ES2349889T3

ES2349889T3 - Péptido de consenso.

Info

Publication number: ES2349889T3
Application number: ES07866581T
Authority: ES
Inventors: Jan Eirik Ellingsen; Stale Petter Lyngstadaas
Original assignee: Corticalis AS
Current assignee: Corticalis AS
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: KR20090117702A; ATE475670T1; PL2118136T3; JP2010513460A; WO2008078167A2; AU2007337797B2; DE602007008147D1; HK1137186A1; JP5253412B2; AU2007337797A1; KR20150014999A; US8367602B2; DK2118136T3; WO2008078167A3; EP2118136B1; CA2673382A1; EP2118136A2; CA2673382C; KR101493437B1; US20100172949A1

Abstract

Un péptido artificial que comprende la secuencia de aminoácidos Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEC ID Nº: 1), en la que a) Pro es prolina; b) X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val; c) Y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Cys, Gin, Ser, Thr y Tyr.

Description

Péptido de consenso.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la inducción y/o estimulación de precipitación mineral y/o biomineralización, y a péptidos artificiales capaces de inducir y/o estimular la precipitación mineral y/o la biomineralización de forma clínica, industrial o química.

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Antecedentes de la técnica

Los tejidos duros de los organismos, por ejemplo dientes, huesos, conchas de moluscos, etc., están compuestos de minerales asociados a menudo a una fase orgánica polimérica.

La biomineralización es el proceso mediante el cual los depósitos minerales del interior o del exterior de las células de diferentes organismos forman las estructuras anteriores. Los ejemplos de minerales depositados incluyen hierro, oro, silicatos, carbonato cálcico y fosfato cálcico. Las propias células dirigen el proceso de biomineralización mediante, por ejemplo, la expresión de proteínas que actúan como nucleadores y la producción de enzimas que modifican las funciones de dichas proteínas. La mayoría de las proteínas asociadas a la biomineralización son aniónicas, lo que les permite interactuar con las superficies de los cristales minerales cargados.

La biomimética se define como técnicas de procesado microestructural que imitan o que se inspiran en el modo natural de producción de minerales, tales como los apatitos. Los medios por los cuales los organismos usan sustancias orgánicas para hacer crecer minerales son de interés en la biomimética. Por ejemplo, las propiedades de deposición de minerales de los biopolímeros, y de análogos sintéticos de los mismos, han sido utilizadas en procesos industriales, por ejemplo en el tratamiento de agua y en dispositivos electrónicos. Muchos cristales fabricados por el hombre requieren de temperaturas elevadas y disoluciones químicas fuertes, mientras que los organismos han sido capaces desde hace mucho tiempo de construir estructuras minerales elaboradas a temperatura ambiente. A menudo las fases minerales no son puras sino que se preparan como materiales compuestos que abarcan una parte orgánica, a menudo una proteína, que toma parte en la biomineralización y la controla. Estos materiales compuestos a menudo no son únicamente tan duros como el mineral puro sino incluso más resistentes, ya que el microentorno controla la biomineralización. Por tanto, existe un gran interés en la utilización de biopolímeros para aplicaciones industriales para inducir la precipitación del mineral.

También tiene un gran interés la utilización de biopolímeros en sistemas biológicos para diversos propósitos. Un ejemplo es en la tecnología de dispositivos prostéticos médicos. Los dispositivos prostéticos médicos óseos hechos de metal o de aleaciones metálicas son utilizados habitualmente. Algunos de los metales y aleaciones usados para los dispositivos prostéticos médicos óseos, tales como el titanio, el zirconio, el hafnio, el tántalo, el niobio, o aleaciones de los mismos, pueden formar un enlace fuerte con el tejido óseo. Dicho enlace entre el metal y el tejido óseo se ha denominado "oseointegración" (Branemark y col., "Osseointegrated medical prosthetic devices in the treatment of the edentulous jaw, Experience from a 10-year period", Almqvist & Wiksell International, Estocolmo, Suecia). Cuando se implanta en un sujeto, el tejido óseo crece sobre las superficies del dispositivo prostético médico de tal modo que el dispositivo prostético médico queda unido al tejido óseo. Sin embargo, se trata de un proceso lento bajo el cual el dispositivo prostético médico a menudo no puede ser cargado. Por tanto, sería valioso aumentar la velocidad a la que los dispositivos prostéticos médicos se unen al hueso.

También presenta un gran interés el desarrollo de métodos para la regeneración de tejido mineralizado, tal como huesos, por ejemplo después de un trauma, una extracción quirúrgica de huesos o dientes o en relacionada con una terapia anticancerígena.

Se ha demostrado que una serie de péptidos naturales inducen la precipitación mineral. Los ejemplos incluyen colágeno 1 y 2, amelogeninas (véase, por ejemplo, el documento US-B2-7132015), ameloblastina, sialoproteína ósea, enamelina y ansocalcina. Sin embargo, no siempre es práctico usar proteínas naturales para el propósito de inducir la precipitación mineral y/o la biomineralización. Por ejemplo, las proteínas naturales a menudo son largas, lo que significa que son difíciles de sintetizar, tanto químicamente como mediante bioproducción. Una proteína natural también contiene aminoácidos naturales, y por tanto puede ser susceptible de una degradación rápida. Asimismo, si se purifica a partir de un entorno natural, tal como dientes en desarrollo, siempre existe el riesgo de contaminación con otros productos que, por ejemplo, pueden provocar reacciones alérgicas. Adicionalmente, una proteína natural larga normalmente tiene muchas funciones en un organismo vivo y por tanto puede no estar optimizada para la inducción y estimulación de la mineralización.

Por lo tanto, es de gran interés el desarrollo de péptidos y métodos que permitan una mejor mineralización in vitro e in vivo.

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Resumen de la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un péptido artificial con propiedades mejoradas para la inducción y/o estimulación de la mineralización, in vivo e in vitro. Otro objetivo de la invención es proporcionar un péptido que sea más fácil de sintetizar que las proteínas naturales, y proporcionar métodos para usar los péptidos de la invención en la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral y/o biomineralización.

Los objetivos definidos anteriormente se logran en un primer aspecto de la invención proporcionando un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las SEC ID Nº: 1-8.

En otro aspecto, los objetivos definidos anteriormente se logran proporcionando una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos de las SEC ID Nº: 1-8.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de los péptidos de la invención para la inducción y/o estimulación de la mineralización y/o biomineralización in vitro.

Otros aspectos adicionales de la invención se refieren a una superficie que tiene un péptido de la invención dispuesto sobre la misma, y a los métodos para proporcionar dicha superficie.

La invención también se refiere a la inducción y/o estimulación in vivo de la biomineralización, así como de la regeneración ósea.

Puesto que las secuencias de aminoácidos de los péptidos artificiales de las SEC ID Nº: 1-8 han sido seleccionadas en base a sus actividades de inducción y/o estimulación de la mineralización, presentan una actividad mejorada para inducir y/o estimular la mineralización en comparación con otros péptidos disponibles en la técnica. Además, debido a su menor longitud respecto a las proteínas de inducción de mineralización naturales, los péptidos artificiales de la invención son más fáciles de sintetizar.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1. Expresión de gen de osteocalcina en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 5).

Figura 2. Expresión de gen Runx2 en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 5).

Figura 3. Expresión de gen TRAP en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 5).

Figura 4. Actividad LDH medida en el fluido de la lesión recogido en la zona del implante tras 4 semanas de tiempo de curación (Ejemplo 5).

Figura 5. Expresión de gen de osteocalcina en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 6).

Figura 6. Expresión de gen Runx2 en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 6).

Figura 7. Expresión de gen TRAP en el tejido óseo de peri-implante unido a los implantes de titanio modificado (Ejemplo 6).

Figura 8. Actividad LDH medida en el fluido de la lesión recogido en la zona del implante tras 4 semanas de tiempo de curación (Ejemplo 6).

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Definiciones

"Precipitación de mineral" o "precipitación mineral" se refiere a la formación in vivo o in vitro de estructuras que comprenden calcio y fosfato, por ejemplo y sin que suponga una limitación, en disoluciones, sobre superficies, en tejidos y sobre dispositivos prostéticos médicos, etc. Los ejemplos de estructuras que comprenden calcio y fosfato incluyen, aunque sin limitación, todos los tipos de hueso, cartílago, todos los tipos de dentina, cemento, esmalte, cálculos, cabello, uñas, ligamento, picos, escamas dérmicas, etc.

"Biomineralización" se refiere a la producción de estructuras internas o externas parcial o totalmente mineralizadas por parte de organismos vivos. En el contexto presente, el término "biomineralización" abarca la formación, la maduración y la remodelación de tejidos óseos, cartilaginosos, de cemento y dentales.

En el presente contexto, un "péptido artificial" se refiere a un péptido que no es un péptido natural en el sentido en que normalmente no existe en la naturaleza, sino que es el producto de la unión de aminoácidos seleccionados en un orden, cantidad y disposición dados que genera péptidos adecuados para su uso en el contexto de la presente invención. Un "péptido artificial" sigue siendo un péptido abarcado por la presente invención incluso aunque pueda comprender partes de un péptido, o el péptido completo, que resulte que existe en la naturaleza. "Artificial" puede usarse de forma indistinta con otras expresiones tales como "sintético" o "no natural".

En el presente contexto, "Pro" denota el aminoácido prolina.

En el presente contexto, "X" denota un aminoácido hidrofóbico. Un aminoácido hidrofóbico, en el presente contexto, se define como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val.

En el presente contexto, "Y" denota un aminoácido polar. Un aminoácido polar ("hidrofílico"), en el presente contexto, se define como un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Asn, Cys, Gln, Ser, Thr y Tyr.

En el presente contexto, se usa la nomenclatura común para denotar aminoácidos. Por lo tanto, por ejemplo, A es Ala (hidrofóbico), C es Cys (polar), F es Phe (hidrofóbico), H es His, I es Ile (hidrofóbico), L es Leu (hidrofóbico),
M es Met (hidrofóbico), N es Asn (polar), Q es Gln (polar), S es Ser (polar), T es Thr (polar), V es Val (hidrofóbico), W es Trp (hidrofóbico), Y es Tyr (polar).

"Dispositivo prostético médico" en el presente contexto se refiere a cualquier dispositivo destinado a ser implantado en el cuerpo de un animal vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo un mamífero humano. Los dispositivos prostéticos médicos en el presente contexto pueden usarse para sustituir anatomía y/o para restaurar cualquier función del cuerpo. Los ejemplos de dispositivos prostéticos médicos incluyen, aunque sin limitación, implantes dentales e implantes ortopédicos.

