ES2351027B1

ES2351027B1 - Uso de peptidos de la proteina e1 del virus de la hepatitis g para inhibir la actividad del virus vih.

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Publication number: ES2351027B1
Application number: ES200930045A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Gomara Elena; Isabel Haro Villar
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Científicas
Priority date: 2009-04-06
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2011-11-24
Anticipated expiration: 2029-04-06
Also published as: WO2010116016A1; ES2351027A1

Abstract

Uso de péptidos de la proteína E1 del virus de la hepatitis G para inhibir la actividad del virus VIH.#La presente invención se refiere al uso de al menos un péptido, o derivado del mismo, contenido en la secuencia de la proteína E1 del virus de la hepatitis G (GBV-C/HGV), capaz de inhibir la actividad del virus VIH, impidiendo o reprimiendo la función y/o actividad del virus VIH (Virus de Inmunodeficiencia Humana), de forma transitoria o permanente, o además capaz de interaccionar con una secuencia aminoacídica de la glicoproteína gp41 del virus VIH, para la elaboración de una composición farmacéutica. Dicho péptido es capaz de impedir la inhibición de la función del fragmento de la proteína gp41 del virus VIH, impedir la fusión celular o impedir la replicación del VIH en una célula huésped. Asimismo la presente invención también se refiere a dicha composición farmacéutica y al método para su fabricación.

Description

Usode péptidosdela proteínaE1 del virusdela hepatitisGpara inhibirla actividad del virus VIH.

La presente invención se reﬁere al uso de al menos un péptido, o derivado del mismo, contenido en la secuencia de la proteína E1 del virus de la hepatitisG(GBV-C/HGV), capaz de inhibir la actividad del virus VIH, impidiendo o reprimiendolafuncióny/oactividaddel virusVIH(Virusde Inmunodeﬁciencia Humana),de forma transitoria o permanente,o además capazde interaccionar con una secuencia aminoacídicadela glicoproteína gp41 del virusVIH, para la elaboración de una composiciónfarmacéutica. Dicho péptido es capaz de impedir la inhibición de la función del fragmento de la proteína gp41 del virus VIH, impedir la fusión celular o impedir la replicación del VIH en una célula huésped. Asimismola presenteinvención tambiénse reﬁerea dicha composiciónfarmacéuticayal métodopara sufabricación.

Estado de la técnica anterior

Cuandoa mediadosdelosaños90se descubrióun supuestonuevovirusdelahepatitis,elGBvirusC(GBV-C), también denominado virusdela hepatitisG(HGV) (Simons et al., 1997. Nature Medicine 1: 564-569; Linnen et al., 1996 Science 271, 505-508), muchos grupos de investigación trataron de correlacionarlo con la inﬂamación hepática u otras enfermedades asociadas. Sin embargo, no se pudo identiﬁcar ninguna inﬂuencia en la salud (Mphahlele et al., 1998. Liver 18: 143-155; Theodore et al., 1997. Hepatology 25: 1285-1286), hasta que el Prof.Tillmann descubrió el inesperado beneﬁcio de la coinfección por GBV-C/HGV en el curso de la enfermedad de los pacientes que habían sido infectadosporVIH(Virusde Inmunodeﬁciencia Humana1)(Heringlake et al., 1998. J. Infect. Dis. 177: 17231726).

Aunque en algunas ocasiones los resultados no han sido claramente signiﬁcativos (Zhang et al., 2006. HIV Med. 7: 173-180), sehaobservado una menor progresióndela enfermedady un incremento enla supervivencia en individuos GBV-C/HGV positivos comparados con individuos GBV-C/HGV negativos, mientras que la pérdida de la viremia GBV-C/HGV está estrechamente relacionada con una mortalidad incrementada así como con una mayor progresión del SIDA(VanderBij et al., 2005. J. Infect. Dis.191: 678-685;Williams et al., 2004. N. Engl. J. Med. 350: 981-990).

El empleo de péptidos sintéticos como inhibidores del VIH-1ha sido objeto de investigación durante los últimos años.Se han estudiadoylo están siendo enla actualidad, para su aplicación clínica enla lucha contrala infecciónpor el VIH-1 un gran número de péptidos que tienen como diana las distintas etapas del ciclo vital del VIH-1.

Los péptidos inhibidores del VIH-1han sido identiﬁcados y/o desarrollados mediante distintos métodos. Algunos péptidos terapéuticos como el Enfuvirtide, ya aprobado para su uso clínico (Burton, 2003. Lancet Infec. Dis. 3, 260), derivan del VIH-1, mientras que otros son péptidos naturales como las quimiocinas, defensinas o el “Virus Inhibitory Peptide” (VIRIP) (Munch et al., 2007, Cell 129: 263-275)o han sido diseñadosysintetizadosa partirde datos cristalográﬁcosde lasproteínas del VIH-1 oapartirde librerías peptídicas (Boggiano et al., 2006. Biochem. Biophvs. Res. Comun. 347: 909-915).

El ciclo replicativo del VIH ha sido descrito con detalle en numerosas revisiones (GreeneyPeterling, 2002. Nat. Med. 8: 673-680; FreedyMouland, 2006. Retrovirology 3: 77). Se ha descrito la entrada del virus a la célula huésped comoun procesoque requiere tres etapas:1) aproximaciónyunióndelVIHalas moléculasdeCD4 (receptor primario)a travésdela glicoproteína viral gp120;2) cambio conformacional engp120,lo que permitela uniónal coreceptorde quimiocinas (CCR5o CXCR4)y3) fusióndela envuelta del VIH conla membranadelacélulamediante un cambio conformacional en la glicoproteína de membrana gp41,el cual tiene lugar únicamente tras la unión productiva de gp120 a CD4. Cada una de estas etapas representa una diana potencial en la inhibición de la replicación viral.

Así pues, sería útil el uso de inhibidores de fusión o entrada viral y/o replicación del virus, para impedir la acción del virus VIH en células huésped, siendo estafase de fusión y/o entrada un punto adecuado para la actuación delos inhibidores, ya que el virus todavía no ha introducido su material genético en el interior celular.

