ES2350043T3 - Composiciones para producir, incrementar y mantener las respuestas inmunes contra epítopos restringidos de mhc de clase i, con fines profilácticos o terapéuticos. - Google Patents

Abstract

El uso de una composición de entrada que se administra directamente al sistema linfático de un mamífero, comprendiendo dicha composición de entrada un plásmido no replicante que codifica un inmunógeno y que comprende además un inmunopotenciador, comprendiendo el inmunógeno un antígeno o su fragmento inmunógeno; y una composición de amplificación que se administra directamente al sistema linfático del mamífero, comprendiendo dicha composición de amplificación un péptido de amplificación, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho antígeno, en el que la composición de entrada y la composición de amplificación no son iguales, y en el que la composición de entrada se administra al menos dos veces, en un curso de uno hasta aproximadamente siete días o como una infusión continua que tiene una duración de entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente 7 días para la fabricación de un medicamento de combinación de inmunización para la profilaxis o la terapia de enfermedades infecciosas o neoplásicas.

Description

Composiciones para producir, incrementar y mantener las respuestas inmunes contra epítopos restringidos de MHC de clase I, con fines profilácticos o terapéuticos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención descrita en este documento se refiere a composiciones para inducir una respuesta inmune restringida al MHC (acrónimo para el inglés "major histocompatibility complex"; complejo mayor de histocompatibilidad) clase I y controlar la naturaleza y la magnitud de la respuesta, promoviendo una intervención inmunológica eficaz en procesos patógenos. Más particularmente, se refiere a composiciones inmunógenas, su naturaleza y el orden, la temporización y la ruta de administración por las que se usan con eficacia.

Descripción de la técnica relacionada Precognición del Complejo Mayor de Histocompatibilidad y Linfocitos T Diana

Los linfocitos T (células T) son células inmunes específicas de antígeno que funcionan en respuesta a señales específicas de antígeno. Los linfocitos B y los anticuerpos que producen son también entidades específicas de antígeno. Sin embargo, a diferencia de los linfocitos B, los linfocitos T no responden a los antígenos que se encuentran en forma libre o soluble. Para que un linfocito T responda a un antígeno se requiere que el antígeno esté ligado a un complejo de presentación conocido como el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).

Las proteínas del MHC proporcionan los medios por los cuales los linfocitos T diferencian a las células naturales o "propias" de las células ajenas. Las moléculas MHC son una categoría de receptores inmunes que presentan epítopos peptídicos potenciales que son controlados posteriormente por los linfocitos T. Hay dos tipos de MHC, MHC clase I y MHC clase II. Los linfocitos T CD4^{+} se relacionan con las proteínas del MHC clase II y predominantemente tienen un fenotipo de ayudante mientras que los linfocitos T CD8^{+} se relacionan con las proteínas de MHC clase I y predominantemente tienen un fenotipo citolítico, pero cada uno de ellos también puede mostrar funciones reguladoras, particularmente depresivas. Ambos MHC son proteínas transmembrana estando la mayor parte de su estructura en la superficie externa de la célula. Además, ambas clases de MHC tienen un sitio de unión de péptido en sus partes externas. Es en este sitio en el que los pequeños fragmentos de proteínas, naturales o ajenos, se unen y se presentan al ambiente extracelular.

Las células llamadas células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés "antigen presenting cells") muestran antígenos frente a los linfocitos T usando el MHC. Los linfocitos T pueden reconocer a un antígeno, si está presentado en el MHC. Este requerimiento se llama restricción del MHC. Si no se muestra un antígeno por un MHC reconocible, el linfocito T no reconocerá y no actuará en la señal del antígeno. Los linfocitos T específicos para el péptido unido a MHC reconocible se unen a estos complejos de MHC-péptido y proceden en las siguientes etapas de la respuesta inmune.

Los péptidos correspondientes a epítopos restringidos nominales a MHC clase I o clase II están entre las formas más simples de antígeno que pueden administrarse para la inducción, amplificación u otra manipulación de la respuesta de los linfocitos T. A pesar de que se ha demostrado que los epítopos peptídicos son eficaces in vitro en la re-estimulación de líneas de linfocitos T cebadas in vivo, clones, o hibridomas de linfocitos T, su eficacia in vivo es muy limitada. Esto es debido a dos factores principales:

(1)

El pobre perfil farmacocinético (PK, "PharmacoKinetic") de los péptidos, originado por la rápida aclaración renal y/o la degradación in vivo, dando lugar a un acceso limitado a APC;

(2)

La insuficiencia de la señalización dependiente del receptor de linfocitos T inducido por antígeno (TCR) solo (señal 1) para inducir o amplificar una respuesta inmune fuerte y mantenida, y en particular una respuesta que consista en células Tc1 o Th1 (que producen IFN-\gamma y TNF-\alpha). Además, el uso de grandes dosis de péptido o adyuvantes de liberación lenta, para sortear el PK limitado asociado a los péptidos, puede provocar un grado variable de insensibilidad o "desviación inmune" a menos que sean usados conjuntamente ciertos adyuvantes inmuno-potenciadores o modulantes.

Resumen de la invención

La solicitud de patente internacional WO 01/30382 A1 se refiere a métodos para inducir y/o realzar las respuestas inmunes respecto a antígenos de tumores administrando el antígeno del tumor o el ácido nucleico que lo codifica directamente en un sitio linfático. El ejemplo de este documento de la técnica anterior describe un método para inducir una respuesta inmune que comprende administrar a un sitio linfático en un mono, una primera composición que comprende un vector ALVAC que codifica gp100 seguido de una inyección de refuerzo de un péptido gp100 modificado después de 14 días. La referencia describe que el vector ALVAC usado es un vector basado en el virus de la viruela del canario atenuado.

La solicitud de patente internacional WO 98/58956 A2 se refiere a métodos para inducir respuestas inmunes contra antígenos usando un virus para cebar la inmunización y péptidos de antígeno combinados con un adyuvante para la inmunización reforzadora. La solicitud de patente internacional WO 03/011331 A se refiere a un método para inducir una respuesta CTL específica pero universal a una pluralidad de epítopos, en la que se usan constructos de poliepítopo en la fase de cebado de un régimen de vacunación, pero en la que se usan inmunógenos que codifican o comprenden los epítopos individualmente para la fase de refuerzo.

Las realizaciones de la presente invención incluyen composiciones para la manipulación, y en particular para la inducción, entrada y/o amplificación de la respuesta inmune a los epítopos restringidos de MHC clase I y a su uso para la profilaxis de una terapia de infecciones o enfermedades neoplásicas.

Algunas realizaciones están relacionadas con el uso médico de la composición que comprende administrar a un mamífero una primera composición que incluye un inmunógeno, el inmunógeno codifica al menos una parte de un primer antígeno; y administrar una segunda composición, que incluye un péptido de amplificación, directamente al sistema linfático del mamífero, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho primer antígeno, en el que la primera composición y la segunda composición no son iguales, en el que la primera composición comprende un plásmido no replicante que codifica un inmunógeno y además comprende un inmunopotenciador, y en el que la primera composición se administra al menos dos veces en un curso de uno hasta aproximadamente siete días o como una infusión continua que tiene una duración de entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente siete días. Los métodos pueden incluir además la etapa de obtener, analizar o detectar y provocar la respuesta de los linfocitos T.

La primera composición puede incluir un ácido nucleico que codifica el antígeno o su fragmento inmunógeno. La primera composición puede incluir un ácido nucleico capaz de expresar el epítopo en un pAPC. La primera composición puede incluir un polipéptido inmunógeno y un inmunopotenciador, por ejemplo. El inmunopotenciador puede ser una citoquina, un ligando del receptor del tipo Toll, y otros similares. El adyuvante puede incluir una secuencia inmunoestimuladora, un ARN y otros similares.

El polipéptido inmunógeno puede ser dicho péptido amplificante. El polipéptido inmunógeno puede ser dicho primer antígeno. El polipéptido inmunógeno puede administrarse como un componente de un protozoo, bacteria, virus, vector viral, o partícula de tipo vírica, o similares. El adyuvante puede administrarse como un componente de un protozoo, bacteria, virus, vector viral o partícula de tipo vírica, o similares. La segunda composición puede estar sin adyuvante y sin inmunopotenciador. La etapa de administración incluye la administración directa al sistema linfático del mamífero. Las administraciones directas al sistema linfático del mamífero pueden incluir la administración directa a un nodo de linfa o vaso de linfa. La administración directa puede ser a dos o más nodos de linfa o vasos de linfa. El nodo de linfa puede ser, por ejemplo, nodos de linfa inguinales, axiliares, cervicales y tonsilares. La respuesta de los linfocito T efectores puede ser una respuesta de linfocitos T citotóxica. La respuesta de los linfocitos T efectores puede incluir la producción de una citoquina pro-inflamatoria, y la citoquina puede ser, por ejemplo, \gamma-IFN o TNF\alpha. La respuesta de los linfocitos T efectores puede incluir la producción de una quimioquina de linfocitos T, por ejemplo, RANTES o MIP-1\alpha, o similares.

El epítopo puede ser un epítopo constitutivo o un epítopo inmune, por ejemplo. La etapa de entrega o la etapa de administración pueden incluir una inyección de un solo bolo, inyecciones de bolo repetidas, por ejemplo. La etapa de entrega o la etapa de administración pueden incluir una infusión continua, la cual puede tener, por ejemplo, una duración entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente 7 días. El método puede incluir un intervalo entre la terminación de la etapa de administración y el principio de la etapa de administración, en el que el intervalo puede ser de al menos aproximadamente siete días. También, el intervalo puede estar entre aproximadamente 7 y aproximadamente 14 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 20 días, aproximadamente 25 días, aproximadamente 30 días, aproximadamente 40 días, aproximadamente 50 días o aproximadamente 60 días, por ejemplo. El intervalo puede ser a lo largo de aproximadamente 75 días, aproximadamente 80 días, aproximadamente 90 días, aproximadamente 100 días o más.

El primer antígeno puede ser un antígeno asociado a la enfermedad, y el antígeno asociado a la enfermedad puede ser un antígeno asociado a un tumor, un antígeno asociado a patógenos. Las realizaciones incluyen métodos para tratar la enfermedad utilizando el método descrito para inmunizar. El primer antígeno puede ser un antígeno asociado a una diana. La diana puede ser una célula neoplásica, una célula infectada por el patógeno, y otras similares. Por ejemplo, puede ser reconocida cualquier célula neoplásica. Las células infectadas por el patógeno pueden incluir, por ejemplo, células infectadas por una bacteria, un virus, un protozoo, unos hongos y otros similares, o células afectadas por un prión, por ejemplo.

La respuesta de los linfocitos T efectores puede detectarse por al menos un indicador, por ejemplo, un ensayo de citoquina, una prueba Elcan, un ensayo de citotoxicidad, un ensayo de tetrámero, una respuesta DTH, una respuesta clínica, encogimiento del tumor, aclaración del tumor, inhibición de la progresión del tumor, disminución del título del patógeno, aclaración del patógeno, mejora de un síntoma de la enfermedad y otros similares. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar una respuesta de linfocitos T efectores respecto al primer antígeno.

Otras realizaciones están relacionadas con métodos de inmunización que incluyen administrar a un mamífero una primera composición que incluye un ácido nucleico que codifica un primer antígeno o su fragmento inmunógeno; administrar una segunda composición, que incluye un péptido, directamente al sistema linfático del mamífero, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho primer antígeno. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar una respuesta de linfocitos T efectores respecto al antígeno.

También, las realizaciones se refieren a métodos para aumentar una respuesta inmune específica del antígeno existente. Los métodos pueden incluir administrar una composición, que incluye un péptido, directamente al sistema linfático de un mamífero, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho antígeno, y en el que dicha composición no fue usada para inducir la respuesta inmune. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar o analizar el aumento de una respuesta inmune específica de antígeno. El aumento puede incluir mantener la respuesta en el tiempo, reactivando a los linfocitos T inactivos, ampliando la población de linfocitos T específicos de antígeno y otros similares. En algunos aspectos, la composición puede no incluir a un inmunopotenciador.

Otras realizaciones se refieren a métodos de inmunización que pueden incluir administrar a un mamífero una primera composición que comprende un inmunógeno, el inmunógeno codifica al menos una parte de un primer antígeno y al menos una parte de un segundo antígeno; administrar una segunda composición que incluye un primer péptido, y una tercera composición que incluye un segundo péptido, directamente al sistema linfático del mamífero, en el que el primer péptido corresponde a un epítopo de dicho primer antígeno, y en el que el segundo péptido corresponde a un epítopo de dicho segundo antígeno, en el que la primera composición puede no ser la misma que la segunda o tercera composición. Los métodos además pueden incluir obtener, detectar o analizar una respuesta de linfocitos T efectores a dichos primero y segundo antígeno. Las segundas y terceras composiciones cada una pueden incluir el primer y segundo péptido. Las segundas y terceras composiciones pueden ser parte de una composición sencilla.

