ES2350089T3 - Un miembro de la familia de las proteína quinasas humanas y usos de la misma. - Google Patents

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Abstract

Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio que comprende analizar la capacidad del compuesto o agente para modular la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en la que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; y e) una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 ó 3, o la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o su complemento; b) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en el que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; y c) un polipéptido de SEQ ID NO:2, identificando así un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio.

Description

Antecedentes de la Invención
Que el fosfato se asocia fuertemente a moléculas, p.ej, a una proteína, se sabe desde finales del siglo diecinueve. Desde entonces, se han encontrado diversos enlaces covalentes del fosfato a las proteínas. Los más comunes implican la
5 esterificación de fosfato a serina, treonina y tirosina y con cantidades más pequeñas unido a lisina, arginina, histidina, ácido aspártico, ácido glutámico y cisteína. La aparición de moléculas fosforiladas, p.ej, proteínas, implica la existencia de una o varias quinasas, p.ej, proteína quinasas, capaces de fosforilar varias moléculas, p.ej, los residuos de aminoácidos en las proteínas, y también de fosfatasas, p.ej, proteína
10 fosfatasas, capaces de hidrolizar varias moléculas fosforiladas, p.ej, los residuos de aminoácidos fosforilados en las proteínas. Las proteína quinasas desempeñan papeles críticos en la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos asociados al crecimiento y a la división celular (D’Urso et al. (1990) Science 250:786-791; Birchmeier et al. (1993) Bioessays 15:185
15 189). Por ejemplo, se ha demostrado que estas quinasas participan en la transmisión de señales de los receptores del factor del crecimiento (Sturgill et al. (1988) Nature 344:715-718; Gomez et al. (1991) Nature 353:170-173), en el control de la entrada de células en mitosis (Nurse (1990) Nature 344:503-508; Maller (1991) Curr. Opin. Cell Biol. 3:269-275) y en la regulación del empaquetamiento de actina (Husain-Chishti et
20 al. (1988) Nature 334:718-721). Las proteína quinasas sirven como receptores del factor de crecimiento y son transductores de señales y se han implicado en la transformación celular y en la malignidad (Hunter et al. (1992) Cell 70:375-387; Posada et al. (1992) Mol. Biol. Cell 3:583-592; Hunter et al. (1994) Cell 79:573-582). Las modificaciones en los genes de quinasa y sus productos pueden conducir a una
25 proliferación celular desregulada, que es un distintivo del cáncer. La modulación de estos genes y sus actividades reguladoras pueden permitir el control de la proliferación y de la invasión de células tumorales.
Las proteína quinasas pueden ser divididas en diferentes grupos según la similitud de las secuencias de aminoácidos o la especificidad de los residuos de 30 tirosina o de serina/treonina. También se han descrito un pequeño número de quinasas de especificidad dual. Dentro de la amplia clasificación, las quinasas pueden ser subdivididas además en familias cuyos miembros comparten un grado más alto de identidad de la secuencia de aminoácidos del dominio catalítico y también tienen propiedades bioquímicas similares. La mayor parte de los miembros de la familia de 35 proteína quinasa también comparten rasgos estructurales fuera del dominio catalítico
de la quinasa que reflejan sus papeles celulares particulares. Éstos incluyen dominios reguladores que controlan la actividad de quinasa o la interacción con otras proteínas (Hanks et al. (1988) Science 241:42-52).
Las quinasas reguladas por señales extracelulares / proteína quinasas
5 activadas por mitógenos (ERK/MAPK por sus siglas en inglés “extracellular signalregulated kinases/mitogen-activated protein kinases”) y las quinasas dirigidas a ciclina (CDK “cyclin-directed kinases”) representan dos grandes familias de quinasas de serina-treonina (véase Songyang et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16: 6486-6493). Ambos tipos de quinasas funcionan en el crecimiento celular, la división celular y la
10 diferenciación celular como respuesta a estímulos extracelulares. Los miembros de la familia ERK\MAPK son participantes críticos en las rutas intracelulares de señalización. Los activadores corriente arriba así como los componentes de ERK\MAPK se fosforilan después del contacto de las células con factores de crecimiento u hormonas o como respuesta a agentes agresores celulares, por ejemplo,
15 calor, luz ultravioleta y citoquinas inflamatorias. Estas quinasas transportan mensajes que han sido transmitidos desde la membrana plasmática al citoplasma por quinasas corriente arriba en el núcleo donde fosforilan los factores de transcripción y efectúan la modulación de la transcripción de genes (Karin et al. (1995) Curr. Biol. 5: 747-757). Los sustratos de la familia ERK\MAPK incluyen c-fos, c-jun, APF2, y miembros de la
20 familia de ETS ELK1, Sap1a, y c-Ets-1 (citado en Brott et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 963-968). Las rutas de transducción de la señalización que emplean a miembros de la familia ERK/MAPK de serina/treonina quinasas están ampliamente conservadas entre eucariotas. La multiplicidad de estas rutas permite que la célula responda a estímulos
25 extracelulares divergentes iniciando una amplia serie de respuestas en los límites desde el crecimiento celular a la apoptosis. Las rutas de ERK/MAPK consisten en un módulo de señalización nuclear principal y tres capas en donde las ERK/MAPK están reguladas por las quinasas MAPK/ERK (MEK) y las MEK, por su parte, están reguladas por quinasas de quinasa MAPK (MAPKKK). Las rutas ERK/MAPK activadas
30 por estrés mamíferas han sido implicadas en numerosas funciones fisiológicas importantes, incluyendo el crecimiento y la proliferación celular, las respuestas inflamatorias y la apoptosis. Por ejemplo, la activación de la ruta de señalización de ERK1,2 por un factor de crecimiento mitogénico, un promotor tumoral o por la transformación suprime la expresión del gen de decorina en fibroblastos, que a su vez,
puede promover la proliferación y la migración de células normales y malignas (Laine et al. (2000) Biochem. J. 349: 19-25). Las CDK regulan las transiciones entre etapas sucesivas del ciclo celular. La actividad de estas moléculas es controlada por acontecimientos de fosforilación y por
5 la asociación con ciclina. La actividad de las CDK está negativamente regulada por la asociación de pequeñas moléculas inhibitorias (Dynlacht (1997) Nature 389:148-152). Los objetivos de la CDK incluyen varios activadores transcripcionales tales como p110Rb, p107, y factores de transcripción, tales como p53, E2F, y ARN polimerasa II, así como varias proteínas citoesqueléticas y proteínas de señalización citoplásmica
10 (citado en Brott et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 963-968). Las proteína quinasas desempeñan papeles críticos en el crecimiento celular, en particular en la transducción de señales para la proliferación celular, diferenciación, y apoptosis. Por lo tanto, los nuevos polinucleótidos y proteínas de proteína quinasa son útiles para modular el crecimiento celular, la diferenciación y/o el desarrollo.
15 En este sentido, Baytel et al. (1998), Biochimica and Biophysica Acta, describen la clonación de un gen humano que codifica el protooncogén de Pim-2 humano y sugieren que es una serina treonina quinasa que puede estar implicada en procesos cancerosos del sistema hematopoyético y en la apoptosis. Además, Ishida et al. (2000) describen en la base de datos del EMBL, número de entrada AB042425, el
20 gen humano y la secuencia de la proteína de un homólogo del protooncogén de pim-2.
Resumen de la Invención
La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento de un nuevo miembro de la familia de proteína quinasa, denominado en este documento "2150" que 25 está implicado en los trastornos respiratorios. Este es un miembro de la familia de proteína quinasa que también ha sido descrito en la base de datos del EMBL con el número de entrada AB042425 como un homólogo del protooncogén pim-2. La secuencia de nucleótidos de un cADN que codifica 2150 se muestra en SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 2150 se muestra en SEQ ID NO:2.
30 Además, la secuencia de nucleótidos de la región de codificación está representada en SEQ ID NO:3. De acuerdo con esto, los rasgos esenciales de la invención son aquellas realizaciones que se reivindican.
35
Breve Descripción de los Dibujos
La figura 1 representa un gráfico de la hidropatía de 2150 humana. Los residuos relativamente hidrófobos son mostrados encima de la línea horizontal de 5 puntos, y los residuos relativamente hidrófilos están debajo de la línea horizontal de puntos. Los residuos de cisteína (cys) son indicados por líneas verticales cortas justo debajo del rastro de hidropatía. Se señalan los números correspondientes a la secuencia de aminoácidos del 2150 humano. Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: todo o parte de una secuencia hidrófoba, p.ej, una secuencia 10 por encima de la línea de puntos, p.ej, la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 75 a 85, de aproximadamente 175 a 185, y de aproximadamente 220 a 230 de SEQ ID NO:2; todo o parte de una secuencia hidrófila, p.ej, una secuencia por debajo de la línea de puntos, p.ej, la secuencia de aproximadamente 10 a 20 aminos, de aproximadamente 190 a 200, y de aproximadamente 235 a 245 de
15 SEQ ID NO:2; una secuencia que incluye un Cys, o un sitio de glicosilación.
Descripción Detallada de la Invención
La secuencia de 2150 humana (SEQ ID NO:1), que tiene aproximadamente 1691 nucleótidos incluyendo las regiones no traducidas, contiene una secuencia de
20 codificación iniciada en la metionina predicha de aproximadamente 936 nucleótidos, incluyendo el codón de terminación (nucleótidos indicados como codificantes de SEQ ID NO:1 en la Figura 1; SEQ ID NO:3). La secuencia de codificación codifica una proteína de 311 aminoácidos (SEQ ID NO:2). El 2150 humano contiene las regiones siguientes u otros rasgos estructurales
25 (para una información general en cuanto a los identificadores de PFAM, prefijo de PS y números de identificación del dominio del prefijo PF, refiérase a Sonnhammer et al. (1997) Protein 28:405-420 y http://www.psc.edu/general/softwarc/packagcs/pfam/pfam.html):
30 un dominio de proteína quinasa (Número de entrada de PFAM PF00069) localizado en aproximadamente los residuos de aminoácidos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2;
un homólogo del protooncogén PIM-2 (ProDom Nº. PD219527) localizado en 35 aproximadamente los residuos de aminoácidos de 287 a 311 de SEQ ID NO:2; un distintivo de la región de unión de ATP de proteína quinasa localizada en aproximadamente los residuos de aminoácidos de 38 a 61 de SEQ ID NO: 2;
5 un distintivo del sitio activo de serina/treonina de proteína quinasas en aproximadamente los residuos de aminoácidos de 159 a 171 de SEQ ID NO:2;
tres sitios de fosforilación de proteína quinasa C (Prosite PS00005) localizados en aproximadamente los aminoácidos de 53 a 55, 130 a 132, y 272 a 274 de
10 SEQ ID NO:2;
cuatro sitios de fosforilación de caseína quinasa II (Prosite PS00006) localizados en aproximadamente los aminoácidos de 195 a 198, 204 a 207, 276 a 279, y 288 a 291 de SEQ ID NO:2;
15 un sitio de fosforilación de tirosina quinasa (Prosite PS00007) localizado en aproximadamente los aminoácidos de 25 a 32 de SEQ ID NO:2;
tres sitios de N-miristoilación (Prosite PS00008) localizados en
20 aproximadamente los aminoácidos de 41 a 46, 91 a 96, y 145 a 150 de SEQ ID NO:2;
La proteína 2150 contiene un número significativo de características estructurales en común con los miembros de la familia de la proteína quinasa. El 25 término "familia" cuando se refiere a la proteína y a las moléculas de ácido nucleico de la invención significa dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural común o motivo y que tienen la suficiente homología de secuencia de aminoácidos o nucleótidos como se define en este documento. Tales miembros de la familia pueden aparecer naturalmente o artificialmente y pueden ser de las mismas
30 especies o de diferentes. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano así como otras proteínas distintas de origen humano, o bien, puede contener homólogos de origen no humano, p.ej, proteínas de rata o ratón. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.
Según se usa en este documento, la expresión "proteína quinasa" incluye una proteína o polipéptido que es capaz de modular su propio estado de fosforilación o el estado de fosforilación de otra molécula, p.ej, una proteína o un polipéptido. Las proteína quinasas pueden tener especificidad con (es decir, una especificidad respecto
5 al fosforilado) los residuos de serina/treonina, residuos de tirosina, o tanto los residuos de serina/treonina como de tirosina, p.ej, las quinasas de especificidad dual.
Las proteína quinasas eucarióticas componen una gran familia de proteínas homólogas. Están todas relacionadas por la presencia de sus dominios de quinasa. Los miembros de la familia de la proteína quinasa de proteínas están caracterizados
10 por una región catalítica conservada que es también común a la subfamilia de serina/treonina de proteína quinasas. Los miembros de la familia de proteína quinasa de proteínas contienen típicamente una región rica en glicina que está próxima a un residuo de lisina. Se ha demostrado que esta región está implicada en la unión del ATP. Otra región en el dominio catalítico contiene un residuo de ácido aspártico
15 conservado que es importante para la actividad catalítica de la subfamilia de serina/treonina quinasa de las proteínas. Un polipéptido 2150 puede incluir un "dominio de proteína quinasa" o regiones homólogas con un "dominio de proteína quinasa". Según se usa en este documento, la expresión "dominio de proteína quinasa"
20 incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 250 a 260 residuos de aminoácidos de longitud y que tiene un valor de bits para el alineamiento de la secuencia respecto al dominio de la proteína quinasa (HMM) de al menos 250,3. Preferiblemente, un dominio de proteína quinasa media la fosforilación uniendo el ATP. Preferiblemente, un dominio de proteína quinasa incluye al menos
25 aproximadamente de 200 a 300 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 225 a 275 residuos de aminoácidos, o de aproximadamente 250 a 260 aminoácidos y tiene un valor de bits para el alineamiento de la secuencia respecto al dominio de proteína quinasa (HMM) de al menos 2,5e-51, más preferiblemente un valor de bits para el alineamiento de 2,5e-61, y lo más preferiblemente un valor de bits
30 para el alineamiento de 2,5-71 o mayor. El polipéptido 2150 contiene un dominio de proteína quinasa. Los miembros de la familia de proteína quinasa están relacionados en virtud de este dominio (también denominado el dominio "catalítico") que consiste en aproximadamente 250-300 residuos de aminoácidos. El dominio de proteína quinasa del polipéptido 2150
35 contiene una región rica en glicina de aproximadamente los residuos de aminoácidos
39 a 44 de SEQ ID NO:2 que están adyacentes a una lisina conservada localizada en aproximadamente el residuo de aminoácido 40 de SEQ ID NO:2. Esta región está implicada en la unión del ATP. El polipéptido 2150 también contiene un ácido aspártico conservado en aproximadamente el aminoácido 163 de SEQ ID NO:2. Este ácido 5 aspártico es la parte de un distintivo de sitio activo de proteína quinasas de serina/treonina que es específica a la mayor parte de serina/treonina quinasas específicas. El modelo de distintivo conservado es como sigue: [LIV]-G-{P}-G-{P}[FYWMGSTNH]-[SGA]-{PW}-[LIVCAT]-{PD}-x-[GSTACLIVMFY]-x(5,18)[LIVMFYWCSTAR]-[AIVP]-[LIVMFAGCKR]-K (SEQ ID NO:6), donde "D" es un residuo
10 de sitio activo. El polipéptido 2150 también puede contener un distintivo de región de unión de ATP de proteína quinasas en aproximadamente los residuos de aminoácido 38 a 61 de SEQ ID NO:2. El modelo de distintivo conservado es como sigue: [LIV]-G-{P}-G-{P}[FYWMGSTNH]-[SGA]-{PW}-[LIVCAT]-{PD}-x-[GSTACLIVMFY]-x(5,18)
15 [LIVMFYWCSTAR]-[AIVP]-[LIVMFAGCKR]-K (SEQ ID NO:7), donde "K" se une al ATP. En las susodichas secuencias distintivo conservadas, y otros motivos o secuencias distintivo descritas en este documento, se usa el código de una letra de la IUPAC estándar para los aminoácidos. Cada elemento en el modelo está separado por
20 una línea de puntos (-); los corchetes ([]) indican los residuos particulares que son aceptados en aquella posición; x indica que cualquier residuo es aceptado en aquella posición; {} indica que el residuo puede ser cualquier aminoácido SALVO QUE esté encerrado entre llaves; y los números en paréntesis (()) indican el número de residuos representados por el aminoácido acompañante (los números en 0 separado por una
25 coma indican que puede estar presente una variedad de residuos especificados por dichos números). Al dominio de proteína quinasa (HMM) se le ha asignado el Número de Entrada PFAM PF00069 (http://genome.wustl.edu/Pfam/.html). Un alineamiento del dominio de la proteína quinasa (aminoácidos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2) del 2150 humano con la secuencia de aminoácidos consenso del
30 dominio de proteína quinasa de Pfam (SEQ ID NO:4) se deriva de un modelo oculto de Markov (HMM) de PFAM. La secuencia derivada de Pfam (SEQ ID NO:4) es la secuencia de aminoácidos consenso que corresponde a los aminoácidos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2. En una realización preferida, un polipéptido 2150 o proteína tiene un "dominio
35 de proteína quinasa" o una región que incluye al menos aproximadamente de 200 a
300, más preferiblemente de aproximadamente 225 a 275 o de 250 a 260 residuos de aminoácidos y tiene al menos aproximadamente una homología del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 %, o 100 % con un "dominio de proteína quinasa," p.ej, el dominio de proteína quinasa del 2150 humano (p.ej, los residuos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2).
5 Para identificar la presencia de un dominio de "proteína quinasa" en una secuencia de proteína de 2150, y hacer la determinación de que un polipéptido o la proteína de interés tienen un perfil particular, puede buscarse la secuencia de aminoácidos de la proteína frente a la base de datos Pfam de HMM (p.ej, la base de datos Pfam, versión 2.1) usando los parámetros por defecto
10 (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). Por ejemplo, el programa hmmsf, que está disponible como parte del paquete HMMER de programas de búsqueda, es un programa de serie específico de familia para MILPAT0063 y un valor de 15 es el valor umbral de serie para determinar una coincidencia. O bien, el valor umbral para determinar una coincidencia puede ser rebajado (p.ej, a S bits). Puede
15 encontrarse una descripción de la base de datos Pfam en Sonhammer et al. (1997) Proteins 28:405-420 y puede encontrarse una descripción detallada de HMM, por ejemplo, en Gribskov et al. (1990) Moth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:15011531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314, cuyos contenidos son incorporados
20 en este documento como referencia. Se realizó una búsqueda frente a la base de datos HMM dando lugar a la identificación de un dominio del "dominio de proteína quinasa" en la secuencia de aminoácidos de 2150 humano en aproximadamente los residuos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2. Para otras identificaciones de dominios, y para identificar la presencia de un
25 dominio de "proteína quinasa" en una secuencia de proteína 2150, y hacer la determinación de que un polipéptido o la proteína de interés tienen un perfil particular, puede buscarse la secuencia de aminoácidos de la proteína frente a una base de datos de dominios, p.ej, la base de datos ProDom (Corpet et al. (1999), Nucleic Acids Res. 27:263-267). La base de datos del dominio de proteína ProDom consiste en una
30 compilación automática de dominios homólogos. Las versiones actuales de ProDom están construidas usando búsquedas de PSI-BLAST recurrentes (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Gouzy et al. (1999) Computers and Chemistry 23:333-340) de las bases de datos de proteínas SWISS-PROT 38 y TREMBL. La base de datos genera automáticamente una secuencia consenso para cada dominio. Se
35 realizó una búsqueda con BLAST frente a la base de datos HMM dando lugar a la identificación de un dominio del "protooncogen PIM-2, quinasa" (SEQ ID NO:5) (No. PD219527; ProDomain versión 2001.1; http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) en la secuencia de aminoácidos de 2150 humano en aproximadamente los residuos de 287 a 311 de SEQ ID NO:2.
