ES2350974T3 - Oligonucleótidos inhibidores y su utilización para reprimir específicamente un gen quie codifica para un receptor de los andrógenos. - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido bicatenario, caracterizado porque está constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3' o 5' de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16.

Description

La presente invención se refiere al campo de la investigación y del tratamiento genéticos de patologías humanas, en particular de los cánceres o de las enfermedades infecciosas. Más particularmente, la invención prevé proporcionar unos medios para determinar la función de un gen o de una familia de genes implicados en un proceso celular, y para reprimir un gen nocivo responsable de una patología en el ser humano o en el animal. La invención se refiere a los agentes activos para la realización de estos métodos y a las composiciones que los contienen.

Se conoce en la técnica anterior, unas técnicas de oligonucleótidos anti-sentido que permiten inhibir específicamente un gen en las células de mamíferos. Estas técnicas se basan en la introducción en las células de un oligonucleótido corto de ADN complementario del gen diana. Este oligonucleótido induce la degradación del ARN mensajero transcrito por el gen diana. Otro modo de acción de los anti-sentido consiste en introducir en la célula un oligonucleótido de ADN que formará una triple hélice con el gen diana. La formación de esta triple hélice reprime el gen, o bien bloqueando el acceso para unas proteínas activadoras, o bien en unos enfoques más sofisticados, induciendo la degradación del gen. Ninguno de estos enfoques parece apoyarse en un mecanismo celular existente en las células de mamíferos, y han demostrado ser poco eficaces. En efecto, la utilización de los anti-sentido en clínica se reduce a algunos casos raros, y no existe ninguna utilización posible de los oligonucleótidos que forman una triple hélice.

El método de la invención se basa en la interferencia ARN designada también "ARN’inh" o "ARNi" o también co-supresión, que se ha demostrado en las plantas. En las plantas, se ha observado que la introducción de un ARN largo bicatenario, que corresponde a un gen, induce la represión específica y eficaz del gen diana. El mecanismo de esta interferencia comprende la degradación del ARN bicatenario en dúplex cortos de oligonucleótidos de 20 a 22 nucleótidos.

Los inventores han demostrado ahora que este principio se puede aplicar a unos genes de mamíferos que desempeñan un papel importante en el control del destino celular.

El enfoque "ARN’inh" denominado más generalmente según la invención oligonucleótidos inhibidores o ARNi se basa en un mecanismo celular cuya importancia se subraya por su gran grado de conservación puesto que este mecanismo está conservado a través de los reinos y las especies, y ha sido demostrado no sólo en la planta, sino también en el gusano Caenorhabditis Elegans y la levadura y los mamíferos, seres humanos y ratones.

Los estudios de investigación realizados en el marco de la invención han mostrado que este enfoque es mucho más eficaz para reprimir específicamente los genes que las técnicas previstas en la técnica anterior. Además, reúne potencialmente las ventajas de los anti-sentido y de los anti-genes. En efecto, en la planta, la co-supresión se efectúa a nivel post-transcripcional, en el ARN maduro, pero también a nivel transcripcional, por lo tanto, en el gen en sí. En efecto, la represión se transmite de generación en generación y

permitiría por lo tanto reprimir un gen de manera prolongada, incluso definitiva.

La invención tiene por lo tanto por objeto un oligonucleótido bicatenario constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprende cada una en uno de sus extremos 3’ o 5’ de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16.

Cada una de las dos secuencias oligonucleotídicas complementarias comprende en uno de los extremos 3’ o 5’ de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido.

Ventajosamente, las dos secuencias oligonucleotídicas tienen el mismo tamaño.

Debido a la ley de apareamiento de las bases, se designará asimismo de forma indistinta a continuación por oligonucleótido de la invención, una u otra de las secuencias del oligonucleótido bicatenario de la invención que es complementario de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SECIDnº 16.

Los oligonucleótidos pueden ser de naturaleza ribonucleotídica, desoxirribonucleotídica o mixta. Se describe asimismo el oligonucleótido complementario de la secuencia diana, designado asimismo hebra antisentido, mayoritariamente de naturaleza ribonucleotídica. La hebra sentido puede ser de naturaleza ribonucleotídica, desoxirribonucleotídica o mixta. Unos ejemplos de oligonucleótidos de tipo ARN/ARN o ADN/ARN se proporcionan en la parte experimental a continuación.

En efecto, los híbridos ARN/ARN son más estables que los híbridos ADN/ADN o ADN/ARN y mucho más estables que los ácidos nucleicos monocatenarios utilizados en unas estrategias anti-sentido.

Se entiende asimismo por oligonucleótido, un polinucleótido de 2 a 100, y más generalmente de 5 a 50, nucleótidos de tipo ribo-, desoxirribo-o mixto.

Se describe la parte de la secuencia oligonucleotídica que se hibrida y complementaria de la secuencia diana que tiene un tamaño comprendido entre 15 y 25 nucleótidos, y muy preferentemente de 20 a 30 nucleótidos.

Los oligonucleótidos bicatenarios de la invención comprenden en uno de sus extremos 3’ a 5’ de cada hebra, de 1 a 5 nucleótidos, preferentemente de 2 a 3, y muy preferentemente 2 nucleótidos desbordantes del híbrido. Estos nucleótidos desbordantes del híbrido pueden ser o no complementarios de la secuencia diana. De esta manera, según la invención, los nucleótidos desbordantes del híbrido son unos nucleótidos

cualquiera, por ejemplo unas timinas.

Se puede representar un oligonucleótido bicatenario de la invención de la siguiente manera, en la que cada guión corresponde a un nucleótido y en la que cada hebra comprende en su extremo 3’ dos timinas desbordantes del híbrido.

imagen1

La secuencia de los oligonucleótidos descritos es sustancialmente complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN mensajero de un gen que se desea reprimir específicamente. A pesar de que se prefieren unos oligonucleótidos perfectamente complementarios de la secuencia diana, se entiende por sustancialmente complementaria, el hecho de que la secuencia oligonucleotídica puede comprender algunos nucleótidos mutados con respecto a la secuencia diana a partir de que las propiedades de represión del gen en cuestión no son alteradas. De esta manera, una secuencia oligonucleotídica descrita puede comprender de 1 a 3 nucleótidos mutados.

Estos nucleótidos mutados descritos pueden ser por lo tanto los desbordantes del híbrido o unos nucleótidos en el interior de la secuencia oligonucleotídica.

Un oligonucleótido de la invención es un híbrido perfecto. La parte de la secuencia oligonucleotídica que se hibrida es perfectamente complementaria de la secuencia diana mientras que los nucleótidos desbordantes del híbrido pueden ser cualquiera y en particular unas timinas. Se entiende de esta forma asimismo por perfectamente complementaria el hecho de que el oligonucleótido de la invención sea complementario de una secuencia que pertenece a un ADN o ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado. Los oligonucleótidos de la invención pueden permitir así discriminar entre la secuencia del gen salvaje y del gen mutado, lo cual puede presentar un interés particular tanto en el análisis de los genes como en las utilizaciones terapéuticas de los oligonucleótidos de la invención.

Los oligonucleótidos de la invención están constituidos generalmente por bases nucleotídicas naturales (A, T, G, C, U), pero pueden comprender asimismo unos nucleótidos modificados o unos nucleótidos que contienen unos grupos reactivos o unos agentes de puenteo o agentes intercalantes que pueden reaccionar con la secuencia diana complementaria al oligonucleótido.

Los oligonucleótidos de la invención se pueden preparar mediante los métodos convencionales de síntesis química o biológica de los oligonucleótidos.

La invención prevé asimismo los oligonucleótidos acoplados a unas sustancias que favorecen o que permiten su penetración, el apuntado o el direccionamiento en las células, se puede tratar de lípidos, de proteínas, de polipéptidos o de péptidos, o cualquier otra sustancia natural o sintética. En efecto, los oligonucleótidos de la invención están destinados a ser internalizados en las células y ventajosamente, en algunos casos, hasta en el núcleo de las células, en el que interactuarán con unas moléculas de ácido nucleico que contienen la secuencia diana del oligonucleótido. Asimismo, puede ser interesante favorecer su penetración en un tejido particular tal como un tumor, el hueso, etc.

Los oligonucleótidos descritos son útiles para reprimir de manera muy eficaz y muy específica un gen o un conjunto de genes y, por lo tanto, para el tratamiento de numerosas patologías humanas. Constituyen asimismo una herramienta de búsqueda para la investigación y la comprensión de la función de genes.

La invención tiene por lo tanto por objeto una composición, en particular farmacéutica para ser utilizada en la búsqueda de la función de gen o con fines terapéuticos o diagnósticos que comprende a título de agente activo por lo menos un oligonucleótido bicatenario constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3’ o 5’ de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16, o un oligonucleótido tal como se ha definido anteriormente acoplado a unas sustancias que favorecen o que permiten su penetración, reconocimiento o direccionamiento en las células.

Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar en unas aplicaciones ex vivo, por ejemplo durante un injerto. De esta manera, los oligonucleótidos pueden ser transfectados en unas células, en particular tumorales, que se inyectarán o se inyectan en los tejidos por ejemplo de los tumores ya desarrollados, por ejemplo por vía local, sistémica o aerosol, etc. con unos agentes de vectorización eventualmente necesarios.

Los oligonucleótidos se utilizarán a unas concentraciones suficientes en función de la aplicación y de la forma de administración utilizada con unos excipientes farmacéuticos apropiados. Según la naturaleza de los oligonucleótidos (ADN/ARN o ARN/ARN), se podrán utilizar unas dosis diferentes para obtener el efecto biológico buscado.

Los oligonucleótidos descritos en la presente invención son asimismo útiles como herramientas de diagnóstico que permiten establecer in vitro el perfil genético de un paciente a partir de una muestra celular de éste. La utilización de los oligonucleótidos descritos en dicho procedimiento de análisis permite conocer o anticipar la respuesta de las células cancerígenas de este paciente y establecer un tratamiento personalizado o también ajustar el tratamiento de un paciente.

Los oligonucleótidos de la invención presentan varias ventajas con respecto a los agentes quimioterapéuticos clásicos:

-Los híbridos ARN-ARN son más estables que los híbridos ADN-ADN o ADN-ARN y mucho más estables que los ácidos nucleicos monocatenarios utilizados en unas estrategias anti-sentido.

-Constituyen unos compuestos naturales, y no se debe temer a priori ninguna reacción inmunológica o de intolerancia medicamentosa,

-Los experimentos de transfecciones realizados en el marco de la invención muestran una mejor penetración de los ARNi en las células tumorales que la obtenida con unos plásmidos. Este punto es esencial en el caso de células tumorales que son generalmente muy difíciles de transfectar.

-Los experimentos de inyección sistémica de ARNsi in vivo muestran una 5 penetración muy buena de estas moléculas en los tejidos.

-Es fácil mezclar varios ARNi entre sí con el fin de considerar como dianas varios genes celulares al mismo tiempo.

10 Los oligonucleótidos descritos y las composiciones que los contienen son útiles para el tratamiento o para la prevención de las enfermedades infecciosas o víricas, en particular el SIDA, las enfermedades infecciosas no convencionales, en particular ESB o Kreutzfeld Jacob. Son indicados muy particularmente para tratar unas enfermedades víricas origen de cánceres. La tabla siguiente reúne unos ejemplos de virus implicados en

15 unas patologías cancerígenas en el ser humano.

Tabla 1

Virus

Tipo de cáncer humano asociado

Virus de la hepatitis B (VHB)

Carcinoma del hígado

Virus de Epstein-Barr (EBV)

Linfoma de Burkitt, cáncer nasofaríngeo, enfermedad de Hodgkin, linfomas no hodgkinianos, cáncer gástrico, cáncer de mama.

