ES2350992B2 - Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. - Google Patents
Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2350992B2 ES2350992B2 ES200901370A ES200901370A ES2350992B2 ES 2350992 B2 ES2350992 B2 ES 2350992B2 ES 200901370 A ES200901370 A ES 200901370A ES 200901370 A ES200901370 A ES 200901370A ES 2350992 B2 ES2350992 B2 ES 2350992B2
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lectin
- uea
- sample
- aeruginosa
- strains
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C12R1/89—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56905—Protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Método y kit de reconocimiento de cepas de
Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no
productoras de microcistinas. La presente invención se refiere a un
método para detectar cepas productoras de microcistina y cepas no
productoras de esta toxina dentro de poblaciones de Microcystis
aeruginosa (Cyanobacteria), mediante la utilización de la
lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus
(UEA-1), de una sonda de marcaje de la lectina y de
los medios necesarios para detectar la sonda. Así mismo la invención
proporciona un kit para el reconocimiento de cepas productoras y no
productoras de microcistina basado en el método descrito.
Description
Método y kit de reconocimiento de cepas de
Microcystis aeruginosa (Cyanobacteria) productoras y no
productoras de microcistinas.
La invención se encuadra en el sector de la
biotecnología para la sanidad ambiental, y más en concreto, en el
relativo a métodos y dispositivos (kits) de reconocimiento de
microorganismos productores de toxinas en agua.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cianobacterias tóxicas engloban un amplio
rango de microalgas capaces de proliferar en aguas continentales de
todo el mundo, en especial cuando éstas tienen un alto grado de
eutrofia, constituyendo una importante preocupación a nivel
internacional.
Unas 40 especies de cianobacterias son capaces
de producir toxinas (microcistinas). Estas toxinas son capaces de
permanecer inalteradas durante largos periodos de tiempo en el medio
acuático siendo un peligro potencial para la salud humana así como
para la fauna doméstica y silvestre. Varios estudios científicos han
demostrado que la microcistina produjo la muerte de 50 personas en
Brasil; casos similares han sido descritos en otros países como
China, donde los blooms o floraciones de cianobacterias tóxicas son
ya un importante problema de salud pública (Zhang et al.,
2009. Sci. Total Environ. 407: 2191-9).
Recientemente en Europa se ha asociado la presencia de microcistina
en el agua de consumo con un incremento en la prevalencia de cáncer
de colon e hígado (Martínez et al., 2009. Med.
Hypotheses 72: 539-40).
Los blooms de cianobacterias tóxicas también han
sido responsables de mortandades masivas de fauna silvestre en
reservas naturales protegidas como el caso del Espacio Natural de
Doñana descrito por López-Rodas et al. (2008.
Vet. Rec. 162: 317-8).
La cianobacteria tóxica que aparece implicada en
la mayoría de episodios tóxicos es M. aeruginosa (Kützing),
productora de microcistina-LR (hepatotoxina). Sin
embargo, no todos los blooms de M. aeruginosa son blooms
tóxicos. De hecho, generalmente durante el periodo de máxima
proliferación de éstas microalgas y en una misma masa de agua,
existen variaciones en la concentración de microcistina. Sivonen y
Jones (1999. En Chorus, I. & Bartram, J. [Eds.] Toxic
cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences,
monitoring and management, pp. 41-111.
Routledge. London.) indican que uno de los factores fundamentales
responsables de la variación de concentración de toxina en el medio,
por encima de las condiciones medioambientales, es la presencia de
una mezcla de cepas capaces de generar una alta producción de toxina
junto con cepas no tóxicas.
En este sentido, diversos estudios han
demostrado que existe una gran variabilidad genética respecto a la
producción de microcistina en diferentes cepas de M.
aeruginosa, concluyendo que existen cepas de M.
aeruginosa altamente tóxicas, cepas muy poco tóxicas y cepas no
tóxicas (Martín et al., 2004. Limnetica 23
1-2: 153-8).
Ante la toxicidad de M. aeruginosa se han
implantado sistemas de control y redes de alerta temprana de la
presencia de cepas tóxicas de M. aeruginosa en los embalses
destinados a la red abastecimiento urbano así como en aquellas masas
de agua de las que se abastecen ganado, y fauna silvestre de interés
en conservación (p.e en el Espacio Natural de Doñana).
