ES2351995T3 - Perfiles de antígenos asociados a tumores en el diagnóstico de cáncer e inmunoterapia. - Google Patents

Abstract

Un método de compatibilizar un estado canceroso en un paciente con uno o más agentes inmunoterapéuticos para usos en un régimen inmunoterapéutico, que comprende las etapas de: clasificar el tejido tumoral del paciente sobre la base de analizar el tejido tumoral para dos o más antígenos asociados a tumores (TuAA) expresados en un panel preseleccionado, en donde el panel preseleccionado comprende dos o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, SSX-2, SSX-4, una proteína MAGE, MAGE-1, MAGE-3, PRAME, NY-ESO-1, LAGE, PSMA, PSCA, SCP-1, melan-A/MART-1 y tirosinasa para desarrollar, un perfil de antígeno para el tumor; y seleccionar uno o más agentes inmunoterapéuticos para uso en un régimen inmunoterapéutico basado en el perfil, comprendiendo el régimen la administración de uno o más agentes inmunoterapéuticos dirigidos a dos o más antígenos dianas del perfil, en donde el tejido tumoral se clasifica por los TuAA que expresa y no por el tejido de origen.

Description

Perfiles de antígenos asociados a tumores en el diagnóstico de cáncer e inmunoterapia.

Fundamento de la invención Campo de la invención

En la presente memoria se describen métodos para hacer compatible un estado canceroso con un agente inmunoterapéutico apropiado para uso en un régimen inmunoterapéutico. También se describen métodos para confirmar la diagnosis de un tipo particular de cáncer.

Descripción de la técnica relacionada

The American Cancer Society (de EE.UU.) ha estimado que más de un millón de personas padece cáncer cada año, y que aproximadamente uno de cada dos hombres estadounidenses y una de cada tres mujeres estadounidenses padecerá algún tipo de cáncer en algún momento de su vida.

El cáncer se desarrolla generalmente cuando las células de una parte del cuerpo empiezan a crecer fuera de control. Aunque hay muchas clases de canceres, dichos cánceres comienzan usualmente debido al crecimiento fuera de control de células anormales.

Las células normales del cuerpo crecen, se dividen y mueren de un modo ordenado. Las células cancerosas son diferentes porque continúan creciendo y dividiéndose. En lugar de morir, sobreviven a las células normales y continúan formando nuevas células anormales.

Las opciones de tratamiento usuales para el cáncer incluyen cirugía, terapia por radiación y quimioterapia. Se está desarrollando una cuarta clase de tratamiento, que se denomina inmunoterapia. Las inmunoterapias intentan ayudar al sistema inmunitario a reconocer células cancerosas, y/o a reforzar una respuesta contra las células cancerosas para destruir el cáncer. Las inmunoterapias son de dos clases activas y pasivas. Las inmunoterapias activas intentan estimular el sistema inmunitario para luchar contra la enfermedad. Las inmunoterapias pasivas no se basan generalmente en el cuerpo para atacar a la enfermedad; en su lugar, usan componentes del sistema inmunitario (tales como anticuerpos) creados fuera del cuerpo.

A pesar de los diversos tipos de tratamientos, sigue existiendo la necesidad de opciones de tratamiento adicionales que sean más estrechamente compatibles con el estado o tipo de cáncer del paciente. Además, es necesario disponer de herramientas de diagnóstico más precisas para el cáncer.

Sumario de la invención

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria están dirigidas al uso de un panel preseleccionado de antígenos asociados a tumores (abreviadamente en lo sucesivo TuAA por la expresión inglesa Tumor-Associated Antigens) para hacer compatible el estado o tipo canceroso de un paciente con un agente inmunoterapéutico apropiado para uso en un régimen inmunoterapéutico. En realizaciones preferidas, los TuAA son antígenos expresados por las células cancerosas propiamente dichas. En realizaciones alternativas, los TuAA son antígenos asociados con componentes no cancerosos del tumor, tales como la neovasculatura asociada al tumor u otra estroma. También se describen métodos para determinar, diagnosticar o confirmar una diagnosis de un tipo de cáncer usando un panel preseleccionado de antígenos. También se describen métodos para predecir el progreso de la enfermedad en un paciente con cáncer.