Otras realizaciones adicionales se refieren a métodos para generar una respuesta inmune tolerogénica o reguladora específica del antígeno. Los métodos pueden incluir administrar periódicamente una composición, que incluye un péptido sin adyuvante, directamente al sistema linfático de un mamífero, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho antígeno, y en el que el mamífero puede estar epitópicamente no infectado. Los métodos pueden incluir además obtener, detectar y analizar una respuesta inmune de linfocitos T tolerogénicos o reguladores. La respuesta inmune puede ayudar en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, por ejemplo. El trastorno inflamatorio puede ser, por ejemplo, una respuesta inmune restringida a MHC clase II. La respuesta inmune puede incluir la producción de una citoquina inmunodepresiva, por ejemplo, IL-5, IL-10, o TGB-beta y otros similares.

Las realizaciones se refieren a métodos para la inmunización que incluyen administrar una serie de dosis inmunógenas directamente en el sistema linfático de un mamífero, en el que la serie puede incluir al menos 1 dosis de entrada y al menos 1 dosis de amplificación, y en el que la dosis de entrada puede incluir un ácido nucleico que codifica un inmunógeno y en el que la dosis de amplificación puede ser sin ningún virus, vector viral o vector competente por replicación. Los métodos pueden incluir además obtener una respuesta inmune específica al antígeno. Los métodos pueden incluir, por ejemplo, 1-6 dosis de entrada. El método puede incluir administrar una pluralidad de dosis de entrada, en el que dichas dosis son administradas en un curso de uno hasta aproximadamente siete días. Las dosis de entrada, dosis de amplificación, o dosis de entrada y de amplificación pueden ser administradas en múltiples pares de inyecciones, en el que un primer miembro de un par puede administrarse aproximadamente 4 días después de un segundo miembro del par, y en el que un intervalo entre primeros miembros de pares diferentes puede ser al menos aproximadamente 14 días. Un intervalo entre una última dosis de entrada y una primera dosis de amplificación puede ser entre aproximadamente 7 y aproximadamente 100 días, por ejemplo.

Otras realizaciones se refieren a juegos de composiciones inmunógenas para inducir una respuesta inmune en un mamífero que incluye 1-6 dosis de entrada y al menos una dosis de amplificación, en el que las dosis de entrada pueden incluir un ácido nucleico que codifica un inmunógeno, y en el que la dosis de amplificación puede incluir un epítopo peptídico, y en el que el epítopo puede ser presentado por la expresión de pAPC del ácido nucleico. La dosis además puede incluir un adyuvante, por ejemplo, ARN. La dosis de entrada y de amplificación pueden estar en un vehículo adecuado para la administración directa al sistema linfático, un nodo de linfa y otros similares. El ácido nucleico puede ser un plásmido. El epítopo puede ser un epítopo HLA clase I, por ejemplo, uno presente en la lista de las Tablas 1-4. El HLA preferentemente puede ser HLA-A2. El inmunógeno puede incluir una serie de epítopo, cuya serie puede incluir una secuencia de liberación. El inmunógeno puede consistir esencialmente en un antígeno asociado a la diana. El antígeno asociado a la diana puede ser un antígeno asociado a un tumor, un antígeno microbiano, cualquier otro antígeno y otros similares. El inmunógeno puede incluir un fragmento de un antígeno asociado a la diana que puede incluir un grupo de epítopo.

Otras realizaciones pueden incluir juegos de composiciones inmunógenas que inducen una respuesta inmune restringida a MHC clase I en un mamífero que incluye 1-6 dosis de entrada y al menos una dosis de amplificación, en el que las dosis de entrada pueden incluir un ácido nucleico que codifica un inmunógeno y un inmunopotenciador, y en el que la dosis de amplificación puede incluir un epítopo peptídico, y en el que el epítopo puede presentarse por pAPC. El ácido nucleico que codifica el inmunógeno puede incluir además una secuencia inmunoestimuladora que sirve como agente inmunopotenciador. El agente inmunopotenciador puede ser, por ejemplo, un ligando de TLR, una secuencia inmunoestimuladora, un ADN que contiene CpG, un dsRNA, un ligando endocítico del Receptor de Reconocimiento de Patrones (PRR, "Pattern Recognition Receptor"), un LPS, una madera de Panamá, tucaresol, una citoquina proinflamatoria y otros similares.

Otras realizaciones se refieren a métodos para generar varios perfiles de citoquina. En algunas realizaciones de la presente invención, puede ser eficaz la administración intranodular del péptido en la amplificación de una respuesta inicialmente inducida con una vacuna de ADN de plásmido. Además, el perfil de citoquina puede ser distinto, dando lugar generalmente la inducción del ADN de plásmido/amplificación del péptido a más quimioquina (citoquina quimiotáctica) y menos producción de citoquina inmunodepresiva que los protocolos de péptido/péptido o ADN/ADN.

Otras realizaciones más se refieren a usos de un péptido en la fabricación de un medicamento sin adyuvante para uso en un protocolo de inmunización de entrada y amplificación. Las composiciones, los kits, los inmunógenos y los compuestos pueden usarse en medicamentos para el tratamiento de diversas enfermedades, para amplificar las repuestas inmunes, generar perfiles de citoquina particulares, y otros similares, como se describe en este documento. Las realizaciones se refieren al uso del péptido sin adyuvante en un método para amplificar una respuesta inmune.

Las realizaciones se refieren a usos, y composiciones, relacionadas con epítopos con especificidad para MHC, incluyendo, por ejemplo, los expuestos en la lista de las Tablas 1-4. Otras realizaciones incluyen uno o varios de MHC expuestos en la lista de las Tablas 1-4, que incluyen combinaciones del mismo, mientras otras realizaciones excluyen expresamente a alguno o más de los MHC o sus combinaciones. Las tablas 3-4 incluyen frecuencias para los antígenos HLA expuestos en la lista.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 A-C: Inducción de respuestas inmunes por inmunización intralinfática.

La Figura 2 representa ejemplos de protocolos para controlar o manipular la inmunidad frente a epítopos restringidos de MHC clase I por la administración dirigida (nodo de linfa) del antígeno.

La figura 3 representa una perspectiva visual en pocillos representativos correspondientes a los datos descritos en la Figura 4.

La figura 4 representa la magnitud de la respuesta inmune que resulta de la aplicación de los protocolos descritos en la Figura 2, medida por ELISPOT y expresada como el número (la frecuencia) de linfocitos T productores de TFN-\gamma (gamma) que reconocen el péptido.

La figura 5 muestra el perfil citotóxico de linfocitos T generados por la administración reconocida del antígeno, como se describe en la Figura 2.

La figura 6 representa la reactividad específica de linfocitos T restringidos de MHC clase I generados por el protocolo representado en la Figura 2.

La figura 7A muestra el perfil de inmunidad, expresado como la capacidad de los linfocitos de producir a miembros de tres clases de modificadores de la respuesta biológica (citoquinas pro-inflamatorias, quimioquinas o agentes quimiotácticos y citoquinas reguladoras inmune o supresoras), subsecuente a la aplicación de los protocolos de inmunización descritos en la Figura 2.

La figura 7B muestra el fenotipado del marcador de superficie celular por citometría de flujo para los linfocitos T generados por los protocolos de inmunización descritos en la Figura 2. La administración repetida de péptido a los nodos de linfa induce la desviación inmune y los linfocitos T reguladores.

La figura 8A y B muestran la frecuencia de linfocitos T específicos medidos por tetrámero, en ratones inmunizados con ADN, péptido o una secuencia de entrada/amplificación de ADN y péptido.

La figura 8C muestra la citotoxicidad específica in vivo, en varios órganos linfoides y no linfoides, en ratones inmunizados con ADN ("pSEM"), péptido ("ELA" = ELAGIGILTV) o una secuencia de entrada/amplificación de ADN y péptido.

La figura 9A muestra la persistencia/el decaimiento de linfocitos T teñidos de tetrámero circulante en animales inmunizados con péptido y amplificados con el péptido, junto con la respuesta de recuerdo después del refuerzo del péptido.

La figura 9B muestra la persistencia/el decaimiento de linfocitos T teñidos de tetrámero circulante en animales entrados con ADN y amplificados con el péptido, junto con la respuesta de recuerdo después de la amplificación del péptido.

La figura 9C muestra la persistencia/el decaimiento de linfocitos T teñidos de tetrámero circulante en animales inmunizados con ADN y amplificados con ADN, junto con la respuesta de recuerdo después del refuerzo del péptido.

La figura 10A muestra la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno usando varios protocolos de inmunización de dos ciclos.

La figura 10B muestra la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno usando varios protocolos de inmunización de tres ciclos.

La figura 10C muestra la expansión de linfocitos T específicos de antígeno circulantes detectados por tinción de tetrámero, en animales cebados usando varios protocolos y amplificados con el péptido.

La figura 10D muestra la expansión de linfocitos T específicos de antígeno subsecuente a varios regímenes de inmunización y detectados por tinción de tetrámero, en órganos linfoides y no linfoides.

La figura 11A muestra un ejemplo de un programa de inmunización a ratones con ADN de plásmido y péptidos.

La figura 11B muestra la respuesta inmune determinada por el análisis ELISPOT provocado por varios protocolos de inmunización (alternando el ADN y el péptido en el orden respectivo o inverso).

La figura 12A muestra una reducción in vivo de células diana antigénicas, en sangre y nodos de linfa, en ratones inmunizados con plásmido y péptido.

La figura 12B muestra una reducción in vivo de células diana antigénicas, en bazo y pulmones, en ratones inmunizados con plásmido y péptido.

La figura 12C muestra un resumen de los resultados presentados en 12A, B.

La figura 12D muestra una correlación entre la frecuencia de linfocitos T específicos y el aclaramiento in vivo de células diana antigénicas en ratones inmunizados por varios protocolos.

La figura 13A muestra el programa de inmunización de ratones con ADN de plásmido y péptidos, así como la naturaleza de las medidas realizadas en dichos ratones.

La figura 13B describe el programa asociado al protocolo usado para la determinación del aclaramiento in vivo de células tumorales humanas en ratones inmunizados.

La figura 13C muestra la reducción in vivo de células diana antigénicas (células tumorales humanas) en pulmones de ratones inmunizados con plásmido y péptido.

La figura 14A muestra el protocolo de inmunización usado para generar la respuesta anti SSX-2 mostrada en 14B.

La figura 14B muestra la expansión de linfocitos T específicos de SSX-2 circulantes subsecuente a la aplicación de un régimen de entrada de ADN/amplificación de péptido, detectado por tinción de tetrámero.

La figura 15A muestra el aclaramiento in vivo de células diana antigénicas en bazos de ratones que se sometieron a varios protocolos de entrada y amplificación para inmunizar simultáneamente contra epítopos de melan A (ELAGIGILTV) y SSX2 (KASEKIFYV).

La figura 15B muestra el aclaramiento in vivo de células diana antigénicas en la sangre de ratones que se sometieron a varios protocolos de entrada y amplificación para inmunizarse simultáneamente contra epítopos de melan A (ELAGIGILTV) y SSX2 (KASEKIFYV).

La figura 15C resume los resultados mostrados detalladamente en las Figuras 15A, B.

La figura 16 muestra la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno circulantes medidos por tinción de tetrámero, en ratones que se someten a dos ciclos de varios protocolos de entrada y amplificación.

La figura 17A y B muestran la persistencia de linfocitos T específicos de antígeno circulantes en animales que se someten a dos ciclos de protocolos de entrada y amplificación que consisten en ADN/ADN/péptido (A) o ADN/péptido/
péptido (B).

La figura 18 muestra el recuerdo duradero en animales que se someten a dos ciclos de un protocolo de entrada y amplificación que consiste en ADN/ADN/ADN.

La figura 19 muestra un esquema de práctica clínica para la involucración y el tratamiento de pacientes con protocolos de entrada y amplificación de ADN/péptido.

Descripción detallada de la realización preferida

Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos y composiciones, por ejemplo, para generar células inmunes específicas a una célula diana, para dirigir una respuesta inmune eficaz contra una célula diana, o para el trato/el tratamiento de trastornos inflamatorios. Los métodos y las composiciones pueden incluir, por ejemplo, composiciones inmunógenas tales como vacunas y terapias, y también métodos profilácticos y terapéuticos. Se describe en este documento el nuevo e inesperado descubrimiento de que al seleccionar la forma del antígeno, la secuencia y el periodo con qué es administrado, y la administración del antígeno directamente en órganos linfoides secundarios, no sólo puede controlarse la magnitud de la respuesta inmune, sino también la naturaleza cualitativa.

Algunas realizaciones preferidas se refieren a composiciones y a sus usos para la entrada y la amplificación de una respuesta de linfocitos T. Por ejemplo, tales métodos pueden incluir una etapa de entrada en la que se administra a un animal una composición que comprende el inmunógeno codificado de un ácido nucleico. La composición se administra al sistema linfático, por ejemplo, a un nodo de linfa. La etapa de entrada puede incluir una o varias administraciones de la composición, por ejemplo, extendidas en un período de tiempo o en una manera continua en el período de tiempo. Los métodos pueden incluir además una etapa de amplificación que comprende administrar una composición que comprende un inmunógeno del péptido. La etapa de amplificación puede ser realizada una o varias veces, por ejemplo, a intervalos en un período de tiempo, en un bolo, o continuamente en un período de tiempo. Aunque no es requerido en todas las realizaciones, algunas realizaciones pueden incluir el uso de composiciones que incluyen un inmunopotenciador o adyuvante.