Explicación de la invención

La presenteinvención se reﬁereal usodeal menosunpéptido contenido enla secuenciadela proteínaE1 del virus GBV-C/HGV,capazde inhibirlaactividaddelvirusVIH, impidiendoo reprimiendola funcióny/oactividaddel virus VIH(Virusde Inmunodeﬁciencia Humana),de forma transitoriao permanente,o además capazde interaccionar con una secuencia amininoacídicadela glicoproteína gp41 del virus VIH(Virusde Inmunodeﬁciencia Humana1), para la elaboración de una composiciónfarmacéutica. Dicho péptido es capaz de inhibir la función delfragmento de la proteína gp41 del virus VIH, impedir la fusión celular o impedir la replicación del VIH en una célula huésped.

En los ejemplos de la presente invención se sintetizan 58 péptidos compuestos por 18 aminoácidos que abarcan la secuencia completa de la proteína E1 del virus GBV-C/HGV (SEQ ID NO: 1). Dichas secuencias solapan en 15 aminoácidos, es decir, un péptido concreto tienetres aminoácidos diferentes respectoal péptido quele precedeoque le sigue.

Acontinuaciónse determinala interacciónde cualquieradelos péptidosdela secuenciaSEQIDNO:1del virus GBV-C/HGV con una secuencia aminoacídica (SEQ ID NO: 2) de la glicoproteína de membrana gp41 del virus VIH-1 (Virus de Inmunodeﬁciencia Humana 1) mediante el empleo de técnicas biofísicas que permiten determinar la inhibiciónde liberaciónde contenidosvesiculares inducidaporSEQIDNO:2,y evaluandoel potencial carácter inhibitoriodel VIH-1 mediante ensayos celulares dirigidosadeterminarla inhibicióndela fusión celularola inhibición de la replicación del virus.

Las principales ventajas que aportan los péptidos sintéticos de la presente invención son:

-: Su baja toxicidad sistémica.

-: La posibilidad de realizar modiﬁcaciones estructurales en ellosyconsecuentemente la capacidad que presentan para mimetizar determinados sustratos o epítopos.

-: Su aplicabilidad en terapias combinadas o cuando aparecen resistencias a otros fármacos antirretrovirales, o

-: Que pueden actuar antes de que se produzca la entrada del virus en la célula.

En este sentido, cualquiera de los péptidos de la presente invención podría tener el mismo potencial que la inducción de inmunidad que aporta una vacuna.

Asípues,unaspectodelapresenteinvencióneselusodealmenosunpéptido,oderivadodelmismo, contenidoen una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, capaz de inhibir la actividad del virus VIH,parala elaboraciónde una composiciónfarmacéutica.

Esdecir,la composiciónfarmacéuticadela presenteinvenciónseusaparael tratamientooprevencióndel síndrome de inmunodeﬁciencia adquirida (SIDA) causado por cualquier tipo de VIH, bien sea del tipo VIH-1, del tipo VIH-2 o cualquier otro tipo de VIH.

Las secuencias aminoacídicasque tienenal menosun60%de identidad conSEQIDNO:1 son secuenciashomologasde diferentes genotipos del virus GBV-C/HGV. Este porcentajede identidad no se ha escogido de forma arbitraria sino tras obtener la identidad de los genotipos conocidos de la base de datos de GeneBankycompararlas por medio de un análisis Blast de la secuencia SEQ ID NO: 1. En este análisis comparativo se ha encontrado una secuencia correspondientea un fragmentode unapoliproteínadelavarianteTroglodites del virus GBV-C/HGV.La secuencia completa (de 2942 aminoácidos) se puede consultar en el número de acceso AAD31543 del GeneBank. En este análisis comparativo se ha podido determinar una identidad de un 66% del fragmento del virus GBV-C/HGV Troglodites respecto de SEQ ID NO: 1.

El término “derivado del mismo”, tal como se entiende en la presente invención se reﬁere al péptido resultante de variaciones en la composición aminoacídica de su secuencia de forma que se obtenga un péptido que tenga su origen en la secuencia original sin perder la característica funcional que le caracteriza en la presente invención.Amodo de ejemplo,unpéptidoderivadode cualquieradelospéptidosqueprocedendeunasecuenciaquetieneal menosun60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, puede tener aminoácidos distintos en la misma posición de la secuencia siempre que esos cambios no afecten a la eﬁcacia en la función deﬁnida para los mismos en la presente invención yteniendo en cuenta que dichos péptidos derivados tienen al menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.

El término “inhibicióndela actividaddel virus VIH”tal comose entiendeenla presenteinvenciónhace referencia a impedir o reprimir la función y/o actividad del virus VIH, de forma transitoria o permanente.

SEQID NO:1 es una secuencia aminoacídicadela proteínadeenvolturaE1 del virusdela hepatitisG (GBV-C/HGV). El péptido, contenido en la secuencia SEQID NO: 1, es capaz de inhibir la actividad del virus VIH actuando en una o varias etapas del proceso de infección de dicho virus.

Una realización preferidase reﬁerealusodeal menosun péptido,oderivadodelmismo, contenidoenuna secuencia aminoacídicaque tieneal menosun80%de identidad conla secuenciaSEQIDNO:1capazde inhibirla actividad delvirus VIH,parala elaboracióndeuna composiciónfarmacéutica.Según una realización más preferida,el péptido,

o derivado del mismo está contenido en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.

Otra realización preferida se reﬁere al uso de al menos un péptido, donde además dicho péptido es capaz de interaccionar con un fragmento de la proteína gp41 del virus VIH.

Según otra realización más preferida, el virus VIH es el virus VIH-1. Otra realización más preferida se reﬁere al usodeal menosun péptido,dondeel fragmentodela proteínagp41esla secuenciaSEQIDNO:2del virus VIH-1.

SEQIDNO:2 esla secuencia aminoacídica comprendida entrelos aminoácidos1y23laglicoproteínade membrana gp41 del virus VIH-1 (Virus de Inmunodeﬁciencia Humana 1) (Nº de acceso ACJ04095 de GeneBank). La envoltura del virus VIH-1 está compuesta de espículas, que son complejos proteicos integrados en la membrana. Cada espículaestá formadaporla proteínagp41,integralenla membrana,y una cabezaexterna formadaporlaproteína gp120, esencial para el acoplamiento con el exterior de ciertas células previo a su invasión. Una posibilidad para inhibir la unión del virus a las células sanas, como por ejemplo, pero sin limitarse, linfocitos es actuar contra la proteína gp41.