La descripción también se refiere a un método para hace compatible un estado o tipo de cáncer de un paciente con un agente inmunoterapéutico que incluye las etapas de analizar el tejido tumoral del paciente para determinar la expresión de un panel preseleccionado de antígenos y basándose en los resultados del análisis, seleccionar un agente inmunoterapéutico que tiene como dianas uno, dos o tres o más de los antígenos expresados por el tejido tumoral del paciente. El método puede incluir además la etapa de desarrollar un perfil de antígenos para el tumor y seleccionar el agente inmunoterapéutico basándose en el perfil. En algunas realizaciones el agente seleccionado es un agente inmunoterapéutico activo. En algunas realizaciones, el agente comprende un inmunógeno que incluye o codifica al menos una porción de al menos uno de los antígenos expresados. En otras realizaciones el agente seleccionado es un agente inmunoterapéutico pasivo. En algunas realizaciones el agente comprende un anticuerpo monoclonal.

La descripción también se refiere a métodos para preparar una composición inmunoterapéutica para cáncer en donde se selecciona un agente inmunoterapéutico sobre la base del perfil de expresión del tejido tumoral para al menos dos antígenos asociados a tumores (TuAA) en un panel preseleccionado de modo que el agente inmunoterapéutico comprende o codifica al menos un segmento de al menos uno de los TuAA expresados y en donde el agente inmunoterapéutico está opcionalmente combinado con excipientes farmacéuticamente aceptables.

La invención se refiere a un método de hacer compatible un estado canceroso en un paciente con uno más agentes inmunoterapéuticos para uso en un régimen inmunoterapéutico, que comprende las etapas de clasificar el tejido tumoral del paciente sobre la base de analizar el tejido tumoral para determinar dos o más antígenos asociados a tumores (TuAA) expresados en un panel preseleccionado, en donde el panel preseleccionado comprende dos o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, SSX-2, SSX-4, una proteína MAGE, MAGE-1, MAGE-3, PRAME, NY-ESO-1, LAGE, PSMA, PSCA, SCP-1, melan-A/MART-1 y tirosinasa, para desarrollar un perfil de antígenos para el tumor; y seleccionar uno o más agentes inmunoterapéuticos para delinear un régimen inmunoterapéutico basado en el perfil, comprendiendo el régimen la administración de uno o más agentes inmunoterapéuticos que tienen como dianas dos o más antígenos del perfil, en donde el tejido tumoral se clasifica por los TuAA que expresan y no por el tejido de origen. En algunas realizaciones, el régimen comprende administrar al menos un agente inmunoterapéutico que tiene como dianas dos, tres, cuatro o más antígenos expresados. Los agentes pueden estar en formas tales como, por ejemplo, ácido nucleico o polipéptido o celulares o humorales o activas o pasivas, etc. Para realizaciones en las cuales el régimen comprende administrar dos o más agentes inmunoterapéuticos, dichos agentes pueden estar en forma similar o diferente. Por tanto, en algunas realizaciones, el régimen puede incluir tanto un agente inmunoterapéutico activo como un agente inmunoterapéutico pasivo.

La descripción también se refiere a métodos para hacer compatible un estado canceroso en un paciente con un agente inmunoterapéutico. Los métodos pueden incluir las etapas de: determinar el tipo del complejo principal de histocompatibilidad (abreviadamente en lo sucesivo MHC por la expresión inglesa Major Histocompatibility Complex) de la clase I del paciente; analizar el tejido tumoral del paciente para determinar dos o más antígenos asociados a tumores (TuAA) expresados en un panel preseleccionado; analizar el tejido tumoral del paciente para determinar la expresión de MHC de la clase I o \beta-microglobulina; seleccionar un agente inmunoterapéutico para administración al paciente basado en los análisis, en donde el agente inmunoterapéutico comprende o codifica un epítopo restringido al tipo de MHC de la clase I del paciente, para cada uno de dos o más antígenos expresados por el tumor. En algunas realizaciones, la expresión del antígeno se detecta en células neoplásicas o células estromales asociadas a tumores o en ambas. En algunas realizaciones, los dos o más antígenos expresados por el tumor incluyen un antígeno expresado por las células neoplásicas y un antígeno expresado por una célula estromal asociada a un tumor.