Para cumplir este objetivo es necesario contar
con métodos de detección rápidos que permitan discriminar de manera
inequívoca entre cepas tóxicas y no tóxicas de M. aeruginosa.
Por el momento no hay un procedimiento eficaz y rápido. Se puede
hacer mediante la secuenciación del DNA buscando los genes de la
microcistina, pero es un procedimiento complejo y lento. En este
sentido el uso de lectinas conjugadas con Isotiocianato de
Fluoresceína (FITC) es una alternativa mucho más sencilla y
rápida.
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas
capaces de unirse mediante enlaces no covalentes a los residuos de
monosacáridos u oligosacáridos presentes en la superficie celular.
Las lectinas han sido ampliamente utilizadas en la clasificación de
bacterias, protozoos y otros microorganismos. La aplicación de
lectinas conjugadas con FITC junto con técnicas de epifluorescencia
microscópica han permitido diferenciar entre especies de
dinoflagelados morfológicamente similares.
También se ha empleado lectinas conjugadas con
FITC para discernir entre diferentes cepas de microorganismos
productores de toxinas. Se han empleado diferentes lectinas para
reconocer cepas tóxicas de M. aeruginosa (Alvarez et
al., 1998. En Reguera, B., Blanco, J., Fernández, M.L. y Wyatt,
T. [Eds.] Harmful algae. pp. 291-5. Xunta de
Galicia and Intergovernmental Oceanographic Commission of UNESCO,
París.), de Alexandrium tamarense (Cho et al., 2001.
J. Plankton Res. 23: 89-95), o para reconocer
cepas de Pseudonitzchia multiseries Hasle productoras de
ácido domóico (Cho et al., 2002. Bot. Mar. 45:
346-72; y Cho, 2003. J. Plankton Res. 25:
309-15.). Recientemente, Hou y colaboradores (2008.
J. Appl. Phycol. 20: 35-46) han empleado
lectinas para reconocer 23 cepas productoras de toxinas de 13
especies diferentes y típicamente problemáticas en aguas de China,
incluyendo Alexandrium tamarense, A. catenella, A. minutum,
Karenia mikimotoi, Takayama pulchellum, Akashiwo sanguínea,
Gyrodinium instriatum, Gymnodinium sp, Prorocentrum donghaiense,
y P. minimum.
Cabe destacar que una de las conclusiones más
importantes de los trabajos citados es que, aunque el reconocimiento
de dinoflagelados tóxicos mediante lectinas es un método sencillo y
rápido, la variabilidad genética de las distintas especies puede
provocar problemas de falso reconocimiento y discriminación (ver,
por ejemplo, Hou et al., 2008. J. Appl. Phycol. 20:
35-46). Por este motivo es necesario obtener
lectinas que permitan superar el problema y discernir con total
garantía y fiabilidad entre cepas productoras de toxinas y cepas no
productoras, de forma que pueda implantarse su empleo rutinario en
los sistemas de control y alerta temprana de calidad de agua.
Teniendo en cuenta que M. aeruginosa
aparece implicada en la mayoría de episodios tóxicos de
proliferaciones de cianobacterias a escala mundial, y que se
caracteriza por una gran variabilidad genética respecto a la
producción de microcistina, resulta especialmente necesario e
interesante la obtención de una lectina que permita reconocer y
discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M.
aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina.
La presente invención tiene por objeto principal
proporcionar un kit basado en una lectina que permite reconocer y
discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M.
aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina. También se reivindica
el método basado en dicho kit por el que se puede reconocer y
discernir inequívocamente entre cepas tóxicas de M.
aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina. Se trata de un
procedimiento fiable, rápido y de sencillo desarrollo, de
implantación idónea en los sistemas de red de alerta temprana en
embalses de abastecimiento urbano y sistemas de control de aguas de
abastecimiento de ganado y aguas refugio de fauna silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa en el hallazgo
inesperado de que la lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus
(UEA-I) es capaz de reconocer y discriminar
inequívocamente entre cepas de Microcystis aeruginosa
productoras de microcistina de las no productoras.
