfermedad autoinmune contra células objetivo sanas. El hallazgo de que un compuesto no actúe como un modulador de la ADCC también puede ser útil en algunas situaciones, ya que demuestra que el compuesto (que puede tener por si mismo otro propósito terapéutico) no interfiere con la habilidad de una combinación anticuerpo -célula efectora particular para inducir ADCC.

Tales métodos pueden emplear cualquiera de las células objetivo, células efectoras, y anticuerpos descritos aquí. En algunas modalidades, la combinación empleada anticuerpo -célula efectora puede ser una combinación que ya ha sido identificada por ser capaz de inducir una respuesta de ADCC contra las células objetivo en cuestión. Se puede añadir el compuesto que va a ser seleccionado a las células objetivo en la misma medida que las células efectoras y el anticuerpo. Alternativamente, se puede añadir el compuesto que va a ser seleccionado a las células objetivo antes de las células efectoras y el anticuerpo, o después de las células efectoras y el anticuerpo.

Los compuestos que pueden ser seleccionados por la habilidad para modular ADCC en los métodos establecidos aquí incluyen, pero no están restringidos a, péptidos, peptoides, proteínas, lípidos, metales, moléculas orgánicas pequeñas, aptámeros de ARN, antibióticos y otros compuestos farmacéuticos, poliaminas, y combinaciones conocidas o derivados de los mismos. Las moléculas orgánicas pequeñas tienen típicamente un peso molecular aproximadamente desde 50 daltons hasta aproximadamente 2.500 daltons (por ejemplo, aproximadamente desde 300 hasta aproximadamente 800 daltons). Los compuestos candidatos pueden derivarse de grandes bibliotecas de compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, las bibliotecas de compuestos sintéticos se encuentran comercialmente disponibles con MayBridge Chemical Co. (Revillet, Cornwall, RU) o Aldrich (Milwaukee, WI). Alternativamente, se pueden utilizar las bibliotecas de compuestos naturales en la forma de extractos de bacterias, hongos, plantas y animales. Adicionalmente, se pueden producir sintéticamente compuestos candidatos utilizando química de combinaciones ya sea como compuestos individuales o como mezclas.

En algunas modalidades, el compuesto que es seleccionado puede ser un compuesto que ya es utilizado en el tratamiento de una enfermedad con la cual están asociadas las células objetivo, y el anticuerpo puede ser un anticuerpo desarrollado para el tratamiento de esa enfermedad. Por ejemplo, cuando las células objetivo son células cancerosas, el compuesto que se selecciona puede ser un agente quimioterapéutico y el anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico desarrollado para el tratamiento del cáncer. Métodos como los establecidos aquí pueden ser por lo tanto utilizados para determinar si el agente quimioterapéutico incrementa o disminuye la muerte de las células objetivo por medio del anticuerpo por ADCC. En forma similar, el compuesto que va a ser seleccionado puede ser uno que module la ADCC en un paciente con un trastorno autoinmune. En tales casos, el anticuerpo que va a ser añadido puede ser un anticuerpo que provoque actividad autoinmune a través de ADCC en un individuo con una enfermedad autoinmune.

En algunas modalidades, los métodos descritos aquí pueden ser métodos de alto rendimiento que evalúan simultáneamente la habilidad de múltiples combinaciones de anticuerpos, células efectoras, y células objetivo para producir una respuesta de ADCC, opcionalmente en presencia de compuestos que puedan modular la respuesta de ADCC. En tales modalidades, se pueden sembrar en placa las células objetivo sobre un sustrato no conductor que contiene dos o más pozos, cada uno de los cuales incluye al menos dos electrodos, y el método puede incluir el monitoreo de cualquier cambio en impedancia entre los electrodos en cada pozo individual. El sistema RT-CES® y el software asociado descritos aquí se adaptan para uso en ensayos de alto rendimiento.