La interacción de cualquiera de los péptidos con la secuencia SEQ ID NO:2tal como se entiende en la presente invención,hace referenciaala acciónquese ejerce recíprocamente entre dichas secuencias.Así pues,porejemplo, pero sin limitarse, la interacción hace referencia a cualquier tipo de enlace químico, fuerzas de Van der Waals o interacciones hidrofóbicas.

Para referirseala composiciónfarmacéuticasepuedeemplear tambiénel término“medicamento”.La composición farmacéutica comprende cualquier péptido contenido en la secuencia SEQ ID NO: 1, tal como se ha descrito en párrafos precedentes.Dicha composiciónpuede comprenderunoomáspéptidosasícomocualquiercombinacióndedichos péptidos. Cualquieradelospéptidosdela presenteinvención,se formulaenuna composiciónfarmacéutica apropiada, enla cantidad terapéuticamente efectiva, junto con unoo másvehículos, adyuvantesoexcipientesfarmacéuticamente aceptables.

En adelante se podrá hacer referencia a cualquiera de los péptidos deﬁnidos en los párrafos precedentes como “péptido/s de la presente invención” o “péptido/s de la invención”.

Los péptidos de la presente invención pueden ser lineales o cíclicos, pueden incorporar residuos no naturales como losD-aminoácidosy, también, pueden modiﬁcarse mediantela conjugación con ácidos grasos. Además,los péptidos de la presente invención pueden formar parte de un sistema para generar anticuerpos anti-péptidos como por ejemplo, pero sin limitarse, MAPS(Multiple Antigen Peptide System). Estas diferentes estrategias de presentación peptídica permitenincrementarla actividad antiviralde péptidos sintéticosy, además, puedenmejorarla estabilidady selectividad de este tipo de moléculas en su aplicación clínica.

Una realización preferida se reﬁere al uso donde el péptido de la invención tiene entre 15y20 aminoácidos. El orden que ocupa cada aminoácido de cualquiera de los péptidos de la invención es el mismo que el orden que ocupa en la secuencia SEQ ID NO: 1, de esta forma, los péptidos de la presente invención son secuencias parciales de lasecuenciaSEQIDNO:1que tienen unaextensiónde entre15y20 aminoácidos o secuencias derivadasdelas anteriores que incorporen algún aminoácido sustituido.

Otra realización preferidase reﬁereal usodela composiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones 1a6, dondela inhibicióndelaactividaddel virusVIHse producepor impedirla entradade materialgenéticodedicho virus a la célula huésped.

El término “entrada del material genético del virus” hace referencia a la entrada de ARN viral protegido o no por cápside y/o nucleocápside así como la entrada de proteínas virales que son consecuencia de la traducción de algunas secuencias de ARN viral en el propio virus.

Las posibles células huésped en las que podría entrar el material genético del virus se seleccionan, pero sin limitarse, de la lista que comprende, linfocitosTCD4+, monocitos, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans

o células de microglía del cerebro.

Segúnuna realizaciónmás preferida,la entradadel materialgenéticoalacélulahuéspedseimpideporla inhibición de la fusión celular. Otra realización aún más preferida se reﬁere al uso de la composiciónfarmacéutica, donde la inhibicióndela fusión celularsellevaa cabopor mediode una composiciónfarmacéuticaque comprendeal menos un péptido contenidoencualquieradelos fragmentos aminoacídicosSEQIDNO:3 oSEQIDNO:4.

El término “inhibición de la fusión celular” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a impedir o reprimir de forma permanente o transitoria la fusión de la envoltura del virus VIH con la membrana de la célula sana (célula huésped a la que se une el virus VIH). Al menos en algunos casos, esta inhibición está basada probablemente en un cambio conformacional en la glicoproteína de membrana gp41 del virus VIH-1 que impide la fusión con la célula huésped.

La valoración del grado de inhibición de la fusión celular se lleva a cabo por medio de la observación de sincitios al microscopio.La formaciónde sincitiosesel efectocitopáticodelVIHen algunas líneas celularesyconsisteenla formaciónde acúmulos celulares(porla acumulacióndediversos núcleos)que pierdenla capacidadde separaciónde la membranadela célulainfectada tras producirsela mitosis, es decir,la célulapierdela capacidaddedividirse.

Otra realizaciónaúnmás preferidase reﬁereal usodela composiciónfarmacéutica, dondeel péptido,o cualquiera de sus combinaciones,se seleccionadela listaque comprendeSEQIDNO:5,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. La lista de péptidos que se presenta pertenecealos fragmentosSEQIDNO:3ySEQIDNO:4dela maneraquese presentaenla tabla1.

TABLA1

Correspondencia de los péptidos implicados en la inhibición de la fusión celular, con los fragmentos de SEQ IDNO: 1

Otra realizaciónpreferidase reﬁerealusodelacomposiciónfarmacéuticadondela inhibicióndelaactividaddel virus VIH se produce por inhibir la función de un fragmento de la proteína gp41 del virus VIH. Preferiblemente el fragmentodelaproteínagp41esSEQIDNO:2.El fragmentodela proteínagp41esun péptidode fusión N-terminal del virus VIH.La función del péptidode fusiónala membrana celular hace quela envoltura del virus se adhieray penetreel viruso su material genéticoal interior del citoplasmadela célula huésped.Es decir,la inhibicióndela funcióndel fragmentodela proteínagp41del virusVIHsepuedeexperimentar mediantela inhibicióndela liberación de contenidos vesiculares.

Una realizaciónmás preferidase reﬁereal usodelacomposiciónfarmacéutica, dondela inhibicióndela función delfragmentodela proteínagp41del virusVIH-1 sellevaacabopor mediode una composiciónfarmacéuticaque comprende al menos un péptido contenido en el fragmento aminoacídico SEQ ID NO: 3.