Los inventores han observado que la lectina
UEA-I se une a la superficie celular de las cepas de
M. aeruginosa no productoras de microcistina investigadas, y
no se une a las cepas de M. aeruginosa productoras de
microcistina. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se
piensa que hay un ligamiento entre los genes que codifican las
glicoproteínas transmembrana diana de la lectina
UEA-I y los genes que codifican microcistinas en
M. aeruginosa, lo que garantiza que la presencia de la
glicoproteína diana de la lectina UEA-I en la
superficie celular de M. aeruginosa, y por tanto, su
reconocimiento y unión por UEA-I, es incompatible
con la producción de microcistina en M. aeruginosa.
De esta forma, mediante un kit que contenga
lectina UEA-I y los medios necesarios para detectar
la unión de dicha lectina con su glicoproteína diana de la
superficie celular de M. aeruginosa, es posible discernir
inequívocamente entre la presencia o ausencia de cepas de M.
aeruginosa productoras de microcistina en una muestra dada. El
método para discernir inequívocamente entre la presencia o ausencia
de cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina en una
muestra dada comprende la exposición de dicha muestra a la lectina
UEA-I en presencia de los medios necesarios para
detectar la unión de dicha lectina con su glicoproteína diana de la
superficie celular de M. aeruginosa, y la posterior detección
de señal.
Un método de estas características, basado en el
empleo de la lectina UEA-I, resulta en un
procedimiento de total fiabilidad para la detección de cepas tóxicas
de M. aeruginosa en el medio, lo que supone un gran avance
técnico en relación con los métodos basados en reconocimiento de la
superficie celular de cepas tóxicas conocidos, que por su sencillez
y rapidez, son más interesantes que otros métodos basados en
secuenciación de DNA, de alta fiabilidad pero de mayor complejidad,
duración, coste económico y requerimiento técnico.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, se
entiende por "lectinas", proteínas o glicoproteínas capaces de
unirse mediante enlaces no covalentes a los residuos de
monosacáridos u oligosacáridos presentes en la superficie celular.
En concreto, la lectina Aglutinina 1 de Ulex europaeus
(UEA-I), es una proteína o glicoproteína producida
por Ulex europaeus con afinidad específica por residuos de
L-fucosa.
Por "sonda", se entiende un elemento de
mareaje que interacciona con una molécula diana, y es capaz de
producir una señal detectable cuando en dicha molécula diana se
produce un cambio de estado, por ejemplo, por efecto del
reconocimiento de otra molécula, o de su unión con otra molécula.
Una "sonda fluorescente" o "fluoróforo", es un elemento de
mareaje capaz de emitir luz fluorescente cuando se produce un cambio
de estado de la molécula diana con la que interacciona.
Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) es una sonda fluorescente que
se emplea comercialmente unida a la lectina UEA-I
para detectar una unión no covalente de dicha lectina a una molécula
diana que puede ser una glicoproteína, un glicolípido o un glúcido.
La epifluorescencia es la técnica que permite detectar la
fluorescencia emitida por la sonda fluorescente o fluoróforo. Puede
aplicarse a un microcospio adaptado para la epifluorescencia.
Por "cepa" se entiende una variante
genotípica de una especie dada que se caracteriza por una propiedad
bioquímica, fisiológica, morfológica, o de otra naturaleza. Así, por
ejemplo, en el caso de M. aeruginosa, se pueden definir cepas
distintas por su capacidad de producción de microcistina. Dicha
capacidad viene definida por la funcionalidad de unos genes que
codifican para heptapéptidos de efecto hepatotóxico conocidos como
microcistinas. Una solución PBS consiste esencialmente en una
disolución de 0.02 M fosfato y 0.15 M NaCl en agua a pH 7.5.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un kit para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de
M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina que comprende:
- -
- lectina UEA-I,
- -
- una sonda que permite detectar la unión de dicha lectina UEA-I con su glicoproteína diana de la superficie celular de M. aeruginosa,
- -
- medios para poner en contacto una muestra con dicha lectina UEA-I.