En algunas modalidades las células objetivo, anticuerpos, y células efectoras añadidos a cada pozo pueden ser iguales o diferentes dependiendo del propósito del ensayo. En algunas modalidades, por ejemplo, se puede utilizar el método para analizar simultáneamente la habilidad de múltiples anticuerpos terapéuticos candidatos para inducir ADCC contra una variedad de células objetivo en presencia de las PBMC de un paciente o las PBMC de diferentes pacientes. Tales métodos de alto rendimiento pueden ser utilizados también para analizar simultáneamente la habilidad de un único anticuerpo candidato para inducir ADCC contra la misma célula objetivo, o una variedad de diferentes células objetivo, en presencia de las mismas células efectoras en una variedad de concentraciones de anticuerpo. Además, se pueden utilizar tales métodos de alto rendimiento para comparar simultáneamente la cinética de la ADCC de una variedad de anticuerpos diferentes. Se pueden utilizar también ensayos de alto rendimiento para selección de compuestos por la habilidad para modular respuestas de ADCC, como se discutió anteriormente.

Además, el uso de un método como el descrito aquí como parte de un método de alto rendimiento permite llevar a cabo experimentos de control en forma paralela al método para analizar la actividad de ADCC descrita anteriormente. Por ejemplo, un ensayo adecuado de control puede incluir siembra en placa y crecimiento de células objetivo y monitoreo de la impedancia en ausencia de células efectoras y anticuerpo. Experimentos de control adicionales pueden incluir la adición de células efectoras solas o la adición de anticuerpo solo a las células objetivo sembradas en placa.

Se describirá adicionalmente la invención en el siguiente ejemplo.

EJEMPLO

1.: Introducción

19 El sistema RT-CES® de ACEA Biosciences (San Diego, CA) (Sensor Electrónico de Células en Tiempo Real) utiliza una lectura electrónica de impedancia para cuantificación no invasiva del estado de las células en tiempo real. Se siembran células en placas de microtitulación E-Plate (ACEA Biosciences), que están integradas con arreglos de sensores microelectrónicos. La interacción de las células con la superficie del microelectrodo conduce a la generación de una respuesta de impedancia célula -electrodo, que indica el estado de las células en términos de morfología, calidad de la adhesión y número. Se utiliza el sistema ACEA para desarrollar un ensayo de ADCC en tiempo real para células adherentes. Se utilizaron dos líneas de células: SKBR3 (una línea de células de adenocarcinoma de glándula mamaria); y MG63 (una línea de células osteoblástica). SKBR3 es una línea de células adherentes que sobreexpresa al antígeno HER-2. Herceptin®, un anticuerpo humanizado contra HER2, media la muerte de células SKBR3 por ADCC en la presencia de células efectoras. MG63 es una línea de células adherentes que sobreexpresa M-SCF. Chir-RX1, un anticuerpo IgG1 humanizado contra M-CSF, media la ADCC contra células MG63 en presencia de células efectoras. Se llevaron a cabo experimentos para determinar si el sistema de ACEA podría ser utilizado para monitorear la muerte en tiempo real de células objetivo SKBR3 y MG63 por ADCC mediada por células efectoras PBMC y ya sea Herceptin® o RX-1.

2.: Preparación de células objetivo, anticuerpo, y PBMC Las células SKBR3 (ATCC, Manassas, VA; catálogo #HTB-30) fueron cultivadas en Medio DME-15.

El anticuerpo humanizado Herceptin® (Genentech Corporation, South San Francisco, CA; nombre comercial Trastuzumab) fue reconstituido con agua para hacer una solución patrón de 21 mg/ml antes de utilizarlo. Herceptin® es estable durante 30 días después de su reconstitución.

Se prepararon PBMC humanas frescas a partir de sangre humana obtenida de donantes voluntarios sanos. Se recolectaron muestras de sangre venosa humana (8,5 ml) en tubos de citrato de amonio de tapa amarilla (ACD-A). Se invirtieron los tubos 10 -15 veces, y se removió y transfirió la sangre entera de cada tubo de tapa amarilla a un tubo cónico de 50 ml. Se diluyó la sangre en proporción 1:3 con PBS en FBS al 2%. Se dispensaron lentamente 12 ml de Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; cat #17-1440-02) por debajo de la mezcla de sangre/PBS. Se centrifugaron las muestras a temperatura ambiente a 2350 rpm durante 30 minutos antes de remover la capa superior (plasma/PBS) por aspiración. Se recolectaron capas de leucocitos con pipetas estériles y se las reunió en un tubo cónico de 50 ml. Si permanecen grupos visibles de WBC por debajo de la capa de leucocitos, se recolecta todo el material de WBC, con cuidado de no remover el exceso de Ficoll-Hypaque. Se añadió PBS -FBS al 2% estearil para llevar el volumen hasta 30 ml, y se agitó la mezcla por medio de inversión. Se centrifugaron las suspensiones diluidas de PBMC a 250 x g (1046 rpm para un rotor Beckman GH3.8) a temperatura ambiente durante 17 minutos, y se recolectó el precipitado celular. Se suspendió el precipitado de PBMC en 2,5 ml Medio R-2 (medio RPMI-1640 con FBS al 2% inactivado con calor), se mezcló bien, y se transfirió a un tubo cónico de 15 ml. Se lavaron las PBMC una vez con medio R-2, y se comprobó el número de células viables por medio de exclusión con azul Tripán (Invitrogen cat. #15250-061 o equivalente).