En el presente contexto, "superficie" se refiere a cualquier superficie que pueda ser de interés para proporcionar un péptido artificial de la invención, tal como una superficie metálica, por ejemplo una superficie de titanio, zirconio, tántalo, aluminio, oro, acero quirúrgico o níquel, o una aleación de los mismos, o una superficie de óxido metálico de los mismos, o una superficie de hidróxido metálico o de hidruro metálico de los mismos, o una superficie de hidroxil apatito, aragonito, biovidrio, vidrio o poliuretano. Otro ejemplo de superficie de acuerdo con la invención incluye una superficie de dispositivo prostético médico, tal como una superficie de dispositivo prostético médico metálico, de óxido metálico o polimérico. Otro ejemplo de una superficie de acuerdo con la invención es una superficie biológica, tal como una superficie de raíz de diente, una superficie de esmalte dental, una superficie ósea, una superficie de injerto, una superficie de una lesión, etc. Ejemplos adicionales de superficies comprenden superficies mucosas, superficies dérmicas, superficies articulares en las articulaciones, cabello y uñas, y otras superficies equivalentes.

En el presente contexto, "sujeto" se refiere a cualquier animal vertebrado, tal como un ave, un reptil, un mamífero, un primate y un humano.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a péptidos artificiales como los descritos en la presente memoria, y a su uso para la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral y/o biomineralización, por ejemplo sobre superficies, en tejidos y/o en una disolución, para la formación y/o regeneración de hueso, así como para la fusión de dos estructuras mineralizadas, tales como dos estructuras biomineralizadas o una estructura biomineralizada y un biomaterial implantable.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un péptido artificial que comprende una secuencia de aminoácidos de consenso Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEC ID Nº: 1), en la que

a): Pro es prolina;

b): X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val, preferiblemente Ile, Leu, Val y Met;

c): Y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Cys, Gln, Ser, Thr y Tyr, preferiblemente Ser y Gln.

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Además, los péptidos de acuerdo con la invención pueden comprender entre 20 y 120 aminoácidos, por ejemplo, aunque sin limitación, entre 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 45-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, o entre 100-120 aminoácidos, por ejemplo, aunque sin limitación, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 37, 42, 47, 49, 51, 53, 57, 59, 63, 65, 75, 85, 87, 88, 92, 95, 105 ó 115 aminoácidos. En una realización preferida, los péptidos de acuerdo con la invención comprenden entre 20-50 aminoácidos.

Los aminoácidos de un péptido artificial de la invención pueden modificarse adicionalmente desde el punto de vista químico, isométrico o cualquier otro, siempre que las secuencias de los péptidos se mantengan intactas. Las modificaciones de los aminoácidos de los péptidos artificiales de la invención pueden aumentar la actividad, la estabilidad, la biocompatibilidad o los resultados clínicos de los péptidos, o reducir la toxicidad y las reacciones adversas de los péptidos. Los ejemplos de modificaciones químicas incluyen, aunque sin limitación, la glicosilación y la metilación. Los aminoácidos también pueden ser de todos los tipos diferentes de formas estereoisoméricas, tales como las formas D ó L de los aminoácidos, o los isómeros S ó R. Los aminoácidos de un péptido artificial de la invención también pueden ser reemplazados por sus análogos sintéticos. El uso de análogos sintéticos puede dar como resultado, por ejemplo, un péptido que sea más estable y menos propenso a la degradación. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen: aminoácidos alfa* y alfa-disustituidos*, aminoácidos N-alquilo*, ácido láctico*, derivados halogenados de aminoácidos naturales tales como trifluorotirosina*, p-Cl-fenilalanina*, p-Br-fenilalanina*, p-I-fenilalanina*, L-alil-glicina*, \beta-alanina*, ácido L-a-aminobutírico*, ácido L-g-aminobutírico*, ácido L-a-aminoisobutírico*, ácido L-e-aminocaproico*, ácido 7-aminoheptanoico#*, sulfona de L-metionina#*, L-norleucina*, L-norvalina*, p-nitro-L-fenilalanina*, L-hidroxiprolina#, L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina (Phe) tales como 4-metil-Phe*, pentametil-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (metil)*, L-Phe (4-isopropil)*, L-Tic (ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*, ácido L-diaminopropiónico# y L-Phe (4-bencilo)*. La notación * se utiliza aquí para indicar la naturaleza hidrofóbica del derivado, mientras que # se utiliza para indicar la naturaleza hidrofílica del derivado,
#* indica características anfipáticas.

Preferiblemente, un péptido artificial de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 1. Más preferiblemente, la invención se refiere a un péptido artificial que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 1.

La SEC ID Nº: 1 identificada anteriormente es un péptido artificial (sintético) que comprende una secuencia de consenso de poli-prolina, que además comprende aminoácidos hidrofóbicos ("X") y polares ("Y"). Este péptido artificial de consenso se construyó en base a la similitudes de secuencia entre regiones de proteínas y péptidos que están implicados en la biomineralización (formación de hueso, cartílago, esmalte, dentina y cemento) con el fin de obtener un péptido que induzca y/o estimule la precipitación mineral en sistemas biológicos (biomineralización), y que también pueda ser usado clínicamente, industrialmente, químicamente o de cualquier otro modo para estimular la formación de estructuras basadas en fosfato de calcio en tejidos, sobre dispositivos prostéticos, sobre superficies, en disoluciones, etc. Las secuencias proteicas usadas para construir el péptido artificial incluyeron las secuencias del colágeno 1 y 2 (humano, de ratón y de rata), amelogenina (humana, de ratón, de rata, de conejo, de cerdo y de vaca), ameloblastina (humana, de rata), sialoproteína ósea (humana, de ratón), enamelina (humana, de ratón). Los péptidos artificiales de la invención son particularmente adecuados para la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral y/o de la biomineralización, ya que las secuencias de aminoácidos están optimizadas para dicho propósito. El uso de un péptido artificial de acuerdo con la invención es ventajoso debido a su menor longitud en comparación con los péptidos naturales, lo que facilita su síntesis y permite el uso de análogos de aminoácido, tal como se explica en la presente memoria. Asimismo, el uso de un péptido artificial permite modificaciones de la secuencia de aminoácidos para hacer que los péptidos se unan a, por ejemplo, superficies metálicas, o para que sean purificados fácilmente, tal como a través de la elección de la secuencia de aminoácidos del propio péptido o a través del uso de etiquetas N- y/o C-terminales.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un péptido artificial que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, que es capaz de inducir y/o estimular la precipitación mineral y/o la biomineralización. Preferiblemente, dicho péptido artificial consta de una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 1.

Una realización adicional de la invención se refiere a una secuencia peptídica de consenso de menor longitud que comprende una secuencia de aminoácidos de Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEC ID Nº: 2), en la

a): Pro es prolina;

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La SEC ID Nº: 2 se construye mediante el ensamblaje de los aminoácidos 47-50, 53-66 y 70-76 de la SEC ID Nº: 1, es decir los aminoácidos subrayados en la SEC ID Nº: 1 anteriormente. Una realización preferida de la invención se refiere a un péptido artificial que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 2, más preferiblemente que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 2. Otra realización preferida se refiere a un péptido artificial que consiste en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en la SEC ID Nº: 2, que es capaz de inducir y/o estimular la precipitación mineral y/o la biomineralización. Debido a su longitud corta, la SEC ID Nº: 2 presenta ventajas para la producción sintética.

La invención también se refiere a otros péptidos artificiales con una secuencia de aminoácidos especificada en una secuencia de consenso de la invención. En un primer aspecto, dicho péptido artificial es PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEC ID Nº: 3). Otra secuencia de aminoácidos preferida es PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEC ID Nº: 4). Estas dos secuencias son las dos secuencias de la invención que representan las secuencias más conservadas.

Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido artificial de unión a metal que induce/estimula la precipitación mineral y/o la biomineralización, que comprende la secuencia de aminoácidos de PLV PCC PLV PCC PLV PCC PCP PLPP (SEC ID Nº: 5) ó PMM PSY PMM PSY PMM PSY PYP PMPP (SEC ID Nº: 6). Estos dos péptidos presentan una elevada actividad de unión a metal debido a su contenido en aminoácidos que comprenden un átomo de azufre, por ejemplo metionina y cisteína. Dichos aminoácidos pueden formar puentes de azufre que puede interaccionar directamente con una superficie metálica. La propiedad de unión a metales puede tener interés cuando es deseable unir un péptido a una superficie metálica, tal como una superficie de un dispositivo prostético médico, in vivo o in vitro.

Otro aspecto de la invención se refiere a un péptido artificial optimizado para la estimulación y/o la inducción de la formación ósea que comprende la secuencia de aminoácidos PLV PSS PLV PSS PLV PSS PSP PLPP (SEC ID Nº: 7). Este péptido comprende varios residuos Ser. Es bien conocido que los residuos de Ser actúan como molécula señal para la formación de los huesos. Cuando un péptido de acuerdo con la SEC ID Nº: 7 es digerido, procesado y/o liberado de una superficie, se cree que se liberará Ser y que actuará como estimulador de la formación de hueso.

Otra realización preferida de la invención se refiere a un péptido artificial que comprende la secuencia de aminoácidos PLV PSS PLV PCC PLV PCC PSP PLPP (SEC ID Nº: 8). Este péptido está optimizado para la unión a superficies metálicas, la inducción de biomineralización y para la liberación de Ser.

Otros aspectos adicionales de la invención se refieren a péptidos artificiales que tienen un 80-100% de identidad con respecto a las secuencias SEC ID Nº: 1-8, tales como los péptidos que tienen un 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 97, 98 ó 99% de identidad con respecto a las secuencias SEC ID Nº: 1-8.

En las realizaciones preferidas, los péptidos artificiales descritos en la presente memoria consiste en las SEC ID Nº: 1-8, respectivamente.