Virus del herpes humano 8 o HHV-8/KSHV

Sarcoma de Kaposi (SK), linfomas primitivos de las serosas (PEL), enfermedad de Castelman multifocal (MCD)

VPH

Cuello uterino, cabeza, cuello, piel, nasofaringe

Virus de los linfocitos T (HTLV)

Leucemia de tipo T

Virus de la hepatitis C (VHC)

Carcinoma del hígado

20 Los oligonucleótidos descritos y las composiciones que los contienen son asimismo útiles para el tratamiento o para la prevención de las enfermedades relacionadas con una hipervascularización tal como la degenerescencia macular relacionada con la edad, la angiogénesis tumoral, las retinopatías diabéticas, la soriasis o la artritis reumatoide.

25 Las investigaciones realizadas han permitido mostrar que estos oligonucleótidos están particularmente adaptados para reprimir unos genes nocivos implicados en la cancerización y son por lo tanto muy particularmente útiles para el tratamiento o para la prevención de los cánceres y más generalmente de las enfermedades oncológicas.

30 Los oligonucleótidos de la invención son útiles para la preparación de una composición farmacéutica útil para la prevención o para el tratamiento del cáncer.

De manera preferida, los oligonucleótidos de la invención son útiles para la preparación de una composición farmacéutica útil para la prevención o para el tratamiento 35 del cáncer de la próstata.

Un tratamiento anti-cancerígeno ideal debe provocar la muerte de la célula tumoral

evitando al mismo tiempo los fenómenos de resistencia. La muerte celular se puede

obtener mediante:

40 -Inhibición de la división celular, bloqueo del ciclo celular, -Inducción de la apoptosis de las células tumorales,

-Inducción de la senescencia,

-Inducción de la necrosis,

-Inducción de la diferenciación. En este caso, los tratamientos conducen a la célula a volverse normal.

De esta manera, en la presente invención, se describe un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos diferentes, que comprenden cada uno una secuencia oligonucleotídica complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN mensajero de un gen cuya represión induce la apoptosis, o la senescencia, o la necrosis, o la diferenciación de las células tumorales o impide su división, o varios de estos fenómenos.

La inducción de la apoptosis de las células tumorales se basa en el hecho de que la función de numerosos genes celulares (por ejemplo miembros de la familia BCL2, BCL XL) es proteger las células de la apoptosis. La pérdida de expresión de estos genes inducida por ARNi permite por lo tanto el paso en apoptosis.

La muerte celular puede ser provocada asimismo mediante la pérdida de adhesión de las células a la matriz (anoikis). Este efecto se puede obtener perturbando el balance entre proteasas e inhibidores de proteasas en los tumores y su entorno estromal. Esta perturbación tiene por otra parte por efecto disminuir las capacidades de las células tumorales para invadir los tejidos sanos y para metastasarse. Los ARNsi pueden por lo tanto ser utilizados para impedir la síntesis de las proteínas de las familias de las metaloproteasas matriciales (MMP), de las metalo-proteasas matriciales membranarias, de sus inhibidores (TIMP), así como la de los activadores de los inhibidores de las proteasas tal como, por ejemplo, PAI-1 y de las proteasas en sí tal como, por ejemplo, la urocinasa.

La inducción de la senescencia se basa en el hecho de que las células normales pueden dividirse sólo un número limitado de veces. Este número está programado a aproximadamente 50 divisiones por ejemplo para unos fibroblastos embrionarios, y "medido" mediante la longitud de los telómeros que se acorta a medida que tienen lugar las divisiones celulares. Por debajo de un cierto tamaño, los telómeros ya no son funcionales y la célula, incapaz de dividirse, entra en senescencia. En las células germinales sin embargo, esta longitud se mantiene constante mediante la acción de una enzima, la telomerasa. La telomerasa se re-expresa en numerosos cánceres, lo cual permite que las células tumorales se multipliquen indefinidamente. Un ARNi que bloquea la expresión de la telomerasa no tendría ninguna consecuencia sobre las células somáticas normales y debería conducir a las células tumorales hacia la senescencia.

El bloqueo de la división celular conduce asimismo a las células hacia la senescencia. Este bloqueo se puede obtener inhibiendo unos receptores celulares esenciales. Estos receptores pueden pertenecer según la naturaleza de la célula o bien a la clase de los receptores de los factores de crecimiento (EGF, SST2, PDGF, FGF, en particular), estén o no mutados, o bien a la de los receptores nucleares de hormonas

(andrógenos, estrógenos, glucocorticoides, en particular).

Los receptores de hormonas son frecuentemente mutados en los cánceres, y la invención se refiere en este caso a la utilización de oligonucleótidos que reconocen las formas mutadas de estos receptores y que no inhiben la síntesis de las formas salvajes. Esto permite por ejemplo en el caso de los carcinomas prostáticos que se han vuelto resistentes mediante mutación del receptor de los andrógenos tratar por vía sistémica a los pacientes con unos ARNsi que bloquean la síntesis del receptor mutado sin inducir ningún efecto de castración relacionado con la inhibición de las formas salvajes del receptor en otros órganos. Se presenta un ejemplo de utilización de oligonucleótidos que reconocen unas formas mutadas del receptor.

El ciclo celular puede ser detenido asimismo inhibiendo la síntesis de las proteínas indispensables para su desarrollo como, por ejemplo, las ciclinas, las quinasas dependientes de las ciclinas, enzimas de replicación del ADN, factores de transcripción tales como E2F.

La inducción de la necrosis resulta de la necesidad de las células tumorales en oxígeno y en nutrientes. Inicialmente, un tumor asegura su desarrollo a partir de los vasos pre-existentes del hospedante. Más allá de 1 a 2 mm de diámetro, las células situadas en el centro del tumor se encuentran en hipoxia. Esta hipoxia, por medio de una prolina hidroxilasa, provoca la estabilización del factor de transcripción Hif1α, cuya secuencia SEC ID nº 59 se proporciona en anexo, que, fijándose sobre unas secuencias HRE en los promotores de sus genes diana, inicia la reacción hipóxica. Esta reacción conduce a la activación de un centenar de genes permitiendo activar en particular la vía de la glicólisis anaerobia, la respuesta al estrés y la angiogénesis. Este último mecanismo activa en particular el gen del VEGF, cuya secuencia SEC ID nº 60 se proporciona en anexo, principal factor angiogénico tumoral.

De esta manera, unos oligonucleótidos que bloquean por ejemplo la expresión del factor de transcripción Hif1α o por ejemplo la del VEGF ponen las células tumorales en la incapacidad para montar una respuesta hipóxica o angiogénica. La angiogénesis es un mecanismo reprimido normalmente en el adulto, con la excepción del ciclo menstrual (útero, ovarios). La inhibición de este mecanismo tiene por lo tanto pocas consecuencias para los tejidos normales.

En la presente invención, se describe un oligonucleótido del que una de dichas secuencias oligonucleotídicas es sustancialmente complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN mensajero del gen que codifica:

-el factor de transcripción Hif1α;

-una o varias de las isoformas del VEGF A o de un miembro de la familia de este factor de crecimiento.

En algunos cánceres, el fenotipo tumoral resulta de, o está mantenido por, la expresión de una proteína normalmente ausente de las células normales. Esta proteína puede resultar de la expresión actual o antigua de un genoma vírico en la célula tal como el del virus del papiloma, HPV, o del virus de la hepatitis B. Esta proteína puede resultar asimismo de la mutación (puntual, deleción, inserción) de un gen celular normal. En este caso, es frecuente que la proteína mutada así producida posea unas propiedades transdominantes negativas con respecto a la proteína normal. La especificidad de los ARNsi permite inhibir la síntesis de la proteína mutante sin bloquear la síntesis de las proteínas salvajes. Dos ejemplos que se refieren a unas formas mutadas de la proteína p53 y del receptor de los andrógenos se exponen en la parte experimental a continuación.

Las investigaciones realizadas en el marco de la invención han permitido mostrar que estos oligonucleótidos están particularmente adaptados para reprimir unos genes nocivos implicados en la cancerización y muy particularmente los que conducen a la formación de proteína de fusión en las células cancerígenas, tal como la proteína de fusión PML-RAR alfa.

En la presente invención, se describen unos oligonucleótidos cuya secuencia es complementaria de una secuencia diana que pertenece a un gen que resulta de una translocación cromosómica de manera que se inhiben los efectos de la proteína de fusión expresada por este gen. De esta manera, la secuencia diana es la que corresponde a la secuencia de la unión de la proteína de fusión.

La tabla 2 del anexo A al final de la presente descripción es una lista no exhaustiva de las proteínas de fusión que representan unas dianas terapéuticas o de diagnóstico para los oligonucleótidos descritos.

El hecho de apuntar con un oligonucleótido descrito la unión entre dos genes, por ejemplo los dos genes pml y rarα, permite llegar a la inhibición específica de la proteína de fusión sin afectar al papel biológico de las proteínas naturales que pueden ser codificadas por el segundo alelo. Esta forma de realización abarca por lo tanto todas las proteínas de fusión implicadas en la cancerogénesis, particularmente las leucemias. Las formas recíprocas, si existen, así como todas las variantes de las proteínas de fusión citadas en anexo constituyen asimismo unas dianas. La invención se refiere por lo tanto muy particularmente a la utilización de los oligonucleótidos tal como se han definido anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de los cánceres.

Las terapias anti-cancerígenas actuales consideran como diana las células cancerígenas, mediante diferentes enfoques, considerados aisladamente o combinados entre sí (quimioterapia, cirugía, radioterapia, inmunoterapia). Los fracasos terapéuticos se deben masivamente o bien a unas células que no han sido alcanzadas por el tratamiento,

o bien, de forma mayoritaria, a unas células que han mutado en respuesta al tratamiento. Esta capacidad de mutación está facilitada en gran medida por la inestabilidad genética de las células tumorales. La inhibición de la vascularización tumoral, que priva las células de oxígeno y de nutrientes, ha abierto, desde algunos años, nuevas perspectivas terapéuticas en cancerología. Esta estrategia, complementaria de las anteriores, considera como diana la célula endotelial normal del hospedante, genéticamente estable, y por lo tanto teóricamente poco susceptible de mutar. Numerosos ensayos clínicos que prevén inhibir la angiogénesis tumoral mediante diferentes enfoques están en curso en el mundo. Sin embargo, los primeros resultados expuestos parecen bastante decepcionantes.

Los inventores han demostrado que unos tumores son capaces de compensar los efectos inhibidores de la angiogénesis, seleccionando unas sub-poblaciones de células que segregan fuertes concentraciones de factores pro-angiogénicos.

Los tumores no están constituidos por células homogéneas en cuanto a su expresión génica. Esto se demuestra mediante numerosos estudios en los que se han realizado unos inmunomarcajes para una gran variedad de antígenos en los tumores. Macroscópicamente, un tumor está compuesto frecuentemente por regiones muy vascularizadas que frecuentan unas zonas de necrosis o por el contrario avasculares.

Esta heterogeneidad tumoral favorece el escape de los tumores a los tratamientos aplicados, sea cual sea su naturaleza. Cuanto más grande es la diversidad de la expresión génica en un tumor, más elevada es efectivamente la probabilidad de que exista por lo menos una célula capaz de resistir a un agente anti-tumoral. Parece entonces esencial asociar diferentes estrategias con el fin de reducir en primer lugar la heterogeneidad tumoral y evitar los fenómenos de escape.