5 Un miembro de la familia 2150 puede incluir al menos un dominio de proteína quinasa; Un miembro de la familia 2150 puede incluir al menos un homólogo del protooncogén PIM-2, dominio de quinasa. Una proteína 2150 humana puede incluir un distintivo de región de unión de 10 ATP de proteína quinasas (modelo Prosite PS00107), que está implicado en la unión del ATP.
Una proteína 2150 humana también puede incluir una distintivo del sitio activo de proteína quinasas de serina/treonina (modelo Prosite PS00108), conteniendo un ácido aspártico necesario para la actividad catalítica.
15 Además, un miembro de la familia 2150 puede incluir al menos uno, dos, preferiblemente tres, sitios de fosforilación de proteína quinasa C (Prosite PS00005); al menos uno, dos, tres, y preferiblemente cuatro, sitios de fosforilación de caseína quinasa II (Prosite PS00006); al menos un sitio de fosforilación de tirosina quinasa (Prosite PS00007); y al menos uno, dos, y preferiblemente tres, sitios de N
20 miristoilación (Prosite PS00008). Cuando los polipéptidos 2150 de la invención pueden modular las actividades mediadas por 2150, pueden ser útiles para desarrollar nuevos agentes diagnósticos y terapéuticos para trastornos asociados a la proteína u otros asociados a 2150 u otros, como se describe a continuación.
25 El asma es una enfermedad inflamatoria de las vías respiratorias. La hipersensibilidad de las vías respiratorias y el exceso de masa de músculo liso coexisten en pacientes con asma y displasia broncopulmonar. Las rutas de la quinasa (es decir, la proteína quinasa C de linfocitos) también pueden conducir a la elaboración de mediadores inflamatorios que probablemente iniciarán y perpetuarán la respuesta
30 asmática. Durante la activación de los linfocitos, se ha destacado el papel de las proteína quinasas. Los cambios de la actividad de quinasa en los linfocitos de sangre periférica en el asma bronquial pueden ser debidos a modificaciones en los mecanismos reguladores de la molécula enzimática. Más expresamente, las serina/treonina quinasas de la superfamilia de la
35 proteína quinasa activada por mitógeno (MAP quinasa), que bajo la activación, se desplazan desde el citoplasma al núcleo después de la estimulación mitogénica, e inician la transcripción. La señalización mitogénica vía serina/treonina quinasas por lo tanto estimula la proliferación del músculo liso, lo que puede aumentar el estrechamiento bronco-constrictor-inducido de las vías respiratorias. Hershenson MB,
5 et. al., (1997) Can J Physiol Pharmacol 75 (7):898-910.
Las actividades asociadas a la proteína quinasa son moderadas por las quimioquinas, que son mediadores importantes de la inflamación. Los estudios en animales sugieren que la inhibición de la acción de la quimioquina sobre las proteína quinasas causan una disminución en la inflamación. El papel potencial de las
10 quimioquinas que actúan sobre las rutas de proteína quinasa en varias manifestaciones de las enfermedades, incluye: síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria del intestino y rechazo de órgano sólido. (Shames BD et. al. (2000) Shock Jul; 14 (1):1-7). Las proteína quinasas también pueden desempeñar un papel crítico en
15 procesos relevantes respecto a la transformación neoplásica y la invasión de tumores. Esto da lugar a proteína quinasas como dianas potencialmente adecuadas para la terapia anticáncer. El bloqueo de la actividad de la proteína quinasa en las células de LTEPa-2 del carcinoma pulmonar humano inhibe marcadamente la velocidad de proliferación celular, la eficacia de formación de colonias en agar-agar suave, la
20 tumorigenecidad en ratones desnudos y las propiedades neoplásicas de estas células tumorales. (Wang XY et. al. (1999) Exp Cell Res, 10 de julio; 250 (1):253-63). Según se usa en este documento, la "actividad de 2150", "actividad biológica de 2150" o la "actividad funcional de 2150", se refiere a la actividad ejercida por una proteína 2150, polipéptido o molécula de ácido nucleico, p.ej, en una célula sensible a
25 2150 o en un sustrato de 2150, p.ej, un sustrato proteico, como se determina in vivo o in vitro. En una realización, la actividad de 2150 es una actividad directa, tal como la asociación con una molécula 2150 diana. Una "molécula diana" o "acompañante de unión" es una molécula con la cual la proteína 2150 se une o interactúa en la naturaleza. En una realización ejemplar, 2150 es una quinasa p.ej, la proteína quinasa
30 C, (que es una serina/treonina quinasa), y que se une así o interactúa en la naturaleza con una molécula de ATP. La actividad de 2150 también puede ser una actividad indirecta, p.ej, una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína 2150 con un receptor de 2150. Según las estructuras de secuencia anteriormente descritas y las
35 similitudes para las moléculas de función conocida, las moléculas 2150 de la presente invención pueden tener actividades biológicas similares que los miembros de la familia de proteína quinasa. Por ejemplo, las proteínas 2150 de la presente invención pueden tener una o varias de las actividades siguientes: 1) la capacidad de regular la transmisión de señales de receptores celulares, p.ej, receptores del factor de
5 crecimiento celular; 2) la capacidad de modular la entrada de células, p.ej, células precursoras, en mitosis; 3) la capacidad de modular la diferenciación celular; 4) la capacidad de modular la muerte celular; y 5) la capacidad de regular la función del citoesqueleto, p.ej, por el apilamiento de actina; 6) la capacidad de unir una molécula, p.ej un nucleótido (p.ej adenosin-trifosfato).
10 Las moléculas 2150 pueden modular, según la invención, las actividades (directamente o indirectamente) de las células en tejidos donde se expresan. Por ejemplo, el mARN de 2150 se expresa en la amígdala (es decir, células epiteliales (es decir, células de Goblet), células hematopoyéticas (es decir, células madre, mieloblastos, mastocitos, linfocitos T (es decir, células CD3 + (es decir, células CD4 +,
15 CD8 +, y CD28 +)), y células B. En consecuencia, las moléculas 2150 de la invención pueden actuar como agentes terapéuticos o diagnósticos para trastornos inflamatorios, hematopoyéticos e inmunes.
Las moléculas 2150 pueden usarse para tratar trastornos respiratorios y pulmonares. Como se demuestra por el análisis Taqman, el mARN de 2150 se 20 expresa en la amígdala, y también se expresa en macrófagos, linfocitos T y subconjuntos de linfocitos de células B localizados en las vías respiratorias. Así, las moléculas 2150 pueden actuar como nuevas dianas diagnósticas y agentes terapéuticos para controlar uno o varios trastornos inmunes, p.ej, inflamatorios, p.ej, la bronquitis crónica, el asma bronquial y la broncoectasia, trastornos proliferativos y / o 25 diferenciativos, p.ej, la proliferación de células de músculo liso, carcinoma, sarcoma, trastornos metastásicos o trastornos hematopoyéticos, p.ej, leucemias, u otros trastornos de la proteína quinasa. Según se usa en este documento, los "trastornos de la proteína quinasa" son enfermedades o trastornos cuya patogénesis está causada, está relacionada, o tiene que ver con una función o expresión aberrante o deficiente de
30 la proteína proteína quinasa. Ejemplos de tales trastornos, p.ej., los trastornos asociados a la proteína quinasa u otros asociados a la proteína 2150, incluyen pero no están limitados a trastornos respiratorios y trastornos pulmonares, trastornos celulares proliferativos y/o diferenciativos, trastornos inmunes, p.ej, inflamatorios. Las moléculas 2150 pueden usarse para tratar trastornos inflamatorios e
35 inmunes, así como trastornos respiratorios y pulmonares en parte porque los miembros de la familia de proteína quinasa se encuentran en los linfocitos T, células B y mastocitos, y también se regulan en el modelo de ratón de enfermedades alérgicas de las vías respiratorias (AAD).
Los ejemplos de trastornos pulmonares incluyen, pero no están limitados a
5 anomalías congénitas; atelectasia; enfermedades de origen vascular, tales como congestión pulmonar y edema, incluyendo edema pulmonar hemodinámico y edema causado por herida microvascular, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (daño alveolar difuso), embolia pulmonar, hemorragia e infarto, e hipertensión pulmonar y esclerosis vascular; enfermedad pulmonar obstruccionista crónica, tal
10 como enfisema, bronquitis crónica, asma bronquial y broncoectasia; enfermedades intersticiales difusas (infiltrativa, restrictiva), tales como neumoconiosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, neumonía intersticial descamativa, alveolitis alérgica, eosinofilia pulmonar (infiltración pulmonar con eosinofilia), bronquiolitis obliterante con neumonía organizante, síndromes de hemorragias pulmonares difusas, incluyendo
15 síndrome de Goodpasture, hemosiderosis pulmonar idiopática y otros síndromes hemorrágicos, manifestaciones pulmonares de las enfermedades del colágeno, y proteinosis alveolar pulmonar; complicaciones de terapias, tales como la enfermedad pulmonar inducida por fármaco, enfermedad pulmonar inducida por radiación y trasplante pulmonar; tumores, tales como carcinoma broncogénico, incluyendo
20 síndromes paraneoplásicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores diversos y tumores metastásicos; patologías de la pleura, incluyendo efusiones pleurales inflamatorias, efusiones pleurales no inflamatorias, pneumotorax y tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.
25 El ácido nucleico y la proteína 2150 pueden usarse según la invención para tratar y/o diagnosticar una variedad de trastornos inmunes, p.ej, inflamatorios, (es decir inflamatorios respiratorios). Los ejemplos de trastornos inmunes o enfermedades incluyen la alergia. La proteína 2150, sus fragmentos, y derivados y otras VARIANTEes de su
30 secuencia en SEQ ID NO:2 como se define en las reivindicaciones se denominan colectivamente "polipéptidos o proteínas 2150". Las moléculas de ácido nucleico que codifican tales polipéptidos o proteínas se denominan colectivamente "ácidos nucleicos de 2150." Según se usa en este documento, la expresión "molécula de ácido nucleico"
35 incluye moléculas de ADN (p.ej, un cADN o ADN genómico) y moléculas de ARN (p.ej,
un mARN) y los análogos del ADN o ARN generado, p.ej, por el uso de análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
La expresión "molécula de ácido nucleico aislada o purificada" incluye
5 moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, en cuanto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual el ADN genómico está naturalmente relacionado. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está sin secuencias que
10 flanquean naturalmente el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 5’ y/o 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en varias realizaciones, la molécula de ácido nucleico aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kilobytes, 4 kilobytes, 3 kilobytes, 2 kilobytes, 1 kilobyte, 0,5 kilobytes o 0,1 kilobytes de las secuencias de
15 nucleótido de 5’ y/o 3’ que naturalmente flanquean la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de cADN, puede estar sustancialmente sin otro material celular o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente sin precursores químicos u otros productos
20 químicos cuando se sintetiza por medios químicos. Según se usa en este documento, la expresión "se hibrida con condiciones de rigurosidad baja, rigurosidad media, rigurosidad alta, o rigurosidad muy alta" describe condiciones de hibridación y lavado. La forma de realizar reacciones de hibridación puede ser encontrada en “Current Protocols in Molecular Biology” (1989) John Wiley
25 and Sons, Nueva York, 6.3.1-6.3.6, que se incorpora como referencia. Son descritos en dicha referencia métodos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas indicadas en este documento son como sigue: 1) condiciones de hibridación de rigurosidad baja en 6X cloruro de sodio / citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de dos lavados en 0,2X SSC, SDS al
30 0,1 % al menos a 50°C (la temperatura de lavado puede ser aumentada a 55°C para condiciones de rigurosidad baja); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o varios lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 60°C; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o varios lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 %
35 a 65°C; y preferiblemente 4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son fosfato de sodio 0,5M, SDS al 7 % a 65°C, seguido de uno o varios lavados en 0,2X SSC, SDS al 1 % a 65°C. Las condiciones de rigurosidad muy altas (4) son las condiciones preferidas y son las que deberían ser usadas a menos que se especifique de otro modo.
5 Según se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico "natural " se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que aparece en la naturaleza (p.ej, codifica una proteína natural).
Según se usa en este documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que 10 codifica una proteína 2150, preferiblemente una proteína 2150 mamífera, y puede
incluir además secuencias reguladoras no codificantes e intrones.
Un polipéptido "aislado" o "purificado" o la proteína están sustancialmente sin material celular u otras proteínas de contaminación celular o fuente de tejido de la cual la proteína es derivada, o están sustancialmente libres de precursores químicos u
15 otros productos químicos cuando se sintetizan por medios químicos. En una realización, la expresión "sustancialmente libre" significa la preparación de la proteína 2150 que tiene menos de aproximadamente 30 %, 20 %, 10 % y más preferiblemente 5 % (por peso en seco), de proteína no 2150 (también denominado en este documento como una "proteína contaminante"), o de precursores químicos o productos químicos
20 de no 2150. Cuando la proteína 2150 o su parte biológicamente activa son producidas recombinantemente, también lo es preferiblemente y sustancialmente sin medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20 %, más preferiblemente menos de aproximadamente el 10 %, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente el 5 % del volumen de la preparación de la proteína. La
25 invención incluye preparaciones aisladas o purificadas de al menos 0,01, 0,1, 1,0, y 10 miligramos en peso seco. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser cambiado de la secuencia de tipo silvestre de 2150 (p.ej, la secuencia de SEQ ID NO:1 ó 3) sin anular, o más preferiblemente, sin cambiar sustancialmente, la actividad biológica,
30 mientras que un residuo de aminoácido "esencial" causa tal cambio. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que son conservados entre los polipéptidos de la presente invención, p.ej, aquellos que se presentan en el dominio de la proteína quinasa, se supone, en particular, que no son susceptibles de la modificación. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo
35 de aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena
lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej, 5 glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolínea, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p.ej, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en una proteína 2150 está 10 preferiblemente sustituido por otro residuo de aminoácido de la misma familia de la cadena lateral. O bien, en otra realización, pueden ser introducidas mutaciones al azar a lo largo de todo o parte de una secuencia de codificación de 2150, como por mutagénesis de saturación, y los mutantes consiguientes pueden ser protegidos según la actividad biológica de 2150 para identificar a los mutantes que retienen la actividad.
15 Después de la mutagénesis de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, la proteína codificada puede ser expresada recombinantemente y la actividad de la proteína puede ser determinada.
Según se usa en este documento, una "parte biológicamente activa" de una proteína 2150 incluye un fragmento de la proteína 2150 que participa en una 20 interacción entre una molécula 2150 y una molécula de no 2150. Las partes biológicamente activas de la proteína 2150 incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas o el derivado de la secuencia de aminoácidos de la proteína 2150, p.ej, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2, que incluye menos aminoácidos que la longitud completa de la proteína 25 2150, y muestran al menos una actividad de la proteína 2150. Típicamente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína 2150, p.ej, la unión de ATP, y la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos asociados con el crecimiento celular y la división. Una parte biológicamente activa de la proteína 2150 puede ser un polipéptido que tenga, por
30 ejemplo, 10, 25, 50, 100, 200 o más aminoácidos de longitud. Las partes biológicamente activas de la proteína 2150 pueden usarse como dianas para desarrollar agentes que modulen la actividad mediada por 2150, p.ej, la unión de ATP, y la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos asociados con el crecimiento celular y la división.
Los cálculos de homología o identidad de secuencia (los términos "homología" e "identidad" son usados de modo intercambiable en este documento) entre secuencias son realizados como sigue:
Para determinar el tanto por ciento de identidad de dos secuencias de
5 aminoácidos, o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias son alineadas con el fin de realizar una comparación óptima (p.ej, los huecos pueden ser introducidos en uno o ambos de un primer y un segundo aminoácido o secuencia de ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden ser descartadas con fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de
10 una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia (p.ej, alineando una segunda secuencia a la secuencia de aminoácidos de 2150 de SEQ ID NO:2 que tiene 311 residuos de aminoácidos, al menos 218, 249 ó 280 residuos de aminoácidos están alineados). Los residuos de aminoácidos o los nucleótidos en las posiciones de
15 aminoácido correspondientes o las posiciones de nucleótidos son comparados entonces. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en aquella posición (según se usa en este documento, la "identidad" del aminoácido o ácido nucleico es equivalente a la
20 "homología" del aminoácido o ácido nucleico). El tanto por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que tiene que ser introducido para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del tanto ciento de identidad
25 entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el tanto por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453 que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o
30 una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización más preferida, el tanto por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando un NWSgapdna. La matriz de CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 ó 80 y un peso
35 de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un juego particularmente preferido de parámetros (y el que debería usarse si el experto no está seguro de qué parámetros deben ser aplicados para determinar si una molécula está dentro de una identidad de secuencia
o la limitación de homología de la invención) es una matriz Blossum 62 de tanteo con una penalización de hueco de 12, una penalización de hueco amplia de 4 y una 5 penalización de hueco de marco de 5.
Puede determinarse el tanto por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos usando el algoritmo de Meyers y Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuo de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una
10 penalización de hueco de 4. Las secuencias de ácido nucleico y proteína descritas en este documento pueden usarse como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a las bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar a otros miembros de familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden realizarse usando los programas
15 NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, valor = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencia de nucleótidos homólogas a las moléculas 2150 de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteína de BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, valor = 50, longitud
20 de palabra = 3 para obtener la secuencia de aminoácidos homóloga a las moléculas 2150 de la proteína de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse el BLAST con huecos como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Utilizando los programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas
25 respectivos (p.ej, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Los polipéptidos 2150 particulares de la presente invención tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2. En el contexto de una secuencia de aminoácido, la expresión "sustancialmente idéntico" se usa en este documento para referirse a un primer
30 aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos que son i) idénticos, o ii) las sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos tal que las primeras y segundas secuencias de aminoácidos pueden tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, se llaman sustancialmente idénticas a las
35 secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que tiene al menos aproximadamente una identidad del 60 %, o 65 %, una identidad del 75 % probable, 85 % más probable, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, una identidad del 98 % o del 99 % respecto a la SEQ ID NO: 2.
En el contexto de la secuencia de nucleótidos, la expresión "sustancialmente
5 idéntico" se usa en este documento para referirse a una primera secuencia de ácidos nucleicos que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos respecto a los nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácidos nucleicos tal que las primeras y segundas secuencias de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común, o que codifican un dominio de
10 polipéptido estructural común o una actividad de polipéptido funcional común. Por ejemplo, se llaman sustancialmente idénticas las secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente una identidad del 60 %, o 65 %, una identidad del 75 % probable, 85 % más probable, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, una identidad del 98 % o del 99 % respecto a SEQ ID NO:1 ó 3.
15 La "expresión incorrecta o expresión aberrante", según se usa en este documento, se refiere a un modelo de tipo no silvestre de la expresión de genes, al nivel de la proteína o del ARN. Esto incluye: la expresión en niveles de tipo no silvestres, es decir, o una sobre-o bajo-expresión; un modelo de expresión que se diferencia del tipo silvestre en términos de tiempo o de etapa en la cual el gen se
20 expresa, p.ej, una mayor o menor expresión (comparado con el tipo silvestre) en un período de desarrollo predeterminado o etapa; un modelo de expresión que se diferencia del tipo silvestre en términos de una menor expresión (comparado con el tipo silvestre) en un tipo de célula predeterminado o tipo de tejido; un modelo de expresión que se diferencia del tipo silvestre en términos de tamaño de empalme,
25 secuencia de aminoácidos, modificación post-transicional, o actividad biológica del polipéptido expresado; un modelo de expresión que se diferencia del tipo silvestre en términos de efecto de un estímulo ambiental o estímulo extracelular en la expresión del gen, p.ej., un modelo de expresión mayor o menor (comparado con el del tipo silvestre) en presencia de un aumento o una disminución en la fuerza del estímulo.
30 El "sujeto", según se usa en este documento, puede referirse a un mamífero, p.ej, un ser humano, o a un modelo experimental de animal o de enfermedad. El sujeto también puede ser un animal no humano, p.ej, un caballo, una vaca, cabra u otro animal doméstico. Una "preparación purificada de células", según se usa en este documento, se
35 refiere, en el caso de células de planta o animal, a una preparación in vitro de células y no a una planta intacta entera o animal. En el caso de células cultivadas o células microbianas, consiste en una preparación de al menos el 10 % y más preferiblemente el 50 % de las células objeto.