3. Ensayo de muerte por ADCC de células SKBR3 por Herceptin® y PBMC

Antes de llevar a cabo el ensayo de ADCC, se realizaron diferentes experimentos para evaluar el efecto de las células SKBR3 solas, con el anticuerpo Herceptin®, o con células efectoras PBMC, sobre la lectura de Índice de Células del sistema RT-CES®.

20 Se sembraron en placa células SKBR3 a razón de 40 K, 20 K, 10 K, o 5 K por pozo y se las colocó en el lector RT-CES®. SE añadió medio fresco después de 20 horas y se monitorearon los Índices de Células durante 100 horas. Como se muestra en la Figura 1, se incrementó el Índice de Células a medida que proliferaban las células SKBR3. El Índice de Células tuvo un límite máximo de detección de 60 K a 160 K células por pozo. En experimentos posteriores, se sembraron en placa células SKBR3 a razón de 40 K por pozo. Después de 20 horas, se añadió medio fresco a un grupo de pozos y se añadió PBS que contenía Triton X-100 a un segundo grupo de pozos, y se llevó nuevamente la placa al lector. Como se muestra en la Figura 2, una caída en el Índice de Células después de la adición de Triton X-100, indica muerte celular. En experimentos adicionales, se sembraron en placa células SKBR3 a razón de 20 K por pozo, y se añadió medio solo, Herceptin®, o anticuerpo de control IgG 20 horas después. La adición ya sea de Herceptin® o de IgG solos no alteró significativamente el Índice de Células comparado con el Índice de Células cuando no se añadió anticuerpo (Figura 3). Se comparó luego el Índice de Células de células SKBR3 sembradas en placa a razón de 20 K por pozo con el Índice de Células de PBMC añadidas al medio solo hasta una cantidad final de 5 X 105 células por pozo. Sorprendentemente, las PBMC no tuvieron un efecto significativo sobre el Índice de Células (Figura 4), indicando que el uso de PBMC como células efectoras en un ensayo de ADCC no interferiría con la detección precisa de células SKBR3 muertas. Cuando se añadieron PBMC a los pozos que contenían células SKBR3 sembradas en placa a razón de 20 K por pozo, cayó el Índice de Células (Figura 5), indicando que las PBMC efectoras solas tienen un efecto NK sobre las células objetivo SKBR3. Se llevó a cabo entonces un ensayo para detectar la muerte por ADCC de células SKBR3 por el anticuerpo objetivo Herceptin® en presencia de PBMC efectoras. Se sembraron en placa células objetivo a razón de 20 K por pozo 20 horas antes del ensayo de ADCC. Al inicio del ensayo de ADCC, se removió temporalmente la placa del Sistema ACEA para la adición de anticuerpo y células efectoras. Se añadieron células efectoras PBMC a las células objetivo SKBR3 en una proporción efector: objetivo de 25:1, junto con el anticuerpo Herceptin® hasta una concentración final de 5 µg/ml. Se llevó nuevamente la placa de células al Sistema ACEA para monitoreo continuo del Índice de Células durante las siguientes 48 horas. La Figura 6 muestra una comparación del Índice de Células de células SKBR3 solas, células SKBR3 con PBMC, y células SKBR3 con anticuerpo Herceptin® y PBMC. Se registró una caída dramática en el Índice de Células después de la adición de PBMC y Herceptin®, reflejando la muerte de células SKBR3 por ADCC. Se repitió el experimento utilizando células SKBR3 con PBMC efectoras en una proporción

E:T de 50:1 ó 12.5:1, con o sin Herceptin® en una concentración de 5 µg/ml. La Figura 7 muestra la muerte por ADCC en el transcurso del tiempo en estos experimentos medida en términos de porcentaje de lisis celular, que se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

imagen1

Los resultados en la Figura 7 demuestran un incremento dramático en lisis celular en presencia de Herceptin® y PBMC como resultado de ADCC.