En algunas realizaciones, según la naturaleza del inmunógeno y el contexto en el cual se encuentra, la respuesta inmune producida puede diferenciarse por su actividad particular y preparación. En particular, aunque la inmunización con el péptido puede generar una respuesta de linfocitos T citotóxicos/citolíticos (CTL), las tentativas de amplificar además esta respuesta con inyecciones adicionales puede conducir en cambio a la expansión de una población de linfocitos T reguladora, y una disminución de la actividad de CTL observable. Así, las composiciones que confieren altas concentraciones de MHC/péptido en la superficie celular dentro del nodo de linfa, sin otra actividad inmunopotenciadora, pueden usarse resueltamente para promover una respuesta reguladora o tolerogénica. Por el contrario, en las composiciones inmunógenas que proporcionan señales de inmunopotenciación amplias (p. ej. ligandos del receptor del tipo Toll [o inducirían la citoquina/los factores de autocrina]) incluso si proporcionan sólo el antígeno limitante, no sólo inducen una respuesta, sino que la introducen también, de modo que los encuentros subsecuentes con el antígeno amplio (p. ej, péptido inyectado) amplifican la respuesta sin cambiar la naturaleza de la actividad observada. Por lo tanto, algunas realizaciones se refieren al control del perfil de la respuesta inmune, por ejemplo, la clase de respuesta obtenida y las clases de citoquinas producidas. Algunas realizaciones se refieren a métodos y composiciones para promover la expansión, o una expansión adicional de CTL, y hay realizaciones que se refieren a métodos y composiciones para promover la expansión de células reguladoras antes que el CTL, por ejemplo.

Los métodos descritos son ventajosos respecto a muchos protocolos que usan sólo el péptido o que no siguen la metodología de entrada y amplificación. Como se establece además anteriormente, muchos protocolos de inmunización basados en péptidos y los protocolos basados en vectores tienen inconvenientes. Sin embargo, de ser acertado, una estrategia de inmunización basada en el péptido o una amplificación inmune tiene ventajas respecto a otros métodos, en particular ciertos vectores microbianos, por ejemplo. Esto es debido a que los vectores más complejos, tales como los vectores virales atenuados vivos o bacterianos, pueden inducir efectos secundarios deletéreos, por ejemplo, replicación in vivo o recombinación; o se vuelven ineficaces respecto a la administración repetida debido a la generación de anticuerpos neutralizantes contra el propio vector. Además, cuando se preparan de tal modo que se vuelven inmunógenos fuertes, los péptidos pueden evitar la necesidad de un procesamiento mediado por proteasoma (como con antígenos de proteína o más complejos, en el contexto del "procesamiento inespecífico" o subsecuente a la infección celular). Esto es porque el procesamiento de antígeno celular para la presentación restringida de MHC-clase I es un fenómeno que selecciona intrínsecamente epítopos dominantes (favorecidos) frente a epítopos subdominantes, que interfieren potencialmente con la inmunogenicidad de los epítopos correspondientes a dianas válidas. Finalmente, la inmunización eficaz basada en péptidos simplifica y acorta el proceso de desarrollo de inmunoterapias.

Así, los métodos eficaces de amplificación inmunes basados en péptidos, en particular los que incluyen los descritos en este documento, pueden ser de una ventaja considerable frente a la inmunoterapia (tal como para el cáncer y las infecciones crónicas) o la vacunación profiláctica (contra ciertas enfermedades infecciosas). Las ventajas adicionales pueden ser conseguidas evitando, en particular si se hace un uso simultáneo de técnicas de adyuvante incómodas, inseguras o complejas, aunque tales técnicas puedan ser utilizadas en varias realizaciones descritas en este
documento.

Definiciones

A menos que se entienda de otra forma por el contexto del uso de un término en este documento, los siguientes términos expuestos tendrán generalmente los sentidos indicados para los fines de esta descripción.

CÉLULA PRESENTADORA DE ANTÍGENO PROFESIONAL (pAPC) - una célula que posee moléculas co-estimuladoras de linfocitos T y que es capaz de inducir una respuesta de células T. Las pAPC bien caracterizadas incluyen células dendríticas, células B y macrófagos.

CÉLULA PERIFÉRICA - una célula que no es una pAPC.

PROTEASOMA CONSTITUTIVO - un proteasoma normalmente activo en células periféricas, y generalmente no presente o no fuertemente activo en pAPC.

INMUNOPROTEASOMA - un proteasoma normalmente activo en las pAPC; el inmunoproteasoma es también activo en algunas células periféricas en tejidos infectados o después de la exposición al interferón.

\newpage

EPÍTOPO - una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmune. En las realizaciones preferidas, los epítopos según esta definición incluyen, pero no necesariamente están limitados a un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmune. En otras realizaciones preferidas, los epítopos según esta definición incluyen, pero no están limitados necesariamente a los péptidos presentados en la superficie celular, los péptidos no covalentemente unidos al sitio de unión de MHC clase I, tal que pueden interaccionar con los receptores de linfocitos T (TCR). Los epítopos presentados por los MHC clase I pueden estar en forma inmadura o madura. "Maduro" se refiere a un epítopo de MHC a diferencia de cualquier precursor ("inmaduro") que puede incluir o consistir esencialmente en un epítopo constitutivo, sino que también incluye otras secuencias en un producto de traducción primario que son eliminadas por procesamiento, incluyendo sin limitación, solo o en cualquier combinación, degradación proteosómica, recorte del extremo N-terminal, o la acción de actividades enzimáticas exógenas. Así, puede proporcionarse un epítopo maduro insertado en un polipéptido algo más largo, cuyo potencial inmunológico es debido, al menos en parte, al epítopo insertado; igualmente, el epítopo maduro puede proporcionarse en su forma última que puede unirse en el sitio de unión de MHC para ser reconocido
por TCR.

EPÍTOPO DE MHC - un polipéptido que tiene una afinidad de unión conocida o predicha para una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) mamífero de clase I o clase II. Algunas moléculas MHC clase I particularmente bien caracterizadas se presentan en las Tablas 1-4.

EPÍTOPO CONSTITUTIVO - En una realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un fragmento de polipéptido que es un epítopo de MHC, y que se expresa en una célula en la cual los proteasomas constitutivos están predominantemente activos. En otra realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un polipéptido que contiene un epítopo constitutivo según la definición anterior, que está flanqueado por uno o varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo constitutivo se define como un ácido nucleico que codifica un epítopo constitutivo según las definiciones anteriores. Los epítopos constitutivos ejemplares son los proporcionados en la publicación de patente de EE.UU. Nº. 20030220239 A1 y en la solicitud PCT Nº. PCT/US2003/027706 (Publicación Nº. WO04022709A2), presentada el 05/09/2003. Cada una de las solicitudes expuestas en esta lista se llama SECUENCIAS DE EPÍTOPO.

EPÍTOPO INMUNE - En una realización preferida, un epítopo inmune se define como un fragmento de polipéptido que es un epítopo de MHC, y que se expresa en una célula en la cual los inmunoproteasomas están predominantemente activos. En otra realización preferida, un epítopo inmune se define como un polipéptido que contiene un epítopo inmune según la definición anterior, que está flanqueado por uno o varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo inmune se define como un polipéptido que incluye una secuencia de grupo de epítopo, teniendo al menos dos secuencias de polipéptido que tienen una afinidad conocida o predicha para un MHC clase I. En aún otra realización preferida, un epítopo inmune se define como un ácido nucleico que codifica un epítopo inmune según cualquiera de las definiciones anteriores.

CÉLULA DIANA - En una realización preferida, las células diana son células asociadas a una condición patógena que pueden actuar con los componentes del sistema inmunológico, por ejemplo, una célula infectada por un virus u otro parásito intracelular, o una célula neoplásica. En otra realización, una célula diana es una célula que es reconocida por las vacunas y los métodos de la invención. Los ejemplos de células diana según esta definición incluyen, pero no están limitados necesariamente a: una célula neoplásica y una célula que alberga a un parásito intracelular, tal como, por ejemplo, un virus, una bacteria o un protozoo. Las células diana también pueden incluir células que son reconocidas con CTL como una parte de un ensayo para determinar o confirmar la liberación del epítopo apropiado y el procesamiento por una célula que expresa el inmunoproteasoma, para determinar la especificidad de los linfocitos T o la inmunogenicidad para un epítopo deseado. Tales células pueden ser transformadas para expresar la secuencia de liberación, o las células pueden ser simplemente pulsadas con el péptido/epítopo.

ANTÍGENO ASOCIADO A LA DIANA (TAA, "Target-Associated Antigen") - una proteína o un polipéptido presente en una célula diana.

ANTÍGENOS ASOCIADOS AL TUMOR (TuAA, "Tumor-Associated Antigens") - un TAA, en el que la célula diana es una célula neoplásica.

EPÍTOPO de HLA - un polipéptido que tiene una afinidad de unión conocida o predicha para una molécula del complejo HLA humano clase I o clase II. Los HLA clase I particularmente bien caracterizados se presentan en las Tablas 1-4.

ANTICUERPO - una inmunoglobulina natural (Ig), poli- o mono-clónico, o cualquier molécula compuesta entera o en parte de un dominio de unión de Ig, tanto derivado bioquímicamente como por el uso de ADN recombinante, o por cualquier otro medio. Los ejemplos incluyen inter alia, F(ab), cadena sencilla Fv, y fusiones de región variables de Ig-proteína de cubierta de fago.

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SIMILITUD SUSTANCIAL - este término se usa para referirse a secuencias que se diferencian en una secuencia de referencia de un modo inconsecuente como se juzga por el examen de la secuencia. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la misma secuencia de aminoácidos son sustancialmente similares a pesar de las diferencias en las posiciones degeneradas o diferencias menores en longitud o composición de cualquier región no codificante. Las secuencias de aminoácidos que se diferencian sólo por la sustitución conservadora o variaciones de longitud menores son sustancialmente similares. Además, las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos constitutivos que se diferencian en el número de residuos flanqueantes del extremo N-terminal, o los epítopos inmunes y los grupos de epítopo que se diferencian en el número de residuos flanqueantes en cada extremo, son sustancialmente similares. Los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente similares son también sustancialmente similares.

SIMILITUD FUNCIONAL - este término se usa para referirse a secuencias que se diferencian de una secuencia de referencia de un modo inconsecuente como se juzga por el examen de una propiedad biológica o bioquímica, aunque las secuencias puedan no ser sustancialmente similares. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos pueden ser útiles como sondas de hibridación para la misma secuencia, pero codificar secuencias de aminoácidos diferentes. Dos péptidos que inducen respuestas CTL específicas y reactivas son funcionalmente similares aun si se diferencian por sustituciones de aminoácidos no conservadoras (y así pueden no estar dentro de la definición de similitud sustancial). Los pares de anticuerpos, o TCR, que reconocen el mismo epítopo pueden ser funcionalmente similares entre sí a pesar de que existan cualesquiera diferencias estructurales. Pueden realizarse pruebas para detectar la similitud funcional de la inmunogenicidad inmunizando con el antígeno "modificado" y probando la capacidad de una respuesta provocada, incluyendo, pero sin limitación, una respuesta de anticuerpo, una respuesta CTL, la producción de citoquina y otras similares, para reconocer el antígeno diana. En consecuencia, dos secuencias pueden ser diseñadas para diferenciarse en algunos aspectos reteniendo la misma función. Tales variantes de secuencia diseñadas de las secuencias descritas o reivindicadas están entre las realizaciones de la presente invención.

CASETE DE EXPRESIÓN - una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, operativamente unido a un promotor y otros elementos de control de la transcripción y la traducción, incluyendo, pero sin limitación, a potenciadores, codones de terminación, sitios de entrada de ribosoma internos y sitios de poliadenilación. El casete también puede incluir secuencias que faciliten moverlo de una molécula huésped a otra.

EPÍTOPO INSERTADO - en algunas realizaciones, un epítopo insertado es un epítopo que está totalmente contenido dentro de un polipéptido más largo; en otras realizaciones, el término también puede incluir un epítopo en el cual sólo el extremo N-terminal o el extremo C-terminal son insertados tal que el epítopo no está totalmente en una posición interior con respecto al polipéptido más largo.

EPÍTOPO MADURO - un péptido sin secuencia adicional más allá de la presente cuando el epítopo está ligado en el sitio de unión del péptido de MHC.

GRUPO DE EPÍTOPO - un polipéptido, o una secuencia de ácidos nucleicos que lo codifica, que es un segmento de una secuencia de proteína, que incluye una secuencia de proteína natural, comprendiendo dos o más epítopos conocidos o predichos con la unión de la afinidad para un elemento de restricción de MHC compartido. En las realizaciones preferidas, la densidad de epítopos dentro del grupo es mayor que la densidad de todos los epítopos conocidos o predichos con la unión de la afinidad para el elemento de restricción de MHC compartido dentro de la secuencia de la proteína completa. Se describen grupos de epítopo y se definen más detalladamente en la solicitud de patente de EE.UU. Nº. 09/561.571 titulada GRUPOS DE EPÍTOPO ("EPITOPE CLUSTERS").

SECUENCIA DE LIBERACIÓN - una secuencia diseñada o modificada que comprende o codifica un epítopo constitutivo insertado en una secuencia más grande que proporciona un contexto que permite al epítopo constitutivo ser liberado por actividades de procesamiento incluyendo, por ejemplo, la actividad del inmunoproteasoma, el recorte del extremo N-terminal y/o otros procesos o actividades, solos o en cualquier combinación.