Varios aspectos de la invención son descritos con detalle más abajo.
5
Moléculas de Ácidos Nucleicos Aisladas
En un aspecto, la invención proporciona, una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que codifica un polipéptido 2150 descrito en este documento, p.ej, una proteína 2150 de longitud completa o su fragmento, p.ej, una parte biológicamente
10 activa de la proteína 2150. También se incluye un fragmento de ácido nucleico adecuado para uso como sonda de hibridación, que puede ser usada, p.ej, para identificar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, el mARN de 2150, y los fragmentos adecuados para su uso como cebadores, p.ej, cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.
15 En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1, o una parte de cualquiera de esta secuencia de nucleótidos. En una realización, la molécula de ácido nucleico incluye secuencias que codifican a la proteína 2150 humano (es decir, la "región de codificación" de SEQ ID NO:1, según se muestra en SEQ ID NO:3), así
20 como secuencias 5’ no traducidas (nucleótidos de 1 a 255 de SEQ ID NO:1) y secuencias 3’ no traducidas (nucleótidos de 1189 a 1691 de SEQ ID NO:1). O bien, la molécula de ácido nucleico puede incluir sólo la región de codificación de SEQ ID NO:1 (p.ej, SEQ ID NO:3) y, p.ej, ninguna secuencia flanqueante que normalmente acompaña a la secuencia objeto. En otra realización, la molécula de ácido nucleico
25 codifica una secuencia correspondiente a un fragmento de la proteína de aproximadamente el aminoácido 32 al 286 de SEQ ID NO:2. En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención incluye una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o una parte de cualquiera de
30 estas secuencias de nucleótidos. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico de la invención es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 tal que se puede hibridar a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o 3, formándose así una doble hélice estable. En una realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente
35 invención incluye una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente: un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más homóloga respecto a la longitud entera de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o una parte, preferiblemente de la misma longitud, de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.
5
Fragmentos de Ácido Nucleico de 2150
Una molécula de ácido nucleico de la invención puede incluir sólo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 ó 3. Por ejemplo, dicha molécula de ácido nucleico puede incluir un fragmento que puede usarse como una sonda o
10 cebador o un fragmento que codifica una parte de una proteína 2150, p.ej, una parte inmunógena o biológicamente activa de una proteína 2150. Un fragmento puede comprender aquellos nucleótidos de SEQ ID NO:1, que codifican un dominio de proteína quinasa de 2150 humano. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen de 2150 permite la generación de sondas y cebadores
15 diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de 2150, o sus fragmentos, así como los homólogos de 2150, o sus fragmentos, a partir de otras especies.
En otra realización, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que incluye una parte, o todo, de la región de codificación y que se extiende dentro de la 20 región no codificante de 5’ o 3’ (o en ambas). Otras realizaciones incluyen un fragmento que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de aminoácido descrito en este documento. Los fragmentos de ácidos nucleicos pueden codificar un dominio específico o un sitio descrito en este documento o sus fragmentos, particularmente los fragmentos que tienen al menos 100 aminoácidos de
25 longitud. Los fragmentos también incluyen secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a las secuencias de aminoácidos específicas descritas antes o sus fragmentos. Los fragmentos de ácidos nucleicos no deberían ser interpretados como que abarcan a aquellos fragmentos que pueden haber sido descritos antes de la invención.
30 Un fragmento de ácido nucleico puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio, región, o sitio funcional descrito en este documento. Un fragmento de ácido nucleico también puede incluir uno o varios dominios, regiones o sitios funcionales descritos en este documento. Así, por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico de 2150 puede incluir una secuencia correspondiente a un dominio de
35 proteína quinasa, como se describe en este documento.
Se proporcionan sondas y cebadores de 2150. Típicamente una sonda/cebador es un oligonucleótido aislado o purificado. El oligonucleótido típicamente incluye una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 75 nucleótidos consecutivos
5 de una secuencia sentido o antisentido de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o de una VARIANTEe alélica natural o mutante de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
En una realización preferida, el ácido nucleico es una sonda que tiene al menos 5 ó 10, y menos de 200, más preferiblemente menos de 100, o menos de 50, pares de bases en longitud. Debería ser idéntico, o diferenciarse por 1, o menos que
10 en 5 ó 10 bases, de una secuencia descrita en este documento. Si es necesario el alineamiento para esta comparación, las secuencias se deberían alinear a favor de una homología máxima. Las secuencias fuera de bucles de deleciones o inserciones,
o correspondencias incorrectas, son consideradas diferencias. Una sonda o cebador puede ser derivado de la cadena sentido o antisentido de 15 un ácido nucleico que codifica: Un dominio de proteína quinasa en aproximadamente los residuos de aminoácidos de 32 a 186 de SEQ ID NO:2. En otra realización, se proporciona un juego de cebadores, p.ej, los cebadores adecuados para el uso en una PCR, que puede usarse para amplificar una región
20 seleccionada de una secuencia de 2150, p.ej, un dominio, una región, sitio u otra secuencia descrita en este documento. Los cebadores deberían tener al menos una longitud de 10 ó 50 pares de bases y menos de 100, o menos de 200 pares de bases en la longitud. Los cebadores deberían ser idénticos, o diferenciarse en una base de una secuencia descrita en este documento o de una VARIANTEe natural. Por ejemplo,
25 se proporcionan los cebadores adecuados para amplificar todas o una parte de cualquiera de las regiones siguientes: un dominio de proteína quinasa de aproximadamente el aminoácido 32 al 286 de SEQ ID NO:2. Un fragmento de ácido nucleico puede codificar un epítopo que lleve la región de un polipéptido descrito en este documento.
30 Un fragmento de ácido nucleico que codifica una "parte biológicamente activa de un polipéptido 2150" puede prepararse aislando una parte de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica como 2150 (p.ej, las actividades biológicas de las proteínas 2150 son descritas en este documento), expresando la parte codificada de la proteína 2150
35 (p.ej, por la expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteína 2150. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de 2150 incluye un dominio de proteína quinasa, p.ej, los residuos de aminoácidos de aproximadamente 32 a 286 de SEQ ID NO:2. Un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de
5 un polipéptido 2150, puede comprender una secuencia de nucleótidos que sea mayor que 300 o más nucleótidos en la longitud.
En las realizaciones preferidas, un ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que tiene aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 o más nucleótidos en su longitud y que se hibrida
10 en condiciones de hibridación rigurosas a una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
VARIANTEes del Ácido Nucleico de 2150 La invención además abarca a moléculas de ácido nucleico que se diferencian
15 de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3. Tales diferencias pueden ser debidas a la degeneración del código genético (y dar lugar a un ácido nucleico que codifica las mismas proteínas 2150 que las codificadas por la secuencia de nucleótidos descrita en este documento). En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótidos
20 que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que se diferencia, por al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 ó 100 residuos de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO:2. Si es necesario el alineamiento para esta comparación las secuencias se deberían alinear a favor de una homología máxima. Las secuencias fuera de bucles de deleciones o inserciones, o correspondencias incorrectas, son
25 consideradas diferencias. Los ácidos nucleicos del inventor pueden ser elegidos para disponer de codones, que son preferidos, o no preferidos, para un sistema de expresión particular, p.ej, el ácido nucleico puede ser aquél en el cual al menos un codón, preferiblemente al menos el 10 %, o el 20 % de los codones han sido cambiados tal que la secuencia
30 es optimizada para la expresión en E. coli, levadura, células de ser humano, insecto o CHO. Las VARIANTEes de ácidos nucleicos pueden ser naturales, tales como las VARIANTEes alélicas (mismo lugar geométrico), homólogas (lugar geométrico diferente) y ortólogas (organismo diferente) o pueden ser artificiales. Las VARIANTEes
35 artificiales pueden prepararse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las VARIANTEes pueden contener sustituciones de nucleótidos, deleciones, inversiones e inserciones. La variación puede aparecer tanto en las regiones codificantes como en las no codificantes. Las variaciones pueden producir tanto sustituciones de aminoácido conservadoras como
5 no conservadoras (según se compara en el producto codificado).
En una realización preferida, el ácido nucleico se diferencia de aquel de SEQ ID NO: 1 ó 3, p.ej, como sigue: por al menos uno pero menos de 10, 20, 30 ó 40 nucleótidos; al menos uno pero menos del 1 %, 5 %, 10 % o 20 % de los nucleótidos en el ácido nucleico objeto. Si es necesario para este análisis las secuencias deberían
10 ser alineadas a favor de una homología máxima. Las secuencias fuera de bucles de deleciones o inserciones, o correspondencias incorrectas, son consideradas diferencias.
Los ortólogos, los homólogos, y las VARIANTEes alélicas pueden ser identificados usando los métodos conocidos en la técnica. Estas VARIANTEes 15 comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, típicamente al menos aproximadamente el 7075 %, más típicamente al menos aproximadamente el 80-85 %, y lo más típicamente al menos aproximadamente el 90-95 % o más idéntico a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:2 o un fragmento de esta secuencia. Tales moléculas de 20 ácido nucleico pueden ser fácilmente identificadas al ser capaces de hibridarse en condiciones rigurosas, a la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la secuencia. Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a ortólogos, homólogos, y VARIANTEes alélicas de los cADN de 2150 de la invención pueden ser aisladas además haciendo un mapa genético respecto al mismo
25 cromosoma o lugar geométrico que el gen de 2150. Las VARIANTEes preferidas incluyen aquellas que están correlacionadas con la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos asociados al crecimiento celular y la división. Las VARIANTEes alélicas de 2150, p.ej, 2150 humano, incluyen tanto
30 proteínas funcionales como no funcionales. Las VARIANTEes alélicas funcionales son VARIANTEes de secuencias de aminoácidos naturales de la proteína 2150 dentro de una población que mantiene la capacidad de unirse al ATP. Las VARIANTEes alélicas funcionales contendrán típicamente sólo la sustitución conservadora de uno o varios aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o la sustitución, la deleción o la inserción de residuos
35 no críticos en regiones no críticas de la proteína. Las VARIANTEes alélicas no
funcionales son VARIANTEes de la secuencia de aminoácidos natural de 2150, p.ej, 2150 humano, proteína dentro de una población que no tiene la capacidad de unirse al ATP, o modular la regulación de cambios bioquímicos y morfológicos asociados con el crecimiento celular y la división. Las VARIANTEes alélicas no funcionales contendrán
5 típicamente una sustitución no conservadora, una deleción o inserción, o truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o una sustitución, inserción o deleción en residuos críticos o regiones críticas de la proteína.
Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican a otros miembros de la familia 2150 y que, por eso, tienen una secuencia de nucleótidos que se diferencia de 10 las secuencias de 2150 de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 se requiere que estén dentro
del ámbito de la invención.
Moléculas de Ácido Nucleico Antisentido, Ribozimas y Moléculas de Ácido Nucleico de 2150 Modificadas
15 En otro aspecto, la invención se caracteriza por una molécula de ácido nucleico aislada que es el antisentido a 2150. Un ácido nucleico "antisentido" puede incluir una secuencia de nucleótidos que sea complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica una proteína, p.ej, complementaria a la cadena de codificación de una molécula de cADN bicatenario o complementaria a una secuencia de mARN. El ácido
20 nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena de codificación entera de 2150, o a sólo una parte de ésta (p.ej, la región de codificación de 2150 humana correspondiente a SEQ ID NO:3). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es una "región no codificante" antisentido de la cadena de codificación de una secuencia de los nucleótidos que codifican a 2150 (p.ej, las regiones no
25 traducidas de 5’ y 3’). Puede diseñarse un ácido nucleico antisentido tal que sea complementario a la región de codificación entera de mARN de 2150, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido a sólo una parte de la región codificante o no codificante de mARN de 2150. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser
30 complementario a la región flanqueante al sitio del inicio de la traducción de mARN de 2150, p.ej, entre las regiones -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos de los genes diana de interés. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, o más nucleótidos en su longitud.
Un ácido nucleico antisentido de la invención puede ser construido usando síntesis química y reacciones de unión enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (p.ej, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse por medios químicos usando nucleótidos naturales o
5 nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o aumentar la estabilidad física de la doble hélice formada entre los ácidos nucleicos antisentido y sentido, p.ej, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. También puede producirse biológicamente un ácido nucleico antisentido usando un vector de expresión en el cual
10 se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación antisentido respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito más adelante en la subdivisión siguiente).
Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención son típicamente administradas a un sujeto (p.ej, por inyección directa en un sitio de tejido), o son 15 generadas in situ tal que se hibridan o se unen al mARN celular y/o ADN genómico que codifica una proteína 2150 para inhibir así la expresión de la proteína, p.ej, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. O bien, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para reconocer las células seleccionadas y luego administrarlas sistémicamente. Para la administración sistémica, pueden ser 20 modificadas las moléculas antisentido tal que se unan expresamente o selectivamente a los receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, p.ej, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular o antígenos. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores
25 descritos en este documento. Para conseguir las concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren constructos del vector en el que la molécula antisentido de ácido nucleico se coloque en el control del promotor pol II fuerte o pol III. En otra realización más, la molécula de ácido nucleico antisentido de la
30 invención es una molécula de ácido nucleico �-anomérica. Una molécula de ácido nucleico �-anomérica forma híbridos bicatenarios específicos con el ARN complementario en el cual, al contrario de las unidades � habituales, las cadenas quedan paralelas entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender 2’-o
metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo de ADN del ARN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330). En otra realización más, un ácido nucleico antisentido de la invención es un ribozima. Un ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica 2150
5 puede incluir una o varias secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de un cADN de 2150 descrito en este documento (es decir, SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3), y una secuencia que tiene la secuencia catalítica conocida responsable de la división del mARN (véase la patente de EE.UU. Nº. 5.093.246 o Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:555-591). Por ejemplo, puede ser construido un derivado de un
10 ARN de L-19 IVS de Tetrahymena en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se divide en un mARN que codifica 2150. Véase, p.ej, Cech et al. patente de EE.UU. Nº. 4.987.071; y Cech et al. patente de EE.UU. Nº. 5.116.742. O bien, puede usarse el mARN de 2150 para seleccionar un ARN catalítico que tenga una actividad de ribonucleasa específica de
15 un grupo de moléculas de ARN. Véase, p.ej, Bartel y Szostak (1993) Science 261:1411-1418. La expresión de genes de 2150 puede ser inhibida reconociendo las secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de 2150 (p.ej, el promotor de 2150 y/o los potenciadores) para formar estructuras helicoidales triples
20 que previenen la transcripción del gen de 2150 en células diana. Véase de forma general, Helene (1991) Anticancer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher (1992) Bioassays 14:807-15. Las secuencias potenciales que pueden ser reconocidas para la formación de la triple hélice pueden ser aumentadas creando una molécula de ácido nucleico llamada de "cambio de sentido". Las
25 moléculas de cambio de sentido son sintetizadas en una manera de alternancia 5’-3’, 3’-5’, tal que se aparean con primero una cadena de una doble hélice y luego la otra, eliminando la necesidad de una extensión importante de purinas o de pirimidinas que están presentes en la cadena de una doble hélice.
La invención también proporciona un cebador marcado de oligonucleótido de 30 forma detectable y moléculas sonda. Típicamente, tales marcadores son quimioluminiscentes, fluorescentes, radiactivos o colorimétricos.
Una molécula de ácido nucleico de 2150 puede ser modificada en el resto de la base, el resto de azúcar o la estructura de fosfato para mejorar, p.ej, la estabilidad, la hibridación o la solubilidad de la molécula. Por ejemplo, la estructura de fosfato de
35 desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico puede ser modificada para generar
los ácidos péptido-nucleicos (véase Hyrup et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4: 5-23). Según se usa en este documento, la expresión "ácido péptidonucleico" o "PNA, por sus siglas en inglés “peptide nucleic acid" se refiere a un ácido nucleico mímico, p.ej, un ADN mímico, en el que la estructura del fosfato de 5 desoxirribosa es sustituida por una estructura de pseudopéptido y sólo son retenidas cuatro nucleobases naturales. La estructura neutra de un PNA puede permitir la hibridación específica a ADN y ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de los oligómeros de PNA puede ser realizada usando protocolos de síntesis de péptidos de fase sólida estándares como se describe en Hyrup et al. (1996) supra;
10 Perry-O’Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675. Los PNA de las moléculas de ácido nucleico de 2150 pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Por ejemplo, los PNA pueden usarse como agentes antisentido o antigenes para la modulación específica de la secuencia de la expresión de genes, por ejemplo, induciendo la transcripción o la detención de la
15 traducción o inhibiendo la replicación. Los PNA de las moléculas 2150 de ácido nucleico también pueden usarse en el análisis de mutaciones de pares de bases solas en un gen, (p.ej, por fijación PCR de PNA-dirigida); como ’enzimas de restricción artificiales” cuando se usan en combinación con otras enzimas, (p.ej, S1 nucleasas (Hyrup et al. (1996) supra)); o como sondas o cebadores para la secuenciación del
20 ADN o la hibridación (Hyrup et al. (1996) supra; Perry-O’Keefe supra). En otras realizaciones, el oligonucleótido puede incluir otros grupos añadidos tales como los péptidos (p.ej, para reconocer los receptores de la célula huésped in vivo), o agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (véase, p.ej, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556; Lemaitre et al.
25 (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; publicación PCT Nº. W088/09810) o la barrera sangre-cerebro (véase, p.ej, la publicación PCT Nº. W089/10134). Además, los oligonucleótidos pueden ser modificados con agentes de división provocados por la hibridación (véase, p.ej, Krol et al. (1988) Bio-Techniques 6:958-976) o agentes intercalantes (véase, p.ej, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Para este fin, el
30 oligonucleótido puede ser conjugado a otra molécula, (p.ej, un péptido, agente de reticulación provocado por la hibridación, agente de transporte o agente de división provocado por la hibridación).
La invención también incluye las moléculas de cebador y sonda de oligonucleótido de baliza molecular que tienen al menos una región que es 35 complementaria a un ácido nucleico 2150 de la invención, dos regiones
complementarias que tienen un fluoróforo y un inactivador tal que la baliza molecular es útil para cuantificar la presencia del ácido nucleico 2150 de la invención en una muestra. Se describen ácidos nucleicos de baliza molecular, por ejemplo, en Lizardi et al., la patente de EE.UU. Nº. 5.854.033; Nazarenko et al., patente de EE.UU. Nº.
5 5.866.336, y Livak et al., patente de EE.UU. Nº. 5.876.930.
Polipéptidos de 2150 Aislados En otro aspecto, la invención se caracteriza por una proteína 2150 aislada, o fragmento, p.ej, una parte biológicamente activa, para uso como inmunógeno o
10 antígeno para generar o probar (o más generalmente unir) anticuerpos anti2150. La proteína 2150 puede ser aislada a partir de células o fuentes de tejido usando técnicas de purificación de proteínas estándares. La proteína 2150 o sus fragmentos pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante o pueden ser sintetizados por medios químicos.