Un péptido de acuerdo con la invención puede comprender además etiquetas N- y/o C-terminales que comprenden los aminoácidos His y/o Met. Met contiene azufre, lo que, como se ha explicado anteriormente, facilita la unión a superficies metálicas. His presenta una fuerte afinidad, por ejemplo, por el Ni y otros metales. Por tanto, el uso de estas etiquetas tiene la ventaja de permitir la unión de los péptidos a superficies metálicas como titanio, zirconio, aluminio, tántalo, oro, acero quirúrgico y níquel, o a una superficie de óxido metálico y/o de hidruro metálico, etc. Esto es de gran importancia, por ejemplo, si el péptido de la invención se va a unir a una superficie metálica, tal como cuando se va usar para mejorar la biomineralización y/o la integración ósea de un dispositivo prostético médico. Las etiquetas C- y/o N-terminales también son útiles en el proceso de purificación de los péptidos producidos, hecho bien conocido por los especialistas en la técnica. El uso de una etiqueta N-terminal y/o C-terminal también permite que el péptido sea expuesto completamente, es decir, la etiqueta se usa para unir el péptido a una superficie y el resto del péptido queda libre para interaccionar con, por ejemplo, átomos, moléculas, células y tejidos. El uso de una etiqueta en cada extremo de un péptido puede ser útil durante la producción del péptido, permitiendo que un extremo del péptido se una a una columna durante la purificación del péptido de interés a partir de productos peptídicos incompletos, mientras que el otro extremo del péptido puede usarse para unirse a una superficie de interés. Por consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere a un péptido artificial como el definido aquí, que además comprende una etiqueta de histidina N-terminal y/o C-terminal. Dicha etiqueta, como se ha mencionado previamente, puede comprender residuos de metionina y/o histidina, que han sido unidos a un péptido artificial de acuerdo con la invención. En una realización preferida, esta etiqueta comprende 3 o más residuos, tal como 3-5 ó 5-10 residuos. Una etiqueta puede comprender cualquier cantidad de residuos unida a un péptido artificial de acuerdo con la invención, que todavía permite una composición estable junto con el péptido artificial de acuerdo con la invención sin afectar a la estructura secundaria del péptido artificial de un modo negativo. Preferiblemente esta etiqueta de histidina consiste en cinco residuos de histidina. En otra realización preferida, el péptido artificial comprende una etiqueta N-terminal y/o C-terminal de metionina, que preferiblemente consiste en cinco residuos de metionina. En otra realización preferida, un péptido de la invención comprende una etiqueta de metionina en su extremo C- o N-terminal y una etiqueta de histidina en el otro extremo.

Debido a su menor longitud, en comparación con las proteínas naturales, los péptidos artificiales de la invención son más fáciles de producir, por ejemplo mediante producción sintética o biosíntesis. Los péptidos artificiales de la invención pueden ser producidos mediante cualquier método conocido para la producción de péptidos, tal como la producción sintética mediante síntesis química. La producción sintética también permite el uso de análogos de aminoácido que pueden mejorar la estabilidad de los péptidos producidos. El especialista en la técnica conoce los métodos disponibles para la síntesis de una secuencia de aminoácidos.

Preferiblemente, se puede usar la bioproducción como método para producir los péptidos. Bioproducción significa la producción de una secuencia de aminoácidos en un sistema biológico, tal como un cultivo celular o células microbianas, por ejemplo, células de bacterias. Para la bioproducción es necesario construir la correspondiente secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos específica. El especialista en la técnica conoce cómo construir dicha secuencia de ácido nucleico una vez determinada la secuencia de aminoácidos específica que se quiere sintetizar, y cómo producir el péptido y purificarlo a partir del sistema usado para producirlo (véase, por ejemplo, Svensson J, Andersson C, Reseland JE, Lyngstadaas SP, Bulow L, Histidine tag fusion increase expression levels of active recombinant Amelogenin in Escherichia coli, Protein Expr Purif, 48; 134-41 (2006)).

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial como el definido en el presente documento, o una combinación de dos o más péptidos artificiales como los definidos en el presente documento. Dicha composición farmacéutica también comprende opcionalmente un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas en el presente contexto también abarcan composiciones cosméticas así como composiciones que pertenecen a la denominada área gris entre productos farmacéuticos y cosméticos, a saber productos cosmoceúticos.

Las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en forma de, por ejemplo, composiciones sólidas, semisólidas o fluidas, tales como, por ejemplo:

-: dispositivos de administración, implantes;

-: polvos, gránulos, granulados, cápsulas, esferas de agarosa o quitosán, microesferas, nanopartículas;

-: pulverizadores, aerosoles, dispositivos de inhalación;

-: geles, hidrogeles, pastas, ungüentos, cremas, jabones, pasta de dientes;

-: disoluciones, dispersiones, suspensiones, emulsiones, mezclas, lociones, enjuagues bucales, champús, enemas;

-: kits que contienen, por ejemplo, dos recipientes separados, en donde el primero de los recipientes comprende un péptido de la invención mezclado opcionalmente con otra(s) sustancia(s) de fármaco activo y/o excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables, y el segundo recipiente contiene un medio adecuado para ser añadido al primer recipiente antes del uso con el objetivo de obtener una composición lista para ser usada.

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Una composición que comprende un péptido de la invención puede ser adecuada para su uso durante una cirugía, por ejemplo, para aplicación local (por ejemplo en la cavidad oral) en forma de gel, película o partícula , o como una disolución de enjuague o un tratamiento con una pasta o crema.

Las composiciones pueden formularse de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" y "Encyclopedia of Pharmaceutical Technology", editados por Swarbrick, J. & J.C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1988.

Los péptidos de la invención pueden aplicarse, por ejemplo, sobre dentaduras, prótesis, implantes, y en cavidades corporales tales como la cavidad oral, nasal y vaginal.

Además, la aplicación dentro del área dental/odontológica también tiene una gran importancia.

Un excipiente, vehículo y/o diluyente farmacéutica o cosméticamente aceptable es una sustancia que es sustancialmente inofensiva para el individuo al que se administra la composición. Dicho excipiente, vehículo y/o diluyente normalmente cumple los requerimientos exigidos por las autoridades sanitarias. Las farmacopedias oficiales, tales como, por ejemplo, la "British Pharmacopoeia", la "United States of America Pharmacopoeia" y la "The European Pharmacopoeia" establecen estándares para los excipientes farmacéuticamente aceptables.

El que un excipiente farmacéuticamente aceptable sea adecuado para uso en una composición farmacéutica generalmente depende del tipo de forma de dosis elegido. A continuación se muestran ejemplos de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para uso en diferentes tipos de composiciones para su uso de acuerdo con la invención.

La elección de excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) en una composición para su uso de acuerdo con la invención, y la concentración óptima de el(los) mismo(s), no pueden predecirse de forma general y deben determinarse en base a una evaluación experimental de la composición final. Sin embargo, el especialista en la técnica de la formulación farmacéutica puede encontrar una guía en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 18ª edición, Mack Publishing Company, Easton, 1990.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir disolventes, agentes tamponantes, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizantes, agentes emulsificantes, agentes de suspensión, agentes formadores de gel, bases de ungüentos, potenciadores de la penetración, perfumes y agentes protectores de la piel.

Los ejemplos de disolventes son, por ejemplo, agua, alcoholes, aceites vegetales o marinos (por ejemplo, aceites comestibles como el aceite de almendra, el aceite de ricino, la manteca de cacao, el aceite de coco, el aceite de maíz, el aceite de semilla de algodón, el aceite de semilla de lino, el aceite de oliva, el aceite de palma, el aceite de cacahuete, el aceite de semilla de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite de semilla de té), aceites minerales, aceites grasos, parafina líquida, polietilenglicoles, propilenglicoles, glicerol, polialquilsiloxanos líquidos, y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de agentes tamponantes son, por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido hidrogenofosfórico, dietilamina, etc.

Los ejemplos adecuados de conservantes para su uso en las composiciones de acuerdo con la invención son parabenos, tales como metilparabeno, etilparabeno, propil p-hidroxibenzoato, butilparabeno, isobutilparabeno, isopropilparabeno, sorbato potásico, ácido sórbico, ácido benzoico, metil benzoato, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, yodopropinil butilcarbamato, EDTA, cloruro de benzalconio y alcohol bencílico, o mezclas de conservantes.

Los ejemplos de humectantes son glicerina, propilenglicol, sorbitol, ácido láctico, urea y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de agentes quelantes son EDTA sódico y ácido cítrico.

Los ejemplos de antioxidantes son hidroxianisol butilado (BHA), ácido ascórbico y derivados del mismo, tocoferol y derivados del mismo, cisteína y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de agentes emulsificantes son gomas naturales, por ejemplo goma de acacia o goma de tragacanto; fosfátidos naturales, por ejemplo lecitina de soja; derivados de monooleato de sorbitán; grasas de lana; alcoholes de lana; ésteres de sorbitán; monoglicéridos; alcoholes grasos; ésteres de ácido graso (por ejemplo, triglicéridos de ácidos grasos); y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de agentes de suspensión son, por ejemplo, celulosas y derivados de celulosa tales como, por ejemplo, carboximetil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carragenina, goma de acacia, goma arábiga, tragacanto y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de bases de gel, agentes potenciadores de la viscosidad o componentes que son capaces de captar el exudado de una herida son: parafina líquida, polietileno, aceites grasos, sílice coloidal o aluminio, jabones de zinc, glicerol, propilenglicol, tragacanto, polímeros de carboxivinilo, silicatos de magnesio-aluminio, Carbopol®, polímeros hidrofílicos tales como, por ejemplo, almidón o derivados de celulosa tales como, por ejemplo, carboximetil celulosa, hidroxietil celulosa y otros derivados de celulosa, hidrocoloides hinchables en agua, carrageninas, hialouronatos (por ejemplo, gel de hialouronato que contiene opcionalmente cloruro sódico), y alginatos que incluyen alginato de propilenglicol.

Otros ejemplos de geles para su uso en una composición de acuerdo con la invención comprenden hidrogeles tales como PEG (Poli Etilen Glicol), dextrasulfatos, dextrosa, heparansulfatos, gelatinas, u otros similares.

Los ejemplos de bases de ungüento son, por ejemplo, cera de abejas, parafina, cetanol, palmitato de cetilo, aceites vegetales, ésteres de sorbitán de ácidos grasos (Span), polietilenglicoles y productos de condensación entre ésteres de sorbitán de ácidos grasos y óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitán (Tween).

Los ejemplos de bases de ungüento hidrofóbicas o emulsificantes en agua son parafinas, aceites vegetales, grasas animales, glicéridos sintéticos, ceras, lanolina y polialquilsiloxanos líquidos.

Los ejemplos de bases de ungüento hidrofílicas son macrogeles sólidos (polietilenglicoles).

Otros ejemplos de bases de ungüento son los jabones de trietanolamina, el alcohol graso sulfatado y los polisorbatos.

Los ejemplos de componentes en polvo son: alginato, colágeno, lactosa, polvo que es capaz de formar un gel cuando se aplica a una herida (absorbe líquido/exudado de herida). Normalmente, los polvos destinados a aplicación sobre heridas abiertas de gran tamaño deben ser estériles y las partículas presentes deben ser micronizadas.