En la presente invención, se describen unos ARNsi inhibidores de la expresión de genes responsables de la desactivación de la p53 y a su utilización en el tratamiento de los cánceres. La p53 es el producto de un gen supresor de tumores o anti-oncógeno, mutado en más de 50% de los tumores en el ser humano. La p53 está así considerada como un "guardián del genoma". Se activa en las células en caso de estrés genotóxico y participa en diversos procesos que incluyen la inducción del proceso de muerte programada.

En 74% de los casos de mutación monoalélica, la desactivación de la p53 se debe a una mutación puntual que desemboca en la expresión de una proteína de tamaño normal, pero mutada. Se considera generalmente que la forma mutada forma unos heterómeros con el producto del alelo salvaje sobre el cual actúa como un "transdominante negativo" y bloquea su actividad. La forma mutante parece tener asimismo una actividad oncogénica en sí misma. De esta manera, unas formas mutadas de la p53 son capaces de activar el gen MDR, que facilita la resistencia de las células cancerígenas a las quimioterapias. Además, la expresión de mutantes de la p53 está asociada a una angiogénesis tumoral más fuerte, debido probablemente al hecho de que las formas mutantes de la p53 ya no son capaces de estimular la transcripción del gen de la trombospondina, uno de los represores más potentes de la angiogénesis, y activan el VEGF y el bFGF, dos potentes activadores de la angiogénesis. Además, las células en las que se expresa una forma mutada de la p53 pierden diversos niveles de regulación. En particular, ya no son capaces de iniciar un proceso de muerte programada, que constituye uno de los procesos principales de protección contra la tumorogénesis. La restauración de una actividad p53 salvaje provoca, en unas células tumorales en cultivo, la restauración de esta respuesta celular. De esta manera, la inhibición de la expresión de las formas mutadas de la p53 representa potencialmente una herramienta potente en terapia anticancerígena.

No existe, en la actualidad, ningún medio eficaz de restaurar una actividad p53 en las células cancerígenas humanas. En lo que se refiere a los cánceres en los que los dos alelos están desactivados, están previstas unas tentativas de restauración de la actividad p53 mediante terapia génica. Estos enfoques son complicados por la utilización de vectores víricos y se muestran, por el momento, poco eficaces.

Por otro lado, se ha observado específicamente en los cánceres cervicales

relacionados con la infección por el virus HPV de las células del cuello uterino, que la p53

puede ser desactivada mediante la sobreexpresión de una proteína vírica. En efecto, este

5 virus codifica para una proteína, la proteína E6, que desactiva la p53. En este tipo de cánceres, es la inhibición de la proteína E6 la que podrá restaurar una actividad p53 salvaje.

En la presente invención, se describen nuevos medios que permiten activar la p53

10 inhibiendo la expresión de genes responsables de su desactivación. Las investigaciones realizadas en el marco de la presente invención han permitido demostrar así que era posible reprimir de manera muy eficaz y muy específica la expresión de una forma mutante de la p53.

15 En la presente invención, se describen unos oligonucleótidos que presentan una secuencia complementaria de una secuencia polinucleotídica específica del gen de la p53 mutada. Se trata por lo tanto de oligonucleótidos cuya secuencia contiene una mutación con respecto a la secuencia de la p53 salvaje. La secuencia del gen salvaje de la p53 está indicada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 1. Las diferentes

20 mutaciones que pueden intervenir sobre la secuencia de la p53 están indicadas en la tabla 3 del anexo B al final de la presente descripción.

Las mutaciones observadas más frecuentemente en las patologías cancerígenas se indican en la tabla 4 siguiente. 25 Tabla 4

Posición

P53 salvaje SEC ID nº

R273H

GAGGTGCGTGTTTGTGC SEC ID nº 61

R248Q

gcaTgaaccggaggcccaT SEC ID nº 62

R248W

gcaTgaaccggaggcccaT SEC ID nº 63

R249S

gcaTgaaccggaggcccaT SEC ID nº 64

G245S

CTGCATGGGCGGCATGAAC SEC ID nº 65

R282W

TGGGAGAGACCGGCGCACA SEC ID nº 66

R175H

TGTGAGGCACTGCCCCCAC SEC ID nº 67

C242S

TAACAGTTCCTGCATGGGCG SEC ID nº 68

Posición

P53 mutada

R273H

GAGGTGCATGTTTGTGC SEC ID nº 69

R248Q

gcaTgaacCAgaggcccaT SEC ID nº 70

R248W

GCATGAACTGGAGGC CAT SEC ID nº 71

R249S

gcaTgaaccggagTcccaT SEC ID nº 72

G245S

CTGCATGC,GCAGCATGAAC SEC ID nº 73

R282W

TGGGAGAGACTGGCGCACA SEC ID nº 74

R175H

TGTGAGGCGCTGCCCCCAC SEC ID nº 75

C242S

TAACAGTTCCTCCATGGGCG SEC ID nº 76

De esta manera, unos oligonucleótidos descritos son complementarios de una

secuencia diana que pertenece al gen de la p53 mutado que contiene una por lo menos

de las mutaciones proporcionadas en la tabla 3 y muy particularmente una por lo menos

de las mutaciones de la tabla 4 anterior.

Estos oligonucleótidos son capaces de discriminar de manera eficaz entre la forma salvaje y la forma mutada de la p53. En efecto, la estrategia es bloquear la expresión de la forma mutada para reactivar la forma salvaje e inducir en las células un proceso de muerte programada para el cual la forma salvaje es indispensable, y/o bloquear cualquier otro proceso inducido por la forma mutada de la p53. Además, esta capacidad de discriminación de los oligonucleótidos de la invención permite tocar sólo las células cancerígenas y salvar las células normales, que no expresan esta forma mutada de la p53.

En la presente invención, se describe el tratamiento o la prevención de las enfermedades inducidas por una desactivación de la proteína p53 y muy particularmente los cánceres resultantes de la expresión de la proteína p53 mutada y los cánceres resultantes de la expresión de genes inhibidores de la p53. En la presente invención, se describe la prevención de la aparición de cánceres en los sujetos que expresan una forma mutada de la p53, tal como en el caso del síndrome de Li Fraumeni.

La p53 puede ser desactivada a través de varios mecanismos distintos. En particular, en la mayoría de los cánceres cervicales, la p53 está desactivada mediante una proteína codificada por el virus del papiloma humano, la proteína E6. E6 provoca la ubiquitinilación de la p53, lo cual conduce a su degradación mediante el proteasoma. En este caso, la expresión de la P53 puede ser restaurada mediante la inhibición de la expresión de la proteína E6. En la presente invención, se describen unos oligonucleótidos que presentan una secuencia complementaria de una secuencia polinucleotídica específica del gen de la proteína E6 de HPV. La secuencia del gen de la proteína E6 de HPV se proporciona en la figura 6A así como en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 2.

Tal como se ha indicado anteriormente, una estrategia según la invención tiene como objetivo bloquear con la ayuda de ARNi la expresión del receptor de los andrógenos en los carcinomas. La secuencia del receptor de los andrógenos se proporciona en el listado de secuencia en anexo con el número SEC ID nº 77. Para tratar los carcinomas antes de que se vuelvan resistentes o los que ya se han vuelto resistentes mediante amplificación del receptor sin mutación, se han utilizado unos ARNsi homólogos de una región para la cual no se ha descrito ninguna mutación en los bancos de datos de las mutaciones del receptor de los andrógenos (anotados ARNsi AR). Para tratar específicamente los carcinomas prostáticos que se han vuelto androgeno-resistentes por mutación, se efectuará una secuenciación del ARNm que codifica para el receptor en las células del paciente con el fin de concebir una secuencia específica de la mutación, permitiendo tratar al paciente sin consecuencia para las células normales. Un ejemplo se presenta mediante la utilización de ARNsi que reconocen específicamente la mutación del receptor de los andrógenos presente en la línea celular LNCaP (ARNsi LNCaP).

En consecuencia, la invención se refiere a unos oligonucleótidos bicatenarios constituidos por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3’ o 5’ de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16. Se trata, por ejemplo, del receptor de los andrógenos que contiene una por lo menos de las mutaciones proporcionadas en la tabla 5 del anexo C. Estos oligonucleótidos de la invención específicos del receptor de los andrógenos son útiles para tratar o para prevenir las enfermedades androgeno-dependientes, tales como, por ejemplo, el cáncer de la próstata.

Otras ventajas y características de la invención se pondrán más claramente de manifiesto en los ejemplos siguientes, que se refieren:

-Ejemplo 1: A la inhibición de la proteína PML-RARα asociada a la leucemia aguda promielocitaria (APL).

-Ejemplo 2: A la inhibición de la angiogénesis tumoral inducida por el VEGF.

-Ejemplo 3: A la inhibición de la respuesta hipóxica inducida por HIF1α.

-Ejemplo 4: A la inhibición de las formas salvajes o mutantes de los receptores de los andrógenos en las células de carcinoma prostático.

-Ejemplo 5: A la inhibición de las formas salvajes o mutantes de la proteína p53.

-Ejemplo 6: A la inhibición de la proteína vírica E6.

-Ejemplo 7: A la utilización de los híbridos ADN/ARN para inhibir la expresión de diferentes proteínas.

-Ejemplo 8: A la administración in vivo de ARNsi por diferentes vías.

En los ejemplos se hace referencia a las figuras, en las que:

-La figura 1A es una representación esquemática de las proteínas RARα, PML y de la proteína de fusión asociada, PML-RARα. La figura 1B representa los resultados de transfecciones con un ARNsi dirigido contra PML-RARα.

-La figura 2 se refiere a la inhibición de la expresión del VEGF por unos ARNsi dirigidos contra esta proteína y las consecuencias de esta inhibición. La figura 2A representa la inmunodetección del VEGF en unas células cJ4 o LNCaP transfectadas por el ARNsi de control o un ARNsi dirigido contra el VEGF. La figura 2B representa la cuantificación mediante ELISA del VEGF en el medio acondicionado de las células cj4 transfectadas por el ARNsi de control o el ARNsi VEGF en función del tiempo después de la transfección. La figura 2C representa la curva de crecimiento en unos ratones sin tratamientos previos de tumores que proceden de la inyección subcutánea de 106 células cJ4 no transfectadas, transfectadas por el ARNsi de control o el ARNsi VEGF. La figura 2D representa el aspecto de los tumores el 7º día después de la inyección de las células. La figura 2E representa la inmunodetección del VEGF en unos tumores que proceden de la inyección de células cj4 transfectadas con el ARNsi de control o el ARNsi VEGF después de 12 días de desarrollo in vivo.

-La figura 3 se refiere al efecto de la inhibición por un ARNsi específico de la expresión de un factor de transcripción, HIFIalfa, sobre la respuesta transcripcional a la hipoxia. La figura representa la medición de la actividad de un informador VEGF luciferasa en respuesta a la hipoxia en unas células cJ4 no transfectadas, transfectadas por el ARNsi de control o por el ARNsi dirigido contra HIFIalfa.