15 Los polipéptidos de la invención incluyen aquellos que se generan a consecuencia de la existencia de genes múltiples, acontecimientos de transcripción alternativos, acontecimientos de empalme de ARN alternativos y acontecimientos translacionales y post-translacionales alternativos. El polipéptido puede ser expresado en sistemas, p.ej, células cultivadas, que dan lugar a sustancialmente las mismas
20 modificaciones post-translacionales presentes cuando el polipéptido se expresa en una célula natural, o en sistemas que causan la modificación o la omisión de modificaciones post-translacionales, p.ej, glicosilación o división, presentes en la célula natural. En una realización preferida, el polipéptido 2150 tiene una o varias de las
25 siguientes características: -tiene la capacidad de unirse al ATP; -tiene la capacidad a regular los cambios bioquímicos y morfológicos
asociados con el crecimiento celular y la división; -tiene la capacidad de mediar la inflamación del músculo liso; 30 -tiene la capacidad de mediar, iniciar o perpetuar la respuesta asmática;
-tiene un peso molecular, p.ej, un peso molecular deducido, preferiblemente sin tener en cuenta ninguna contribución de las modificaciones post-translacionales, composición de aminoácido u otra característica física del polipéptido 2150, p.ej, un polipéptido de SEQ ID NO:2;
-tiene una similitud de secuencia total de al menos el 70 %, más preferiblemente al menos 80, 90 ó 95 %, con un polipéptido de SEQ ID NO:2; -se expresa en al menos los siguientes tejidos humanos y líneas celulares: a niveles altos en amígdala, linfocitos T, células B y mastocitos;
5 -tiene un dominio de proteína quinasa que es preferiblemente aproximadamente el 70 %, 80 %, 90 % ó 95 % idéntico a los residuos de aminoácidos de aproximadamente 32 a 286 de SEQ ID NO:2;
-tiene un distintivo de región de unión a ATP de proteína quinasas; -tiene una distintivo de sitio activo de proteína quinasa de serina/treonina.
10 En una realización preferida, la proteína 2150, o su fragmento, se diferencia de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO:2. En una realización, se diferencia por al menos uno, pero por menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácidos. En otra, se diferencia de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO:2 por al menos un residuo,
15 pero menos del 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de los residuos en éste se diferencia de la secuencia correspondiente en SEQ ID NO:2. (Si esta comparación requiere el alineamiento, las secuencias deberían ser alineadas a favor de una homología máxima. Las secuencias fuera de bucles de deleciones o inserciones, o correspondencias incorrectas, son consideradas diferencias. Las diferencias son,
20 preferiblemente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservadora. En una realización preferida, las diferencias no están en el dominio de proteína quinasa en aproximadamente los residuos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2. En otra realización, una o varias diferencias están en el dominio de proteína quinasa en aproximadamente los residuos de 32 a 286 de SEQ ID NO:2.
25 Otras realizaciones incluyen una proteína que contiene uno o varios cambios de la secuencia de aminoácidos, p.ej, un cambio de un residuo de aminoácido que no es esencial para la actividad. Tales proteínas 2150 se diferencian en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, aunque retienen la actividad biológica.
En una realización, la proteína incluye una secuencia de aminoácidos de al 30 menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o más homólogo a la SEQ ID NO:2.
Se proporciona una proteína 2150, o su fragmento, que varía de la secuencia de SEQ ID NO:2 en las regiones definidas por los aminoácidos de aproximadamente 287 a 311 por al menos uno, pero por menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácidos
35 en la proteína o el fragmento, pero que no se diferencia de SEQ ID NO:2 en regiones definidas por los aminoácidos de aproximadamente 32 a 286. (Si esta comparación requiere el alineamiento, las secuencias deberían estar alineadas a favor de una homología máxima. Las secuencias fuera de bucles de deleciones o inserciones, o correspondencias incorrectas, son consideradas diferencias. En algunas realizaciones
5 la diferencia está en un residuo no esencial o es una sustitución conservadora, mientras que en otras la diferencia está en un residuo esencial o es una sustitución no conservadora.
En una realización, una parte biológicamente activa de una proteína 2150 incluye un dominio de proteína quinasa. Además, otras partes biológicamente activas,
10 en las cuales otras regiones de la proteína son suprimidas, pueden prepararse por técnicas recombinantes y ser evaluadas para una o más de las actividades funcionales de una proteína 2150 natural. En una realización preferida, la proteína 2150 tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la proteína 2150 es
15 suficientemente o sustancialmente idéntica a SEQ ID NO:2. En otra realización más, la proteína 2150 es suficientemente o sustancialmente idéntica a SEQ ID NO:2 y retiene la actividad funcional de la proteína de SEQ ID NO:2, como se describe detalladamente en las subdivisiones anteriores.
20 Anticuerpos Anti2150 En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti2150. El término "anticuerpo" según se usa en este documento se refiere a una molécula de inmunoglobulina o su parte inmunológicamente activa, es decir, una parte que se une al antígeno. Los ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de
25 inmunoglobulina incluyen scFV y fragmentos dcFV, Fab y fragmentos F(ab’)2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como papaína o pepsina, respectivamente.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlónico, monoclónico, recombinante, p.ej, uno quimérico o humanizado, totalmente humano, no humano, p.ej, murino, o de 30 cadena sencilla. En una realización preferida, tiene la función efectora y puede fijar el
complemento. El anticuerpo puede acoplarse al agente de visualización o la toxina.
Puede usarse una proteína 2150 de cadena completa o, el fragmento peptídico antigénico de 2150 como un inmunógeno o puede usarse para identificar anticuerpos anti2150 hechos con otros inmunógenos, p.ej, células, preparaciones de membrana, y
35 otros por el estilo. El péptido antigénico de 2150 debe incluir al menos 8 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO:2 y abarca un epítopo de 2150. Preferiblemente, el péptido antigénico incluye al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos, aún más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente al
5 menos 30 residuos de aminoácidos.
Los fragmentos de 2150 que incluyen residuos de aproximadamente 10 a 20, de aproximadamente 200 a 210, o de aproximadamente 235 a 245 de SEQ ID NO:2 pueden usarse para preparar, p.ej, usados como inmunógenos o usados para caracterizar la especificidad de un anticuerpo, anticuerpos frente a regiones hidrófilas
10 de la proteína 2150. Del mismo modo, los fragmentos de 2150 que incluyen residuos de aproximadamente 75 a 85, de aproximadamente 175 a 185, o de aproximadamente 220 a 230 de SEQ ID NO:2 pueden usarse para preparar un anticuerpo frente a una región hidrófoba de la proteína 2150; los fragmentos de 2150 que incluyen residuos de aproximadamente 1 a 311, o su subconjunto, p.ej aproximadamente los residuos de 32
15 a 286 de SEQ ID NO:2 pueden usarse para preparar un anticuerpo frente a una región de proteína quinasa de la proteína 2150. Se proporcionan los anticuerpos reactivos, o específicos o selectivos, con cualquiera de estas regiones, u otras regiones o dominios descritos en este documento.
20 Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de 2150 localizadas en la superficie de la proteína, p.ej, regiones hidrófilas, así como regiones con alta antigenicidad. Por ejemplo, puede usarse un análisis de probabilidad de superficie de Emini de la secuencia de la proteína 2150 humana para indicar las regiones que tienen una probabilidad particularmente alta de estar localizadas en la
25 superficie de la proteína 2150 y probablemente constituirán así los residuos superficiales útiles para dirigir la producción del anticuerpo. En una realización preferida, el anticuerpo puede unirse a la parte extracelular de la proteína 2150, p.ej, se puede unir a una célula entera que expresa la proteína 2150. En otra realización, el anticuerpo se une a una parte intracelular de la proteína
30 2150. En una realización preferida, el anticuerpo se une a un epítopo en cualquier dominio o región en las proteínas 2150 descritas en este documento.
Además, los anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos están también dentro del ámbito de la invención. Los anticuerpos quiméricos, 35 humanizados, pero lo más preferiblemente, completamente humanos son deseables
para las aplicaciones que incluyen la administración repetida, p.ej, el tratamiento terapéutico de pacientes humanos, y algunas aplicaciones diagnósticas. Los anticuerpos monoclónicos quiméricos y humanizados, que comprenden tanto partes humanas como no humanas, pueden prepararse usando técnicas de ADN
5 recombinantes estándares. Tales anticuerpos monoclónicos quiméricos y humanizados pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando los métodos descritos en Robinson et al. solicitud internacional PCT Nº/US86/02269; Akira, et al. solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al. solicitud de patente
10 europea 173.494; Neuberger et al. publicación internacional PCT Nº. WO 86/01533; Cabilly et al. patente de EE.UU. Nº. 4.816.567; Cabilly et al. solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res.
15 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559). Un anticuerpo humanizado o injertado de la región determinante de complementariedad (CDR) tendrá al menos uno o dos, pero generalmente tres CDR del receptor (de cadenas pesadas y/o ligeras de inmunoglobulina) sustituidas por una
20 CDR del donante. El anticuerpo puede ser sustituido por al menos una parte de una CDR no humana o sólo algo de las CDR pueden ser sustituidas por las CDR no humanas. Sólo es necesario sustituir el número de CDR requeridas para unir el anticuerpo humanizado a un 2150 o su fragmento. Preferiblemente, el donante será un anticuerpo de roedor, p.ej, un anticuerpo de ratón o rata, y el receptor será un marco
25 humano o un marco consenso humano. Típicamente, la inmunoglobulina que proporciona los CDR se llama "donante" y la inmunoglobulina que proporciona el marco se llama "aceptadora". En una realización, la inmunoglobulina donante es una no humana (p.ej, roedor). El marco aceptador es un marco natural (p.ej, uno humano)
o un marco consenso, o una secuencia aproximadamente el 85 % o más alta, 30 preferiblemente 90 %, 95 %, 99 % o más alta idéntica a ésta.
Según se usa en este documento, la expresión "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada de los aminoácidos que se dan con más frecuencia (o nucleótidos) en una familia de secuencias relacionadas (Véase, p.ej, Winnaker, (1987) “From Genes to Clones” (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania). En una familia de
35 proteínas, cada posición en la secuencia consenso es ocupada por el aminoácido que aparece con más frecuencia en aquella posición en la familia. Si dos aminoácidos aparecen igualmente con la misma frecuencia, cualquiera puede ser incluido en la secuencia consenso. Un "marco consenso" se refiere a la región marco en la secuencia consenso de inmunoglobulina.
5 Un anticuerpo puede ser humanizado por métodos conocidos en la técnica. Pueden generarse anticuerpos humanizados sustituyendo secuencias de la región variable Fv que no estén directamente implicadas en la unión del antígeno con las secuencias equivalentes de las regiones variables de Fv humano. Se proporcionan métodos generales para generar anticuerpos humanizados en Morrison (1985)
10 Science 229:1202-1207, Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214, y Queen et al. patentes de EE.UU. Nos. 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762, cuyos contenidos son incorporados por medio de ésta como referencia. Aquellos métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todo o parte de regiones variables de Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera.
15 Las fuentes de tal ácido nucleico son conocidas por los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden ser obtenidas a partir de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un polipéptido 2150 o su fragmento. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o su fragmento, puede ser clonado entonces en un vector de expresión apropiado.
20 Los anticuerpos humanizados o injertados en CDR pueden producirse por el injerto de CDR o por la sustitución de CDR, en el que puede sustituirse una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, p.ej, la patente de EE.UU. Nº. 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060; Winter, patente de
25 EE.UU. Nº. 5.225.539, cuyos contenidos son expresamente incorporados por este medio como referencia. Winter describe un método de injerto de CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (solicitud de patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter, patente de EE.UU. Nº. 5.225.539), cuyos contenidos son expresamente
30 incorporados por este medio como referencia. También están dentro del ámbito de la invención los anticuerpos humanizados en los cuales los aminoácidos específicos han sido sustituidos, suprimidos o añadidos. Los anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácido en la región marco, tales como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, un
35 anticuerpo humanizado tendrá residuos marco idénticos al residuo marco del donador
o a otro aminoácido además del residuo marco del receptor. Para generar tales anticuerpos, puede sustituirse un número seleccionado y pequeño de residuos marco del aceptador de la cadena de inmunoglobulina humanizada por los aminoácidos del donante correspondiente. Las posiciones preferidas de las sustituciones incluyen los 5 residuos de aminoácidos adyacentes a la CDR, o que son capaces de interaccionar con una CDR (véase, p.ej, la patente de EE.UU. Nº. 5.585.089). Los criterios para seleccionar los aminoácidos del donador son descritos en el documento de EE.UU. Nº. 5.585.089, p.ej, las columnas 12-16 del documento de EE.UU. Nº. 5.585.089, p.ej., las columnas 12-16 del documento de EE.UU. Nº. 5.585.089, cuyo contenido se incorpora
10 por este medio como referencia. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan et al., documento EP 519596 A1, publicado el 23 de diciembre de 1992.
Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden producirse 15 usando ratones transgénicos que sean incapaces de expresar genes de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humana. Véase, por ejemplo, Lonberg y Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93); y patentes de EE.UU. Nº. 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; y 5.545.806. Además, pueden ser contratadas compañías tales como
20 Abgenix, Inc (Fremont, CA) y Medarex, Inc (Princeton, NJ), para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita antes. Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado usando una técnica denominada "selección dirigida." En este
25 enfoque, un anticuerpo monoclónico no humano seleccionado, p.ej, un anticuerpo murino, se usa para dirigir la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. Esta tecnología es descrita en Jespers et al. (1994) Bio/Technology 12:899-903). El anticuerpo anti2150 puede ser un anticuerpo de cadena sencilla. Un
30 anticuerpo de cadena sencilla (scFV) puede modificarse como se describe, por ejemplo, en Colcher et al. (1999) Ann. N Y Acad. Sci. 880:263-80; y Reiter (1996) Clin. Cancer Res. 2:245-52. El anticuerpo de cadena sencilla puede ser dimerizado o multimerizado para generar anticuerpos multivalentes que tengan especificidades para epítopos diferentes de la misma proteína 2150 diana.
En una realización preferida, el anticuerpo tiene una capacidad reducida, o ninguna, de unirse a un receptor de Fc. Por ejemplo, es un isotipo o subtipo, fragmento u otro mutante, que no apoya la unión a un receptor de Fc, p.ej, tiene un receptor de Fc mutagenizado o suprimido que se une a la región.
5 Un anticuerpo (o su fragmento) puede ser conjugado a un resto terapéutico tal como una citotoxina, un agente terapéutico o un ión radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye a cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina, daunorubicina,
10 dihidroxi-antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, maitansinoides, p.ej, maitansinol (véase, la patente de EE.UU. Nº. 5.208.020), CC-1065 (véanse, las patentes de EE.UU. Nº. 5.475.092, 5.555.499, 5.846.545) y sus análogos o homólogos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no
15 están limitados a antimetabolitos (p.ej, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, decarbazina 5-fluorouracil), agentes alquilantes (p.ej., mecloretamina, tioepa clorambucil, CC-1065, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ej, daunorubicina (antes
20 daunomicina) y doxorubicina), antibióticos (p.ej, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p.ej, vincristina, vinblastina, taxol y maitansinoides). Los iones radiactivos incluyen, pero no están limitados al yodo, itrio y praseodimio. Los conjugados de la invención pueden usarse para modificar una respuesta
25 biológica dada; el resto terapéutico no debe ser interpretado como limitado con los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto terapéutico puede ser una proteína o un polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tales como abrina, ricino A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como el factor de necrosis
30 tumoral, �-interferón, �−interferón, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador de plasminógeno de tejido; o, modificadores de respuesta biológicos tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colonia de macrofase de granulocitos ("G-M-CSF"), factor estimulante
35 de colonia de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.
O bien, puede conjugarse un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado del anticuerpo como se describe por Segal en la patente de EE.UU. Nº. 4.676.980.
Un anticuerpo anti2150 (p.ej, un anticuerpo monoclónico) puede usarse para
5 aislar 2150 por técnicas estándares, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, puede usarse un anticuerpo anti2150 para detectar la proteína 2150 (p.ej, en un lisado celular o sobrenadante celular) a fin de evaluar la abundancia y el modelo de expresión de la proteína. Pueden usarse anticuerpos anti2150 de modo diagnóstico para controlar los niveles de proteína en el tejido como
10 parte de un procedimiento de ensayo clínico, p.ej, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable (es decir, marcando el anticuerpo). Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
15 bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, �−galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de
20 fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina y los ejemplos del material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. En las realizaciones preferidas, puede prepararse un anticuerpo inmunizando
25 con un antígeno de 2150 purificado, o su fragmento, p.ej, un fragmento descrito en este documento, un antígeno asociado a la membrana, tejidos, p.ej, preparaciones de tejido ordinarias, células enteras, células preferiblemente vivas, células lisadas o fracciones de células, p.ej, fracciones de membrana. Los anticuerpos que se unen sólo a una proteína 2150 natural, sólo
30 desnaturalizada o por otra parte la proteína 2150 no natural, o que se unen a ambos, están dentro de la invención. Los anticuerpos con epítopos lineales o estructurales están dentro de la invención. Los epítopos estructurales pueden ser identificados a veces identificando los anticuerpos que se unen a la proteína 2150 natural, pero no desnaturalizada.
35
Usos
Las moléculas de ácido nucleico, las proteínas, los homólogos de proteína, y los anticuerpos descritos en este documento pueden usarse en uno o varios de los métodos siguientes: a) ensayos de cribado; b) medicina preventiva (p.ej, ensayos
5 diagnósticos, ensayos pronósticos; control de ensayos clínicos, y farmacogenética); y c) métodos de tratamiento (p.ej, terapéuticos y profilácticos).
Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención pueden usarse, por ejemplo, para expresar una proteína 2150 (p.ej, vía un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar
10 el mARN de 2150 (p.ej, en una muestra biológica) o una modificación genética en un gen de 2150, y para modular la actividad de 2150, como se describe más abajo. Las proteínas 2150 pueden usarse para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de un sustrato de 2150 o la producción de inhibidores de 2150. Además, las proteínas 2150 pueden usarse para seleccionar
15 sustratos de 2150 naturales, para seleccionar fármacos o compuestos que modulen la actividad de 2150, así como tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de la proteína 2150 o la producción de formas proteicas de 2150 que han disminuido, una actividad aberrante o no deseada comparada con la proteína 2150 de tipo silvestre (p.ej, aberrante o deficiente de trastornos proliferativos
20 y / o diferenciativos p.ej., carcinoma, sarcoma, trastornos metastásicos o trastornos hematopoyéticos, p.ej, leucemias, función o expresión). Además, los anticuerpos anti2150 de la invención pueden usarse para detectar y aislar proteínas 2150, para regular la disponibilidad biológica de las proteínas 2150, y modular la actividad de 2150.
25 Se proporciona un método para evaluar un compuesto según su capacidad de interaccionar, p.ej, uniéndose, con un polipéptido 2150 diana. El método incluye: poner en contacto el compuesto con el polipéptido 2150 diana; y evaluar la capacidad del compuesto para interaccionar, p.ej, uniéndose o formando un complejo, con el polipéptido 2150 diana. Este método puede ser realizado in vitro, p.ej, en un sistema
30 libre de células, o in vivo, p.ej, en un ensayo trampa de interacción de dos híbridos. Este método puede usarse para identificar moléculas naturales que interaccionan con el polipéptido 2150 diana. También puede usarse para encontrar inhibidores naturales
o sintéticos del polipéptido 2150 diana. Se mencionan detalladamente métodos de cribado más abajo.
35
Ensayos de Cribado:
La invención proporciona métodos (también denominados en este documento "ensayos de cribado") para identificar moduladores, es decir, candidatos o compuestos de ensayo o agentes (p.ej, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, 5 pequeñas moléculas u otros fármacos) que se unen a proteínas 2150, tienen un efecto estimulador o inhibitorio, por ejemplo, en la expresión de 2150 o la actividad de 2150,
o tienen un efecto estimulador o inhibitorio, por ejemplo, en la expresión o la actividad de un sustrato de 2150. Los compuestos así identificados pueden usarse para modular la actividad de productos génicos diana (p.ej, genes de 2150) en un protocolo
10 terapéutico, para elaborar la función biológica del producto génico diana, o identificar compuestos que interrumpan las interacciones de los genes normales diana. En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de ensayo que son sustratos de una proteína 2150 o polipéptido o su parte biológicamente activa. En otra realización, la invención
15 proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de ensayo que se unan o modulen la actividad de una proteína 2150 o polipéptido o su parte biológicamente activa. Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden ser obtenidos usando cualquiera de los numerosos enfoques en los métodos de las genotecas
20 combinatorias conocidas en la técnica, incluyendo: genotecas biológicas; genotecas peptoides (genotecas de moléculas que tienen funcionalidades peptídicas, pero con una nueva estructura no peptídica, que son resistentes a la degradación enzimática, aunque, sin embargo, se mantengan bioactivos; véase, p.ej, Zuckermann et al. (1994)
J. Med. Chem. 37:2678-85); genotecas de fase sólida o fase de solución paralelas
25 espacialmente direccionables; métodos de genoteca sintéticos que requieren la deconvolución; método de genoteca de “un-compuesto una-cuenta”; y métodos de genoteca sintéticos usando la selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de genoteca biológica y de genoteca peptoide están limitados a las genotecas del péptido, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables al péptido, al oligómero
30 no peptídico o a genotecas de molécula pequeña de compuestos (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145). Los ejemplos de métodos para la síntesis de genotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 90:6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-426; 35 Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678-85; Cho et al. (1993) Science
261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Editor. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Editor. Engl. 33:2061; y en Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233-51.