Los ejemplos de otros excipientes son polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, hidroxipropil celulosa, pectina, goma de xantano, goma de algarroba, goma de acacia, gelatina, carbómero, emulsificantes como vitamina E, estearatos de glicerilo, glucósido de cetarilo, colágeno, carragina, hialouronatos y alginatos y quitosanos.

Los agentes dispersantes y humectantes adecuados son, por ejemplo, fosfátidos naturales, por ejemplo, lecitina o lecitina de soja; productos de condensación de óxido de etileno con, por ejemplo, un ácido graso, un alcohol alifático de cadena larga, o un éster parcial derivado de ácidos grasos y un hexitol o un anhídrido de hexitol, por ejemplo estearato de polioxietileno, monooleato de polioxietilen sorbitol, monooleato de polioxietilen sorbitán, etc.

Los agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, gomas naturales tales como, por ejemplo, goma de acacia, goma de xantano o goma de tragacanto; celulosas tales como, por ejemplo, carboximetil celulosa sódica, celulosa microcristalina (por ejemplo, Avicel® RC 591, metilcelulosa); alginatos y quitosanos tales como, por ejemplo, alginato sódico, etc.

La concentración del péptido artificial en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención variará, como puede entender fácilmente el especialista en la técnica, dependiendo del uso pretendido para la composición. Normalmente, la concentración del péptido en la composición farmacéutica es aproximadamente de 0,01-1 mg/mL. La cantidad aplicada in vivo a un sujeto normalmente es de aproximadamente 10 ng-0,1 mg/cm^{2}, preferiblemente de aproximadamente 1 \mug/cm^{2}.

En un aspecto, la invención se refiere a una superficie que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención. Opcionalmente, dicha superficie también comprende una sal mineral depositada sobre ella, tal como carbonato cálcico y/o fosfato cálcico. En una realización preferida, esta superficie es una superficie metálica y/o de óxido metálico o es una superficie de una aleación metálica y/o de un óxido de la misma. En una realización preferida, dicho metal es titanio, zirconio, tántalo, aluminio, oro, acero quirúrgico o níquel. En otra realización preferida dicho óxido metálico es óxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de tántalo u óxido de zirconio. En otra realización adicional, una superficie de acuerdo con la invención está cubierta al menos parcialmente por un óxido de un metal o por una aleación del mismo que comprende un péptido artificial como el descrito en el presente documento.

En otra realización preferida, dicha superficie está cubierta al menos parcialmente por un hidruro de un metal o por una aleación del mismo, que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención. La capa de hidruro formada sobre la superficie de acuerdo con la invención puede comprender cualquier hidruro de un metal o una aleación del mismo, o una mezcla de varios hidruros diferentes de un metal o de una aleación del mismo. Los ejemplos de metales que pueden usarse en el contexto de la presente invención para formar una capa de hidruro son el titanio, el zirconio, el hafnio o el tántalo, o una aleación de los mismos. En el caso de una superficie de titanio o de una aleación del mismo, la mayor parte de la capa externa modificada, es decir, más del 50%, preferiblemente está constituida por hidruro de titanio. Esta capa de hidruro de titanio también puede comprender pequeñas cantidades de otros elementos y/o hidruros de los mismos.

En una realización, la invención se refiere a un método para producir una capa de hidruro sobre una superficie de un metal o de una aleación del mismo que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención. Esto puede llevarse a cabo recubriendo una superficie que comprende un péptido con una capa de hidruro, o convirtiendo la superficie en un hidruro. Un método preferido para producir dicha capa es tratar el implante mediante electrolisis. Las capas de hidruro metálico se describen con más detalle en el documento WO 00/38753.

En otra realización preferida adicional, dicha superficie comprende una capa de un material de hidróxido correspondiente seleccionado entre un hidróxido metálico tal como hidróxido de titanio, hidróxido de zirconio, hidróxido de tántalo, hidróxido de hafnio, hidróxido de niobio e hidróxido de cromo y/o vanadio, o un hidróxido de una aleación de un metal tal como titanio, zirconio, tántalo, hafnio, niobio o cromo, o cualquier otro metal descrito en la presente memoria cuya superficie comprenda un péptido artificial de acuerdo con la invención.

Además, la invención también se refiere a un método para preparar una superficie que esté cubierta al menos parcialmente con una capa de hidróxido de un metal o de una aleación del mismo, tal como se describe en la presente memoria, que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método el sometimiento de partes de la superficie del material metálico a un tratamiento de electrolisis para formar la capa de material de hidróxido. Las capas de hidróxido metálico se describen con más detalle en el documento WO 03/08695.

Cabe destacar que la formación de una capa de hidróxido, óxido y/o hidruro sobre una superficie de un metal o de una aleación del mismo, en una superficie que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención, depende de las condiciones usadas durante el tratamiento de electrolisis. En general, se puede llevar a cabo un tratamiento de electrolisis tal como se ha descrito en la presente memoria para formar una capa de hidróxido, hidruro y/u óxido sobre un metal o aleación del mismo que incorpora un péptido artificial de acuerdo con la invención. Sin embargo, en condiciones ácidas se formará principalmente una capa de hidruro sobre la superficie, y en condiciones básicas se formará principalmente una capa de hidróxido y/u óxido sobre la superficie que comprende un péptido de acuerdo con la invención.

Si el pH del electrolito es inferior al pI del péptido, la carga neta del péptido será positiva. En una célula electrolítica, el péptido cargado positivamente viajará hacia el electrodo cargado negativamente, donde se formará una capa de hidruro de un metal o de una aleación del mismo. Si el pH es superior al pI, el péptido se cargará negativamente y viajará hacia el electrodo cargado positivamente formando una capa de hidróxido y/u óxido sobre una superficie de un metal o de una aleación del mismo. Esto demuestra que un péptido de acuerdo con la invención puede ser usado tanto en condiciones ácidas como básicas, es decir durante la hidratación, hidroxidación y/u oxidación de una superficie de un metal o de una aleación del mismo.

En otra realización preferida, dicha superficie es un apatito de hidroxilo, aragonito, biovidrio, vidrio, poliuretano o una superficie de dispositivo prostético médico polimérico. En otra realización preferida dicha superficie es una superficie biológica, como se ha definido anteriormente.

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En una realización preferida, la superficie sobre la cual se proporciona el péptido artificial de la invención es una superficie de dispositivo prostético médico, tal como una superficie de dispositivo prostético médico metálica, de óxido metálico o polimérica. Como se ha mencionado previamente, dicha superficie de dispositivo prostético médico puede comprender un péptido artificial de la invención, u opcionalmente un péptido artificial y una sal mineral. Se cree que dichas superficies de dispositivo prostético médico inducen y/o estimulan la precipitación mineral y/o la biomineralización sobre la superficie del dispositivo prostético médico cuando se implanta en un sujeto. Con ello, la oseointegración del dispositivo prostético médico puede aumentar y el resultado de la implantación del dispositivo en un sujeto puede mejorar. También es posible unir un péptido de la invención a un dispositivo prostético médico antes de la implantación y cultivar células, como se ha mencionado anteriormente, sobre él, células que a continuación pueden ser biomineralizadas antes de la implantación del dispositivo prostético médico en un sujeto. En este caso, se pueden preparar estructuras biomineralizadas sobre la superficie del dispositivo prostético médico. El mineral precipitado biológicamente tiene una estructura y unas propiedades químicas diferentes a las de mineral precipitado inorgánicamente y, por tanto, tiene un mejor potencial para actuar en sistemas biológicos. Sin pretender establecer ninguna teoría, esta mejor actuación de las superficies de acuerdo con la invención en sistemas biológicos puede deberse a la carga de la superficie así como a que los cristales que forman la superficie mineralizada están ordenados en su estructura, proporcionando así un entorno más biocompatible que una estructura sintética. Las células pueden eliminarse opcionalmente antes de la implantación. De este modo se prepara una estructura "bio-estructurada", "bio-imitada" o "bio-moldeada".

Tal como se ha definido previamente, un dispositivo prostético médico en el presente contexto está relacionado con cualquier dispositivo destinado a ser implantado en el organismo de un animal vertebrado, en particular de un mamífero, en particular de un humano. Los dispositivos prostéticos médicos en el presente contexto pueden usarse para reemplazar anatomía y/o para restaurar cualquier función del organismo. Ejemplos no limitantes de dichos dispositivos son los dispositivos médicos que reemplazan anatomía o que restauran una función del organismo tales como la articulación de cadera femoral; la cabeza femoral; la taza acetabular; codo, incluyendo troncos, cuñas, injertos articulares; rodilla, incluyendo los componentes femorales y tibiales, tronco, cuñas, injertos articulares o componentes patelares; hombros, incluyendo tronco y cabeza; muñeca; tobillos; mano; dedos; pulgares; vértebras; discos espinales; articulaciones artificiales; implantes dentales; implantes osiculoplásticos; implantes del oído medio, incluyendo yunque, maleo, estribo, yunque-estribo, maleo-yunque, maleo-yunque-estribo; implantes cocleares; dispositivos de fijación ortopédicos tales como uñas, tornillos, grapas y placas; válvulas cardíacas; marcapasos; catéteres; vasos; implantes de relleno; implantes para la retención de sistemas de ayuda a la audición; implantes de fijación externa; y también dispositivos intrauterinos (DIUs); y dispositivos bioelectrónicos tales como dispositivos electrónicos intracocleares o intracraneales.

En otro aspecto, la invención se refiere a un cultivo celular o a un tejido que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención. Opcionalmente, dicho cultivo celular o tejido también comprende una sal mineral depositada sobre el mismo, tal como carbonato cálcico y/o fosfato cálcico. Dicho cultivo celular puede comprender, por ejemplo, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, fibroblastos, células madre, tales como células madre embrionarias y mesenquimales, o células progenitoras, omnipotentes, pluripotentes y multipotentes, células musculares, adipocitos, células de cartílago o de ligamento. Dicho péptido y/o sal mineral está presente en dicho cultivo celular y/o tejido en cualquier disolución biocompatible y/o en una disolución natural, dependiendo de que el entorno para la biomineralización sea in vitro o in vivo.

Los péptidos artificiales de la invención tienen uso en muchas situaciones en las que se requiere precipitación mineral y/o biomineralización. Por tanto, la invención también se refiere al uso de un péptido artificial o de una composición farmacéutica como los definidos en la presente memoria para la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral y/o de la biomineralización. Se puede usar un péptido artificial de la invención para dichos propósitos solo o en una combinación de dos o más péptidos de la invención. Los péptidos de la invención también pueden usarse junto con a proteínas y/o péptidos naturales, tales como amelogeninas, que inducen y/o estimulan la mineralización y/o la biomineralización. Por tanto, una realización de la invención se refiere a una composición, tal como una composición farmacéutica, de un péptido artificial de acuerdo con la presente invención junto con un polímero biológico, tal como, aunque sin limitación, amelogenina, fibrina, fibrinógeno, laminina, colágeno, polisacáridos, celulosa, etc.