-La figura 4 se refiere a la inhibición por unos ARNsi específicos de la expresión del receptor de los andrógenos en unas células, y las consecuencias funcionales de estas inhibiciones. La figura 4A representa la detección mediante inmunotransferencia de la expresión del receptor de los andrógenos 48h después de la transfección de las células LNCaP por un ARNsi de control o un ARNsi dirigido contra el receptor de los andrógenos (AR). La figura 4B representa la medición de la actividad de un informador axARE luciferasa al R1881 en diversos clones de la línea LNCaP no transfectada, o transfectada por el ARNsi de control o el ARNsi AR. La figura 4C representa la comparación de la respuesta al R1881 de células LNCaP no transfectadas (100%), y de las células LNCaP transfectadas por un ARNsi de control, un ARNsi dirigido contra el receptor de los andrógenos (AR) o un ARNsi que reconoce específicamente una mutación puntual presente en el receptor de los andrógenos de la línea LNCaP. La figura 4D representa el crecimiento en unos ratones no tratados previamente de tumores resultantes de la inyección subcutánea de células LNCaP transfectadas por un ARNsi de control o por un ARNsi dirigido contra el receptor de los andrógenos. La figura 4E representa el crecimiento de tumores LNCaP en unos ratones que han recibido el 40º día después de la implantación de las células una inyección intravenosa en la vena de la cola de 2 µg de ARNsi dirigidos contra el VEGF o de ARNsi de control. La figura 4F representa el crecimiento de tumores LNCaP en unos ratones que han recibido en el 34º día y en el 40º día después de la implantación de las células tumorales una inyección intraperitoneal de 2 µg de ARNsi dirigido contra el receptor de los andrógenos o de ARNsi de control.

-La figura 5 se refiere a la inhibición de la expresión de formas salvajes o mutantes de la p53 por unos ARNsi y de las consecuencias funcionales de estas inhibiciones. La figura 5A representa la secuencia de proteína p53 humana. La figura 5B representa la inhibición específica y dependiente de la dosis por unos ARNsi de la expresión de formas salvajes o mutantes de la p53 transfectadas en unas células que no la expresan inicialmente. La figura 5C representa la inhibición específica por unos ARNsi de la expresión simultánea o no de formas salvajes o mutantes de la p53 transfectadas en unas células que no la expresan inicialmente. La figura 5D representa la inhibición de la expresión de la p53 endógena salvaje o de una forma mutante transfectada de p53 por unos ARNsi. La figura 5E representa el efecto de la inhibición de la p53 por unos ARNsi sobre la resistencia a un estrés genotóxico. Las figuras 5F, G, H e I muestran la inhibición de la expresión de una forma mutante de la p53 en las células de un paciente que padece el síndrome de Li Fraumeni en el nivel del ARNm (5G), y la expresión de la proteína mediante inmunotransferencia (5F) o en inmunofluorescencia indirecta (5H) y las consecuencias sobre la resistencia de estas células a un estrés genotóxico. La figura 5J muestra la inhibición por los ARNsi específicos de la transcripción dependiente de la p53 en unas células que expresan mediante transfección unas formas salvajes o mutantes de la p53. La figura 5K muestra la inhibición de la expresión de uno de los genes diana de la p53, la p21, proteína inhibidora de la proliferación celular, mediante la coexpresión de formas mutantes de la p53 y la restauración de esta expresión mediante el tratamiento de las células con un ARNsi que inhibe la síntesis de la forma mutante de la p53.

-La figura 6 se refiere a la inhibición de la expresión de la proteína E6 del virus del papiloma humano HPV mediante unos ARNsi específicos y las consecuencias de esta inhibición. La figura 6A representa la secuencia de la proteína HPV. La figura 6B representa el efecto de la inhibición por unos ARNsi específicos de la expresión de la proteína E6 de HPV en unas células que expresan este virus, sobre la expresión de la p53 y de la p21. Las figuras 6C y 6D representan el efecto de la inhibición de la expresión de la proteína E6 de HPV sobre el ciclo celular.

-La figura 7 se refiere a la utilización de ARNsi híbridos, que comprenden unas bases ADN y unas bases ARN. Las figuras 7A y 7B representan el efecto de ARNsi híbridos ADN/ARN sobre la expresión de la GFP expresada mediante transfección en unas células. La figura 7C compara el efecto de ARNsi ARN/ARN, ADN/ARN o ARN/ADN con dosis constante sobre la inhibición de la transcripción inducida por el receptor de los andrógenos. Las figuras 7D y 7E representan los efectos de una sustitución de bases ARN por unas bases ADN en la secuencia de ARNsi que inhibe la síntesis de la p53.

-La figura 8 se refiere a la inhibición de la luciferasa en unos tumores que expresan esta enzima mediante la inyección de ARNsi por vía subcutánea, o intra-tumoral o intra-peritoneal o intra-venosa.

EJEMPLO 1: INHIBICIÓN DE LA PROTEÍNA PML-RAR imagen2 ASOCIADA A LA LEUCEMIA AGUDA PROMIELOCITARIA (APL)

I -Introducción.

La leucemia aguda promielocitaria (APL) se debe a la translocación t(15; 17) sobre el cromosoma 15. En los pacientes que lo padecen, el receptor del ácido retinoico RARα (RARα) se fusiona a la proteína PML (promyelocytic leukemia protein) generando así la proteína de fusión PML-RARα. Hasta ahora, se han identificado cinco proteínas de fusión que utilizan el RARα. Todos estos tipos de leucemias implican el receptor RARα y son clínicamente similares, lo cual sugiere que la ruptura de la vía de transducción del ácido retinoico es crucial en la patogénesis de las leucemias APL.

La proteína de fusión PML-RARα ha guardado los dominios de unión al ADN y al ácido retinoico del RARα. Se ha mostrado que la proteína de fusión PML-RARα reprime la expresión de los genes diana del ácido retinoico y provoca así el bloqueo de la diferenciación de las células promielocitarias. Sólo la administración de dosis farmacológicas de ácido retinoico permite levantar la represión transcripcional ejercida por PML-RARα y el incremento de la diferenciación celular. Además, la porción proteica PML de la proteína de fusión podría asimismo intervenir en el mecanismo del bloqueo de la vía de transducción por el ácido retinoico. En la medida en la que PML funciona como un inhibidor de crecimiento y un agente apoptótico y que es necesaria para la expresión de ciertos genes inducida por el ácido retinoico, el efecto dominante negativo de PML-RARα sobre PML podría permitir que las células adquieran una capacidad de crecimiento, una resistencia a la apoptosis y una parada de la diferenciación.

Unos estudios de biología celular sobre PML han mostrado que esta proteína posee una localización particular en el núcleo, en unas estructuras particulares denominadas cuerpos nucleares. Parece que el papel de estas estructuras está en relación directa con el papel antioncógeno de PML. En las células malignas APL, la proteína PML-RARα provoca, mediante heterodimerización con PML, la deslocalización de PML de los cuerpos nucleares hacia unas estructuras micropuntuadas que pueden corresponder a unos sitios de anclaje de PML-RARα sobre la cromatina. Esta deslocalización podría bloquear la función pro-apoptótica de PML y su papel en la diferenciación mieloide. Varios equipos han mostrado que el tratamiento combinado con ácido retinoico y con el AS2O3 sobre unas líneas celulares que expresan la proteína de fusión PML-RARα permite la degradación de las proteínas de fusión al mismo tiempo que una relocalización de PML sobre los cuerpos nucleares. Esta reorganización de los cuerpos nucleares restaura las funciones de PML y contribuye al incremento de la diferenciación.

Por último, la proteína quimérica PML-RARα tendría por lo tanto un doble efecto dominante negativo, sobre RARα y sobre PML, permitiendo al mismo tiempo que las células se escapen de la apoptosis y bloquear la diferenciación de los promielocitos así transformados.

Más del 98% de los pacientes que padecen la leucemia APL presentan la translocación t(15; 17) (q22; q21) que conduce a la formación de genes fusionados PMLRARα y RARα-PML. Existen dos sub-tipos de proteínas de fusión PML-RARα, las fusiones S (short) y L (Long). La forma larga de la proteína de fusión PML-RARα que corresponde a una proteína de 955 aminoácidos representa la forma mayoritariamente expresada y ha sido por lo tanto considerada como modelo en este estudio (anexos A, B y C). Esta proteína comprende los aminoácidos 1 a 552 de la proteína PML fusionados con los aminoácidos 59 a 462 del receptor α del ácido retinoico (RARα).

II -Preparación y administración de los oligonucleótidos.

Se han sintetizado unos oligonucleótidos ARN complementarios que corresponden a la secuencia de la unión del gen de la proteína de fusión, es decir, 10 nucleótidos del gen PML y 10 nucleótidos del gen RARα, con adición de dos desoxitimidinas en dirección 3’ (figura 1). Estos oligonucleótidos han sido hibridados y se ha verificado la obtención del oligonucleótido bicatenario sobre gel de acrilamida.

Las secuencias de los ARNsi PML-RAR y de control utilizados (5’-3’) se proporcionan a continuación.

Control:

FW: [CAUGUCAUGUGUCACAUCUC]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 3)

REV: [GAGAUGUGACACAUGACAUG] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 4)

PR:

Sentido: [GGGGAGGCAGCCAUUGAGAC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 5)

Antisentido: [GUCUCAAUGGCUGCCUCCCC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 6)

III -Resultados

Unos fibroblastos NIH3T3 han sido co-transfectados con la lipofectamina mediante un vector de expresión de la proteína PML-RARα (100 ng) y mediante 500 ng de ARNsi de control (C) o dirigidos contra PML-RARα (PR). Se ha realizado, 48 horas después de la transfección, una transferencia western (figura 1B) sobre unos extractos celulares totales utilizando un anticuerpo que reconoce la proteína RARα, entera o en forma de proteína de fusión.

La figura 1B muestra que la transfección del ARNsi PR inhibe en gran medida la expresión de la proteína de fusión PML-RARα con respecto a las células transfectadas con el ARNsi de control (C), sin modificar la expresión de la proteína RARα.

EJEMPLO 2: INHIBICIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS TUMORAL POR EL VEGF

I -Introducción

El VEGF (vascular endothelial growth factor) es uno de los factores más potentes angiogénicos identificados. Estos factores son sobreexpresados en numerosas situaciones de hipervascularizaciones patológicas y en particular en el desarrollo tumoral. La inhibición de esta angiogénesis permite bloquear el crecimiento tumoral. El presente procedimiento tiene como objetivo inhibir la angiogénesis tumoral bloqueando la expresión de uno de estos factores angiogénicos y en este ejemplo, el del VEGF por las células tumorales.

II -Preparación y administración de los oligonucleótidos

Se han sintetizado dos oligonucleótidos ARN, complementarios de una región de la secuencia que codifica el VEGF humano, conservada en la rata y en el ratón. Se han añadido dos desoxinucleótidos (TT) en 3’.

-secuencia de los ARNi VEGF:

5'[AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 7) 5'[UUCUUUGGUCUGCAUUCACAU] ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 8)

-Secuencia de los ARNi de control:

5'[CAUGUCAUGUGUCACAUCUC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 9) 5'[GAGAUGUGACACAUGACAUg]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 10)

Estos oligonucleótidos o unos oligonucleótidos de control, cuya secuencia no presenta ninguna homología con las secuencias catalogadas en las bases de datos, han sido hibridados y transfectados utilizando el kit polyfect (Qiagen) en unas células de un fibrosarcoma de rata (cJ4) o en las células humanas del carcinoma prostático LNCaP.

III -Resultados

Se ha realizado una inmunofluorescencia indirecta, 48 horas después de la transfección, para detectar la expresión de la proteína en las células. La figura 2A muestra una inhibición masiva de la expresión del VEGF.

Para cuantificar este efecto, se ha efectuado una dosificación del VEGF mediante ELISA (quantikine, R&D) en unas células cJ4 transfectadas en paralelo con el ARNi de control o con el ARNi VEGF. Las células han sido incubadas 48 horas antes de la dosificación en un medio que contiene 1% de suero. La dosificación se ha realizado 4 días y 6 días después de la transfección. En estas condiciones, la figura 2B muestra una inhibición de la secreción de VEGF de 85% a 4 días y de 75% a 6 días, y de 60% a 13 días en las células transfectadas con el ARNi VEGF comparado con las transfectadas con el ARNi de control (figura 2B).