Las genotecas de compuestos pueden presentarse en solución (p.ej, Houghten
5 (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner, USP 5.223.409), esporas (Ladner USP ’409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89:18651869) o en fago (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382; Felici (1991) J.
10 Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra.). En una realización, un ensayo es un ensayo celular en el que una célula que expresa una proteína 2150 o su parte biológicamente activa se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de 2150. La determinación de la capacidad del compuesto de
15 ensayo para modular la actividad de 2150 puede llevarse a cabo supervisando, por ejemplo, los cambios bioquímicos y morfológicos asociados con el crecimiento celular y la división. La célula, por ejemplo, puede ser de origen mamífero, p.ej, humano.
También puede evaluarse la capacidad del compuesto de ensayo para modular la unión de 2150 a un compuesto, p.ej, un sustrato de 2150, o la unión a 2150. Esto 20 puede llevarse a cabo, por ejemplo, conectando el compuesto, p.ej, el sustrato, con un radioisótopo o marcador enzimático tal que la unión del compuesto, p.ej, el sustrato, a 2150 puede determinarse detectando el compuesto marcado, p.ej, el sustrato, en un complejo. O bien, podría conectarse 2150 a un radioisótopo o marcador enzimático para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo para modular la unión de
25 2150 a un sustrato de 2150 en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (p.ej, los 125I, 14C, 35S
sustratos de 2150) pueden marcarse con o 3H, directamente o indirectamente, y el radioisótopo puede ser detectado por recuento directo de radioemisión o por recuento por centelleo. O bien, los compuestos pueden marcarse enzimaticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o
30 luciferasa, y el marcador enzimático puede detectarse por la determinación de la conversión de un sustrato apropiado al producto. Puede evaluarse la capacidad de un compuesto (p.ej, un sustrato de 2150) para interaccionar con 2150 con o sin el marcaje de cualquiera de los interaccionantes. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un
35 compuesto con 2150 sin el marcaje del compuesto o de 2150. McConnell et al. (1992) Science 257:1906-1912. Según se usa en este documento, un "microfisiómetro" (p.ej, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad en la que una célula acidifica su ambiente usando un sensor potenciométrico direccionable por la luz (LAPS). Los cambios en esta tasa de acidificación pueden usarse como indicadores de
5 la interacción entre el compuesto y 2150.
En otra realización más, se proporciona un ensayo sin células en el que se pone en contacto una proteína 2150 o su parte biológicamente activa con un compuesto de ensayo y se evalúa la capacidad del compuesto de ensayo de unirse a la proteína 2150 o su parte biológicamente activa. Las partes preferidas
10 biológicamente activas de las proteínas 2150 que se usan en los ensayos de la presente invención incluyen los fragmentos que participan en las interacciones con moléculas no 2150, p.ej, fragmentos con tanteos de probabilidad superficiales altos.
Las formas solubles y/o unidas a la membrana de las proteínas aisladas (p.ej, las proteínas 2150 o sus partes biológicamente activas) pueden usarse en los ensayos 15 sin célula de la invención. Cuando se usan las formas unidas a la membrana de la proteína, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante. Los ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, ndodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-Nmetilglucamida, Tritón ® X-100, Tritón ® X-114, Thesit ®, Isotridecipoli(etilen-glicol
20 éter)n, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano (CHAP-SO) o sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-amonio-1-propano.
Los ensayos sin célula implican preparar una mezcla de reacción de la proteína del gen diana y el compuesto de ensayo en condiciones y durante un tiempo suficiente 25 para permitir que los dos componentes interactúen y se unan, formándose así un
complejo que puede ser eliminado y/o detectado.
La interacción entre dos moléculas también puede detectarse, p.ej, usando transferencias de energía de fluorescencia (FET) (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE.UU. Nº. 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., patente de EE.UU. Nº.
30 4.868.103). Un marcador fluoróforo en la primera molécula de 'donador'se selecciona tal que su energía fluorescente emitida será absorbida por un marcador fluorescente durante un segundo, molécula 'aceptadora', que por su parte es capaz de emitir fluorescencia debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula proteica 'donadora'puede utilizar simplemente la energía fluorescente natural de los residuos
35 de triptófano. Se eligen los marcadores que emiten longitudes de onda diferentes de la luz, tal que el marcador de la molécula 'aceptadora'puede ser diferenciada de la del 'donador'. Ya que la eficacia de la transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la cual ocurre la unión entre las
5 moléculas, la emisión fluorescente del marcador de la molécula 'aceptadora'en el ensayo debería ser máxima. Un acontecimiento de unión FET puede medirse cómodamente por medios de detección fluorométricos estándares conocidos en la técnica (p.ej, usando un fluorímetro).
En otra realización, puede llevarse a cabo la determinación de la capacidad de
10 la proteína 2150 de unirse a una molécula diana usando el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) a tiempo real (véase, p.ej, Sjolander y Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705). La "resonancia de plasmón de superficie" o "BIA" detecta interacciones biospecíficas a tiempo real, sin marcar ninguno de los interaccionantes (p.ej, BIAcore). Los cambios
15 de masa en la superficie de unión (indicativo de un acontecimiento de unión) causan modificaciones del índice refractivo de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón de superficie (SPR)), causando una señal detectable que puede ser usada como una indicación de las reacciones a tiempo real entre las moléculas biológicas.
20 En una realización, el producto génico diana o la sustancia de ensayo se fija a una fase sólida. Los complejos del producto génico/compuesto de ensayo diana fijados en la fase sólida pueden ser detectados al final de la reacción. Preferiblemente, el producto génico diana puede fijarse en una superficie sólida, y el compuesto de ensayo, (que no está fijado), puede marcarse, directamente o indirectamente, con los
25 marcadores detectables mencionados en este documento. Puede ser deseable inmovilizar 2150, un anticuerpo anti2150 o su molécula diana para facilitar la separación de las formas complejadas desde las no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como adecuar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a una proteína 2150, o la interacción de una
30 proteína 2150 con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede llevarse a cabo en cualquier recipiente adecuado que contenga los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtítulo, probetas y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añada un dominio que permita que se unan una o ambas proteínas a una
35 matriz. Por ejemplo, glutationa-S-transferasa/proteínas de fusión de 2150 o glutationa
S-transferasa/proteínas de fusión diana pueden ser adsorbidas en las perlas de glutationa sepharose (Sigma Chemical, San. Louis, MO) o placas de microtítulo derivatizadas de glutationa, que son combinadas entonces con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o la proteína 2150, 5 y la mezcla se incuba en condiciones conducentes a la formación del complejo (p.ej, en condiciones fisiológicas salinas y de pH). Después de la incubación, las perlas o los pocillos de la placa de microtítulo son lavados para eliminar cualquier componente desunido, la matriz se inmoviliza en el caso de las perlas, el complejo se determina directamente o indirectamente, por ejemplo, como se describe antes. O bien, los
10 complejos pueden ser disociados de la matriz, y el nivel de unión de 2150 o la actividad puede ser determinada usando técnicas estándares. Otras técnicas para inmovilizar una proteína 2150 o una molécula diana en matrices incluyen la conjugación utilizando biotina y estreptavidina. Pueden prepararse la proteína 2150 biotinilada o las moléculas diana de biotina-NHS (N-hidroxi
15 succinimida) usando técnicas conocidas en la técnica (p.ej, el kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), y se inmovilizan en los pocillos de placas de 96 pocillos revestidos de estreptavidina (Pierce Chemicals).
A fin de llevar a cabo el ensayo, se añade el componente no inmovilizado a la superficie revestida que contiene el componente fijado. Después de que la reacción se 20 complete, los componentes no reaccionados son eliminados (p.ej, lavando) en condiciones tales que cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. La detección de complejos fijados en la superficie sólida puede llevarse a cabo de varios modos. Cuando el componente previamente no inmovilizado está premarcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que
25 los complejos se formaron. Cuando el componente anteriormente no inmovilizado no está premarcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar los complejos fijados en la superficie; p.ej, usando un anticuerpo marcado específico o selectivo para el componente inmovilizado (el anticuerpo, por su parte, puede estar marcado directamente o marcado indirectamente, p.ej, por un anticuerpo anti-Ig marcado).
30 En una realización, este ensayo se realiza utilizando anticuerpos reactivos con la proteína 2150 o con las moléculas diana, pero que no interfieren con la unión de la proteína 2150 a su molécula diana. Tales anticuerpos pueden ser derivatizados en los pocillos de la placa, y la diana no unida o la proteína 2150 puede ser atrapada en los pocillos por la conjugación del anticuerpo. Los métodos para detectar tales complejos,
35 además de aquellos descritos más arriba para los complejos GST-inmovilizados,
incluyen la inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con la proteína 2150 o molécula diana, así como los ensayos unidos a enzima que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína 2150 o la molécula diana.
5 O bien, los ensayos de células libres pueden llevarse a cabo en fase líquida. En tal ensayo, los productos de reacción son separados de los componentes no reaccionados, por cualquiera de diversas técnicas estándares, incluyendo, pero no limitados a: centrifugación diferencial (véase, por ejemplo, Rivas y Minton (1993) Trends Biochem Sci 18:284-7); cromatografía (cromatografía de filtración de gel,
10 cromatografía de intercambio iónico); electroforesis (véase, p.ej, Ausubel et al., ed. (1999) “Current Protocols in Molecular Biology”, J. Wiley, Nueva York); e inmunoprecipitación (véase, por ejemplo, Ausubel et al., ed. (1999) “Current Protocols in Molecular Biology”, J. Wiley, Nueva York). Tales resinas y técnicas cromatográficas son conocidas por los expertos en la técnica (véase, p.ej, Heegaard (1998) J Mol
15 Recognit 11:141-8; Hage y Tweed (1997) J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 699:499525). Además, la transferencia de energía de fluorescencia también puede ser adecuadamente utilizada, como se describe en este documento, para detectar la unión sin purificación adicional del complejo de la solución. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína
20 2150 o su parte biológicamente activa con un compuesto conocido que se una a 2150 para formar una mezcla de ensayo, poniendo en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinando la capacidad del compuesto de ensayo de interaccionar con una proteína 2150, en donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína 2150 incluye la
25 determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de unirse preferiblemente a 2150 o su parte biológicamente activa, o para modular la actividad de una molécula diana, comparando con el compuesto conocido.
Los productos génicos diana de la invención, in vivo, pueden interaccionar con una o varias macromoléculas celulares o extracelulares, tales como proteínas. Para 30 los fines de esta discusión, tales macromoléculas celulares y extracelulares son denominadas en este documento "parejas de unión." Los compuestos que impiden tales interacciones pueden ser útiles en la regulación de la actividad del producto génico diana. Tales compuestos pueden incluir, pero no están limitados a moléculas tales como anticuerpos, péptidos y moléculas pequeñas. Los genes diana 35 preferidos/productos para su uso en esta realización son los genes de 2150
identificados en este documento. En una realización alternativa, la invención proporciona métodos para determinar la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de una proteína 2150 por la modulación de la actividad de un efector corriente abajo de una molécula 2150 diana. Por ejemplo, puede determinarse
5 la actividad de la molécula efectora en una diana apropiada, o la unión del efector a una diana apropiada, puede determinarse, como se describe antes.
Para identificar los compuestos que interfieren con la interacción entre el producto génico diana y su(s) pareja(s) celular(es) o de unión extracelular, se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto génico diana y la pareja de unión, en
10 condiciones y durante un tiempo suficiente, para permitir que los dos productos formen el complejo. A fin de probar a un agente inhibitorio, se proporciona la mezcla de reacción en presencia y ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo puede ser incluido al principio en la mezcla de reacción, o puede ser añadido a la vez después de la adición del gen diana y su pareja celular o de unión extracelular. Las
15 mezclas de reacción control son incubadas sin el compuesto de ensayo o con un placebo. La formación de cualquier complejo entre el producto génico diana y la pareja celular o de unión extracelular se detecta entonces. La formación de un complejo en la reacción de control, pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo, indica que el compuesto interfiere con la interacción del producto génico diana
20 y la pareja de unión interactiva. Además, la formación del complejo dentro de las mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana normal también puede ser comparada respecto a la formación del complejo dentro de mezclas de reacción que contienen el compuesto de ensayo y el producto génico diana mutante. Esta comparación puede ser importante en aquellos casos en
25 los que es deseable identificar compuestos que bloqueen interacciones de mutantes, pero no productos génicos diana normales. Estos ensayos pueden llevarse a cabo en un formato heterogéneo u homogéneo. Los ensayos heterogéneos implican fijar el producto génico diana o la pareja de unión en una fase sólida, y detectar los complejos fijados en la fase sólida al
30 final de la reacción. En los ensayos homogéneos, la reacción entera se realiza en una fase líquida. En cada enfoque, el orden de adición de los reactivos puede ser variado para obtener una información diferente sobre los compuestos analizados. Por ejemplo, los compuestos de ensayo que interfieren con la interacción entre los productos génicos diana y las parejas de unión, p.ej, por competición, pueden ser identificados
35 llevando a cabo la reacción en presencia de la sustancia de ensayo. O bien, los compuestos de ensayo que bloquean los complejos preformados, p.ej, los compuestos con constantes de unión más altas que desplazan uno de los componentes del complejo, pueden ser probados añadiendo el compuesto de ensayo a la mezcla de la reacción después de que los complejos se hayan formado. Los diversos formatos son
5 descritos brevemente más abajo.
En un sistema de ensayo heterogéneo, el producto génico diana o la pareja celular interactiva o de unión extracelular, se fija en una superficie sólida (p.ej, una placa de microtítulo), mientras que la especie no fijada se marca, directamente o indirectamente. Las especies fijadas pueden ser inmovilizadas por uniones no
10 covalentes o covalentes. O bien, puede usarse un anticuerpo inmovilizado específico o selectivo para las especies que se fijan para fijar las especies a la superficie sólida. A fin de llevar a cabo el ensayo, la pareja de las especies inmovilizadas se expone a la superficie revestida con o sin el compuesto de ensayo. Después de que la reacción se completa, los componentes no reaccionados son eliminados (p.ej,
15 lavando) y cualquier complejo formado permanecerá inmovilizado en la superficie sólida. Cuando la especie no inmovilizada está premarcada, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron los complejos. Cuando la especie no inmovilizada no está premarcada, puede usarse un marcador indirecto para detectar los complejos fijados en la superficie; p.ej, usando un anticuerpo marcado
20 específico o selectivo para las especies no inmovilizadas al principio (el anticuerpo, por su parte, puede marcarse directamente o marcarse indirectamente, p.ej, por un anticuerpo anti-Ig marcado). Según el orden de adición de los componentes de reacción, los compuestos de ensayo que inhiben la formación del complejo o que bloquean los complejos preformados pueden ser detectados.
25 O bien, la reacción puede llevarse a cabo en una fase líquida en presencia o ausencia del compuesto de ensayo, los productos de reacción se separan de los componentes no reaccionados, y los complejos se detectan; p.ej, utilizando un anticuerpo inmovilizado específico o selectivo para uno de los componentes de unión para fijar cualquier complejo formado en la disolución, y un anticuerpo marcado
30 específico o selectivo para la otra pareja para detectar los complejos fijados. De nuevo, según el orden de adición de los reactivos a la fase líquida, pueden ser identificados los compuestos de ensayo que inhiben el complejo o que bloquean los complejos preformados. En una realización alternativa de la invención, puede usarse un ensayo
35 homogéneo. Por ejemplo, se prepara un complejo preformado del producto génico diana y el producto de la pareja celular interactiva o de unión extracelular en el que los productos génicos diana o sus parejas de unión están marcados, pero la señal generada por el marcador se inactiva debido a la formación del complejo (véase, p.ej, la patente de EE.UU. Nº. 4.109.496 que utiliza este enfoque para los inmunoensayos).
5 La adición de una sustancia de ensayo que compite y desplaza una de las especies del complejo preformado causará la generación de una señal por encima de la línea de fondo. De esta manera, pueden identificarse las sustancias de ensayo que bloquean la interacción de la pareja de unión del producto génico diana.
En otro aspecto más, las proteínas 2150 pueden usarse como "proteínas de
10 cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos (véase, p.ej, la patente de EE.UU. Nº. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Brent, documento WO94/10300), para identificar otras proteínas, que se unan o interaccionen con 2150 ("proteínas de unión
15 de 2150" o "2150-bp") y están implicadas en la actividad de 2150. Tales 2150-bp pueden ser activadores o inhibidores de señales por las proteínas 2150 o 2150 dianas tales como, por ejemplo, elementos corriente abajo de una ruta de señalización mediada por 2150. El sistema de dos híbridos está basado en la naturaleza modular de la mayor
20 parte de los factores de transcripción, que consisten en dominios de activación y unión del ADN separables. Brevemente, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica para una proteína 2150 se fusiona a un gen que codifica el ADN que se une al dominio de un factor de transcripción conocido (p.ej, GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN, de una genoteca de secuencias
25 de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona a un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. (O bien la 2150 proteína puede fusionarse al dominio del activador.) Si el "cebo" y las proteínas "presa" son capaces de interaccionar, in vivo, formando un complejo dependiente de 2150, los dominios de activación y unión del ADN del factor de
30 transcripción se acercan mucho. Esta proximidad permite la transcripción de un gen reportero (p.ej, lacZ) que se une operativamente a un sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. La expresión del gen reportero puede detectarse y las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional pueden ser aisladas y usadas para obtener el gen clonado que codifica la proteína que se
35 relaciona con la proteína 2150.
En otra realización, se identifican los moduladores de la expresión de 2150. Por ejemplo, se pone en contacto una célula o una mezcla libre de células con un compuesto candidato y la expresión de mARN de 2150 o la proteína evaluada con relación al nivel de expresión de mARN de 2150 o la proteína en ausencia del
5 compuesto candidato. Cuando la expresión de mARN de 2150 o la proteína es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador del mARN de 2150 o de la expresión de la proteína. O bien, cuando la expresión del mARN de 2150 o la proteína es menos (según las estadísticas sustancialmente menos) en presencia del compuesto candidato que en su
10 ausencia, el compuesto candidato es identificado como un inhibidor de mARN de 2150
o la expresión de la proteína. El nivel de mARN de 2150 o la expresión de la proteína puede ser determinado por los métodos descritos en este documento para detectar el mARN de 2150 o la proteína.
En otro aspecto, la invención se refiere a una combinación de dos o más de los
15 ensayos descritos en este documento. Por ejemplo, puede ser identificado un agente de modulación usando un ensayo celular o de células libres, y puede ser confirmada in vivo la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína 2150, p.ej, en un animal tal como un modelo de ratón para una enfermedad alérgica de las vías respiratorias (AAD) o inflamación y trastornos respiratorios p.ej, bronquitis crónica,
20 asma bronquial y broncoectasia o trastornos hematopoyéticos, p.ej, leucemias. Esta invención además se refiere a nuevos agentes identificados por los anteriores ensayos de cribado descritos. En consecuencia, dentro del ámbito de esta invención está usar además a un agente identificado como se describe en este documento (p.ej, un agente de modulación de 2150, una molécula de ácido nucleico
25 de 2150 antisentido, un anticuerpo de 2150 específico, o una pareja de unión de 2150) en un modelo animal apropiado para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismo de acción del tratamiento con tal agente. Además, los nuevos agentes identificados por los anteriores ensayos de cribado descritos pueden usarse para los tratamientos que se describen en este documento.
