ES2350731T3 - Marcadores biológicos predictivos de respuesta anti-cancerígena a inhibidores de quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico. - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para predecir la sensibilidad del crecimiento de células tumorales a una inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad del desarrollo de células tumorales a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en el que una alta relación de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR.

Description

Marcadores biológicos predictivos de respuesta anti-cancerígena a inhibidores de quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico.

Antecedentes de la invención

La presente invención se dirige a métodos para diagnosticar y tratar pacientes de cáncer. En particular, la presente invención se dirige a métodos para determinar qué pacientes se beneficiarán más de un tratamiento con un inhibidor de quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR-siglas en inglés).

El cáncer es un nombre genérico para una amplia gama de dolencias celulares caracterizadas por un desarrollo desregulado, carencia de diferenciación y la capacidad de invadir tejidos locales y de metastatizarse. Estas dolencias neoplásicas afectan, con diversos grados de prevalencia, a cada tejido y órgano del cuerpo.

A lo largo de las últimas décadas se ha desarrollado una multitud de agentes terapéuticos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Los tipos de agentes anti-cancerígenos, más comúnmente utilizados, incluyen: agentes alquilantes de ADN (p. ej. ciclofosfamida, ifosfamida), antimetabolitos (p. ej. metotrexato, un antagonista de fotalato y 5-fluorouracilo, un antagonista de pirimidina), disruptores de microtúbulos (p. ej. vincristina, vinblastina, paclitaxel), intercaladores de ADN (p. ej. doxorubicina, daunomicina, cisplatino) y terapia con hormonas (p. ej. tomoxifen, flutamida).

La familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) comprende cuatro receptores estrechamente relacionados (HER1/EGFR, HER2, HER3 y HER4) implicados en respuestas celulares, tales como diferenciación y proliferación. La sobre-expresión de la quinasa de EGFR, o de su ligando TFG-alfa, está frecuentemente asociada con muchos cánceres, incluidos cánceres de mama, pulmón, colorrectal, de ovarios, de células renales, de vejiga, de cabeza y cuello, glioblastomas y astrocitomas, y se piensa que contribuye en el desarrollo maligno de estos tumores. También se ha encontrado que una mutación por deleción específica en el gen de EGFR (EGFRvIII) incrementa la tumogeniciad celular. La activación de vías de señalización estimuladas por EGFR fomenta múltiples procesos que son en potencia promotores del cáncer, por ejemplo proliferación, angiogénesis, motilidad e invasión celular, apoptosis disminuida e inducción de resistencia a fármacos. La expresión de HER1/EGFR incrementada está frecuentemente ligada a una enfermedad en estado avanzado, metástasis y una prognosis deficiente. Por ejemplo, en NSCLC y cáncer gástrico, la expresión incrementada de HER1/EGFR ha demostrado correlacionarse con una elevada tasa metastásica, una deficiente diferenciación del tumor y una proliferación incrementada del tumor.

Mutaciones que activan la actividad de la proteína tirosina quinasa intrínseca del receptor y/o aumentan la señalización situada más abajo ha sido observada en NSCLC y glioblastoma. Sin embargo, ha suscitado polémica el papel de mutaciones como un mecanismo principal para conferir sensibilidad a inhibidores del receptor de EGF, por ejemplo erlotinib (TARCEVA^{TM}) o gefitinib (IRESSA^{TM}). Recientemente, se ha informado que una forma mutante del receptor de EGF de longitud completa predice la capacidad de respuesta al inhibidor de tirosina quinasa del receptor de EGF gefitinib (Paez. J.G. et al. (2004) Science 304: 1497-1500; Lynch, T.J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350: 2129-2139). Estudios con cultivos de células han demostrado que líneas celulares que expresan la forma mutante del receptor de EGF (es decir H3255) eran más sensibles a la inhibición del crecimiento por parte del inhibidor de tirosina quinasa del receptor de EGF gefitinib, y que se requerían concentraciones de gefitinib mucho más elevadas para inhibir las líneas de células tumorales que expresan el receptor de EGF de tipo salvaje. Esas observaciones sugieren que formas mutantes específicas del receptor de EGF pueden reflejar una mayor sensibilidad a inhibidores del receptor de EGF, pero no identifican un fenotipo que carezca por completo de respuesta.

El desarrollo para uso como agentes anti-tumorales de compuestos que inhiben directamente la actividad de quinasa del EGFR, así como anticuerpos que reducen la actividad de quinasa de EGFR bloqueando la activación de EGFR son sectores de intenso esfuerzo de investigación (de Bono J.S. y Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8: págs 19-26; Dancey, J. y Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2: 92-313). Varios estudios han demostrado, descrito o sugerido que algunos inhibidores de quinasa del EGFR podrían mejorar el exterminio de células tumorales o de neoplasia cuando se utilizan en combinación con otros determinados agentes o tratamientos anti-cancerígenos o quimioterapéuticos (p. ej. Herbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther, 1: 719-732; Solomon, B. et al (2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55: 713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13; Grunwald, V. e Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95: 851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6): 658-666; Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticanncer Ther. 3: 367-380, Bulgaru, A. M. et al. (2003) Expert Rev. Anticanncer Ther. 3: 269-279; Dancey, J. y Sausville, E. A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2: 92-313; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6: 2053-2063; y Publicación de Patente nº: US 2003/0157104).

Erlotinib (p. ej. erlotinib HCl, también conocido como TARCEVA^{TM}u OSI-774) es un inhibidor de la quinasa de EGFR oralmente disponible. In vitro, erlotinib ha demostrado una actividad inhibidora sustancial frente a quinasa del EGFR en un cierto número de líneas de células tumorales humanas, incluido cáncer colorrectal y de mama (Moyer J. D. et al. (1997) Cancer Res. 57: 4838) y una evaluación preclínica ha demostrado actividad de un cierto número de xenoinjertos de tumores humanos que expresan EGFR (Pollack, V. A. et al. (1999), J. Pharmacol. Exp. Ther. 291: 739). Más recientemente, erlotinib ha demostrado una actividad prometedora en ensayos de fase I y II en un cierto número de indicaciones, incluido el cáncer de cabeza y cuello. (Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 77), NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20: 310a, resumen 1235), CRC (Oza, M., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 196a, resumen 785) y MBC (Winer, E., et al. (2002) Breast Cancer Res. Treat. 76: 5115a, resumen 445). En un ensayo de fase III, la monoterapia con erlotinib prolongó significativamente la supervivencia, retardó el progreso de la enfermedad y retardó el empeoramiento de síntomas relacionados con el cáncer de pulmón en pacientes con NSCLC avanzado, refractario al tratamiento (Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology 22: 14S (suplemento del 15 de julio), resumen 7022). Mientras que la mayoría de los datos de ensayos clínicos para erlotinib se refieren a su uso en NSCLC, resultados preliminares a partir de estudios en fase I/II han demostrado una actividad prometedora para la terapia con erlotinib y una combinación de capecitabina/erlotinib en pacientes con una amplia gama de tipos de tumores sólidos humanos, incluidos CRC (Oza, M., et al. (2003). Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 196a, resumen 785) y MBC (Jones, R. J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22; 45a, resumen 180). En noviembre de 2004, la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos (FDA) aprobó TARCEVA^{TM} para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC-siglas en inglés) avanzado o metastásico tras el fallo de al menos un régimen de quimioterapia anterior. TARCEVA^{TM} es el único fármaco en la clase de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que demuestra en un ensayo clínico en fase III un incremento de la supervivencia en pacientes con NSCLC avanzado.

Un fármaco anti-neoplásico exterminaría de forma ideal células cancerígenas de forma selectiva, con un amplio índice terapéutico en relación con su toxicidad hacia células no malignas. También conservaría su eficacia frente a células malignas, incluso después de exposición prolongada al fármaco. Desgraciadamente, ninguna de las quimioterapias actuales posee un perfil ideal de este tipo. En su lugar, la mayoría poseen índices terapéuticos muy estrechos. Además de ello, células cancerosas expuestas a concentraciones ligeramente sub-letales de un agente quimioterapéutico desarrollarán con mucha frecuencia una resistencia a un agente de este tipo y también con bastante frecuencia una resistencia cruzada a varios otros agentes antineoplásicos. Adicionalmente, para cualquier tipo de cáncer dado, no se puede predecir con frecuencia qué paciente es probable que responda a un tratamiento particular, incluso con terapias más recientes que fijan como objetivo genes, tales como inhibidores de quinasa del EGFR, necesitando así un considerable ensayo y error, a menudo con un riesgo y molestias considerables sobre el paciente, con el fin de encontrar la terapia más eficaz.

Así, existe la necesidad de un tratamiento más eficaz para la neoplasia y otros trastornos proliferativos y de medios más eficaces para determinar qué tumores responderán a qué tratamiento. Estrategias para reforzar la eficacia terapéutica de los fármacos existentes han implicado cambios en el programa de su administración, y también su uso en combinación con otros agentes anticancerígenos o moduladores bioquímicos. La terapia de combinación es bien conocida como un método que puede resultar en una mayor eficacia y en efectos secundarios reducidos en relación con el uso de la dosis terapéuticamente relevante de cada uno de los agentes por sí solo. En algunos casos, la eficacia de la combinación del fármaco es aditiva (la eficacia de la combinación es aproximadamente igual a la suma de los efectos de cada uno de los fármacos por sí solos), pero en otros casos el efecto es sinérgico (la eficacia de la combinación es mayor que la suma de los efectos de cada uno de los fármacos administrados individualmente).

Planteamientos terapéuticos específicos para dianas, tales como erlotinib, están generalmente asociados a una toxicidad reducida en comparación con agentes citotóxicos convencionales y, por lo tanto, conducen por sí mismos al uso en regímenes de combinación. Se han observado resultados prometedores en estudios de fase I/II de erlotinib en combinación con bevacizumab (Mininberg. E. D. et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 627a, resumen 2521) y gemcitabina (Dragovich, T., (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22: 223a, resumen 895). Datos recientes en ensayos de fase III de NSCLC han demostrado que erlotinib o gefitinib de primera línea, en combinación con una quimioterapia convencional, no mejoraban la supervivencia (Gatzemeier, U., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23: 617 (resumen 7010); Herbst, R.S., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23: 617 (resumen 7011); Giaccone, G., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 777; Herbst, R., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22: 785). Sin embargo, ensayos de fase III de cáncer pancreático han demostrado que erlotinib de primera línea, en combinación con gemcitabina, mejoraban la supervivencia (OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche Pharmaceuticals Press Release, 9/20/04).

Matar Pablo et al. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 1 de octubre de 2004, vol. 10, nº 19, páginas 6487-6501 describen un cierto número de genes que son regulados diferencialmente tras la fijación combinada como objetivo de EFGR con el inhibidor de tirosina quinasa gefitinib y el anticuerpo monoclonal cetuximab.

Varios grupos han investigado biomarcadores potenciales para predecir una respuesta del paciente a inhibidores de EGFR (véanse, por ejemplo, las publicaciones PCT: WO 2004/063709, WO 2005/017493, WO 2004/111273, WO 2004/071572, WO 2005/117553 y WO 2005/070020; y las solicitudes de patente US publicadas: US 2005/0019785 y US 2004/0132097). Sin embargo, todavía no han emergido ensayos de diagnóstico o pronóstico que puedan guiar a los médicos practicantes en el tratamiento de sus pacientes con inhibidores de quinasa del EGFR.

Durante la mayoría de las metástasis del cáncer, se produce un importante cambio en una célula tumoral, conocido como la transición epitelial-mesenquimal (EMT-siglas en inglés) (Thiery, J. P. (2002) Nat. Rev. Cancer 2: 442-454; Savagner, P. (2001) Bioessays 23: 912-923; Kang Y. y Massague, J. (2004) Cell 118: 277-279; Julien-Grille, S., et al. Cancer Research 63: 2172-2178; Bates, R. C. et al. (2003) Current Biology 13: 1721-1727; Lu Z., et al. (2003) Cancer Cell. 4(6) 499-515)). Las células epiteliales que están unidas apretadamente entre sí y exhiben polaridad, dan lugar a células mesenquimales que están mantenidas juntas entre sí de forma más suelta, exhiben una pérdida de polaridad y tienen la capacidad de trasladarse. Estas células mesenquimales pueden diseminarse en tejidos que rodean al tumor original, así como separarse del tumor, invadir la sangre y los vasos linfáticos y trasladarse a nuevas localizaciones en las que se dividen y forman tumores adicionales. La EMT no se produce en células sanas, excepto durante la embriogénesis. En circunstancias normales, TGF-\beta actúa como un inhibidor del crecimiento. Sin embargo, se piensa que durante la metástasis del cáncer TGF-\beta comienza a fomentar la EMT.

Así, siguen siendo una necesidad crítica métodos mejorados para determinar el mejor modo de tratamiento para cualquier paciente de cáncer dado y para la incorporación de determinaciones de este tipo en regímenes de tratamiento más eficaces para pacientes de cáncer, ya se utilicen inhibidores de este tipo como agentes sencillos o combinados con otros agentes anticancerígenos.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona métodos de diagnóstico y pronóstico para predecir la eficacia del tratamiento de un paciente de cáncer con un inhibidor de la quinasa del EGFR. En base al sorprendente descubrimiento de que la sensibilidad del crecimiento de células tumorales a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR depende de si dichas células tumorales han sufrido una EMT, se han concebido métodos para determinar biomarcadores epiteliales y mesenquimales para predecir la sensibilidad de células tumorales a inhibidores de quinasa del EGFR.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad del crecimiento de células tumorales a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: confirmar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; confirmar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad del crecimiento de células tumorales a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en donde una elevada relación de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR.

También se proporcionan métodos mejorados para tratar pacientes de cáncer con inhibidores de quinasa del EGFR que incorporan la metodología anterior. Así, la presente invención proporciona, además, un método para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente, que comprende las etapas de diagnosticar una posible capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR, confirmando si las células tumorales han sufrido una transición epitelial-mesenquimal, y administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Actividad in vivo de erlotinib frente a xenoinjertos de NSCL.

Figura 2: A. El perfilado proteómico de líneas de NSCLC, sensibles o relativamente insensibles a la inhibición de la quinasa del EGFR in vitro mostraron una detección acusadamente incrementada por LC-MS/MS de péptidos de vimentina y fibronectina en líneas celulares relativamente insensibles a erlotinib. B. Líneas de NSCLC sensibles a la inhibición del receptor de EGF expresan niveles elevados de E-cadherina, con tendencias observadas para \gamma- y \alpha-cateninas. Se llevaron a cabo inmunotransferencias de E-cadherina con dos anticuerpos distintos con resultados similares (datos no mostrados). Líneas de NSCLC relativamente insensibles a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib expresaban las proteínas mesenquimales vimentina y/o fibronectina. No se observó relación alguna entre la expresión total de la proteína del receptor de EGF y la sensibilidad, a pesar de que todas las líneas sometidas a ensayo expresaban el receptor de EGF detectable. C. Microscopía confocal de líneas de NSCLC sensibles a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib, H292 y H441, mostrando una expresión en la membrana de E-cadherina, pero ninguna en las líneas celulares Calu6 y H1703 que son relativamente insensibles a erlotinib. A la inversa, las líneas relativamente insensibles Calu6 y H1703 expresaban una tinción del filamento intermedia para vimentina, mientras que no lo hacían las líneas sensibles a erlotinib H292 y H441.

Figura 3: Líneas de NSCLC se desarrollaron en forma de xenoinjertos subcutáneos en ratos SCID hasta un volumen de \sim500 mm^{3}, se eliminaron y congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido (4 animales por línea celular). El tejido tumoral se pulverizó al tiempo que se congelaba, se sometió a lisis con detergente y SDS-PAGE según se describe, e inmunotransferencias se sondaron con anticuerpos contra E-cadherina, \gamma-catenina, Brk, fibronectina, vimentina y GAPDH. Consistente con los resultados in vitro, la expresión de E-cadherina se restringió a líneas sensibles a erlotinib, y fibronectina a líneas relativamente sensibles.

Figura 4: Inmunotransferencia que muestra mayores niveles de expresión de Brk en líneas de células NSCLC que son lo más sensibles a la inhibición por quinasa del EGFR.

Figura 5: A) Líneas de células pancreáticas sensibles a la inhibición del receptor de EGF expresan niveles elevados de las proteínas de adhesión de células epiteliales de E-cadherina y \gamma-catenina. El marcador mesenquimal vimentina aparecía lo más abundantemente en las células PCANC1 insensibles. B) Microscopía confocal de una línea de células pancreáticas sensible a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib, BxPC3, que muestra una expresión en la membrana de E-cadherina pero no en la línea de células MiaPaca2, que es relativamente insensible a erlotinib. Inversamente, la línea MiaPaca2 relativamente insensible expresaba una tinción intermedia del filamento para vimentina, mientras que no lo hacía la línea BxPC3 sensible a erlotinib.

Figura 6a: Curva de Kaplan-Meier que ilustra que el tiempo en la progresión de la enfermedad (TTP-siglas en inglés) es mayor para pacientes que reciben erlotinib en combinación con quimioterapia, en comparación con pacientes que reciben quimioterapia solamente con una intensidad de tinción con E-cadherina de los tumores de >= 2. Figura 6b: Curva de Kaplan-Meier que ilustra que el tiempo en la progresión de la enfermedad (TTP) no se extiende para pacientes con una intensidad de tinción con E-cadherina de los tumores de <= 1, quienes son tratados con erlotinib en combinación con quimioterapia, en comparación con pacientes que reciben quimioterapia solamente.

Descripción detallada de la invención

El término "cáncer" en un animal se refiere a la presencia de células que poseen características típicas de células provocadoras de cáncer, tales como una proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico, rápido crecimiento y tasa de proliferación y determinados rasgos morfológicos característicos. A menudo, células cancerígenas estarán en forma de un tumor, pero dichas células pueden existir solas en un animal, o pueden circular en el torrente sanguíneo en forma de células independientes, tales como células leucémicas.

"Crecimiento anormal de las células", tal como se utiliza en esta memoria, a menos que se indique de otro modo, se refiere al crecimiento de las células que es independiente de mecanismos reguladores normales (por ejemplo pérdida de la inhibición por contacto). Esto incluye el crecimiento anormal de: (1) células tumorales (tumores) que proliferan expresando una tirosina quinasa mutada o la sobreexpresión de una tirosina quinasa receptora; (2) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que se produce una activación aberrante de la tirosina quinasa; (4) cualesquiera tumores que proliferen mediante tirosina quinasas de receptor; (5) cualesquiera tumores que proliferen mediante la activación aberrante de serina/treonina quinasa y (6) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las que se produce una activación aberrante de serina/treonina quinasa.

El término "tratamiento", tal como se utiliza en esta memoria y a menos que se indique de otro modo, significa invertir, aliviar, inhibir el progreso de o prevenir, ya sea parcialmente o por completo, el desarrollo de tumores, metástasis tumorales u otras células provocadoras de cáncer neoplásicas en un paciente. El término "tratamiento", tal como se utiliza en esta memoria y a menos que se indique de otro modo, se refiere al acto de tratar.