El término “inhibición de la liberación de contenidos vesiculares” tal como se entiende en la presente invención se reﬁerea impediro reprimirde forma permanenteo transitoriala lisisdevesículas lipídicas.

La secuenciaSEQIDNO:3 esun fragmento aminoacídicoque correspondea una secuencia parcialdeSEQID NO: 1. El fragmento está compuesto de 69 aminoácidos. Así pues, a modo de ejemplo, el fragmento puede contener 55 péptidos de 15 aminoácidos o 50 péptidos de 20 aminoácidos además de cualquier péptido derivado de ellos.

Una realizaciónaúnmás preferidase reﬁereal usodela composiciónfarmacéutica, dondeel péptido,o cualquiera de sus combinaciones, se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ IDNO:10oSEQIDNO:11.La lista anteriorde péptidos perteneceal fragmentoSEQIDNO:3.

La composiciónfarmacéutica de la presente invención podría ser utilizada en la inhibición de la replicación del virusVIH-1y la eﬁcaciade dicha inhibiciónpuede servaloradapor mediodela medidadela concentracióndel antígeno p24 del virus VIH-1. La detección la proteína p24, es un marcador directo de la presencia del virus en el organismo.

El término “inhibición de la replicación” tal como se entiende en la presente invención se reﬁere a impedir o reprimir de forma permanente o transitoria la generación de nuevo material genético a partir del material genético del virus VIH-1, nuevos virus o viriones. El término “virión” se reﬁere a la partícula viral infectiva compuesta al menos por ácido nucleico vírico y/o proteínas víricas. Las proteínas víricas son proteínas estructurales como las que forman la cubierta externa o cápside, o también pueden ser otro tipo de proteínas enzimáticas (por ejemplo POL, VIF, VPR, TAT, etc...). Los viriones son liberados al medio extracelular.

Otro aspecto de la presente invención se reﬁere a una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido, o derivado del mismo, contenido en una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, capaz de inhibir la actividad del virus VIH.

Una realización preferidase reﬁereala composiciónfarmacéutica dondela secuencia aminoacídica tieneal menos un80%de identidadconSEQIDNO:1.Segúnotrarealizaciónmás preferida,la secuencia aminoacídicaesSEQID NO: 1.

Otra realizaciónpreferidasereﬁerealacomposiciónfarmacéutica,dondeademásalmenosunpéptido,oderivado del mismo, capaz de inhibir la actividad del virus VIH, es capaz además de interaccionar con un fragmento de la proteína gp41 del virus VIH. Según otra realización más preferida, el fragmento de la proteína gp41 es la secuencia SEQID NO:2del virus VIH-1.

Otra realización preferida más se reﬁere a la composición farmacéutica, donde el péptido tiene entre 15 y 20 aminoácidos.

Otra realización preferidase reﬁereala composiciónfarmacéuticaque además comprendeexcipientesfarmacéuticamente aceptables.

El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los péptidos dela presenteinvención, estabiliza dichos péptidoso ayudaala preparacióndela composiciónfarmacéutica enel sentidode darle consistencia o aportarle cualquierotra característicadeseablepara dicha preparación.Así pues,los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación comoporejemploelfosfatodecalcio dibásico, función desintegradoraparafacilitarla disolucióndelos componentes ysu absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

Eltérminoexcipiente“farmacéuticamente aceptable”hace referenciaaqueelexcipienteesté permitidoyevaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

Además,elexcipiente debe serfarmacéuticamente adecuado,esdecir,unexcipienteque permitala actividaddel principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los péptidos de la presente invención.

Otrarealización preferidase reﬁereauna composiciónfarmacéuticaqueademás comprendeal menosunvehículo farmacéuticamente aceptable.

Elvehículo,al igual queelexcipiente, es una sustancia que se emplea enla composiciónfarmacéutica para diluir cualquiera de los compuestos de la presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención.La funcióndelvehículoesfacilitarla incorporaciónde otros compuestos, permitir unamejor dosiﬁcación yadministracióno dar consistenciayformaal medicamento. Cuandola formade presentaciónes líquida,elvehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

Otra realización preferida se reﬁere a la composición farmacéutica que además comprende otra sustancia activa. Esta sustancia activa debe permitir la actividad de cualquiera de los péptidos de la invención, es decir, debe ser compatible.

En adelante se podrá hacer referenciaala cualquierade las composicionesfarmacéuticas descritas como “composición/esfarmacéutica/sdela presenteinvención”o “composición/esfarmacéutica/sdelainvención”.

Otroaspectodela presenteinvenciónsereﬁereaun métodoparalafabricacióndela composiciónfarmacéuticade la invención, que comprende:

a) Sintetizaral menosunpéptido,oderivadodelmismo,y

b) preparar el producto obtenido en el apartado (a) en una forma adaptada a la administración oral o parenteral.

Talcomosehadescritoenpárrafos precedentes,elpéptido,oderivadodelmismo,está contenidoenuna secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el péptido, o derivado del mismo, está contenido en una secuencia aminoacídica con al menos un 80%yaún más preferiblemente el péptido, o derivado del mismo, está contenido en la secuencia SEQ ID NO: 1. Cualquiera de los péptidos de la presenteinvenciónes capazde inhibirla actividad del virus VIH, preferiblementeel virus es VIH-1yademás, puede ser capaz de interaccionar con un fragmento de la proteína gp41 del virus VIH, preferiblemente el fragmento de la proteínagp41esla secuenciaSEQIDNO:2del virus VIH-1.

La síntesis de cualquiera de los péptidos de la presente invención puede llevarse a cabo por medio de cualquier técnica conocida en el estado de la técnica. La técnica de síntesis puede, pero sin limitarse, una técnica de síntesis macromolecular, como por ejemplo, pero sin limitarse,síntesisdepéptidos enfase sólida.También se puede obtener cualquiera de los péptidos de la invención mediante técnicasde ADN recombinante, es decir, mediante técnicas adaptadasde biología molecularybiotecnológica, en microorganismoso plantas modiﬁcados genéticamente.

La síntesis de cualquiera de los péptidos de la presente invención mediante técnicas de ADN recombinante se lleva a cabo mediante inserción en un vector de expresión de la secuencia nucleotídica que codiﬁca para la secuencia aminoacídica de cualquiera de los péptidos de la presente invención.

