ES2350461T3

ES2350461T3 - Péptidos asociados a tumor unidos a moléculas mhc.

Info

Publication number: ES2350461T3
Application number: ES08014304T
Authority: ES
Inventors: Stefan Stevanovic; Hans-Georg Rammensee; Toni Weinschenk
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2011-01-24
Anticipated expiration: 2023-03-27
Also published as: ATE417859T1; JP5042300B2; US7666984B2; EP1507795B1; CA2487137C; PT2014673E; CA2487137A1; US20050222390A1; EP1734048A1; DE50313004D1; ES2317379T3; PL206306B1; HRP20041108A2; JP5042301B2; AU2010200689A1; CY1108680T1; PL211157B1; AU2010200689B2; HRP20041108B1; CY1108507T1

Abstract

Un péptido asociado a tumor con la secuencia de aminoácidos SVFAGVVGV (SEQ ID n.º 75), en donde el péptido tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.

Description

La presente invención se refiere a péptidos asociados a tumor con la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.

Los péptidos de este tipo son utilizados, por ejemplo, en la inmunoterapia de las enfermedades tumorales.

La identificación de antígenos asociados a tumores (TAA) mediante componentes del sistema inmune desempeña un papel fundamental en la destrucción de células tumorales por parte del sistema inmune. Este mecanismo se basa en la condición de que entre las células tumorales y las células normales existen diferencias cualitativas o cuantitativas. Para desencadenar una respuesta antitumoral, las células tumorales deben expresar a los antígenos, lo cual provoca una respuesta inmunológica suficiente para la destrucción del tumor.

Los linfocitos T citotóxicos que expresan la molécula CD8 (en adelante, CTL) tienen un papel importante en el rechazo a tumores. Para que se desencadene una reacción inmune de este tipo a través de los linfocitos T citotóxicos, deben presentarse proteínas o péptidos foráneos ante los linfocitos T. Los linfocitos T sólo reconocen a los antígenos como fragmentos de péptidos cuando éstos son presentados por moléculas MHC en la superficie de la célula. Estas moléculas MHC (Major Histocompatibility Complex) son receptoras de péptidos que, normalmente, los unen dentro de la célula para transportarlos a la superficie de la célula. Este complejo formado por péptidos y moléculas MHC es reconocido por los linfocitos T. Las moléculas MHC del ser humano también se conocen como «antígenos de leucocito humano» (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: Las moléculas MHC de clase I, que aparecen en la mayoría de células con núcleo, presentan

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péptidos producidos por degradación proteolítica de proteínas endógenas. Las moléculas MHC de clase II sólo aparecen en células especializadas presentadoras de antígenos (APC) y presentan péptidos de proteínas exógenas que, en el transcurso de la endocitosis, son absorbidos y transformados por las APC. Los complejos formados por péptido y MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T CD8+ citotóxicos; los complejos formados por péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4.

Para que un péptido pueda desencadenar una respuesta celular inmune, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos unidos a moléculas MHC de clase I suelen tener de 8 a 10 residuos y contienen en su secuencia dos residuos conservados (Anchor), que interactúan con el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.

Para que el sistema inmune pueda desencadenar una respuesta efectiva de CTL contra los péptidos derivados de tumor, es necesario que dichos péptidos, además de poder unirse a las moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también sean reconocidos por linfocitos T con receptores específicos de linfocitos T (TCR, T-cell receptor).

El objetivo principal para el desarrollo de una vacuna antitumoral es la identificación y caracterización de antígenos asociados a tumores que son reconocidos por CTL CD8+.

Los antígenos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos específicos de tumores o sus epítopos pueden ser moléculas de cualquier clase de proteína como, por ejemplo, encimas, receptores, factores de transcripción, etc. Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras

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específicas: de tejidos como, por ejemplo, los antígenos CT

(cancer: testis), expresados en distintos tipos de tumor y en

tejido sano de los testículos.

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos de tumores y, por lo tanto, puedan ser aplicadas como tratamiento, deben cumplirse determinadas condiciones: el antígeno debe estar expresado fundamentalmente por células tumorales, no por tejido normal o, si éste lo expresa, debe ser en cantidades inferiores a las de los tumores. En caso de que el antígeno en cuestión no sólo se exprese en un tipo de tumor, sino en varios, también es deseable que lo haga en concentraciones altas. También es esencial la presencia de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno, ya que dichos péptidos derivados de un antígeno asociado a un tumor («péptidos inmunógenos») desencadenan una respuesta de linfocitos T, ya sea in vitro o in vivo.

Los antígenos asociados a tumores (TAA) representan, por tanto, el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los métodos para la identificación y caracterización de los TAA se basan en la acción de los CTL ya inducidos en el paciente o en la creación de perfiles de transcripción diferenciados entre tumores y tejidos normales.

El hallazgo de genes sobreexpresados en tejidos tumorales o expresados de manera selectiva en dichos tejidos no proporciona, sin embargo, información precisa sobre la acción de los antígenos transcritos por estos genes en la inmunoterapia. La causa de ello es que sólo los péptidos aislados de estos antígenos son aptos para una acción de ese tipo, ya que sólo los epítopos de los antígenos –no todo el antígeno– son capaces de provocar una respuesta de linfocitos T mediante la presentación de MHC. Por eso es importante seleccionar péptidos de proteínas sobreexpresadas o expresadas de manera selectiva, presentados

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con moléculas MHC y así obtener blancos para el reconocimiento específico de tumores mediante linfocitos T citotóxicos.

Ante estos antecedentes, el objetivo de la presente invención es facilitar al menos una nueva secuencia de aminoácidos para un péptido con la capacidad de unirse a una molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.

Este objetivo se alcanza, conforme a la presente invención, mediante la preparación de un péptido asociado a tumor con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo compuesto por las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 79 de la lista adjunta de secuencias, en donde el péptido tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.

De esta forma, se alcanza el objetivo que sirve de base para la presente invención.

Con ello se entiende que los péptidos identificados por el tumor son sintetizados para obtener mayores cantidades y para su aplicación para los fines descritos más abajo o transportados en células para su expresión.

Los inventores pudieron aislar e identificar los péptidos mencionados como ligandos específicos de moléculas MHC de clase I a partir de tejido tumoral. Se denominan péptidos «asociados a tumores» a aquellos aislados e identificados a partir de material tumoral. Estos péptidos, que son presentados en tumores auténticos (primarios) están sujetos al procesamiento de antígenos en una célula tumoral.

Los ligandos específicos se pueden aplicar en la terapia contra el cáncer; por ejemplo, para inducir una respuesta inmune contra

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células tumorales que expresan los antígenos de los que proceden los péptidos.

Dicha respuesta inmune en forma de una inducción de CTL se puede obtener in vivo. Para ello, se administra el péptido por ejemplo en forma de composición farmacéutica a un paciente con una enfermedad tumoral asociada a TAA.

Por otro lado, también se puede desencadenar una respuesta CTL ex vivo en un tumor que expresa los antígenos de los que proceden los péptidos. Para ello, se incuban las células precursoras de CTL junto con células presentadoras de antígenos y los péptidos. Finalmente, se cultivan los CTL así estimulados y se administran al paciente estos CTL activados.

También existe la posibilidad de cargar ex vivo las APC con los péptidos y administrar al paciente estas APC cargadas. El antígeno se expresa en el tejido tumoral del que procede el péptido. Las APC pueden entonces presentar a los CTL el péptido y activarlos.

Los péptidos conforme a la invención también pueden ser aplicados como reactivos diagnósticos.

De esta forma, con los péptidos se puede saber si en una población de CTL existen CTL dirigidos específicamente contra un péptido o si fueron inducidos por terapia.

Además, con los péptidos también se puede comprobar el aumento de linfocitos T precursores que muestran una reactividad contra el péptido definido.

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Además, el péptido puede ser utilizado como marcador para seguir el desarrollo de un tumor que expresa el antígeno des que procede el péptido.

En la tabla 1 adjunta se presentan los péptidos identificados. Aparecen clasificados según el tipo de HLA al que se unen. En la tabla también se dan las proteínas de las que proviene el péptido y la posición correspondiente del péptido en la proteína. Se mantienen los nombres en inglés de las proteínas, con el fin de evitar traducciones confusas. También se dan los números de registro de la base de datos Genbank del National Center for Biotechnology Information del Instituto Nacional de Salud (véase http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov).