4. Comparación del ensayo de ADCC en tiempo real con el ensayo de ADCC de Liberación de Calceína AM

21 Se llevaron a cabo experimentos para comparar el % de lisis detectado utilizando el ensayo de ADCC en tiempo real con el % de lisis detectado utilizando un ensayo estándar de ADCC de liberación de Calceína AM. El ensayo de Calceína-AM fue realizado utilizando el siguiente protocolo. Se descongeló un vial de Calceína AM (Molecular Probes, Eugene, OR; catálogo # C-3099) con una solución de 1 mg/ml en DMSO seco y se lo mezcló suavemente por medio de pipeteo. Para marcar las células SKBR3, se removió el medio y se lavó la monocapa con 10 ml de PBS solo (sin suero bovino fetal (FBS)). Se separó la monocapa por medio de la adición de 5 ml de EDTA/PBS y se incubó durante 10 minutos a 37°C. Se añadieron 10 ml de medio fresco R10 (medio RPMI-1640 con FBS al 10% inactivado por calor, Pen/Strep (concentración final 100 µg/ml), y Lglutamina (concentración final 2 mM)). Se recolectaron, centrifugaron y contaron las células, y se transfirieron 2.5 X 106 células a tubos frescos de 15 ml. Se suspendieron las células en 2,5 ml de R-10 en un tubo cónico de 15 ml, y se añadieron 12,5 µl de Calceína AM (concentración final 5 µM) a cada tubo. Se incubaron los tubos durante 30 minutos a 37°C en CO2 humidificado al 5%, asegurándose que la tapa esté suelta. Se mezclaron suavemente las células cada 10 minutos para evitar que se asienten. Se lavaron las células marcadas dos veces con 10 ml de R-2 (medio RPMI-1640 con FBS al 2% inactivado por calor). Se suspendieron las células en medio R-10 hasta tener 5 X 105 células/ml. Se sembraron en placa células objetivo SKBR3 a razón de 20 K por pozo par el ensayo de ADCC. Al inicio del ensayo de ADCC, se añadieron células efectoras PBMC a las células objetivo en una proporción de 25:1, junto con anticuerpo de control IgG o Herceptin® en las concentraciones mostradas en la Figura 8. Se permitió la incubación de las mezclas de células objetivo, células efectoras, y anticuerpos a 37°C durante cuatro horas. Al final de la incubación, se precipitaron las células y se midió la liberación de Calceína AM a partir del sobrenadante. Se restó el control promedio del medio de fondo para cada objetivo para cada línea individual de células objetivo para análisis, y se calculó el porcentaje de mínimo a máximo utilizando la siguiente ecuación:

imagen1

El ensayo se considera inválido si el porcentaje de liberación mínima versus el de liberación máxima fue superior a 37%. Se calculó el porcentaje específico de lisis a partir del promedio de puntos por triplicado utilizando la siguiente ecuación:

imagen1

El porcentaje detectado de lisis utilizando el ensayo de Calceína-AM es mostrado en la Figura 8B. La Figura 8A muestra el porcentaje de lisis detectado en un ensayo paralelo realizado utilizando el sistema RT-CES®. Se sembraron en placa células objetivo SKBR3 18 -20 horas antes de la adición de células efectoras PMBC e IgG o anticuerpos Herceptin® en las mismas proporciones y concentraciones que para el ensayo de Calceína-AM. El porcentaje de lisis detectado utilizando el sistema RT-CES fue aproximadamente 2 veces superior que el porcentaje de lisis detectado utilizando marcación con Calceína-AM. Esto puede ser debido al hecho de que el ensayo de Calceína-AM requiere que las células estén en suspensión, mientras que las células se adhieren en el ensayo de RTCES.