El efecto de la inhibición de la expresión de VEGF por las células tumorales ha sido ensayado in vivo: 3 días después de la transfección, tres grupos de 4 ratones hembras sin tratamiento previo de 4 semanas de edad han sido inyectados subcutáneamente a razón de un millón de células por ratón: el primer grupo ha sido inyectado con unas células no transfectadas, el segundo con unas células transfectadas por el ARNi de control, y el tercero por unas células transfectadas con el ARNi VEGF. No se ha efectuado antes de la inyección ninguna selección de las células transfectadas.

El crecimiento tumoral ha sido monitorizado midiendo el volumen de los tumores a intervalos regulares (figura 2C).

Las figuras 2C y 2D no muestran ninguna diferencia significativa entre los tamaños de los tumores de los grupos A y B. Una reducción muy fuerte del volumen tumoral se observa en el grupo C. El aspecto de los tumores, mucho más blancos en el grupo C (figura 2D) traduce una disminución marcada de la vascularización tumoral. Después del sacrificio de los animales, el día 12º después de la inyección, los tumores han sido disecados, fijados y se ha realizado una inmunodetección del VEGF sobre unos cortes de estos tumores. Se observa una reducción muy fuerte de la expresión del VEGF en los tumores del grupo C en comparación con las del grupo B (figura 2E).

En otro experimento, unos tumores han sido inducidos en unos ratones machos sin tratamiento previo mediante inyección de células del carcinoma prostático LNCaP. Habiendo alcanzado el volumen de los tumores 1 a 1,5 cm3 40 días después de la inyección, los ratones han sido divididos en dos grupos. El primer grupo (4 ratones) recibió una inyección intravenosa en la vena de la cola de 2 microgramos de ARNsi de control en 100 µl de PBS. El segundo grupo recibió una dosis equivalente de ARNsi VEGF en las mismas condiciones. Se observa que el ARNsi VEGF, pero no el ARNsi de control, induce una parada transitoria del crecimiento tumoral. (figura 4D).

EJEMPLO 3: INHIBICIÓN DE LA RESPUESTA HIPÓXICA

I -Introducción

Ciertos tumores son capaces de desarrollarse en unas condiciones de fuerte anoxia. Se observa muy frecuentemente en los tumores unas regiones muy poco vascularizadas. Esta poca sensibilidad a la hipoxia tiene dos consecuencias: por un lado un tratamiento anti-angiogénico tiene pocas posibilidades de ser eficaz sobre estos tumores o estas sub-poblaciones tumorales. Por otro lado, esta baja vascularización dificulta el suministro de moléculas terapéuticas. El factor de transcripción Hif1α regula la actividad de más de 100 genes que permiten la respuesta hipóxica. La inhibición de este factor de transcripción en los tumores hipóxicos tiene como objetivo bloquear su crecimiento.

II -Preparación de los oligonucleótidos

-ARNi Hif1α

5'[CAUGUGACCAUGAGGAAAUGA]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 11) 5'[UCAUUUCCUCAUGGUCACAUG]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 12)

-ARNi de control

5'[GAUAGCAAUGACGAAUGCGUA]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 13) 5'[UACGCAUUCGUCAUUGCUAUC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 14)

III -Resultados

El promotor del VEGF contiene un elemento de respuesta al factor de transcripción Hif1α. Para ensayar in vitro el efecto de un ARNi dirigido contra Hif1α, se han transfectado unas células cJ4 con un vector informador VEGF-luciferasa, solo o en asociación con un ARNi Hif1α o de control.

Las células han sido incubadas 24 horas después de la transfección durante 18 horas en un medio sin suero, adicionado o no con 100 µM de cloruro de cobalto con el fin de producir unas condiciones hipóxicas, y después se ha medido la actividad luciferasa.

La figura 3 muestra una inhibición completa de la inducción de la respuesta del promotor VEGF a la hipoxia que se observó cuando las células son transfectadas con el ARNi Rifα pero no con el ARNi de control.

EJEMPLO 4: Inhibición de las formas salvajes o mutantes de los receptores de los andrógenos en los carcinomas prostáticos

I -Introducción

Los carcinomas prostáticos son la segunda causa de mortalidad por cáncer para los seres humanos en los países industrializados. En Francia, son la causa de más de

9.500 muertes por año. Las células epiteliales prostáticas son dependientes de los endógenos para su crecimiento. Los carcinomas prostáticos son inicialmente androgenodependientes. Una castración química permite en un primer tiempo bloquear el crecimiento del carcinoma. Sin embargo, en todos los casos, estos carcinomas se vuelven androgeno-independientes y su pronóstico es entonces muy pesimista. Esta androgenoindependencia se debe, según los individuos, lo más frecuentemente a una mutación del receptor (que le confiere por ejemplo una respuesta a los estrógenos o a los glucocorticoides) o a una amplificación del receptor.

II -Preparación de los oligonucleótidos

Se han sintetizado dos oligonucleótidos ARN, complementario de una región de la secuencia que codifica el receptor andrógeno (AR) no mutado humano. Se han añadido dos desoxinucleótidos (TT) en 3’. En otros experimentos, se han utilizado unos ARNsi, denominados LNCaP, que reconocen específicamente la mutación del receptor de los andrógenos (T877A) en las células de carcinoma prostático humano LNCaP.

-AR:

5'[GACUCAGCUGCCCCAUCCACG]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 15)

5'[CGUGGAUGGGGCAGCUGAGUC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 16)

-Control:

5'[GAUAGCAAUGACGAAUGCGUA]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 17)

5'[UACGCAUUCGUCAUUGCUAUC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 18)

-LNCap:

5'[GCAUCAGUUCGCUUUUGAC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 19)

5'[GUCAAAAGCGAACUGAUGC]ARN-TT[ADN] (SEC ID nº 20)

Se han utilizado varios sub-clones de la línea de carcinoma prostático humana LNCaP en este estudio. La línea original, LNCaP es androgeno-dependiente. Las células LN70, obtenidas por pasos repetidos de la línea LNCaP in vitro, tienen una disminución de su respuesta a los andrógenos. El clon LNS5, obtenido después del paso de las células en el animal, es androgeno-resistente.

III -Resultados

Unas células LNCaP han sido transfectadas in vitro con unos ARNsi AR o unos ARNsi de control utilizando el agente de transfección polyfect (Qiagen). Las células han sido soltadas de su soporte 48 horas después de la transfección. La mitad de las células ha sido utilizada para realizar una detección mediante transferencia western del receptor de los andrógenos, y la otra mitad se ha recultivado. El receptor de los andrógenos (banda a 110 kDa) ya no es detectable mediante western en las células transfectadas por el ARNsi AR (figura 4A). Las células transfectadas por el ARNsi recultivadas han resultado incapaces de proseguir su crecimiento, al contrario que las células transfectadas por el ARNsi de control.

El nivel de respuesta a los andrógenos se ha medido transfectando diferentes clones celulares de la línea LNCaP con un vector informador disponiendo la secuencia que codifica la luciferasa corriente abajo de un promotor mínimo flanqueado por 4 repeticiones del elemento de respuesta a los andrógenos (4xARE). Después de la transfección, se han incubado las células durante 18 horas en ausencia de suero y en presencia o en ausencia de un análogo metabólicamente estable de la dihidrotestosterona, el R1881 (NEN). La relación de las actividades luciferasas en estas dos condiciones permite medir el nivel de respuesta a los andrógenos del vector informador.

Se ha medido el efecto de la cotransfección en estas células del ARNi de control o del ARNi AR sobre la respuesta a los andrógenos de los diferentes clones de la línea LNCaP.

La figura 4B muestra una inhibición completa de la respuesta a los andrógenos en los dos clones sensibles a los andrógenos: LNCaP y LNCaP p70. Este método no permite medir la respuesta del clon LNS5, androgeno-resistente, al tratamiento por el ARNi AR.

El receptor de los andrógenos presente en la línea LNCaP es portador de una mutación. Se han utilizado dos ARNsi diferentes para inhibir su síntesis, el ARNsi AR utilizado anteriormente y el ARNsi LNCaP que reconoce específicamente la mutación LNCaP. Se ha medido la respuesta a los andrógenos tal como en el experimento 4B (figura 4C).

Para estudiar el efecto de la inhibición de la expresión del receptor de los andrógenos sobre el crecimiento tumoral in vivo de las células de carcinoma prostático, unas células del carcinoma LNCaP, transfectadas por un ARNsi de control (grupo A) o AR (grupo b) han sido inyectadas subcutáneamente a unos ratones machos sin tratamiento previo. El crecimiento tumoral ha sido monitorizado a intervalos regulares. Se observa que los tumores de los animales del grupo B han empezado más tardíamente que los del grupo A y que el volumen de los tumores del grupo B en el 48º día es claramente más pequeño que el de los tumores del grupo A (figura 4D).

En otro experimento, unas células LNCaP han sido inyectadas en unos ratones machos sin tratamiento previo. Cuando, en el 34º día, los tumores han alcanzado un volumen comprendido entre 1,2 y 1,5 cm3, los ratones han recibido por vía intraperitoneal una inyección de 2 µg de ARNsi de control o AR en 100 µl de PBS. Esta inyección se repitió en el 40º día. Se observa que la administración de ARNsi AR provoca una

disminución de la velocidad del crecimiento tumoral (figura 4E).

EJEMPLO 5: Inhibición de las formas salvajes o mutantes de la proteína p53

I-Preparación de los oligonucleótidos

Se han preparado los tres ARNsi cuya secuencia se indica a continuación, uno dirigido contra la forma salvaje de la p53, y el otro dirigido contra la forma mutada expresada en un paciente y que ha dado lugar al establecimiento de una línea.

Esta mutación corresponde a unas de las tres observadas más frecuentemente en los tumores humanos.

-

p53 salvaje:

Sentido: [GCAUGAACCGGAGGCCCAU]ARN[TT]ADN (SEC ID Nº 21) Anti: [AUGGGCCUCCGGWCAUGC]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 22)

-

p53 MT1 (r248w):

Sentido: [GCAUGAACUGGAGGCCCAU]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 23) Anti: [AUGGGCCUCCAGWCAUGC]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 24)

-

p53 MT2 (r248w):

Sentido: [UCAUGAACUGGAGGCCCAU]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 25) Anti: [AUGGGCCUCCAGWCAUGA]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 26)

Los

nucleótidos subrayados en la p53 salvaje son los mutados en la forma

mutante, y que están en cursiva en las secuencias de las formas mutadas de la p53 mutado (p53 MT1 y MT2). Las bases anteriores en negrita son unas mutaciones que han sido introducidas para aumentar la especificidad.

II -Resultados

Tal como se ha mostrado en la figura 5B, las células H1299-NCl, que no expresan la p53, han sido transfectadas (utilizando la lipofectamina) por unos vectores de expresión (400 ng) de la p53 salvaje (WT) o mutada (mt.). Los ARNsi (en dosis creciente: 0, 125 ng, 250 ng, 500 ng y 1.000 ng) dirigidos contra la forma salvaje (WT), la forma mutada (MT1 y MT2), o un ARNsi irrelevante (C) han sido transfectados al mismo tiempo. Las células han sido recogidas 24 horas después, y se han analizado mediante transferencia western con un anticuerpo dirigido contra la p53.

Tal como se muestra en la figura 5C, las células H1299-NCl, que no expresan la p53, han sido transfectadas (utilizando la lipofectamina) por los vectores de expresión (400 ng) de la p53 salvaje (WT), mutada (mt.), o una mezcla de las dos (WT + MT), tal como se ha indicado. Los ARNsi (400 ng) dirigidos contra la forma salvaje (WT), la forma mutada (MT1), o un ARNsi irrelevante (C) han sido transfectados al mismo tiempo. Las células han sido recogidas 24 horas después, y se han analizado mediante transferencia western (ib: immunoblot) con un anticuerpo dirigido contra la p53 (DO1, Santa Cruz), o la actina celular (Sigma) para controlar la cantidad de proteínas utilizada en el ensayo.