CTLp - Los precursores de CTL son linfocitos T que pueden ser inducidos a exhibir la actividad citolítica. En segundo lugar, la actividad lítica in vitro, por la cual son generalmente observados CTLp, puede provenir de cualquier combinación en blanco, efectora y CTL de recuerdo in vivo.

LINFOCITOS T DE RECUERDO - Un linfocito T, sin tener en cuenta su posición en el cuerpo, que ha sido previamente activado por el antígeno, pero que está en un estado fisiológico quiescente que requiere una re-exposición al antígeno a fin de ganar la función efectora. Fenotípicamente, son generalmente los CD62L^{-} CD44^{hi} CD107\alpha^{-}IGN-\gamma^{-} LT\beta^{-} TNF-\alpha^{-} y está en G0 del ciclo celular.

LINFOCITO T EFECTOR - Un linfocito T que, cuando se encuentra con un antígeno, exhibe fácilmente la función efectora. Los linfocitos T efectores son generalmente capaces de salir del sistema linfático y entrar en la periferia inmunológica. Fenotípicamente, son generalmente los cD62L-CD44^{hi} CD107\alpha^{+} IGN-\gamma^{+} LT\beta^{+} TNF-\alpha^{+} y ciclan activamente.

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FUNCIÓN EFECTORA - Generalmente, la activación de linfocitos T de forma general, incluyendo la adquisición de actividad citolítica y/o secreción de citoquinas.

INDUCCIÓN de una respuesta de linfocitos T - Incluye en muchas realizaciones el proceso de generar una respuesta de linfocitos T en blanco, o en algunos contextos, células quiescentes; activando los linfocitos T.

AMPLIFICACIÓN de una respuesta de linfocitos T - Incluye en muchas realizaciones el proceso o el aumento del número de células, el número de células activadas, el nivel de actividad, la velocidad de proliferación, o parámetro similar de linfocitos T implicados en una respuesta específica.

ENTRADA - Incluye en muchas realizaciones una inducción que confiere estabilidad particular en el perfil inmune del linaje inducido de linfocitos T.

RECEPTOR DEL TIPO TOLL (TLR) - Los receptores del tipo Toll (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de patrones que son activados por componentes específicos de microbios y ciertas moléculas del huésped. Como parte del sistema inmunológico innato, contribuyen a la primera línea de defensa contra muchos patógenos, aunque también desempeñan un papel en la inmunidad adaptable.

LIGANDO DEL RECEPTOR DEL TIPO TOLL (TLR) - Cualquier molécula capaz de unirse y activarse a un receptor del tipo Toll. Los Ejemplos incluyen, sin limitación: ARN bicatenario sintético de poli 1C A, conocido como interferón inductor. El polímero está compuesto de una cadena de ácido poli-inosínico y ácido policitidílico, ARN bicatenario, oligodesoxirribonucleótido de CpG no metilado u otras secuencias immunoestimuladoras (ISS), lipopolisacáridos (LPS), \beta-glucanos e imidazoquinolinas, así como sus derivados y análogos.

ADYUVANTES INMUNOPOTENCIADORES - Adyuvantes que activan pAPC o linfocitos T incluyendo, por ejemplo: ligandos de TLR, ligandos del Receptor de Reconocimiento de Patrones (PRR) endocítico, madera de Panamá, tucaresol, citoquinas, y otros similares. Algunos adyuvantes preferidos son los descritos en Marciani, D.J. Drug Discovery Today 8:934-943, 2003.

SECUENCIA INMUNOESTIMULADORA (ISS; "IMMUNOSTIMULATORY SEQUENCE"\cdot) - Generalmente un oligodesoxirribonucleotido que contiene una secuencia CpG desmetilada. El CpG también puede ser insertado en el ADN bacterianamente producido, particularmente en plásmidos. Otras realizaciones incluyen varios análogos; entre las realizaciones preferidas están las moléculas con uno o varios enlaces fosforotioato o bases no fisiológicas.

VACUNA - En las realizaciones preferidas, una vacuna puede ser una composición inmunógena que proporcione o ayude a la prevención de una enfermedad. En otras realizaciones, una vacuna es una composición que puede proporcionar o ayudar a la cura de una enfermedad. En otros, una composición de vacuna puede proporcionar o ayudar a la mejora de una enfermedad. Otras realizaciones de la composición inmunógena de vacuna pueden usarse como agentes terapéuticos y/o profilácticos.

INMUNIZACIÓN - un proceso para inducir la protección parcial o completa frente a una enfermedad. O bien, un proceso para inducir o amplificar una respuesta del sistema inmunológico frente a un antígeno. En una segunda definición, puede implicar una respuesta inmune protectora, inmunidad particularmente proinflamatoria o activa, pero también puede incluir una respuesta reguladora. Así, en algunas realizaciones, la inmunización es distinguida de la tolerización (un proceso por el cual el sistema inmunológico evita producir una inmunidad proinflamatoria o activa) mientras que en otras realizaciones este término incluye la tolerización.

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TABLA 1 Moléculas MHC Clase I

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TABLA 2 Moléculas MHC Clase I

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La siguiente discusión se establece por los inventores además para la mejor comprensión de la operación de la invención. Sin embargo, no se pretende que esta discusión limite la patente en ninguna teoría particular de lo que es la operación no expuesta en las reivindicaciones.

El eficaz control inmune-mediado de los procesos tumorales o de las infecciones microbianas generalmente implica la inducción y la expansión de linfocitos T específicos de antígeno dotados de múltiples capacidades tales como la migración, las funciones efectoras y la diferenciación en células de recuerdo. La inducción de las respuestas inmunes puede ser lograda por varios métodos e implica la administración de antígenos en formas diferentes, con un efecto variable en la magnitud y la calidad de la respuesta inmune. Un factor restrictivo en el logro del control de la respuesta inmune es reconocer pAPC capaces de tratar y presentar con eficacia los epítopos resultantes frente a linfocitos T específicos.

Una solución a este problema es la administración directa de antígenos a los órganos linfoides secundarios, un microambiente abundante en pAPC y linfocitos T. El antígeno puede administrarse, por ejemplo, como un polipéptido o como un antígeno expresado por cualquiera de una variedad de vectores. El resultado en términos de magnitud y calidad de la inmunidad puede ser controlado por factores incluyendo, por ejemplo, la dosis, la formulación, la naturaleza del vector y el ambiente molecular. Las realizaciones de la presente invención pueden realzar el control de la respuesta inmune. El control de la respuesta inmune incluye la capacidad de inducir tipos diferentes de respuestas inmunes cuando sea necesario, por ejemplo, desde respuestas reguladoras a pro-inflamatorias. Las realizaciones preferidas proporcionan un mayor control de la magnitud y la calidad de las respuestas frente a epítopos restringidos de MHC clase I que son de gran interés para la inmunoterapia activa.

Los métodos de inmunización anteriores han mostrado ciertas limitaciones importantes: primero, muy a menudo, las conclusiones en cuanto a la potencia de las vacunas fueron extrapoladas a partir de datos de inmunogenicidad generados a partir de un panel, o de uno muy limitado, de ensayos de lectura ultrasensibles. Con frecuencia, a pesar de la potencia deducida de un régimen de vacunación, la respuesta clínica no era significativa o era de lo más modesta. En segundo lugar, después de la inmunización, pueden ser generadas y/o ampliadas células T reguladoras, junto con más células efectoras T convencionales, y tales células pueden interferir con la función de la respuesta inmune deseada. La importancia de tales mecanismos en la inmunoterapia activa ha sido reconocida sólo recientemente.

La administración intranodular de inmunógenos proporciona una base para el control de la magnitud y el perfil de las respuestas inmunes. La carga eficaz in vivo de pAPC, llevada a cabo a consecuencia de tal administración, proporciona una magnitud sustancial de la inmunidad, hasta usando un antígeno en su forma más simple -un epítopo peptídico- generalmente asociado con farmacocinéticas pobres. La calidad de la respuesta puede ser controlada además por medio de la naturaleza de los inmunógenos, vectores y protocolos de inmunización. Dichos protocolos pueden ser aplicados para realzar/modificar la respuesta en las infecciones crónicas o en los procesos tumorales.

La inmunización se ha basado tradicionalmente en la administración repetida de antígenos para aumentar la magnitud de la respuesta inmune. El uso de vacunas de ADN ha generado respuestas de alta calidad, pero ha sido difícil obtener respuestas de magnitud altas usando tales vacunas, hasta con dosis de refuerzo repetidas. Ambas características de la respuesta, la magnitud de calidad alta y baja, son probablemente debidas a los niveles relativamente bajos de carga de epítopo en MHC conseguido con estos vectores. En cambio, se ha vuelto más común, reforzar tales vacunas usando el antígeno codificado en un vector de virus vivo a fin de conseguir una magnitud alta de la respuesta necesaria para la utilidad clínica. Sin embargo, el uso de vectores vivos puede implicar varios inconvenientes que incluyen cuestiones de seguridad potenciales, disminuyendo la eficacia de los refuerzos posteriores debido a una respuesta humoral frente al vector inducido por las administraciones previas, y los gastos de creación y producción. Así, el uso de vectores vivos o ADN solo, aunque provoque respuestas de alta calidad, puede causar una magnitud o sostenibilidad limitada de la respuesta.

En este documento se describen realizaciones que se refieren a protocolos y a métodos que, cuando se aplican a péptidos, los hicieron eficaces como instrumentos terapéuticos inmunes. Tales métodos no dependen del pobre PK de los péptidos y, de ser aplicados en el contexto de regímenes a menudo más complejos y específicos, causan una fuerte amplificación y/o control de la respuesta inmune. En las realizaciones preferidas, la administración directa del péptido en órganos linfoides origina una fuerte amplificación de improviso de las respuestas inmunes, después de un agente de cebado que induce una respuesta inmune fuerte, moderada o hasta suave (a niveles de la detección por técnicas convencionales o por debajo de ésta) que consiste en células Tcl. Aunque las realizaciones preferidas de la invención puedan emplear la administración intralinfática de antígeno en todas las etapas de la inmunización, la administración intralinfática de péptido sin adyuvante es más preferida. La amplificación de péptido que utiliza la administración intralinfática puede ser aplicada a respuestas inmunes existentes que pueden haber sido inducidas anteriormente.

También, como se demuestra en este documento, la iniciación óptima, que origina la expansión consecuente de linfocitos T específicos, puede conseguirse mejor exponiendo los linfocitos T en blanco a cantidades limitadas del antígeno (como puede resultar de la expresión a menudo limitada del antígeno codificado por el plásmido) en un contexto rico co-estimulador (como en un nodo de linfa). Esto puede causar la activación de linfocitos T que llevan receptores de linfocitos T que reconocen complejos MHC-péptido con afinidad alta en células que presentan el antígeno y pueden causar la generación de células de recuerdo que son más reactivas frente a una estimulación subsecuente. El ambiente co-estimulador beneficioso puede ser aumentado o asegurado por el uso de agentes inmunopotenciadores.

Aunque la pobre farmacocinética de los péptidos libres ha prevenido de su uso en la mayor parte de las rutas de la administración, la administración directa en órganos linfoides secundarios, particularmente nodos de linfa, se ha demostrado que es eficaz cuando el nivel de antígenos es mantenido más o menos continuamente por infusión continua o inyección frecuente (por ejemplo, diariamente). Dicha administración intranodular para la generación de CTL se muestra en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Nº. 20020007173 A1 y en la solicitud PCT Nº. PCTUS98/14289 (Publicación Nº. WO9902183A2) cada una titulada "A METHODS OF INDUCING A CTL RESPONSE". En algunas realizaciones de la presente invención, la administración intranodular del péptido era eficaz en la amplificación de una respuesta inicialmente inducida con una vacuna de ADN de plásmido. Además, el perfil de citoquina era distinto, con la inducción de ADN de plásmido/amplificación de péptido que generalmente causa la mayor producción de quimioquina (citoquina quimiotáctica) y menor citoquina inmunodepresiva que los protocolos de péptido/péptido o ADN/ADN.

Por lo tanto, tales protocolos de inducción de ADN/amplificación de péptido pueden mejorar la eficacia de las composiciones, incluyendo las vacunas terapéuticas para el cáncer e infecciones crónicas. Los principios de selección del epítopo beneficiosos para tales inmunoterapias son descritos en la publicación de patente de EE.UU. Nº. 20030215425 A1, titulada "EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS"; publicación Nº. 20030046714 A1, titulada "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER" y publicación Nº. 20030220239 A1, y Solicitud PCT Nº. PCT/US2003/027706 (Publicación Nº. WO 04022709A2), titulada "EPITOPE SEQUENCES", y PCT/US01/13806 (Publicación Nº. WO 01/82963), titulada "Method of identifying and producing antigen peptides and use thereof as vaccines". Los aspectos del diseño global de plásmidos de vacuna son descritos en la publicación de patente de EE.UU. Nº. 20030228634 A1, titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGETASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN"; Publicación Nº. 2003-0138808, Solicitud PCT Nº. PCT/US2003/026231 (Publicación Nº. WO 2004/018666) y la patente de EE.UU. Nº. 6.709.844, titulada "AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION".