La frase "un método de tratar" o su equivalente, cuando se aplica, por ejemplo, al cáncer, se refiere a un proceso o curso de acción que está diseñado para reducir o eliminar el número de células cancerígenas en un animal o para aliviar los síntomas de un cáncer. "Un método para tratar" cáncer u otro trastorno proliferativo no significa necesariamente que las células cancerígenas u otro trastorno vaya a ser de hecho eliminado, que el número de células o trastorno vaya a ser de hecho reducido, o que los síntomas de un cáncer o de otra enfermedad vayan a ser de hecho aliviados. A menudo, un método de tratar el cáncer se llevará a cabo incluso con una baja probabilidad de éxito pero, que dado el historial médico y la expectación de supervivencia estimada de un animal, se considera no obstante un curso de acción beneficioso en general.

La expresión "agente terapéuticamente eficaz" significa una composición que educirá una respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que esté siendo investigado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro doctor.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" significa la cantidad del presente compuesto o combinación que educirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano que esté siendo investigado por el investigador, veterinario, doctor médico u otro doctor.

Los datos que se presentan en los Ejemplos en esta memoria que siguen demuestran que células tumorales, tales como células de NSCLC o cáncer pancreático, que contienen EGFR de tipo salvaje, desarrolladas en un cultivo celular o in vivo, muestran una gama de sensibilidades a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR, que dependen de si han sufrido una transición epitelial a mesenquimal (EMT). Antes de la EMT, las células tumorales son muy sensibles a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR, tales como erlotinib HCl (TARCEVA^{TM}) mientras que células tumorales que han sufrido una EMT son esencialmente menos sensibles a la inhibición por parte de compuestos de este tipo. Los datos indican que la EMT puede ser un "conmutador biológico general" que determina el nivel de sensibilidad de tumores a inhibidores de quinasa del EGFR. Se demuestra que el nivel de sensibilidad de tumores a inhibidores de quinasa del EGFR puede evaluarse determinando el nivel de biomarcadores expresados por una célula tumoral, que son característicos para células ya sea antes o subsiguientemente a un episodio de EMT. Por ejemplo, niveles elevados de la expresión de células tumorales de biomarcadores epiteliales, tales como E-cadherina, indicativos de una célula que no ha sido sometida todavía a una EMT, se correlacionan con una elevada sensibilidad a inhibidores de quinasa del EGFR. Inversamente, altos niveles de expresión de células tumorales de biomarcadores mesenquimales, tales como vimentina o fibronectina, indicativos de que una célula se ha visto sometida a una EMT, se correlacionan con una baja sensibilidad a inhibidores de quinasa del EGFR. Así, estas observaciones pueden formar la base de valiosos métodos nuevos de diagnóstico para predecir los efectos de inhibidores de quinasa del EGFR sobre el desarrollo del tumor, y proporcionar a los oncólogos una herramienta adicional para ayudarles a elegir el tratamiento más apropiado para sus pacientes.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad de desarrollo de una célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad de desarrollo de la célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en donde una elevada relación de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR.

Ejemplos preferidos de biomarcadores epiteliales incluyen E-cadherina y Brk (es decir, PTK-6) (véase la Tabla 1). Ejemplos adicionales de biomarcadores epiteliales que se pueden utilizar en el método de esta invención incluyen \gamma-catenina (es decir plakoglobina de adhesión), \alpha-catenina (es decir \alpha1, \alpha2 o \alpha3-catenina), queratina 8, queratina 18, conexina 31, plakofilina 3, stratafina 1, laminina alfa-5 y ST14 (véase la Tabla 1).

Ejemplos preferidos de biomarcadores mesenquimales incluyen vimentina y fibronectina (véase la Tabla 1). Ejemplos adicionales de biomarcadores mesenquimales que se pueden utilizar en el método de la invención incluyen fibrilina-1, fibrilina-2, colágeno alfa-2(IV), colágeno alfa-2(V), LOXL1, nidogen, C11orf9, tenascina, N-cadherina y fibronectina EDB^{+} embrional, tubulina alfa-3 y epimorfina (véase la Tabla 1).

En la práctica de esta invención, con biomarcadores epiteliales preferidos, el nivel de expresión en células tumorales que son sensibles a inhibidores de quinasa del EGFR se encontrará generalmente a un nivel tan elevado que el biomarcador será muy fácilmente detectable, utilizando, por ejemplo, un anticuerpo específico anti-biomarcador para la detección. Con biomarcadores epiteliales preferidos, el nivel de expresión en células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR se encontrarán generalmente a un nivel tan bajo que el biomarcador será apenas detectable, en caso de que lo sea, utilizando procesos similares (p. ej. en los datos presentados en los Ejemplos que figuran en esta memoria a continuación, compárense los niveles de E-cadherina entre células tumorales sensibles y relativamente insensibles en las Figuras 2B, 3 y 5).

Sin embargo, para otros biomarcadores epiteliales menos preferidos, el nivel de expresión del biomarcador en células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR puede ser fácilmente detectable pero, no obstante, se encontrará a un nivel de expresión sustancialmente inferior que en células tumorales que son sensibles a inhibidores de quinasa del EGFR (p. ej., en los datos presentados en los Ejemplos que figuran en esta memoria a continuación, compárense los niveles de \alpha-catenina para las células tumorales H1703 o SW1573 relativamente insensibles con las células tumorales H441, H358, H322 y H292 sensibles en la Figura 2B).

De manera similar, en la práctica de esta invención, con biomarcadores mesenquimales, el nivel de expresión en células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR se encontrará generalmente a un nivel tan elevado que el biomarcador será muy fácilmente detectable utilizando, por ejemplo, un anticuerpo específico anti-biomarcador para la detección. Con biomarcadores mesenquimales preferidos, el nivel de expresión en células tumorales que son relativamente sensibles a inhibidores de quinasa del EGFR se encontrará generalmente a un nivel tan bajo que el biomarcador será apenas detectable, en caso de que lo sea, utilizando procesos similares (p. ej. en los datos presentados en los Ejemplos que figuran en esta memoria a continuación, compárense los niveles de fibronectina o vimentina entre células tumorales sensibles y relativamente insensibles en las Figuras 2B, 3 y 5).

También, para otros biomarcadores mesenquimales menos preferidos, el nivel de la expresión del biomarcador en células tumorales que son relativamente sensibles a inhibidores de quinasa del EGFR puede ser fácilmente detectable pero, no obstante, se encontrará a un nivel de expresión esencialmente menor que en células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR.

Para cualquier biomarcador epitelial o mesenquimal dado, la gama de nivel de expresión entre células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR y las que son sensibles, se puede evaluar fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo testando en un panel de células tumorales según se describe en esta memoria (p. ej. Figura 2B) o testando en biopsias de tumores de pacientes cuyos tumores exhiben una gama de sensibilidades a un inhibidor de quinasa del EGFR (p. ej. TARCEVA^{TM}).

Para un porcentaje relativamente pequeño de células tumorales que son relativamente insensibles a inhibidores de quinasa del EGFR, métodos para predecir la sensibilidad del desarrollo de la célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende evaluar el nivel de un biomarcador epitelial o mesenquimal expresado por una célula tumoral, en circunstancias en las que solamente se evalúa un nivel sencillo de biomarcador, pueden predecir falsamente que el desarrollo de la célula tumoral es sensible a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR. Por ejemplo, en los datos presentados en los Ejemplos que figuran en esta memoria a continuación, los niveles de los biomarcadores epiteliales \gamma-catenina y \alpha-catenina en células tumorales H460, o el biomarcador mesenquimal fibronectina en células H1703, predicen falsamente una elevada sensibilidad a inhibidores de quinasa del EGFR (véase la Figura 2B). Así, basado en predicciones falsas de este tipo, un médico puede ser conducido a tratar un pequeño número de pacientes con inhibidores de quinasa del EGFR, y el tumor puede no ser sensible al inhibidor. Sin embargo, para una amplia mayoría de células tumorales (p. ej., al menos 90%, de los datos presentados en los Ejemplos que figuran en esta memoria a continuación), sería de esperar que la evaluación de un nivel de expresión sencillo del
biomarcador proporcionara una predicción fiable del nivel de sensibilidad a inhibidores de quinasa del EGFR.

Además, se ha encontrado que ninguna célula tumoral que sea sensible a inhibidores de quinasa del EGFR, cuando se somete a ensayo por métodos en los que se evalúa únicamente un nivel sencillo de biomarcador, dé una predicción falsa de que el desarrollo de la célula tumoral sea insensible a la inhibición por un inhibidor de quinasa del EGFR. Así, utilizando los métodos de ensayo descritos en esta memoria, no se conduciría jamás a un doctor a no revelar el tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR en los casos en los que el paciente se pueda beneficiar de un tratamiento de este tipo.

Además, un experto en la técnica médica, particularmente perteneciente a la aplicación de ensayos diagnósticos y tratamiento con agentes terapéuticos, reconocerá que los sistemas biológicos son en cierto modo variables y no siempre enteramente predecibles y, así, ocasionalmente, son ineficaces muchos ensayos de diagnóstico o agentes terapéuticos buenos. Así, en última instancia, el juicio del médico que atienda el caso será el que determine el curso de tratamiento más apropiado para un paciente individual, basado en los resultados del ensayo, el estado e historial del paciente y su propia experiencia. Incluso, puede haber ocasiones, por ejemplo cuando un médico elija tratar un paciente con un inhibidor de quinasa del EGFR, incluso cuando no se haya predicho que un tumor sea particularmente sensible a inhibidores de quinasa del EGFR, basado en los datos de ensayos diagnósticos o de otros criterios, particularmente si han fallado la totalidad o mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias, o si se anticipa cualquier sinergia cuando se administra con otro tratamiento. El hecho de que los inhibidores de quinasa del EGFR, como una clase de fármacos, sea relativamente bien tolerada en comparación con muchos otros fármacos anticancerígenos, tales como una mayor qui-
mioterapia tradicional o agentes citotóxicos utilizados en el tratamiento del cáncer, hacen a esta opción más viable.

Ejemplos preferidos de biomarcadores epiteliales adecuados para uso en esta invención, tales como E-cadherina, no conducen a predicciones falsas de ningún tipo cuando se utilizan en métodos en los que se evalúa solamente un nivel sencillo de biomarcador.

Esta invención proporciona métodos en los que se utiliza una evaluación simultánea del nivel de expresión en células tumorales de más de un nivel de biomarcador. En realizaciones preferidas de estos métodos (descritas en lo que sigue), no existe nivel de falsa predicción, como es el caso de algunos de los métodos en los que se evalúa un nivel sencillo de expresión del biomarcador.

La presente invención también proporciona un método para predecir la sensibilidad del desarrollo de células tumorales a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad del desarrollo de la célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en el que una relación elevada de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR. En una realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende Brk y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende vimentina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende \gamma-catenina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

La presente invención también proporciona un método para predecir la sensibilidad del desarrollo de un tumor a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad del desarrollo del tumor a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en el que una relación elevada de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR. En una realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende Brk y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende vimentina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende \gamma-catenina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

La presente invención también proporciona un método para predecir si un paciente de cáncer está afectado por un tumor que responderá eficazmente al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por células del tumor; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por células del tumor; y predecir si el tumor responderá eficazmente al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR, en el que una relación elevada de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con un tumor que responderá eficazmente al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR. En una realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende Brk y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende vimentina. En otra realización preferida de este método, el biomarcador epitelial comprende \gamma-catenina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

En el contexto de los métodos de esta invención, biomarcadores expresados por una célula tumoral pueden incluir marcadores moleculares y celulares que indican el estado de transición de la célula tumoral. En una realización preferida, el biomarcador es una proteína marcadora individual o su ARNm codificante, característica del estado de transición particular del tumor, es decir un tumor que exhibe características epiteliales o mesenquimales. En una realización alternativa, en determinadas circunstancias el biomarcador puede ser un patrón morfológico característico producido en la célula tumoral por macromoléculas celulares que es característico de un estado epitelial o mesenquimal.

TABLA 1 Identificación del gen biomarcador molecular

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La Tabla 1 lista los genes que codifican ejemplos de biomarcadores moleculares que pueden utilizarse en la práctica de los métodos de la invención descritos en esta memoria. Los biomarcadores moleculares pueden incluir cualquier producto expresado por estos genes, incluidas variantes de los mismos, p. ej. ARNm o proteína expresado, variantes de corte y empalme, proteínas modificadas co- y post-traducción, variantes polimórficas, etc. En una realización, el biomarcador es la fibronectina EDB^{+} embrional, una variante de corte y empalme expresada por el gen de fibronectina 1 (Kilian, O. et al. (2004) Bone 35(6): 1334-1345). Una posible ventaja de determinar esta forma fetal de fibronectina es que se pueden distinguir fácilmente tumores similares a los mesenquimales a partir del tejido del estroma circundante. En una realización adicional, el biomarcador puede ser un homólogo animal del producto génico humano (p. ej. de perro, ratón, rata, conejo, gato, mono, simio, etc.).

En los métodos descritos en esta memoria, la célula tumoral procederá, típicamente, de un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer, un estado precanceroso u otra forma de desarrollo anormal de las células, y que necesita tratamiento. El cáncer puede ser cáncer de pulmón (p. ej. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC-siglas en inglés)), cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovarios o cualquiera de una diversidad de otros cánceres descritos en lo que sigue en esta memoria. El cáncer es preferiblemente uno que se sabe que es potencialmente tratable con un inhibidor de quinasa del EGFR.

En los métodos de esta invención, el nivel de expresión del biomarcador se puede evaluar con relación a una molécula control, cuyo nivel de expresión permanece constante a lo largo de la EMT, o cuando se comparan células tumorales que expresan estados de transición epitelial o mesenquimal según se indica por biomarcadores moleculares (p. ej. un gen "housekeeping" (gen de referencia o de control interno) tal como GAPDH, \beta-actina, tubulina o similar). El nivel de expresión del biomarcador también se puede evaluar con relación al otro tipo de biomarcador de célula tumoral (es decir, epitelial en comparación con mesenquimal), o con el nivel de biomarcador en células no tumorales del mismo tejido, u otra fuente de células o tejidos utilizada como una referencia de ensayo.

En los métodos de esta invención, el nivel de un biomarcador epitelial o mesenquimal expresado por una célula tumoral se puede evaluar utilizando cualquiera de los procesos de bioensayo convencionales conocidos en la técnica para la determinación del nivel de expresión de un gen, incluido, por ejemplo, ELISA, RIA, inmunoprecipitación, inmunotransferencia, microscopía de inmunofluorescencia, RT-PCR, hibridación in situ, micromatriz ("microarray") de ADNc o similar, según se describe con mayor detalle en lo que sigue.

En los métodos de esta invención, el nivel de expresión de un biomarcador epitelial o mesenquimal de una célula tumoral se evalúa preferiblemente sometiendo a ensayo una biopsia del tumor. Sin embargo, en una realización alternativa, el nivel de expresión del biomarcador de la célula tumoral se puede evaluar en fluidos o excreciones corporales que contienen niveles detectables de biomarcadores que proceden del tumor o de células tumorales. Fluidos o excreciones corporales, útiles en la presente invención, incluyen sangre, orina, saliva, heces, fluido pleural, fluido linfático, esputo, ascitis, fluido prostático, fluido cerebroespinal (CSF-siglas en inglés) o cualquier otra secreción corporal o derivado de la misma. Por sangre se quiere dar a entender que incluye sangre entera, plasma, suero o cualquier derivado de la sangre. La evaluación de biomarcadores epiteliales o mesenquimales de tumores en fluidos o excreciones corporales de este tipo se puede a veces preferir en circunstancias en las que sea inapropiado o inconveniente un método de muestreo invasivo.

En los métodos de esta invención, la célula tumoral puede ser una célula tumoral de cáncer de pulmón (p. ej. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)), una célula tumoral de cáncer pancreático, una célula tumoral de cáncer de mama, una célula tumoral de cáncer de cabeza y cuello, una célula tumoral de cáncer gástrico, una célula tumoral de cáncer de colon, una célula tumoral de cáncer de ovarios, o una célula tumoral procedente de cualquiera de una diversidad de otros cánceres según se describe a continuación en esta memoria. La célula tumoral es preferiblemente de un tipo que se sabe o espera que exprese quinasa del EGFR, como lo hacen todas las células tumorales procedentes de tumores sólidos. La quinasa del EGFR puede ser de tipo salvaje o una forma mutante.

En los métodos de esta invención, el inhibidor de quinasa del EGFR puede ser cualquier inhibidor de quinasa del EGFR según se describe a continuación en esta memoria, pero preferiblemente es 6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]-(3-etinilfenil)amina (también conocida como erlotinib, OSI-774 o TARCEVA^{TM} (erlotinib HCl), incluidas sales o polimorfos farmacéuticamente aceptables de la misma.

Los siguientes métodos representan realizaciones adicionales específicas del método de la invención.

La presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad del desarrollo de una célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR que comprende: determinar el nivel de la célula tumoral de al menos un polipéptido del biomarcador epitelial; determinar el nivel de la célula tumoral de al menos un polipéptido del biomarcador mesenquimal; comparar el nivel de al menos un polipéptido del biomarcador epitelial con el nivel de al menos un polipéptido del biomarcador mesenquimal; en el que una elevada relación de polipiéptido del biomarcador epitelial a polipéptido del biomarcador mesenquimal indica una elevada sensibilidad pronosticada del desarrollo de la célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR. Para este método, ejemplos de polipéptidos de biomarcador epitelial útiles incluyen E-cadherina, \gamma-catenina, queratina 8, queratina 18, conexina 31, plakofilina 3, stratafina 1, laminina alfa-5, ST14 y Brk. Para este método, ejemplos de polipéptidos del biomarcador mesenquimal útiles incluyen vimentina y fibronectina.

La presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad del desarrollo de una célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: determinar el nivel de la célula tumoral de al menos un polinucleótido del biomarcador epitelial que codifica un polipéptido; determinar el nivel de la célula tumoral de al menos un polinucleótido del biomarcador mesenquimal que codifica un polipéptido; comparar el nivel de al menos un polinucleótido del biomarcador epitelial con el nivel de al menos un polinucleótido del biomarcador mesenquimal; en el que una elevada relación de polinucleótido del biomarcador epitelial a polinucleótido del biomarcador mesenquimal indica una elevada sensibilidad pronosticada del desarrollo de la célula tumoral a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR. Para este método, ejemplos de polipéptidos útiles codificados por el polinucleótido del biomarcador epitelial incluyen E-cadherina, \gamma-catenina, queratina 8, queratina 18, conexina 31, plakofilina 3, stratafina 1, laminina alfa-5, ST14 y Brk. Para este método ejemplos de polipéptidos útiles codificados por el polinucleótido del biomarcador mesenquimal incluyen vimentina y fibronectina.