Los inventores pudieron aislar los péptidos (o ligandos) de tumores de células renales de dos pacientes, RCC01 y RCC13. Se aislaron 68 ligandos del tejido tumoral del paciente RCC01 y 13 ligandos del tejido tumoral del paciente RCC13. Dos de los ligandos identificados en ambos pacientes eran idénticos. Éstos eran los péptidos con SEQ ID n.º 1 y 3 (YVDPVITSI del protooncogén met [C-Met] y ALLNIKVKL de la queratina 18).

Se identificaron 79 ligandos a partir de los tumores de los pacientes, de los cuales 30 estaban unidos a los subtipos de HLA HLA-A*02, 13 a los subtipos HLA-A*68, 34 a los subtipos HLA-B*18

o HLA-B*44 y 2 a los subtipos HLA*24

Todos los ligandos HLA-A*02 presentan el motivo peptídico específico del alelo: (Leucina/valina, isoleucina, alanina o metionina en la posición 2; leucina/valina, isoleucina o alanina en el C-terminal.

Algunos de los ligandos provienen de genes de mantenimiento fuertemente expresados, que en la mayoría de los tejidos son

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expresados de forma regular, aunque muchos se distinguen por su asociación a tumores.

En el caso del péptido con ID de secuencia n.º YVDPVITSI, se trata, por ejemplo, de un ligando relacionado especialmente con tumores y que procede del proto-oncogén met (c-met) (posición 654-662). Los péptidos con ID de secuencia n.º 2, 22 y 23 proceden de la adipofilina (también llamada «proteína relacionada con la diferenciación adiposa») y presentan las posiciones 129-137, 62-71 y 349-358 en esta proteína, en la que las dos últimas figuran entre los péptidos presentados por HLA

A*68.: En el caso del ligando con ID de secuencia n.º 3, se

trata de: un ligando que procede de la queratina 18 y allí se

encuentra localizado en la posición 365-373.

La mayor parte de los ligandos presentan el aminoácido ácido glutamínico (E) en la posición 2, un residuo conservadoaminoácido del subtipo HLA-B*44. Así se pudieron identificar péptidos procedentes de proteínas que ya en anteriores intentos se identificaron como inmunógenos como, por ejemplo, el péptido con ID de secuencia n.º 5, que procede de la proteína anexina II (posición en la anexina II: 55-63). Esta proteína se presenta como inmunógena con respecto a las moléculas MHC de clase II en pacientes con melanoma (véase Heinzel y col,. The self peptide annexin II [208 -223] presented by dendritic cells sentisizes autologous CD4+ T lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001, «Cancer Immunol. Immunother.» 49:671-678).

Además, se pudieron identificar algunos péptidos procedentes de proteínas, sobreexpresadas en tejido tumoral. Así, se pudieron identificar fragmentos de Vimentina (EEIAFLKKL, posición 229237) y Caldesmon (DEAAFLERL, posición 92-100). Young y col. (Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers, 2001, «Am. J. Pathol.», 158:1639-1651) que estas

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proteínas estaban sobreexpresadas en tejidos de células tumorales renales.

Los inventores pudieron además identificar, entre otros, ligandos procedentes de ets-1 (NEFSLKGVDF, posición 86-95), Alfa-Catenina (NEQDLGIQY, posición 169-177) y Galectina 2 (SEVKFTVTF, posición 80-88).

Además, los inventores aislaron el fragmento YYMIGEQKF (ID de secuencia n.º 79), procedente de la enzima Nicotinamida-N- Metiltransferasa (posición 203-211). Takahashi y col. (Gene expression profiling of clear cell renal cell carcinoma: gene identification and prognostic classification, 2001, «Proc. Natl. Acad. Sci.» EUA, 98:9754-9749) demostraron que esta enzima se encontraba sobreexpresada en el tejido tumoral de las células renales.

De forma sorprendente, los inventores pudieron mostrar, para uno de los péptidos identificados, linfocitos T citotóxicos específicos en sangre de donantes. De esta forma se da el potencial para desencadenar una respuesta de CTL específica contra los tumores.

Además, los inventores pudieron mostrar con experimentos propios que, mediante la utilización de dos péptidos modelo seleccionados, era posible generar in vitro linfocitos T citotóxicos específicos para el péptido con SEQ ID n.º 1 (fragmento del proto-oncogén-c-met o del péptido c-met) o específicos para el péptido con SEQ ID n.º 2 (fragmento de adipofilina o péptido de adipofilina). Con estos CTL se pudieron destruir células tumorales diana, las cuales expresaban las proteínas correspondientes y, además, provenían de distintas líneas celulares tumorales de diferentes pacientes. Los inventores pudieron demostrar, además, que los mencionados CTL

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también lisaron, por ejemplo, células dendríticas previamente sensibilizadas (cargadas) con los correspondientes péptidos. Con estos experimentos, los inventores demostraron que, con los péptidos conforme a la presente invención como epítopos, linfocitos T humanos pudieron ser activados in vitro. Por lo tanto, los inventores demostraron que los CTL obtenidos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un paciente y específicos para un péptido determinado, pudieron destruir células del mismo tipo de tumor de otro paciente. Los inventores también demostraron que con estos CTL se pudieron lisar células de otros tipos de tumor.

En una forma de realización preferida, para la estimulación de una respuesta inmune también se pueden utilizar péptidos que presentan la secuencia con ID n.º 1 a 79, y en los que al menos un aminoácido se ha sustituido por otro aminoácido con propiedades químicas similares.

Éstos son, con respecto a los subtipos de MHC correspondientes, los aminoácidos de anclaje, por ejemplo, que se pueden sustituir por aminoácidos con propiedades químicas similares. De esta forma, por ejemplo, en el caso de los péptidos asociados al subtipo MHC HLA-A*02, en la posición 2 se pueden intercambiar la leucina por isoleucina, valina o metionina y al revés, y, en el

extremo: carboxílico, la leucina por valina, isoleucina y

alanina,: todos los cuales presentan cadenas laterales no

polares.

Además es posible utilizar péptidos con ID de secuencia n.º 1 a 79, que presentan al menos otro aminoácido más en los extremos carboxílico y/o amínico, o en los que se ha eliminado al menos un aminoácido.

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Además, se pueden utilizar péptidos con ID de secuencia n.º 1 a 79 en los que al menos un aminoácido se ha modificado químicamente.

El/los aminoácido(s) cambiante(s) se escoge(n) de tal forma que la variación no influye en la inmunogenicidad del péptido, es decir, que presenta una afinidad de unión a la molécula MHC similar y capacidad de estimulación de los linfocitos T.

Conforme a la presente invención, el péptido puede ser utilizado para el tratamiento de enfermedades tumorales y/o enfermedades adenomatosas.

Entre las enfermedades tumorales que se pueden tratar se encuentran los cánceres de riñón, mama, páncreas, estómago, testículo y piel. La enumeración de enfermedades tumorales es sólo un ejemplo, es decir, no limita el campo de aplicación.

Los inventores pudieron demostrar mediante experimentos propios que los péptidos conforme a la invención son adecuados para dicha utilización. Se demostró que CTL generados expresamente, específicos para determinados péptidos, pudieron destruir de forma efectiva y selectiva células tumorales.

Para la aplicación de antígenos asociados a tumores en una vacuna tumoral, son posibles varias formas de aplicación. De esta forma, Tighe y col., (1998, Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint, «Immunol. Today» 19(2):89-97) describían que el antígeno puede ser administrado como proteína recombinante con los adyuvantes o los vehículos apropiados o como ADNc codificante para el antígeno en vectores plasmídicos. En estos casos, el antígeno debe ser empleado y presentado en el cuerpo del paciente por células presentadoras de antígenos (APC), con el fin de que se desencadene una respuesta inmune.

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Melief y col. (1996, Peptide-based cancer vaccines, «Curr. Opin. Immunol.» 8:651-657) muestran otra posibilidad: la utilización de péptidos sintéticos como vacuna.

En una forma de realización preferida, el péptido se aplica con adyuvantes o en su forma aislada.

Se puede utilizar como adyuvante, por ejemplo, el factor estimulante de colonias granulocito-macrófago (GM-CSF).

Otros ejemplos de adyuvantes son el hidróxido de aluminio o emulsiones de aceites minerales como, por ejemplo, el adyuvante de Freund, la saponina o los compuestos de silicio.