Sorprendentemente, la inyección intranodular repetida de péptido según un programa de refuerzo de cebado tradicional causó la reducción de la magnitud de la respuesta citolítica comparado con la respuesta observada después de la administración inicial sola. El examen del perfil de la respuesta inmune muestra que esto es el resultado de la inducción de la regulación inmune (depresión) en vez de la falta de respuesta. Esto es al contrario para inducir-y-amplificar protocolos que abarcan a los inmunógenos codificados por el ADN, típicamente plásmidos. La carga directa de pAPC por inyección intranodular del antígeno generalmente disminuye o evita la necesidad de adyuvantes que son comúnmente usados para corregir la farmacocinética de los antígenos administrados vía otras rutas parenterales. La ausencia de tales adyuvantes, que son generalmente proinflamatorios, puede facilitar por lo tanto la inducción de un perfil de respuesta inmune diferente (es decir, regulador o tolerogénico) que ha sido anteriormente observado con la inmunización del péptido. Ya que la respuesta, como se muestra en los ejemplos de más abajo, es medida en los órganos linfoides secundarios remotos al sitio de inyección inicial, tales resultados apoyan los métodos de uso y las composiciones según las realizaciones de la invención para modificar las reacciones inflamatorias (depresivas) en curso. Este e puede ser útil hasta con trastornos inflamatorios que tienen una etiología restringida de MHC clase II, reconociendo el mismo antígeno, o a cualquier antígeno adecuado asociado con el sitio de la inflamación, y basándose en los efectos particulares presentes mediados por las citoquinas inmunodepresivas.

A pesar de que la administración del péptido repetida cause gradualmente la disminución de la respuesta inmune citolítica, la inducción con un agente, tal como un ADN recombinante no replicante (plásmido) tuvo un impacto sustancial en las dosis subsecuentes, permitiendo una fuerte amplificación de la inmunidad frente a epítopos expresados por el ADN recombinante y el péptido, y de entrada de su naturaleza citolítica. De hecho, cuando las administraciones solas o múltiples del vector de ADN recombinante o el péptido por separado no consiguieron ninguna respuesta inmune o respuestas modestas, induciendo con el ADN y amplificando con el péptido se consiguieron respuestas sustancialmente más altas, tanto como en la velocidad de los respondedores como con la magnitud de la respuesta. En los ejemplos mostrados, la velocidad de respuesta fue al menos doblada y la magnitud de la respuesta (media y mediana) fue al menos triplicada usando el protocolo de inducción de ADN recombinante/amplificación de péptido. Así, los protocolos preferidos causan la inducción de la inmunidad (inmunidad de Tc1) que es capaz de tratar con células antigénicas in vivo, dentro de órganos linfoides y no linfoides. Un factor restrictivo en la mayor parte de la inmunoterapia del cáncer es la susceptibilidad limitada de las células tumorales al ataque inmune, posiblemente debido a la presentación reducida de MHC/péptido. En las realizaciones preferidas, la fuerte expansión de la inmunidad es conseguida por la inducción de ADN/amplificación del péptido, con una magnitud que generalmente iguala o excede la respuesta inmune generalmente observaba después de una infección con microbios virulentos. Esta elevada magnitud puede ayudar a compensar la pobre presentación de MHC/péptido y causa realmente un aclaramiento de las células tumorales humanas como se muestra en modelos preclínicos especializados tales como, por ejemplo, ratones transgénicos HLA.

Tales protocolos de inducir-y-amplificar que implican secuencias específicas de dosis de entrada de ADN recombinante, seguido de refuerzos de péptido administrados a órganos linfoides son, por lo tanto, útiles para la inducción, amplificación y el mantenimiento de fuertes respuestas de linfocitos T, por ejemplo para la profilaxis o la terapia de enfermedades infecciosas o neoplásicas. Tales enfermedades pueden ser carcinomas (p. ej, renal, ovárico, de pecho, pulmonar, colorectal, próstata, cabeza-y-cuello, vejiga, uterina, piel), melanoma, tumores de diversos orígenes y en tumores generales que expresen los antígenos asociados al tumor definido o definible, tales como oncofetales (p. ej, CEA, CA 19-9, CA 125, CRD-BP, Das-1, 5T4, TAG-72, y otros similares), diferenciación de tejido (p. ej, melan-A, tirosinasa, gp100, PSA, PSMA, y otros similares), o antígenos de testículo de cáncer (p. ej, PRAME. MAGE, LAGE, SSX2, NY-ESO-1, y otros similares; véase la Tabla 5). Los genes de testículo de cáncer y su importancia para el tratamiento del cáncer son examinados en Scanlon et al., Cancer Immunity 4:1-15, 2004), antígenos asociados a la neovasculatura del tumor (p. ej, PSMA, VEGFR2, Tie-2) son también útiles en relación a las enfermedades cancerosas, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. Nº. 10/094.699 (Publicación Nº. 20030046714 A1), titulada "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER". Los métodos y las composiciones pueden usarse para reconocer varios organismos y condiciones de enfermedad. Por ejemplo, los organismos diana pueden incluir bacterias, virus, protozoos, hongos y otros similares. Las enfermedades diana pueden incluir las causadas por priones, por ejemplo. Las enfermedades ejemplares, los organismos y los antígenos y los epítopos asociados a los organismos diana, células y enfermedades son descritos en la publicación de patente de EE.UU. Nº. 20020007173 A1. Entre las enfermedades infecciosas que pueden ser reconocidas están las causadas por los agentes que tienden a establecer infecciones crónicas (VIH, virus del herpes simple, CMV, Hepatitis B y virus C, virus del papiloma y otros similares) y/o los que están relacionados con infecciones agudas (por ejemplo, virus de la gripe, sarampión, RSV, virus del Ebola). Son de interés los virus que tienen un potencial oncogénico -desde la perspectiva de la profilaxis o la terapia- tal como el virus del papiloma, virus Epstein Barr y HTLV-1. Todos estos agentes infecciosos han sido definidos o los antígenos definibles que pueden usarse como base para diseñar las composiciones, tales como los epítopos peptídicos.

Las aplicaciones preferidas de tales métodos (Véase, p. ej, la Figura 19) incluyen la inyección o la infusión en uno o varios nodos de linfa, comenzando con un número (p. ej, de 1 a 10, o más, de 2 a 8, de 3 a 6, preferido aproximadamente de 4 ó 5) de administraciones de ADN recombinante (intervalo de dosis de 0,001-10 mg/kilogramos, preferido 0,005-5 mg/kg) seguido de una o varias administraciones de péptido (preferido aproximadamente 2), preferiblemente en un vehículo inmunológicamente inerte o formulación (intervalo de dosis de 1 ng/kg-10 mg./kilogramo, preferido 0,005-5 mg/kilogramo). Como la dosis no se escala linealmente necesariamente con el tamaño del sujeto, las dosis para los seres humanos pueden tender hacia partes más bajas, y las dosis para ratones pueden tender hacia partes más altas, de estos intervalos. La concentración preferida de plásmido y péptido bajo la inyección es generalmente aproximadamente 0,1 \mug/ml-10 mg/ml, y la concentración más preferida es aproximadamente 1 mg/ml, generalmente independientemente del tamaño o la especie del sujeto. Sin embargo, los péptidos particularmente potentes pueden tener concentraciones óptimas hacia el extremo inferior de este intervalo, por ejemplo entre 1 y 100 \mug/ml. Cuando sólo se usan protocolos del péptido para promover la dosis de tolerancia son generalmente preferidos hacia el extremo más alto de estos intervalos (p. ej, 0,5-10 mg/ml). Esta secuencia puede repetirse cuando sea necesario mantener una respuesta inmune fuerte in vivo. Además, el tiempo entre la última dosis de entrada de ADN y la primera dosis de amplificación del péptido no es crítico. Preferiblemente es de aproximadamente 7 días o más, y puede exceder varios meses. La multiplicidad de inyecciones de ADN y/o péptido puede ser reducida sustituyendo infusiones que duren varios días (preferido 2-7 días). Puede ser ventajoso iniciar la infusión con un bolo de material similar al que podría ser dado como una inyección, seguido de una infusión lenta (24-12000 \mul/día para administrar aproximadamente 25-2500 \mug/día para el ADN, 0,1-10.000 \mug/día para el péptido). Esto puede llevarse a cabo a mano o por el uso de una bomba programable, tal como una bomba de insulina. Tales bombas son conocidas en la técnica y permiten puntos periódicos y otros perfiles de dosis, que pueden ser deseables en algunas realizaciones.

Debe apreciarse que mientras este método hace uso con éxito del péptido, sin conjugación a proteínas, la adición del adyuvante, etc., en la etapa de amplificación, la ausencia de tales componentes no es requerida. Así, pueden ser usados en las realizaciones el péptido conjugado, adyuvantes, inmunopotenciadores, etc.. Las composiciones más complejas del péptido administrado al nodo de linfa, o con una capacidad de albergar el sistema linfático, que incluyen células dendríticas pulsadas por el péptido, suspensiones tales como formulaciones de liposoma, conjuntos, emulsiones, micropartículas, nanocristales, formados o que abarcan epítopos peptídicos o el antígeno en varias formas, pueden ser sustituidas por el péptido libre en el método. A la inversa, el refuerzo del péptido por la administración intranodular puede seguir a la preparación por cualquier medio/o ruta que logre la inducción de células de recuerdo hasta en niveles modestos.

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A fin de reducir la aparición de la resistencia debido al mosaicismo de la expresión de antígenos, o a la mutación o pérdida del antígeno, es ventajoso inmunizar a múltiples antígenos concomitantemente, preferiblemente aproximadamente 2-4. Puede usarse cualquier combinación de antígenos. Puede usarse un perfil de expresión del antígeno de un tumor particular para determinar qué antígeno o combinación de antígenos usar. Las combinaciones específicas de antígenos particularmente adecuados para el tratamiento de cánceres seleccionados se describen en las solicitudes de patente de EE.UU. 60/479.554. Para provocar respuestas frente a una pluralidad de antígenos o al epítopo de un antígeno solo, estos métodos pueden usarse para administrar múltiples entidades inmunógenas, individualmente o como mezclas. Cuando los inmunógenos son administrados individualmente, se prefiere que las diferentes entidades sean administradas a nodos de linfa diferentes o al(a los) mismo(s) nodo(s) de linfa en momentos diferentes, o al(a los) mismo(s) nodo(s) de linfa a la misma vez. Esto puede ser particularmente relevante para la administración de péptidos para los cuales puede ser difícil de averiguar una formulación sencilla que proporcione solubilidad y estabilidad a todos los péptidos componentes. Una molécula de ácido nucleico sola puede codificar múltiples inmunógenos. O bien, múltiples moléculas de ácido nucleico que codifican uno o un subconjunto de todos los inmunógenos componentes para la pluralidad de antígenos pueden mezclarse juntos mientras que la dosis deseada puede ser proporcionada sin requerir una concentración tan alta de ácido nucleico que la viscosidad se vuelva problemática.

En las realizaciones preferidas, el método requiere la administración directa al sistema linfático. En las realizaciones preferidas, esto es a un nodo de linfa. Los vasos de linfa aferentes son preferidos de manera similar. La opción del nodo de linfa no es crítica. Los nodos de linfa inguinales son preferidos por su tamaño y accesibilidad, pero los nodos axiliares y cervicales y las amígdalas pueden ser ventajosos de manera similar. La administración a un nodo de linfa solo puede ser suficiente para inducir o amplificar una respuesta inmune. La administración a múltiples nodos puede aumentar la fiabilidad y la magnitud de la respuesta.

Los pacientes que pueden beneficiarse de tales métodos de inmunización pueden ser reclutados usando métodos para definir su perfil de expresión de proteína MHC y el nivel general de sensibilidad inmune. Además, su nivel de inmunidad puede ser controlado usando técnicas estándares junto con el acceso a la sangre periférica. Finalmente, los protocolos de tratamiento pueden ser ajustados según la sensibilidad a la inducción o las fases de amplificación y la variación en la expresión del antígeno. Por ejemplo, pueden administrarse dosis de entrada repetidas preferiblemente hasta que sea obtenida una respuesta detectable, y luego la administración de la(s) dosis del péptido de amplificación, en vez de amplificar después de algún número de grupo de dosis de entrada. Del mismo modo, dosis de mantenimiento o amplificación programadas del péptido pueden ser discontinuadas si su eficacia mengua, los números de linfocitos T reguladores específicos de antígeno aumentan o son observadas algunas otras pruebas de tolerización y puede administrarse otra entrada antes que continúe la amplificación con el péptido.

Los siguientes ejemplos tienen sólo fines ilustrativos y no se espera que limiten el alcance de la invención o sus diversas realizaciones de ningún modo.

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Ejemplo 1 Inducción altamente eficaz de respuestas inmunes por inmunización intra-linfática

Se inmunizaron ratones que llevaban un transgen que expresaba una versión de cadena sencilla quimérica de un MHC clase I humano (A*0201, denominado "HHD"; véase Pascolo et al. J. Exp. Med. 185 (12):2043-51, 1997) mediante una administración intranodular como sigue. Cinco grupos de ratones (n=3) fueron inmunizados con el plásmido que expresa el análogo de melan-A 26-35 A27L (pSEM) para la inducción y se amplificaron una semana más tarde, empleando rutas de inyección diferentes: subcutánea (sc), intramuscular (im) e intralinfática (in, usando inoculación directa en los nodos de linfa inguinales). El programa de inmunización y dosis se muestra en la Figura 1A. Una semana después de la amplificación, los ratones fueron sacrificados; los esplenocitos se prepararon y se tiñeron usando anticuerpos monoclonales anti-CD8 marcados y tetrámeros que reconocen receptores de linfocitos T específicos de melan-A 26-35. Los datos representativos se muestran en la Figura 1B: aunque la administración subcutánea e intramuscular consiguió frecuencias de tetrámero+ linfocitos T CD8+ de alrededor del 1% o menos, la administración intralinfática del plásmido consiguió una frecuencia de más del 6%. Además, los esplenocitos fueron estimulados ex vivo con el péptido melan-A y se probaron frente a células diana marcadas con ^{51}Cr (células T2) en varias proporciones E:T (Figura 1C). Los esplenocitos de animales inmunizados por la inyección del nodo de intralinfa mostraron un nivel más alto de la lisis in vitro en varias proporciones E:T, usando este ensayo de citotoxicidad estándar.