5.: Ensayo de muerte por ADCC de células MG63 por medio del anticuerpo monoclonal RX-1 y PBMC

22 Se sembraron en placa células MG63 y SKBR3 a razón de 20 K células por pozo, y se monitorearon Los Índices de Células durante 24 horas. El crecimiento de células SKBR3 tenía una relación lineal con el Índice de Células, mientras que el crecimiento de células MG63 generalmente no la tenía (Figura 9). Aproximadamente entre 7 horas y aproximadamente 17 horas, sin embargo, el crecimiento de las células MG63 estaba en una relación aproximadamente lineal con el Índice de Células, sugiriendo que el ensayo de ADCC debería ser realizado dentro de este período de tiempo para las células MG63. Se realizó un ensayo de ADCC con las células objetivo MG63 sembradas en placa en una relación de 20 K por pozo. Se comparó el Índice de Células para células MG63 solas con el Índice de Células para células MG63 a las cuales se les añadió PBMC, PBMC y anticuerpo de control IgG, o anticuerpo PBMC y RX1 después de 18 -20 horas. La relación de PBMC efectoras con respecto a las células objetivo MG63 en cada experimento fue de 50:1, y se añadió el anticuerpo en una concentración de 5 µg/ml. Como se muestra en la Figura 10A, el Índice de Células cayó después de la adición de PBMC y RX1 como resultado de ADCC de las células MG63. Las cinéticas de ADCC fueron, sin embargo, diferentes de las cinéticas observadas cuando se repitió el mismo experimento con células SKBR3 en presencia de PBMC, PBMC y IgG, o PBMC y Herceptin® (Figura 10B). Estos resultados demuestran la utilidad de los ensayos de ADCC en tiempo real para proporcionar información detallada sobre las cinéticas de ADCC.

6.: Conclusión

Los ensayos de ADCC descritos aquí proveen mejoras sobre los métodos actuales para analizar ADCC. A diferencia de los ensayos estándar, los ensayos con base en RT-CES® pueden ser utilizados para seguir la muerte por ADCC en tiempo real, y para seguir las cinéticas de ADCC en detalle. Los ensayos son más sensibles que otros ensayos de ADCC que se encuentran actualmente disponibles, son más rápidos, y tienen el potencial para ser optimizados por selección de alto rendimiento. Además, los ensayos libres de etiquetas y no radioactivos, o que requieren niveles reducidos de etiquetas, los hacen más seguros que los ensayos que involucran marcación radioactiva, por ejemplo. Ya que se pueden llevar a cabo ensayos sobre células adherentes, sin desprendimiento de la placa, permiten una evaluación más precisa de ADCC sobre células in vivo. Por lo tanto, los ensayos de ADCC descritos aquí mejorarán la habilidad para ensayar anticuerpos terapéuticos candidatos para actividad de ADCC.

Adicionalmente, los ensayos de ADCC establecidos aquí pueden ser utilizados para identificar poblaciones de pacientes adecuadas para tratamiento con un anticuerpo particular. Como se discutió anteriormente, se pueden llevar a cabo los ensayos utilizando las PBMC como células efectoras. Existen polimorfismos en los receptores Fc sobre células efectoras PBMC que pueden afectar la habilidad de las células efectoras para enlazar un anticuerpo objetivo específico, y por lo tanto para mediar la ADCC. Los ensayos de ADCC establecidos aquí son ensayos rápidos y fáciles que pueden ser utilizados para determinar si las PBMC de un paciente particular, en combinación con un anticuerpo terapéutico, son capaces de mediar la ADCC de células objetivo.

En resumen, los métodos de ensayo de ADCC establecidos aquí tienen el potencial para cambiar la forma en que se mide la ADCC, tanto en la industria para desarrollo de fármacos, como en investigación básica para el estudio de la respuesta inmunológica mediada por anticuerpos.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación,

no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido. 5

Documentos de patente citados en la descripción

• US 5840313 A [0004] • WO 2005047482 A [0027] [0029] [0032]

• EP 1176195 A [0004] • US 20050112544 A [0027] 10 • WO 2004010103 A [0026] [0032] • WO 2006015387 A [0028]

•: WO 2004010102 A [0026] [0032] • WO 2005077104 A [0032]

•: WO 200577104 A [0027] [0029]

Literatura citada en la descripción que no es de patentes

15

•: Nelson y colaboradores. Nature, 2003, vol. 422, 766 -774 [0046]

•: Snijdewint y colaboradores. Int. J. Cancer, 2001, vol. 93, 97 -106 [0048]