La presente invención proporciona un método para evaluar si un paciente de cáncer está afectado por un cáncer que responderá de un modo eficaz al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR, comprendiendo el método comparar: el nivel de expresión de un biomarcador epitelial en una muestra del paciente; y el nivel de expresión de un biomarcador mesenquimal en una muestra del paciente, en el que una elevada relación de la expresión del biomarcador epitelial al nivel de expresión del biomarcador mesenquimal es un indicativo de que el paciente está afectado por un cáncer que es probable que responda eficazmente al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR. Para este método, ejemplos de biomarcadores epitelial útiles incluyen E-cadherina, \gamma-catenina, queratina 8, queratina 18, conexina 31, plakofilina 3, stratafina 1, laminina alfa-5, ST14 y Brk, y ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Para este método ejemplos de biomarcadores mesenquimales útiles incluyen vimentina y fibronectina, y ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.

En cualquiera de los métodos anteriores que se refieren a una muestra del paciente, un ejemplo de una muestra de este tipo puede ser una biopsia del tumor.

La presente invención proporciona un método para determinar en un paciente con un tumor la probabilidad de que dicho paciente vaya a mostrar un beneficio de supervivencia relativamente larga con una terapia con un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: determinar el nivel de uno o más biomarcadores epiteliales de las células del tumor, comparar dicho nivel con el nivel de expresión del biomarcador epitelial en un control no tumoral o con el nivel de un polipéptido o ácido nucleico control en la muestra del tumor, y determinar si las células del tumor contienen un nivel relativamente alto de uno o más biomarcadores epiteliales, determinar el nivel de uno o más biomarcadores mesenquimales de las células del tumor, comparar dicho nivel con el nivel de la expresión del biomarcador mesenquimal en un control no tumoral, o con el nivel de un polipéptido o ácido nucleico control en la muestra del tumor, y determinar si las células del tumor contienen un nivel relativamente bajo de uno o más biomarcadores mesenquimales, en el que un elevado nivel de uno o más biomarcadores epiteliales y un bajo nivel de uno o mas biomarcadores mesenquimales es indicativo de que un paciente con un tumor mostrará un beneficio de supervivencia relativamente larga con una terapia con un inhibidor de quinasa del EGFR.

Para la evaluación de la expresión del biomarcador epitelial o mesenquimal de una célula tumoral, en los métodos de la presente invención se pueden utilizar muestras de pacientes que contengan células tumorales, o proteínas o ácidos nucleicos producidos por estas células tumorales. En estas realizaciones, el nivel de expresión del biomarcador se puede confirmar evaluando la cantidad (p. ej., cantidad o concentración absoluta) del marcador en una muestra de célula tumoral, p. ej. una biopsia del tumor obtenida de un paciente, u otra muestra del paciente que contiene material derivado del tumor (p. ej. sangre, suero, orina u otros fluidos o excreciones corporales según se describe antes en esta memoria). Naturalmente, la muestra celular puede someterse a una diversidad de técnicas preparativas y de almacenamiento post-recogida bien conocidas (p. ej., extracción de ácidos nucleicos y/o proteínas, fijación, almacenamiento, congelación, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de evaluar la cantidad del marcador en la muestra. De igual manera, también biopsias de tumores pueden someterse a técnicas preparativas y de almacenamiento post-recogida, p. ej. fijación.

En los métodos de la invención, se puede detectar la expresión de proteínas del biomarcador que tengan al menos una porción que se exhiba sobre la superficie de células tumorales que la expresen. Es una cuestión simple para el experto determinar si una proteína marcada, o una porción de la misma, queda expuesta sobre la superficie de la célula. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos inmunológicos para detectar proteínas de este tipo sobre células enteras, o métodos de análisis de la secuencia basados en ordenador, bien conocidos, se pueden utilizar para predecir la presencia de al menos un dominio extracelular (es decir, que incluya tanto proteínas secretadas como proteínas que tengan al menos un dominio sobre la superficie de la célula). La expresión de una proteína marcadora que tenga al menos una porción que se exhiba sobre la superficie de la célula que la exprese se puede detectar sin lisar necesariamente la célula tumoral (p. ej., utilizando un anticuerpo marcado que se une específicamente con un dominio de la superficie de la célula de la proteína).

La expresión de biomarcadores descritos en esta invención se puede evaluar por cualquiera de una amplia diversidad de métodos bien conocidos para detectar la expresión de un ácido nucleico o proteína transcrito. Ejemplos no limitantes de métodos de este tipo incluyen métodos inmunológicos para la detección de proteínas secretadas, en la superficie de la célula, citoplasmáticas o nucleares, métodos de purificación de proteínas, ensayos de la función o actividad de proteínas, métodos de hibridación de ácidos nucleicos, métodos de transcripción inversa de ácidos nucleicos y métodos de amplificación de ácidos nucleicos.

En una realización, la expresión de un biomarcador se evalúa utilizando un anticuerpo (p. ej. un anticuerpo radio-marcado, marcado con cromóforo, marcado con fluoróforo o marcado con enzima), un derivado de anticuerpo (p. ej. un anticuerpo conjugado con un sustrato o con la proteína o ligando de una pareja de proteína-ligando {p. ej., biotina-estreptavidina}) o un fragmento de anticuerpo (p. ej. un anticuerpo de cadena sencilla, un dominio hipervariable de anticuerpo aislado, etc.) que se une específicamente con un biomarcador de proteína o fragmento de la misma, incluido un biomarcador de proteína que ha sufrido la totalidad o una parte de modificaciones post-traducción a las que normalmente se queda sometida en la célula tumoral (p. ej. glicosilación, fosforilación, metilación, etc.).

En otra realización, la expresión de un biomarcador se confirma preparando ARNm/ADNc (es decir, un polinucleótido transcrito) procedente de células en una muestra de paciente, e hibridando el ARNm/ADNc con un polinucleótido de referencia que es un complemento de un ácido nucleico del biomarcador o un fragmento del mismo. Opcionalmente, ADNc se puede amplificar utilizando cualquiera de una diversidad de métodos de reacción en cadena de la polimerasa antes de la hibridación con el polinucleótido de referencia. La expresión de uno o más biomarcadores puede detectarse igualmente utilizando PCR cuantitativa para evaluar el nivel de expresión del o de los biomarcadores. Alternativamente, para detectar la presencia de un biomarcador en un paciente se puede utilizar cualquiera de los muchos métodos conocidos para detectar mutaciones o variantes (p. ej. polimorfismos de nucleótidos sencillos, deleciones, etc.) de un biomarcador de la invención.

En una realización relacionada, una mezcla de polinucleótidos transcritos, obtenidos de la muestra se pone en contacto con un sustrato que tenga fijado al mismo un polinucleótido complementario a u homólogo con al menos una porción (p. ej. al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 500 o más residuos de nucleótido de un ácido nucleico del biomarcador). Si polinucleótidos complementarios u homólogos son diferencialmente detectables sobre el sustrato (p. ej. detectables utilizando cromóforos o fluoróforos diferentes, o fijados a diferentes posiciones seleccionadas), entonces los niveles de expresión de una pluralidad de biomarcadores se puede confirmar simultáneamente utilizando un único sustrato (p. ej. una micromatriz de "chip de genes" de polinucleótidos fijados en posiciones seleccionadas). Cuando se utiliza un método para evaluar la expresión del biomarcador que implica la hibridación de un ácido nucleico con otro, se prefiere que la hibridación se realice en condiciones de hibridación estrictas.

Cuando en los métodos de la invención se utiliza una pluralidad de biomarcadores de la invención, el nivel de expresión de cada biomarcador en una muestra del paciente se puede comparar con el nivel normal de expresión de cada uno de la pluralidad de biomarcadores en muestras no cancerosas del mismo tipo, ya sea en una mezcla de reacción sencilla (es decir, utilizando reactivos, tales como diferentes sondas fluorescentes, para cada biomarcador) o en mezclas de reacción individuales que corresponden a uno o más de los biomarcadores.

El nivel de expresión de un biomarcador en tejido humano normal (es decir, no canceroso) se puede confirmar de una diversidad de maneras. En una realización, este nivel normal de expresión se confirma evaluando el nivel de expresión del biomarcador en una porción de células que parecen ser no cancerosas, y comparando luego este nivel normal de expresión con el nivel de expresión en una porción de las células tumorales. De forma alternativa y, en particular, a medida que se vuelve disponible información adicional como resultado del comportamiento rutinario de los métodos descritos en esta memoria, se pueden utilizar valores medios de población para la expresión normal de los biomarcadores de la invención. En otras realizaciones, el nivel "normal" de expresión de un biomarcador se puede determinar evaluando la expresión del biomarcador en una muestra del paciente obtenida de un paciente no afectado por cáncer, de una muestra de paciente obtenida de un paciente antes del sospechado brote del cáncer en el paciente, a partir de muestras archivadas del paciente, y similares.

Un método ejemplar para detectar la presencia u ausencia de un biomarcador de proteína o de ácidos nucleicos en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica (p. ej. un fluido corporal asociado al tumor) de un sujeto de ensayo, y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el polipéptido o ácido nucleico (p. ej. ARNm, ADN genómico o ADNc). Los métodos de detección de la invención se pueden utilizar, así, para detectar ARNm, proteína, ADNc o ADN genómico, por ejemplo en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, técnicas in vitro para la detección de ARNm incluyen hibridaciones de Northern e hibridaciones in situ. Técnicas in vitro para la detección de una biomarcador de proteína incluyen análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISAs), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Técnicas in vitro para la detección de ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Técnicas in vivo para la detección de ARNm incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-siglas en inglés), hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Además, técnicas in vivo para la detección de una biomarcador de proteína incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra la proteína o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo, cuya presencia y localización en un sujeto se puede detectar mediante técnicas convencionales de formación de imágenes.

Un principio general de ensayos de diagnóstico y pronóstico de este tipo implica preparar una muestra o mezcla de reacción que puede contener un biomarcador, y una sonda, en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para permitir que el biomarcador y la sonda interactúen y se unan, formando así un complejo que se puede separar y/o detectar en la mezcla de reacción. Estos ensayos se pueden llevar a cabo de una diversidad de maneras.

Por ejemplo, un método de llevar a cabo un ensayo de este tipo implicaría anclar el biomarcador o la sonda sobre un soporte en fase sólida, al que se alude también como un sustrato, y detectar complejos de biomarcador/sonda dianas anclados en la fase sólida al término de la reacción. En una realización de un método de este tipo, una muestra procedente de un sujeto que ha de ser analizada en cuanto a la presencia y/o concentración de biomarcador, se puede anclar sobre un vehículo o soporte en fase sólida. En otra realización, es posible la situación inversa, en la que la sonda se puede anclar a una fase sólida y una muestra procedente de un sujeto se puede dejar que reaccione en forma de un componente no anclado del ensayo.

Existen muchos métodos establecidos de anclar componentes de ensayo a una fase sólida. Éstos incluyen, sin limitación, moléculas de biomarcador o de sonda que se inmovilizan a través de la conjugación de biotina y estreptavidina. Componentes de ensayo biotinilados de este tipo se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida), utilizando técnicas conocidas en la técnica (p. ej. kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.), y se inmovilizan en los pocillos de placas de 96 pocillos revestidas con estreptavidina (Pierce Chemical). En determinadas realizaciones, las superficies con componentes de ensayo inmovilizados se pueden preparar de antemano y almacenar.

Otros vehículos o soportes en fase sólida adecuados para ensayos de este tipo incluyen cualquier material capaz de unir la clase de molécula a la que pertenezca el biomarcador o la sonda. Soportes o vehículos bien conocidos incluyen, pero no se limitan a vidrio, poliestireno, nilón, polipropileno, nilón, polietileno, dextrano, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.

Con el fin de llevar a cabo ensayos con los planteamientos antes mencionados, el componente no inmovilizado se añade a la fase sólida, tras lo cual se ancla el segundo componente. Después de haberse completado la reacción, los componentes que no forman complejos se pueden separar (p. ej. mediante lavado) en condiciones, de manera que cualesquiera complejos formados permanecerán inmovilizados sobre la fase sólida. La detección de complejos de biomarcador/sonda anclados a la fase sólida se puede conseguir en un cierto número de métodos esbozados en esta memoria.

En una realización, la sonda, cuando es el componente de ensayo no anclado, se puede marcar para los fines de detección y lectura del ensayo, ya sea directa o indirectamente, con marcadores detectables comentados en esta memoria y que son bien conocidos para un experto en la técnica.

También es posible detectar directamente la formación del complejo biomarcador/sonda sin una manipulación o marcaje adicional de componente alguno (biomarcador o sonda), por ejemplo utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (es decir FET-siglas en inglés, véase, por ejemplo, Lakowicz et al., pat. de EE.UU. nº 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., pat. de EE.UU. nº 4.868.103). Un marcador fluoróforo en la primera molécula "donante" se selecciona de modo que tras la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por una marca fluorescente en una segunda molécula "aceptora", la cual, a su vez, es capaz de fluorescer debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína "donante" puede utilizar simplemente la energía fluorescente natural de residuos triptófano. Los marcadores se eligen de modo que emitan diferentes longitudes de onda de luz, de modo que el marcador de molécula "aceptora" puede ser diferenciado del de la "donante". Dado que la eficacia de transferencia de energía entre los marcadores está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se pueden confirmar las relaciones espaciales entre éstas. En una situación en la que se produce la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente del marcador de molécula "aceptora" en el ensayo debería ser máxima. Un suceso de unión FET se puede medir convenientemente a través de medios de detección fluorométricos convencionales bien conocidos en la técnica (p. ej. utilizando un fluorímetro).

En otra realización, la determinación de la capacidad de una sonda de reconocer un biomarcador se puede conseguir sin marcar componente de ensayo alguno (sonda o biomarcador) utilizando una tecnología tal como el análisis de la interacción biomolecular (BIA-siglas en inglés) en tiempo real (véase, p. ej., Sjolander, S. y Urbaniczky, C., 1991, Anal. Chem. 63: 2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705). Tal como se utiliza en esta memoria, "BIA" o "resonancia del plasmón en superficie" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (p. ej. BIAcore). Cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un suceso de unión) dan como resultado alteraciones del índice refractario de la luz próxima a la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón en superficie (SPR-siglas en inglés)), dando como resultado una señal detectable que se puede utilizar como un indicativo de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

Alternativamente, en otra realización, se pueden llevar a cabo ensayos de diagnóstico y pronóstico análogos con biomarcador y sonda como solutos en una fase líquida. En un ensayo de este tipo, el biomarcador y la sonda formando complejo se separan de componentes que no forman complejo mediante cualquiera de un cierto número de técnicas convencionales, que incluyen, pero no se limitan a: centrifugación diferencial, cromatografía, electroforesis e inmunoprecipitación. En la centrifugación diferencial, complejos de biomarcador/sonda se pueden separar de componentes del ensayo que no forman complejo a través de una serie de etapas centrífugas, debido a los diferentes equilibrios en sedimentación de complejos, basados en sus diferentes tamaños y densidades (véase, por ejemplo, Rivas, G. y Minton, A. P., 1993, Trends Biochem Sci. 18(8): 284-7). También se pueden utilizar técnicas cromatográficas convencionales para separar moléculas que forman complejo de las que no forman complejo. Por ejemplo, la cromatografía por filtración en gel separa moléculas en base al tamaño y a través de la utilización de una resina de filtración en gel apropiada en un formato de columna, por ejemplo el complejo relativamente mayor se puede separar de los componentes que no forman complejos, relativamente menores. De manera similar, se pueden explotar las propiedades de carga relativamente diferentes del complejo de biomarcador/sonda, en comparación con los componentes que no forman complejo para diferenciar el complejo de componentes que no forman complejo, por ejemplo a través de la utilización de resinas de cromatografía de intercambio de iones. Resinas y técnicas cromatográficas de este tipo son bien conocidas por el experto en la técnica (véase, p. ej., Heegaard, N. H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6): 141-8; Hage, D. S., y Tweed, S. A. J. Cromatogr B Biomed Sci Appl, 10 de octubre de 1997; 699(1-2): 499-525). La electroforesis en gel también se puede emplear para separar componentes de ensayo que forman complejo de componentes no unidos (véase, p. ej. Ausubel et al., comp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987-1999). En esta técnica, complejos de proteínas o ácidos nucleicos se separan en base al tamaño o la carga, por ejemplo. Con el fin de mantener la interacción de unión durante el proceso electroforético, se prefieren típicamente materiales de matriz en gel no desnaturalizantes y condiciones la ausencia de agente reductor. Condiciones apropiadas para el ensayo particular y componentes del mismo serán bien conocidas por un experto en la técnica.

En una realización particular, el nivel de biomarcador de ARNm se puede determinar tanto mediante formatos in situ como in vitro en una muestra biológica utilizando métodos conocidos en la técnica. La expresión "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células, fluidos biológicos y materiales aislados de los mismos, aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Muchos métodos de detección por expresión utilizan ARN aislado. Para métodos in vitro, se puede utilizar cualquier técnica de aislamiento de ARN que no seleccione contra el aislamiento de ARNm para la purificación de ARN procedente de células tumorales (véase, p. ej., Ausubel et al., comp., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987-1999). Adicionalmente, grandes cantidades de muestras de tejidos se pueden fácilmente procesar utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales, como, por ejemplo, el proceso de aislamiento de ARN de una sola etapa de Chomczynski (1989, pat. de EE.UU. nº 4.843.155).

El ARNm aislado se puede utilizar en ensayos de hibridación o amplificación que incluyen, pero no se limitan a análisis de Southern o Northern, análisis de la reacción en cadena de la polimerasa y disposiciones ordenadas (arrays) de sondas. Un método de diagnóstico preferido para la detección de niveles de ARNm implica poner en contacto el ARNm aislado con una molécula de ácido nucleico (sonda) que se pueda hibridar al ARNm codificado por el gen que está siendo detectado. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 y 500 nucleótidos de longitud y es suficiente para hibridarse específicamente en condiciones estrictas a un ARNm o ADN genómico que codifica un biomarcador de la presente invención. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos diagnósticos de la invención se describen en esta memoria. La hibridación de un ARNm con la sonda indica que el biomarcador en cuestión está siendo expresado.

En un formato, el ARNm se inmoviliza sobre una superficie sólida y se pone en contacto con una sonda, por ejemplo haciendo pasar el ARNm aislado sobre un gel de sacarosa y transfiriendo el ARNm del gel a una membrana, tal como nitrocelulosa. En un formato alternativo, la o las sondas se inmovilizan sobre una superficie sólida y el ARNm se pone en contacto con la o las sondas, por ejemplo en una matriz de chip de genes Affymetrix. Un experto puede fácilmente adaptar métodos de detección de ARNm conocidos para uso en la detección del nivel de ARNm codificado por los biomarcadores de la presente invención.