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Ejemplo 2 Efectos del orden en el que las diferentes formas del inmunógeno son administradas

Se inmunizaron ratones HHD por la administración intranodular de plásmido (pSEM) o péptido (Mel A; ELAGIGILTV; SEQ ID NO:1) en varias secuencias. El polipéptido inmunógeno codificado por pSEM se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 10/292.413 (Publicación Nº. 20030228634 A1) titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN".

El protocolo de inmunización (Figura 2) comprendía:

i)

Fase de inducción/Dosis de inducción: inyección bilateral en los nodos de linfa inguinales de 25 \mul (microlitros) de solución salina estéril que contiene 25 \mug (microgramos) de plásmido o 50 \mug (microgramos) de péptido, el día 0 y el día 4.

ii)

Dosis de amplificación: como se describe antes en el Ejemplo 1 y se inicia a las 2 semanas después de la finalización de la fase de inducción.

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La respuesta inmune se midió por técnicas estándares, después del aislamiento de los esplenocitos y la estimulación in vitro con el péptido cognado en presencia de pAPC. Es preferible que el perfil de la respuesta inmune se delinee teniendo en cuenta los resultados que provienen de los ensayos múltiples, facilitando la evaluación de varias funciones efectoras y reguladoras y proporcionando una visión más global de la respuesta. Puede darse consideración al tipo de ensayo usado y no simplemente a su número; por ejemplo, dos ensayos para diferentes citoquinas proinflamatorias no es tan aclarativo como un ensayo más para una quimioquina o una citoquina inmunodepresiva.

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Ejemplo 3 Análisis de ELISPOT de ratones inmunizados como se describe en el Ejemplo 2

El análisis de ELISPOT mide la frecuencia de linfocitos T, específicos del péptido y productores de citoquina. La figura 3 representa ejemplos representativos en duplicados; y la Figura 4 representa un resumen de los datos expresados individualmente como el número células productoras de citoquina/10^{6} células de respondedor. Los resultados muestran, por el contrario, que con los ratones inmunizados con el péptido, los ratones inmunizados con el plásmido o introducidos por el plásmido/amplificados por el péptido desarrollaron frecuencias elevadas de linfocitos T productores de IFN-\gamma (gamma) que reconocen el péptido melan-A. Cuatro de cuatro ratones, a los que se les había introducido el plásmido y amplificado con el péptido, mostraron frecuencias superiores a 1/2000. Por el contrario, dos de cuatro ratones inmunizados en todas las etapas del protocolo con el plásmido, mostraron frecuencias superiores a 1/2000. Ninguno de los ratones, usando sólo el péptido como inmunógeno, juntó la elevada respuesta que comporta los linfocitos T productores de IFN-\gamma. En efecto, la administración repetida de péptido disminuyó la frecuencia de tales células, en fuerte contraste con el péptido administrado después de la entrada con el plásmido.

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Ejemplo 4 Análisis de la actividad citolítica de ratones inmunizados como se describe en el Ejemplo 2

Se prepararon esplenocitos reunidos (recogidos de bazos, picados, lisados de glóbulos rojos) a partir de cada grupo y se incubaron con pAPC singénico cubierto del péptido de melan-A, estimulado con LPS, durante 7 días, en presencia de rIL-2. Las células se lavaron e incubaron en proporciones diferentes con células diana T2 marcadas con ^{51}Cr pulsadas con el péptido melan-A (ELA), durante 4 horas. La radiactividad liberada en el sobrenadante se midió usando un contador \gamma (gamma). La respuesta fue cuantificada como el % de lisis = (señal de muestra - línea de fondo)/(señal máxima - línea de fondo) x 100, donde la línea de fondo representa la radiactividad liberada por las células diana solas cuando se incuban en el medio de ensayo, y la señal máxima es la radiactividad liberada por las células diana lisadas con detergente. La figura 5 ilustra los resultados del ensayo de citotoxicidad anteriormente descrito. Los niveles de actividad citolítica conseguidos, después de la estimulación in vitro con el péptido, fueron mucho mayores para aquellos grupos que habían recibido ADN como dosis de inducción in vivo que aquellos que habían recibido el péptido como dosis de inducción. Consecuente con los datos del ELISPOT anteriores, la inducción de una respuesta inmune con una composición de ADN condujo a una función efectora estable y amplificable, mientras que la inmunización usando sólo el péptido causó una respuesta menor, cuya magnitud además disminuyó bajo la administración repetida.

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Ejemplo 5 Reactividad específica

Se prepararon esplenocitos y se usaron como antes en el Ejemplo 4 contra células diana cubiertas de tres péptidos diferentes: el inmunógeno análogo de melan-A y los que representan los epítopos humanos y murinos correspondientes a éste. Como se muestra en la Figura 6, fue observada una actividad citolítica similar en las tres dianas, demostrando la reactividad específica de la respuesta respecto a las secuencias naturales.

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Ejemplo 6 La administración repetida del péptido respecto a los nodos de linfa induce la desviación inmune y linfocitos T reguladores

El perfil de citoquina de linfocitos T específicos generados por los procedimientos de inmunización descritos anteriormente (y en la figura 2), fue evaluado por ELISA o Luminex®. (el análisis Luminex® es un método para medir la citoquina producida por los linfocitos T en el cultivo en una manera de multiplexor.) Se usaron los sobrenadantes de siete días de cultivos de linfocitos variados generados como se describe antes para medir los modificadores de la respuesta biológica siguientes: MIP-1\alpha, RANTES y TGF-\beta (ELISA de captura, usando placas cubiertas de anticuerpo de anticitoquina y los reactivos específicos tales como el anticuerpo marcado por biotina, estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y sustrato colorimétrico; R&D Systems). Las otras citoquinas fueron medidas por Luminex®, usando el T1/T2 y los kits inflamatorios T proporcionados por el fabricante especializado (BD Pharmingen).

Los datos en la Figura 7A comparan los tres protocolos de inmunización diferentes y muestran un efecto inesperado del protocolo en el perfil de la respuesta inmune: mientras que la entrada del plásmido permitió la inducción de linfocitos T que secretan citoquinas pro-inflamatorias, la administración repetida del péptido causó la generación de citoquinas supresoras reguladoras o inmunes tales como IL-10, TGF-\beta e IL-5. Debería ser apreciado que el programa de inmunización usado para el protocolo únicamente del péptido proporcionó la presencia periódica, en vez de continua, del epítopo dentro del sistema linfático que, en cambio, prolonga la fase efectora de la respuesta. Finalmente, la entrada del plásmido seguido de la amplificación del péptido causó la producción de cantidades elevadas de quimioquinas de linfocitos T MIP-1\alpha y RANTES. Las quimioquinas de linfocitos T tales como M1P-1\alpha y RANTES pueden desempeñar un papel importante en la regulación del tráfico a tumores o sitios de infección. Durante el control inmune, los linfocitos T específicos para antígenos asociados a la diana pueden encontrar el ligando cognado, proliferar y producir mediadores que incluyen quimioquinas. Éstos pueden amplificar el reclutamiento de linfocitos T en el sitio donde el antígeno está siendo reconocido, permitiendo una respuesta más potente. Se generaron los datos de los sobrenadantes obtenidos a partir de los cultivos sin purificar (medios + ET de duplicados, dos medidas independientes).

Las células fueron recogidas del tejido intersticial pulmonar y del bazo por métodos estándares y se tiñeron con anticuerpos contra CD8, CD62L y CD45RB, junto con el agente de tetrámero que identifica linfocitos T específicos de Melan A. Los datos en la Figura 7B representan poblaciones controladas de CD8 + Tetrámero + linfocitos T (eje y CD45RB y eje x CD62L).

Todos juntos, los resultados demuestran la desviación inmune en animales a los que se les ha inyectado el péptido sólo (IFN-gamma reducida, producción de TNF-alfa, IL-10 aumentado, TGF-beta e IL-5, fuerte inducción de CD62L-CD45Rblow CD8 + tetrámero + células reguladoras).

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Ejemplo 7 Inducción altamente eficaz de respuestas inmunes alternando el plásmido no replicante (entrada) con el péptido (amplificación) administrado al nodo de linfa

Tres grupos de ratones HHD, transgénicos para el gen de MHC humano clase I HLA.A2, fueron inmunizados mediante la administración intralinfática contra el antígeno asociado del tumor de melan-A. Los animales fueron cebados (inducidos) por inoculación directa en los nodos de linfa inguinales con tanto el plásmido pSEM (25 \mug/nodo de linfa) como el péptido ELA (ELAGIGILTV, análogo de melan A 26-35 A27L) (25 \mug/nodo de linfa) seguido de una segunda inyección tres días más tarde. Después de diez días, los ratones fueron reforzados con pSEM o ELA de la misma manera seguido de un aumento final tres días más tarde para amplificar la respuesta (véase la Figura 11A para un programa de inmunización similar), causando las siguientes combinaciones de inducción y amplificación: pSEM + pSEM, pSEM + ELA, y ELA + ELA (12 ratones por grupo). Diez días más tarde, la respuesta inmune fue controlada usando un reactivo de tetrámero específico de melan-A (HLA-A*0201 MART1 (ELAGIGILTV)-PE, Beckman Coulter). A los ratones individuales les fue extraída sangre vía el seno venoso retro-orbital y fueron aislados PBMC usando la centrifugación por densidad (Lympholyte Mammal, Laboratorios Cedarlane) a 2000 revoluciones por minuto durante 25 minutos. Los PBMC fueron teñidos conjuntamente con un anticuerpo específico de ratón frente a CD8 (BD Biosciences) y el reactivo de tetrámero melan-A y los porcentajes específicos se determinaron por citometría de flujo usando un citómetro de flujo del calibre FACS (BD). Los porcentajes de células CD8+ específicos de melan-A, generadas por las diferentes combinaciones de cebado/refuerzo, se muestran en las Figuras 8A y 8B. El grupo cebado de plásmido/refuerzo del péptido (pSEM + ELA) produjo una fuerte respuesta inmune con un porcentaje de tetrámero medio de 4,6 entre todos los animales. Se define que los ratones respondedores tienen porcentajes de tetrámero de 2 o mayor, lo que representaba un valor equivalente al promedio del grupo de control no inmunizado más 3 veces el error estándar (EE). Tales valores son considerados respuestas muy fuertes en la técnica y pueden ser conseguidas por lo general usando sólo vectores replicantes. El grupo de inmunización de pSEM + ELA contenía 10 de 12 ratones que fueron encontrados que eran sensibles y esto representaba una diferencia estadísticamente significativa comparando con el grupo de control (p (Fisher) = 0,036). Las otras dos series de inmunización, pSEM + pSEM y ELA + ELBA, produjeron 6 de 12 respondedores, pero tenían valores de p mayores que 0,05 haciéndolos menos estadísticamente significativos. Para medir la inmunidad de estos ratones, los animales fueron expuestos a células diana cubiertas del péptido in vivo. Se aislaron esplenocitos de la camada de ratones HHD control y se incubaron con 20 \mug/mL de péptido ELA durante 2 horas. Estas células se tiñeron entonces con fluorescencia CFSE^{hi} (4,0 \muM durante 15 minutos) y se co-inyectaron intravenosamente en ratones inmunizados con una proporción igual de esplenocitos control que no habían sido incubados con el péptido, teñidos con fluorescencia CFSE^{lo} (0,4 \muM). Dieciocho horas más tarde, la eliminación específica de células diana se midió retirando el bazo, el nodo de linfa, PBMC, y el pulmón de los animales expuestos (5 ratones por grupo) y midiendo la fluorescencia de CFSE por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 8C. En el grupo de cebado/refuerzo de pSEM + ELA, 4 de 5 ratones mostraron una fuerte respuesta inmune y se aclaró con éxito aproximadamente el 50% de las dianas en cada uno de los tejidos probados. Se muestran también los histogramas representativos para cada uno de los grupos experimentales (PBMC).

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Ejemplo 8 El refuerzo del péptido reactiva con eficacia las células de recuerdo inmunes en animales inducidos con ADN y se mantuvo hasta que los niveles de tetrámero estuvieron cerca de la línea de fondo

Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en ratones (5 ratones por grupo) después de la inmunización, como se describe en la Figura 9A. Antes de 5 semanas después de la finalización del programa de inmunización, los niveles de tetrámero habían vuelto cerca de la línea de fondo. Los animales fueron reforzados a las 6 semanas con el péptido ELA para determinar si las respuestas inmunes podían ser restauradas. Los animales que reciben inmunizaciones previas del plásmido pSEM (ADN/ADN, Figura 9C) mostraron una expansión sin precedentes de linfocitos T CD8+ específicos de melan-A después de la amplificación de ELA, con niveles en el intervalo de más del 10%. Por otra parte, los animales que recibieron inyecciones previas del péptido ELA (Figura 9A) derivaron en poca ventaja desde el refuerzo de ELA como se indica por la menor frecuencia de células que tiñen el tetrámero. Los ratones que recibieron el ADN seguido del péptido como inmunización inicial mostraron una expansión significativa, pero intermedia al recibir el péptido de amplificación, comparando con los otros grupos. (Figura 9B). Estos resultados demuestran claramente una fuerte razón fundamental para una estrategia de inmunización de entrada de ADN/ADN y amplificación del péptido.