30
Ensayos de Detección
Las partes o los fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos identificados en este documento pueden usarse como reactivos del polinucleótido. Por ejemplo, estas secuencias pueden usarse: (i) para mapear sus genes respectivos en
35 un cromosoma p.ej, para localizar las regiones de los genes asociados a la enfermedad genética o asociados a una enfermedad de 2150; (ii) identificar a un individuo a partir de una ínfima muestra biológica (determinación de tipos histológicos); e (iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones son descritas en las subdivisiones de más abajo.
5
Mapeo Cromosómico
Las secuencias de nucleótidos de 2150 o sus partes pueden usarse para localizar la posición de los genes de 2150 en un cromosoma. Este proceso se llama mapeo cromosómico. El mapeo cromosómico es útil para correlacionar las secuencias
10 de 2150 con los genes asociados a la enfermedad. Brevemente, se pueden mapear los genes de 2150 frente a cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 bp de longitud) de las secuencias de nucleótidos de 2150. Estos cebadores pueden usarse entonces para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas
15 humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de 2150 producirán un fragmento amplificado. Un panel de híbridos de células somáticas en los cuales cada línea celular contiene un solo cromosoma humano o un pequeño número de cromosomas humanos, y un grupo completo de cromosomas de ratón, puede permitir una fácil
20 correlación de los genes individuales frente a los cromosomas humanos específicos. (D’Eustachio et al. (1983) Science 220:919-924). Pueden usarse otras estrategias de mapeo p.ej, hibridación in situ (descritas en Fan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6223-27), pre-seleccionando con cromosomas clasificados por flujo marcado, y la preselección por la hibridación
25 respecto a genotecas de cADN específicas al cromosoma para mapear a 2150 respecto a una posición cromosómica.
Medicina Preventiva La presente invención también pertenece al campo de la medicina preventiva
30 en la cual los ensayos diagnósticos, los ensayos pronósticos y el control de los ensayos clínicos se usan con fines pronósticos (preventivos) para tratar así a un individuo.
Generalmente, la invención proporciona un método para determinar si un sujeto está en peligro de padecer un trastorno relacionado con una lesión o la 35 expresión defectuosa de un gen que codifica 2150.
El trastorno asociado con la expresión defectuosa del gen de 2150 es un trastorno del sistema respiratorio. El método incluye uno o varios de los siguientes:
5 -detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o la ausencia de una mutación que afecta a la expresión del gen de 2150, o detectar la presencia o ausencia de una mutación en una región que controla la expresión del gen, p.ej, una mutación en la región control de 5’; -detectar, en un tejido del sujeto, la presencia o la ausencia de una mutación
10 que cambia la estructura del gen de 2150; -detectar, en un tejido del sujeto, la expresión defectuosa del gen de 2150, a nivel del mARN, p.ej, detectando el nivel de un mARN de tipo no silvestre; -detectar, en un tejido del sujeto, la expresión defectuosa del gen, a nivel de la proteína, p.ej, detectando el nivel de un polipéptido de 2150 de tipo no
15 silvestre.
En las realizaciones preferidas, el método incluye: averiguar la existencia de al menos uno de: una deleción de uno o varios nucleótidos del gen de 2150; una inserción de uno o varios nucleótidos en el gen, una mutación de punto, p.ej, una
20 sustitución de uno o varios nucleótidos del gen, un vasto reordenamiento cromosómico del gen, p.ej, una translocación, inversión o deleción.
Por ejemplo, la detección de la lesión genética puede incluir: (i) proporcionar una sonda/cebador que incluya un oligonucleótido que contenga una región de la secuencia de nucleótidos que se hibrida en una secuencia sentido o antisentido de
25 SEQ ID NO:1, o sus mutantes naturales o secuencias flanqueantes de 5’ o 3’ naturalmente asociadas con el gen de 2150; (ii) presentar la sonda/cebador frente al ácido nucleico del tejido; y detectar, por hibridación, p.ej, hibridación in situ, de la sonda / cebador frente al ácido nucleico, la presencia o ausencia de la lesión genética.
En las realizaciones preferidas, detectar la expresión defectuosa incluye
30 averiguar la existencia de al menos uno de: una modificación en el nivel de un transcrito de ARN mensajero del gen de 2150; la presencia de un modelo de empalme tipo no silvestre de un transcrito de ARN mensajero del gen; o un nivel de 2150 de tipo no silvestre.
Los métodos de la invención pueden usarse prenatalmente o para determinar si el descendiente de un sujeto estará en peligro de padecer un trastorno del sistema respiratorio.
En las realizaciones preferidas, el método incluye determinar la estructura de 5 un gen de 2150, siendo indicativa una estructura anormal, del riesgo de padecer el trastorno del sistema respiratorio.
En las realizaciones preferidas, el método incluye poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo frente a la proteína 2150 o a un ácido nucleico, que se hibrida expresamente con el gen. Estas y otras realizaciones se estudian más
10 abajo.
Ensayos Diagnósticos y Pronósticos para Trastornos del Sistema Respiratorio La presencia, el nivel, o la ausencia de la proteína 2150 o el ácido nucleico en una muestra biológica puede ser evaluada obteniendo una muestra biológica de un
15 sujeto de ensayo y poniendo en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar la proteína 2150 o el ácido nucleico (p.ej, mARN, ADN genómico) que codifica la proteína 2150 tal que la presencia de la proteína 2150 o el ácido nucleico es detectada en la muestra biológica. La expresión "muestra biológica" incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos,
20 células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Una muestra biológica preferida es el suero. El nivel de expresión del gen de 2150 puede ser medido de varios modos, incluyendo, pero no limitados a: medir el mARN codificado por los genes de 2150; medir la cantidad de proteína codificada por los genes de 2150; o medir la actividad de la proteína codificada por los genes de 2150.
25 El nivel de mARN correspondiente al gen de 2150 en una célula puede ser determinado tanto en formatos in situ como in vitro. El mARN aislado puede usarse en ensayos de hibridación o amplificación incluyendo, pero no están limitados a, análisis Southern o Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa y series de sondas. Un método diagnóstico
30 preferido para la detección de niveles de mARN implica poner en contacto el mARN aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que puede hibridarse al mARN codificado por el gen detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de 2150 de cadena entera, tal como el ácido nucleico de SEQ ID NO:1, o una parte de éste, tal como un oligonucleótido de al menos 30, 50, 100, 250 ó
35 500 nucleótidos de longitud y ser suficiente para hibridarse expresamente en
condiciones rigurosas al mARN de 2150 o al ADN genómico. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos diagnósticos son descritas en este documento. En un formato, el mARN (o cADN) es inmovilizado en una superficie y es puesto en contacto con las sondas, por ejemplo corriendo el mARN aislado en un gel
5 de agarosa y transfiriendo el mARN del gel a una membrana, tal como la nitrocelulosa. En un formato alternativo, las sondas son inmovilizadas en una superficie y el mARN (o cADN) es puesto en contacto con las sondas, por ejemplo, en una serie de chips de genes de dos dimensiones. Un experto en la técnica puede adaptar métodos de detección de mARN conocidos para su uso en la detección del nivel de mARN
10 codificado por los genes de 2150. El nivel de mARN en una muestra que es codificada por uno de 2150 puede ser evaluado con la amplificación del ácido nucleico, p.ej, por rtPCR (Mullis (1987) patente de EE.UU. Nº. 4.683.202), reacción en cadena de ligasa (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), replicación de secuencia auto-sostenida (Guatelli et
15 al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi et al., (1988) Bio / Technology 6:1197), replicación por círculo rodante (Lizardi et al., patente de EE.UU. Nº. 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación del ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas
20 amplificadas usando las técnicas conocidas en la técnica. Según se usa en este documento, los cebadores de amplificación son definidos como un par de moléculas de ácido nucleico que pueden hibridarse a las regiones 5’ o 3’ de un gen (más y menos cadenas, respectivamente, o viceversa) y contener una región corta en medio. En general, los cebadores de amplificación tienen aproximadamente de 10 a 30
25 nucleótidos de longitud y una región flanqueante de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. En las condiciones apropiadas y con los reactivos apropiados, tales cebadores permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueante de los cebadores. Para los métodos in situ, una célula o muestra de tejido puede ser
30 preparada/tratada e inmovilizada en un soporte, típicamente un portaobjetos de vidrio, y luego puesta en contacto con una sonda que se puede hibridar al mARN que codifica el gen de 2150 analizado.
En otra realización, los métodos además ponen en contacto una muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar el mARN de 2150, o el ADN 35 genómico, y comparar la presencia del mARN de 2150 o el ADN genómico en la
muestra de control con la presencia del mARN de 2150 o el ADN genómico en la muestra de ensayo. Pueden usarse diversos métodos para determinar el nivel de proteína codificada por 2150. En general, estos métodos incluyen poner en contacto un agente
5 que se une selectivamente a la proteína, tal como un anticuerpo con una muestra, para evaluar el nivel de proteína en la muestra. En una realización preferida, el anticuerpo lleva un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlónicos, o más preferiblemente, monoclónicos. Puede usarse un anticuerpo intacto, o su fragmento (p.ej, Fab o F(ab’)2). El término "marcado", en cuanto a la sonda o al
10 anticuerpo, se requiere que abarque tanto el marcaje directo de la sonda o del anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o al anticuerpo, como el marcaje indirecto de la sonda o del anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable. Se proporcionan en este documento ejemplos de sustancias detectables.
15 Los métodos de detección pueden usarse para detectar a la proteína 2150 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Las técnicas in vitro para la detección de la proteína 2150 incluyen ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, inmunoensayo de enzimas (EIA), radioinmunoensayos (RIA), y análisis de transferencia Western. Las técnicas in vivo
20 para la detección de la proteína 2150 incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti2150 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y posición en un sujeto pueden detectarse por técnicas de visualización estándares. En otra realización, los métodos además incluyen poner en contacto la muestra
25 de control con un compuesto o agente capaz de detectar la proteína 2150, y comparar la presencia de la proteína 2150 en la muestra de control con la presencia de la proteína 2150 en la muestra de ensayo. La invención también incluye kits para detectar la presencia de 2150 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede incluir un compuesto o agente capaz de
30 detectar la proteína 2150 o el mARN en una muestra biológica; y un estándar. El compuesto o el agente pueden envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones para usar el kit que detecta a la proteína 2150 o el ácido nucleico. Para los kits basados en el anticuerpo, el kit puede incluir: (1) un primer
35 anticuerpo (p.ej, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido
correspondiente a un marcador de la invención; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o al primer anticuerpo y que se conjuga a un agente detectable.
Para los kits basados en oligonucleótidos, el kit puede incluir: (1) un
5 oligonucleótido, p.ej, un oligonucleótido marcado de forma detectable, que se hibrida a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido correspondiente a un marcador de la invención o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico correspondiente a un marcador de la invención. El kit puede incluir también a un agente tampón, un conservante, o un agente estabilizante de proteínas.
10 El kit puede también incluir los componentes necesarios para detectar al agente detectable (p.ej, una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra de control o una serie de muestras de control que pueden ser analizadas y comparadas con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del kit puede incluirse dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden
15 estar dentro de un envase individual, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos realizados usando el kit. Los métodos diagnósticos descritos en este documento pueden identificar sujetos que tienen, o están en peligro de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad defectuosa de 2150 o expresión aberrante o no
20 deseada. Según se usa en este documento, la expresión "no deseada" incluye un fenómeno no deseado implicado en una respuesta biológica tal como el dolor o una proliferación celular desregulada.
En una realización, se identifica una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de 2150 aberrante o no deseada. Se obtiene una muestra de 25 ensayo de un sujeto y la proteína 2150 o el ácido nucleico (p.ej, el mARN o el ADN genómico) se evalúan, en donde el nivel, p.ej, la presencia o la ausencia, de la proteína 2150 o el ácido nucleico son diagnósticos en un sujeto que tiene, o está en peligro de desarrollar, una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de 2150 o no deseada. Según se usa en este documento, una
30 "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés, incluyendo un fluido biológico (p.ej, suero), muestra celular o histológica. Los ensayos pronósticos descritos en este documento pueden usarse para determinar si a un sujeto se le puede administrar un agente (p.ej, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, pequeña molécula u
35 otro fármaco candidato) para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la
expresión de 2150 o actividad aberrante o no deseada. Por ejemplo, tales métodos pueden usarse para determinar si un sujeto puede ser tratado con eficacia con un agente para los trastornos respiratorios p.ej, bronquitis crónica, asma bronquial y broncoectasia o trastornos hematopoyéticos, p.ej, leucemias, trastornos proliferativos y
5 / o diferenciativos p.ej, carcinoma, sarcoma.
También pueden usarse los métodos según la invención para detectar modificaciones genéticas en un gen de 2150, determinando así si un sujeto con el gen modificado está en peligro de padecer un trastorno caracterizado por una regulación defectuosa en la actividad de la proteína 2150 o la expresión del ácido nucleico, tales
10 como inflamación y trastornos respiratorios p.ej, bronquitis crónica, asma bronquial y broncoectasia, trastornos proliferativos y / o diferenciativos p.ej, carcinoma, sarcoma, trastornos metastásicos o trastornos hematopoyéticos, p.ej, leucemias. En las realizaciones preferidas, los métodos incluyen la detección, en una muestra del sujeto, de la presencia o la ausencia de una modificación genética caracterizada por al menos
15 una de una modificación que afecta a la integridad de un gen que codifica una proteína 2150, o la expresión defectuosa del gen de 2150. Por ejemplo, tales modificaciones genéticas pueden detectarse averiguando la existencia de al menos una de 1) una deleción de uno o varios nucleótidos de un gen de 2150; 2) una adición de uno o varios nucleótidos a un gen de 2150; 3) una sustitución de uno o varios nucleótidos de
20 un gen de 2150, 4) un reordenamiento cromosómico de un gen de 2150; 5) una modificación en el nivel de un transcrito de ARN de mensajero de un gen de 2150, 6) la modificación aberrante de un gen de 2150, tal como el modelo de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un modelo de empalme del tipo no silvestre de un transcrito de ARN de mensajero de un gen de 2150, 8) un nivel del tipo no silvestre de
25 una proteína 2150, 9) la pérdida alélica de un gen de 2150, y 10) la modificación posttranslacional inadecuada de una proteína 2150. Puede detectarse una modificación sin una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa, tal como el ancla PCR o RACE PCR, o, de forma alternativa, en un reacción de ligamiento en cadena (LCR), esta última puede ser particularmente
30 útil para detectar mutaciones de punto en el gen de 2150. Este método puede incluir las etapas de recuperar una muestra de células de un sujeto, aislar el ácido nucleico (p.ej, genómico, mARN o ambos) de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o varios cebadores que se hibriden expresamente a un gen de 2150 en condiciones tal que la hibridación y la amplificación del gen de 2150 (si está
35 presente) ocurran, y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud frente a una muestra control. Se espera que la PCR y/o LCR puedan ser deseables de usar como una etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para detectar las mutaciones descritas en este documento. O bien, pueden usarse otros
5 métodos de amplificación descritos en este documento o conocidos en la técnica.
En otra realización, pueden ser identificadas las mutaciones en un gen de 2150 de una célula muestra detectando las modificaciones en modelos de división de la enzima de restricción. Por ejemplo, el ADN control y la muestra se aíslan, se amplifican (opcionalmente), se digieren con una o varias endonucleasas de restricción,
10 y se determinan los tamaños de longitud del fragmento, p.ej, por electroforesis de gel y se comparan. Las diferencias en los tamaños de longitud de fragmentos entre la muestra y el ADN control indican las mutaciones en el ADN de muestra. Además, el uso de ribozimas específicos a la secuencia (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.495.531) puede usarse para validar la presencia de mutaciones específicas por
15 el desarrollo o la pérdida de un sitio de división de ribozima. En otras realizaciones, las mutaciones genéticas en 2150 pueden ser identificadas hibridando una muestra y los ácidos nucleicos control, p.ej, el ADN o ARN, dos series dimensionales, p.ej, series basadas en chips. Tales series incluyen una pluralidad de direcciones, cada una de las cuales es posicionalmente distinguible
20 de la otra. Una sonda diferente se localiza en cada dirección de la pluralidad. Las series pueden tener una alta densidad de direcciones, p.ej, pueden contener cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). Por ejemplo, las mutaciones genéticas en 2150 pueden ser identificadas en dos series dimensionales que
25 contienen sondas de ADN generadas por la luz como se describe en Cronin, M.T. et al. supra. Brevemente, puede usarse una primera serie de hibridación de sondas para rastrear a través de largas extensiones del ADN en una muestra y controlar para identificar cambios de bases entre las secuencias haciendo series lineales de sondas sobrelapantes secuenciales. Esta etapa permite la identificación de mutaciones de
30 punto. Esta etapa es seguida de una segunda serie de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando series de sondas más pequeñas especializadas complementarias a todas las VARIANTEes o mutaciones detectadas. Cada serie de mutación está formada por grupos de sonda paralelas, una complementaria al gen de tipo silvestre y otra complementaria al gen del mutante.
En otra realización más, puede usarse cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica directamente para secuenciar el gen de 2150 y detectar mutaciones comparando la secuencia de la muestra 2150 con la secuencia (control) correspondiente tipo silvestre. Pueden utilizarse procedimientos
5 de secuenciación automatizados realizando los ensayos diagnósticos (Naeve et al. (1995) Biotechniques 19:448-53), incluyendo la secuenciación por espectrometría de masas.
Otros métodos para detectar las mutaciones en el gen de 2150 incluyen los métodos en los cuales se usa la protección de agentes de división para detectar las
10 bases mal emparejadas en el ARN/ARN o hetero-dobles hélices ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230: 1242; Cotton et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295).
En otra realización más, la reacción de división de falta de correspondencia emplea una o varias proteínas que reconocen los pares de bases descoordinadas en 15 el ADN bicatenario (llamadas "enzimas de reparación de falta de correspondencia del ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear las mutaciones de punto en los cADN de 2150 obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli divide A en faltas de correspondencia de G/A y la timidina ADN glicosilasa de células HeLa divide T en faltas de correspondencia de G/T (Hsu et al. (1994)
20 Carcinogenesis 15:1657-1662; patente de EE.UU. Nº. 5.459.039). En otras realizaciones, se usarán modificaciones en la movilidad electroforética para identificar las mutaciones en los genes de 2150. Por ejemplo, puede usarse el polimorfismo de conformaciones monocatenarias (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre los ácidos nucleicos del mutante y del tipo silvestre
25 (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenario de los ácidos nucleicos de 2150 muestra y control serán desnaturalizados y se dejarán renaturalizar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos monocatenarios varía según la secuencia, la modificación resultante
30 en la movilidad electroforética permite la detección de hasta un cambio de base sencillo. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede realzarse usando ARN (mejor que ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio de la secuencia. En una realización preferida, el método sustancial utiliza el análisis de hetero-dobles
hélices para separar moléculas hetero-dobles hélices bicatenarias según los cambios de la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5). En otra realización más, se analiza el movimiento de los fragmentos mutantes
o de tipo silvestre en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente
5 desnaturalizante usando la electroforesis de gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se usa la DGGE como el método de análisis, el ADN se modificará para asegurar que no se desnaturalice completamente, por ejemplo añadiendo una pinza de GC de aproximadamente 40 bp del ADN rico en GC de alto punto de fusión por PCR. En una realización más, se usa
10 un gradiente de temperaturas en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar las diferencias de movilidad del ADN control y de la muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
Los ejemplos de otras técnicas para detectar las mutaciones de punto incluyen, pero no están limitados a hibridación de oligonucleótidos selectiva, amplificación 15 selectiva o extensión del cebador selectiva (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki
et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230).