Tal como se muestra en la figura 5D, unas células U2OS (osteosarcoma humano que expresa una forma salvaje de la p53) han sido transfectadas de manera estable o bien por un vector que expresa una forma mutante de la p53 (R248W), o bien por el vector vacío correspondiente (pCADN3). Estas líneas han sido transfectadas por los ARNsi indicados y la expresión de las proteínas indicadas ha sido detectada mediante transferencia western.

En todos los casos, el ARNsi dirigido contra la forma mutada de la proteína inhibe la forma mutada y el ARNsi dirigido contra la forma salvaje inhibe la forma salvaje. Además, no existe ninguna "reacción cruzada", puesto que el ARNsi dirigido contra la forma salvaje no tiene ningún efecto sobre la forma mutada y recíprocamente. Se debe observar que la expresión del mutante estabiliza la proteína salvaje cuando está coexpresada. En consecuencia, la inhibición del mutante devuelve, mediante este efecto indirecto, la forma salvaje a su nivel de base, sin que haya ninguna inhibición de la expresión de la proteína.

Tal como se muestra en la figura 5E, las células utilizadas en la figura 5D han sido transfectadas por los ARNsi indicados. Las células han sido sometidas a continuación a un estrés genotóxico mediante un tratamiento con doxorrubicina (200 ng/ml) durante 24 horas). La figura 5E muestra el análisis del ciclo celular de estas células mediante la incorporación de yoduro de propidio y análisis con FACS. Las células no transfectadas con la forma mutante, y por lo tanto que expresan sólo la forma salvaje (células PCADN) muestran un alto porcentaje de parada en G1 en presencia de doxorrubicina. El tratamiento de estas células por el ARNsi salvaje, disminuyendo la p53, reduce esta parada en G1. Las células que expresan la forma mutada y salvaje (R248W) se paran poco en G1 en presencia de doxorrubicina, mostrando que la forma mutada inhibe la actividad de la forma salvaje. Cuando estas células se tratan con el ARNsi mt1, recuperan una capacidad normal (a comparar con los controles PCADN no tratados) para pararse en G1, mostrando la restauración de la actividad p53 salvaje en estas células.

Tal como se muestra en las figuras 5F, G, H, las células MDA 087 (que proceden de un paciente que padece un síndrome de Li Fraumeni y que expresan el mutante R248W) han sido transfectadas con un ARNsi dirigido contra la forma mutante (MT1) de la p53, o también con un ARNsi irrelevante (C) (1,6 µg). La expresión de la p53 ha sido detectada en estas células mediante transferencia western (figura 5F), los ARN mensajeros han sido medidos mediante PCR cuantitativa (Light cycler, Roche) (figura 5G)

o inmunofluorescencia (figura 5H).

Las células MDA 087 han sido transfectadas con un ARNsi que reconoce la forma salvaje (WT) o la forma mutada de la p53 (mtl) o también por un ARNsi de control, y se han sometido a continuación a un estrés genotóxico mediante un tratamiento con doxorrubicina (200 ng/ml) durante 24 horas. La expresión de la forma mutante de la p53 ha sido detectada mediante transferencia western en las células. Se observa que las células que han recibido el ARNsi mt1 no son capaces de estabilizar la p53 en respuesta a la doxorrubicina (figura 5I).

La figura 5J muestra el efecto de los ARNsi mt1 y mt2 en unas células que expresan las formas salvajes y mutadas de la p53. Las células H1299-NCl, que no expresan la p53, han sido transfectadas (usando la lipofectamina) por un vector informador que comprende el gen de la luciferasa bajo el control de un elemento de respuesta a la p53 y unos vectores de expresión (400 ng) de la p53 salvaje (WT), mutada (MT) o una mezcla de las dos (WT + MT), tal como se ha indicado. Los ARNsi (400 ng) dirigidos contra la forma salvaje (WT), la forma mutada (mt1, mt2), o un ARNsi irrelevante

(C) han sido transfectados al mismo tiempo. Las células han sido recogidas 24 horas después, y han sido analizadas para la expresión de la luciferasa. La p53 salvaje sola activa el vector informador, y la co-expresión de la forma mutante inhibe esta actividad. La co-transfección del ARNsi salvaje inhibe la expresión de la proteína salvaje y por lo tanto la activación residual del gen informador. La co-transfección de los ARNsi mt1 y mt2, por el contrario, restaura esta activación bloqueando selectivamente la expresión de la forma mutada e impidiendo el efecto de transdominante negativo que ejerce sobre la forma p53 salvaje.

La figura 5K muestra un resultado similar sobre la expresión de una de las dianas de la p53, la proteína inhibidora de la proliferación celular p21, en unas células tratadas tal como en la figura 5F. La expresión de la p21, detectada mediante transferencia western está activada por la p53 salvaje y está inhibida cuando el mutante se co-expresa. Esta inhibición se levanta en presencia del ARNsi mt1.

EJEMPLO 6: Inhibición de la proteína vírica E6

I-Preparación de los oligonucleótidos

Se ha preparado asimismo un ARNsi dirigido contra la proteína E6 de HPV. Responde a la secuencia siguiente:

-HPV-16-S2

Sentido: 5' [CCACAGUUAUGCACAGAGC]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 27) Anti: 5' [GCUCUGUGCAUAACUUGG]ARN[TT]]ADN (SEC ID nº 28)

II -Resultados

Tal como se ha mostrado en la figura 6B, unas células CasKi y SiHA, que expresan ambas la proteína E6 de HPV han sido transfectadas con los ARNsi indicados, tratadas o no como se ha indicado por la doxorrubicina y analizadas mediante transferencia western utilizando los anticuerpos indicados. El tratamiento de las células por el ARNsi E6 induce un aumento de la expresión de p53. Esta expresión de p53 se traduce por un aumento de la expresión de la proteína p21.

Tal como se muestra en la figura 6C, el ciclo celular de las células SiHA tratadas tal como en la figura 6B ha sido analizado mediante FACS. La figura representa un experimento característico. Se observa un aumento de células en fase G1 (figura 6D) en las células tratadas por el ARNsi E6, aumento que se observa asimismo en estas células cuando estas son tratadas mediante la doxorrubicina.

EJEMPLO 7: Efecto de los oligonucleótidos ARN/ARN y de los híbridos ADN/ARN

I -Introducción

La invención prevé la utilización de oligonucleótidos híbridos ADN/ARN como alternativa a los oligonucleótidos ARN/ARN para inhibir específicamente la expresión de un gen. En el caso de los híbridos ADN/ARN, la hebra sentido es preferentemente de naturaleza ADN y la hebra anti-sentido de naturaleza ARN. Los demás aspectos que se refieren en particular al tamaño de los oligonucleótidos, a la naturaleza de los extremos 3’ y al modo de síntesis, son los mismos que para los oligonucleótidos ARN/ARN. Las aplicaciones de estos híbridos ADN/ARN son idénticas a las descritas anteriormente para los ARNsi ARN/ARN, en particular en lo que se refiere a las aplicaciones terapéuticas, con objetivo de diagnóstico o de validación de genes. Las dosis de oligonucleótidos usadas para obtener los mismos efectos con los híbridos ADN/ARN y los ARN/ARN pueden sin embargo ser diferentes.

II -Preparación de los oligonucleótidos

La hebra sentido es aquélla cuya secuencia es idéntica a la del ARN mensajero. La hebra anti-sentido es la hebra complementaria de la hebra sentido. Por convención, en un dúplex, la naturaleza de las hebras se indica en el orden sentido/anti-sentido. De esta manera, por ejemplo, un híbrido ADN/ARN, anotado D/R es un oligonucleótido cuya hebra sentido es de naturaleza ADN y la hebra anti-sentido es de naturaleza ARN y de secuencia complementaria del ARN mensajero.

En los experimentos descritos, se han utilizado los oligonucleótidos cuya secuencia está indicada a continuación.

-Para la GFP:

GAP

Sentido: [GCAAGCTGACCCTGAAGTTCAT] ADN (SEC ID nº 29)

Antisentido: [GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG]ARN (SEC ID nº 30)

Control GFP:

Sentido: [CAUGUCAUGUGUCACAUCUC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 31)

Antisentido: [GAGAUGUGACACAUGACAUG]ARN[TT]ADN (SEC ID nº 32)

-Para el LNCaP: Las bases subrayadas a continuación corresponden a la mutación del receptor de los andrógenos expresada en las células del carcinoma prostático humano (LNCap).

LNCaP: Sentido: [GCATCAGTTCGCTTTTGACTT] ADN (SEC ID nº 33)

[GCAUCAGUUCGCUUUUGAC] ARN-TT [ADN] (SEC ID nº 34) Antisentido: [GTCAAAAGCGAACTGATGCTT] ADN (SEC ID nº 35)

[GUCAAAAGCGAACUGAUGC] ARN-TT [ADN] (SEC ID nº 36) Control LNCaP: Sentido: [GUUCGGUCUGCUUACACUA] ARN-TT [ADN] (SEC ID nº 37) Antisentido: [UAGUGUAAGCAGACCGAAC] ARN-TT [ADN] (SEC ID nº 38)

-Para la P53: Las hebras ADN de los híbridos anotados H1 comprenden unas bases ARN (U,

subrayadas). La mutación presente en los oligonucleótidos MT1 se indica en cursiva. WT: Sentido: 5' [GCAUGAACCGGAGGCCCAU] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 39)

Anti: 5' [AUGGGCCUCCGGUUCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 40) wtH1 D/R: Sentido: 5' [GCAUGAACCGGAGGCCCAUTT] ADN (SEC ID nº 41)

Anti: 5' [AUGGGCCUCCGGWCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 42) wt H1 R/D: Sentido: 5' [GCAUGAACCGGAGGCCCAU] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 43)

Anti: 5'[AUGGGCCUCCGGUUCAUGCTT]ADN (SEC ID nº 44) wt H2 D/R: Sentido: 5' [GCATGAACCGGAGGCCCATTT] ADN (SEC ID nº 45)

Anti: 5' [AUGGGCCUCCGGUUCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 46)

wt H2 R/D:

Sentido: 5' [GCAUGAACCGGAGGCCCAU] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 47) Anti: 5' ATGGGCCUTCCGGTTCATGCTT] ADN (SEC ID nº 48)

Mtl (r248w)**:

Sentido: 5' [GCAUGAACUGGAGGCCCAU]ARN [TT] ADN (SEC ID nº 49) Anti: 5' [AUGGGCCUCCAGUUCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 50)

Mtl H1 D/R:

Sentido: 5' [GCAUGAACUGGAGGCCCAUTT] ADN (SEC ID nº 51) Anti: 5' [AUGGGCCUCCAGUUCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 52)

Mtl H1 R/D:

Sentido: 5' [GCAUGAACUGGAGGCCCAU] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 53) Anti: 5' AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT] ADN (SEC ID nº 54)

Mtl H2 D/R:

Sentido: 5' [GCATGAACTGGAGGCCCATTT] ADN (SEC ID nº 55) Anti: 5' [AUGGGCCUCCAGUUCAUGC] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 56)

Mtl H2 R/D:

Sentido: 5' [GCATGAACTGGAGGCCCAT] ARN [TT] ADN (SEC ID nº 57) Anti: 5' [AUGGGCCUCCAGUUCAUGCTT] ADN (SEC ID nº 58)

II -Resultados

1) Inhibición de la GFP (Green Fluorescent Protein) por los híbridos ADN/ARN

Los ARNsi de control (R/R) o GFP (D/R) en dosis crecientes han sido introducidos por transfección utilizando el kit Polyfect en los mioblastos de ratones C2C12, al mismo tiempo que un vector de expresión de la GFP. El nivel de GFP ha sido monitorizado mediante transferencia western (figura 7A) y mediante la medición directa de la fluorescencia emitida por la GFP con la ayuda de un fluorímetro (figura 7B). Se observa una fuerte inhibición (hasta 80%) de la expresión de la GFP por los ARNsi híbridos ADN/ARN.