Un método alternativo para determinar el nivel de biomarcador de ARNm en una muestra implica el proceso de amplificación de ácidos nucleicos, p. ej., mediante RT-PCR (la realización experimental recogida en Mullis, 1987, pat. de EE.UU. nº 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189-193), la replicación de la secuencia autosostenida (Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177), Q-beta replicasa (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197), replicación en círculo rodante (Lizardi et al., pat. de EE.UU. nº 5.854.033) o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si este tipo de moléculas están presentes en números muy bajos. Tal como se utiliza en esta memoria, cebadores de amplificación se definen como un par de moléculas de ácido nucleico que se pueden reasociar a la región 5' o 3' de un gen (cadenas plus y menos, respectivamente, o viceversa) y contienen una región corta entre ellas. En general, los cebadores de amplificación son de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos de longitud y flanquean una región de aproximadamente 50 a 200 nucleótidos de longitud. En condiciones apropiadas y con reactivos apropiados, cebadores de este tipo permiten la amplificación de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos flanqueada por los cebadores.

Para métodos in situ, el ARNm no necesita ser aislado de las células tumorales antes de la detección. En métodos de este tipo, una muestra de célula o tejido se prepara/procesa utilizando métodos histológicos conocidos. La muestra se inmoviliza después sobre un soporte, típicamente un portaobjetos, y luego se pone en contacto con una sonda que se puede hibridar a ARNm que codifica el biomarcador.

Como una alternativa a la realización de determinaciones basadas en el nivel de expresión absoluto del biomarcador, las determinaciones se pueden basar en el nivel de expresión normalizado del biomarcador. Niveles de expresión se normalizan corrigiendo el nivel de expresión absoluto del biomarcador al comparar su expresión con la expresión de un gen no es un biomarcador, p. ej. un gen "housekeeping" que es constitutivamente expresado. Genes adecuados para la normalización incluyen genes domésticos, tales como el gen actina, o genes específicos para células epiteliales. Esta normalización permite la comparación del nivel de expresión en una muestra, p. ej., una muestra de un paciente, con otra muestra, p. ej., una muestra no tumoral, o entre muestras de diferentes fuentes.

Alternativamente, el nivel de expresión se puede proporcionar como un nivel de expresión relativa. Para determinar un nivel de expresión relativa de un biomarcador (p. ej. un biomarcador mesenquimal), el nivel de expresión del biomarcador se determina para 10 o más muestras de aislados de células normales frente a cancerígenas, preferiblemente 50 o más muestras, antes de la determinación del nivel de expresión para la muestra en cuestión. Se determina el nivel de expresión medio de cada uno de los genes sometidos a ensayo el número mayor de muestras, y éste se utiliza como un nivel de expresión de línea base para el biomarcador. El nivel de expresión del biomarcador determinado para la muestra de ensayo (nivel absoluto de expresión) se divide luego por el valor de expresión medio obtenido para ese biomarcador. Esto proporciona un nivel de expresión relativo.

En otra realización de la presente invención, se detecta una biomarcador de proteína. Un agente preferido para detectar una biomarcador de proteína de la invención es un anticuerpo capaz de unirse a una proteína de este tipo o a un fragmento de la misma, preferiblemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales o, más preferiblemente, monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto o un fragmento derivado del mismo (p. ej. Fab o F(ab').sub.2). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, enlace físico) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que es directamente marcado. Ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia y marcando en el extremo una sonda de ADN con biotina, de modo que se pueda detectar con estreptavidina marcada de modo fluorescente.

Proteínas procedentes de células tumorales se pueden aislar utilizando técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos de aislamiento de las proteínas empleados pueden ser, por ejemplo, tales como los descritos en Harlow y Lane (Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

Se puede emplear una diversidad de formatos para determinar si una muestra contiene una proteína que se une a un anticuerpo dado. Ejemplos de formatos de este tipo incluyen, pero no se limitan a inmunoensayo de enzima (EIA), radioinmunoensayo (RIA), análisis de transferencia Western y análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA). Un experto puede fácilmente adaptar métodos de detección de proteína/anticuerpo conocidos para uso en la determinación de si células tumorales expresan un biomarcador de la presente invención.

En un formato, se pueden utilizar anticuerpo o fragmentos o derivados de anticuerpo en métodos tales como transferencias Western o técnicas de inmunofluorescencia para detectar las proteínas expresadas. En usos de este tipo, es generalmente preferible inmovilizar el anticuerpo o las proteínas sobre un soporte sólido. Soportes o vehículos en fase sólida adecuados incluyen cualquier soporte capaz de unir un antígeno o un anticuerpo. Soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilón, amilasas, celulosas naturales o modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita.

Un experto en la técnica conocerá muchos otros vehículos adecuados para unir anticuerpo o antígeno, y será capaz de adaptar un soporte de este tipo para uso con la presente invención. Por ejemplo, proteína aislada de células tumorales se puede hacer pasar sobre una electroforesis en gel de poliacrilamida e inmovilizarla sobre un soporte en fase sólida, tal como nitrocelulosa. Después, el soporte se puede lavar con tampones adecuados, seguido de tratamiento con el anticuerpo marcado de forma detectable. El soporte en fase sólida se puede lavar luego con el tampón una segunda vez para separar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcador unido sobre el soporte sólido puede entonces detectarse por medios convencionales.

Para análisis ELISA, parejas de unión específicas pueden ser del tipo inmune o no inmune. Parejas de unión específicas inmunes se ejemplifican por los sistemas de antígeno-anticuerpo o sistemas de hapteno/anti-hapteno. Se pueden mencionar fluoresceína/anti-fluoresceína, dinitrofenilo/anti-dinitrofenilo, biotina/anti-biotina, péptido/anti-péptido y similares. El miembro de anticuerpo de la pareja de unión específica se puede producir por métodos habituales, familiares para los expertos en la técnica. Métodos de este tipo implican inmunizar un animal con el miembro de antígeno de la pareja de unión específica. Si el miembro de antígeno de la pareja de unión específica es no inmunogénico, p. ej., un hapteno, éste se puede acoplar covalentemente a una proteína vehículo para hacerla inmunogénica. Parejas de unión no inmunes incluyen sistemas en los que los componentes comparten una afinidad natural uno por otro, pero no son anticuerpos. Ejemplos de parejas no inmunes son biotina-estreptavidina, factor intrínseco-vitamina B_{12}, proteína de unión a ácido fólico-folato y similar.

Está disponible una diversidad de métodos para marcar covalentemente anticuerpos con miembros de parejas de unión específicas. Los métodos se seleccionan en base a la naturaleza del miembro de la pareja de unión específica, del tipo de enlace deseado y de la tolerancia del anticuerpo a diversas químicas de conjugación. La biotina se puede acoplar covalentemente a anticuerpos utilizando derivados activos comercialmente disponibles. Algunos de éstos son biotina-N-hidroxi-succinimida que se une a grupos amina sobre proteínas; biotina-hidrazida que se une a restos carbohidrato, aldehídos y grupos carboxilo a través de un acoplamiento de carbodiimida; y biotina-maleimida y yodoacetil-biotina que se unen a grupos sulfhidrilo. Fluoresceína se puede acoplar a grupos amina de la proteína utilizando isotiocianato de fluoresceína. Grupos dinitrofenilo se pueden acoplar a grupos de amina de la proteína utilizando sulfato de 2,4-dinitrobenceno ó 2,4-dinitrofluorobenceno. Se pueden emplear otros métodos convencionales de conjugación para acoplar anticuerpos monoclonales a un miembro de una pareja de unión específica, incluido el acoplamiento con dialdehído, con carbodiimida, reticulación homofuncional y reticulación heterobifuncional. El acoplamiento con carbodiimida es un método eficaz de acoplamiento de grupos carboxilo sobre una sustancia a grupos amina sobre otra. El acoplamiento con carbodiimida se facilita utilizando el reactivo 1-etil-3-(dimetil-aminopropil)-carbodiimida (EDAC) comercialmente disponible.

Reticuladores homobifuncionales, incluidos los imidoésteres bifuncionales y ésteres de N-hidroxisuccinimida bifuncionales están comercialmente disponibles y se emplean para el acoplamiento de grupos amina sobre una sustancia a grupos amina sobre otra. Reticuladores heterobifuncionales son reactivos que poseen diferentes grupos funcionales. Los reticuladores heterobifuncionales comercialmente disponibles, más comunes, tienen un éster de N-hidroxisuccinimida reactivo con amina como un grupo funcional y un grupo reactivo con sulfhidrílo como el segundo grupo funcional. Los grupos reactivos con sulfhídrilo más comunes son maleimidas, disulfuros de piridilo y halógenos activos. Uno de los grupos funcionales puede ser un aril-nitreno fotoactivo el cual, tras la irradiación, reacciona con una diversidad de grupos.

El anticuerpo marcado de forma detectable o el miembro marcado de forma detectable de la pareja de unión específica se prepara mediante acoplamiento a un informador, que puede ser un isótopo radiactivo, enzimas, materiales fluorógenos quimioluminiscentes o electroquímicos. Dos isótopos radiactivos comúnmente utilizados son ^{125}I y ^{3}H. Procesos de marcaje isotópico radioactivo convencionales incluyen los métodos de cloramina T, lactoperoxidasa y Bolton-Hunter para ^{125}I y la metilación reductiva para ^{3}H. La expresión "marcada de forma detectable" se refiere a una molécula marcada de modo que pueda ser fácilmente detectada por la actividad enzimática intrínseca del marcador o por la unión al marcador de otro componente que puede por sí mismo ser fácilmente detectado.

Enzimas adecuadas para uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, glucosa oxidasa, luciferasas, incluidas la de la luciérnaga y renilla, \beta-lactamasa, ureasa, proteína fluorescente verde (GFP-siglas en inglés) y lisozima. El marcaje con enzimas se facilita utilizando dialdehído, acoplamiento con carbodiimida, reticuladores homobifuncionales y reticuladores heterobifuncionales tal como se describe antes para el acoplamiento del anticuerpo con un miembro de una pareja de unión específica.

El método de marcaje elegido dependerá de los grupos funcionales disponibles en la enzima y del material a ser marcado, y de la tolerancia de ambos a las condiciones de conjugación. El método de marcaje utilizado en la presente invención puede ser uno, pero no limitado a cualesquiera métodos convencionales actualmente empleados que incluyen los descritos por Engvall y Pearlmann, Immunochemistry 8, 871 (1971), Avrameas y Ternynck, Immunochemistry 8, 1175 (1975), Ishikawa et al., J. Immunoassay 4(3): 209-327 (1983) y Jablonski, Anal. Biochem. 148:199 (1985).

El marcaje se puede conseguir por métodos indirectos tales como utilizando espaciadores u otros miembros de parejas de unión específicas. Un ejemplo de ello, es la detección de un anticuerpo biotinilado con estreptavidina no marcada y enzima biotinilada, añadiéndose estreptavidina y enzima biotinilada ya sea secuencial o simultáneamente. Así, de acuerdo con la presente invención, el anticuerpo utilizado para la detección puede ser directamente marcado de forma detectable con un informador o indirectamente con un primer miembro de una pareja de unión específica. Cuando el anticuerpo está acoplado a un primer miembro de una pareja de unión específica, entonces la detección se efectúa haciendo reaccionar el primer miembro del anticuerpo de un complejo de unión específica con el segundo miembro de la pareja de unión que está marcada o no marcada tal como se ha mencionado antes.

Además de ello, el anticuerpo detector no marcado se puede detectar haciendo reaccionar el anticuerpo no marcado con un anticuerpo marcado, específico para el anticuerpo no marcado. En este caso "marcado de forma detectable", tal como se utiliza antes, se toma para dar a entender que contiene un epítopo mediante el cual se puede unir un anticuerpo específico para el anticuerpo no marcado. Un anti-anticuerpo de este tipo se puede marcar directa o indirectamente utilizando cualquiera de los planteamientos comentados anteriormente. Por ejemplo, el anti-anticuerpo se puede acoplar a biotina, la cual se detecta haciéndola reaccionar con el sistema de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante, comentado anteriormente.

En una realización de esta invención, se utiliza biotina. El anticuerpo biotinilado se hace reaccionar, a su vez, con el complejo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Para efectuar la detección cromogénica se puede utilizar ortofenilendiamina, 4-cloro-naftol, tetrametilbenzidina (TMB), ABTS, BTS o ASA.

En un formato de inmunoensayo para llevar a la práctica esta invención, se utiliza un ensayo de sándwich "en avance" en el que se ha inmovilizado el reactivo de captura, utilizando técnicas convencionales sobre la superficie de un soporte. Soportes adecuados utilizados en ensayos incluyen soportes polímeros sintéticos, tales como polipropileno, poliestireno, poliestireno sustituido, p. ej. poliestireno aminado o carboxilado, poliacrilamidas, poliamidas, poli(cloruro de vinilo), perlas de vidrio, agarosa o nitrocelulosa.

La invención también comprende kits para detectar la presencia de un biomarcador de proteína o de ácidos nucleicos en una muestra biológica. Kits de este tipo se pueden utilizar para determinar si un sujeto que padece o tiene un riesgo incrementado de desarrollar un tumor que es menos susceptible a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado, capaz de detectar un biomarcador de proteína o de ácidos nucleicos en una muestra biológica, y medios para determinar la cantidad de proteína o ARNm en la muestra (p. ej. un anticuerpo que se une a la proteína o un fragmento de la misma o una sonda de oligonucleótidos que se une a ADN o ARNm que codifica la proteína). Kits también pueden incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.

Para kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (p. ej. fijado a un soporte sólido) que se une a un biomarcador de proteína; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo, diferente, que se une a la proteína o al primer anticuerpo y está conjugado a un marcador detectable.

Para kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, p. ej. un oligonucleótido marcado de forma detectable, que se hibrida a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un biomarcador de proteína o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de biomarcador de ácidos nucleicos. El kit también puede comprender, p. ej., un agente tamponador, un conservante o un agente estabilizador de proteínas. El kit puede comprender, además, componentes necesarios para detectar el marcador detectable (p. ej. una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra control o una serie de muestras control que se pueden analizar y comparar con la muestra de ensayo. Cada uno de los componentes del kit pueden estar encerrado en un recipiente individual y la totalidad de los diversos recipientes puede estar dentro de un solo envase, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los análisis realizados utilizando el kit.

La presente invención proporciona, además, un método para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente que comprende las etapas de diagnosticar una probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR evaluando si las células tumorales han sufrido una transición epitelial-mesenquimal, por ejemplo por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria para determinar el nivel de expresión de biomarcadores epiteliales y mesenquimales de las células tumorales y administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR. Para este método, un ejemplo de un inhibidor de quinasa del EGFR preferido sería erlotinib, incluidas sales o polimorfos farmacológicamente aceptables del mismo. En este método, uno o más agentes o tratamientos anti-cancerígenos adicionales se pueden co-administrar de forma simultánea o secuencial con el inhibidor de quinasa del EGFR según se juzgue que sea apropiado por el médico encargado de la administración, dada la predicción de la probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR en combinación con cualesquiera circunstancias adicionales pertenecientes al paciente individual.

Se apreciará por un experto en la técnica médica que la manera exacta de administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR siguiendo una diagnosis de una probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR estará a la discreción del médico que lo atienda. El modo de administración, incluida la dosificación, o combinación con otros agentes anticancerígenos, tiempo y frecuencia de administración, y similares, pueden verse afectados por la diagnosis de la probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR, así como del estado e historial del paciente. Así, incluso pacientes a los que se les han diagnosticado tumores de los que se pronosticó una insensibilidad relativa a inhibidores de quinasa del EGFR pueden seguir beneficiándose del tratamiento con inhibidores de este tipo, particularmente en combinación con otros agentes anticancerígenos o agentes que puedan alterar la sensibilidad del tumor a inhibidores de quinasa del EGFR.

La presente invención proporciona, además, un método para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente, que comprende las etapas de diagnosticar la probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR evaluando si las células tumorales han sufrido una transición epitelial-mesenquimal, por ejemplo por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria para determinar el nivel de expresión de biomarcadores epiteliales y mesenquimales de las células tumorales, identificar que el paciente es uno que es probable que demuestre una respuesta eficaz al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR y administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR.

La presente invención proporciona, además, un método para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente, que comprende las etapas de diagnosticar la probable capacidad de respuesta del paciente a un inhibidor de quinasa del EGFR evaluando si las células tumorales han sufrido una transición epitelial-mesenquimal, por ejemplo por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria para determinar el nivel de expresión de biomarcadores epiteliales y mesenquimales de las células tumorales, identificar al paciente como uno que es menos probable o que no es probable que demuestre una respuesta eficaz al tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR y tratar a dicho paciente con una terapia anticancerígena distinta de la de un inhibidor de quinasa del EGFR.

Agentes que refuerzan la sensibilidad del desarrollo de una célula tumoral a un inhibidor de quinasa del EGFR pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes con cánceres a quienes se pronostica que tienen una menor respuesta a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR (incluido cáncer de pulmón, cáncer pancreático o cualesquiera otros tipos de cáncer descritos en esta memoria). Agentes de este tipo que refuerzan la sensibilidad del desarrollo de una célula tumoral por un inhibidor de quinasa del EGFR pueden ser agentes que inducen una transición mesenquimal a epitelial (EMT) o que inhiben una actividad celular específica responsable de la sensibilidad reducida a inhibidores de quinasa del EGFR, o inducen una actividad celular específica que refuerza la sensibilidad a inhibidores de quinasa del EGFR. Ejemplos de agentes adecuados incluyen antagonistas de agentes inductores EMT, antagonistas TGF-beta o antagonista del receptor de TGF-beta, (por ejemplo: anti-TGF-beta y receptor anti-TGF-beta, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol (SB203580); 4-[4-(3,4-metilendioxifenil)-5-(2-piridil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida (SEB 431542); y análogos u homólogos de actividad similar o mayor de compuestos de este tipo), inhibidores de proteína-tirosina quinasas FAK, ILK, SRC, FYN o YES e inhibidores de calpaína.

Un método para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, simultánea o secuencialmente, uno o más antagonistas de un agente inductor de EMT. En una realización preferida, primero se determina que dicho tumor tiene un fenotipo epitelial por la presencia de uno o más biomarcadores epiteliales. En una realización particular, dicho agente inductor de EMT es un anticuerpo anti-TGF-beta un anticuerpo del receptor anti-TGF-beta, 4-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfinilfenil)-5-(4-piridil)-1H-imidazol (SB 203580); o 4-[4-(3-metilendioxifenil)-5-(2-piridil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida (SB 431542). En una realización particular, dicho antagonista de EGFR es erlotinib.

Los métodos que preceden para tratar tumores o metástasis de tumor en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial uno o más de otros agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anticancerígenos o compuestos que refuerzan los efectos de este tipo de agentes.