O bien, puede usarse la tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación por PCR selectiva junto con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden
20 llevar la mutación de interés al centro de la molécula (de modo que la amplificación dependa de la hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:24372448) o al extremo 3’ final de un cebador donde, en condiciones apropiadas, la falta de coincidencia puede impedir, o reducir, la extensión de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además, puede ser deseable introducir un nuevo sitio de restricción
25 en la región de la mutación para crear la detección según la división (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se espera que en ciertas realizaciones, también puede realizarse la amplificación usando Taq ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189-93). En tales casos, la unión ocurrirá sólo si hay una coincidencia perfecta con el extremo 3’ final de la secuencia 5'haciendo posible
30 detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de la amplificación. Pueden realizarse los métodos descritos en este documento, por ejemplo, utilizando kits diagnósticos pre-envasados que comprenden al menos un ácido nucleico sonda o reactivo del anticuerpo descrito en este documento, que puede ser
35 usado cómodamente, p.ej, en ajustes clínicos para diagnosticar a pacientes que muestren síntomas o historia de familia de una enfermedad o enfermedad que implique al gen de 2150.
Uso de Moléculas 2150 como Marcadores Sustitutos
5 Las moléculas 2150 de la invención son también útiles como marcadores de trastornos o estados de enfermedad, tales como marcadores para precursores de estados de enfermedad, tales como marcadores para la predisposición de estados de enfermedad, tales como marcadores de la actividad farmacéutica, o tales como marcadores del perfil farmacogenómico de un sujeto. Usando los métodos descritos en
10 este documento, la presencia, la ausencia y/o la cantidad de moléculas 2150 de la invención puede detectarse, y pueden ser correlacionadas con uno o varios estados biológicos in vivo. Por ejemplo, las moléculas 2150 de la invención pueden servir como marcadores sustitutos para uno o más trastornos o estados de enfermedad o para condiciones que conducen hasta estados de enfermedad. Según se usa en este
15 documento, un "marcador sustituto" es un marcador bioquímico diana que guarda correlación con la ausencia o la presencia de una enfermedad o un trastorno del sistema respiratorio, o con la progresión de una enfermedad o un trastorno del sistema respiratorio (p.ej, con la presencia o la ausencia de un tumor). Estos marcadores pueden servir para indicar si un curso particular de tratamiento es eficaz en la
20 disminución de un estado de enfermedad o trastorno. Los marcadores sustitutos son de uso particular cuando la presencia o el grado de estado de una enfermedad o trastorno son difíciles de evaluar por metodologías estándares (p.ej, tumores en etapas iniciales), o cuando se desea una evaluación de la progresión de la enfermedad antes de que sea alcanzado el punto final clínico potencialmente peligroso
25 (p.ej, puede hacerse una evaluación de la enfermedad cardiovascular usando los niveles de colesterol como un marcador sustituto, y puede hacerse un análisis de la infección del VIH usando los niveles de ARN del VIH como un marcador sustituto, con mucha anticipación de los resultados clínicos indeseables de un infarto de miocardio o un SIDA totalmente desarrollado). Los ejemplos del uso de marcadores sustitutos en la
30 técnica incluyen: Koomen et al. (2000) J. Mass. Spectrom. 35: 258-264; y James (1994) AIDS Treatment News Archive 209. Las moléculas 2150 de la invención son también útiles como marcadores farmacodinámicos. Según se usa en este documento, un "marcador farmacodinámico" es un marcador bioquímico diana que guarda correlación expresamente con los
35 efectos del fármaco. La presencia o la cantidad de un marcador farmacodinámico no
están relacionadas con el estado de la enfermedad o el trastorno para el cual el fármaco está siendo administrado; por lo tanto, la presencia o la cantidad del marcador son indicativas de la presencia o la actividad del fármaco en un sujeto. Por ejemplo, un marcador farmacodinámico puede ser indicativo de la concentración del fármaco en un 5 tejido biológico, en el cual el marcador se expresa o se transcribe o no se expresa o no se transcribe en aquel tejido en relación al nivel del fármaco. De esta manera, la distribución o el consumo del fármaco pueden ser supervisados por el marcador farmacodinámico. Del mismo modo, la presencia o la cantidad del marcador farmacodinámico pueden estar relacionadas con la presencia o la cantidad del 10 producto metabólico de un fármaco, tal que la presencia o la cantidad del marcador son indicativas de la velocidad de ruptura relativa del fármaco in vivo. Los marcadores farmacodinámicos son de uso particular en el aumento de la sensibilidad de detección de los efectos del fármaco, particularmente cuando el fármaco se administra en dosis bajas. Ya que hasta una pequeña cantidad de un fármaco puede ser suficiente para 15 activar múltiples rondas de la transcripción o expresión del marcador (p.ej, un marcador de 2150), el marcador amplificado puede estar en una cantidad que sea más fácilmente detectable que el fármaco por sí mismo. También, el marcador puede ser más fácilmente detectado debido a la naturaleza del marcador por sí mismo; por ejemplo, usando los métodos descritos en este documento, pueden ser empleados 20 anticuerpos anti2150 en un sistema de detección inmunológico para un marcador de la proteína 2150, o pueden usarse sondas radiomarcadas específicas de 2150 para detectar un marcador de mARN de 2150. Además, el uso de un marcador farmacodinámico puede ofrecer la predicción según el mecanismo del riesgo debido al tratamiento farmacéutico más allá de la variedad de observaciones directas posibles.
25 Los ejemplos del uso de marcadores farmacodinámicos en la técnica incluyen: Matsuda et al., documento de EE.UU. Nº. 6.033.862; Hattis et al. (1991) Env. Health Perspect. 90: 229-238; Schentag (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Supl. 3: S21S24; y Nicolau (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56 Supl. 3: S16-S20. Las moléculas 2150 de la invención son también útiles como marcadores
30 farmacogenómicos. Según se usa en este documento, un "marcador farmacogenómico" es un marcador bioquímico diana que guarda correlación con una respuesta farmacéutica clínica específica o susceptibilidad en un sujeto (véase, p.ej, McLeod et al. (1999) Eur. J. Cancer 35:1650-1652). La presencia o la cantidad del marcador farmacogenómico están relacionadas con la respuesta predicha del sujeto
35 frente a un fármaco específico o clase de fármacos antes de la administración del
fármaco. Evaluando la presencia o la cantidad de uno o varios marcadores farmacogenómicos en un sujeto, puede seleccionarse la terapia farmacéutica más apropiada para el sujeto, o que se predice que tiene un mayor grado de éxito. Por ejemplo, según la presencia o la cantidad de ARN, o de proteína (p.ej., la proteína 5 2150 o el ARN) para marcadores de tumores específicos en un sujeto, pueden ser seleccionados un fármaco o el curso del tratamiento que se optimiza para el tratamiento del tumor específico que probablemente está presente en el sujeto. Del mismo modo, la presencia o la ausencia de una mutación de secuencia específica en el ADN de 2150 puede guardar correlación con una respuesta del fármaco de 2150. El
10 uso de marcadores farmacogenómicos permite por lo tanto la aplicación del tratamiento más apropiado para cada sujeto sin necesidad de administrar la terapia.
Composiciones Farmacéuticas El ácido nucleico y los polipéptidos, sus fragmentos, así como los anticuerpos
15 anti2150 (también denominado en este documento "compuesto activo") de la invención pueden ser incorporados en las composiciones farmacéuticas que se definen en las reivindicaciones. Tales composiciones incluyen típicamente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Según se usa en este documento la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye
20 disolventes, medios de dispersión, capas, agentes antibacterianos y antifungosos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y otros por el estilo, compatibles con la administración farmacéutica. También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones. Se formula una composición farmacéutica que sea compatible con su ruta
25 pretendida de administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen la administración parenteral, p.ej, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (p.ej, por inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o las suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los componentes siguientes: un diluyente estéril tal como agua para inyección,
30 solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabens; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetracético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio
35 o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases, tales como hidróxido de
sodio o ácido clorhídrico. La preparación parenteral puede introducirse en ampollas, jeringuillas disponibles o viales de dosis múltiples hechos de cristal o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para
5 la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersiones. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen una solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida a un grado que sea inyectable. Debe ser estable en las
10 condiciones de fabricación y almacenaje y debe conservarse frente a la acción de la contaminación de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y otros por el estilo), y sus mezclas adecuadas. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, por
15 el uso de una capa tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede ser conseguida mediante diversos agentes antibacterianos y antifungosos, por ejemplo, parabens, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y otros por el estilo. En muchos casos, será preferible incluir a
20 agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser causada por la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, el monoestearato de aluminio y la gelatina. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto
25 activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes enumerados antes, como se requiera, seguido de la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de polvos
30 estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier otro ingrediente deseado de su solución previamente filtrada en estéril. Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un
35 vehículo comestible. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo
puede ser incorporado con excipientes y ser usado en forma de comprimidos, pastillas,
o cápsulas, p.ej, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal. Pueden incluirse como parte de la composición sustancias espesantes farmacéuticamente 5 compatibles, y/o materiales adyuvantes. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y otros por el estilo pueden contener cualquiera de los ingredientes siguientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglomerante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz;
10 un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como hierbabuena, salicilato de metilo, o edulcorante de naranja. Para la administración por inhalación, se administran los compuestos en la
15 forma de una pulverización de aerosol de un recipiente a presión o dosificador que contiene a un propulsor adecuado, p.ej, un gas tal como el dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucoso o transdérmico. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la 20 formulación agentes penetrantes apropiados para que la barrera sea impregnada. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales de bilis y derivados de ácidos fusídico. La administración transmucosa puede llevarse a cabo por el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los
25 compuestos activos son formulados en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica. Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (p.ej, con bases de supositorio convencionales tales como la mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.
30 En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra una eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantaciones y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etileno-vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico,
35 colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales
formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposómicas (incluyendo los liposomas reconocidos en células infectadas con anticuerpos monoclónicos frente a antígenos virales) también pueden
5 usarse como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse según los métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. Nº. 4.522.811.
Es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en la forma de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma de
10 dosis unitaria así usada en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que se trata; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado conjuntamente con el vehículo farmacéutico requerido. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse
15 por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales de laboratorio, p.ej, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La proporción de la dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresado como la proporción de lD50/ED50. Se prefieren los compuestos que
20 muestran índices terapéuticos altos. Mientras que pueden usarse compuestos que muestren efectos secundarios tóxicos, debería ponerse cuidado en diseñar un sistema de administración que reconozca tales compuestos en el sitio del tejido afectado a fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, así, reducir los efectos secundarios.
25 Pueden usarse los datos obtenidos de los ensayos del cultivo celular y los estudios en animales en la formulación de una variedad de dosis para su uso en seres humanos. La dosis de tales compuestos está preferiblemente dentro de una variedad de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de esta variedad según la forma de la dosis empleada y la
30 ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de los ensayos del cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para conseguir una variedad de concentraciones en el plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición
35 medio máxima de síntomas) como se determina en el cultivo celular. Tal información puede usarse más exactamente para determinar las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma pueden ser medidos, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
Como se define en este documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de
5 proteína o polipéptido (es decir, una dosis eficaz) está en el intervalo de aproximadamente de 0,001 a 30 mg./kilogramos de peso corporal, preferiblemente aproximadamente de 0,01 a 25 mg./kilogramos de peso corporal, más preferiblemente aproximadamente de 0,1 a 20 mg./kilogramos de peso corporal, y aún más preferiblemente aproximadamente de 1 a 10 mg./kilogramos de peso corporal, de 2 a 9
10 mg./kilogramos, de 3 a 8 mg./kilogramos, de 4 a 7 mg./kilogramos, o de 5 a 6 mg./kilogramos de peso corporal. La proteína o el polipéptido pueden ser administrados una vez por semana durante aproximadamente entre 1 a 10 semanas, preferiblemente entre 2 a 8 semanas, más preferiblemente entre aproximadamente 3 a 7 semanas, y aún más preferiblemente durante aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas. El
15 experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo requerido para tratar con eficacia un sujeto, incluyendo, pero no limitados a la rigurosidad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos anteriores, el estado de salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína,
20 polipéptido o anticuerpo, no conjugado o conjugado como se describe en este documento, puede incluir un tratamiento solo o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.
Para los anticuerpos, la dosis preferida es de 0,1 mg./kilogramos de peso corporal (generalmente de 10 mg./kilogramo a 20 mg./kilogramo). Si el anticuerpo 25 debe actuar en el cerebro, una dosis de 50 mg./kilogramo a 100 mg./kilogramo es, por lo general, la apropiada. Generalmente, los anticuerpos parcialmente humanos y los anticuerpos totalmente humanos tienen un período de semivida más largo dentro del cuerpo humano que otros anticuerpos. En consecuencia, las dosis inferiores y la administración menos frecuente son, a menudo, posibles. Pueden usarse
30 modificaciones, tales como la lipidación, para estabilizar los anticuerpos y realzar el consumo y la penetración en el tejido (p.ej, en el cerebro). Un método para la lipidación de anticuerpos se describe en Cruikshank et al. ((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193). La presente invención abarca a agentes que modulan la expresión o la
35 actividad. Un agente puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña. Por ejemplo,
tales moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, péptidos, peptidomiméticos (p.ej, peptoides), aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos 5 heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que
10 tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres, y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos. Las dosis ejemplares incluyen cantidades de microgramo o miligramo de la molécula pequeña por kilogramo del sujeto o peso de muestra (p.ej, aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo,
15 aproximadamente 100 microgramos por kilogramo a aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo. Además se sobrentiende que las dosis apropiadas de una molécula pequeña dependen de la potencia de la molécula pequeña con respecto a la expresión o la actividad que se modula. Cuando tienen que administrarse una o
20 varias de estas pequeñas moléculas a un animal (p.ej, un ser humano) a fin de modular la expresión o la actividad de un polipéptido o el ácido nucleico de la invención, un médico, veterinario, o el investigador puede prescribir, por ejemplo, una dosis relativamente baja al principio, aumentando posteriormente la dosis hasta que sea obtenida una respuesta apropiada. Además, se sobrentiende que el nivel de la
25 dosis específica para cualquier sujeto animal particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso del cuerpo, el estado de salud general, el género y la dieta del sujeto, el tiempo de administración, la ruta de administración, la velocidad de excreción, cualquier combinación de fármacos y el grado de expresión o actividad que se modula.
30 Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser insertadas en vectores y ser usadas como vectores en terapia génica. Los vectores en terapia génica pueden ser administrados a un sujeto, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local (véase la patente de Estados Unidos Nº. 5.328.470) o por la inyección estereostática (véase p.ej, Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
35 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector en la terapia génica puede incluir el vector de la terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual se incrusta el vehículo de administración de los genes. O bien, cuando el vector de administración de genes completo puede producirse intacto de las células recombinantes, p.ej, vectores retrovirales, la
5 preparación farmacéutica puede incluir una o varias células que producen el sistema de administración de genes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar incluidas en un recipiente, paquete, o dosificador junto con las instrucciones para su administración.
10 Métodos de Tratamiento: La presente invención proporciona tanto métodos profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en peligro de padecer (o susceptible) un trastorno
o trastorno asociado a la expresión o actividad aberrante de 2150 o no deseada, en el que el trastorno es del sistema respiratorio. Como se usa en este documento, el 15 término "tratamiento" se define como la aplicación o la administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el objetivo de curar, calmar, aliviar, aplacar, cambiar, remediar, mejorar, reparar o afectar la enfermedad,
20 los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad. Un agente terapéutico incluye, pero no está limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos antisentido.
Con respecto a los métodos profilácticos y terapéuticos del tratamiento, tales tratamientos pueden ser expresamente adaptados o modificados, según el 25 conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. La "farmacogenómica", según se usa en este documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas como la secuenciación de genes, la genética estadística y el análisis de expresión de genes en fármacos en el desarrollo clínico y en el mercado. Más expresamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su 30 respuesta frente a un fármaco (p.ej, un "fenotipo de respuesta de fármaco" de un paciente, o "genotipo de respuesta de fármaco".) Así, otro aspecto de la invención proporciona métodos para adaptar el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo con las moléculas 2150 de la presente invención o con los moduladores 2150 según el genotipo de la respuesta del fármaco de aquel individuo. La
35 farmacogenómica permite a un médico reconocer los tratamientos profilácticos o
terapéuticos en los pacientes que más se beneficiarán del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con el fármaco.
En un aspecto, la invención proporciona un método para impedir en un sujeto
5 una enfermedad o condición asociada con una expresión o actividad aberrante de 2150 o no deseada, administrando al sujeto un 2150 o un agente que module la expresión de 2150 o al menos la actividad de 2150. Los sujetos en peligro de padecer una enfermedad que está causada o contribuida por la expresión o actividad aberrante de 2150 o no deseada pueden ser identificados, por ejemplo, por algún ensayo o una
10 combinación diagnóstica o pronóstica como se describe en este documento. La administración de un agente profiláctico puede hacerse antes de la manifestación de la característica de los síntomas del 2150 pendiente, tal que una enfermedad o el trastorno son prevenidos o, de otra forma, retrasados en su progresión. Según el tipo de 2150 pendiente, por ejemplo, puede usarse para tratar el sujeto un 2150, agonista
15 de 2150 o agente antagonista de 2150. El agente apropiado puede ser determinado según el cribado de los ensayos descritos en este documento. Es posible que aproximadamente algunos trastornos asociados a 2150 puedan estar causados, al menos en parte, por un nivel anormal del producto génico, o por la presencia de un producto génico que muestre una actividad anormal. Como tal, la
20 reducción del nivel y/o la actividad de tales productos génicos causarían la mejora de los síntomas del trastorno. Las moléculas 2150 pueden actuar como nuevas dianas diagnósticas y agentes terapéuticos para controlar uno o varios trastornos respiratorios, y trastornos asociados con el pulmón, trastornos proliferativos y/o diferenciativos celulares y los
25 trastornos inmunes descritos anteriormente, p.ej, inflamatorios. Como se ha mencionado, el tratamiento con éxito de los trastornos asociados a 2150 puede realizarse por técnicas que sirven para inhibir la expresión o la actividad de los productos génicos diana. Por ejemplo, pueden usarse compuestos, p.ej, un agente identificado usando algunos ensayos descritos antes, que resultan de exhibir
30 una actividad moduladora negativa, de acuerdo con la invención para prevenir y/o mejorar los síntomas de los trastornos asociados a 2150. Tales moléculas pueden incluir, pero no están limitadas a péptidos, fosfopéptidos, moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas, o anticuerpos (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos policlónicos, monoclónicos, humanizados, humanos, anti-idiotípicos, de cadena
quimérica o simples, y Fab, F(ab’)2 y fragmentos de la genoteca de expresión de Fab, moléculas scFV, y sus fragmentos de unión al epítopo). Además, también pueden usarse moléculas antisentido y de ribozima que inhiban la expresión del gen diana de acuerdo con la invención para reducir el nivel de
5 expresión de los genes diana, reduciendo así con eficacia el nivel de actividad de los genes diana. Incluso además, pueden utilizarse moléculas de triple hélice en la reducción del nivel de actividad de los genes diana. Se han mencionado anteriormente las moléculas antisentido, de ribozima y de triple hélice.
Es posible que el uso de moléculas antisentido, ribozimas y/o de triples hélices
10 para reducir o inhibir la expresión del gen mutante también pueda reducir o inhibir la transcripción (triple hélice) y/o la traducción (antisentido, ribozima) del mARN producido por alelos de genes diana normales, tal que la concentración del producto génico presente diana normal puede ser inferior lo que es necesario para un fenotipo normal. En tales casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican y expresan los
15 polipéptidos de los genes diana que muestran la actividad de los genes diana normal pueden ser introducidas en células por medio del método de la terapia génica. O bien, en los casos en los que el gen diana codifique una proteína extracelular, puede ser preferible co-administrar la proteína de los genes diana normal en la célula o tejido a fin de mantener el nivel necesario de actividad génica diana celular o tisular.