2) Inhibición del receptor de los andrógenos por los híbridos ADN/ARN.

Las células LNCaP han sido transfectadas con un vector informador que pone la luciferasa bajo el control de un promotor que contiene 4 elementos de respuesta al receptor de los andrógenos. Los ARNsi R/R, D/R o R/D indicados en la figura han sido transfectados 24 horas más tarde por el agente de transfección Transit-tKO (Mirus) a razón de 250 ng de cada bicatenario para 80.000 células. Las células han sido incubadas en un medio completo que contiene unos andrógenos, y la actividad luciferasa, normalizada con respecto a la cantidad de proteínas de cada muestra, ha sido medida 24 horas más tarde (figura 7C). Los híbridos R/D no han mostrado ninguna actividad inhibidora en este experimento. Los híbridos LNCaP D/R inhiben tan eficazmente como los ARNsi R/R el receptor de los andrógenos.

3) Inhibición de la p53 por los híbridos ADN/ARN

La figura 7D muestra que los híbridos H1 D/R son tan eficaces como los R/R para inhibir la expresión de los genes. Las células H1299-NCl, que no expresan la p53, han sido transfectadas (utilizando la lipofectamina) por unos vectores de expresión (400 ng) de la p53 salvaje (WT), mutada (MT) o una mezcla de las dos (WT + MT), tal como se ha indicado. Un vector CMV-GFP ha sido transfectado asimismo como control interno. Los ARNsi (400 ng) dirigidos contra la forma salvaje (WT), la forma mutada (MT), o un ARNsi irrelevante (CTRL) han sido transfectados al mismo tiempo. Las células han sido recogidas 24 horas después, y se han analizado mediante transferencia western con un anticuerpo dirigido contra la p53 (DO1, Santa Cruz), o la GFP (Sant-Cruz) para controlar la eficacia de la transfección. Nota: la expresión de la forma mutada de la proteína estabiliza la forma salvaje.

La figura 7E muestra que los híbridos H2 D/R son tan eficaces como los R/R para inhibir la expresión de los genes. Las células H1299-NCl, que no expresan la p53, han sido transfectadas (utilizando la lipofectamina) por unos vectores de expresión (400 ng) de la p53 salvaje (WT), mutada (MT) o una mezcla de las dos (WT + MT), tal como se ha indicado. Los ARNsi (400 ng) dirigidos contra la forma salvaje (WT), la forma mutada (MT), o un ARNsi irrelevante (C) han sido transfectados al mismo tiempo. Las células han sido recogidas 24 horas después, y se han analizado mediante transferencia western con un anticuerpo dirigido contra la p53 (DO1, Santa Cruz).

EJEMPLO 8: Administración in vivo de ARNsi por diferentes vías

Unas células tumorales que expresan la luciferasa de manera estable han sido inyectadas subcutáneamente a unos ratones sin tratamiento previo (1 millón de células en el flanco derecho). El 8º día del crecimiento tumoral, los tumores que tienen un volumen medio de 200 mm3 han sido inyectados o bien con unos ARNsi de control (secuencia mezclada de HIF1 alfa, véase el ejemplo 3), o bien con un ARNsi dirigido contra la luciferasa. Los ARNsi de control (3 µg/ratón) han sido inyectados en un volumen de 50 µl de PBS por vía subcutánea en el flanco del animal.

Los ARNsi luciferasa han sido inyectados a razón de 3 µg/ratón (3 animales en cada grupo) en 50 µl de PBS por vía subcutánea (sc), o por vía intraperitoneal (ip) o por vía intravenosa (iv) (vena de la cola) o por vía intratumoral (it). En este último caso, los ARNsi luciferasa (3 µg/ratón) han sido diluidos en 20 µl de PBS sólo.

Tres días después de la inyección de los ARNsi, los animales han sido sacrificados, los tumores han sido extraídos y homogeneizados con la ayuda de un triturador polytron. Sobre los homogeneizados, se han realizado una dosificación de las proteínas y una medición de la actividad luciferasa en un luminómetro.

Los resultados representados en la figura 8 muestran la actividad luciferasa aplicada a la cantidad de proteína.

Tabla 2 Anexo A

Enfermedad APL (acute promyelocytic leukaemia)

Proteína de fusion PML-RARalpha PLZF-RARalpha NPM-RARalpha NuMA-RARalpha STATSbeta/RARalpha Translocación cromosómica t(15;17)(q22;q21) t(11;17)(q23;q21) t(5;17)(q32;q12) t(5;17)(q13;q21)

ALL (acute lymphoblastic leukaemia)

TEL-AML1 BCR/ABL MLLIAF4 t(12;21) (p13;q22) t(9;22)(q34;q 11) t(4;11)(q21;q23)

ALL-translocation CALM/AF10 ALL1/AF4

t(12:21)(q12;q22) t(10;11)(p12-p13; q14-q21) t(4;11)

E2A/HLF

t(17;19)(q22;p13)

AML (acute myeloid leukemia)

TLS/FUS-ERG MLL-AF10 MLL-ABI1 t(16;21)(p11;q22) AML (M7) t(10;11)(p12-p13; q23); t(10;11)

HLXB9-ETV6 MLL-ELL CBFbeta/MYH11 AML1-MTG8 TEL-TRKC AML1/ETO CALM/AF10 ETV6-BTL CBFbeta-SMMHC FUS/ERG

t(7;12)(q36;p13) t(11;19)(q23;p13.1) inv[16] t(8;21) t(12;15)(p13;q25) t(8;21) t(10;11) (p12-p13; q 14-q21 ) t(4;12)(q11-q12;p13). inv(16)(p13;q22) t(16;21)(p11;q22)

DEK/CAN MLL-AF9

t(6;9)(p23;q34). t(9;11)(p22;q23)

MLL-ENL MLL-AF4

(11q23) t(4;11)(q21;q23)

MLL-AF6 MLL-AF17

t(6;11)(q27;23) t(11;17)(q23;q21)

MLL-AFX

t(X;11)(q13;q23).

MLL-AF1p

MLL-AF1q

t(1;11)(q21;q23)

MLL self MLL-CBP

t(11;16)(q23;p13)

Referencias

De The et al. Cell 1991, 66: 675 ChenZ et al. EMBOJ 1993, 12:1161 Redner RL et al. Blood 1996, 87:882 Wells RA et al. Leukemia 1996, 10:735 Arnould C et al. Hum. Mol Genet. 1999, 8:1741

Domer PH et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 7884-8

Dreyling MH et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:4804 Janssen JW et al. Blood 1994, 84:3835

Hunger SP

et al. Genes Dey 1992,

6:1608

Ichikawa

H et al. Cancer Res 1994,

54:2865

Borkhardt A et al. Leukemia 1995, 9:1796

Shibuya et al. Genes Chromosomes Cancer 2001, 32:1 Beverloo et al. Cancer Res 2001, 61:5374 Rubnitz JE et al. Blood 1996, 87:4804 Tobal K et al. BrJ Haematol 1995, 91:104 Miyoshi et al. EMBO J 1993, 12:2715 Eguch et al. Blood, 1999, 93:1355 Kusec R et al. Leukemia, 1994, 8:735 Dreyling MH et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:4804

Cools et al. Blood 1999, 94: 1820 Wijmenga C et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996, 93:1630

Panagopoulos I et al. Genes Chromosomes Cancer, 1994, 11:256

on Lindem M et al. Mol Cell Biol, 1992, 12:1687 Super HJ et al. Blood, 1995, 85:855 Schreiner SA et al. Leukemia 1999, 13:1525 Domer PH et al. Proc NatI Acad Sci USA 1993, 90: 7884 Tanabe S et al. Genes Chromosomes Cancer 1996, 15:206 Prasad R et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1994, 91: 8107 Borkhardt A et al. Oncogene 1997,14:195 So CW et al. Leukemia 2000, 14:594

Tabla 2 (continuación) Anexo A

Enfermedad

Proteína de Translocación Referencias

fusion

cromosómica

AML1-ETO

t(8;21) Busson-Le Coniat M et al. Leukemia

1999, 13:302

So CW et al. Cancer Res 1997, 57:117

Taki T et al. Blood 1997, 89: 3945

Erickson P et al. Blood 1992, 80:1825

MDS/AML

NPM-MLF1 t(3;5)(q25.1;q34) Yoneda-Kato N et al. Oncogene 1996,

(myelodysplasia/

12:265

acute myeloid

leukemia)

CML (chronic

Bcr-Ab1/p210 Ben-Neriah Y et al. Science 1986,

myelogenous

233:212

leukemia)

AML1-MDS1-EVI1 t(3;21)(q26;q22) Fears S et al. Proc Natl Acad Sci U S A

1996, 93: 1642

(AME)

BpALL (cell acute

TEL-AML1 t(12;21) (p13;q22) Golub TR et al. Proc Natl Acad Sci U S A

lymphoblastic

1995, 92: 4917

leukemia)

MPD

TEL-JAK2 t(9;12)(p24;q13) Lacronique et al. Science 1997, 278

(myeloproliferative

:1309

disease)

TEL-PDGFbetaR t(5;12)(q33;p13) Jousset C et al. EMBO J, 1997, 16 :69

TEL-TRKC

t(12;15)(p13;q25) Eguch et al. Blood, 1999, 93:1355

CMML (chronic

involving PDGFbetaR t(5;17)(q33;p13) Magnusson et al. Blood 2001 98:2518

myelomonocytic

HIP1/PDGFbetaR t(5;7)(q33;q11.2) Ross TS et al. Blood 1998, 91:4419

leukemia)

TEL/PDGFbetaR t(5;12)(q33;p13) Tomasson MH et al. Blood 1999, 93:1707

MALT (gastric

API2-MALT1 t(11;18)(q21;q21) Motegi M et al. Am J Pathol 2000,

mucosa

156:807

associated

lymphoid tissue

lymphoma)

ALCL (anaplastic

NPM-ALK t(2;5)(p23;q35) Waggott W et al. Br J Haematol 1995,

large cell

89:905

lymphoma)

SU-DHL-1 t(2;5) Siminovitch KA et al. Blood 1986, 67:391

ATIC-ALK

inv(2)(p23q35) Colleoni GW et al. Am J Pathol 2000,

156:781

ALK-related

t(2;17)(p23;q25) Maes et al. Am J Pathol 2001, 158:2185

translocation

MPD

NUP98-HOXA9 t(7;11)(p15;p15) Nakamura T et al. Nat Genet 1996,

(myeloproliferative

12:154

disease)

APP (amyloid

APP+1 (38-kDa) Hersberger et al. J Neurochem 2001

precursor protein)

76(5): 1308-14

in sporadic

Alzheimer's

disease (AD) or

Down's syndrome

primary pleural

SYT-SSX1 t(X;18)(p11.2;q11.2) Crew AJ et al. EMBO J 1995,14:2333

monophasic

SYT-SSX2 t(X;18)(p11.2;q11.2) Crew AJ et al. EMBO J 1995,14:2333

synovial sarcomas

(SS)