Otros agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anticancerígenos adicionales, o compuestos que refuerzan los efectos de este tipo de agentes incluyen, por ejemplo: agentes alquilantes o agentes con una acción alquilante, tal como ciclofosfamida (CTX; p. ej. CYTOXAN®), clorambucilo (CHL; p. ej. LEUKERAN®), cisplatino (CisP, p. ej. PLATINOL®), busulfan (p. ej. MYLERAN®), melfalan, carmustina (BCNu), estreptozotocina, trietilenmelamina (TEM), mitomicina C y similares; anti-metabolitos, tales como metotrexato (MTX), etopósido (VP16; p. ej. VEPESID®), 6-mercaptopurina (6MP), 6-tiocguanina (6TG), citarabina (Ara-C), 5-fluorouracilo (5-FU), capecitabina (p. ej. XELODA®), dacarbazina (DTIC) y similares; antibióticos, tales como actinomicina D, doxorubicina (DXR; p. ej. ADRIAMYCIN®), daunorubicina (daunomicina), bleomicina, mitramicina y similares; alcaloides, tales como alcaloides vinca, tales como vincristina (VCR), vinblastina y similares; y otros agentes antitumorales, tales como paclitaxel (p.ej. TAXOL®) y derivados de pactitaxel, los agentes citostáticos, glucocorticoides, tales como dexametasona (DEX, p. ej. DECADRON®) y corticosteroides, tales como prednisona, inhibidores de enzimas nucleósidas, tales como hidroxiurea, enzimas agotadoras de aminoácidos, tales como asparaginasa, leucovorina y otros derivados de ácido fólico, y diversos agentes antitumorales y similares. Los siguientes agentes también se pueden utilizar como agentes adicionales: arnifostina (p. ej. ETHYOL®), dactinomicina, mecloretamina (nitrógeno mostaza), estreptozocina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), doxorubicina lipo (p. ej. DOXIL®), gemcitabina (p. ej. GEMZAR®), daunorubicina (p. ej. DAUNOXOME®), procarbazina, citomicina, docetaxel (p. ej. TAXOTERE®), aldeslequina, carboplatino, oxaliplatino, cladribina, camptotecina, CPT 11 (irinotecan), 10-hidroxi-7-etil-camptotecina (SN38), floxuridina, fludarabina, ifosfamida, idarubicina, mesna, interferón beta, interferón alfa, mitoxantrona, topetecan, leuprolida, megestrol, melfalan, mercaptopurina, plicamicina, mitotano, pegaspargasa, pentostatina, pipobromano, plicamicina, tamoxifen, teniposido, testolactona, tioguanina, tiotepa, uracilo mostaza, vinorelbina, clorambucilo.

Los métodos que anteceden para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, uno o más agentes anti-hormonales. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "agente anti-hormonal" incluye compuestos orgánicos o peptídicos naturales o sintéticos que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores.

Agentes anti-hormonales incluyen, por ejemplo: antagonistas del receptor de esteroides, anti-estrógenos, tales como tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, otros inhibidores de aromatasa, 42-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno (p. ej. FARESTON®); anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores, farmacéuticamente aceptables, agonistas y/o antagonistas de hormonas de glicoproteínas, tales como hormona estimulante de folículos (FSH-siglas en inglés), hormona estimulante de tiroides (TSH-siglas en inglés) y hormona luteinizante (LH-siglas en inglés) y LHRH (hormona liberadora de hormona luteinizante); el agonista del LHRH acetato de goserilina, comercialmente disponible como ZOLADEX® (AstraZeneca); el antagonista de LHRH D-alaninamida N-acetil-3-(2-naftalenil)-D-alanil-4-cloro-D-fenilalanil-3-(3-piridinil)-D-alanil-L-seril-N6-(3-pridinilcarbonil)-L-lisil-N6-(3-piridinilcarbonil)-D-lisil-L-leucil-N6-(1-metiletil)-L-lisil-L-prolina (p. ej. ANTIDE®, Ares-Serono); el antagonista de LHRH acetato de ganirelix; el acetato de ciproterona anti-andrógeno esteroidal (CPA-siglas en inglés) y acetato de megestrol, comercialmente disponible como MEGACE® (Bristol-Myers Oncology), la flutamida anti-andrógeno no esteroidal (2-metil-N-[4,20-nitro-3-(trifluorometil)-fenilpropanamida), comercialmente disponible como EULEXIN® (Schering Corp); la nilutamida anti-andrógeno no esteroidal (5,5-dimetil-3-[4-nitro-3-(trifluorometil-4'-nitrofenil)-4,4-dimetil-imidazolidinadiona); y antagonistas para otros receptores no permisivos, tales como antagonistas para RAR, RXR, TR, VDR y similares.

El uso de los agentes citotóxicos y otros agentes anticancerígenos descritos anteriormente en regímenes quimioterapéuticos está generalmente bien caracterizado en las técnicas de la terapia del cáncer, y su uso en esta memoria cae bajo las mismas consideraciones para vigilar la tolerancia y eficacia y para controlar las vías de administración y las dosificaciones, con algunos ajustes. Por ejemplo, las dosificaciones reales de los agentes citotóxicos pueden variar en función de la respuesta de las células cultivadas del paciente determinada al utilizar métodos de histocultura. En general, la dosificación se reducirá en comparación con la cantidad utilizada en ausencia de otros agentes adicionales.

Dosificaciones típicas de un agente citotóxico eficaz que pueden estar en los intervalos recomendados por el fabricante, y en los casos indicados por respuestas in vitro o respuestas en modelos con animales, se pueden reducir hasta aproximadamente un orden de magnitud de concentración o cantidad. Así, la dosificación final dependerá del juicio del médico, del estado del paciente y de la eficacia del método terapéutico basado en la capacidad de respuesta in vitro de las células malignas cultivadas primariamente o de la muestra de tejido histocultivada, o las respuestas observadas en los modelos con animales apropiados.

Los métodos que anteceden para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de manera simultánea o secuencial, uno o más inhibidores de la angiogénesis.

Agentes anti-angiogénicos incluyen, por ejemplo: inhibidores del VEGFR, tales como SU-5416 y SU-6668 (Sugen Inc. of South San Francisco, Calif. EE.UU.) o según se describe, por ejemplo, en las solicitudes internacionales nºs WO 99/24440, WO 99/62890, WO 95/21613, WO 99/61422, WO 98/50356, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437 y las patentes de EE.UU. nºs 5.883.113, 5.886.020, 5.792.783, 5.834.504 y 6.235.764; inhibidores del VEGF, tales como IM862 (Cytran Inc. de Kirkland, Wash., EE.UU.), angiozima, una ribozima sintética procedente de Ribozyme (Boulder, Colo.) y Chiron (Emeryville, Calif); y anticuerpos contra VEGF, tales como bevacizumab (p. ej. AVASTIN^{TM} Genentech, South San Francisco, CA); un anticuerpo humanizado recombinante contra VEGF; antagonistas del receptor de integrina y antagonistas de integrina, tales como integrinas \alpha_{v}\beta_{3}, \alpha_{v}\beta_{5} y \alpha_{v}\beta_{6} y subtipos de las mismas, p. ej. cilengitida (EMD 121974), o los anticuerpos anti-integrina, tales como, por ejemplo, anticuerpos humanizados específicos para \alpha_{v}\beta_{3} (p. ej. VITAXIN®); factores, tales como IFN-alfa (patentes de EE.UU. nºs 4.530.901, 4.503.035 y 5.231.176); fragmentos de angiostatina y plasminógeno (p. ej. kringle 1-4, kringle 5, kringle 1-3 (O'Reilly, M. S. et al. (1994) Cell 79: 315-328; Cao et al. (1996). J. Biol. Chem. 271: 29461-29467; Cao et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 22924-22928); endostatina (O'Reilly. M. S. et al. (1997) Cell 88: 277; y la publicación de patente internacional nº WO 97/15666); trombospondina (TSP-1; Frazier (1991) Curr. Opin. Cell. Biol:3:792); factor de plaquetas 4 (PF4); inhibidores del activador de plasminógeno/uroquinasa; antagonistas del receptor de uroquinasa; heparinasas; análogos de fumagilina, tales como TNP-4701; suramina y análogos de suramina; esteroides angiostáticos; antagonistas de bFGF, antagonistas de flk-1 y flt-1; agentes anti-angiogénesis, tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa 2 de la matriz) e inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa 9 de la matriz). Ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de la matriz útiles se describen en las publicaciones de patente internacional nºs WO 96/33172, WO 96/27583, WO 98/07697; WO 98/03516, WO 98/34918; WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667 y WO 99/07675, publicaciones de patente europea nºs 818.442, 780.386, 1.004.578. 606.046 y 931.788; publicación de patente de Gran Bretaña nº 9912961 y patentes de EE.UU. nºs 5.863.949 y 5.861.510. Inhibidores de MMP-2 y MMP-9 preferidos son aquellos que tienen una escasa actividad o ninguna actividad inhibidora de MMP-1. Se prefieren más aquellos que inhiben selectivamente MMP-2 y/o MMP-9 con relación a las otras metaloproteinasas de la matriz (es decir, MMP-1, MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP-13).

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, uno o más agentes pro-apoptóticos o estimulantes de la apoptosis de células tumorales.

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, uno o más inhibidores de la transducción de señales.

Inhibidores de la transducción de señales incluyen, por ejemplo: inhibidores del receptor erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se unen al receptor erbB2, por ejemplo trastuzumab (p. ej. HERCEPTIN®); inhibidores de otras proteínas tirosina-quinasas p. ej. imitinib (p. ej. GLEEVEC®); inhibidores de ras, inhibidores de raf (p. ej. BAY 43-9006, Onyx Pharmaceuticals/Bayer Pharmaceuticals), inhibidores de MEK, inhibidores de mTOR, inhibidores de quinasa dependiente de ciclina, inhibidores de quinasa de la proteína quinasa C; e inhibidores de PDK-1 (véase Dancey, J. y Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313, para una descripción de varios ejemplos de este tipo de inhibidores y su uso en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer).

Inhibidores del receptor erbB2 incluyen, por ejemplo: inhibidores del receptor erbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome plc), anticuerpos monoclonales, tales como AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. de The Woodlands, Tex., EE.UU.) y 2B-1 (Chiron), e inhibidores de erbB2, tales como los descritos en las publicaciones internacionales nºs WO 98/02434, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 98/02437, WO 97/13760 y WO 95/19970, y las patentes de EE. UU. nºs 5.587.458, 5.877.305, 6.465.449 y 6.541.481.

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, un anticuerpo anti-HER2 o un fragmento inmunoterapéuticamente activo del mismo.

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, uno o más agentes anti-proliferativos adicionales.

Agentes anti-proliferativos adicionales incluyen, por ejemplo: inhibidores de la enzima farnesil proteína transferasa e inhibidores del receptor de tirosina quinasa del PDGFR, incluidos los compuestos descritos y reivindicados en las patentes de EE.UU. 6.080.769, 6.194.438, 6.258.824, 6.586.447, 6.071.935, 6.495.564, 6.150.377, 6.596.735 y 6.479.513 y la publicación de patente internacional WO 01/40217.

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Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, un inhibidor de COX II (ciclooxigenasa II). Ejemplos de inhibidores de COX-II útiles en incluyen alecoxib (p. ej. CELEBREX^{TM}), valdecoxib y rofecoxib.

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, tratamiento con radiación o un agente radiofarmacéutico.

La fuente de radiación puede ser externa o interna al paciente que está siendo tratado. Cuando la fuente es externa al paciente, la terapia se conoce como terapia de radiación con haz externo (EBRT-siglas en inglés). Cuando la fuente de radiación es interna al paciente, el tratamiento se denomina braquiterapia (BT). Átomos radiactivos para uso en el contexto de esta invención se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limitan a radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yodo-123, yodo-131 e indio-111. En los casos en los que el inhibidor de quinasa del EGFR es un anticuerpo, también es posible marcar el anticuerpo con isótopos radiactivos de este tipo.

La terapia de radiación es un tratamiento convencional para controlar tumores y/o metástasis de tumores no reseccionables o que no se pueden operar. Se han observado resultados mejorados cuando la terapia de radiación ha sido combinada con una quimioterapia. La terapia de radiación se basa en el principio de que una radiación de alta dosis suministrada a una zona diana dará como resultado la muerte de células reproductoras tanto en tejidos tumorales como normales. El régimen de dosificación de la radiación se define generalmente en términos de dosis absorbida de radiación (Gy), tiempo y fraccionamiento, y debe ser cuidadosamente definida por el oncólogo. La cantidad de radiación que recibe un paciente dependerá de diversas consideraciones, pero las dos más importantes son la localización del tumor en relación con las otras estructuras u órganos críticos del cuerpo y el grado al que se haya extendido el tumor. Un curso típico de tratamiento para un paciente que está siendo sometido a terapia de radiación será un programa de tratamiento a lo largo de un período de 1 a 6 semanas, con una dosis total de 10 y 80 Gy administrados al paciente en una fracción diaria única de aproximadamente 1,8 a 2,0 Gy, 5 días a la semana. En una realización preferida, existe sinergia cuando los tumores en pacientes humanos se tratan con el tratamiento de combinación de la invención y radiación. En otras palabras, la inhibición del crecimiento del tumor por medio de los agentes que comprenden la combinación está reforzada cuando se combina con radiación, opcionalmente con agentes quimioterapéuticos o anticancerosos adicionales. Parámetros de terapias de radiación adyuvantes están, por ejemplo, contenidos en la publicación de patente internacional WO 99/60023.

Los métodos precedentes para tratar tumores o metástasis de tumores en un paciente comprenden, además, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de quinasa del EGFR y, además, de forma simultánea o secuencial, tratamiento con uno o más agentes capaces de reforzar las respuestas inmunes antitumorales.

Agentes capaces de reforzar las respuestas inmunes antitumorales incluyen, por ejemplo: anticuerpos CTLA4 (antígeno 4 de linfocitos citotóxicos), (p. ej. MDX-CTLA4) y otros agentes capaces de bloquear CTLA4. Anticuerpos CTLA4 específicos que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen los descritos en la patente de EE.UU. nº 6.628.736.

Una "cantidad eficaz" de un agente o terapia es como se define anteriormente. Una "cantidad sub-terapéutica" de un agente o terapia es una cantidad menor que la cantidad eficaz para ese agente o terapia, pero que, cuando se combina con una cantidad eficaz o sub-terapéutica de otro agente o terapia, puede producir un resultado deseado por parte del médico, debido, por ejemplo, a una sinergia en los efectos eficaces resultantes o efectos secundarios reducidos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "paciente" se refiere preferiblemente a un ser humano que necesita tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR para cualquier fin y, más preferiblemente, un ser humano que necesita un tratamiento de este tipo para tratar cáncer o un estado o lesión pre-canceroso. Sin embargo, el término "paciente" también se puede referir a animales no humanos, preferiblemente mamíferos, tales como perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, ovejas y primates no humanos, entre otros que necesitan de tratamiento con un inhibidor de quinasa del EGFR.

En una realización preferida, el paciente es un ser humano que necesita tratamiento de cáncer, un estado o lesión precanceroso u otras formas de un desarrollo normal de las células. El cáncer es preferiblemente cualquier cáncer tratable, ya sea parcial o completamente, por la administración de un inhibidor de quinasa del EGFR. Por ejemplo, el cáncer puede ser cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCL-siglas en inglés), cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovarios, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer uterino, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma de la cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroidea, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma del tejido blando, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular, cáncer biliar, leucemia crónica o aguda, linfomas linfocíticos, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC), tumores del eje espinal, glioma madre del cerebro, glioblastoma multiforme, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenomas de la pituitaria, incluidas versiones refractarias de cualquiera de los cánceres anteriores o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. El estado o lesión precanceroso incluye, por ejemplo, el grupo que consiste en leucoplaquia oral, queratosis actínica (queratosis solar), pólipos precancerosos del colon o recto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome del cáncer de colon no poliposis hereditario (HNPCC-siglas en inglés) esófago de Barrett, displasia de la vejiga y estados cervicales precancerosos.

"Co-administración de" y "co-administrar" un inhibidor de quinasa del EGFR con un agente anticanceroso adicional (componentes ambos a los que se alude en esta memoria como los "dos agentes activos") se refiere a cualquier administración de los dos agentes activos, ya sea por separado o juntos, en que los dos agentes activos se administran como parte de un régimen de dosis apropiada, diseñado para obtener el beneficio de la terapia de la combinación. Así, los dos agentes activos, se pueden administrar ya sea como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. El agente adicional se puede administrar antes de, al mismo tiempo que o de forma subsiguiente a la administración del inhibidor de quinasa del EGFR, o en alguna combinación del mismo. En los casos en los que el inhibidor de quinasa del EGFR se administra al paciente a intervalos repetidos, p. ej. durante un curso convencional de tratamiento, el agente adicional se puede administrar antes de, al mismo tiempo que o de forma subsiguiente a cada una de las administraciones del inhibidor de quinasa del EGFR o alguna combinación del mismo, o a diferentes intervalos en relación con el tratamiento con inhibidor de quinasa del EGFR, o en una dosis sencilla antes de, en cualquier momento durante o de forma subsiguiente al curso de tratamiento con el inhibidor de quinasa del EGFR.

El inhibidor de quinasa del EGFR se administrará típicamente al paciente en un régimen de dosis que proporcione el tratamiento más eficaz del cáncer (tanto desde perspectivas de eficacia como de seguridad) para el que está siendo tratado el paciente, según se conoce en la técnica y según se describe, p. ej. en la publicación de patente internacional nº WO 01/34574. Al llevar a cabo el método de tratamiento de la presente invención, el inhibidor de quinasa del EGFR se puede administrar de cualquier manera eficaz conocida en la técnica, tal como por las vías oral, tópica, intravenosa, intra-peritoneal, intramuscular, intra-articular, subcutánea, intra-nasal, intra-ocular, intra-vaginal, rectal o intradérmica, dependiendo del tipo de cáncer que se esté tratando, del tipo de inhibidor de quinasa del EGFR que se esté utilizando (por ejemplo, molécula pequeña, anticuerpo, ARNi, ribozima o construcción antisentido) y del juicio médico del doctor que lo prescriba, basado, p. ej., en los resultados de estudios clínicos publicados.

La cantidad de inhibidor de quinasa del EGFR administrada y el tiempo de administración del inhibidor de quinasa del EGFR dependerán del tipo (especie, género, edad, peso, etc.) y del estado del paciente que esté siendo tratado, de la gravedad de la enfermedad o estado que esté siendo tratado y de la vía de administración. Por ejemplo, inhibidores de quinasa del EGFR de moléculas pequeñas se pueden administrar a un paciente en dosis que oscilen entre 0,001 y 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en dosis individuales o divididas o mediante infusión continua (véase, por ejemplo, la publicación de patente internacional nº WO 01/34574). En particular, erlotinib HCl se puede administrar a un paciente en dosis que oscilen entre 5-200 mg por día, ó 100-1600 mg por semana, en dosis únicas o dividas o por infusión continua. Una dosis preferida es 150 mg/día. Inhibidores de quinasa del EGFR basados en anticuerpos, o construcciones antisentido, de ARNi o de ribozima se pueden administrar a un paciente en dosis que oscilen entre 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana, en dosis únicas o divididas, o por infusión continua. En algunos casos, pueden ser más adecuados niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo antes mencionado, mientras que en otros casos pueden emplearse dosis todavía mayores sin provocar ningún efecto secundario perjudicial, con la condición de que dosis mayores de este tipo se dividan primeramente en varias dosis pequeñas para la administración a lo largo del día.