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Ejemplo 9 Optimización de la inmunización para conseguir altas frecuencias de linfocitos T específicos en órganos linfoides y no linfoides

Como se describe en la Figura 9A-C, los ratones que fueron sometidos a una inmunización de entrada con una serie de dos grupos de inyecciones de plásmido seguido de la amplificación con el péptido produjeron una potente respuesta inmune. Se muestran otras pruebas para esto en las Figuras 10A-C que ilustran los niveles de tetrámero antes (Figura 10A) y después de la administración del péptido (Figura 10B). Los niveles de tetrámero en ratones individuales pueden ser claramente observados y representan hasta el 30% de la población total de CD8 + de linfocitos T en ratones que recibieron el protocolo de inmunización de ADN/ADN/Péptido. Estos resultados se resumen en el gráfico en la Figura 10C. Además, los altos niveles de tetrámero son claramente evidentes en sangre, nodo de linfa, bazo y pulmón de animales que recibieron este protocolo de inmunización refinado (Figura 10D).

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Ejemplo 10 Una secuencia de administración exacta de inmunógeno de plásmido y péptido determina la magnitud de la respuesta inmune

Seis grupos de ratones (n=4) fueron inmunizados con el plásmido que expresaba el análogo melan-A 26-35 A27L (pSEM) o el péptido melan-A usando el cebado y la amplificación por inoculación directa en los nodos de linfa inguinales. El programa de inmunización se muestra en la Figura 11A (dosis de 50 \mug de plásmido o péptido/nodo de linfa, bilateralmente). Dos grupos de ratones fueron iniciados usando el plásmido y se amplificaron con plásmido o péptido. A la inversa, dos grupos de ratones fueron iniciados con el péptido y se amplificaron con péptido o plásmido. Finalmente, dos grupos de ratones control fueron iniciados con péptido o con plásmido, pero no se amplificaron. A las cuatro semanas después de la última inoculación, los bazos se recogieron y las suspensiones de esplenocitos se prepararon, reunieron y estimularon con el péptido melan-A en placas ELISPOT cubiertas con anticuerpo anti-IFN-\gamma. A 48 horas después de la incubación, fue desarrollado el ensayo y la frecuencia de linfocitos T que producen citoquina que reconocían melan-A fue contada automáticamente. Los datos se representaron en la Figura 5B como la frecuencia de linfocitos T específicos/1 millón de células de respondedor (medio de triplicados + EE). Los datos mostraron que la inversión del orden de iniciación y amplificación de las dosis del plásmido y péptido tiene un efecto sustancial en la magnitud total de la respuesta: mientras que la entrada de plásmido seguido de la amplificación del péptido causaba la respuesta más alta, la dosis de iniciación del péptido seguido de la amplificación del plásmido generó una respuesta sustancialmente más débil, similar a la administración repetida del péptido.

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Ejemplo 11 Correlación de respuestas inmunes con el protocolo de inmunización y por la eficacia manifestada in vivo aclarando las células diana dentro de los órganos linfoides y no linfoides

Para evaluar la respuesta inmune obtenida por el protocolo de entrada y amplificación, fueron expuestos 4 grupos de animales (n=7) con las células diana cubiertas de melan-A in vivo. Fueron aislados esplenocitos de la camada de ratones HHD control y se incubaron con 20 \mug/mL del péptido ELA durante 2 horas. Estas células se tiñeron entonces con fluorescencia CFSE^{hi} (4,0 \muM durante 15 minutos) y se co-inyectaron intravenosamente en ratones inmunizados con una proporción igual de esplenocitos control teñidos con fluorescencia CASE^{lo} (0,4 \muM). Dieciocho horas más tarde, la eliminación específica de células diana se midió retirando el bazo, el nodo de linfa, PBMC y el pulmón de los animales expuestos y midiendo la fluorescencia de CFSE por citometría de flujo. Las figuras 12A y 12B muestran gráficos de histograma de CFSE de tejidos de animales control no inmunizados o animales que recibieron un protocolo de inmunización de péptido/péptido, ADN/péptido o ADN/ADN (se muestran dos ratones representativos de cada grupo). El grupo de entrada de ADN/amplificación de péptido mostró altos niveles de eliminación específica de células diana en órganos linfoides así como no linfoides (Figura 12C) y representó el único protocolo de inmunización que demostró una correlación específica con los niveles de tetrámero (Figura 12D, r^{2} = 0,81 o más alto para todos los tejidos probados).

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Ejemplo 12 Aclaramiento de células tumorales humanas en animales inmunizados por el protocolo de entrada y amplificación refinado

La inmunidad con el antígeno melan-A fue probada además exponiendo ratones a células tumorales de melanoma humanas después de la inmunización con el protocolo refinado. La figura 13A muestra la estrategia de inmunización refinada empleada para los 3 grupos probados. Los ratones inmunizados recibieron dos inyecciones intravenosas de células diana humanas, 624.38 HLA.A2^{+}, marcadas con fluorescencia CFSE^{hi} mezclada con una proporción igual de células control 624.28 HLA.A2' marcadas con CFSE^{lo} como se ilustra en la Figura 13B. Catorce horas más tarde, los ratones fueron sacrificados y los pulmones (el órgano en el cual las dianas humanas se acumulan) fueron analizados para la lisis específica de células diana por citometría de flujo. La figura 13C muestra gráficos de histograma de CFSE representativos derivados de un ratón, de cada grupo. La entrada del ADN seguido de una amplificación del péptido claramente inmunizó a los ratones contra las células tumorales humanas como se demuestra por la eliminación específica de casi el 80% de las dianas en el pulmón. La serie más larga de inyecciones de entrada del ADN también condujo a una mayor frecuencia adicional de células CD8 + reactivas con el tetrámero melan-A.

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Ejemplo 13 La estrategia de entrada de ADN-amplificación del péptido causa una fuerte inmunidad contra un epítopo derivado de SSX2. KASEKIFYV (SSX241-49)

Los animales inmunizados contra el antígeno asociado al tumor de SSX2 usando el programa de inmunización definido en la Figura 14A, mostraron una fuerte respuesta inmune. La figura 14B muestra la tinción representativa del tetrámero de ratones cebados (incorporados) con el plásmido pCBP y reforzados (amplificados) con SSX241-49 K41F o con análogo del péptido K41Y. Estos análogos son específicos y reactivos con los linfocitos T específicos para el epítopo SSX241-49. Estos ejemplos ilustran que el protocolo de entrada y amplificación puede producir una especificidad de antígeno SSX2 que se acerca al 80% de los linfocitos T CD8 disponibles. El plásmido pCBP y los principios de su diseño se describen en la solicitud de patente de EE.UU. Nº. 10/292.413 (Publicación Nº. 20030228634 A1) titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOMES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN".

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Ejemplo 14 La estrategia de entrada y amplificación puede ser usada para provocar respuestas inmunes contra epítopos localizados en antígenos diferentes simultáneamente

Cuatro grupos de ratones HHD (n=6) fueron inmunizados vía una intra-inyección del nodo de linfa con cualquiera de pSEM solo; pCBP solo; pSEM y pCBP como una mezcla; o con pSEM en el LN izquierdo y pCBP en el LN derecho. Estas inyecciones fueron seguidas 10 días más tarde con un ELA o con el aumento del péptido SSX2 en la misma manera. Todos los ratones inmunizados fueron comparados con los controles no inmunizados. Los ratones fueron expuestos a esplenocitos de la camada de HHD cubiertos de ELA o péptido SSX2, empleando un ensayo de citotoxicidad de triple máximo de CFSE in vivo lo que permite la evaluación de la lisis específica de dos dianas de antígeno simultáneamente. Números iguales de células control-CFSE^{lo}, SSX2-CFSB^{med} y BLA-CFSE^{hl} fueron infundidas intravenosamente en ratones inmunizados, y 18 horas más tarde los ratones fueron sacrificados y la eliminación de células dianas se midió en bazo (Figura 15A) y sangre (Figura 15B) por fluorescencia CFSE usando un citómetro de flujo. Las figuras 15A y 15B muestran el tanto por ciento de lisis específica de las dianas de SSX2 y antígeno de Melan-A de ratones individuales y la Figura 15C resume los resultados en un formato de diagrama de barras. La inmunización de los animales con una mezcla de dos vacunas generó inmunidad frente a ambos antígenos y causó la respuesta inmune más alta, representando una lisis específica del tanto por ciento de SSX22 promedio en bazo de 30 +/-11 y 97 +/-1 para Melan-A.

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Ejemplo 15 Los ciclos repetidos de entrada de ADN y la amplificación del péptido consiguen y mantienen una fuerte inmunidad

Tres grupos de animales (n=12) recibieron dos ciclos de los protocolos de inmunización siguientes: ADN/ADN/
ADN; ADN/péptido/péptido; o ADN/ADN/péptido. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones después de cada ciclo de inmunización y se representan en la Figura 16. El ciclo de inmunización de ADN/ADN/
péptido inicial causó un promedio de 21,1 +/-3,8 por ciento de células T CD8+ + tetrámero casi 2 veces más alto que los otros dos grupos. Después del segundo ciclo de la inmunización de entrada y amplificación el porcentaje de tetrámero medio para el grupo de ADN/ADN/péptido aumentó del 54,5% al 32,6 +/-5,9-2,5-veces más alto que los niveles de ADN/péptido/péptido y 8,25 veces más alto que los niveles del grupo de ADN/ADN/ADN. Además, en estas condiciones, los otros programas de inmunización consiguieron un poco de aumento de la frecuencia de linfocitos T positivos de tetrámero.

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Ejemplo 16 Linfocitos T de recuerdo duraderos provocados por regímenes de inducción inmune y amplificación, que consistían en plásmido alternantes y vectores de péptido

Cuatro animales transgénicos HHD (3563, 3553, 3561 y 3577) recibieron dos ciclos del siguiente protocolo de entrada y amplificación: ADN/ADN/péptido. El primer ciclo implicó la inmunización los días -31, -28, -17, -14, -3, 0; el segundo ciclo implicó inmunizaciones el día 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con el péptido el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones los 7-10 días después de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización. Las flechas en el diagrama corresponden a la finalización de los ciclos. (Figura 17A). Los cuatro animales mostraron una respuesta después del último refuerzo (amplificación), demostrando la persistencia del recuerdo inmune en vez de la inducción de tolerancia.

Cinco animales transgénicos HHD (3555, 3558, 3566, 3598 y 3570) recibieron dos ciclos del siguiente protocolo de entrada y amplificación: ADN/péptido/péptido. Como antes, el primer ciclo consistió en la inmunización los días -31, -28, -17, -1, -4, -3, 0; el segundo ciclo consistió en inmunizaciones los días 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con el péptido el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones a los 7-10 días después de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización (Figura 17B). Por comparación, este protocolo de entrada y amplificación que sustituye al péptido por las inyecciones de ADN posteriores en cada ciclo resultó, en este experimento, en un menor recuerdo inmune o en una sensibilidad reducida.

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Ejemplo 17 Linfocitos T de recuerdo duraderos con la capacidad de expansión sustancial son generados por la administración de ADN intranodular

Siete animales transgénicos HHD recibieron dos ciclos del protocolo de inmunización siguiente: ADN/ADN/ADN. El primer ciclo implicó la inmunización los días - 3, -1, -28, -17, -14, -3, 0; el segundo ciclo implicó inmunizaciones los días 14, 17, 28, 31, 42 y 45. Los ratones fueron reforzados con el péptido el día 120. Los niveles de tetrámero de Melan-A fueron medidos en los ratones 7-10 días después de cada ciclo de inmunización y periódicamente hasta 90 días después del segundo ciclo de inmunización. (Figura 18). Siete animales mostraron % de frecuencias límites de células de tetrámero + durante y después de los dos ciclos de inmunización, pero mostraron fuertes respuestas después de un aumento del péptido, demostrando un recuerdo inmune sustancial.

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Ejemplo 18 Varias combinaciones del antígeno más el adyuvante inmunopotenciador son eficaces para el entrada de una respuesta CTL

La administración intranodular de péptido es un medio muy potente de amplificar respuestas inmunes provocadas por la administración intralinfática de agentes (replicativos o no replicativos) que comprenden o están en asociación con adyuvantes tales como TLR.

Se refuerzan sujetos (tales como ratones, seres humanos u otros mamíferos) por infusión intranodular o inyección con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más el adyuvante (CpG, dsRNA, ligandos de TLR), proteína recombinante más el adyuvante (CpG, dsRNA, ligandos de TLR), microbios eliminados o antígenos purificados (p. ej, componentes de la pared celular que tienen actividad inmunopotenciadora) y se amplifican por la inyección intranodular del péptido sin el adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después del aumento por los métodos de tinción del tetrámero y otros muestra el aumento sustancial de la magnitud. Por el contrario, un aumento que utiliza el péptido sin el adyuvante por otras rutas no consigue el mismo aumento de la respuesta inmune.