También se describen métodos de determinar o confirmar la existencia de cáncer que comprenden la etapa de determinar el perfil de expresión del tejido tumoral para al menos un polipéptido, en donde el polipéptido es parte de un panel preseleccionado que comprende al menos dos TuAA y al menos un marcador de linaje.

El panel preseleccionado de TuAA puede incluir, por ejemplo, pero sin limitación, antígenos de cáncer testicular, antígenos específicos de tejidos, antígenos oncofetales, antígenos de diferenciación, factores de crecimiento, receptores de factores de crecimiento, factores de adhesión, proteínas de transducción de señales, factores de transcripción, productos de oncogenes, productos génicos supresores de tumores, agentes microbianos, y similares. En algunas realizaciones, el panel preseleccionado comprende dos o tres o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, SSX-2, SSX-4, una proteína MAGE, MAGE-1, MAGE-3, PRAME, NY-ESO-1, LAGE, PSMA, PSCA, SCP-1, melan-A/MART-1 y tirosinasa. En algunas realizaciones, el cáncer es carcinoma. El carcinoma puede ser, por ejemplo, de mama, colo-rectal, de próstata, de páncreas, de pulmón, de ovario, de células renales o de melanocitos.

El tejido tumoral analizado puede incluir tejidos tumorales primarios o tejidos tumorales metastásicos. La expresión del antígeno se puede detectar en células neoplásicas o células estromales asociadas a tumores o en ambas. En algunas realizaciones, el panel preseleccionado incluye un antígeno expresado por una célula neoplásica y un antígeno expresado por una célula estromal asociada a tumores. Las células estromales pueden pertenecer a la neovasculatura. El antígeno asociado a la neovasculatura puede ser PSMA y el antígeno de células neoplásicas puede ser NY-ESO-1, SSX-2, LAGE o PRAME.

La expresión de antígenos se puede detectar, directamente o indirectamente. Por ejemplo, el análisis puede detectar la ausencia, presencia y/o abundancia de mRNA, polipéptido, proteína madura, péptido o complejo MHC-péptido. En algunas realizaciones, el análisis detecta el estado del TuAA, tal como el estado del proceso, el empalme diferencial, la mutación a partir de la línea germinal, la variación de la secuencia de consenso en una población humana, la localización celular, la localización subcelular, la co-expresión con otros marcadores y similares. Ejemplos de análisis útiles incluyen RT-PCR, determinación de transcritos, determinación de proteínas, determinación de epítopos o cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, el análisis comprende transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, hibridación de Northern, auto-radiografía, detección quimioluminescente, autofluorografía, citometría de flujo, perfilado de expresión en chips de genes, inmunohistoquímica, hibridación de Western, radioinmunoensayo o hibridación in situ, individualmente o en combinación o en cualquiera de sus combinaciones. En algunas realizaciones, se llevan a cabo al menos dos etapas de análisis en diferentes momentos, durante el curso de la enfermedad y se obtiene una información comparativa durante de las etapas de análisis. La información obtenida se puede usar para implementar, modificar o retirar una terapia.

En una realización, el tumor es un melanoma y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en tirosinasa, melan-A/MART-1, NY-ESO-1, PRAME, una proteína SSX, y una proteína MAGE. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En otra realización, el tumor es cáncer de mama y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en NY-ESO-1, C35, Her2/Neu, una proteína SSX, y una proteína MAGE. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En incluso otra realización, el tumor es cáncer colo-rectal y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en CEA, una proteína SSX, PRAME, NY-ESO-1, LAGE, PSCA, SCP-1, PSMA, y una proteína MAGE. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En incluso otra realización, el tumor es cáncer de ovarios y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro más TuAA seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, PRAME, NY-ESO-1, PSMA, Her2/neu, C35, PSCA, SCP-1, CEA, LAGE, y una proteína MAGE. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3. El cáncer de ovario puede ser, por ejemplo, carcinoma seroso, carcinoma no seroso, carcinoma (célula), carcinoma de células claras y similares.