Los inhibidores de quinasa del EGFR y otros agentes adicionales se pueden administrar por separado o juntos por la misma o diferentes vías y en una amplia diversidad de formas de dosificación diferentes. Por ejemplo, el inhibidor de quinasa del EGFR se administra preferentemente por vía oral o parental. En los casos en los que el inhibidor de quinasa del EGFR sea erlotinib HCl (TARCEVA^{TM}), se prefiere la administración oral. Tanto el inhibidor de quinasa del EGFR como otros agentes adicionales se pueden administrar en dosis únicas o múltiples.

El inhibidor de quinasa del EGFR se puede administrar con diversos soportes farmacéuticamente aceptables en forma de comprimidos, cápsulas, pastillas, trociscos, caramelos duros, polvos, sprays, cremas, pomadas, supositorios, jaleas, geles, pastas, lociones, ungüentos, elixires, jarabes y similares. La administración de formas de dosificación de este tipo se puede llevar a cabo en dosis únicas o múltiples. Vehículos incluyen diluyentes o cargas sólidos, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos, etc. Composiciones farmacéuticas orales se pueden edulcorar y/o aromatizar adecuadamente.

El inhibidor de quinasa del EGFR se puede combinar junto con diversos vehículos inertes farmacéuticamente aceptables en forma de sprays, cremas, pomadas, supositorios, jaleas, geles, pastas, lociones, ungüentos y similares. La administración de formas de dosificación de este tipo se puede llevar a cabo en dosis únicas o múltiples. Vehículos incluyen diluyentes o cargas sólidos, medios acuosos estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos, etc.

Todas las formulaciones que comprendan inhibidores de quinasa del EGFR proteicos deberían seleccionarse con el fin de evitar una desnaturalización y/o degradación y pérdida de la actividad biológica del inhibidor.

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Métodos para preparar composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de quinasa del EGFR se conocen en la técnica y se describen, p. ej., en la publicación de Patente Internacional nº WO 01/34574. A la vista de las enseñanzas de la presente invención, métodos para preparar composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de quinasa del EGFR resultarán evidentes a partir de las publicaciones arriba citadas y de otras referencias conocidas, tales como Remigton Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18ª edición (1990).

Para la administración oral de inhibidores de quinasa del EGFR, comprimidos que contienen uno o los dos agentes activos se combinan con cualquiera de diversos excipientes tales como, por ejemplo, celulosa microcristalina, citrato sódico, carbonato cálcico, fosfato dicálcico y glicina, junto con diversos desintegrantes, tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), ácido algínico y determinados silicatos complejos, junto con aglutinantes de la granulación, tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril-sulfato de sodio y talco son a menudo muy útiles para fines de formación de comprimidos. Composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina; materiales preferidos a este respecto incluyen también lactosa o azúcar de la leche, así como polietilenglicoles de elevado peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para la administración oral, el inhibidor de quinasa del EGFR se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o saboreantes, materia colorante o colorantes y, si se desea, también agentes emulsionantes y/o de suspensión, junto con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerol y diversas combinaciones similares de los mismos.

Para la administración parenteral de uno cualquiera o de los dos agentes activos, se pueden emplear disoluciones ya sea en aceite de sésamo o aceite de cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como disoluciones acuosas estériles que comprenden al agente activo o una sal soluble en agua correspondiente del mismo. Disoluciones acuosas estériles de este tipo están preferiblemente tamponadas de forma adecuada, y también se han convertido preferiblemente en isotónicas, p. ej. con suficiente solución salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para fines de inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Las disoluciones oleosas son adecuadas para fines de inyección intra-articular, intramuscular y subcutánea. La preparación de todas estas disoluciones en condiciones estériles se consigue fácilmente por técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Debería seleccionarse cualquier formulación parenteral seleccionada para la administración de inhibidores de quinasa del EGFR proteicos con el fin de evitar una desnaturalización y pérdida de la actividad biológica del inhibidor.

Adicionalmente, es posible administrar por vía tópica uno o los dos agentes activos, por ejemplo por medio de cremas, lociones, jaleas, geles, pastas, ungüentos, pomadas y similares, de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional. Por ejemplo, se puede preparar una formulación tópica que comprenda un inhibidor de quinasa del EGFR en una concentración de aproximadamente 0,1% (p/v) a aproximadamente 5% (p/v).

Para fines veterinarios, los agentes activos se pueden administrar por separado o juntos a animales utilizando cualquiera de las formas y por cualquiera de las vías descritas anteriormente. En una realización preferida, el inhibidor de quinasa del EGFR se administra en forma de una cápsula, bolo, comprimido, drenaje líquido, por inyección o como un implante. Como una alternativa, el inhibidor de quinasa del EGFR se puede administrar con el pienso animal y, para este fin, se puede preparar un aditivo o premezcla para el pienso concentrado para un pienso animal normal. Formulaciones de este tipo se preparan de una manera convencional de acuerdo con la práctica veterinaria convencional.

Tal como se utiliza en esta memoria la expresión "inhibidor de quinasa del EGFR" se refiere a cualquier inhibidor de quinasa del EGFR e incluye cualquier entidad química que, tras la administración a un paciente, dé como resultado la inhibición de una actividad biológica asociada con la activación del receptor de EGF en el paciente, incluido cualquiera de los efectos biológicos situados más abajo que resultan de otro modo de la unión a EGFR de su ligando natural. Inhibidores de quinasa del EGFR de este tipo incluyen cualquier agente que pueda bloquear la activación del EGFR o cualquiera de los efectos biológicos situados más abajo de la activación del EGFR que sean relevantes para tratar el cáncer en un paciente. Un inhibidor de este tipo puede actuar uniéndose directamente el dominio intracelular del receptor e inhibiendo su actividad de quinasa. Alternativamente, un inhibidor de este tipo puede actuar ocupando el sitio de unión al ligando o una porción del mismo del receptor de EGF, haciendo con ello inaccesible el receptor a su ligando natural, de manera que se previene o reduce su actividad biológica normal. Alternativamente, un inhibidor de este tipo puede actuar modulando la dimerización de polipéptidos del EGFR, o la interacción del polipéptido del EGFR con otras proteínas, o reforzar la ubicuidad y degradación endocitótica del EGFR. Los inhibidores de quinasa del EGFR incluyen, pero no se limitan a inhibidores de bajo peso molecular, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, construcciones antisentido, ARNs inhibidores pequeños (es decir, interferencia del ARN por parte de ARNds, ARNi) y ribozimas. En una realización preferida, el inhibidor de quinasa del EGFR es una molécula orgánica pequeña o un anticuerpo que se une específicamente al EGFR humano.

Inhibidores de quinasa del EGFR incluyen, por ejemplo, inhibidores de quinasa del EGFR de quinazolina, inhibidores de quinasa del EGFR de pirido-pirimidina, inhibidores de quinasa del EGFR de pirimido-pirimidina, inhibidores de quinasa del EGFR de pirrolo-pirimidina, inhibidores de quinasa del EGFR de pirazolo-pirimidina, inhibidores de quinasa del EGFR de fenilamino-pirimidina, inhibidores de quinasa del EGFR de oxindol, inhibidores de quinasa del EGFR de indolocarbazol, inhibidores de quinasa del EGFR de ftalazina, inhibidores de quinasa del EGFR de isoflavona, inhibidores de quinasa del EGFR de quinalona e inhibidores de quinasa del EGFR de trifostina, tales como los descritos en las siguientes publicaciones de patente, y todas las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos inhibidores de quinasa del EGFR: Publicaciones de Patente Internacional nºs WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701 y WO 92/20642; solicitudes de patente europea nºs EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063 y EP 682027; patentes de EE.UU. nºs 5.747.498, 5.789.427, 5.650.415 y 5.656.643; y solicitud de patente alemana nº DE 19629652. Ejemplos no limitantes adicionales de inhibidores de quinasa del EGFR de bajo peso molecular incluyen cualesquiera de los inhibidores de quinasa del EGFR descritos en Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12): 1599-1625.

Ejemplos preferidos específicos de inhibidores de quinasa del EGFR de bajo peso molecular que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen [6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]-(3-etinilfenil)amina, también conocida como OSI-774, erlotinib o TARCEVA^{TM} (erlotinib HCl); OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (patente de EE.UU. nº 5.747.498; publicación de patente internacional nº WO 01/34574 y Moyer, J. D. et al. (1997) Cancer Res. 57:4838-4848); CI-1033 (anteriormente conocido como PD183805; Pfizer), (Sherwood et al., 1999, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 40: 723); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (Universidad de California); CGP-59326 (Novartis); PKI-166 (Novartis); EKB-569 (Wyeth); GW-2016 (también conocido como GW-572016 o ditosilato de lapatinib; GSK); y gefitinib (también conocido, como ZD1839 o IRESSA^{TM}; AstraZeneca) (Woodburn et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633). Un inhibidor de quinasa del EGFR de bajo peso molecular particularmente preferido que se puede utilizar de acuerdo con la presente invención es [6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]-(3-etinilfenil)amina, es decir, erlotinib) su sal hidrocloruro (es decir erlotinib HCl, TARCEVA^{TM}) u otras formas salinas (p. ej. mesilato de erlotinib).

Inhibidores de quinasa del EGFR basados en anticuerpos incluyen cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-EGFR que pueda bloquear parcial o completamente la activación del EGFR por parte de su ligando natural. Ejemplos no limitantes de inhibidores de quinasa del EGFR basados en anticuerpos incluyen los descritos en Modjatehedi, H., et al., 1993, Br. J. Cancer 67: 247-253; Teramoto, T., et al., 1996, Cancer 77: 639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M., et al., 1999, Cancer Res. 15: 59(8): 1935-40; y Yang, X., et al., 1999, Cancer Res. 59: 1236-1243. Así, el inhibidor de quinasa del EGFR puede ser el anticuerpo monoclonal Mab E7.6.3 (Yang, X. D. et al. (1999) Cancer Res. 59: 1236-43) o Mab C225 (nº de acceso a ATCC nº HB-8508), o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tenga su especificidad de unión. Inhibidores de quinasa del EGFR de anticuerpos monoclonales adecuados incluyen, pero no se limitan a IMC-C225 (también conocido como cetuximab o ERBITUX^{TM}; Imclone Systems), ABX-EGF (Abgenix), EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt), RH3 (York Medical Bioscience Inc.), y MDX-447 (Medarex/Merck KgaA).

Inhibidores de quinasa del EGFR basados en anticuerpos adicionales se pueden obtener de acuerdo con métodos conocidos al administrar el antígeno o epítopo apropiado a un animal hospedante seleccionado, p. ej. de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Diversos adyuvantes conocidos en la técnica se pueden utilizar para aumentar la producción de anticuerpos.

A pesar de que anticuerpos útiles en la práctica de la invención pueden ser policlonales, se prefieren anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales contra EGFR se pueden preparar y aislar utilizando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Técnicas para la producción y el aislamiento incluyen, pero no se limitan a la técnica del hibridoma, originalmente descrita por Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256:495-497); la técnica del hibridoma de células humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030); y la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).

Alternativamente, se pueden adaptar técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (véase, p. ej. la patente de EE. UU. nº 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla anti-EGFR. Inhibidores de quinasa del EGFR basados en anticuerpos, útiles para la puesta en práctica de la presente invención, también incluyen fragmentos de anticuerpos anti-EGFR que incluyen, pero no se limitan a fragmentos F(ab').sub.2, que se pueden generar mediante digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que se pueden generar reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab').sub.2. Alternativamente, se pueden construir librerías de expresión de Fab y/o scFv (véase, p. ej. Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida de fragmentos que tengan la especificidad para EGFR deseada.

Técnicas para la producción y el aislamiento de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica y se describen en Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, y en J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, Londres. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos anti-EGFR humanizados también se pueden preparar de acuerdo con técnicas conocidas, tales como las descritas en Vaughn, T. J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539 y referencias citadas en la misma y dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos son también útiles en la práctica de la presente invención.

Inhibidores de quinasa del EGFR para uso en la presente invención se pueden basar alternativamente en construcciones de oligonucleótidos antisentido. Oligonucleótidos antisentido, incluidas moléculas de ARN antisentido y moléculas de ADN antisentido, actuarían para bloquear directamente la traducción del ARNm del EGFR uniéndose a él y, así, evitando la traducción de la proteína o aumentando la degradación del ARNm, disminuyendo así el nivel de la proteína quinasa de EGFR y, así, la actividad en una célula. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones únicas de la secuencia transcrita de ARNm que codifica EGFR se pueden sintetizar, p. ej., mediante técnicas convencionales del fosfodiéster y administrar, p. ej., mediante inyección intravenosa o infusión. Métodos para utilizar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión de genes, cuya secuencia es conocida, son bien conocidos en la técnica (p. ej. véanse las patentes de EE.UU. nºs 6.566.135; 6.566.131; 6.365.354; 6.410.323; 6.107.091; y 5.981.732).

ARNs inhibidores pequeños (ARNsis) también pueden funcionar como inhibidores de quinasa del EGFR para uso en la presente invención. La expresión de genes de EGFR se puede reducir poniendo en contacto el tumor, sujeto o célula con un pequeño ARN de doble cadena (ARNds) o un vector o construcción que determina la producción de un pequeño ARN de doble cadena, de modo que la expresión de EGFR queda específicamente inhibida (es decir, ARN interferencia o ARNi). Métodos para seleccionar un ARNds o vector que codifica ARNds apropiado son bien conocidos en la técnica para genes cuya secuencia es conocida (p. ej. véase, Tuschi, T. et al. (1999), Genes Dev. 13(24): 3191-3197; Elbashir, S. M. et al. (2001) Nature 411: 494-498; Hannon, G. J. (2002) Nature 418: 244-251; McManus, M. T. y Sharp, P. A. (2002) Nature Reviews Genetics 3: 737-747; Bremmelkamp, T. R. et al. (2002) Science 296: 550-553; patentes de EE.UU. nºs 6.573.099 y 6.506.559; y publicaciones de patente internacional nºs WO 01/36646, WO 99/32619; y WO 01/68836).

Las ribozimas también pueden funcionar como inhibidores de quinasa del EGFR para uso en la presente invención. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de ARN. El mecanismo de la acción de la ribozima implica una hibridación específica para la secuencia de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, seguido de escisión endonucleolítica. Moléculas de ribozima con motivo de horquilla o de cabeza de martillo tratadas mediante ingeniería genética que catalizan de forma específica y eficaz la escisión endonucleolítica de secuencias de ARNm del EGFR son con ello útiles dentro del alcance de la presente invención. Sitios de escisión de ribozima específicos dentro de cualquier diana de ARN potencial se identifican inicialmente rastreando la molécula diana en cuanto a sitios de escisión de ribozimas, que típicamente incluyen las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen diana que contiene el sitio de escisión se pueden evaluar en cuanto a las características estructurales predichas, tales como estructura secundaria, que pueden hacer inadecuada la secuencia de oligonucleótidos. La adecuidad de dianas candidato también se pueden evaluar sometiendo a ensayo su capacidad de acceso a la hibridación con oligonucleótidos complementarios utilizando, p. ej., ensayos de protección de ribonucleasa.

Tanto ribonucleótidos antisentido como ribozimas útiles como inhibidores de quinasa del EGFR se pueden preparar por métodos conocidos. Éstos incluyen técnicas para la síntesis química, tales como, p. ej., mediante síntesis química de fosforoamidita en forma sólida. Alternativamente, moléculas de ARN antisentido se pueden generar mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Secuencias de ADN de este tipo se pueden incorporar en una amplia diversidad de vectores que incorporan promotores de ARN polimerasa adecuados, tales como, promotores de T7 o SP6 polimerasa. Diversas modificaciones a los oligonucleótidos de la invención se pueden introducir como medio de incrementar la estabilidad intracelular y la semivida. Modificaciones posibles incluyen, pero no se limitan a la adición de secuencias flanqueantes de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos con los extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fosforotioato ó 2'-O-metilo más que enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena principal de los oligonucleótidos.

En el contexto de los métodos de tratamiento, inhibidores de quinasa del EGFR se utilizan como una composición constituida por un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz no tóxica de un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables).

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de bases o ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables. Cuando un compuesto es de carácter ácido, su correspondiente sal se puede preparar convenientemente a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluidas bases inorgánicas y bases orgánicas. Sales derivadas de bases inorgánicas de este tipo incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre (cúprico y cuproso), férrico, ferroso, litio, magnesio, manganeso (mangánico y manganoso), potasio, sodio, zinc y sales similares. Son particularmente preferidas las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias así como aminas cíclicas y aminas sustituidas, tales como aminas que se producen en la naturaleza y sustituidas sintetizadas. Otras bases no tóxicas orgánicas, farmacéuticamente aceptables, a partir de las cuales se pueden formar sales incluyen resinas de intercambio de iones, tales como, por ejemplo, arginina, betaína, cafeína, colina, N',N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaina, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

Cuando un compuesto es de carácter básico, su correspondiente sal se puede preparar convenientemente a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluidos ácidos inorgánicos y orgánicos. Ácidos de este tipo incluyen, por ejemplo, ácido acético, bencenosulfónico, benzoico, canfosulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, oleico, málico, mandélico, metanosulfoníco, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico y similares. Particularmente preferidos son los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico.

Composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables) en calidad de ingrediente activo, pueden incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, otros ingredientes o adyuvantes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos pueden incluir los de agentes citotóxicos, quimioterapéuticos y anticancerígenos, o agentes que refuerzan los efectos de este tipo de agentes, tal como se ha listado anteriormente. Las composiciones incluyen composiciones adecuadas para la administración por vía oral, rectal, tópica y parenteral (incluidas subcutánea, intramuscular e intravenosa), a pesar de que la vía más adecuada en cualquier caso dado dependerá del hospedante particular y de la naturaleza y gravedad de los estados para los que esté siendo administrado el ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en una forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia.