En una realización preferente de la presente
invención, la sonda que permite detectar la unión de la lectina
UEA-I con su glicoproteína diana de la superficie
celular de M. aeruginosa es una sonda fluorescente. En una
realización aun más preferente de la presente invención, dicha sonda
es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC). En una realización
particular de la presente invención, el medio para poner en contacto
una muestra con la lectina UEA-I, comprende un
recipiente y una solución PBS. Dicho recipiente puede ser un tubo de
ensayo, un microtubo, un microtubo de tipo Eppendorf, o uno, o
varios pocillos de una placa multipocillos.
En una realización más particular de la presente
invención, el kit para la discriminación de cepas tóxicas de M.
aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina comprende lectina
UEA-I en una concentración entre 1 y 1000
microgramos de lectina por mililitro de muestra. En una realización
aun más particular de la presente invención, el kit comprende dicha
lectina en una concentración entre 50 y 500 microgramos de lectina
conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene la
muestra. En una realización aun más particular de la presente
invención, el kit comprende lectina UEA-I en una
concentración entre 95 y 105 microgramos de lectina conjugada con
sonda por mililitro de solución que contiene la muestra.
También es objeto de la presente invención el
método para el reconocimiento y discriminación de cepas tóxicas de
M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra con la lectina UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina UEA-I,
- b)
- detectar la señal emitida por dicha sonda, o la ausencia de señal.
En una realización particular de la presente
invención, el método para la discriminación de cepas tóxicas de
M. aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina comprende lectina
UEA-I en una concentración entre 1 y 1000
microgramos de lectina por mililitro de muestra. En una realización
aun más particular de la presente invención, dicho método comprende
dicha lectina en una concentración entre 50 y 500 microgramos de
lectina conjugada con sonda por mililitro de solución que contiene
la muestra. En una realización aun más particular de la presente
invención, dicho método comprende lectina UEA-I en
una concentración entre 95 y 105 microgramos de lectina conjugada
con sonda por mililitro de solución que contiene la muestra.
En una realización preferente de dicho método,
la sonda que permite detectar la unión de dicha lectina
UEA-I con su glicoproteína diana de la superficie
celular de M. aeruginosa es fluorescente. En una realización
preferente de dicho método, dicha sonda fluorescente es FITC, los
medios para poner en contacto una muestra con la lectina
UEA-I comprenden un microtubo y una solución PBS, y
la detección de la señal emitida por la sonda FITC, o la ausencia de
señal, se realiza por epifluorescencia mediante un microscopio con
filtro para FITC. En una realización particular de dicho método, se
incluye una etapa de homogeneización y acondicionamiento de la
muestra, previa a poner en contacto dicha muestra con la lectina
UEA-I y con una sonda específica de dicha lectina
UEA-I, comprendiendo dicha etapa de homogeneización
y acondicionamiento la centrifugación de la muestra y su
resuspensión en una solución PBS.
La presente invención proporciona un kit que
permite reconocer y discernir entre cepas tóxicas de M.
aeruginosa productoras de microcistina y cepas de M.
aeruginosa no productoras de microcistina con total garantía y
fiabilidad. El uso de este kit, y del método para la discriminación
entre cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de
microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de
microcistina basado en dicho kit, supone un avance definitivo en el
desarrollo de técnicas eficaces para prevenir y controlar la
presencia de microorganismos productores de toxinas en aguas como es
el caso de M. aeruginosa. Se trata de un procedimiento rápido
y de sencillo desarrollo, de implantación idónea en los sistemas de
red de alerta temprana en embalses de abastecimiento urbano y
sistemas de control de aguas de abastecimiento de ganado y aguas
refugio de fauna silvestre. La fiabilidad y garantía que proporciona
dicho kit y su empleo, sumados a las ventajas en cuanto a rapidez y
sencillez técnica propias de los métodos de reconocimiento frente a
otros métodos conocidos, supone el avance necesario y definitivo
para su empleo rutinario por parte de empresas e instituciones
encargadas de garantizar la salubridad de las aguas.