La célula hospedadora se transfecta, mediante las técnicas conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo pero sinlimitarse, con electroporación, con biolística, Agrobacterium tumefaciens o cualquier otra técnica que permita la integración de cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención en el ADN de la célula huésped, ya sea genómico, cloroplástico o mitocondrial.

Laexpresióndelácidonucleicoenlacéluladelainvencióndalugaraunpéptidoquepuedeserpuriﬁcado mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica.

En cada caso la forma de presentación de la composición farmacéutica se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra formade administración clínicamente permitiday en una cantidad terapéuticamente eﬁcaz.

La forma adaptada a la administración oral se reﬁere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. La forma adaptadaala administraciónoralse seleccionadela listaque comprende,perosin limitarse, gotas,jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, píldora, tableta, pastilla, trocisco o lioﬁlizado.

Laformaadaptadaala administraciónparenteralse reﬁereaunestadofísicoquepuedapermitirsu administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamentea estos tiposde víasde administraciónparenteral. Cualquierade los péptidosdelainvención puedeir asociado, por ejemplo, pero sin limitarse, con liposomas o micelas. Un liposoma es una vesícula esférica con una membrana fosfolipídica. El liposoma contiene un núcleo de solución acuosa. La micela es un lípido esférico que contiene materialnoacuoso.Tantolos liposomas comolas micelaspueden utilizarse como transportadoresdediversas sustancias entreelexterioryel interiordela célula.

Porotraparte,cualquieradelos péptidosdela presenteinvenciónpuedeirunidoaunoomás lípidos.Ellípido puedeestar formadopor cadenas alifáticas saturadaso insaturadas,lineales,o constituyendounoomás anillosaromáticos. En este caso se denominan lipopéptidos. Además, cualquiera de los péptidos de la invención puede ir asociado a partículas como por ejemplo partículas de oro.

Otra posibilidadesquela composiciónfarmacéuticase presenteen una formaadaptadaala administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada. La forma adaptada a la administración rectal se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a la administración transdérmica se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.

Otra realización preferida se reﬁere al método donde el péptido se selecciona de la listaque comprende SEQ ID NO:5-16,es decir,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQIDNO:10, SEQID NO:11,SEQID NO:12,SEQID NO:13,SEQID NO:14,SEQID NO:15oSEQIDNO: 16.

Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Paraelexperto enla materia, otros objetos,ventajasy característicasde la invención se desprenderán en partede la descripcióny en parte de la práctica de la invención. Las siguientesﬁgurasyejemplosse proporcionana modode ilustración,y nosepretendeque sean limitativosdela presente invención.

Descripción de las ﬁguras

Fig. 1. Muestra los péptidos con capacidad de inhibir la liberación de contenidos vesiculares inducida por el péptido de fusión SEQ ID NO: 2 del VIH-1.

Entre paréntesis se muestra el número de la secuencia que le ha sido asignado en la presente invención a cada uno de los péptidos de la ﬁgura: P7 (SEQ ID NO: 6), P8 (SEQ ID NO: 7), P10 (SEQ ID NO: 8), P18 (SEQ ID NO: 10), P22 (SEQ ID NO: 11).

Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen la síntesis de los péptidos de la presente invención así como la inhibición de determinadas actividades del virus VIH-1. Los siguientes ejemplos especíﬁcos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza delapresenteinvención.Estosejemplosseincluyen solamenteconﬁnes ilustrativosynohandeser interpretadoscomo limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo1

Materiales y métodos

1.1. Síntesis de los péptidos

Se han obtenido 58 péptidos de la proteína de envoltura E1 del virus GBV-C/HGV (SEQ ID NO: 1) por metodología de Síntesis de Péptidos enFase Sólida en un sintetizador semiautomático de péptidos (SAM, Multisyntech, Germany), en formade carboxamidas terminales, empleando una resinaTentagel RAM (Rapp Polymere GmbH,Germany)(100 mg, 0.28 meq/g)ysiguiendo una estrategia Fmoc/tBut.La protecciónde los aminoácidos seha llevadoa cabo de la siguiente forma:

Trifenilmetil(Trt) para glutamina, asparagina,histidinaycisteína; terbutilo (tBu) para ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treoninaytirosina; 2,2,5,7,8-pentametill-croman-6-sulfonil (Pmc) para argininaytert-butiloxicarbonilo (Boc) para lisinaytriptófano.

La reacción de acoplamiento entre aminoácidos se llevó a cabo por duplicado empleando excesos de tres veces de los Fmoc-aminoácidos.La activaciónde los aminoácidos se realizó con diisopropilcarbodiimida (DIPCDI)y1-hidroxibenzotriazol (HOBt) o con hexaﬂuorofosfato de 2-(1H-9-azobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HATU) en presenciadeN-etildiisopropilamina (DIEA).La eliminación secuencial del grupo protector Fmoc se llevóa cabocon 20% de piperidina en dimetilformamida (DMF). La ﬁnalización de estas reacciones fue evaluada por reacción colorimétrica (test de ninhidrina). Una vez completada la síntesis se realizó la etapa ﬁnal de desanclaje del péptido de la resinaydesproteccióndelosgrupos funcionales.Paraellosetratólapeptidil-resinaconácido triﬂuoroacético(TFA) al 95% en presenciade capturadoresde carbocationes, fundamentalmente un 2.5%de aguay un 2.5%de triisopropilsilano (TIS), durante cuatro horas. Los péptidos ﬁnales se aislaron por precipitación con dietiléter, se centrifugarony lioﬁlizaron en un 10% de ácido acético.

La caracterización de los péptidos se llevó a cabo por cromatografía HPLC analítica en una columna de fase reversa (Kromasil,C-18,5 µm, 25x0.46 cm) empleando como eluyentes acetonitriloyagua con un 0.05% en TFA. La identidadde los péptidos obtenidos con un gradode pureza superioral 90% por HPLC analíticaa una longitudde onda de 215 nm, fue conﬁrmada por espectrometría de masas MALDI-Tof.