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Ejemplo 19 La administración intranodular de péptido es un medio muy potente de amplificar respuestas inmunes provocadas por el antígeno más el adyuvante inmunopotenciador por cualquier ruta de la administración

Se inmunizan sujetos (tales como ratones, seres humanos u otros mamíferos) por la administración parenteral o mucosa de vectores tales como plásmidos, virus, péptido más el adyuvante (CpG, dsRNA, ligandos de TLR), proteína recombinante más el adyuvante (CpG, dsRNA, ligandos de TLR), microbios eliminados o antígenos purificados (p. ej, componentes de la pared celular que tienen actividad inmunopotenciadora) y se amplifican por la inyección intranodular del péptido sin el adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después del aumento por los métodos de tinción del tetrámero y otros muestra el aumento sustancial de la magnitud. Por el contrario, un aumento que utiliza el péptido sin el adyuvante por otras rutas que la intranodular no consigue el mismo aumento de la respuesta inmune.

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Ejemplo 20 Rotura de la tolerancia usando un protocolo de inmunización de entrada y amplificación

A fin de romper la tolerancia o restaurar la sensibilidad inmune contra autoantígenos (tales como antígenos asociados al tumor) sujetos (tales como ratones, seres humanos u otros mamíferos) se inmunizan con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más el adyuvante (CpG, dsRNA, miméticos de TLR), proteína recombinante más el adyuvante (CpG, dsRNA, miméticos de TLR), los microbios eliminados o los antígenos purificados y se incrementa por la inyección intranodular con el péptido (correspondiente a un epítopo propio) sin el adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después del aumento por los métodos de tinción del tetrámero y otros muestra el aumento sustancial de la magnitud de la respuesta inmune ("ruptura de la tolerancia").

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Ejemplo 21 Práctica clínica para la inmunización por entrada y amplificación

Se diagnostican pacientes que necesitan un tratamiento por una enfermedad neoplásica o infecciosa usando criterios clínicos y de laboratorio; se tratan o no usando una terapia de primera línea; y se refiere a una evaluación para inmunoterapia activa. Se hace la inscripción según otros criterios (perfil del antígeno, haplotipado de MHC, sensibilidad inmune) según la naturaleza de la enfermedad y las características del producto terapéutico. El tratamiento (Figura 19) se realiza por inyección intralinfática o infusión (bolo, bomba programable u otros medios) del vector (plásmidos) y antígenos de proteína (péptidos) en una secuencia precisa. El protocolo más preferido implica ciclos repetidos que abarcan la entrada del plásmido seguido de la amplificación de la(s) dosis del péptido. La frecuencia y la continuación de tales ciclos pueden ser ajustadas según la respuesta medida por medios inmunológicos, clínicos y otros. La composición que se administra puede ser monovalente o polivalente, conteniendo vectores múltiples, antígenos o epítopos. La administración puede ser a uno o varios nodos de linfa simultáneamente o en etapas. Los pacientes que reciben esta terapia muestran una mejora de los síntomas.

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Ejemplo 22 Práctica clínica para la inducción de la desviación inmune o desactivación de linfocitos T patógenos

Los pacientes con trastornos autoinmunes o inflamatorios son diagnosticados usando criterios clínicos y de laboratorio, son tratados o no usando terapia de primera línea, y se refiere a la evaluación para inmunoterapia activa. Se hace la inscripción según otros criterios (perfil del antígeno, haplotipado de MHC, sensibilidad inmune) según la naturaleza de la enfermedad y las características del producto terapéutico. El tratamiento se realiza por inyección intralinfática o infusión (bolo; bomba programable u otros medios) del péptido carente de adyuvantes promotores de T1 y/o junto con moduladores inmunes que amplifican la desviación inmune. Sin embargo, las inyecciones de bolos periódicas son el modo preferido para generar la desviación inmune por este método. Los tratamientos con el péptido pueden llevarse a cabo cada semana, cada dos semanas o con menos frecuencia (p. ej., mensualmente), hasta que sea obtenido un efecto deseado en la inmunidad o el estado clínico. Tales tratamientos pueden implicar una sola administración, o administraciones múltiples estrechamente espaciadas como en la figura 2, grupo 2. La terapia de mantenimiento puede iniciarse después, usando un régimen ajustado que implica inyecciones menos frecuentes. La composición que se administra puede ser monovalente o polivalente, conteniendo múltiples epítopos. Se prefiere que la composición esté sin ningún componente que prolongue la residencia del péptido en el sistema linfático. La administración puede hacerse a uno o varios nodos de linfa simultáneamente o en etapas y la respuesta se controla midiendo los linfocitos T específicos para inmunizar péptidos o epítopos no relacionados ("expansión de epítopo"), además de los métodos clínicos pertinentes.

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Ejemplo 23 Composiciones inmunógenas (p. ej., Vacunas Virales)

Se inyectaron seis grupos (n=6) de ratones transgénicos HLA-A2 con 25 \mug del vector de plásmido bilateralmente en los nodos de linfa inguinales, según el programa siguiente: día 0, 3, 14 y 17. El vector codifica tres epítopos restringidos de A2 de gag de VIH (SLYNTVATL, VLAEAMSQV, MTNNPPIPV), dos de pol (KLVGKLNWA, ILKEPVHGV) y uno de env (KLTPLCVTL). Dos semanas después del último ciclo del entrada, a los ratones se les inyectaron mezclas que abarcaban todos estos cinco péptidos (5 \mug/péptido/nodo bilateralmente tres días separados). En paralela, a cinco grupos de ratones se les inyecta péptidos individuales (5 \mug/péptido/nodo bilateralmente tres días separados). Siete días más tarde a los ratones se les extrae sangre y la respuesta se evalúa por tinción del tetrámero frente a cada péptido. Después, la mitad de los ratones se exponen al virus de Vaccinia recombinante que expresa env; gag o pol (10^{3} TCID_{5}/ratón) y en 7 días, se mide el título viral en los ovarios usando un ensayo de placa convencional. La otra mitad se sacrifica, los esplenocitos se estimulan con péptidos durante 5 días y la actividad citotóxica se mide frente a células diana cubiertas de péptidos. Como controles, a los ratones les fueron inyectados plásmido o péptidos solos. Los ratones reforzados con el plásmido y amplificados con los péptidos mostraron una inmunidad más fuerte frente a los cinco péptidos, por tinción de tetrámero y citotoxicidad.

Más generalmente, a fin de romper la tolerancia, restaurar la sensibilidad inmune o inducir la inmunidad contra los antígenos no propios tales como virales, bacterianos, parásitos o microbianos, los sujetos (tales como ratones, seres humanos u otros mamíferos) son inmunizados con vectores tales como plásmidos, virus, péptido más el adyuvante (CpG, dsRNA, miméticos de TLR), proteína recombinante más el adyuvante (CpG, dsRNA, miméticos de TLR), microbios eliminados o antígenos purificados (tales como componentes de la pared celular) y se incrementan por la inyección intranodular con el péptido (correspondiente a un epítopo propio) sin el adyuvante. La respuesta inmune medida antes y después del aumento por los métodos de tinción del tetrámero y otros muestra el aumento sustancial de la magnitud de la respuesta inmune. Tal estrategia puede ser usada para proteger contra la infección o tratar infecciones crónicas causadas por agentes tales como HBV, HCV, HPV, CMV, virus de la gripe, VIH, HTLV, RSV, etc.

Claims (37)

1. El uso de una composición de entrada que se administra directamente al sistema linfático de un mamífero, comprendiendo dicha composición de entrada un plásmido no replicante que codifica un inmunógeno y que comprende además un inmunopotenciador, comprendiendo el inmunógeno un antígeno o su fragmento inmunógeno; y una composición de amplificación que se administra directamente al sistema linfático del mamífero, comprendiendo dicha composición de amplificación un péptido de amplificación, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho antígeno, en el que la composición de entrada y la composición de amplificación no son iguales, y en el que la composición de entrada se administra al menos dos veces, en un curso de uno hasta aproximadamente siete días o como una infusión continua que tiene una duración de entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente 7 días para la fabricación de un medicamento de combinación de inmunización para la profilaxis o la terapia de enfermedades infecciosas o neoplásicas.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el inmunopotenciador es una citoquina.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el inmunopotenciador es un ligando del receptor del tipo Toll.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que el inmunopotenciador comprende una secuencia inmunoestimuladora.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que el inmunopotenciador comprende ARN.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición de amplificación está libre de inmunopotenciador.

7. El uso de la reivindicación 1, en el que la administración directa al sistema linfático del mamífero comprende la administración directa a un nodo de linfa o vaso de linfa.

8. El uso de la reivindicación 7, en el que la administración directa es a dos o más nodos de linfa o vasos de linfa.

9. El uso de la reivindicación 7, en el que el nodo de linfa es seleccionado de un grupo que consiste en nodos de linfa inguinales, axiliares, cervicales y tonsilares.

10. El uso de la reivindicación 1, en el que la administración de entrada y amplificación de composiciones produce una respuesta de linfocitos T efectores frente al antígeno.

11. El uso de la reivindicación 10, en el que la respuesta del linfocito T efector comprende la producción de una citoquina pro-inflamatoria.

12. El uso de la reivindicación 11, en el que la citoquina es \gamma-IFN o TNF\alpha.

13. El uso de la reivindicación 10, en el que la respuesta del linfocito T efector comprende la producción de una quimioquina de linfocitos T.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que la quimioquina es RANTES o MIP-1a.

15. El uso de la reivindicación 1, en el que el epítopo es un epítopo constitutivo.

16. El uso de la reivindicación 1, en el que el epítopo es un epítopo inmune.

17. El uso de la reivindicación 1, en el que la etapa de entrega o la etapa de administración comprenden una inyección de un solo bolo.

18. El uso de la reivindicación 1, en el que la etapa de entrega o la etapa de administración comprenden inyecciones de bolo repetidas.

19. El uso de la reivindicación 1, en el que la etapa de administración comprende una infusión continua.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que la infusión tiene una duración de entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente 7 días.

21. El uso de la reivindicación 1 que tiene un intervalo entre la terminación de la etapa de administración y el principio de la etapa de administración, en el que el intervalo es al menos aproximadamente siete días.

22. El uso de la reivindicación 21, en el que el intervalo está entre aproximadamente 7 y aproximadamente 14 días.

23. El uso de la reivindicación 21, en el que el intervalo es a lo largo de aproximadamente 75 días.

24. El uso de la reivindicación 1, en el que el antígeno es un antígeno asociado a la enfermedad.

25. El uso de la reivindicación 24, en el que el antígeno asociado a la enfermedad es un antígeno asociado a un tumor.

26. El uso de la reivindicación 24, en el que el antígeno asociado a la enfermedad es un antígeno asociado a un patógeno.

27. El uso de la reivindicación 1, en el que el antígeno es un antígeno asociado a una diana.

28. El uso de la reivindicación 27, en el que la diana es una célula neoplásica.

29. El uso de la reivindicación 27, en el que la diana es una célula infectada por un patógeno.

30. El uso de la reivindicación 29, en el que la célula infectada por el patógeno es infectada por un protozoo, una bacteria, unos hongos, un virus o un prión.

31. El uso de la reivindicación 10, en el que la respuesta del linfocito T efector es detectada por al menos un indicador seleccionado del grupo que consiste en un ensayo de citoquina, un ensayo de Elispot, un ensayo de citotoxicidad, un ensayo de tetrámero, una respuesta DTH, una respuesta clínica, el encogimiento del tumor, el aclaramiento del tumor, la inhibición de la progresión del tumor, un menor título del patógeno, el aclaramiento del patógena y la mejora de un síntoma de la enfermedad.

32. El uso de la reivindicación 10, en el que la respuesta del linfocito T efector es una respuesta de un linfocito T citotóxico.

33. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición amplificante se administra en uno o varios tiempos.

34. Un juego de composiciones inmunógenas que comprenden una composición de entrada y amplificación, en el que la composición de entrada comprende un plásmido no replicante que codifica un inmunógeno y además comprende un inmunopotenciador, comprendiendo el inmunógeno un antígeno o su fragmento inmunógeno; y en el que la composición de amplificación comprende un péptido de amplificación, en el que el péptido corresponde a un epítopo de dicho antígeno, en el que la composición de entrada y la composición de amplificación no son iguales, para la profilaxis o la terapia de enfermedades infecciosas o neoplásicas en la administración de las composiciones directamente al sistema linfático de dicho mamífero, en el que la composición de entrada se administra al menos dos veces en un curso de uno hasta aproximadamente siete días con una infusión continua que tiene una duración de entre aproximadamente 8 horas hasta aproximadamente siete días.

35. El juego de la reivindicación 34, en el que el plásmido que codifica el inmunógeno comprende además una secuencia inmunoestimuladora que sirve como un agente inmunopotenciador.

36. El juego de la reivindicación 35, en el que el agente inmunopotenciador es seleccionado del grupo que consiste en un ligando de TLR, una secuencia inmunoestimuladora, un ADN que contiene CpG, un dsRNA, un ligando endocítico del Receptor de Reconocimiento de Patrones (PRR), un LPS, una madera de Panamá, tucaresol y una citoquina pro-inflamatoria.

37. El juego de la reivindicación 34 en el que el juego comprende 1-6 dosis de la composición de entrada.