Para facilitar la comprensión de las
características de la invención y formando parte de la memoria
descriptiva, se incluye la siguiente figura:
Figura 1: Imagen al microscopio del
reconocimiento de distintas cepas de M. aeruginosa mediante
el método descrito, empleando 100 microgramos de lectina
UEA-I conjugada con Isotiocianato de Fluoresceína
(FITC). La señal emitida por la sonda FITC, o la ausencia de señal,
se detecta por epifluorescencia mediante un microscopio con filtro
para FITC.
a) Imagen de una cepa de M. aeruginosa no
productora de microcistina. b) Imagen de una cepa tóxica de M.
aeruginosa productora de microcistina.
La presente invención se ilustra adicionalmente
mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser
limitativos de su alcance.
Ejemplo
1
A continuación se describe el método de empleo
del kit objeto de la presente invención para detectar la presencia
de cepas de M. aeruginosa productoras de microcistina en
muestras de agua tomadas en un embalse de agua dulce para
abastecimiento de población humana.
Las muestras, tal y como llegaron al
laboratorio, se homogeneizaron mediante agitación manual. Con ayuda
de una micropipeta se depositó una alícuota de 1 mililitro de
volumen de muestra en un microtubo tipo Eppendorf (Eppendorf Ibérica
S.A.). El microtubo con la muestra se centrifugó durante 5 minutos a
13.000 revoluciones por minuto y se retiró el sobrenadante con una
pipeta de plástico. La pastilla sedimentada se resuspendió en 500
microlitros de solución PBS (disolución de 0.02 M fosfato, 0.15 M
NaCl, pH 7.5) homogeneizándose mediante agitación suave. Se
añadieron 50 microgramos de lectina UEA-I conjugada
con la sonda fluorescente Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) de la
disponible comercialmente (Sigma-Aldrich S.A.), para
dar una concentración final de 100 microgramos de lectina conjugada
por mililitro de muestra. El microtubo con la muestra se incubó en
agitación durante 10 minutos a 20 grados centígrados y en oscuridad.
Transcurrido ese tiempo, con ayuda de una micropipeta, se
depositaron 20 microlitros de la muestra incubada en un portaobjetos
para microscopía como los disponibles comercialmente en el mercado.
La preparación con la muestra dispuesta en el portaobjetos se
examinó por observación en un microscopio de la marca Zeiss Axiovert
dotado con un filtro para FITC de excitación en un rango de longitud
de onda de 450-490 nanómetros y emisión en un rango
de 520-560 nanómetros. Las muestras en las que se
observó una luz verde fluorescente se registraron como muestras
negativas a la presencia de cepas
M. aeruginosa productoras de microcistina. Las muestras en las que no se detectó luz fluorescente se registraron como positivas a la presencia de cepas M. aeruginosa productoras de microcistina. En todos los casos se emplearon controles positivos (células teñidas con naranja de acridina) y negativos (células incubadas con lectinas no conjugadas con FITC).
M. aeruginosa productoras de microcistina. Las muestras en las que no se detectó luz fluorescente se registraron como positivas a la presencia de cepas M. aeruginosa productoras de microcistina. En todos los casos se emplearon controles positivos (células teñidas con naranja de acridina) y negativos (células incubadas con lectinas no conjugadas con FITC).
Ejemplo
2
A continuación se describe un ejemplo de
certificación de la fiabilidad del kit de reconocimiento de cepas
productoras de microcistina basado en la lectina
UEA-I conjugada con la sonda FITC.
Se tomaron 29 muestras de clones de cepas de
M. aeruginosa disponibles en la colección de Cultivo de Algas
Tóxicas de la Universidad Complutense de Madrid (Madrid, España).
Las 29 cepas habían sido aisladas en embalses de agua para
suministro de agua potable o lagos localizados en Andalucía (sur de
España). Los clones se obtuvieron a partir de una única célula
vegetativa aislada de las muestras mediante un
micromanipulador-microinyector comercial de los
disponibles en el mercado (Zeiss-Eppendorf). Las
cepas crecieron en frascos de cultivo (Greiner,
Bio-One Inc. Longwood, NJ, USA) que contenían 30
mililitros de solución BG-11 como la descrita por
Rippka et al. (1979. Gen. Microbiol. 111:
1-61), a 20 grados centígrados y 120 micromoles de
fotones por metro cuadrado y Segundo producidos por tubos de luz
blanca funcionando en ciclos continuos. Los clones se mantuvieron en
fase de crecimiento exponencial mediante transferencia a medio
fresco cada 15 días. La ausencia de bacterias se monitorizó
periódicamente mediante epifluorescencia y tinción con naranja de
acridina, y observación al microscopio.