Un aspecto de la invención se refiere al uso de los péptidos artificiales de la invención para la inducción y/o estimulación de la mineralización in vitro en, por ejemplo, cultivos celulares, tejidos, sobre superficies y/o en disoluciones. En otro aspecto, la invención se refiere a dichos cultivos celulares, tejidos, superficies y/o disoluciones que comprenden un péptido artificial de la invención, tal como se ha descrito anteriormente. Dichos cultivos celulares, tejidos, superficies y/o disoluciones tendrán de este modo actividad de inducción/estimulación de la mineralización y/o la biomineralización. Proporcionando una sal mineral a dicho cultivo celular, tejido, superficie y/o disolución, se obtendrá una estructura mineralizada. Por tanto, para propósitos in vitro, se añade una sal mineral, no siendo necesario in vivo debido a que la sal está disponible de forma natural en el organismo.

Como se ha mencionado anteriormente, los péptidos artificiales de la invención se pueden usar para inducir la precipitación mineral y/o la biomineralización sobre una superficie. Los ejemplos preferidos de dichas superficies son superficies metálicas, tales como de titanio, zirconio, aluminio, tántalo, oro, acero quirúrgico y níquel, o cualquier otro metal descrito en la presente memoria, y o superficies de óxido metálico, hidróxido metálico y/o hidruro metálico. Los ejemplos de superficies de óxido metálico incluyen, aunque sin limitación, óxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de tántalo u óxido de zirconio. Otras superficies preferidas incluyen apatito de hidroxilo, aragonito, biovidrio, vidrio, poliuretano y superficies de dispositivos prostéticos médicos poliméricos. Los ejemplos preferidos de superficies también incluyen superficies de dispositivos prostéticos médicos, tales como superficies de dispositivos prostéticos médicos metálicos, de óxido metálico y poliméricos. Asimismo, las superficies particularmente preferidas incluyen todos los tipos de superficies biológicas, tales como superficie de raíz de diente, superficie de esmalte dental, una superficie ósea, una superficie de injerto, una superficie de una herida, etc.

En otro aspecto de la invención se puede usar un péptido artificial de la invención para la inducción y/o la estimulación de la mineralización de un cultivo celular para el crecimiento de tejidos que comprenden células para implante, tales como osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, fibroblastos, células madre, tales como células madre embrionarias y mesenquimales, y células progenitoras, omnipotentes, pluripotentes y multipotentes, células musculares, adipocitos, células de cartílago o ligamento. Suministrando también una sal mineral como las mencionadas anteriormente el tejido cultivado puede ser mineralizado antes de la implantación. Para este propósito se puede proporcionar un péptido artificial de la invención en disolución en el medio de cultivo celular y/o unido a la placa de cultivo celular.

Otro ejemplo de una superficie de acuerdo con la invención es una superficie de separación en columna. Dicha superficie puede, junto con un péptido artificial de la invención, ser usada para la separación de mineral y metales tóxicos de la sangre. Dicha superficie también puede usarse para la precipitación de calcio y otros minerales a partir de líquidos, tales como líquidos de infusión.

En otro aspecto de la presente invención, la mineralización y/o biomineralización es inducida y/o estimulada en presencia de una superficie que comprende un péptido artificial de la invención. Esto se debe a que la estimulación y/o la inducción de la mineralización y/o la biomineralización pueden ser inducidas no solo sobre la propia superficie, sino también en las proximidades de la superficie.

La presente invención también se refiere a un método para proporcionar una superficie inductora y/o estimuladora de la precipitación mineral y/o de la biomineralización, que comprende las etapas de:

a): proporcionar una superficie que va a ser mineralizada;

b): proporcionar un péptido artificial de la invención;

c): poner en contacto dicho péptido con dicha superficie para proporcionar dicho péptido sobre dicha superficie.

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Este método también puede comprender opcionalmente la etapa adicional de sumergir dicha superficie con dicho péptido en una disolución que comprende una sal mineral, tal como una sal de fosfato de calcio y/o de carbonato de calcio. Las superficies preferidas para la presente invención han sido descritas en esta memoria.

De acuerdo con la presente invención, se puede usar un péptido artificial para la inducción in vivo de la formación y/o regeneración de tejido óseo, cartilaginoso, cemento y/o dental.

En una realización preferida, la etapa c) del método anterior se lleva a cabo usando una corriente eléctrica. En este caso, preferiblemente, el pH de un electrolito que comprende al péptido está por debajo del pI del péptido, la corriente por debajo de 20 V, la densidad de carga entre 0,1 y 1000 mA por centímetro cuadrado. Preferiblemente, la temperatura oscila entre temperatura ambiente y 60 grados Celsius. El pH puede ajustarse con cualquier ácido, preferiblemente ácido acético u otro ácido orgánico (ácido tartárico, ácido maleico, ácido oxálico, etc.), pero también es posible usar HCl, HF y H_{3}PO_{4}. Preferiblemente, el electrolito comprende entre 0,005 y 1,0 M de una sal, preferiblemente una sal que contenga calcio, pero también es posible usar NaCl u otras sales.

La presente descripción también se refiere a un método para la inducción y/o estimulación in vivo de la biomineralización en presencia de un dispositivo prostético médico, tal como sobre el dispositivo prostético médico o en el tejido circundante, en un sujeto, que comprende las etapas de:

a): proporcionar una superficie de dispositivo prostético médico inductora y/o estimuladora de la precipitación mineral y/o la biomineralización producida mediante un método como el descrito anteriormente;

b): implantar dicho dispositivo prostético médico en dicho sujeto.

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Cuando se usa el péptido de acuerdo con la invención para inducir la biomineralización de un dispositivo prostético médico, se pueden utilizar diferentes estrategias. Independientemente de la estrategia elegida, la primera etapa siempre consiste en recubrir el dispositivo prostético médico con el péptido, tal como se ha descrito en el presente documento. La siguiente etapa puede ser sumergir el dispositivo prostético médico en una disolución que comprenda al menos una sal mineral para propósitos in vitro, tal como se ha descrito previamente. Así, el mineral se deposita sobre la superficie del dispositivo prostético médico, proporcionando una superficie mineralizada. Después, el dispositivo prostético médico se implanta en un sujeto, en donde el péptido artificial y los focos de nucleación de la superficie producen una deposición mineral adicional in vivo. En una estrategia alternativa, el dispositivo prostético médico se recubre primero con el péptido, tal como se ha mencionado anteriormente. A continuación, el dispositivo prostético médico es implantado en un sujeto, donde el péptido ayuda a la deposición mineral sobre la superficie del dispositivo prostético médico.

Se puede usar cualquier método adecuado conocido por el especialista en la técnica para la unión de un péptido de acuerdo con la invención a una superficie. Un ejemplo de un método preferido para la unión de los péptidos se describe, por ejemplo, en Hayakawa y col. (Hayakawa, T., Yoshinari, M., y Nemoto K. Direct attachment of fibronectin to tresyl chloride-activated titanium. J. Biomed Mater Res A, 2003, 67 (2): 684-8), que describe el uso de cloruro de tresilo para unir un péptido a la superficie del implante de titanio. Este método proporciona un liberación limitada del péptido desde la superficie y se usa en el ejemplo 5 de la sección experimental. Otro método preferido para unir un péptido de acuerdo con la invención a una superficie se describe en Imamura y col. (Imamura, K. Kawasaki, Y., Nagayasu, T., Sakiyama, T., y Nakanishi, K. Adsorption characteristics of oligopeptides composed of acidic and basic amino acids on titanium surface. J. Biosci Bioeng, 2007, 103 (1): 7-12), que describe el uso de las propiedades naturales de los péptidos para adherirse a una superficie de titanio a través de sus grupos carboxílicos cargados negativamente. Este modo de unión de un péptido de acuerdo con la invención con una superficie se ilustra en el ejemplo 6 de la sección experimental, y proporciona una adsorción pasiva y una liberación de los péptidos hacia el interior de los tejidos y/o células que circundan al implante. Como se ha mencionado aquí anteriormente, un péptido de acuerdo con la invención también puede unirse a una superficie mediante el uso de etiquetas N- y/o C-terminales que comprenden los aminoácidos His y/o Met.

Existen varios modos disponibles para el especialista en la técnica para investigar si la formación de hueso se produce sobre y/o alrededor de un implante con un péptido de acuerdo con la invención. Un modo de detectar el nivel de actividad de células osteoblásticas en un tejido con un implante es detectar los niveles de factor transcripcional runx2/Cbfa-1, que regula la expresión de genes de proteína de matriz extracelular ósea que codifican para la sialoproteína, osteocalcina y colágeno tipo I de los huesos (Lian y col., Current Pharmaceutical Design, 2003, 9, 2677-2685). También se puede usar la expresión de TRAP (del inglés "Tartrate-Resistant Acid Phosphatase") para estudiar la resorción ósea mediante células osteoclásticas en tejidos, en donde un descenso de la expresión de TRAP es indicativo de una resorción ósea reducida. Por tanto, el perfil de expresión de TRAP es indicativo de la presencia de osteoclastos diferenciados en la interfaz hueso-implante (Minkin y col., "Role of the osteoclast at the bone-implant interface" Adv Dent Res 13: 49-56, Junio, 1999).

La actividad de LDH (lactato deshidrogenasa) puede usarse en el contexto de la presente invención para investigar la biocompatibilidad de un implante con un péptido de acuerdo con la invención, en donde una disminución de la actividad indica una mejora de la biocompatibilidad. La actividad de LDH está presente en el fluido de la lesión, que es liberado desde el tejido óseo inflamado, y que puede usarse como marcador de necrosis de tejido en la interfaz hueso-implante. (Michael Messieh, "Synovial Fluid levels of Lactate Dehydrogenase in Patients with Total Knee Arthroplasty", The Journal of Arthroplasty, Vol. 11, Nº4, 1996; Michael Messieh, Levels of Lactate Dehydrogenase in Osteoarthritic and Failed Total Knee Joints, The Journal of Arthroplasty Vol. 11, Nº3, 1996).