En todavía otra realización, el tumor es cáncer de pulmón y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en PSMA, NY-ESO-1, SSX-2, y una proteína MAGE. El cáncer puede ser, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En otra realización, el tumor es cáncer de próstata y el panel preseleccionado de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en NY-ESO-1, PSA, PSCA, PSMA, una proteína SSX, y a proteína MAGE. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En otra realización, el tumor es cáncer de páncreas y el panel de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en PSMA, PRAME, NY-ESO, LAGE, PSCA, y una proteína MAGE y una proteína SSX. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

En todavía otra realización, el tumor es un carcinoma de células renales o cáncer renal y el panel de antígenos comprende al menos dos o tres o cuatro o más TuAA seleccionados del grupo que consiste en PSMA, PRAME, NY-ESO, LAGE, PSCA, SCP-1, una proteína MAGE, y una proteína SSX. La proteína SSX puede ser SSX-2 o SSX-4. La proteína MAGE puede ser MAGE-1 o MAGE-3.

La descripción también se refiere a un método de comercializar agentes inmunoterapéuticos para el cáncer que comprende establecer una relación con un laboratorio de diagnóstico de cáncer, en donde el laboratorio incluye medios para la expresión de los TuAA en un panel de ensayos estándar, y en donde los TuAA se analizan para determinar si corresponden a los inmunógenos de los agentes inmunoterapéuticos que han de ser comercializados, y enviar un informe con cada uno de los resultados de análisis de los pacientes identificando los agentes inmunoterapéuticos que comprenden inmunógenos que corresponden a los TuAA expresados por el tumor del paciente. En algunas realizaciones, la relación comprende servicios contratados. En algunas realizaciones, la relación es una relación empresarial.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica temporal que muestra el programa de inmunización con dos plásmidos (pCBP que expresa SSX-2 41-49 y pSEM que expresa Melan A).

La Figura 2 es un gráfico de barras que muestra la actividad de linfocitos T citotóxicos (abreviadamente CTL por la expresión inglesa Cytotoxic T-Lymphocyte) obtenida usando el protocolo de la Figura 1.

La Figura 3 es una representación gráfica temporal que muestra el programa de inmunización de un protocolo de inmunización de entrada-y-amplificación usando plásmidos y péptidos que representan dos epítopos.

La Figura 4 es una tabla que muestra la eliminación in vivo de células pulsadas con epítopos en ratones inmunizados de acuerdo con el protocolo de la Figura 3.

Las Figuras 5A y 5B son representaciones gráficas temporales que muestran los protocolos de inmunización para inducir fuertes respuestas multivalentes. La Figura 5A muestra que el uso de péptidos para refuerzo restaura las respuestas inmunitarias multivalentes incluso si los plásmidos y péptidos se usan en forma de mezclas. La Figura 5B muestra que la segregación de componentes de plásmidos y péptidos permite la inducción de respuestas inmunitarias multivalentes.

Descripción detallada de la realización preferida

Es conocida la frecuencia de expresión de muchos antígenos asociados a tumores (TuAA) en diversos tipos de cánceres. Sin embargo, no se ha descrito la frecuencia de aparición de algunos antígenos, y especialmente ciertas combinaciones de TuAA en diversos tipos de cánceres. La medida precisa de la presencia de los TuAA en tejidos tumorales ayuda a determinar qué tipos de TuAA serán útiles para el tratamiento de un tipo particular de cáncer.

Muchos intentos de desarrollar inmunoterapias para cáncer han tenido como diana un solo antígeno. Esto puede ser problemático para dos razones distintas. Primeramente, la expresión de cualquier TuAA particular en cáncer puede ser en forma de mosaico, variando la expresión del antígeno desde elevada en algunas células dentro de una masa tumoral hasta estar completamente ausente en otras. Además, el TuAA puede ser expresado en algunas lesiones pero no en otras. Al dirigir una respuesta inmunitaria contra más de un solo antígeno, si están adecuadamente seleccionados, se maximiza el número de células tumorales que puede ser reconocido. En segundo lugar, algunos tumores pierden la expresión de un TuAA después de la inmunización, dando lugar a una población resistente. Si la respuesta inmunitaria va dirigida contra más de un TuAA llega a ser mucho más difícil que surja un tumor resistente debido a que entonces para evitarlo debe perder simultáneamente la expresión de cada uno de los antígenos. Por tanto, al tratar el cáncer con inmunoterapia, puede ser ventajoso usar una combinación de diversos TuAA, tanto debido a una protección/cobertura más completa de la población de células tumorales, como debido a que habrá menos probabilidad de evitar el tumor a través de la pérdida de expresión de los TuAA. En realizaciones preferidas, esta técnica del ataque multivalente se emplea cuando un tumor es positivo para dos, tres, cuatro o más TuAA de la combinación usada.