La producción de microcistina de las distintas
cepas se midió mediante un test específico ELISA de los disponibles
comercialmente siguiendo las indicaciones del fabricante (Enviro
Gard Microcystin Quantitube Test Kit; Strategic Diagnostic, Newark,
N.J., USA). Se realizaron medidas adicionales de certificación de
los resultados utilizando un test comercial (Microcystest) basado en
inhibición de fosfatasas según las indicaciones del fabricante
(ZEU-Immunotech, Zaragoza, España).
A partir de muestras de los clones que se
mantenían en fase de crecimiento exponencial se tomaron alícuotas
que contenían 100.000 \pm 1000 células, que fueron incubadas con
la lectinas UEA-I fluorescente durante 1 hora a 20
grados centígrados en oscuridad, y examinadas tal y como se ha
descrito en el Ejemplo 1 de la presente memoria.
Los resultados se indican en la Tabla 1
Claims (17)
1. Kit para el reconocimiento y discriminación
de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras de microcistina
y cepas de M. aeruginosa no productoras de microcistina que
comprende:
- a)
- lectina UEA-I,
- b)
- una sonda específica de la unión de la lectina UEA-I a la glicoproteína diana de dicha lectina UEA-I,
- c)
- medios para poner en contacto una muestra con dicha lectina UEA-I.
2. Kit según la reivindicación 1 en el que la
sonda es fluorescente.
3. Kit según la reivindicación 2 en el que la
sonda es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
4. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque los medios para poner en
contacto la muestra con la lectina UEA-I comprenden
un recipiente y una solución PBS.
5. Kit según la reivindicación 4
caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un
microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocillos
de una placa multipocillos.
6. Kit según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
7. Kit según la reivindicación 6,
caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
8. Kit según la reivindicación 7,
caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
9. Método para el reconocimiento y
discriminación de cepas tóxicas de M. aeruginosa productoras
de microcistina y cepas de M. aeruginosa no productoras de
microcistina que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra con la lectina UEA-I y con una sonda especifica de dicha lectina UEA-I
- b)
- detectar la señal emitida por dicha sonda, o la ausencia de señal.
10. Método según la reivindicación 9,
caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 1 y 1000 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
11. Método según la reivindicación 10,
caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 50 y 500 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
12. Método según la reivindicación 10
caracterizado porque la concentración de lectina
UEA-I se encuentra entre 95 y 105 microgramos de
lectina por mililitro de solución que contiene la muestra.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque la sonda
específica de la lectina UEA-I es fluorescente.
14. Método según la reivindicación 13,
caracterizado porque la sonda específica de la lectina
UEA-I es Isotiocianato de Fluoresceína (FITC).
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque los medios para
poner en contacto la muestra con la lectina UEA-I
comprenden un recipiente y una solución PBS.