En la práctica, los compuestos inhibidores de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables) se pueden combinar en calidad del ingrediente activo en mezcla íntima con un vehículo farmacéutico de acuerdo con técnicas de formación de compuestos farmacéuticas convencionales. El vehículo puede adoptar una amplia diversidad de formas en función de la forma de preparación deseada para la administración, p. ej., oral o parenteral (incluida intravenosa). Así, las composiciones farmacéuticas se pueden presentar en forma de unidades discretas adecuadas para la administración por vía oral, tales como cápsulas, saquitos o comprimidos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo. Además, las composiciones se pueden presentar en forma de un polvo, en forma de gránulos, en forma de una solución, en forma de una suspensión en un líquido acuoso, en forma de un líquido no acuoso, en forma de una emulsión de aceite en agua o en forma de una emulsión líquida de agua en aceite. Además de las formas de dosificación comunes recogidas anteriormente, un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas las sales farmacéuticamente aceptables de cada uno de sus componentes) también se puede administrar por medios y/o dispositivos de suministro de liberación controlada. Las composiciones de combinación se pueden preparar por cualquiera de los métodos de farmacia. En general, métodos de este tipo incluyen una etapa de asociar los ingredientes activos con el soporte que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones se preparan mezclando uniforme e íntimamente el ingrediente activo con vehículos líquidos o soportes sólidos finamente divididos o ambos. Luego, el producto puede conformarse convenientemente a la presentación deseada.

Un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables) también se puede incluir en composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más de otros compuestos terapéuticamente activos. Otros compuestos terapéuticamente activos pueden incluir los agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anticancerígenos, o agentes que refuerzan los efectos de agentes de este tipo, según se lista anteriormente.

Así, en una realización, la composición farmacéutica puede comprender un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR en combinación con un agente anticancerígeno, en donde dicho agente anticancerígeno es un miembro seleccionado del grupo que consiste en fármacos alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de microtúbulos, podofilotoxinas, antibióticos, nitrosoureas, terapias con hormonas, inhibidores de quinasa, activación de la apoptosis de células tumorales y agentes antiangiogénicos.

El vehículo farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, líquido o gas. Ejemplos de vehículos sólidos incluyen lactosa, tierra arcillosa, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio y ácido esteárico. Ejemplos de vehículos líquidos son jarabe de azúcar, aceite de cacahuete, aceite de oliva y agua. Ejemplos de vehículos gaseosos incluyen dióxido de carbono y nitrógeno.

En la preparación de las composiciones para la forma de dosificación oral, se puede emplear cualquier medio farmacéutico conveniente. Por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saboreantes, conservantes, agentes colorantes y similares se pueden utilizar para formar preparaciones líquidas orales, tales como suspensiones, elixires y disoluciones; mientras que vehículos, tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, y similares se pueden utilizar para formar preparaciones sólidas orales tales como polvos, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y cápsulas son las unidades de dosificación orales preferidas en donde se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Opcionalmente, los comprimidos se pueden revestir mediante técnicas acuosas o no acuosas convencionales.

Un comprimido que contiene la composición se puede preparar mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes o adyuvantes accesorios. Las tabletas comprimidas se pueden preparar comprimiendo, en una máquina adecuada, el ingrediente activo en una forma libremente fluyente, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, agente tensiactivo o de dispersión. Los comprimidos moldeados se pueden hacer moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en forma de polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Cada comprimido contiene preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 5 g del ingrediente activo, y cada saquito o cápsula contiene preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 5 g del ingrediente activo.

Por ejemplo, una formulación prevista para la administración por vía oral a seres humanos puede contener de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 5 g del agente activo, formando compuesto con una cantidad apropiada y conveniente de material de vehículo que puede variar desde aproximadamente 5 a aproximadamente 95 por ciento de la composición total. Formas de dosificación unitaria contendrán generalmente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 g de ingrediente activo, típicamente 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg ó 1000 mg.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración por vía parenteral se pueden preparar en forma de disoluciones o suspensiones de los compuestos activos en agua. Se puede incluir un tensiactivo adecuado tal como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos en aceites. Además, se puede incluir un conservante para prevenir el desarrollo perjudicial de microorganismos.

Composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles. Además, las composiciones pueden estar en forma de polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles de este tipo. En todos los casos, la forma inyectable final debe ser estéril y debe ser eficazmente fluida para una facilidad de introducirla en la jeringa. Las composiciones farmacéuticas deben ser estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento; así, preferiblemente deberían conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p. ej. glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), aceites vegetales y mezclas adecuadas de los mismos.

Composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma adecuada para el uso tópico, tal como, por ejemplo, un aerosol, crema, ungüento, loción, polvo espolvoreable o similares. Además, las composiciones pueden estar en una forma adecuada para uso en dispositivos transdermales. Estas formulaciones se pueden preparar utilizando un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables) a través de métodos de tratamiento convencionales. Como un ejemplo, una crema o ungüento se prepara mezclando material hidrófilo y agua, junto con aproximadamente 5% en peso a aproximadamente 10% en peso del compuesto para producir una crema o ungüento con una consistencia deseada.

Composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma adecuada para la administración por vía rectal, en donde el vehículo es un sólido. Es preferible que la mezcla forme supositorios de dosis unitaria. Vehículos adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente utilizados en la técnica. Los supositorios se pueden formar convenientemente mezclando primero la composición con el o los vehículos reblandecidos o fundidos, seguido de enfriamiento rápido y conformación en moldes.

Además de los ingredientes de vehículo antes mencionados, las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden incluir, según sea apropiado, uno o más ingredientes de vehículo adicionales tales como diluyentes, tampones, agentes saboreantes, aglutinantes, agentes tensiactivos, espesantes, lubricantes, conservantes, (incluidos anti-oxidantes) y similares. Además, se pueden incluir otros adyuvantes para hacer a la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido. Composiciones que contienen un compuesto inhibidor de quinasa del EGFR (incluidas sus sales farmacéuticamente aceptables) también se pueden preparar en forma de concentrado en polvo o en líquido.

Niveles de dosificación para los compuestos serán aproximadamente como los descritos en esta memoria, o según se describen en la técnica para estos compuestos. Sin embargo, ha de entenderse que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores incluida la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración, tasa de excreción, combinación del fármaco y la gravedad de la enfermedad particular que está siendo sometida a terapia.

Muchos métodos experimentales alternativos conocidos en la técnica se pueden sustituir con éxito por los específicamente descritos en esta memoria en la práctica de esta invención, tal como, por ejemplo, se describen en muchos de los excelentes manuales y libros de texto disponibles en los sectores de tecnología relevante para esta invención (p. ej., Using Antibodies, A Laboratory Manual, editado por Harlow, E. y Lane, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (p. ej. ISBN 0-87969-544-7); Roe B. A. et al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley & Sons (p. ej. ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins'', 2000, comp. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thorner. Academic Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001, 3ª edición, por Joseph Sambrook y Peter MacCallum, (el antiguo manual de Maniatis Cloning) (p. ej. ISBN 0-87969-577-3); Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et al. John Wiley & Sons (p. ej. ISBN 0-471-50-338-X); Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (p.ej. ISBN 0-471-11184-8), y Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, comp. Deutscher, M. P., Academic Press, Inc. (p. ej. ISBN 0-12-213585-7), o según se describe en las muchas páginas web de universidad y comerciales dedicadas a describir métodos experimentales en biología molecular.

Esta invención se comprenderá mejor a partir de los Detalles Experimentales que siguen. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son meramente ilustrativos de la invención según se describe con más detalle en las reivindicaciones que siguen a continuación, y no se han de considerar que la limitan de modo alguno.

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Detalles experimentales Introducción

Inhibidores de la función del receptor de EGF han demostrado una utilidad clínica, y la definición de las rutas de señalización claves del receptor de EGF que describen subconjuntos de pacientes que se beneficiarán lo más probablemente de la terapia, ha resultado un sector importante de investigación. En NSCLC y glioblastomas se han observado mutaciones que activan la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa del receptor y/o aumentan la señalización situada más abajo. Sin embargo, el papel de las mutaciones como un mecanismo principal para conferir sensibilidad a inhibidores del receptor de EGF ha sido contradictorio. Estudios in vitro y clínicos han demostrado una variabilidad considerable entre líneas celulares del receptor de EGF de tipo salvaje (wt) y tumores en sus respuestas celulares a la inhibición del receptor de EGF, que en parte ha demostrado derivar de la activación independiente del receptor de EGF de la vía de fosfatidil inositol 3-quinasa, conduciendo a la fosforilación continua de la serina-treonina quinasa Akt anti-apoptótica. Los determinantes moleculares a vías alternativas de la activación de PI3-quinasa y la consiguiente insensibilidad del inhibidor del receptor de EGF son un sector activo de investigación. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1 (receptor IGF-1), que activa intensamente la vía de PI3-quinasa, ha estado implicado en la resistencia celular a inhibidores de EGF. Los papeles de redes de célula-célula y célula-adhesión, que también pueden ejercer señales de supervivencia a través de la vía de PI-13-quinasa en la mediación de la insensibilidad a la inhibición del receptor de EGF selectiva son menos claros y se postularían de modo que impactaran en la sensibilidad de la célula al bloqueo del receptor de EGF. La capacidad de células tumorales por mantener el crecimiento y señales de supervivencia en ausencia de la adhesión a la matriz extracelular o los contactos célula-célula es importante no sólo en el contexto de la migración de las células y la metástasis, sino también para mantener la proliferación celular y la supervivencia en entornos de tumores similares a heridas, en las que la matriz extracelular está siendo remodelada y se disminuye la inhibición por el contacto de la célula. Aquí, los autores de la invención demostraron que la sensibilidad de NSCLC y células pancreáticas a la inhibición por parte del receptor de EGF es conferida por un fenotipo de célula epitelial de E-cadherina en el que la señalización del miembro de la familia ErbB era activa. Inversamente, la insensibilidad a la inhibición del receptor de EGF fue mediada a través de una transición epitelial-mesenquimal (EMT) asociada con la expresión de vimentina y/o fibronectina.

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Materiales y métodos Cultivo celular y preparación de extractos celulares

Las líneas NSCLC con EFGRwt, H292, H358, H322, H441, A549, Calu6, H460, H1703 y SW1573 se cultivaron en los medios suplementados, apropiados, recomendados por ATCC. Extractos de células se prepararon mediante lisis con detergente (Tris-HCl 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de Na al 0,5%, SDS al 0,1%) que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa. La concentración de proteínas solubles se determinó mediante ensayo micro-BSA (Pierce, Rockford IL).

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Identificación de la proteína y cuantificación mediante secuenciación del péptido por LC-MS/MS

Resinas de inmunoafinidad anti-fosfotirosina se prepararon mediante acoplamiento covalente a un soporte sólido por métodos convencionales. Para cada experimento biológico se utilizaron resinas de inmunoafinidad recientemente preparadas para maximizar la unión e inducir el efecto remanente. En síntesis, anticuerpos anti-fosfotirosina se reticularon a IgG unida a soporte sólido y de forma no covalente mediante una elución a bajo pH. Resinas de afinidad recientes se prepararon para cada experimento biológico para evitar una contaminación cruzada. Las proteínas aisladas mediante selección por afinidad anti-fosfotirosina se midieron mediante el marcaje iTRAQ de péptidos trípticos según se ha descrito previamente (Ross et al, 2004; Haley et al., 2004). Las masas de péptidos y la información de las secuencias se determinaron mediante LC-MS/MS por electroproyección y búsqueda en la base de datos. Se consideraron péptidos con niveles de confianza >= 90% con puntuaciones de >=20, después de lo cual se inspeccionaron manualmente los espectros. Las relaciones de la expresión de péptidos se convirtieron en valores de log_{2} y se promediaron para proporcionar un valor de expresión de proteína único para cada instante (1, 4 y 24 horas) después de la exposición a erlotinib (1 \muM). Las proteínas se agruparon en racimos mediante relaciones de expresión de proteínas temporales log_{2} utilizando los métodos jerárquicos euclidianos y mapas de auto-organización.

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Análisis de inmunotransferencia de NSCLC y extractos de líneas de células pancreáticas

La inmunodetección de proteínas se realizó mediante transferencia electroforética de proteínas separadas por SDS-PAGE a nitrocelulosa, incubación con anticuerpos y detección en una segunda etapa quimioluminiscente (Pico West; Pierce, Rockford IL). Los anticuerpos incluían: E-cadherina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; cs21791), \alpha-catenina (sc9988), \beta-catenina (sc7963), \gamma-catenina (sc8415) y Brk (sc 1188); Vimentina (BD Biosciences, San Jose, CA; BD550513) y Fibronectina (BD610077); GAPDH (AbCam, Cambridge, Reino Unido); Phospho-Akt (Cell Signaling, Beverly, MA #9271), Akt (CS #9272), Phospho-p44/42 Map kinase^{T202/Y204} (Erk1/2; CS#9101), familia de Phospho-Src^{Y416} (CS #2101), Phospho-STAT3^{Y705} (CS #9131) y Phospho-S6^{S235/236} (CS #2211), \beta-actina (Sigma, Saint Louis, MO #A5441). Los anticuerpos incluían, además: Phospho-Shc (Cell Signaling, #2434, Beverly, MA), Phospho-Paxillin (Cell Signaling, #2541), Phospho-Akt (Ser473 y Thr308) (Cell Signaling, #9271 y 9275), Phospho-HER2/ErbB2 (Cell Signaling, #2245), Phospho-Her3 (Tyr1289) (Cell Signaling #9101), Phospho-EGFR (Tyr 845) (Cell Signaling #2231), Phospho-EGFR (Tyr 992) (Cell Signaling, #2235), Phospho-EGFR (Tyr1045) (Cell Signaling #2237), EGFR (Cell Signaling, #2232), Phospho-p70 S6 quinasa (Cell Signaling, #9205), Phospho-GSK-3alfa/beta (Cell Signaling #9331), Phospho-EGFR (Tyr 1068) (Cell Signaling #2236), familia de Phospho-Src (Tyr416) (Cell Signaling #2101), phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (Cell Signaling #9251), phospho-STAT3 (Tyr 705) (Cell Signaling #9131), ErbB2 (Cell Signaling 242); ErbB4 (Cell Signaling 4795), PY20 (Exalpha Biologicals Inc.), Brk (Santa Cruz Biochemicals).

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Farmacología in vitro

El día 1, células NSCLC se extendieron en placas a razón de 3-5 x 10^{4} células/pocillo en placas de 96 pocillos en sus medios con contenido en suero normales. Al cabo de 24 h, se añadió a las placas erlotinib a una concentración 10X en una disolución de DMSO al 10%/agua para conseguir un intervalo de concentraciones de ensayo final de 20 \muM a 8 nM. Las diluciones se realizaron en etapas triples. Las concentraciones finales de DMSO en cada pocillo eran constantes y no excedían del 1%. Después de la adición de erlotinib, las células se volvieron a disponer en la incubadora y se dejaron durante 72 h. El día 5 se utilizó Cell-Titer Glo (Promega) para confirmar los efectos sobre la viabilidad de las células. Se siguieron las instrucciones de los fabricantes para el ensayo. Los experimentos se realizaron por triplicado hasta al menos un n=3. Los datos se normalizaron como un porcentaje de inhibición en comparación con pocillos control con DMSO sólo y el análisis de la concentración-respuesta se realizó utilizando el softwre Prizm graphing.

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Farmacología in vivo

A ratones CD-1 nu/nu hembras (Charles River Laboratories) se les implantaron células tumorales NSCLC recolectadas en un solo sitio por vía subcutánea en el flanco de los ratones en la región axilar. Se dejó que los tumores se desarrollaran hasta 200 + 50 mm^{3}, momento en el que los animales fueron clasificados en grupos de tratamiento de 8 animales por grupo basados en el peso (+ 1 g de peso corporal) y se las tatuó en la cola para la identificación permanente. Los volúmenes de los tumores y los pesos corporales se determinaron dos veces semanalmente. El volumen del tumor se determinó midiendo en dos direcciones con calibres vernier y se calculó utilizando la fórmula; Volumen del tumor = (longitud x anchura^{2})/2. Los datos se representaron como el % de cambio en los valores medios del volumen del tumor y del peso corporal para cada grupo. La inhibición del desarrollo del tumor (% TGI) se determinó como % de TGI = 100(1-W_{t}-W_{c}): en que W_{t} es el volumen del tumor mediano del grupo tratado en el momento x y W_{c} es el volumen del tumor mediano del grupo control en el momento x. TARCEVA^{TM} se dosificó en una disolución al 6% de captisol (CyDex, Inc) en API (agua para inyección) y todos los animales control fueron dosificados con un volumen igual del vehículo. Estudios de inhibición de crecimiento del tumor se dosificaron mediante sonda oral una vez al día durante 14 días. Los estudios farmacodinámicos se dosificaron mediante sonda oral durante 1-3 días con tumores procedentes de 4 animales control y 4 animales tratados con TARCEVA^{TM}, se recolectaron y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido 4 horas después de la dosificación los días 1, 2 y 3.

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Microscopía confocal

Células desarrolladas sobre portaobjetos de vidrio durante 24 horas se lavaron y fijaron con formaldehído al 3,7% en PBS, seguido de permeabilización en NP-40 al 0,5%. Las células se lavaron, se bloquearon con BSA al 5% y se incubaron con anticuerpos primarios durante 2 horas a la temperatura ambiente y con anticuerpo secundario conjugado con FITC diluido durante 1 hora. Los núcleos se tiñeron con DAPI (300 nM durante 5 min). Las imágenes confocales se capturaron utilizando un microscopio confocal de objetivo giratorio a un aumento de 60X.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Resultados TABLA 2 Inhibición del desarrollo de líneas de células tumorales del receptor de EGFwt sensibles o relativamente insensibles a erlotinib, expresada como la concentración (\muM) requerida para una eficacia semi-máxima (CE_{50}) y una inhibición máxima (%) por parte de erlotinib. La inhibición del desarrollo del tumor (TGI) se da para el día 15 tras exposición del xenoinjerto a erlotinib

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Líneas de NSCLC que contienen un receptor de EGFwt exhiben una gama de sensibilidades a erlotinib in vitro

Líneas de células NSCLC que contienen mutaciones en el dominio catalítico de EGFR exhibían una hipersensibilidad al tratamiento con los inhibidores de EGFR selectivos erlotinib y gefitinib. Se ha sugerido que solamente aquellos pacientes que portan mutaciones de este tipo responderían y/o mostrarían un beneficio de supervivencia por el tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa del EGFR. Sin embargo, un ensayo clínico controlado con placebo, aleatorio, llevado a cabo con erlotinib, indicaba que la tasa de supervivencia de pacientes expuestos al fármaco era bastante superior a la aparición pronosticada de mutaciones de este tipo en la población de pacientes. Esto sugería que a pesar de que las mutaciones eran un indicador de la respuesta de los pacientes, estaban indudablemente implicados otros factores en la aportación del beneficio de supervivencia.

Inicialmente, el receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se secuenció en 14 líneas de células NSCLC. El análisis de la secuencia demostró que el EGFR expresado en todas las líneas de células de este estudio era de tipo salvaje con respecto a dos mutaciones recientemente identificadas (mutaciones por deleción y puntual; datos no mostrados). Habiendo determinado que los receptores eran de tipo salvaje, se evaluó la sensibilidad del panel de líneas de células de cáncer de pulmón de células no pequeñas utilizando un ensayo de viabilidad de las células.