•: Hayes y colaboradores. J. Immunol., 1990, vol. 145, 962 -970 [0048]

•: Lu y colaboradores. Cancer Immunol. Immunother, 2002, vol. 51, 153 -162 [0048]

Claims

Reivindicaciones

1. Un método para evaluar la citotoxicidad celular que depende de anticuerpos (ADCC), que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo están en una monocapa sobre el sustrato; y

(b)

la adición al medio de ensayo de células efectoras y un anticuerpo que se enlaza a las

células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que no se ha efectuado la función de ADCC en el medio de ensayo, en donde opcionalmente el anticuerpo se deriva de un paciente con un trastorno autoinmune.
2.

El método de acuerdo a la reivindicación 1, que comprende la medición de la impedancia a intervalos regulares.
3.

El método de acuerdo a la reivindicación 2, que comprende la derivación de un Índice de Células (CI) a partir de cada medición de impedancia y determinar si se presenta un cambio en el Índice de Células, en donde el Índice de Células se deriva de cada medición de impedancia utilizando la fórmula

en donde Rb(f) y Rcélula(f) son las resistencia del electrodo que dependen de la frecuencia sin células o con células presentes, respectivamente, y N es el número de los puntos de frecuencia en los cuales se mide la impedancia.
4.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las mediciones de impedancia se toman cada 15 minutos.
5.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el método comprende además la siembra en placa de las células objetivo, y en donde opcionalmente las células objetivo se siembran en placa 18 a 24 horas antes de la adición del anticuerpo y de las células efectoras.
6.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las células objetivo se siembran en placa con una densidad entre 2 K y 100 K por pozo, o en donde las células objetivo se siembran en placa con una densidad de aproximadamente 20 K por pozo.
7.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proporción de células efectoras con respecto a células objetivo (E:T) es de 25:1, o en donde la E:T es mayor a 10:1, o en donde la E:T es mayor a 50:1, o en donde la E:T es mayor a 100:1.
8.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se añade el anticuerpo en una concentración entre 1 y 100 µg/ml, entre 1 y50 µg/ml, o entre 2 y8 µg/ml.
9.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la adición al medio de ensayo de dos o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o la adición al medio de ensayo de 3 o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo, o la adición al medio de ensayo de 4 o más anticuerpos que se enlazan a las células objetivo.
10.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las células objetivo expresan antígenos apicales, que comprende opcionalmente una etapa preliminar de selección de células objetivo para la expresión del antígeno apical.
11.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde las células objetivo son células cancerosa o célula infectadas por virus, en donde opcionalmente las células cancerosas son de una línea de células, opcionalmente las células cancerosas son células SKBR3 o células MG63.
12.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde las células efectoras incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células citotóxicas T o neutrófilos.
13.

El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la etapa (b) comprende la adición a las células objetivo de sangre entera que ha sido parcialmente enriquecida por las células efectoras, o comprende la adición de sangre entera a las células efectoras, y en donde la sangre entera incluye las células efectoras.
14.

Un método para seleccionar un anticuerpo candidato por la habilidad para inducir ADCC contra células objetivo, que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b)

la adición de células efectoras y el anticuerpo candidato que enlaza a las células

imagen1

objetivo al medio de ensayo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la habilidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la inhabilidad del anticuerpo candidato para efectuar la función de ADCC contra las células objetivo.
15. Un método para identificar un paciente que tiene una enfermedad asociada con células objetivo que es adecuado para tratamiento con un anticuerpo candidato que es capaz de modular ADCC, en donde las células objetivo son 1) células sanas asociadas con una enfermedad autoinmune, 2) células infectadas con virus o 3) células cancerosas, comprendiendo el método:

(a)

el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad;

(b)

la adición de PBMC aisladas del paciente y el anticuerpo candidato a las células objetivo; y

(c)

la determinación de si un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato se presenta después de la adición de las PBMC y el anticuerpo, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de lo adecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el

anticuerpo es indicativo de lo inadecuado del paciente para el tratamiento con el anticuerpo.
16. Un método de selección de un compuesto candidato por la habilidad para modular ADCC, que comprende:

(a)

el monitoreo de la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en el medio del ensayo;

(b)

la adición al medio del ensayo de células efectoras y un anticuerpo, en presencia y en ausencia del compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y

(c)

la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo en ausencia del compuesto candidato, en donde un cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato que es mayor que cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato tiene la capacidad para modular ADCC,

en donde opcionalmente el compuesto que va a ser seleccionado modula la ADCC relacionada con autoinmunidad.
17.