16. Método según la reivindicación 15,
caracterizado porque el recipiente es un tubo de ensayo, un
microtubo, un microtubo del tipo Eppendorf, o uno, o varios pocillos
de una placa multipocillos.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 16, que incluye una etapa de homogeneización y
acondicionamiento de la muestra, previa a poner en contacto dicha
muestra con la lectina UEA-I y con una sonda
específica de dicha lectina UEA-I, comprendiendo
dicha etapa de homogeneización y acondicionamiento la centrifugación
de la muestra y su resuspensión en una solución PBS.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901370A ES2350992B2 (es) | 2009-06-05 | 2009-06-05 | Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. |
| PCT/ES2010/000244 WO2010139820A1 (es) | 2009-06-05 | 2010-06-02 | Método y kit de reconocimiento de cepas de microcystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901370A ES2350992B2 (es) | 2009-06-05 | 2009-06-05 | Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2350992A1 ES2350992A1 (es) | 2011-01-28 |
| ES2350992B2 true ES2350992B2 (es) | 2011-08-10 |
Family
ID=43297301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200901370A Active ES2350992B2 (es) | 2009-06-05 | 2009-06-05 | Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2350992B2 (es) |
| WO (1) | WO2010139820A1 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103267748B (zh) * | 2013-04-19 | 2015-05-13 | 河北科技大学 | 用于测定莠去津生物毒性的铜绿微囊藻藻液的制备方法 |
| CN106568748A (zh) * | 2016-10-09 | 2017-04-19 | 江南大学 | 一种基于壳核型上转换材料和二硫化钼发生荧光共振能量转移检测微囊藻毒素lr的方法 |
| CN110186886B (zh) * | 2019-05-29 | 2022-02-11 | 扬州大学 | 水体中微囊藻毒素mc-lr浓度的反演方法 |
| CN113278015B (zh) * | 2021-05-31 | 2022-05-13 | 云南大学 | 一种荧光探针及其制备方法和应用 |
| CN114014848B (zh) * | 2021-12-03 | 2022-04-29 | 云南大学 | 一种rna荧光探针及其制备方法和应用 |
-
2009
- 2009-06-05 ES ES200901370A patent/ES2350992B2/es active Active
-
2010
- 2010-06-02 WO PCT/ES2010/000244 patent/WO2010139820A1/es not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2350992A1 (es) | 2011-01-28 |
| WO2010139820A8 (es) | 2011-02-03 |
| WO2010139820A1 (es) | 2010-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2350992B2 (es) | Metodo y kit de reconocimiento de cepas de mirocystis aeruginosa (cyanobacteria) productoras y no productoras de microcistinas. | |
| Verlecar et al. | Phytoplankton identification manual | |
| ES2694874T3 (es) | Procedimiento y dispositivo para la detección de bacterias | |
| Tillmann et al. | Life cycle of the pseudocolonial dinoflagellate Polykrikos kofoidii (Gymnodiniales, Dinoflagellata) | |
| CN102391954B (zh) | 球形棕囊藻培养液的除菌方法 | |
| ES2523378T3 (es) | Composiciones y métodos para detectar afecciones precancerosas en muestras celulares y de tejidos mediante 5, 10, 15, 20-tetrakis (carboxifenil) porfina | |
| ES2625065T3 (es) | Método de detección de bacterias en la leche | |
| BRPI1015218B1 (pt) | Métodos para determinar a resistência antimicrobiana | |
| US20150337351A1 (en) | Methods of microorganism immobilization | |
| ES2875894T3 (es) | Procedimiento de detección y de identificación directa por vía óptica de un microorganismo en una muestra biológica | |
| JP6639906B2 (ja) | 生物試料検出方法 | |
| US20160334312A1 (en) | Pre-concertation apparatus & method | |
| Lee et al. | Growth and Physiology of Foraminifera in the Laboratory: Part 3: Initial Studies of Rosalina floridana (Cushman) | |
| Yu et al. | Rapid detection and enumeration of total bacteria in drinking water and tea beverages using a laboratory-built high-sensitivity flow cytometer | |
| Smith et al. | Diagnosis of human Giardiasis | |
| Yahav et al. | Pathogen detection using frequency domain fluorescent lifetime measurements | |
| JP4683604B2 (ja) | 内部精度管理法 | |
| WO2016016500A1 (es) | Método y aparato para la detección de microorganismos | |
| US11906497B2 (en) | Rapid bacteria test | |
| ES2428920T3 (es) | Procedimiento de citometría de flujo para la determinación del número total de leucocitos y del número de trombocitos, así como para la diferenciación de leucocitos en muestras de sangre de aves | |
| ES2715687T3 (es) | Un método para mejorar el análisis de microorganismos en matrices complejas | |
| ES2893198T3 (es) | Un método de cuantificación de la capacidad de cultivo celular bacteriano individuales usando parámetros independientes del cultivo | |
| US20250231174A1 (en) | Methods and devices for screening extracellular vesicles | |
| Chung | Development of fluorescently labelled Cryptosporidium oocyst surrogates to test the efficacy of sand filtration processes | |
| Magbitang | Development of a Flow Cytometry Method for the Identification and Enumeration of Enterococcus faecalis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2350992 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20110810 |