En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para la inducción y/o estimulación in vivo de la biomineralización que comprende la administración de un péptido artificial o de una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial como se ha descrito en la presente memoria a un sujeto que lo necesite. Con el fin de lograr esto, se administra al tejido de interés un péptido artificial de la invención, solo o formando parte de una composición farmacéutica como se ha descrito en la presente memoria. El péptido puede administrarse en cualquier forma adecuada dependiendo del uso pretendido, tal como mediante inyección sistémica y/o local y/o perfusión. Si se administra un péptido de la invención a un tejido, puede inducir la biomineralización y la formación adicional de hueso. Los ejemplos de tejido de interés en el presente contexto incluyen huesos, cartílagos, cemento y dientes. Los ejemplos de condiciones que pueden conducir a fracturas óseas incluyen, aunque sin limitación, resección ósea, por ejemplo en traumas, tumores, quistes, e infecciones o inflamaciones, tales como periodontitis, periimplantitis u ostitis. El péptido de acuerdo con la invención puede administrarse a un sujeto que lo necesite y que padezca una condición de este tipo. El péptido, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente se aplica directamente al tejido. También se puede aplicar un péptido artificial de la invención a un tejido o cultivo celular in vitro con el fin de inducir la precipitación mineral. En ambas situaciones, in vivo e in vitro, los ejemplos de células para las que tiene interés la administración de un péptido de la invención son osteoblastos, osteocitos, osteoclastos, fibroblastos, células madre, tales como células madre embrionarias y mesenquimales, y células progenitoras, omnipotentes, pluripotentes y multipotentes, células musculares, adipocitos, células de cartílago y ligamento.

Sin pretender establecer una teoría al respecto, es posible vislumbrar que un péptido de la inducción puede inducir la formación de hueso mediante el inicio de la precipitación de fosfato cálcico y/o mediante la estimulación de células implicadas en la formación de estructuras óseas, tales como los osteoclastos o los osteoblastos. Los experimentos llevados a cabo por los inventores han demostrado que los péptidos que comprenden un péptido de consenso de la invención pueden unirse al calcio. Asimismo, los experimentos han demostrado que una secuencia de consenso de acuerdo con la invención puede unirse a un receptor implicado en el proceso de biomineralización.

Un péptido de la invención y/o una composición farmacéutica que comprende dicho péptido pueden ser administrados a un sujeto que lo necesite mediante cualquier ruta adecuada dependiendo del tejido al que se vaya a administrar el péptido, por ejemplo mediante administración tópica (dérmica), oral, bucal, nasal, aural, rectal o vaginal, o mediante administración a una cavidad del cuerpo tal como, por ejemplo, una raíz de diente, un canal de raíz de diente o una fractura ósea. Además, se puede adaptar una composición para la administración en relación con una cirugía, por ejemplo en relación con una incisión en el organismo. Los péptidos de la invención también pueden administrarse mediante inyecciones locales, mediante aplicación en un gel o a través de un dispositivo médico, tal como un dispositivo prostético médico, por ejemplo, un injerto, una estructura soporte o un material de biovidrio. También es posible administrar péptidos mediante partículas de alginato o quitosán (liberación lenta), una pasta de dientes (que permitiría la remineralización de esmalte junto con fluoruro), en un champú (con calcio, que proporcionaría una composición de fortalecimiento y/o espesamiento del cabello), en un material de relleno dental (material compuesto o en combinación con materiales de relleno de raíz para la inducción de curación ósea aplicable al diente). Si se administra localmente, como tal o en una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención, en el interior de, por ejemplo, una fractura, un defecto periodontal, procedimiento de elevación de alveolos o senos de extracción, los péptidos de la invención pueden mejorar y/o acelerar la curación ósea en los casos. Los péptidos probablemente actúan induciendo deposiciones minerales que actúan como "siembras" para la formación de hueso adicional, incluyendo la diferenciación y la maduración de células óseas.

Para la administración para el tratamiento de la osteoporosis, el péptido puede encapsularse y ser liberado oralmente mediante digestión, a través de la cavidad nasal o los pulmones por inhalación o mediante inyección en la sangre, en el fluido espinal (fracturas espinales), en articulaciones (para curar defectos de cartílago o cambios degenerativos en superficies articulares) o intraperitonealmente como un depósito de liberación lenta.

En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido artificial como el definido en la presente memoria para su uso como medicamento. En particular, la invención se refiere al uso del péptido artificial y/o composición farmacéutica para la preparación de un medicamento para la inducción de biomineralización. En particular, la invención también se refiere al uso de un péptido artificial y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial para la preparación de un medicamento para la formación y/o regeneración de hueso. En una realización particular, la invención también se refiere al uso de un péptido artificial y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial para la preparación de un medicamento para la formación y/o regeneración de tejido óseo, cartilaginoso, cemento y/o dental. Los péptidos de la invención y/o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos también pueden usarse para la preparación de medicamentos para el tratamiento de osteoporosis, fracturas, periodontitis, traumas, síndrome metabólico óseo, pulitis, lesiones dentales apicales, etc.

Los péptidos de la invención y/o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos también pueden usarse para la preparación de un medicamento para la curación de fracturas óseas.

En un aspecto, la invención también se refiere a un péptido artificial y/o a una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial como el descrito en la presente memoria para su uso en la inducción de la biomineralización. Por ejemplo, se puede usar un péptido artificial y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para la formación y/o la regeneración de tejido óseo, cartilaginoso, cemento y/o dental.

En otro aspecto, la invención se refiere a un péptido artificial y/o a una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial como el descrito en la presente memoria para su uso en la formación y/o regeneración de huesos.

En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un péptido artificial y/o a una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial como el descrito en la presente memoria para su uso en la curación de fracturas óseas.

Los péptidos artificiales de la invención también pueden usarse en combinación con péptidos naturales que inducen la precipitación mineral y/o la biomineralización y/o la formación de huesos, tal como las amelogeninas. También es posible usar una combinación de dos o más péptidos de la invención para la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral, incluyendo la biomineralización.

Los péptidos artificiales de la invención también pueden usarse para la fusión de dos estructuras biomineralizadas, o para la fusión de una estructura biomineralizada con otro material. Los ejemplos de dichos materiales incluyen biomateriales implantables, tales como titanio y acero, biovidrio, fosfatos de calcio, apatito, etc. Otros ejemplos incluyen material para columnas, materiales para filtros, etc.

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Sección experimental Ejemplo 1 Un recubrimiento inductor de mineralización basado en péptidos sobre una superficie de titanio

Se unieron ocho implantes con forma de moneda con un diámetro de 6,25 mm a un electrodo de titanio y se sumergieron en un electrolito esterilizado que contiene NaCl 0,5 M, ajustado a pH 8,0 mediante el uso de NaOH 1,0 M, y un péptido de poli-prolina sintético diseñado para estimular la nucleación de cristales de fosfato de calcio. El péptido, que tiene un pI de 5,82, tenía la siguiente secuencia: PLV PSY PLV PSY PLV PSY PYP PLPP (SEC ID Nº: 3), y se aplicó a una concentración final de 0,01 mg/mL en el electrolito. El electrodo se unió a la toma positiva de una fuente de alimentación y se aplicó durante ocho horas una corriente eléctrica de 10 voltios a 100 mA a una temperatura de célula de 40 grados Celsius. El proceso electrolítico produjo un recubrimiento delgado de péptidos sobre la superficie de titanio oxidado visible como una precipitación grisácea. Tras el recubrimiento los especímenes de titanio fueron aclarados con agua esterilizada y posteriormente fueron colocados en recipientes de vidrio esterilizados donde se dejó que secaran al aire. Como control se produjeron ocho especímenes de titanio tratados de forma idéntica a los especímenes de ensayo pero sin añadir péptidos al electrolito. Tras el secado, los especímenes de titanio (los recubiertos con péptido y los de control) fueron sumergidos en 50 mL de una disolución saturada de fosfato de calcio a 50 grados Celsius. A continuación se dejó que la disolución se enfriara hasta temperatura ambiente y se incubó a 25 grados Celsius durante 48 horas. A continuación se extrajo a los especímenes de titanio de la disolución, se aclararon brevemente con agua esterilizada y se secaron al aire en un desecador. Una vez secos, los implantes fueron analizados directamente mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para la determinación cuantitativa y cualitativa del número y naturaleza de focos de precipitación mineral presentes sobre las superficies. El número de unidades de formación mineral (ufm) sobre la superficie se corresponde directamente con el número de posiciones de nucleación mineral presentes sobre la superficie durante los experimentos.

Los resultados (Tabla 1) demuestran que los especímenes de titanio que tenían sus superficies recubiertas con el péptido sintético de poli-prolina tenían un número significativamente (p<0,01) mayor de focos de deposición mineral. El mineral depositado tenía un elevado contenido de Calcio y Fósforo (análisis elemental mediante SEM-EDX), lo que indica que las deposiciones eran todas de fosfato cálcico. Esto es una clara evidencia de que el péptido sintético usado aquí influye positivamente en la formación de la deposición mineral ósea sobre superficies de titanio.

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TABLA 1 Número de unidades de formación mineral (ufm) por mm cuadrado de superficie de titanio determinado mediante SEM. Los valores por encima de 10.000 se registran como "confluente"

1

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Ejemplo 2 Un recubrimiento de péptido artificial de poli-prolina que promueve la precipitación mineral sobre una superficie de un implante médico de titanio

Se usó una capa de un péptido sintético de poli-prolina con la secuencia PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLPP (SEC ID Nº: 4) y un pI de 5,55, que tiene el potencial de actuar como nucleador biológico de la formación mineral, para recubrir implantes médicos fabricados en titanio. Se usó el péptido para recubrir ocho implantes dentales esterilizados con un área superficial total de aproximadamente 1 centímetro cuadrado usando una célula galvánica. El electrolito usado fue NaCl 1M en agua esterilizada con un pH ajustado a pH 2 mediante HCl, y la concentración inicial de poli-prolina sintética fue 0,1 mg por mL de electrolito. Se usó un voltaje de 10 voltios con una densidad de corriente de 1 mA/cm^{2}. A este pH, el péptido de poli-prolina se carga negativamente y migra hacia el electrodo positivo al que están unidos los implantes. El proceso se llevó a cabo a temperatura ambiente. Se dejó que la electrolisis progresara durante 4 horas después de lo cual se retiraron los implantes de titanio de la célula galvánica, fueron aclarados con agua esterilizada y secados al aire en un desecador. En una instalación idéntica se produjeron ocho implantes de control, sin péptido artificial de poli-prolina. Tras el secado, los implantes de titanio (recubiertos con péptido y de control) fueron sumergidos en 50 mL de una disolución saturada de fosfato cálcico a 50 grados Celsius. A continuación la disolución se dejó enfriar a temperatura ambiente y se incubó a 25 grados Celsius durante 24 horas. A continuación los especímenes de titanio fueron sacados de la disolución, aclarados brevemente con agua esterilizada y secados al aire en un desecador. Una vez secos, los implantes fueron analizados directamente mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) para la determinación cuantitativa y cualitativa del número y naturaleza de los focos de precipitación mineral presentes en sus superficies. El número de unidades de formación mineral (ufm) sobre la superficie se corresponde directamente con el número de posiciones de nucleación mineral presentes sobre la superficie durante los experimentos.