La utilización de adyuvantes ofrece la ventaja de que la respuesta inmune desencadenada por el péptido se puede reforzar y/o que el péptido se estabiliza.

En otra forma de realización, el péptido se aplica unido a una célula presentadora de antígeno.

Esta medida presenta la ventaja de que los péptidos pueden ser presentados al sistema inmune, especialmente a los linfocitos T citotóxicos (CTL). De esta forma, los CTL pueden reconocer a las células tumorales y destruirlas selectivamente. Como células presentadoras de antígenos son apropiadas para dicha aplicación, por ejemplo, las células dendríticas, los monocitos o los linfocitos B.

Las células se cargan con los péptidos ex vivo, por ejemplo. Por otro lado, también existe la posibilidad de transfectar las células con el ADN codificante de los péptidos o el ARN correspondiente para llevar a la expresión de los péptidos en las células.

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Los inventores pudieron mostrar en experimentos propios que es posible cargar células dendríticas (DC) con péptidos específicos y que estas células dendríticas cargadas activan CTL específicas de péptidos. Esto significa que el sistema inmunológico puede ser estimulado para desarrollar CTL contra los tumores, que expresan los péptidos correspondientes.

Las células presentadoras de antígenos portadoras del péptido pueden utilizarse para ello de forma directa, o bien ser activadas antes de su aplicación, por ejemplo, con la proteína de choque térmico gp96. Esta proteína de choque térmico induce

la: expresión de moléculas MHC de clase I y de moléculas

coestimulantes: como la B7 y estimula además la producción de

citocinas.: De esta forma, se estimula de forma global el

desencadenamiento de respuestas inmunes.

En otra forma de realización preferida, los péptidos son utilizados para la marcación de leucocitos, especialmente de linfocitos T.

Esta aplicación es ventajosa cuando los péptidos se utilizan para descubrir si en una población de CTL existen CTL dirigidos específicamente contra un péptido.

El péptido también se puede aplicar como marcador en la evaluación de un tratamiento contra una enfermedad tumoral.

En inmunizaciones u otros tratamientos también se puede aplicar el péptido para la monitorización. Por lo tanto, el péptido no sólo es útil para el tratamiento, sino también para el diagnóstico.

En otra forma de realización preferida, los péptidos se aplican para la preparación de un anticuerpo.

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Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse de manera

convencional: mediante la inmunización de animales con una

inyección: de los péptidos y la posterior purificación de la

inmunoglobulina.

Los anticuerpos monoclonales pueden producirse por protocolos estándar, como se describe, por ejemplo, en «Methods Enzymol.» (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

En otro de sus aspectos, la invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene uno o varios de los péptidos.

Esta composición se puede administrar por vía parenteral, como subcutánea, intradérmica o intramuscular, o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente acuoso. Además, la composición puede contener coadyuvantes como, por ejemplo, amortiguadores, aglutinantes, agentes de acoplamiento, etc.

Los péptidos también pueden administrarse junto con sustancias inmunoestimulantes como, por ejemplo, citocinas. Se puede encontrar una descripción completa de adyuvantes para una composición de este tipo en A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3ª Ed, 2000, «American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press».

El medio puede aplicarse en la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales y/o adenomatosas.

El medio farmacéutico, que contiene al menos uno de los péptidos con las secuencias con ID n.º 1 a 79, se administra a un paciente con una enfermedad tumoral a la que se está asociada el péptido o antígeno en cuestión. De esta forma, puede

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desencadenarse una respuesta inmune específica de tumor en base a CTL específicos de tumor.

La cantidad de péptido o péptidos existente en la composición farmacéutica se da en una cantidad terapéuticamente efectiva. Por ello, los péptidos contenidos en la composición también pueden unirse, al menos, a dos tipos distintos de HLA.

En otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los péptidos con los ID de secuencia n.º 1 a 79.

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN y, asimismo, se pueden aplicar en la inmunoterapia del cáncer. Para ello, el péptido expresado por la molécula de ácidos nucleicos induce una respuesta inmune contra las células tumorales que expresan el péptido.

Conforme a la presente invención, las moléculas de ácidos nucleicos también pueden encontrarse en un vector.

Además, la invención se refiere a células que, con ayuda de la molécula de ácidos nucleicos, la cual codifica los péptidos, han sido modificadas genéticamente de tal forma que producen un péptido con las secuencias con ID n.º 1 a 79.

Para ello, las células son transfectadas con el ADN codificante de los péptidos o el ARN correspondiente, de tal forma que los péptidos son expresados en las células. Para dicha aplicación son apropiadas como células presentadoras de antígenos, por ejemplo, las células dendríticas, los monocitos o los linfocitos

B.

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Se entiende que las características mencionadas con anterioridad y las que se aclararán más adelante no sólo se aplican en la combinación dada, sino también en su forma aislada, sin que por ello se abandone el marco de la presente invención.

A continuación se presentan y explican, en los ejemplos siguientes y las figuras incluidas, ejemplos de realización de la invención. Muestran los siguiente:

Fig. 1 la detección de linfocitos T CD8+ específicos de queratina 18;

Fig. 2a-d la inducción de reacciones de CTL in vitro específicas de péptido-c-met (SEQ ID n.º 1), Fig. 2a+b o de péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig. 2c+d;

Fig. 3a-f las lisis específica de antígeno de las líneas celulares que expresan c-met o adipofilina mediante CTL, inducida por CTL inducidos por péptido-c-met(SEQ ID n.º 1), Fig. 3a-d, o péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig. 3e-f;

Fig. 4a-c ensayos de inhibición de lisis con células tumorales 51Cr

marcadas con y células T2 no marcadas, sensibilizadas con el péptido, mediante CTL inducidos por el péptido-c-Met (SEQ ID n.º 1), Fig. 4a+b o péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig. 4c;

Fig. 5a+b la lisis de DC autólogas, transfectadas con ARN del tumor, mediante CTL inducidos por el péptido-c-met (SEQ ID n.º 1), Fig. 5a, o el péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig. 5b;

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Fig. 6 los CTL autólogos específicos de adipofilina inducidos in vitro reconocen las células tumorales de un paciente con leucemia linfática crónica, pero no células B o células dendríticas autólogas.

5 Ejemplo 1

1.1. Muestras de pacientes

El departamento de urología de la Universidad de Tubinga facilitó dos muestras de pacientes que presentaban tumor de células del riñón confirmado histológicamente. Ninguno de los

10 pacientes había recibido tratamiento preoperatorio. El paciente n.º 1 (en adelante, RCC01) presentaba la siguiente tipificación HLA: HLA-A*02 A*68 B*18 B*44; el paciente n.º 2 (en adelante, RCC13), HLA-A*02 A*24 B*07 B*40.

1.2. Aislamiento del péptido ligado a MHC de clase I

15 Las muestras de tumor sometidas a choque térmico se procesaron como se describe en Schirle, M. y col. (Identification of tumorassociated MHC class I ligands by a novel T cell-independent approach, 2000, «European Journal of Immunology», 30:2216-2225). Los péptidos se aislaron con protocolos estándar mediante el uso

20 del anticuerpo monoclonal W6/32, específico para la molécula HLA de clase I, o del anticuerpo monoclonal BB7.2, específico para HLA-A2. Barnstable, C.J. y col. (Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis, 1978, «Cell»,

25 14:9-20) y Parham, P. & Brodsky, F.M. (Partial purification and some properties of BB7.2. A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28, 1981, «Hum. Immunol.», 3:277-299) describen la preparación y uso de estos anticuerpos.

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1.3. Espectrometría de masas

Los péptidos obtenidos a partir del tejido tumoral del paciente RCC01 se separaron mediante HPLC en fase invertida (sistema SMART, µRPC C2/C18 SC 2.1/19, Amersham Pharmacia Biotech) y las fracciones obtenidas se analizaron mediante nano espectrometría de masas ESI. Se procedió como se describe en Schirle, M. y col,

Identification: of tumor-associated MHC class I ligands by a

novel: T cell-independent approach, 2000, «Eur ope an Journal of

Immunology», 30:2216-2225.