Dermatofibrosarco COL1A1/PDGFB

t(17;22) O’ Brien KP et al. Genes Chromosomes

ma protuberans

rearrangement Cancer 1998, 23:187

(DP)

Tabla 2 (continuación) Anexo A

Enfermedad

Proteína de Translocación Referencias

fusion

cromosómica

ARMS (pediatric

EWS-FLII Athale et al. J Pediatr Hematol Oncol

alveolar

2001, 23: 99

rhabdomyosarcom EWS-ERG

t(11;22)(q24;q12) Sorensen PH et al. Nat Genet 1994,

a)

6:146

ESFT (Ewing

PAX3-FKHR t(2;13)(q35;q14) Fredericks W J et al. Mol Cell Biol

sarcoma family of

1995,15:1522

tumors)

PAX7-FKHR t(1;13)(p36;q14) Barr FG et al. Hum Mol Genet 1996, 5:15

DSRCT

EWS-WTI t(11:22)(p13:q12) Benjamin et al. Med Pediatr Oncol 1996

(desmoplastic

27(5):434-9

small round cell

EWS/FI-1 t(11-22) (q24;q12) Fidelia-Lambert et al. Hum Pathol 1999,

tumors)

30:78

MM (multiple

IGH-MMSET t(4;14)(p16.3;q32) Malgeri et al. Cancer Res 2000 60:4058

myeloma)

MPD (stem cell

FGFR1-CEP110 t(8;9)(p12;q33) Guasch et al. Blood 2000 95:1788

myeloproliferative

disorder)

Ewing sarcoma

EWS-FEV t(2;22)(q13;q22,t(3;18) Llombart-Bosch et al. Diagn Mol Pathol

(ES)-peripheral

(p21;q23) 2000, 9: 137

primitive

EWS-FLI1 t(11;22;14)(q24;q12;q11) Bonin G et al. Cancer Res 1993, 53:3655

neuroectodermal

tumor (pPNET)

EWS-ERG

t(21;22)(q22;q12) Sorensen PH et al. Nat Genet. 1994,

6:146

ETV6/CBFA2

t(12;21)(p12;q22) Fears S et al. Genes Chromosomes

Cancer 1996, 17:127

MLS (myxoid

FUS/CHOP t(12;16)(q13;p11) Rabbitts TH et al. Nat Genet 1993, 4:175

liposarcomas)

EWS/CHOP t(12;22;20)(q13;q12;q11) Zinszner H et al. Genes Dev 1994, 8:2513

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECERCHE SCIENTIFIQUE

<120> Oligonucleótidos inhibidores, y su utilización para reprimir específicamente un gen

<130> 24240PCT Noviembre de 2002

<140> pct/fr02/xxxxx

<141> 08/11/2002

<150> FR01/14549

<151> 09/11/2001

<150> FR02/04474

<151> 10/04/2002

<160> 77

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 1182

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1182)

<223> Secuencia del gen p53

<400> 1 <210> 2

imagen1

<211> 7904 <212> ADN 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7904) 10 <223> Variante HPV16

<400> 2

imagen3

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> hebra sentido de PML-raro

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(22)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 3

caugucaugu gucacaucuc tt

<210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> hebra anti-sentido de PML-raro

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 4

gagaugugac acaugacaug tt

22

<210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> hebra sentido PLM-raro <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos <400> 5

ggggaggcag ccauugagac tt

22

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> hebra anti-sentido PML-raro

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Residuos de timina añadidos

<400> 6

gucucaaugg cugccucccc tt

22

<210> 7

<211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Secuencia procedente del VGEF humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 7

augugaaugc agaccaaaga att

23

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del VEGF humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 8

uucuuugguc ugcauucaca utt

23

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> secuencia procedente del VEGF humano

<220> <221> misc_feature

<222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 9

caugucaugu gucacaucuc tt

22

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> secuencia procedente del VEGF humano

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 10

gagaugugac acaugacaug tt

22

<210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 11

caugugacca ugaggaaaug att

23

<210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 12

ucauuuccuc auggucacau gtt

23

<210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220> <221> misc feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 13

gauagcaaug acgaaugcgu att

23

<210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> Secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<400> 14

uacgcauucg ucauugcuau ctt

23

<210> 15 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 15

gacucagcug ccccauccac gtt

23

<210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> residuos de timina añadidos

<400> 16

cguggauggg gcagcugagu ctt

23

<210> 17 <211>23 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 17

gauagcaaug acgaaugcgu att 23

<210> 18

<211> 23

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> secuencia procedente del HIF 1 alfa humano

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(23)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 18

uacgcauucg ucauugcuau ctt 23

<210> 19

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> Secuencia procedente del receptor de andrógenos que contiene la mutación T8 77A

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 19 gcaucaguuc gcuuuugact t 21

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos que contiene la mutación T8 77A

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 20

gucaaaagcg aacugaugct t 21

<210> 21

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del p53 humano salvaje (sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 21

gcaugaaccg gaggcccaut t 21

<210> 22

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje (antisentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 22

augggccucc gguucaugct t 21

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del p53 humano mutado que contiene la mutación MT1 (r248w) (sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 23

gcaugaacug gaggcccaut t 21

<210> 24

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del p53 humano mutado que contiene la mutación MT1 (r248w) (antisentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 24 augggccucc aguucaugct t 21

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del p53 humano mutado que contiene la mutación MT2 (r248w) (sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 25

ucaugaacug gaggcccaut t 21

<210> 26

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del p53 humano mutado que contiene la mutación MT2 (r248w) (antisentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 26

augggccucc aguucaugat t 21

<210> 27

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del E6 de HPV (sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 27

ccacaguuau gcacagagctt

21

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> secuencia procedente del E6 de HPV (antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> residuos de timina añadidos

<400> 28

gcucugugca uaacuuggtt

20

<210> 29 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> secuencia procedente del gen que codifica la GFP (hebra sentido)

<400> 29

gcaagctgac cctgaagttc at

22

<210> 30 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> secuencia procedente del gen que codifica la GFP (hebra anti-sentido)

<400> 30

gaacuucagg gucagcuugc cg

22

<210> 31 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> secuencia procedente del gen que codifica la GFP (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 31

caugucaugu gucacaucuc tt

22

<210> 32 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> secuencia procedente del gen que codifica la GFP (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 32

gagaugugac acaugacaug tt

22

<210> 33

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra sentido)

<400> 33

gcatcagttc gcttttgact t 21

<210> 34

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 34

gcaucaguuc gcuuuugact t 21

<210> 35

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra sentido)

<400> 35

gtcaaaagcg aactgatgct t

21

<210> 36

<211> 21

<212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 36

gucaaaagcg aacugaugct t 21

<210> 37

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra sentido)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> residuos de timina añadidos

<400> 37

guucggucug cuuacacuat t 21

<210> 38

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del receptor de andrógenos humano mutado (hebra antisentido)

<220>

<221> misc_feature

<222>

(20)..(21)

<222>

(1)..(3933)

-103

<223> residuos de timina añadidos

<400> 38

uaguguaagc agaccgaact t

21

<210> 39 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 39

gcaugaaccg gaggcccaut t

21

<210> 40 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 40

augggccucc gguucaugct t

21

<210> 41 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 41

gcaugaaccg gaggcccaut t

21

<210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 42

augggccucc gguucaugct t

21

<210> 43 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 muté (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 43

gcaugaaccg gaggcccaut t

21

<210> 44 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 44

augggccucc gguucaugct t

21

<210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 muté (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 45

gcatgaaccg gaggcccattt

21

<210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 46

augggccucc gguucaugct t

21

<210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 47

gcaugaaccg gaggcccaut t

21

<210> 48 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> residuos de timina añadidos

<400> 48

atgggccutc cggttcatgc tt

22

<210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 49

gcaugaacug gaggcccaut t

21

<210> 50 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 50

augggccucc aguucaugct t

21

<210> 51 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220>

<221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 51

gcaugaacug gaggcccaut t

21

<210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 52

augggccucc aguucaugct t

21

<210> 53 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 53

gcaugaacug gaggcccaut t

21

<210> 54 <211> 21 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 54

augggccucc aguucaugct t

21

<210> 55 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 55

gcatgaactg gaggcccatt t

21

<210> 56 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 56

augggccucc aguucaugct t

21

<210> 57 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra sentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos <400> 57

gcatgaactg gaggcccatt t

21

<210> 58 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado (hebra antisentido)

<220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> residuos de timina añadidos

<400> 58

augggccucc aguucaugct t

21

<210> 59 <211> 3933 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature

<223> Homo sapiens hypoxia-inducible factor 1 sub-unidad alfa. (HIF-1 alfa)

<400> 59

imagen1

imagen1

<210> 60 5 <211> 3166

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> misc_feature

<222> (1)..(3166)

<223> VEGF A humano

<400> 60 15

imagen1

imagen1

<210> 61 <211> 17 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 61

gaggtgcgtg tttgtgc

17

<210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 62

gcatgaaccg gaggcccat

19

<210> 63 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 63

gcatgaaccg gaggcccat

19

<210> 64 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 64

gcatgaaccg gaggcccat

19

<210> 65 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 65

ctgcatgggc ggcatgaac

19

<210> 66 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 66

tgggagagac cggcgcaca

19

<210> 67

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 67

tgtgaggcac tgcccccac 19

<210> 68

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano salvaje

<400> 68

taacagttcc tgcatgggcg 20

<210> 69

<211> 17

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(17)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r273h

<400> 69

gaggtgcatg tttgtgc

17

<210> 70

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r248q

<400> 70

gcatgaacca gaggcccat 19

<210> 71

<211> 18

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r248w

<400> 71

gcatgaactg gaggccat 18

<210> 72

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r249s

<400> 72

gcatgaaccg gagtcccat

19

<210> 73

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> <221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación g245s

<400> 73

ctgcatgggc agcatgaac 19

<210> 74

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r282w

<400> 74

tgggagagac tggcgcaca 19

<210> 75

<211> 19

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación r175h

<400> 75

tgtgaggcgc tgcccccac 19

<210> 76

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> secuencia procedente del gen p53 humano mutado que contiene la mutación c242s

<400> 76

taacagttcc tccatgggcg

20

5

<210> 77 <211> 3231 <212> ADN <213> Homo sapiens

10

<220> <221> misc_feature <222> (1).. (3231) <223> secuencia que codifica el receptor de andrógenos humano.

<400> 77

imagen1

imagen1

Claims (5)

1. Reivindicaciones

   1.

   Oligonucleótido bicatenario, caracterizado porque está constituido por dos secuencias oligonucleotídicas complementarias que forman un híbrido que comprenden cada una en uno de sus extremos 3’ o 5’ de uno a cinco nucleótidos no apareados que forman unos extremos monocatenarios desbordantes del híbrido, siendo una de dichas secuencias oligonucleotídicas complementaria de una secuencia diana que pertenece a una molécula de ADN o de ARN de un gen que codifica un receptor de los andrógenos mutado o no mutado, estando una de dichas secuencias oligonucleotídicas representada en el listado de secuencias en anexo con el número SEC ID nº 15 o SEC ID nº 16.

2. 2.

   Oligonucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque está acoplado a unas sustancias que favorecen o que permiten su penetración, su apuntado o su direccionamiento en las células.

3. 3.

   Composición, en particular farmacéutica, para ser utilizada con fines terapéuticos o de diagnóstico, caracterizada porque comprende a título de agente activo por lo menos un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. 4.

   Utilización de un oligonucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, para el tratamiento de un cáncer.

5. 5.

   Utilización según la reivindicación 4, caracterizada porque dicho cáncer es el cáncer de la próstata.

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