20 Otro método por el cual las moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse en el tratamiento o prevención de una enfermedad caracterizada por la expresión de 2150 es por el uso de moléculas de aptámeros específicos para la proteína 2150. Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico que tienen una estructura terciaria que les permite unirse expresamente o selectivamente a los ligandos de la proteína (véase,
25 p.ej, Osborne et al. (1997) Curr. Opin. Chem Biol. 1: 5-9; y Patel (1997) Curr Opin Chem Biol 1:32-46). Ya que las moléculas de ácido nucleico pueden ser introducidas más cómodamente, en muchos casos, en células diana que lo puedan ser las moléculas proteínas terapéuticas, los aptámeros ofrecen un método por el cual la actividad proteica de 2150 puede ser expresamente disminuida sin la introducción de
30 fármacos u otras moléculas que puedan tener efectos pluripotentes. Pueden generarse anticuerpos que sean tanto específicos para el producto génico diana como reductores de la actividad del producto génico diana. Tales anticuerpos pueden, por lo tanto, administrarse en los casos por los cual las técnicas moduladoras negativas son apropiadas para el tratamiento de trastornos asociados a
2150. Para una descripción de los anticuerpos, véase la sección de Anticuerpos anterior. En las circunstancias en las que la inyección de un animal o un sujeto humano con una proteína 2150 o epítopo para estimular la producción de anticuerpos sea
5 dañina para el sujeto, es posible generar una respuesta inmune contra 2150 por el uso de anticuerpos anti-idiotípicos (véase, por ejemplo, Herlyn (1999) Ann Med 31:66-78; y Bhattacharya-Chatterjee y Foon (1998) Cancer Treat Res. 94:51-68). Si un anticuerpo anti-idiotípico se introduce en un mamífero o sujeto humano, debería estimular la producción de anticuerpos anti-anti-idiotípicos, que deben ser específicos frente a la
10 proteína 2150. Pueden generarse de esta manera las vacunas dirigidas a una enfermedad caracterizada por la expresión de 2150 también. En los casos en los que el antígeno diana sea intracelular y se usen anticuerpos enteros, puede preferirse interiorizar a los anticuerpos. La lipofectina o los liposomas pueden usarse para administrar el anticuerpo o un fragmento de la región
15 Fab que se una al antígeno diana en células. Cuando se usan fragmentos del anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibitorio más pequeño que se une al antígeno diana. Por ejemplo, pueden usarse péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos correspondiente a la región Fv del anticuerpo. O bien, también puede administrarse la cadena sencilla que neutraliza a los anticuerpos que se unen a los antígenos diana
20 intracelulares. Tales anticuerpos de cadena sencilla pueden administrarse, por ejemplo, expresando secuencias de nucleótidos que codifiquen anticuerpos de cadena sencilla dentro de la población celular diana (véase, p.ej, Marasco et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893). Los compuestos identificados que inhiben la expresión, la síntesis y/o la
25 actividad de los genes diana pueden administrarse a un paciente en dosis terapéuticamente eficaces para prevenir, tratar o mejorar los trastornos asociados a 2150. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a aquella cantidad del compuesto suficiente para causar la mejora de los síntomas de los trastornos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse por procedimientos
30 farmacéuticos estándares como se describe antes. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y los estudios en animales pueden usarse en la formulación de una variedad de dosis para su uso en seres humanos. La dosis de tales compuestos está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna
35 toxicidad. La dosis puede estar dentro del intervalo de esta variedad según la forma de
dosis empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada al principio de los ensayos de cultivos celulares. Una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir una variedad de concentraciones en el plasma circulante que
5 incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que consigue una inhibición medio máxima de los síntomas) como se determina en cultivos celulares. Tal información puede usarse más exactamente para determinar las dosis útiles en seres humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
10 Otro ejemplo de la determinación de la dosis eficaz para un individuo es la capacidad de analizar directamente los niveles de compuesto "libre" y "unido" en el suero del sujeto de ensayo. Tales ensayos pueden utilizar agentes miméticos del anticuerpo y/o "biosensores" que han sido creados por técnicas de impresión molecular. El compuesto que es capaz de modular la actividad de 2150 se usa como
15 plantilla, o "impresión de la molécula", para organizar espacialmente los monómeros polimerizables antes de su polimerización con los reactivos catalíticos. La eliminación posterior de la molécula impresa deja una matriz polimérica que contiene una "imagen negativa" repetida del compuesto y que es capaz de unirse de nuevo selectivamente a la molécula en condiciones de ensayo biológicas. Una revisión detallada de esta
20 técnica puede ser apreciada en Ansell et al. (1996) Current Opinion in Biotechnology 7:89-94 y en Shea (1994) Trends in Polymer Science 2:166-173. Tales matrices de afinidad "impresas" son susceptibles en los ensayos de unión de ligando, por lo cual el componente de anticuerpo monoclónico inmovilizado es sustituido por una matriz apropiadamente impresa. Un ejemplo del uso de tales matrices de esta forma puede
25 apreciarse en Vlatakis et al. (1993) Nature 361:645-647. Por el uso del marcaje del isótopo, puede controlarse fácilmente la concentración "libre" del compuesto que modula la expresión o actividad de 2150 y usarse en los cálculos de la IC50. Tales matrices de afinidad "impresas" también pueden ser diseñadas para incluir grupos fluorescentes cuyas propiedades de emisión de fotones cambian
30 mensurablemente bajo la unión local y selectiva del compuesto diana. Estos cambios pueden ser fácilmente analizados usando los dispositivos de fibra óptica a tiempo real apropiados, permitiendo por su parte optimizar rápidamente la dosis en un sujeto de ensayo según su IC50 individual. Se menciona un ejemplo rudimentario de tal "biosensor" en Kriz et al. (1995) Analytical Chemistry 67:2142-2144.
Otro aspecto de la invención pertenece a métodos para modular la expresión o actividad de 2150 con fines terapéuticos. En consecuencia, en una realización ejemplar, el método modulador de la invención implica poner en contacto una célula con un 2150 o un agente que module una o varias de las actividades de la actividad de
5 la proteína 2150 asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína 2150 puede ser un agente como el que se describe en este documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, una molécula diana natural de una proteína 2150 (p.ej, un sustrato de 2150 o receptor), un anticuerpo de 2150, un agonista de 2150 o antagonista, un peptidomimético de un agonista de 2150 o antagonista, u otra
10 molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o varias actividades de 2150. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la proteína 2150 activa y una molécula de ácido nucleico que codifica 2150. En otra realización, el agente inhibe una
o varias de las actividades de 2150. Los ejemplos de tales agentes inhibitorios
15 incluyen las moléculas 2150 antisentido de ácido nucleico, anticuerpos anti2150 e inhibidores de 2150. Estos métodos moduladores pueden realizarse in vitro (p.ej, cultivando la célula con el agente) o, de forma alternativa, in vivo (p.ej, administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo aquejado con una enfermedad o trastorno caracterizado por la
20 expresión o actividad aberrante o no deseada de una proteína 2150 o molécula de ácido nucleico. En una realización, el método implica administrar a un agente (p.ej, un agente identificado por un ensayo de cribado descrito en este documento), o la combinación de agentes que modula (p.ej., sobrerregula o desregula) la expresión o actividad de 2150. En otra realización, el método implica administrar una proteína 2150
25 o molécula de ácido nucleico como terapia para compensar la menor expresión o actividad aberrante, o no deseada, de 2150. La estimulación de la actividad de 2150 es deseable en situaciones en las cuales 2150 se desregula anormalmente y/o en que la mayor actividad de 2150 probablemente tendrá un efecto beneficioso. Por ejemplo, la estimulación de la
30 actividad de 2150 es deseable en situaciones en las cuales 2150 se desregula y/o en que la mayor actividad de 2150 probablemente tendrá un efecto beneficioso. Igualmente, la inhibición de la actividad de 2150 es deseable en situaciones en las cuales 2150 se sobrerregula anormalmente y/o en el que la menor actividad de 2150 probablemente tendrá un efecto beneficioso.
Esta invención se ilustra más adelante mediante los ejemplos siguientes, que no deberían interpretarse como limitación.
5 EJEMPLOS Análisis de Expresión de Genes
Se preparó el ARN total a partir de varios tejidos humanos por un método de extracción de una sola etapa usando el ARN STAT-60 según las instrucciones del fabricante (TelTest, Inc). Cada preparación de ARN fue tratada con DNasa I (Ambion)
10 a 37°C durante 1 hora. El tratamiento con ADNsa I se determinó completo si la muestra requería al menos 38 ciclos de amplificación PCR para alcanzar un nivel umbral de fluorescencia usando la �-2 microglobulina como referencia de amplicón interna. La integridad de las muestras de ARN después del tratamiento con DNasa fue confirmada por electroforesis de gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio.
15 Después de la extracción de fenol, se preparó el cADN a partir de la muestra usando el Sistema de Selección SUPERSCRIPT™ siguiendo las instrucciones del fabricante (GibcoBRL). Un control negativo del ARN sin transcriptasa inversa fue sometido a una falsa reacción de transcriptasa inversa para cada muestra de ARN.
La expresión de 2150 humano fue medida por PCR cuantitativa TaqMan ® 20 (Perkin Elmer Applied Biosystems) en cADN preparado a partir de una variedad de tejidos humanos o líneas celulares normales y afectados (p.ej, canceroso).
Las sondas fueron diseñadas con el software PrimerExpress (PE Biosystems) según la secuencia del gen de 2150 humano. Cada sonda del gen de 2150 humano fue marcada usando FAM (6-carboxifluoresceína), y la sonda de referencia �-2
25 microglobulina fue marcada con un tinte fluorescente diferente, VIC. El marcaje diferencial del gen diana y de los genes de referencia e internos permitió así la medida en el mismo pocillo. Fueron añadidos los cebadores directos e inversos y las sondas tanto para �-2 microglobulina como para el gen diana a la Mezcla Maestra PCR Universal TaqMan ® (PE Applied Biosystems). Aunque la concentración final de
30 cebador y sonda pudiera variar, cada uno era consistente internamente dentro de un experimento dado. Un experimento típico contenía 200 nM de cebadores directos e inversos más 100 nM de sonda para la �-2 microglobulina y 600 nM de cebadores directos e inversos más sonda a 200 nM para el gen diana. Fueron realizados experimentos de matriz TaqMan en un Sistema de Detección de Secuencia PRISMA
35 ABI 7700 (PE Applied Biosystems). Las condiciones del ciclador térmico fueron como sigue: constante durante 2 minutos a 50°C y 10 minutos a 95°C, seguido de PCR de dos pasos para 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos seguido de 60°C durante 1 minuto.
El método siguiente fue usado para calcular cuantitativamente la expresión de
5 genes de 2150 humano en los diversos tejidos con relación a la expresión de la �-2 microglobulina en el mismo tejido. El valor del ciclo umbral (Ct) es definido como el ciclo en el cual un aumento estadísticamente significativo de la fluorescencia es detectado. Un valor de Ct inferior es indicativo de una concentración de mARN más alta. El valor de Ct del gen de 2150 humano se normaliza restando el valor de Ct del
10 gen de �-2 microglobulina para obtener un valor de �Ct usando la fórmula siguiente: �Ct=Cthuman 2150 -Ct �-2 microglobulina. La expresión se calibrada entonces contra una muestra de cADN mostrando un nivel comparativamente bajo de la expresión del gen de 2150 humano. El valor de �Ct para la muestra del calibrador se resta entonces de �Ct para cada muestra de tejido según la fórmula siguiente: ��Ct=�Ct-muestra -�Ct
15 calibrador. La expresión relativa se calcula entonces usando la fórmula aritmética dada por 2-��Ct . La expresión del gen de 2150 humano diana en cada uno de los tejidos probados se representa gráficamente entonces como se dice más detalladamente más abajo.
Los resultados indican una expresión significativa de 2150 en la amígdala, 20 células hematopoyéticas, mastocitos, linfocitos T y células B. La molécula 2150 se expresa a niveles altos en la amígdala comparado con NTC. La molécula 2150 se expresa a niveles bajos en el resto de linfocitos T CD4 (+). La molécula 2150 se expresa a niveles altos en las células CD4 (+) siguientes:
25 estimulación �CD3 durante cuatro horas; estimulación �CD3/ �CD8 durante cuatro horas. Los niveles medios de 2150 son expresados en células CD4 (+) después de la estimulación con �CD3 durante dos horas, y la estimulación de �CD3/ �CD28 durante 24 horas. La molécula 2150 se expresa a niveles bajos en el resto de linfocitos T CD8
30 (+). La molécula 2150 se expresa a niveles alto en lo siguiente: estimulación IFNΔ durante veinticuatro horas; los niveles medios de 2150 son expresados en células CD8 (+) después de la estimulación con �CD3 durante cuatro horas, y veinticuatro horas; después de la estimulación con �CD3/ �CD28 durante cuatro horas. La molécula 2150 se expresa a niveles bajos en el resto de mastocitos. La
35 molécula 2159 se expresa a niveles medios en lo siguiente: estimulación de IFNg durante cuatro horas, y veinticuatro horas; los niveles medios de 2150 son expresados en mastocitos después de la estimulación de IFNΔ durante cuatro horas, y veinticuatro horas.
LISTA DE SECUENCIAS
5
<110> Meyers, Rachel E., Lora, Jose M. <120> 2150, Miembro de la Familia de Proteína Quinasa Humana y Sus Usos
10
<130> MPI2001-137 <150> 60/301,702
<151> 2001-06-28
15
<160> 7
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
20
<210> 1 <211> 1691 <212> ADN <213> Homo sapiens
25
<220> <221> CDS <222> (256)...(1188)
<400> 1
imagen1
imagen1
<210> 2
<211> 311
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
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<210> 3
<211> 933
<212> ADN
<213> Homo sapiens
5
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(933)
10 <400> 3
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imagen1
<210> 4
<211>
278 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Consenso
<400> 4
<210> 5
<211>
25 5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Consenso
<400> 5
<210> 6
<211>
13 5 <212> FRT
10 10
imagen1
imagen1
<213> Secuencia Artificial
<220>
<221> VARIANTE 10 <222> (1) ... (1)
<223>
Xaa en posición 1 puede ser L o I o V o M o F o Y o C
<223>
Xaa en posición 2 puede ser cualquier aminoácido.
15 <223> Xaa en posición 4 puede ser cualquier aminoácido.
<221> VARIANTE
<222> (6) ... (6)
<223> El aminoácido en posición 6 puede ser L o IV o M o F o Y
20
<223>
Xaa en posición 8 puede ser cualquier aminoácido.
<223>
Xaa en posición 9 puede ser cualquier aminoácido.
25 <221> VARIANTE
<222> (11)...(13)
<223> Xaa en las posiciones 11, 12 y 13 puede ser I o V o M o F o Y o C o T
<400> 6
imagen2
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial
5 <220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa en posición 1 puede ser L, I o V
10 <221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa en posición 3 puede ser A, E, Q, D, N, L, G, K, S, V, R, T, I, M, F, Y, C, W,
o H.
15 <221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223>
Xaa en posición 5 puede ser A, E, Q, D, N, L, G, K, S, V, R, T, I, M, F, Y, C, W o
H.
20 <221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa en posición 6 puede ser F, Y, W, M, G, S, T, N o H.
<221> VARIANTE 25 <222> (7)...(7)
<223> Xaa en posición 7 puede ser S, G o A.
<221> VARIANTE
<222>
(8) ... (8) 30 <223> Xaa en posición 8 puede ser A, E, Q, N, L, G, K, S, V, R, T, I, M, F, Y, C, D o H.
<221> VARIANTE
<222> (9)...(9)
<223> Xaa en posición 9 puede ser L o I o V o C o A o T
<221> VARIANTE
<222> (10)...(10)
<223>
Xaa en posición 10 puede ser A, E, Q, N, L, G, K, S, V, R, T, I, M, F, Y, C, W o
H.
<223>
Xaa en posición 11 puede ser cualquier aminoácido
<221> VARIANTE
<222>
(12)...(12) 10 <223> Xaa en posición 12 puede ser G, S, T, A, C, L, I, V, M, F o Y.
<223> Xaa desde las posiciones 13 a 20 puede ser cualquier aminoácido.
<221> VARIANTE
<222>
(21)...(21) 15 <223> Xaa en posición 21 puede ser L, I, V, M, F, Y, W, C, S, T, A o R.
35 5
<221> VARIANTE
<222> (22)...(22)
<223> Xaa en posición 22 puede ser A, I, V o P.
20
<221> VARIANTE
<222> (23)...(23)
<223> Xaa en posición 23 puede ser L, I, V, M, F, A, G, C, K o R.
25 <400> 5
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Claims (11)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio que comprende analizar la capacidad del compuesto o agente para
    5 modular la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3;
    10 b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que
    15 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en la que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; y e) una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 ó 3,
    o la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
    20
    a) un polipéptido que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o su complemento;
    25 b) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en el que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; y c) un polipéptido de SEQ ID NO:2,
    30 identificando así un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio.
  2. 2. Un método para identificar un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio que comprende: a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 30 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1 ó 3; y b) detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra que se
    5 hibrida a la sonda;
    en la que la presencia de una molécula de ácido nucleico que se hibrida a la sonda identifica a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio.
    10
  3. 3. Un método para identificar a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio que comprende:
    a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto que comprende moléculas de
    15 ácido nucleico con un primer y un segundo cebador de amplificación, comprendiendo el primer cebador al menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:1 ó 3 y comprendiendo el segundo cebador al menos 10 nucleótidos contiguos del complemento de SEQ ID NO:1 ó 3; y b) incubar la muestra en condiciones que permitan la amplificación del ácido nucleico;
    20 en el que la presencia de la amplificación de ácido nucleico en la muestra identifica a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio.
  4. 4. Un método para identificar a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o 25 que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio que comprende:
    a) poner en contacto una muestra obtenida del sujeto que comprende polipéptidos con un anticuerpo que se une expresamente a un polipéptido de SEQ ID NO:2; y b) detectar la presencia de un polipéptido en la muestra que se une al anticuerpo;
    30
    en el que la presencia de la unión del anticuerpo en la muestra identifica a un sujeto que tiene un trastorno respiratorio o que está en peligro de desarrollar un trastorno respiratorio.
    35 5. Un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho trastorno respiratorio es el asma.
  5. 6. El uso de un modulador seleccionado del grupo que consiste en:
    a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, o su
    5 fragmento; b) un anticuerpo que modula la actividad del polipéptido de SEQ ID NO:2; y c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2,
    10 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno respiratorio.
  6. 7. El uso de un modulador seleccionado del grupo que consiste en:
    a) una molécula de ácido nucleico antisentido que modula la expresión de una
    15 molécula de ácido nucleico de comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3; b) es un ribozima que modula la expresión de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 ó 3;
    20 c) la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 ó 3, o su fragmento; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2,
    25 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno respiratorio.
  7. 8. El uso de la reivindicación 6 ó 7, en el que dicho modulador se administra en una formulación farmacéuticamente aceptable.
    30 9. El uso de la reivindicación 7, en el que dicho modulador se administra usando un vector de terapia génica.
  8. 10.
    El uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que dicho trastorno respiratorio es el asma.
  9. 11.
    Una composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de un trastorno respiratorio en un sujeto, que comprende un compuesto que modula la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:
    35
    5 a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3; b) una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 300 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3;
    10 c) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2; d) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en la que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:2; y
    15 e) una molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 ó 3,
    o la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
    d) un polipéptido que es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende
    20 una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70 % idéntica a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o su complemento; e) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en el que el fragmento comprende al menos 100 aminoácidos contiguos
    25 de SEQ ID NO:2; y f) un polipéptido de SEQ ID NO:2,
    y un vehículo adecuado.
    30 12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que dicho trastorno respiratorio es el asma.
  10. 13.
    Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio según la reivindicación 1, en el que dicho método es un ensayo celular.
  11. 14.
    Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio según la reivindicación 1, en el que dicho método es un ensayo de células libres.
    35
    5 15. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 %, 90 % o 95 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
    10 16. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno respiratorio según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido es codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80 %, 90 % o el 95 % idéntica a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, o su complemento.
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