Los péptidos obtenidos a partir de tejido tumoral del paciente RCC13 se identificaron, como se ha mencionado, mediante LC MS capilar, pero con ligeras modificaciones: 100 µl de muestra se cargaron, desmineralizaron y preconcentraron en una precolumna de 300 µm * 5 mm C18 µ (LC Packings). El disolvente y la muestra se administraron con una bomba de inyección (PHD 2000, Harvard Apparatur, Inc.) con una inyección impermeabilizada de 100 µl (1710 RNR, Hamilton) a una velocidad de 2 µl/min. Para la separación de los péptidos se conectó una columna de preconcentración a 75 µm * 250 mm C-18 (LC Packings). Finalmente, se efectuó un gradiente binario con 25-60% B en 70 min, en el que se redujo la tasa de flujo de 12 µl/min a, aproximadamente, 300 µm/min, mediante el uso de una conexión TEE (ZT1C, Valco) y una columna de 300 µm * 150 mm C-18.

Con el fin de asegurar que el sistema estaba libre de péptidos sobrantes, se realizó una medición de una muestra vacía. Se efectuaron fragmentaciones en línea, como se ha descrito, y los espectros de los fragmentos fueron analizados manualmente. Los análisis de las bases de datos (NCBInr, EST) se efectuaron con MASCOT (http://www.matrixscience.com).

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1.4. Identificación de 77 ligandos MHC de clase I de tejido

tumoral del paciente RCC01

En la tabla 1 adjunta se presentan los ligandos unidos a HLAA*02, HLA-A*68, HLA-B*18 o HLA-B*44. Los péptidos que estaban asociados a HLA-A*02 presentan el motivo peptídico específico de alelo: así, en la posición 2 había leucina, valina, isoleucina, alanina o metionina y en el C-terminal, leucina, valina isoleucina o alanina. La mayoría de los ligandos procedían de las llamadas proteínas de mantenimiento, aunque también se identificaron ligandos de proteínas asociados a tumores.

Los ligandos asociados a HLA-A*68 se identificaron por sus aminoácidos de anclaje treonina, isoleucina, valina, alanina o leucina en la posición 2 y arginina o lisina en el C-terminal. Esto señalaba hacia el subtipo HLA-A*6801. Entre los péptidos asociados a HLA-A*68 se incluyeron dos ligandos de adipofilina, MTSALPEIQK y MAGDIYSVFR, además del ETIPLTAEKL procedente de ciclina D1 asociada a tumor. De la anexina II procedía el péptido TIVNILTNR. Esta proteína se presenta como inmunógena con respecto a las moléculas MHC de clase II en pacientes con melanoma (véase Heinzel y col,. The self peptide annexin II [208 -223] presented by dendritic cells sentisizes autologous CD4+ T lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001, «Cancer Immunol. Immunother.» 49:671-678). Los otros ligandos presentaban ácido glutamínico en la posición 2, que es un aminoácido de anclaje

para: el subtipo HLA-B*44. El motivo peptídico del HLA-B*18

todavía: no se conoce, por lo que los ligandos de estas dos

moléculas HLA-B no se pueden distinguir.

1.5. Ligandos MHC de clase I de tejido tumoral del paciente RCC13

También para este tejido tumoral se pudieron identificar los mismos ligandos que se identificaron para el paciente RCC01 y

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los que procedían del proto-oncogén met (c-met) y la queratina

18. Eran los péptidos con SEQ ID n.º 1 y 3. Además, se pudieron obtener otros ligandos de este tejido tumoral. De esta forma se identificó, por ejemplo, un ligando procedente de la

5 nicotinamida-N-metiltransferasa (NNMT), un gen que en más de 95% de todos los tumores de riñón aparece sobreexpresado. Además, se solaparon otros ligandos con el repertorio de péptidos de RCC01.

1.6. Comprobación de los linfocitos T específicos de queratina 18 en el repertorio normal de linfocitos T CD8+

10 Las células mononucleares de sangre periférica de pacientes sanos se tiñeron con tetrámeros de HLA-A*0201, contruidos con péptidos de adipofilina, queratina 18 o proto-oncogén met (cmet): Para la preparación de los tetrámeros se constituyeron moléculas HLA-A*0201 recombinantes in vitro con los péptidos

15 SVASTITGV (SEQ ID n.º 2, adipofilina), ALLNIKVKL (SEQ ID n.º 3, queratina 18) o YVDPVITSI (SEQ ID n.º 1, proto-oncogén met (cmet), se limpiaron con filtrado de gel, se biotinilaron y se mezclaron con estreptavidina para el ligado de los monómeros.

De forma sorprendente, se encontró una población significativa

20 de linfocitos T CD8+ específica para la queratina 18 en cuatro de 22 pacientes sanos. En la figura 1 se muestran los resultados del teñido doble mediante representación de puntos, en donde la fila central muestra los resultados del teñido con queratina 18. Entre el 0,02% y el 0,2% de los linfocitos T CD8+ era específico

25 para la queratina 18. En la fila inferior de la representación de puntos se puede apreciar que esta unión era específica del tetrámero de queratina 18.

Ejemplo 2

20

Con el fin de analizar la presentación de los péptidos con la SEQ ID n.º 1 (YVDPVITSI) (fragmento peptídico del proto-oncogén c-met) y la SEQ ID n.º 2 (fragmento peptídico de la adipofilina) mediante células tumorales y el reconocimiento del péptido mediante CTL, se indujeron CTL in vitro específicos del péptido c-met (péptido con SEQ ID n.º 1) y CTL específicos del péptido de adipofilina (SEQ ID n.º 2). Para ello se utilizaron células dendríticas (DC) procedentes de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes HLA-A*02+ sanos.

2.1. Obtención de células dendríticas

Las células dendríticas se aislaron de PBMC de sangre heparinizada mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll/Paque (Biochrom, Berlín, Alemania). La sangre heparinizada se obtuvo a partir de preparaciones de capa de leucocitos de donantes sanos del banco de sangre de la Universidad de Tubinga. Las células se colocaron en placas de 6 pocillos (Falcon, Heidelberg, Alemania) (1 x 107 células / 3 ml por pocillo) en medio RP10 (RPMI 1640, complementado con un 10% de suero fetal de ternero inactivado por calor y con antibióticos). Tras una incubación de 2 horas a 37 ºC y con un 5% de CO2, se quitaron las células no adheridas y se cultivaron en medio RP10 los monocitos adheridos. Se añadieron al medio las siguientes citocinas: GM-CSF humano recombinante (factor estimulante de colonias granulocito-macrófago; Leukomax, Novartis; 100 ng/ml), interleucina IL-4 (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania; 1000 IU [ml]) y TNF-α (factor α de necrosis tumoral) (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania; 10 ng/ml).

2.2. Síntesis de los péptidos

Por ejemplo, se sintetizaron dos péptidos unidos a HLA-A*02 (c- Met [SEQ ID n.º 1, YVDPVITSI] o adipofilina [SEQ-ID n.º 2,

21

SVASTITGV], como se identificaron los mencionados anteriormente) mediante la utilización de grupos protectores F-moc (9Fluorenilmetiloxicarbonilo) en un sintetizador de péptidos (432A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) y se analizaron mediante HPLC en fase invertida y espectrometría de masas. De esta forma, se pudieron preparar suficientes cantidades del péptido identificado.

2.3. Inducción de una respuesta de CTL específica de antígeno mediante la aplicación de péptidos sintéticos restringidos a HLA-A*02

Para la inducción de CTL se sensibilizaron durante 2 horas las DC obtenidas en el paso 2.1 (5 x 105) con los péptidos obtenidos en el paso 2.2. con SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2, cada uno con 50 µg/ml, se lavaron y se incubaron con 2,5 x 106 PBMC autólogas en medio RP10. Después de 7 días de incubación, las células se volvieron a estimular con PBMC autólogas sensibilizadas con péptidos. Los días 1, 3 y 5 se añadió 1 ng/ml de interleucina IL-2 (R&D Systems) recombinante humana. La actividad citotóxica de los CTL inducidos de esta manera se examinó el 5º día, tras la última reestimulación , mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr (véase más abajo, en 2.4 [ensayo CTL]).