1.2. Estudio de la inhibición del VIH-1 por parte de los péptidos del virus GBV-C/HGV

El posible papel inhibidor de las secuencias peptídicas relacionadas con el virus GBV-C/HGV, diseñadas, sintetizadas, puriﬁcadasy convenientemente caracterizadas,seha comprobadopor mediodelos siguientes ensayos:

a.: Ensayode inhibiciónde liberaciónde contenidosvesiculares inducida porelFP delVIH-1,

b.: Ensayode inhibicióndela fusión celular.

a) Ensayo de inhibición de liberación de contenidos vesiculares inducida por la secuencia SEQ ID NO: 2 (fragmento aminoacídico que pertenece a la secuencia de la glicoproteína de membrana gp41 del VIH-1)

Se ha realizado el ensayo biofísico de liberación de contenidos vesiculares descrito por Ellens (Ellens et al., 1984. Biochemistry 23: 1532-1538).Para ello se han preparadovesículas lipídicas unilamelares (LUVs) que contienen las sondas ﬂuorescentes: sal sódica del ácido8-aminonaftaleno-1,3,6-trisulfónico (ANTS)yp-xileno-bis(piridinio)-bromuro (DPX), según el protocolo descrito por nuestro grupo de trabajo (Larios et al.,2005. Arch. Biochem. Biophys.

442:149-159).Las diferentes construcciones peptídicassehan mezclado conSEQIDNO:2 en DMSOpreviamente a su adición a la suspensión de liposomas LUVs registrándose la emisión de la sonda ANTS a una longitud de onda de 520 nm. El posible efecto lítico propio de cada una de las construcciones del GBV-C/HGV ha sido restado de la liberación observada en cada caso. Los ensayos se han realizado en un espectroﬂuorímetro PTI QM4CW(Photon Technology Internacional).

b) Ensayo de inhibición de la fusión celular

Este ensayo se llevó a cabo empleando dos líneas celulares:

HeLa-env,queexpresala proteínadelaenvolturadelVIH-1 eintegraensu genomael promotorLTRdelVIH1,y TZM-bl (AIDS reagentsCat.No8129),queexpresael receptorde membranadelos linfocitosCD4yloscoreceptores CCR5yCXCR4e integraensu genomalos genesdela luciferasayla β-galactosidasa. Cuando fusionan las dos células se activa la expresión del gen de la luciferasa, lo que produce la oxidación de la luciferina formándose un peróxido intermedioquesedegrada rápidamenteydalugarala oxiluciferina,la cualal pasardel estadoexcitado al fundamental emite fotones que pueden ser detectados en un lector de luminiscencia (indicativo del grado de fusión celular).

El ensayo de inhibición de la fusión celular inducido por los péptidos del virus GBV-C/HGV consiste en la incubación de aproximadamente 2.500 células HeLa-env por pocillo (placas Cultek Ref: 3912) durante 1 hora con concentraciones crecientes de los péptidos a ensayar (en la presente invención se han empleado concentraciones de entre 100y1000 µM), seguida de la adición de unas 10 veces (aproximadamente de unas 25.000 células) de TZMble incubación durante24 horas.Para controlarla fusión celularse reservaron pocillosen ausenciade péptidos,y se empleó un inhibidor conocidodela fusión celular, C-34 (AIDS reagents Cat.No 9824), como control positivo.

Lavaloración cualitativadelgradode inhibicióndela fusión celularsellevóacabopor mediodela observaciónde la formaciónde sincitiosal microscopio. Losvalores cuantitativos se han obtenidopor lecturadelaluminiscencia (kit comercial Britelite, Perkin Elmer Cat. No 6016761) en un lector de microplacas SpectraMax M5(Molecular Devices).

1.3. Estudio de la viabilidad celular de los péptidos del virus GBV-C/HGV

La toxicidad celular de los péptidos sintetizados del virus GBV-C/HGV se determinó según el ensayo que empleó bromuro de 3-(4,5-dimetiltriazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) (Mosmann, 1983. J. Immunol. Methods 65: 5563).

Ejemplo2

Resultados de inhibición de la función del péptido de fusión del VIH-1 (SEQ ID NO: 2) e inhibición de la fusión celular, inducidas por distintos péptidos de la secuencia SEQ ID NO: 1

Con la ﬁnalidad de analizar la interacción de la proteínade envuelta del virus GBV-C/HGV con el péptido de fusión de la glicoproteínagp41 del virus VIH-1 (SEQ ID NO: 2), se realizó la síntesis de péptidos que abarcanla secuencia completa de la proteína E1 del virus GBV-C/HGV (SEQ ID NO: 1) mediante la síntesis de secuencias peptídicas compuestas de 18 aminoácidos solapadas en 15 residuos. Los 58 péptidos obtenidos se caracterizaron por HPLCyHPLC-MS mostrando una pureza superioral 90%.

Sellevóa caboel estudiodesu capacidadde inhibirel procesode desestabilizacióndevesículas lipídicas inducido porelpéptidodefusióndelVIH-1(SEQIDNO:2) siguiendoelprocedimientodetalladoenlaparteexperimental.Tal ycomo se muestra en la Fig. 1, se han podido seleccionar una serie de péptidos con capacidad de inhibir la función deSEQIDNO:2. Estos péptidos seleccionados sonSEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO: 10ySEQIDNO:11.Para comprobarla especiﬁcidaddela interacción observada entrelos péptidosdel virusGBVC/HGVyel péptidoSEQIDNO:2del virusVIH-1,se utilizó melitina como péptido control.Sepudo comprobar que los péptidos seleccionados no inhibían la capacidad lítica de la melitina tras realizar el mismo ensayo pero en presencia de melitina en lugar del péptido SEQID NO: 2, por lo que se conﬁrmóla especiﬁcidad de la interacción antes descrita.

Enla tabla2se indicanlos péptidosque correspondenala proteínadeenvueltaE1del virus GBV-C/HGV(SEQID NO: 1) que a distintas concentraciones, han mostrado capacidad de inhibir la formación de sincitios según el ensayo realizadode fusión celular. Asimismose muestranlosvaloresde inhibición alcanzadosporel péptido inhibidor control. Tras la realización de los ensayos de toxicidad, siguiendo el ensayo del MTT (ejemplo 1.3), con los péptidos del virus GBV-C/HGV se pudo comprobar una viabilidad celular del 100%.