Un método de acuerdo a cualquier reivindicación previa que es un ensayo de alto rendimiento, y en donde el sustrato no conductor incluye dos o más pozos de microtitulación, comprendiendo cada pozo al menos dos electrodos, y el monitoreo de la impedancia entre los electrodos en cada pozo.
18.

Un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b)

la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio de ensayo, en donde el

anticuerpo se enlaza con las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en inducción de ADCC, y en donde un incremento o ningún cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en inducción de ADCC.
19. Un ensayo de control de calidad para un anticuerpo, que comprende:

(a)

el monitoreo de la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo;

(b)

la adición de células efectoras y el anticuerpo al medio de ensayo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo; y

(c)

la comparación de cualquier cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo con cualquier cambio en la impedancia para una muestra de control después de la adición de las células efectoras y un anticuerpo de control;

en done una disminución en la impedancia después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es indicativa

de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de ADCC, y en

donde la carencia de una disminución en la impedancia después de la adición de las células

efectoras y el anticuerpo que es mayor que cualquier disminución en la impedancia para la

muestra de control después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo de control es

indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para ser liberado para uso en la inducción de

ADCC,

en donde opcionalmente una disminución en la impedancia después de la adición de las

células efectoras y el anticuerpo que es al menos 25% mayor que la disminución en la

impedancia para la muestra de control después de la adición de las células efectoras y el

anticuerpo de control es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para ser liberado para

uso en la inducción de ADCC.
20. Un método para selección de un compuesto candidato para uso como compuesto terapéutico contra una enfermedad autoinmune, que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo, en donde las células objetivo son células sanas;

(b)

añadir al medio de ensayo células efectoras y un anticuerpo, con y sin el compuesto candidato, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde las células efectoras son PBMC de un individuo diagnosticado con la enfermedad autoinmune; y

(c)

comparar cualquier cambio en la impedancia en presencia del compuesto candidato con cualquier cambio en la impedancia en ausencia del compuesto candidato, en donde una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea mayor que cualquier disminución en la impedancia en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune, y en donde la falta de una disminución en la impedancia en ausencia del compuesto candidato que sea superior a cualquier disminución en la impedancia en presencia del compuesto candidato es indicativa de que el compuesto candidato no es adecuado como agente terapéutico contra la enfermedad autoinmune.
21. Un método para determinar si un anticuerpo candidato es adecuado para tratar a un individuo que tiene una enfermedad autoinmune, que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre los electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo asociadas con la enfermedad autoinmune; y

(b)

añadir el anticuerpo candidato y las PBMC aisladas del individuo a las células objetivo; y

(c)

determinar si se presenta un cambio en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las PBMC y el anticuerpo candidato, en donde una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo es adecuado para el tratamiento del individuo, y en donde la falta de una disminución en impedancia entre los electrodos es indicativa de que el anticuerpo no es adecuado para el tratamiento del individuo.
22. Un método para determinar una concentración óptima de un anticuerpo para inducir una respuesta de ADCC, que comprende:

(a)

monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de dos o más muestras de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b)

añadir células efectoras y un anticuerpo a las dos o más muestras de células objetivo, en donde el anticuerpo se enlaza a las células objetivo, y en donde se añade el anticuerpo en diferentes concentraciones a las dos o más muestras de células objetivo;

en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de la función de ADCC que se ha efectuado en el medio de ensayo, y en donde se determina que la concentración de anticuerpo que resulta en la mayor disminución en impedancia es la concentración óptima.
23. Un método para determinar si un anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre una célula objetivo, que comprende:

(a) monitorear la impedancia entre electrodos sobre un sustrato no conductor que soporta el crecimiento de células objetivo en un medio de ensayo; y

(b) añadir células efectoras y el anticuerpo a las células objetivo; en donde una disminución en la impedancia entre los electrodos sobre el sustrato después de la adición de las células efectoras y el anticuerpo es indicativa de que el anticuerpo se enlaza a un antígeno apical sobre las células objetivo.

“Siguen 12 páginas de dibujos”