2.4. Ensayo CTL

Para los ensayos de CTL se utilizaron como células diana células tumorales, células sensibilizadas con péptido y de distintas líneas celulares y DC autólogas. Las células sensibilizadas con péptido se sensibilizaron durante 2 horas con 50 µg/ml de péptido (SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2). Todas las células diana se marcaron en medio RP10 (RPMI 1640, complementado con un 10 % de suero fetal de ternero inactivado por calor y con antibióticos) durante 1 hora a 37 °C con [51Cr]cromato de sodio

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(51Cr). Finalmente, se repartieron 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con suelo redondeado. Se añadieron distintas cantidades de CTL hasta alcanzar un volumen de 200 µl, con una incubación final de 4 horas a 37 ºC. Después se recogieron los resultados (50 µl/pocillo) y se hizo un recuento en un contador de placas beta. El porcentaje de la lisis específica se calculó de la siguiente forma: 100 x (liberación experimental – liberación espontánea / liberación máxima – liberación espontánea). La liberación espontánea y la liberación máxima se fijaron en presencia de medio o de Triton X-100 al 2%.

2.5. Resultados de la inducción de CTL

a) Actividad citotóxica de los CTL frente a DC sensibilizadas

por péptidos

En la figura 2 se muestran los resultados del ensayo de Cr51

liberación de (véase el epígrafe 2.4. más abajo) con referencia a la actividad citotóxica de CTL inducidos (véase el epígrafe 2.3. más abajo) frente a células T2 o dendríticas. La línea celular T2 es HLA-A*02+ y carente de TAP (transportador asociado al procesamiento antigénico); (los transportadores de

péptidos: TAP transportan fragmentos peptídicos de un antígeno

proteico: desde el citosol hasta el retículo endopl asmático,

donde se asocia a moléculas MHC).

En las figuras 2a y 2b se muestra la actividad citotóxica de los CTL, inducidos mediante la utilización del péptido con la SEQ ID n.º 1, frente a células T2 y dendríticas. Ambos tipos de célula fueron previamente sensibilizados con el péptido c-met con SEQ ID n.º 1 (cuadrícula rellena de negro) o con un péptido irrelevante (Survivin [Sv]; ELTLGEFLKL; SEQ ID n.º 80) o VIH (ILKEPVHGV; Pol. péptido HIV-1 con transcripción inversa, posición de los ácidos nucleicos 476-484; SEQ ID n.º 81). En las

23

figuras 2c y 2d se muestra la actividad citotóxica de los CTL, inducidos mediante la utilización del péptido con SEQ ID n.º 2, frente a células T2 y dendríticas, que previamente fueron sensibilizadas con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.

La lisis específica reflejada en la liberación de 51Cr se muestra en las figuras 2a a 2d y en los diagramas de lisis de CTL de las figuras 3 a 5, frente a diferentes proporciones de células efectoras (CTL) y células diana (células marcadas con 51Cr, para lisar).

Como se puede ver en las figuras 2a a 2d, se pudo mostrar, con una línea celular de CTL obtenida tras 2 semanas de reestimulación, una destrucción de las células específica de antígeno. Sólo se destruyeron, mediante una cantidad en aumento de CTL, las células que presentaban el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1 (figuras 2a y 2b) o el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 (figuras 2c y 2d) (véanse en las figuras 2a a 2d las curvas correspondientes con las cuadrículas en negro). Las células de control cargadas con péptidos irrelevantes no fueron destruidas (las curvas con cuadrículas vacías). De esta forma, se pudo mostrar la especificidad de la actividad citolítica.

b) Actividad citotóxica de CTL frente a líneas celulares de tumor

En una etapa posterior, se volvió a utilizar un ensayo de liberación de 51Cr para evaluar si los CTL –que son específicos para el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1 o para el péptido de

adipofilina: con SEQ ID n.º 2– reconocen y lisan células

tumorales: que expresan endógen amen te el proto-o ncogén c-met o

adipofilina.

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24

Para ello se aplicaron las siguientes líneas celulares HLA-A*02 positivas marcadas con 51Cr: HCT 116 (cáncer de intestino; obtenida de el Prof. G. Pawelec, Tubinga, Alemania), A 498, MZ 1257 y MZ 1774 (carcinoma de células renales; obtenida de el Prof. A. Knuth, Fráncfort, Alemania), MCF-7 (cáncer de mama; adquirida de la ATCC, American Type Culture Collection), Mel 1479 (melanoma; obtenida de el Prof. G. Pawelec, Tubinga, Alemania) y U 266 (mieloma múltiple; obtenida de el Prof. G. Pawelec, Tubinga, Alemania). Estas líneas celulares expresan el proto-oncogén c-met y la adipofilina como estructuras diana (targets).

Las líneas celulares B Croft (VEB [virus de Epstein-Barr]); HLAA*02+; obtenida de O.J. Finn, Pittsburgh, EUA) y SK-OV-3 (tumor ovárico; HLA-A*03+; obtenida de O.J. Finn, Pittsburgh, EUA) se utilizaron en los análisis como controles negativos. Las células K 562 (que se pueden obtener, por ejemplo, en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ; ACC 10) se utilizaron para determinar la actividad de las células asesinas naturales (NK), ya que esta línea celular está altamente sensibilizada frente a estas células asesinas.

Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RP10 (RPMI 1640, complementado con un 10% de suero fetal de ternero inactivado por calor y antibióticos).

Con las líneas celulares de tumor mencionadas anteriormente y los CTL inducidos como se describe en el epígrafe 2.3, se efectuaron los ensayos de liberación de 51Cr (véase el epígrafe 2.4).

Las figuras 3a a 3f muestran los resultados de estos ensayos de CTL: en las figuras 3a a 3d se muestran los CTL inducidos mediante la utilización del péptido de c-met con SEQ ID n.º 1;

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25

en las figuras 3e y 3f se muestran los CTL inducidos mediante la utilización del péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.

Como se puede ver en las figuras 3a a 3f, los CTL, específicos para el péptido c-met con SEQ ID n.º 1 (Fig. 3a a 3d) o para el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 (Fig. 3e y 3f), lisaron de forma eficaz células tumorales que expresaban tanto HLA-A*02 como c-met o adipofilina (también en la Fig. 3a la línea celular HCT 116, en la Fig. 3b la línea celular A 498, en la Fig. 3c las líneas celulares MZ 1257 y MEL 1479 y en la Fig. 3d las líneas celulares MCF-7 y U 266; en la Fig. 3e las líneas celulares A 498, U 266 y MCF-7, en la Fig. 3f las líneas celulares MZ 1774, Mel 1479 y MZ 1257). La lisis específica se midió –como se dio anteriormente en el epígrafe 2.4.– mediante la liberación de 51Cr. Por el contrario, la línea celular de control SK-OV-3 (HLAA-*02-negativa) no fue lisada por los CTL inducidos con el péptido con SEQ ID n.º 1 ni por los CTL inducidos por el péptido con SEQ ID n.º 2. Esto demuestra que ambos péptidos deben ser presentados en relación con las moléculas HLA-A*02 en las células tumorales, con el fin de lisar las células diana de forma efectiva. Además, de esta forma se comprobó la especificidad antigénica y la restricción de MHC de los CTL.

Además, los CTL inducidos in vitro por el péptido con SEQ ID n.º 1 no reconocieron la línea celular K562 (véanse las Fig. 3a, 3b y 3d), lo que demuestra que la actividad citotóxica no es proporcionada por células asesinas naturales (NK).

c) Ensayos de inhibición

Con el fin de seguir verificando la especificidad antigénica y la restricción de MHC de los CTL inducidos in vitro, se efectuaron ensayos de inhibición con líneas celulares de inhibidores no marcadas con 51Cr (fríos).

26

Con ello se analizó la capacidad de las líneas celulares sensibilizadas con péptidos para inhibir o competir con la lisis de células tumorales. Para ello se aplicó un exceso de inhibidor (es decir, de células sensibilizadas no marcadas). La proporción del inhibidor (células sensibilizadas con péptidos) y la diana (células tumorales) fue de 20:1. En la lisis de las líneas celulares del inhibidor no se pudo liberar 51Cr, ya que las líneas celulares del inhibidores no estaban marcadas.

Como inhibidor se aplicó la línea celular T2 (HLA-A*02; deficiente de TAP; véase el epígrafe 2.5.a). La línea celular T2 se sensibilizó antes de cada ensayo con los péptidos relevantes (SEQ ID n.º 1 o 2) o con un péptido de control irrelevante (Survivin [Sv], SEQ ID n.º 80)

Los resultados de estos ensayos se muestran en las figuras 4a a 4c: en las figuras 4a y 4b se aplicaron CTL que fueron inducidos con el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1; en la figura 4c, CTL que fueron inducidos por el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.