El cálculo del porcentaje de inhibición para cada péptido se ha obtenido según la ecuación:

%inhibición péptido= 100-{[(Lum(P) – Lum0)/(Lum100 -Lum0)]x 100}

siendo:

Lum(P)= luminiscencia de las células tratadas con el péptido

Lum0= luminiscenciade lascélulas control no fusionadas

Lum100= luminiscenciade las células control totalmente fusionadas

Losestudios realizados indicanquevariasdelas secuencias sintetizadas, pertenecientesala proteínadeenvueltaE1 del virus GBV-C/HGV, disminuyen notablemente la fusión de membranas celulares, lo que indica un efecto inhibidor de éstos péptidos frente al virus VIH-1.

TABLA2

Resultados de la inhibición de la fusión celular inducida por distintos péptidos de la secuencia SEQ ID NO: 1 (proteína de envoltura E1) del virus GBV-C/HGV a diferentes concentraciones. Se muestran los valores de inhibición

alcanzados por el inhibidor control (C34)

Claims

REIVINDICACIONES

1.Usodealmenosun péptido,o derivadodel mismo, contenidoen una secuencia aminoacídicaque tieneal menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, capaz de inhibir la actividad del virus VIH, para la elaboración de una composiciónfarmacéutica.
2.

Usodeal menos un péptido segúnla reivindicación1, dondela secuencia aminoacídicatieneal menos un 80% de identidad conSEQIDNO:1.
3.

Usodeal menos un péptido según cualquierade las reivindicaciones1ó2, dondela secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1.
4.

Uso de al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el virus VIH es del tipo VIH-1.
5. Uso según cualquierade lasreivindicaciones1 a4, dondeel péptido tiene entre15y20aminoácidos.
6.Usosegún cualquieradelasreivindicaciones1 a5,dondeelpéptidoestácontenidoen cualquieradelosfragmentos aminoacídicosSEQIDNO:3 oSEQIDNO:4,dela secuenciaSEQIDNO:1, donde además dicho péptido mantiene la función de origen.
7.Usosegúnlareivindicación6,dondeel péptido,o cualquierade sus combinaciones,se seleccionadela listaque comprende SEQ ID NO: 5-16.
8.Usosegúnlareivindicación7,dondeel péptido,o cualquierade sus combinaciones,se seleccionadela listaque comprende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9-10, SEQ ID NO: 12-16.
9.Usosegúnlareivindicación7,dondeel péptido,o cualquierade sus combinaciones,se seleccionadela listaque comprende SEQ ID NO: 6-8, SEQID NO: 10-11.
10. Composición farmacéutica que comprende al menos un péptido, o derivado del mismo, contenido en una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 60% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1, donde dicho péptido es capaz de inhibir la actividad del virus VIH.
11.Composiciónfarmacéuticasegúnlareivindicación10, dondela secuencia aminoacídica tieneal menosun80% de identidad con SEQ ID NO: 1.
12.

Composiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones10u11, dondela secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1.
13.

Composiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones10a12, dondeel péptido tiene entre15y 20 aminoácidos.
14.

Composiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones10a13,que además comprendeexcipientesfarmacéuticamente aceptables.
15.

Composiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones10a14,que además comprendeal menos unvehículofarmacéuticamente aceptable.
16.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, que además comprende otra sustancia activa.
17.

Métodoparalafabricacióndelacomposiciónfarmacéuticasegún cualquieradelasreivindicaciones10a16 que comprende:

a) Sintetizaral menos un péptido,o derivado del mismo,y

b) preparar elproducto obtenido en el apartado (a) en una forma adaptada a la administración oral o parenteral.
18. Método para lafabricación dela composiciónfarmacéutica según la reivindicación 17, donde el péptido se selecciona de la lista que comprende SEQ ID NO: 5-16.

LISTADE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de Investigaciones Cientíﬁcas

<120> Usode péptidosdela proteínaEl del virusdela hepatitsGpara inhibirla actividaddelvirus VIH

<130> 1641.438bis

<160> 16

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Human immunodeﬁciencyvirus type1

<210> 3

<211> 69

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 3

<210> 4

<211> 48

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 4

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 6

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 7

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 8

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 9 <210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 12

<210> 13

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 13

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<210> 15

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> PRT

<213> HepatitisGB virusC

<400> 16

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud:200930045

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 06.04.2009

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A

JUNG, S., KNAUER, O., DONHAUSER, N. et al. Inhibition of HIV strains by GB virus C in cell culture can be mediated by CD4 and CD8 T-lymphocyte derived soluble factors. AIDS. Agosto 2005, Vol. 19, Nº 12, páginas 1267-1272. ISSN 0269-9370. 1-4,10-12,17

A

JUNG, S., EICHENMÜLLER, M., DONHAUSER, N. et al. HIV entry inhibition by the envelope 2 glycoprotein of GB virus C. AIDS. Marzo 2007, Vol. 21, Nº 5, páginas 645-647. ISSN 0269-9370. <DOI:10.1097/QAD.0b013e32803277c7> 1-4,10-12,17

A

SÁNCHEZ-MARTÍN, M. J., AMIGO, J. M., PUJOL, M. et al. Fluorescence study of the dynamic interaction between E1(145-162) sequence of hepatitis GB virus C and liposomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Junio 2009, Vol. 394, Nº 4, páginas 1003-1010. ISSN 1618-2650. <DOI: 10.1007/s00216-008-2593-8> Publicado en línea el 20.01.2009. 5-8,13,18

A

PÉREZ-LÓPEZ, S., VILA-ROMEU, N., ALSINA ESTELLER, M. A. et al. Interaction of GB virus C/ hepatitis G virus synthetic peptides with lipid langmuir monolayers and large unilamellar vesicles. The Journal of Physical Chemistry. B. 8 Enero 2009, Vol. 113, Nº 1, páginas 319-327. ISSN 1520-6106. <DOI: 10.1021/jp806938y> 6-9,18

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones □ para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 15.12.2010