El análisis de la sensibilidad de erlotinib en una gama de líneas de células NSCLC humanas, que eran de tipo salvaje para EGFR, indicaba una amplia gama de sensibilidad (Tabla 2; Griffin et al. 2005). Los autores de esta invención han clasificado así ampliamente estas líneas de células en las que son relativamente insensibles (H1703, SW1573, H460 y Calu6), aquellas que muestran una sensibilidad intermedia (A549) y aquellas que son sensibles (H441, H358, H322 y H292) a la inhibición del crecimiento mediada por erlotinib in vitro y en xenoinjertos. Estas diferencias se pueden correlacionar, en parte, con una fallo de las líneas de células relativamente insensibles por mostrar una inhibición mediada por erlotinib de la fosforilización Akt/PKB (Griffin et al., 2005). Se observó una gama de sensibilidades de las células a erlotinib en las líneas de células que oscilaban entre las más sensibles (H292) a las menos sensibles (H460). Existían unas pocas correlaciones entre el tipo del tumor y la sensibilidad a erlotinib, a pesar de que es interesante señalar que las dos líneas de células derivadas de carcinoma bronquioalveolar (BAC) (H358 y H322) mostraban un nivel de sensibilidad a la inhibición de EGFR. Informes previos de ensayos clínicos han sugerido que de la población de pacientes con NSCLC, aquellos con histologías BAC tendían a tener un mayor beneficio en el tratamiento que otros pacientes de NSCLC. Sin embargo, deberían testarse más líneas de células derivadas de BAC antes de sacar conclusión alguna. Los datos procedentes de los experimentos de farmacología in vitro se resumen en la Tabla 2. Las curvas de concentración-respuesta se analizaron de dos maneras. Primeramente con el fin de definir los valores CI50 más tradicionalmente aceptados (no mostrados), las curvas se han ajustado en un intervalo de 0-100%. Sin embargo, dado que erlotinib y otros inhibidores de EGFR pueden describirse como citostáticos más que citotóxicos y, por lo tanto, no se esperaría nunca lograr un exterminio completo de las células, es cuestionable lo relevante que es un valor CI50. De hecho, incluso en las líneas más sensibles, una eficacia máxima de aproximadamente 70-80% era la más observada. Por lo tanto, una CE50 que limita las curvas del 0-80% es una comparación de la potencia más relevante.

Con el fin de determinar la relevancia del ensayo de viabilidad de las células in vitro a la eficacia in vivo, se testó una selección de líneas de células que oscilaban desde sensibles a insensibles in vitro en modelos de xenoinjerto en ratones. Los datos procedentes de estos experimentos se muestran en la Figura 1 y en la Tabla 2. La correlación entre la sensibilidad in vitro y la sensibilidad in vivo a erlotinib era decisiva. Aquellas células que eran más sensibles in vitro eran también las más sensibles in vivo, siendo el orden de rango de sensibilidad de todas las líneas de células idéntico entre los dos ensayos. Un hallazgo de este tipo sustenta fuertemente el uso del ensayo in vitro como una guía inicial para evaluar la sensibilidad a erlotinib en modelos de xenoinjerto. Las líneas de células elegidas se tomaron en cuanto a su gama de sensibilidades basada en las actividades in vitro e in vivo. A pesar de ser una clasificación algo subjetiva, se seleccionaron dos líneas sensibles (H292 y H358), dos intermedias (H441 y A549) y dos insensibles (H460 y Calu-6). A pesar de su baja sensibilidad in vitro, A549 fue clasificada como una línea de células intermedia debido a un bajo nivel de respuesta in vivo. El objetivo principal del estudio adicional era determinar los determinantes moleculares de la sensibilidad a erlotinib en estas líneas de células de NSCLC.

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Cambios en los marcadores de células epiteliales y mesenquimales se correlacionan con la sensibilidad de líneas de células de NSCLC a erlotinib

Inicialmente, se midieron diferencias en la fosforilación de la proteína tirosina y formación de complejo entre líneas de NSCLC sensibles o relativamente insensibles a erlotinib in vitro y en modelo de xenoinjerto. Estos experimentos implicaban una selección de la afinidad de anti-fosfotirosina de lisados de células, digestión tríptica e identificación de las proteínas basada en los espectros de iones de fragmento LC-MS/MS. Los autores de la invención observaron una diferencia decisiva entre las líneas de NSCLC sensibles y relativamente insensibles a erlotinib en la expresión anormal de vimentina y/o fibronectina (Figura 2A). Típicamente, la expresión de vimentina y fibronectina son características de las células mesenquimales y están sólo débilmente expresadas o no expresadas en linajes de células epiteliales. La expresión de vimentina se encontró principalmente en H1703 y Calu6, mientras que la expresión de fibronectina se observó en células H460. Estas tres líneas de NSCLC eran relativamente insensibles a la inhibición del desarrollo por parte de erlotinib in vitro (CE_{50} > 10 \muM) e in vivo (a 200 mg/kg por vía oral qd). Se encontró una pequeña expresión o ninguna expresión de vimentina o fibronectina en las líneas H292 y H358 de NSCLC sensibles a erlotinib, la línea intermedia A549 o en las dos líneas de células H1650 y H1975 del receptor de EGF mutante.

Basado en la expresión de proteínas mesenquimales en líneas NSCLC relativamente insensibles a erlotinib, los autores de la invención analizaron extractos de proteínas procedentes del mismo panel de líneas de células NSCLC relativamente insensibles y sensibles en cuanto a la presencia o ausencia de marcadores característicos de fenotipos epiteliales o mesenquimales (Figura 2B). De forma decisiva, se detectó E-cadherina en las líneas de células sensibles (H441, H358, H322 y H292) pero estaba ausente en las líneas de células relativamente insensibles (H1703, SW1573, H460 y Calu6). La línea de células sensible de forma intermedia A549 mostró una expresión baja, pero detectable. Se observó una pérdida similar de \gamma-catenina en células relativamente insensibles a erlotinib, con excepción de H460. Por lo tanto, las líneas de células relativamente insensibles parece haber perdido la expresión de las proteínas marcadoras de células epiteliales. A continuación, los autores de la invención se preguntaron si estas líneas de células expresaban los marcadores mesenquimales fibronectina y/o vimentina. Las líneas de células relativamente insensibles claramente expresaban a uno cualquiera o a los dos de fibronectina y vimentina (Figura 2B), mientras que ninguna de las proteínas era detectable en líneas de células sensibles a erlotinib. De manera interesante, la línea de células A549 sensible de forma intermedia mostraba de nuevo niveles bajos, pero detectables, de las dos proteínas. Sin embargo, experimentos con microscopía confocal (resultados no mostrados) utilizando inmunotinción con anticuerpos específicos para E-cadherina y vimentina indicaban que el cultivo de células A549 utilizado parecía ser una población mixta de células, ya que no se observaba tinción dual de las células. Esto podría también explicar los resultados en cierta medida variables obtenidos con esta línea de células, y es consistente con su sensibilidad intermedia a erlotinib.

Los cambios en los marcadores en las líneas de células se analizaron adicionalmente en dos líneas de células relativamente insensibles y en dos líneas de células sensibles mediante microscopía confocal después de inmunotinción con anticuerpos dirigidos contra E-cadherina y vimentina (Figura 2C). No se pudo detectar tinción alguna con E-cadherina en células H1703 o Calu6 (Figura 2B, paneles 1 y 2) mientras que la totalidad de estas células podía ser teñida para vimentina (Figura 2C, paneles 5 y 6). Lo contrario era cierto para las líneas de células sensibles H441 y H292, con una clara tinción con E-cadherina en la membrana de estas células (Figura 2C, paneles 3 y 4) pero ninguna tinción visible con vimentina (Figura 2C, paneles 7 y 8). Tomados conjuntamente, estos datos indican que células NSCLC, que eran relativamente insensibles a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib, parecían haber sufrido una transición a un tipo de célula más mesenquimal y expresaban vimentina o fibronectina. En contraposición, líneas de células que eran sensibles a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib mantenían un fenotipo epitelial y expresaban E-cadherina.

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La sensibilidad a erlotinib se correlaciona con la conservación de marcadores epiteliales durante el desarrollo del tumor in vivo

Xenoinjertos de tumores derivados de líneas de células NSCLC desarrollados en ratones exhibieron un grado similar de sensibilidad a erlotinib al observado para la respectiva línea de células in vitro. Los autores de la invención desearon, por lo tanto, examinar si los marcadores de proteínas identificados in vitro también eran predictivos de la sensibilidad a erlotinib in vivo. Se prepararon extractos de proteínas de 3 xenoinjertos de tumores independientes desarrollados a partir de células H460, Calu6, A549, H441 y H292. La inmunotinción de extractos indicaba que E-cadherina no se expresaba de forma detectable en los xenoinjertos derivados de las células H460 y Calu6 que son relativamente insensibles a erlotinib, se expresaban a bajos niveles en xenoinjertos derivados de las células A549 de sensibilidad intermedia y se expresaban a altos niveles en líneas de células H441 y H292 sensibles a erlotinib (Figura 3). Se observó un resultado similar tras el análisis de los niveles de \gamma-catenina. En contraposición, muestras de xenoinjerto derivadas de Calu6 expresaban fibronectina y vimentina (Calu6) o fibronectina sola (H460), un resultado consistente con el obtenido de cultivos de células in vitro (Figura 2B). Extractos de xenoinjertos derivados de H441 H292 mostraron una pequeña expresión o ninguna de fibronectina o vimentina. Estos resultados in vivo sustentan adicionalmente los datos in vitro e indican que la presencia de estos marcadores de proteínas no es un artefacto del cultivo celular. Además, los autores sustentan la hipótesis de que la sensibilidad a erlotinib se podía limitar a células con un fenotipo epitelial y que las células que han sufrido una EMT se vuelven menos dependientes tras la señalización con EGFR para la proliferación y supervivencia de las células.

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Expresión de Brk en líneas de células NSCLC que son relativamente insensibles o sensibles a la inhibición del receptor de EGF

Los resultados de estos experimentos condujeron a la hipótesis de trabajo de que la sensibilidad a erlotinib se determina por la capacidad del compuesto de inhibir la señalización de Akt. Siguiendo esta hipótesis, surge la cuestión sobre lo que es único de estas células que permite que la vía del EGRF impacta de forma tan significativa la señalización celular por parte de Akt.

Documentos recientes han sugerido un enlace potencial interesante entre EGFR y la señalización por Akt, que puede o puede no implicar una heterodimerización con otros miembros de Her, tales como ErbB3, que implican a la tirosina quinasa Brk no receptora (también conocida como PTK6). Por lo tanto, era de interés determinar si podía haber alguna relación entre la expresión de Brk en líneas sensibles e insensibles a erlotinib, proporcionando así un fundamento sobre por qué la inhibición de EGFR esta intrínsecamente ligada a Akt en células sensibles comparadas con insensibles. La Figura 4 muestra el análisis de transferencia Western de un cierto número de líneas procedente del panel de NSCLC y su respectiva expresión de la proteína Brk. De forma interesante, existe una muy buena correlación entre los niveles de Brk y la sensibilidad a erlotinib, en la medida en que una elevada expresión de Brk se iguala a una mayor sensibilidad a erlotinib y una ausencia o una expresión más baja de Brk tiende a caracterizar líneas
insensibles.

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El análisis de marcadores de EMT es predictivo de la sensibilidad a erlotinib de líneas de células pancreáticas en cultivo

Los autores de la invención extendieron seguidamente sus estudios para preguntarse si estas observaciones serían aplicables a otros tipos de células cancerígenas. Dado que erlotinib ha demostrado una eficacia en estudios de combinación en fase III con gemcitabina en cáncer pancreático, los autores examinaron la sensibilidad de líneas de células pancreáticas a la inhibición del crecimiento por parte de erlotinib in vitro y su expresión de marcadores de líneas epiteliales y mesenquimales. Consistente con los datos de NSCLC, líneas de células pancreáticas sensibles a erlotinib expresaban E-cadherina, pero no vimentina o fibronectina, mientras que líneas pancreáticas que son relativamente insensibles a erlotinib habían perdido la expresión de E-cadherina y adquirieron la expresión de vimentina y/o fibronectina (Figura 5). Estos resultados se observaron tanto mediante estudios de inmunotransferencia (Figura 5A) como de microscopía por fluorescencia confocal (Figura 5B).

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Pacientes con tumores que expresan altos niveles de E-cadherina tienen un mayor tiempo de progreso a la enfermedad cuando se tratan con erlotinib + quimioterapia en comparación con tratamiento con quimioterapia sólo

Muestras de pacientes que participaron en un ensayo clínico en fase III aleatorio y doble ciego, al que se alude como Tribute, se analizaron en cuanto a la expresión de E-cadherina por medio de inmunohistoquímica (IHC-siglas en inglés). Tribute ha estudiado 1079 pacientes en aproximadamente 150 centros en los Estados Unidos de América con NSCLC confirmada histológica, quienes no habían recibido una quimioterapia previa en comparación con erlotinib + quimioterapia (carboplatino/paclitaxel) con quimioterapia sola. Pacientes que recibieron paclitaxel (200 mg/m^{2}, 3 horas por infusión i.v.), seguido de carboplatino (AUC = 6 mg/ml x minuto infundido a lo largo de 15-30 minutos utilizando la fórmula de Calvert) con o sin erlotinib (100 mg/día p.o. ascendiendo a 150 mg/día para pacientes tolerantes). Muestras de tumores, bloques embebidos en parafina fijados con formalina o portaobjetos no teñidos, procedentes de 87 pacientes en el ensayo Tribute se inmunotiñeron para detectar la expresión de E-cadherina. La intensidad de la tinción se evaluó como 0,1 +, 2+ y 3+ con 65 de las 87 muestras con una intensidad de tinción >=2 y 22 que tenían una intensidad de tinción <=1.

La inmunohistoquímica para E-cadherina se llevó a cabo en secciones de tejido embebido en parafina y fijado con formalina, reunidas en una micromatriz de tejidos. Después de la desparafinización, se llevó a cabo la separación del antígeno mediante pretratamiento con disolución Target Retrieval a 110 grados C durante 20 min (DakoCytomation, Carpenteria CA). Las secciones pretratadas se incubaron después con anticuerpos IgG2 monoclonales de ratón primarios frente a E-cadherina (clon 36, Pharmingen) a una concentración de 1 microgramo/ml durante 60 min a la temperatura ambiente. El anticuerpo primario unido a las secciones se detectó utilizando IgG anti-ratón de caballo biotinilida y se visualizó utilizando la técnica del complejo de avidina-biotina peroxidasa (Vectastain ABC Elite, Vector Laboratories) y diaminobencidina como cromágeno.

Se determinó que pacientes cuyos tumores se teñían para altos valores de E-cadherina de la membrana y citoplásmica exhibían un tiempo significativamente mayor al progreso a la enfermedad (TTP) cuando se trataban con la combinación de erlotinib y quimioterapia en comparación con quimioterapia sola (34,0 semanas frente a 19,3 semanas, p=0,0028). Los resultados se proporcionan en la la Tabla 2 y se ilustran mediante la curva de Kaplan-Meier en la Figura 6a. Inversamente, pacientes cuyos tumores tenían una baja expresión de E-cadherina en la membrana y citoplásmica (intensidad de tinción de < =1) no tenían una diferencia significativa en TTP para los dos grupos de tratamiento que se ilustra por la curva de Kaplan-Meier en la Figura 6b.

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TABLA 2 Tiempo al progreso por parte de tinción con E-cadherina para grupos de tratamiento con erlotinib + quimioterapia y quimioterapia sola

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Conclusión

La pérdida de la expresión de E-cadherina y la adquisición de un fenotipo más mesenquimal ha demostrado correlacionarse con una prognosis deficiente en múltiples tumores sólidos derivados del epitelio. La pérdida de E-cadherina y, en menor medida, de \gamma-catenina y Brk se correlacionaba con la insensibilidad celular y del xenoinjerto a la inhibición del receptor del EGF. Inversamente, la adquisición celular de marcadores mesenquimales, vimentina, fibronectina o fibrilina se correlaciona con una pérdida de sensibilidad a inhibidores del receptor del EGF. Los autores de la invención demuestran claramente que una transición epitelial a mesenquimal, parcial o completa impacta negativamente sobre las respuestas celulares a inhibidores del receptor del EGF in vitro y en xenoinjertos y sirve como diagnóstico para pacientes que se benefician lo más probablemente de terapias con inhibidores de quinasa del receptor de EGF y de anticuerpos del receptor anti-EGF.

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Abreviaturas

EGF, factor de crecimiento epidérmico; EMT, transición epitelial a mesenquimal; NSCLC, carcinoma de pulmón de células no pequeñas; HNSCC, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; CRC, cáncer colorrectal; MBC, cáncer de mama metastásico, EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico, Brk, quinasa del tumor de mama (también conocido como proteína tirosina quinasa 6) (PTK6)); LC, cromatografía líquida, MS, espectrometría de masas; IGF-1, factor de crecimiento insulínico tipo 1, TGF\alpha, factor de crecimiento transformante alfa, HB-EGF, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina; LPA, ácido lisofosfatídico; TGF\alpha, factor de crecimiento transformante alfa; CI_{50}, concentración inhibidora semi-máxima; pY, fosfotirosina; wt, tipo salvaje; PI3K, fosfatidil inositol-3 quinasa; GAPDH, gliceraldehído de 3-fosfato deshidrogenasa.

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Equivalentes

Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de confirmar, utilizando no más de una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a realizaciones específicas de la invención descritas específicamente en esta memoria. Equivalentes de este tipo pretenden quedar abarcados por el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (9)

1. Un método in vitro para predecir la sensibilidad del crecimiento de células tumorales a una inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, que comprende: evaluar el nivel de un biomarcador epitelial expresado por una célula tumoral; evaluar el nivel de un biomarcador mesenquimal expresado por una célula tumoral; y predecir la sensibilidad del desarrollo de células tumorales a la inhibición por parte de un inhibidor de quinasa del EGFR, en el que una alta relación de niveles de expresión de biomarcador epitelial a mesenquimal se correlaciona con una elevada sensibilidad a la inhibición por parte de inhibidores de quinasa del EGFR.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial se selecciona de Brk, \gamma-catenina, \alpha1-catenina, \alpha2-catenina, \alpha3-catenina, queratina 8, queratina 18, conexina 31, placofilina 3, stratafina 1, laminina alfa-5 y ST14.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial es E-cadherina.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador mesenquimal se selecciona de vimentina, fibronectina, fibrilina-1, fibrilina-2, colágeno alfa-2(IV), colágeno alfa-2(V), LOXL1, nidogen, C11orf9, tenascina, fibronectina EDB^{+} embrional, tubulina alfa-3 y epimorfina.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial comprende Brk y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial comprende E-cadherina y el biomarcador mesenquimal comprende vimentina.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el biomarcador epitelial comprende \gamma-catenina y el biomarcador mesenquimal comprende fibronectina.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el inhibidor de quinasa del EGFR comprende erlotinib.