En las figuras 4a y 4b se evaluó la lisis de las líneas celulares U 266 y A 498 marcadas con 51Cr, sin línea celular de inhibidor (cada curva con cuadrículas negras); con la línea celular T2 del inhibidor, sensibilizada con un péptido irrelevante (Survivin; SEQ ID n.º 80; control negativo, las curvas con los triángulos rellenos); y con la línea celular T2 del inhibidor, sensibilizada con el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1 (curvas con los rombos en blanco).

Sin la existencia de las células del inhibidor, se observó una lisis de las células tumorales mediante CTL (véanse en las figuras 4a a 4d las curvas con las cuadrículas rellenas de negro). Como se deduce de las figuras 4a y 4b, con un exceso de

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blanco inhibidor no tuvo lugar la lisis de las células tumorales (y por lo tanto, la liberación de 51Cr), siempre que el blanco inhibidor estaba sensibilizado con el péptido c-met con SEQ ID n.º 1 (véanse las curvas con los rombos en blanco). La actividad de los CTL se orientó hacia el exceso de células T2 sin marcar, de forma que se lisaron éstas, y no las células tumorales. Las células T2, sensibilizadas con un péptido irrelevante (Survivin;

SEQ: ID n.º 80), no pudieron inhibir la lisis de las células

tumorales: por los CTL, de forma que se pudo medir el 51Cr

liberado: (véanse en las figuras 4a y 4b las curvas con los

triángulos rellenos de negro).

Se pudo observar algo parecido al utilizar CTL inducidos por la aplicación del péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 (véase la figura 4c):

La restricción MHC y la especificidad antigénica de la actividad citotóxica, transmitida a través de los CTL inducidos por adipofilina, pudo confirmarse mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal específico de HLA-A*02 y en un ensayo de inhibición con un inhibidor sin marcar (frío): Los resultados de este experimento se muestran en la figura 4c. Las células tumorales A 498 se bloquearon mediante la adición del anticuerpo específico de HLA-A*02 (anticuerpo monoclonal BB7.2, IgG2b, obtenido de S. Stefanovic, Tubinga), de forma que no se lisaron por la adición de CTL y no se liberó 51Cr (véase en la figura 4c la curva con símbolos de triángulos en blanco). Como control se utilizó un anticuerpo inespecífico que no bloqueaba la molécula HLA-A*02 (ChromPure Maus IgG, Dianova, Alemania; véase en la Fig. 4c la curva con las cuadrículas rellenas). Para estos experimentos de inhibición, se incubaron las células en las placas de 96 pocillos durante 30 min. con 10 µg/ml de anticuerpos.

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Además, se demostró que la línea celular T2 de competición, que se sensibilizó con el péptido irrelevante Survivin con SEQ ID n.º 80 (T2/SV), no pudo inhibir la lisis de la línea celular tumoral A 498 producida por los CTL (véase en la figura 4c la curva con los círculos en negro), pero que la línea celular del inhibidor T2 (T2/AD) sensibilizada con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 pudo inhibir la lisis de la línea celular del tumor, de forma que, al final, no se pudo medir ninguna liberación de 51Cr (véase en la figura 4c la curva con los símbolos x).

d) Lisis específica de DC transfectadas

En un paso posterior, se analizó la actividad citotóxica de los CTL en un experimento autólogo. Para ello se utilizaron DC autólogas, obtenidas de la misma PBMC que la utilizada para la inducción de CTL (véase el epígrafe 2.2.), como células diana. Antes de efectuar los ensayos de CTL se realizó la electroporación de las DC con ARN, que, o bien se aisló anteriormente de líneas celulares de tumor o bien mostraba ARN de control (EGFP-ARN transcrito in vitro [enhanced Green fluorescent Protein-RNA]; plásmido utilizado: pSP64 Poly(A) EGFPII, obtenido de Van Tendeloo, Amberes, Bélgica). El ARN completo se aisló de las células tumorales con el kit QIAGEN Rneasy Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania) conforme a los datos del fabricante. La cantidad y pureza del ARN se fijó fotométricamente y se guardó en partes alícuotas a -80 ºC.

Antes de la electroporación el sexto día, se lavaron DC inmaduras dos veces con medio X-VIVO 20 sin suero (BioWhittaker, Walkersville, EUA) y se volvieron a suspender en una concentración final de 2 x 107 células/ml. Finalmente, se mezclaron 200 µl de la suspensión celular con 10 µg del ARN total y se sometieron a electroporación en una cubeta de 4 mm mediante Easyject PlusTM (Peqlab, Erlangen, Alemania)

29

(Parámetros: 300 V, 150 µF, 1540 �, tiempo de pulsación: 231 ms). Después de la electroporación, las células se traspasaron de inmediato a medio RP10 y se devolvieron al incubador. Más del 80% de las células eran viables tras la electroporación.

Los resultados de estos experimentos se muestran en las figuras 5a y 5b. En la figura 5a se aplicaron CTL inducidos mediante la utilización del péptido c-met con SEQ ID n.º 1; en la figura 5b se aplicaron CTL inducidos mediante la utilización del péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.

Tras efectuarse el ensayo de CTL con CTL inducidos por el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1 (véase el epígrafe 2.4.), se pudo observar una lisis específica de DC, electroporadas con ARN de líneas celulares de tumor que expresaban c-met (A 498 y MCF7) (véanse en la figura 5a las curvas con los símbolos en negro). Por el contrario, las DC que fueron electroporadas con ARN de la línea celular tumoral Croft que no expresaba el c-met no fueron lisadas (véase la curva con los rombos en blanco).

Los CTL inducidos por el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2, lisaron las DC, que fueron electroporadas con ARN de la línea celular A-498 que expresaba adipofilina (véase en la figura 5b la curva con los triángulos en negro). Además, se lisaron DC que fueron sensibilizadas con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 (véase en la figura 5b la curva con los rombos en negro). Por el contrario, las DC que fueron electroporadas con el (EGFP)ARN de control no se lisaron (véase en la figura 5b la curva con los triángulos en blanco).

Esto demuestra que –después de la transfección de las DC con ARN de células tumorales positivas de c-met o adipofilina– los péptidos identificados, es decir, el péptido de c-met con SEQ ID

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n.º 1 y el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 fueron procesados y presentados.

e) Inducción de CTL específicos de adipofilina en un paciente con leucemia linfática crónica

En otro experimento, se generaron, a partir de PBMC de un paciente HLA-A-*0201+ con leucemia linfática crónica (CLL) CTL específicos para el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2. El paciente se encontraba en remisión tras un tratamiento con fludarabina. Además, se aplicaron en un ensayo linfocitos CLL autólogos primarios y DC de dicho paciente como blancos marcados con 51Cr, en el que se transmitió una liberación de 51Cr mediante los CTL inducidos por péptidos. Como se muestra en la figura 6, tanto las DC autólogas de este paciente, que se sensibilizaron con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 (DC+AD), como los linfocitos CLL autólogos (linfocitos CLL) fueron lisados por los CTL inducidos por el péptido. Por el contrario, las DC, sensibilizadas con el péptido irrelevante Survivin con SEQ ID n.º 80, no fueron lisadas (DC+SV). Los linfocitos B no malignos y la línea celular K 562 tampoco fueron lisados por los CTL.

La especificidad de la respuesta de los CTL se comprobó en un ensayo de inhibición del blanco, en el que se aplicó como células del inhibidor la línea celular T2 (véase más arriba), que estaba sensibilizada con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 o con el péptido irrelevante Survivin con SEQ ID n.º

80. Los CTL inducidos mediante la utilización del péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 también lisaron aquí las líneas celulares del inhibidor existentes en exceso, que fueron sensibilizadas con el péptido relevante con SEQ ID n.º 2, de

51Cr

forma que las células tumorales marcadas con no fueron lisadas en este caso (véase en la figura 6 la curva con las casillas en blanco).

31

En resumen, los inventores pueden demostrar que los péptidos identificados producen sustancias muy prometedoras en la inmunoterapia de una variedad de enfermedades (tumorales).

Tabla 1

Secuencia: Posición/Tipo de gen N.º de SEQ ID n.º

reg.