Examinador E. Relaño Reyes Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud:200930045

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

A61K38/10 (01.01.2006) C07K14/18 (01.01.2006) A61P31/18 (01.01.2006)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61K, C07K, A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI, MEDLINE, BIOSIS, EMBASE, NPL, COMPENDX, INSPEC, XPESP, XPOAC, UniProt, Euro Patents, Japan Patents, Korea Patents, US Patents

Informe del Estado de la Técnica Página 2/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930045

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 15.12.2010

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930045

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

JUNG, S. et al. AIDS. Agosto 2005, Vol. 19, Nº 12, páginas 1267-1272. 08-2005

D02

JUNG, S. et al. AIDS. Marzo 2007, Vol. 21, Nº 5, páginas 645-647. 03-2007

D03

SÁNCHEZ-MARTÍN, M. J., et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry. Junio 2009, Vol. 394, Nº 4, páginas 1003-1010. 20.01.2009

D04

PÉREZ-LÓPEZ, S. et al. The Journal of Physical Chemistry. B. 8 Enero 2009, Vol. 113, Nº 1, páginas 319-327. 08.01.2009

En D01 se anticipa el hecho de que se produce una disminución en la replicación del VIH, tanto con tropismo CCR5 como con tropismo CXCR4, en células mononucleadas periféricas (PBMC) infectadas con el virus GBV-C. Esto se confirmó con PBMC transfectadas con el ARN de cadena positiva de GBV-C, ya sea completo o con una deleción en la región NS4A y NS5B, y PBMC incubadas con sobrenadantes de células PBMC infectadas, o transfectadas con el ARN con o sin la deleción. El hecho de que el ARN con la deleción sea funcional, indica que al menos una de las proteínas E1, E2, NS2 o NS3, es responsable de la inhibición del VIH. Sin embargo, aunque se señala que todavía no se conoce el mecanismo a través del cual el GBV-C inhibe la replicación del VIH, no se destaca a E1 como posible responsable del mismo, sino que centra sus hipótesis, todavía no concluyentes, en E2.

D02 divulga un trabajo de investigación sobre la capacidad que presenta la proteína E2 de GBV-C de inhibir la replicación del VIH. Aunque está centrado en E2, comprueba que la transfección de PBMC con un ARN de GBV-C que expresa solo las proteínas E1 y E2, es capaz de inhibir la replicación del VIH. Sin embargo, en los estudios de inhibición presentados, no confiere importancia a E1.

En D03 se investigan las propiedades de un péptido que consiste en los aminoácidos del 145 al 162 de E1, y que presenta un 100% de identidad con la SEQ. ID. NO. 16 de la solicitud. Este péptido puede que actúe como péptido de fusión en el GBV-C. A pesar de que en el documento se anticipa que este virus puede que tenga actividad inhibitoria frente al VIH, no se apunta que el péptido estudiado o la proteína E1, sean los responsables de dicha actividad.

En D04 se estudia un péptido que consiste en los residuos del 53 al 66 de la proteína E1 de GBV-C. Sin embargo, no se señala ninguna relación entre E1 o dicho péptido, y la inhibición en la replicación del VIH.
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud, tiene por objeto el uso de péptidos que estén contenidos en una secuencia aminoacídica con al menos un 60% de identidad con la SEQ. ID. NO. 1, y capaces de inhibir la actividad del VIH, en la fabricación de una composición farmacéutica (reivindicaciones de la 1 a la 5). Dichos péptidos pueden presentar las secuencias SEQ. ID. NO. 5-16 (reivindicaciones de la 6 a la 9). La SEQ. ID. NO. 1 corresponde a la proteína E1 del virus de la hepatitis G (GBV-C). También son objeto de la solicitud, la composición farmacéutica que comprende al menos uno de estos péptidos (reivindicaciones de la 10 a la 16) y el método de fabricación de la misma (reivindicaciones 17 y 18).

Informe del Estado de la Técnica Página 4/5

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud:200930045

NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 Y 8.1 LP 11/1986)

1. REIVINDICACIONES DE LA 1 A LA 9

El objeto de la presente solicitud, de acuerdo con la reivindicación 1, es el uso de al menos un péptido contenido en una secuencia aminoacídica con al menos un 60% de identidad con respecto a la SEQ. ID. NO. 1, y capaz de inhibir el VIH-1, en la elaboración de una composición farmacéutica. La SEQ. ID. NO. 1 corresponde a la proteína E1 del virus GBV-C.

Aunque los documentos D01 y D02 realizan estudios sobre la capacidad inhibidora del GBV-C en la replicación del VIH, de ninguno de ellos se deduce que E1 pueda ser la responsable de esta actividad.

Por otro lado, ni D03 ni D04, que estudian péptidos derivados de E1, apuntan la posibilidad de que estos péptidos, o la propia E1, inhiban la replicación del VIH.

En consecuencia, ninguno de los documentos citados, tomados solos o en combinación, revelan la invención definida en la reivindicación 1. Además, en dichos documentos no hay sugerencias que dirijan al experto en la materia hacia la invención definida por esta reivindicación. Por lo tanto, la reivindicación 1 tiene novedad y actividad inventiva.

Las reivindicaciones de la 2 a la 9, son dependientes de la reivindicación 1 y como ella también cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva.
2. REIVINDICACIONES DE LA 10 A LA 16

La reivindicación 10 tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende un péptido, o derivado del mismo, contenido en una secuencia aminoacídica con al menos un 60% de identidad con la SEQ. ID. NO. 1 y con actividad inhibidora frente al VIH.

Dado que el uso de estos péptidos para la elaboración de una composición farmacéutica es nuevo e inventivo, la composición farmacéutica que los comprende también lo es. Así, la reivindicación 10 presenta novedad y actividad inventiva.

Las reivindicaciones de la 11 a la 16, son dependientes de la 10, y como ésta tienen novedad y actividad inventiva.
3. REIVINDICACIONES 17 Y 18.

El objeto de la presente solicitud, según las reivindicaciones 17 y 18, es un método de fabricación de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 16.

Al ser la composición nueva e inventiva, también lo es el método de fabricación. En consecuencia, las reivindicaciones 17 y 18 cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva.

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