Los resultados (Tabla 2) demuestran que los implantes de titanio que tenían sus superficies recubiertas con el péptido sintético de poli-prolina presentaban un número significativamente (p<0,01) mayor de focos de deposición mineral. El mineral depositado tenía un alto contenido de Calcio y Fósforo (análisis elemental mediante SEM-EDX), lo que indica que las deposiciones eran todas de fosfato de calcio. Las superficies de los implantes metálicos que tienen la capacidad de inducir y promover la nucleación y deposición de mineral óseo (fosfatos de calcio) sobre sus superficie probablemente funcionarán mejor clínicamente que otros implantes. Se cree que un aumento de la velocidad de deposición mineral ósea sobre la superficie del implante acelera la oseointegración del implante y estimula la curación del tejido óseo circundante. Se considera que una oseointegración apropiada es la clave de un resultado clínico exitoso en tratamientos con implantes ortopédicos y dentales.

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TABLA 2 Número de unidades de formación mineral (ufm) por mm cuadrado de superficie de implante

2

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Ejemplo 3 Evaluación de los implantes de titanio que tienen una biocompatibilidad mejorada mediante deposición electrolítica de un péptido de consenso sobre su superficie

Se unieron ocho implantes mecanizados con forma de moneda con un diámetro de 6,25 mm a un electrodo de titanio y se sumergieron en un electrolito esterilizado que contiene NaCl 0,5 M, ajustado a pH 8,0 mediante el uso de NaOH 1,0 M, y que contiene 0,1 mg/mL de un péptido artificial de la invención (pI < 8,0, los péptidos son anfolitos que tienen una carga neta negativa cuando el pH es superior al pI de la molécula). El electrodo se une a la toma positiva de una fuente de alimentación, usando una densidad de carga de 1 mA/cm^{2}. El proceso electrolítico producirá una delgada capa de óxido de titanio que contiene el péptido de consenso sobre las superficies de los implantes. Se dejará que el proceso continúe durante dos horas a temperatura ambiente. Tras la electrolisis, los implantes serán lavados en agua esterilizada y posteriormente se colocarán en recipientes de vidrio esterilizados en donde se dejarán secar al aire. A modo de control, se tratarán ocho implantes paralelos del mismo modo pero en un electrolito sin péptido de consenso.

Los implantes con superficies recubiertas con péptido de consenso (n=8) y los controles (n=8) serán colocados en defectos óseos corticales calibrados en tibias de conejos (conejo Blanco de Nueva Zelanda). Se realizará una pequeña incisión central en la médula ósea debajo de cada implante para permitir la migración de células osteogénicas hacia las superficies de los implantes. Los métodos usados serán todos de acuerdo a un modelo estandarizado y validado establecido para el estudio de unión de hueso a superficies de implante de titanio (Ronold, H.J. y Ellingsen, J.E. The use of a coin shaped implant for direct in situ measurement of attachment strength for osseointegrating biomaterial surfaces. Biomaterials 23: 2201-2209 (2002)). Cada conejo recibirá cuatro implantes, dos en cada tibia. La localización de los implantes de ensayo y de control será aleatoria en un ensayo de "operador ciego". A las seis semanas del implante, los conejos serán sacrificados y se extraerán los huesos de tibia con los implantes unidos a ellos. Directamente después de la extracción, los huesos de tibia se fijarán a una plantilla especialmente diseñada, y el implante será separado usando un procedimiento de separación calibrado y midiendo la fuerza de la unión entre el implante y el hueso. La fuerza necesaria para la separación de los implantes se registrará en Newtons (N).

Se espera que los resultados demuestren que los implantes de titanio que tenían superficies recubiertas con un péptido de consenso estén unidas más fuertemente al hueso cortical que los implantes de control no tratados después de seis semanas de curación. Este resultado será clínicamente importante, ya que la unión ósea temprana es un indicio de un menor tiempo de curación ósea. Esto sería importante para obtener resultados clínicos exitosos en estrategias de "carga temprana" en tratamientos de implantes ortopédicos y dentales.

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Ejemplo 4 Preparación de una superficie de implante de titanio osteoconductiva que contiene un péptido de consenso

Se unieron ocho implantes mecanizados con forma de moneda con un diámetro de 6,25 mm a un electrodo de titanio y se sumergieron en un electrolito esterilizado que contiene NaCl 0,5 M, ajustado a pH 5,0 mediante el uso de HCl 1,0 M, y que contiene 0,01 mg/mL de un péptido artificial de la invención (pI>5,0, los péptidos son anfolitos que tienen una carga neta positiva cuando el pH es inferior al pI de la molécula). El electrodo se une a la toma negativa de una fuente de alimentación, usando una densidad de carga neta en la superficie del implante de 1 mA/cm^{2}. El proceso electrolítico producirá superficies de implante con un recubrimiento fino del péptido de consenso. Tras la electrolisis, los implantes serán lavados en agua esterilizada y posteriormente se colocarán en recipientes de vidrio esterilizados en donde se dejarán secar al aire. Se tratarán ocho implantes del mismo modo, pero sin el péptido de consenso, y se incluirán como controles.

Los implantes con superficies recubiertas con péptido de consenso (n=8) y los controles (n=8) serán colocados en defectos óseos corticales calibrados en tibias de conejos (conejo Blanco de Nueva Zelanda). Se realizará una pequeña incisión central en la médula ósea debajo de cada implante para permitir la migración de células osteogénicas hacia las superficies de los implantes. Los métodos usados serán todos de acuerdo a un modelo estandarizado y validado establecido para el estudio de unión de hueso a superficies de implante de titanio (Ronold, H.J. y Ellingsen, J.E. The use of a coin shaped implant for direct in situ measurement of attachment strength for osseointegrating biomaterial surfaces. Biomaterials 23: 2201-2209 (2002)). Cada conejo recibirá cuatro implantes, dos en cada tibia. La localización de los implantes de ensayo y de control será aleatoria en un ensayo de "operador ciego". A las cuatro semanas del implante, los conejos serán sacrificados y se extraerán los huesos de tibia con los implantes unidos a ellos. Directamente después de la extracción, los huesos de tibia se fijarán a una plantilla especialmente diseñada, y el implante será separado usando un procedimiento de separación calibrado y midiendo la fuerza de la unión entre el implante y el hueso. La fuerza necesaria para la separación de los implantes se registrará en Newtons (N).

Se espera que los resultados demuestren que los implantes de titanio que tenían superficies recubiertas con un péptido de consenso estén unidas más fuertemente al hueso cortical que los implantes de control no tratados después de cuatro semanas de curación. Este resultado será clínicamente importante, ya que la unión ósea temprana es un indicio de un menor tiempo de curación ósea. Esto sería importante para obtener resultados clínicos exitosos en estrategias de "carga temprana" en tratamientos de implantes ortopédicos y dentales.

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Ejemplo 5 Experimentos llevados a cabo con el Péptido: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLP P (SEQ ID Nº: 4) 1. Materiales y métodos 1.1. Monedas de titanio

Se lavaron y esterilizaron antes de ser usados implantes de titanio mecanizados comercialmente puros (cp) con un diámetro de 6,25 mm y una altura de 1,95 mm. Resumidamente, los implantes fueron lavados juntos en un vaso de precipitados de vidrio con agua desionizada durante 30 s, a continuación con etanol al 70% durante 30 s, y después en un baño de ultrasonidos a 40ºC durante 5 minutos en agua desionizada. Los implantes fueron colocados posteriormente en una disolución de NaOH al 40% en un baño de agua a 40ºC durante 10 minutos, sometidos a ultrasonidos en agua desionizada durante 5 minutos, y a continuación lavados con agua desionizada hasta que el pH llegó a 6. Después, los implantes fueron sometidos a ultrasonidos en agua desionizada a 50ºC durante 5 minutos, fueron llevados a una disolución al 50% de HNO_{3} a 50ºC durante 10 minutos, y sometidos a ultrasonidos en agua desionizada durante otros 5 minutos. Los implantes fueron lavados con agua desionizada hasta alcanzar pH=6 y fueron almacenados en etanol al 70%. Antes de ser usadas, las monedas fueron aclaradas con agua, aclaradas con etanol, sometidas a ultrasonidos durante 5 minutos a temperatura ambiente y aclaradas con agua desionizada. A continuación las monedas de titanio fueron esterilizadas mediante autoclave a 121ºC durante 15 minutos.

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1.2. Preparación de la disolución de péptido

El péptido (PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLP P) (SEC ID Nº: 4) fue disuelto en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) con un pH=7,4 a una concentración de 20 mg/mL. Esta disolución fue nuevamente disuelta en PBS hasta una concentración final de 0,1 mg/mL.

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1.3. Activación de los implantes de titanio con cloruro de tresilo y acoplamiento con el péptido

La superficie del implante de titanio mecanizado fue recubierta en primer lugar con 10 \muL de cloruro de tresilo (cloruro de 2,2,2-trifluoroetanosulfonilo) e incubada a 37ºC durante 2 días. A continuación, se lavó el implante de titanio trefilado con agua, agua-acetona (50:50) y acetona, y se secó en un desecador.

La disolución de péptido (10 \muL, 0,1 mg/mL) se aplicó a la superficie del implante de titanio y se incubó durante 24 h a 37ºC, a continuación se aclaró con agua. Finalmente, los implantes fueron secados en un desecador, empaquetados y almacenados a 4ºC.

Los implantes de control fueron activados con cloruro de tresilo pero sin añadir péptido posteriormente. El método usado para unir el péptido a los implantes de titanio con cloruro de tresilo fue adaptado de Hayakawa y col., 2003.

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1.4. Estudio con animales

En este estudio se usaron seis conejos hembra Blancos de Nueva Zelanda, de 6 meses de edad y con un peso de 3,0-3,5 kg (ESF ProdukterEstuna AB, Norrtälje, Suecia).