Paciente RCC01 HLA-A*02

1. YVDPVITSI: 654-662 met proto-oncogen J02958 SEQ ID n.º 1

2. SVASTITGV: 129-137 adipose differentiationrelated protein X97324 SEQ ID n.º 2

3. ALLNIKVKL: 365-373 keratin 18 M26326 SEQ ID n.º 3

4. ALFDGDPHL: 1-9 KIAA0367 AB002365 SEQ ID n.º 4

5. RLLDYVVNI: 679-687 hypothetical protein FLJ20004 AB040951 SEQ ID n.º 5

6. ALANGIEEV: 101-109 apolipoprotein L, 3 AY014906 SEQ ID n.º 6

7. QLIDKVWQL: 593-601 SEC14 (S.cerevisiae)-like 1 D67029 SEQ ID n.º 7

8. ALSDLEITL: 389-397 mitogen inducible 2 Z24725 SEQ ID n.º 8

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9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

ILDTGTIQL: 174-182 kidneyand liverspecific gene

SLLGGDVVS: 27-36

V: delta sleep inducing peptide, immunoreactor

FLDGNELTL: 167-175

chloride intracellular

channel 1

NLLPKLHIV: 179-187

chloride intracellular

channel 1

ALASHLIEA: 507-515

EH-domain containing 2

SLYGGTITI: 296-304

hypothetical protein FLJ11189

FLLDKKIGV: 218-226

chaperonin containing TCP1, subunit 2 (beta)

FLDGNEMTL: 178-186

chloride intracellular

channel 4

AIVDKVPSV: 147-155

coat-protein gamma-cop

DVASVIVTK: 241-250

L: signal recognition particle 54kD

LASVSTVL: 130-137

hemoglobin, alpha 2

AB013094

AF153603

U93205

AF181263 AK000697

AF026166

AF097330

AF100756 U51920

AF230076

SEQIDn.º 9

SEQ ID n.º10

SEQ ID n.º11

SEQ ID n.º12

SEQ ID n.º13 SEQ ID n.º14

SEQ ID n.º15

SEQ ID n.º16

SEQ ID n.º17 SEQ ID n.º18

SEQ ID n.º19

33

20.

21.

VMAPRTLVL

LLFDRPMHV

HLA-A*68

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

MTSALPIIQ K

MAGDIYSVF R

ETIPLTAEK L

DVMVGPFKL R

TIIDILTKR

TIVNILTNR

TIIDIITHR

SIFDGRVVA K

STIEYVIQR

3-11 HLA-A

267-275 hnRNP M

62-71 adipose differentiationrelated protein

349-358 adipose differentiationrelated protein

115-124 cyclin D1/PRAD1

934-943 A kinase (PRKA) anchor protein 2

64-72 annexin A1

55-63 annexin A2

385-393 annexin A6

107-116 putative membrane protein

115-123 Sec23 (S. cerevisiae) homolog B

SEQ ID n.º20

L03532: SEQ ID n.º21

X97324: SEQ ID n.º22

X97324: SEQ ID n.º23

X59798: SEQ ID n.º24

AJ303079: SEQ ID n.º25

X05908: SEQ ID n.º26

BC001388: SEQ ID n.º27

J03578: SEQ ID n.º28

AB020980: SEQ ID n.º29

BC005032: SEQ ID n.º30

34

31.: ELIKPPTIL R 132-141 adaptor-rela ted prot ein AF092092 SEQ ID n.º31

32.: EIAMATVTALR complex 3 248-258 aldolase A, fructo seX12447 SEQ ID n.º32

33.: ETIGEILKK biphosphate 95-103 hnRNP K BC000355 SEQ ID n.º33

34.: SLADIMAKR 86-94 ribosomal pr otein L24 BC000690 SEQ ID n.º34

HLA-B*44 o HLA-B*18

35.: EEIAFLKKL 229-237 M14144 SEQ ID n.º35

vimentin

36.: DEAAFLERL 92-100 M64110 SEQ ID n.º36

caldesmon 1

37.: DEMKVLVL 545-552 M96803 SEQ ID n.º37

spectrin,: beta, n on

erythrocytic 1

38.: DEVKFLTV 191-198 M82809 SEQ ID n.º38

annexin A4

39.: NENSLFKSL 935-943 D21260 SEQ ID n.º39

clathrin,: he avy

polypeptide (Hc)

40.: DEFKVVVV 373-380 coat protein, gamma-cop AF100756 SEQ ID n.º40

41.: EEVKLIKKM 137-145 M11147 SEQ ID n.º41

ferritin, light polypeptide

35

42.: DEVKLPAKL 158-166

polymerase I and transcript release factor

43.: TERELKVAY 637-645

hypothetical protein FLJ20004

44.: NEFSLKGVD 86-95

F: ets-1

45.: NEQDLGIQY 169-177 catenin alpha 1

46.: EERIVELF 306-313

signal transducer and activator of

transcription 3

47.: EEIREAFRV 84-93

F: calmodulin 3

48.: DEYIYRHFF 344-352

cell cycle progression 8 protein

49.: DELELHQRF 308-316 adenovirus 5 E1A binding protein

50.: SEVKFTVTF 80-88

galectin 2

51.: IETIINTF 12-19

calgranulin B

52.: KENPLQFKF 61-69/72-80 villin 2

(ezrin)/(radixin)

AF312393: SEQ ID n.º42

AB040951: SEQ ID n.º43

J04101: SEQ ID n.º44

D13866: SEQ ID n.º45

BC000627: SEQ ID n.º46

J04046: SEQ ID n.º47

AF011794: SEQ ID n.º48

X86098: SEQ ID n.º49

M87842: SEQ ID n.º50

M26311: SEQ ID n.º51

J05021/: SEQ ID n.º52

L02320

36

53.: DEVRTLTY 41-48 hnRNP methyltransferase, S. cerevisiae-like 2 Y10807 SEQ ID n.º53

54.: GEAVVNRVF 43-51 large multifunctional protease 2, LMP2 Z14977 SEQ ID n.º54

55.: EEVLIPDQK Y 385-394 F-box and leucine-rich AF126028 SEQ ID n.º55

repeat protein 3A

56.: DEGRLVLEF 163-171 sterol O-acyltransferase 1 L21934 SEQ ID n.º56

57.: DEVELIHF 838-845 chromatin-specific transcription elongation factor AF152961 SEQ ID n.º57

58.: VEVLLNYAY 83-91 NS1-binding protein AF205218 SEQ ID n.º58

59.: TENDIRVMF 120-128 CUG triplet repeat, RNAbinding protein 1 AF267534 SEQ ID n.º59

60.: LEGLTVVY 62-69 coatomer protein complex subunit zeta 1 AF151878 SEQ ID n.º60

61.: NELPTVAF 192-199 hypothetical protein AK001475 SEQ ID n.º61

62.: EEFGQAFSF 77-85 MHC, class II, DP alpha 1 X03100 SEQ ID n.º62

63.: VEAIFSKY 33-40 hnRNP C (C1/C2) M29063 SEQ ID n.º63

37

277-285: M69181 SEQ ID n.º64

myosin, heavy polypeptide

10, non-muscle

206-214: K01177 SEQ ID n.º65

aldolase B, fructose

bisphosphate

159-167: AK025971 SEQ ID n.º66

hypothetical protein

FLJ22318

MHC-I: SEQ ID n.º67

56-63: BF431469 SEQ ID n.º68

EST reading frame-1

frameshift, DDX3 reading: AF061337 SEQ ID n.º69

frame +2

209-217: AL132825 SEQ ID n.º70

transient receptor

protein 4 associated

protein

2-10: L26232 SEQ ID n.º71

phospholipid transfer

protein

72-80: AA483794 SEQ ID n.º72

EST

325-333: AK000904 SEQ ID n.º73

hypothetical protein

FLJ10042

64.

65.

66.

67.

68.

HLA-A*02

DERTFHIFY

TEKVLAAVY

VESPLSVSF

SEAGSHTLQ W DEGKVIRF

Paciente RCC13

69.

70.

71.

72.

73.

ALAAVVTEV TLIEDILGV

ALFGALFLA

VLATLVLLL TLDDLIAAV

38

74.

75.

76.

77.

YLDNGVVFV

SVFAGVVGV

SLINVGLIS V

ALADGVQKV

HLA-A*24

78.

79.

TYGEIFEKF

YYMIGEQKF

316-324: U18299 SEQ ID n.º74

damage-specific DNA

binding protein 1 (127kD)

581-589: U58855 SEQ ID n.º75

guanylate cyclase 1,

soluble, alpha 3

48-57: BC000476 SEQ ID n.º76

acidic protein rich in

leucines

176-184: AF323540 SEQ ID n.º77

apolipoprotein L, 1)

107-115: AF070652 SEQ ID n.º78

NADH dehydrogenase

(ubiquinone) 1, (B14.5b)

203-211: U08021 SEQ ID n.º79

nicotinamide-n

methyltransferase

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Immatics Biotechnologies GmbH

<120>: Péptidos asociados a tumor unidos a moléculas MHC

10: <130> <160> 4648P102 79

<170>: PatentIn version 3.1

39

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile 15

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Val Ala Ser Thr Ile Thr Gly Val 15

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Ala Leu Leu Asn Ile Lys Val Lys Leu 15

<210> 4

<211> 9

40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Ala Leu Phe Asp Gly Asp Pro His Leu 15

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Arg Leu Leu Asp Tyr Val Val Asn Ile 15

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Ala Leu Ala Asn Gly Ile Glu Glu Val 15

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

41

<400> 7 Gln Leu Ile Asp Lys Val Trp Gln Leu

15

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Ala Leu Ser Asp Leu Glu Ile Thr Leu 15

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ile Gln Leu 15

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

42

Ser Leu Leu Gly Gly Asp Val Val Ser Val

15 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Phe Leu Asp Gly Asn Glu Leu Thr Leu 15

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asn Leu Leu Pro Lys Leu His Ile Val 15

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Leu Ala Ser His Leu Ile Glu Ala

43

15

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Ser Leu Tyr Gly Gly Thr Ile Thr Ile 15

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Phe Leu Leu Asp Lys Lys Ile Gly Val 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Phe Leu Asp Gly Asn Glu Met Thr Leu 15

44

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ala Ile Val Asp Lys Val Pro Ser Val 15

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Asp Val Ala Ser Val Ile Val Thr Lys Leu 15 10

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu 15

<210> 20

45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Val Leu 15

<210> 21

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Leu Leu Phe Asp Arg Pro Met His Val 15

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

Met Thr Ser Ala Leu Pro Ile Ile Gln Lys 15 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

46

<213> Homo sapiens

<400> 23

Met Ala Gly Asp Ile Tyr Ser Val Phe Arg 15 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Glu Thr Ile Pro Leu Thr Ala Glu Lys Leu 15 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Asp Val Met Val Gly Pro Phe Lys Leu Arg 15 10

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

47

<400> 26 Thr Ile Ile Asp Ile Leu Thr Lys Arg

15

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

Thr Ile Val Asn Ile Leu Thr Asn Arg 15

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Thr Ile Ile Asp Ile Ile Thr His Arg 15

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

48

Ser Ile Phe Asp Gly Arg Val Val Ala Lys

15 10

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ser Thr Ile Glu Tyr Val Ile Gln Arg 15

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Glu Leu Ile Lys Pro Pro Thr Ile Leu Arg 15 10

<210> 32

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Glu Ile Ala Met Ala Thr Val Thr Ala Leu Arg 15 10

49

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

Glu Thr Ile Gly Glu Ile Leu Lys Lys 15

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

Ser Leu Ala Asp Ile Met Ala Lys Arg 15

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35

Glu Glu Ile Ala Phe Leu Lys Lys Leu 15

50

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

Asp Glu Ala Ala Phe Leu Glu Arg Leu 15

<210> 37

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

Asp Glu Met Lys Val Leu Val Leu 15

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

Asp Glu Val Lys Phe Leu Thr Val 15

<210> 39

<211> 9

51

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Asn Glu Asn Ser Leu Phe Lys Ser Leu 15

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Asp Glu Phe Lys Val Val Val Val 15

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys Met 15

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

52

<400> 42

Asp Glu Val Lys Leu Pro Ala Lys Leu 15

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Thr Glu Arg Glu Leu Lys Val Ala Tyr 15

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Asn Glu Phe Ser Leu Lys Gly Val Asp Phe 15 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

53

Asn Glu Gln Asp Leu Gly Ile Gln Tyr

15

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

Glu Glu Arg Ile Val Glu Leu Phe 15

<210> 47

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe 15 10

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Asp Glu Tyr Ile Tyr Arg His Phe Phe

54

15

<210> 49

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Asp Glu Leu Glu Leu His Gln Arg Phe 15

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

Ser Glu Val Lys Phe Thr Val Thr Phe 15

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

Ile Glu Thr Ile Ile Asn Thr Phe 15

55

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Lys Glu Asn Pro Leu Gln Phe Lys Phe 15

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

Asp Glu Val Arg Thr Leu Thr Tyr 15

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

Gly Glu Ala Val Val Asn Arg Val Phe 15

<210> 55

56

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

Glu Glu Val Leu Ile Pro Asp Gln Lys Tyr 15 10

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

Asp Glu Gly Arg Leu Val Leu Glu Phe 15

<210> 57

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

Asp Glu Val Glu Leu Ile His Phe 15

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

57

<213> Homo sapiens

<400> 58 Val Glu Val Leu Leu Asn Tyr Ala Tyr

15

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Thr Glu Asn Asp Ile Arg Val Met Phe 15

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

Leu Glu Gly Leu Thr Val Val Tyr 15

<210> 61

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

58

<400> 61 Asn Glu Leu Pro Thr Val Ala Phe

15

<210> 62

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 62

Glu Glu Phe Gly Gln Ala Phe Ser Phe 15

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 63

Val Glu Ala Ile Phe Ser Lys Tyr 15

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

59

Asp Glu Arg Thr Phe His Ile Phe Tyr 15

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Thr Glu Lys Val Leu Ala Ala Val Tyr 15

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Val Glu Ser Pro Leu Ser Val Ser Phe 15

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Leu Gln Trp 15

60

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

Asp Glu Gly Lys Val Ile Arg Phe 15

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Ala Leu Ala Ala Val Val Thr Glu Val 15

<210> 70

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 70

Thr Leu Ile Glu Asp Ile Leu Gly Val 15

61

<210> 71

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 71

Ala Leu Phe Gly Ala Leu Phe Leu Ala 15

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

Val Leu Ala Thr Leu Val Leu Leu Leu 15

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Thr Leu Asp Asp Leu Ile Ala Ala Val 15

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

62

<400> 74

Tyr Leu Asp Asn Gly Val Val Phe Val 15

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Ser Val Phe Ala Gly Val Val Gly Val 15

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 76

Ser Leu Ile Asn Val Gly Leu Ile Ser Val 15 10

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 77

63

Ala Leu Ala Asp Gly Val Gln Lys Val 15

<210> 78

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 78

Thr Tyr Gly Glu Ile Phe Glu Lys Phe 15

<210> 79

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 79

Tyr Tyr Met Ile Gly Glu Gln Lys Phe 15

<210> 80

<211> 10<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 80

Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu 15 10

64

<210> 81<211> 9<212> PRT<213> Humanes Immundefizienz Virus

<400> 81

Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 15

Claims

Reivindicaciones

1.

Un péptido asociado a tumor con la secuencia de aminoácidos SVFAGVVGV (SEQ ID n.º 75), en donde el péptido tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.
2.

El péptido conforme a la reivindicación 1, caracterizado porque en N-y/o C-terminal existe otro aminoácido.
3.

El péptido conforme a las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque un aminoácido se ha eliminado.
4.

El péptido conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque al menos un aminoácido se ha modificado químicamente.
5.

La utilización del péptido conforme a las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades tumorales y/o enfermedades adenomatosas.
6.

La utilización del péptido conforme a las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales y/o enfermedades adenomatosas.
7.

La utilización conforme a las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada porque la enfermedad es cáncer renal, de mama, de páncreas, de estómago, de vejiga y/o de testículo.
8.

La utilización conforme a las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque el péptido es aplicado junto con un adyuvante.
9.

La utilización conforme a las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque el péptido se aplica unido a una célula presentadora de antígeno.
10.

La utilización del péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la marcación in vitro de leucocitos, especialmente de linfocitos T.
11.

La utilización conforme a la reivindicación 10 para evaluar el desarrollo de una terapia de una enfermedad tumoral.
12.

La utilización del péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un anticuerpo, siempre que la producción no tenga lugar en seres humanos.
13.

Una composición farmacéutica que contiene el péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
14.

Una molécula de ácidos nucleicos que codifica el péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos.
15.

Células que, con ayuda de la molécula de ácidos nucleicos o del vector conforme a la reivindicación 14, son modificadas genéticamente de tal forma que producen un péptido conforme a una de las reivindicaciones 1 a 4.

66

67