Los implantes con superficies recubiertas con el péptido de consenso (n=12) y los controles (n=12) fueron colocados en defectos óseos corticales calibrados en las tibias de los conejos (Blancos de Nueva Zelanda). Se practicó una pequeña incisión central en la médula ósea debajo de cada implante para permitir la migración de células osteogénicas a las superficies de los implantes. Los métodos usados fueron todos según un modelo estandarizado y validado establecido para el estudio de la unión ósea de superficies de implantes de titanio (Ronold y Ellingsen, 2002). Cada conejo recibió cuatro implantes, dos en cada tibia. La localización de los implantes de ensayo y de control fue aleatoria en un ensayo de "operador ciego". A las cuatro semanas del implante, los conejos fueron sacrificados y se extrajeron los huesos de tibia con los implantes unidos a ellos. Directamente después de la extracción, los huesos de tibia fueron fijados a una plantilla especialmente diseñada, y los implantes fueron separados usando un procedimiento de separación calibrado. A continuación los implantes fueron transferidos directamente a un tubo esterilizado y fueron procesados para extracción de ARN y de proteínas, para el análisis de expresión de marcadores óseos y necrosis.

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1.5. Expresión génica in vivo de marcadores óseos: runx2, osteocalcina y TRAP

La expresión génica de runx2, osteocalcina y TRAP fue estudiada usando RT-PCR en tiempo real como indicación de la formación de hueso (runx2, osteocalcina) o de la resorción ósea (TRAP) en el tejido óseo peri-implante unido a la superficie de los diferentes implantes.

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1.6. Análisis del fluido de la lesión: actividad LDH y proteína total

Se analizó la actividad LDH y la proteína total en el fluido de la lesión recolectado de la localización del implante después de un periodo de curación de 4 semanas. La liberación de LDH es un marcador sensible para la necrosis del tejido (Williams y col., 1983) y por tanto para la biocompatibilidad de los implantes. La cantidad de proteína total se usó para normalizar errores provocados por las diferencias en el número de células óseas en los implantes separados.

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2. Conclusión

Los implantes recubiertos con el péptido de consenso mostraron un aumento significativo en la expresión de osteocalcina, lo que indica que la actividad celular osteoblástica mejoró en estas muestras. Además, se observó un descenso en la expresión TRAP, lo que sugiere que la resorción ósea por células osteoclásticas se vio reducida significativamente en estas muestras. Estos efectos juntos contribuyen a un incremento neto de la formación ósea adyacente a los implantes recubiertos con el péptido de consenso. Además, el descenso de la actividad de LDH en el tejido periimplantado indica que la presencia del péptido de consenso mejoró significativamente la biocompatibilidad del implante de titanio. Estos resultados se muestran en las Figuras 1-4.

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Ejemplo 6 Experimentos llevados a cabo con el Péptido: PLV PSQ PLV PSQ PLV PSQ PQP PLP P (SEC ID Nº: 4) 1. Materiales y métodos 1.1. Monedas de titanio

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1.2. Preparación de la disolución de péptido

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1.3. Adsorción de péptido en los implantes de titanio (adsorción física)

Los péptidos pueden adsorberse físicamente sobre una superficie de titanio, como un método alternativo a la unión covalente. Los grupos carboxílicos cargados negativamente muestran una fuerte afinidad por las superficies de óxido metálico y por tanto pueden interactuar directamente con la superficie de titanio (Imamura y col., 2007). Se aplicó la disolución de péptido (10 \muL, 0,1 mg/mL) a la superficie del implante de titanio y se incubó durante 24 h a 37ºC. Después de 24 h, los implantes de titanio fueron aclarados y empaquetados con el mismo método descrito anteriormente. Los implantes de control fueron tratados con 10 \muL de PBS sin añadir péptido.

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1.4. Estudio con animales

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1.6. Análisis del fluido de la lesión: actividad LDH y proteína total

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2. Conclusión

Los implantes recubiertos con el péptido de consenso mostraron un aumento significativo en la expresión de marcadores pro-osteogénicos Osteocalcina y Runx2, lo que indica claramente que la actividad celular osteoblástica mejoró en estas muestras. Además, se observó un descenso en la expresión TRAP, lo que sugiere que la resorción ósea por células osteoclásticas se vio reducida significativamente en estas muestras. Estos efectos juntos contribuyen a un incremento neto de la formación ósea adyacente a los implantes recubiertos con el péptido de consenso. Además, el descenso de la actividad de LDH en el tejido periimplantado indica que la presencia del péptido de consenso mejoró significativamente la biocompatibilidad del implante de titanio. Estos resultados se muestran en las Figuras 5-8.

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Referencias

Branemark y col. "Osseointegrated medical prosthetic devices in the treatment of the edentulous jaw, Experience from a 10-year period", Almqvist & Wiksell International, Estocolmo, Suecia.

Svensson J, Andersson C, Reseland JE, Lyngstadaas SP, Bulow L. "Histidine tag fusion increase expression levels of active recombinant Amelogenin in Escherichia coli", Protein Expr Purif, 48; 134-41 (2006).

Haykawa, T., Yoshinari, M., y Nemoto K. "Direct attachment of fibronectin to tresyl chloride-activated titanium", J Biomed Mater Res A, 2003, 67 (2): 684-8.

Imamura, K., Kawasaki, Y., Nagayasu, T., Sakiyama, T., y Nakanishi, K. "Adsorption characteristics of oligopeptides composed of acidic and basic amino acids on titanium surface". J Biosci Bioeng, 2007, 103 (1): 7-12.

Lian y col., Current Pharmaceutical Design, 2003, 9, 2677-2685.

Minkin y col., "Role of the osteoclast at the bone-implant interface" Adv Dent Res 13: 49-56, Junio, 1999.

Michael Messieh, "Synovial Fluid levels of Lactate Dehydrogenase in Patients with Total Knee Arthroplasty", The Journal of Arthroplasty Vol. 11, Nº4, 1996.

Michael Messieh, "Levels of Lactate Dehydrogenase in Osteoarthritic and Failed Total Knee Joints", The Journal of Arthroplasty, Vol. 11, Nº3, 1996.

Ronold, H.J. y Ellingsen J.E., "The use of a coin shaped implant for direct in situ measurement of attachment strength for osseointegratin biomaterial surfaces". Biomaterials 23; 2201-2209 (2002).

Williams DL, Marks V. Biochemistry in Clinical Practice. Londres: William Heineman Medical Books; 1983.

<110> S. Peter Lyngstadaas

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Jan Eirik Ellingsen

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<120> Péptido de consenso

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<130> PD53793PC00

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<160> 8

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 92

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido de consenso

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(92)

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<223> Las posiciones 2-3, 9-10, 15-16, 18, 34-35, 37, 48-49, 56-57, 62-63, 68-69, 74, 77-84, 86-87, 89-92 pueden seleccionarse independientemente entre Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(92)

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<223> Las posiciones 5-7, 12-13, 20-25, 27-32, 39-41, 43-44, 46, 51, 53-54, 59-60, 65-66, 71 pueden seleccionarse independientemente entre Asn, Cys, Gln, Ser, Thr y Tyr

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<400> 1

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4

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<210> 2

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido de consenso

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(25)

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<223> Las posiciones 2-3, 8-9, 14-15, 23 pueden seleccionarse independientemente entre Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(25)

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<223> Las posiciones 5-6, 11-12, 17-18, 20 pueden seleccionarse independientemente entre Asn, Cys, Gln, Ser, Thr y Tyr

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 3

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<210> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 5

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9

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<210> 6

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 6

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11

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<210> 7

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 7

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12

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<210> 8

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<211> 25

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Péptido inductor de mineralización/biomineralización

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<400> 8

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13

Claims

1. Un péptido artificial que comprende la secuencia de aminoácidos Pro-X-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Y-Y-Y-Y-Pro-X-X-Pro-X-Pro-Y-Y-Y-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro-X-X-X-X-X-X-X-X-Pro-X-X-Pro-X-X-X-X (SEC ID Nº: 1), en la que

a): Pro es prolina;

b): X es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp y Val;

c): Y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Cys, Gin, Ser, Thr y Tyr.

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2. Un péptido artificial que comprende la secuencia de aminoácidos Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-X-X-Pro-Y-Y-Pro-Y-Pro-Pro-X-Pro-Pro (SEC ID Nº: 2), en la que

a): Pro es prolina;

c): Y es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, Cys, Gln, Ser, Thr y Tyr.

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3. Un péptido artificial de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7 ó SEC ID Nº: 8.

4. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende una etiqueta de histidina N-terminal y/o C-terminal.

5. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que además comprende una etiqueta de metionina N-terminal y/o C-terminal.

6. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4-5 que comprende una etiqueta de histidina y una etiqueta de metionina.

7. Una composición farmacéutica que comprende uno o más péptido(s) artificial(es) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y opcionalmente un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente
aceptable.

8. Una superficie, tal como una superficie de metal y/o de óxido, hidróxido y/o hidruro metálico, una superficie seleccionada del grupo que consiste en superficies de dispositivo prostético médico de apatito de hidroxilo, aragonito, biovidrio, vidrio, poliuretano y polimérica, una superficie de dispositivo prostético médico o una superficie biológica, que comprende un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y que opcionalmente comprende una sal mineral depositada sobre la misma.

9. El uso de un péptido artificial o de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la inducción y/o estimulación de la precipitación mineral, en donde la precipitación mineral es inducida y/o estimulada in vitro en un cultivo celular, en un tejido, sobre una superficie y/o en una disolución.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la superficie es una superficie metálica y/o de óxido, hidróxido y/o hidruro metálico, una superficie seleccionada del grupo que consiste en superficies de dispositivo prostético médico de apatito de hidroxilo, aragonito, biovidrio, vidrio, poliuretano y polimérica, una superficie de dispositivo prostético médico o una superficie biológica.

11. Un método para proporcionar una superficie inductora y/o estimuladora de la precipitación y/o la biomineralización que comprende las etapas de:

a): proporcionar una superficie que va a ser mineralizada;

b): proporcionar un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6;

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12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, que además comprende la etapa de sumergir dicha superficie con dicho péptido en una disolución que además comprende una sal mineral, tal como fosfato cálcico y/o carbonato cálcico.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en el que la etapa c) se lleva a cabo usando una corriente eléctrica.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que dicha superficie es una superficie metálica y/o de óxido, hidróxido y/o hidruro metálico, una superficie seleccionada del grupo que consiste en superficies de dispositivo prostético médico de apatito de hidroxilo, aragonito, biovidrio, vidrio, poliuretano y polimérica, o una superficie de dispositivo prostético médico.

15. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para su uso como medicamento.

16. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 para su uso en la inducción de biomineralización.

17. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la formación y/o regeneración de tejido óseo, cartilaginoso, cemento y/o dental.

18. Un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y/o una composición farmacéutica que comprende un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en la curación de fracturas óseas.

19. El uso de un péptido artificial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la fusión de dos estructuras biomineralizadas, o para la fusión de una estructura biomineralizada con otro material.