El ataque multivalente puede ofrecer otra ventaja al aumentar la sensibilidad del tumor al ataque. Si la diana es más de un solo antígeno de una célula tumoral, se aumenta la concentración eficaz de agente antitumoral. Además, el ataque a la estroma asociada con el tumor, tal como la vasculatura, puede aumentar la accesibilidad de las células tumorales al (a los) agente(s) que se dirigen hacia ellas como dianas. Por tanto, incluso un antígeno que también se expresa en algunos tejidos normales puede recibir mayor consideración como antígeno diana, si los otros antígenos que han de actuar como dianas en un ataque multivalente no son expresados también por dicho tejido.

Definiciones

A no ser que se deduzca claramente de otro modo del contexto del uso de un término en la presente memoria, para los fines de esta descripción los términos listados a continuación tendrán generalmente los significados indicados.

Célula profesional de presentación de antígenos (abreviadamente en lo sucesivo pAPC, por la expresión inglesa, Professional Antigen-Presenting Cell).- Es una célula que posee moléculas co-estimuladora de linfocitos T y es capaz de inducir una respuesta a los linfocitos T. Las pAPC incluyen células dendríticas, linfocitos B, y macrófagos.

Célula periférica.- Es una célula que no es una pAPC.

Proteasoma de mantenimiento.- Es un proteasoma normalmente activo en células periféricas, y que generalmente no está presente o no es fuertemente activo en las pAPC.

Inmunoproteasoma.- Es un proteasoma normalmente activo en las pAPC; el inmunoproteasoma es también activo en algunas células periféricas de tejidos infectados o después de la exposición a interferón.

Epítopo.- Es una molécula o sustancia capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En realizaciones preferidas, los epítopos de acuerdo con esta definición incluyen, pero sin estar necesariamente limitados a ellos, un polipéptido y un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido es capaz de estimular una respuesta inmunitaria. En otras realizaciones preferidas, los epítopos de acuerdo con esta definición incluyen, pero sin estar necesariamente limitados a ellos, péptidos presentados en la superficie de células, estando los péptidos unidos no covalentemente a la hendidura de unión del MHC de la clase I, de tal modo que pueden interactuar con los receptores de los linfocitos T. Los epítopos presentados por el MHC de la clase I pueden estar en forma inmadura o madura. "Maduro" se refiere a un epítopo del MHC para distinguirlo de cualquier precursor ("inmaduro") que pueden incluir o consistir esencialmente en un epítopo de mantenimiento, sino que también incluye otras secuencias en un producto de la traducción primaria que ha sido eliminado por procesamiento, incluyendo sin limitación, solo o en cualquier combinación, digestión por el proteasoma, recorte del N-terminal o la acción de actividades enzimáticas exógenas. Por tanto, puede proporcionarse un epítopo maduro embebido en un polipéptido algo más largo, cuyo potencial inmunológico es debido, al menos en parte, a los epítopos embebidos; análogamente, los epítopos maduros puede ser proporcionados en su forma final que puede unirse en la hendidura de unión del HMC para ser reconocido por los receptores de los linfocitos T (abreviadamente en lo sucesivo TCR por la expresión T Cell Receptors).

Epítopo del MHC.- Es un polipéptido que tiene una afinidad de unión conocida o predicha para una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de mamífero de la clase I o la clase II.

Epítopo de mantenimiento.- En una realización preferida, un epítopo de mantenimiento se define como un fragmento de polipéptido que es un epítopo del MHC, y que se presenta en una célula en la cual son predominantemente activos los proteasomas de mantenimiento. En otra realización preferida, un epítopo de mantenimiento se define como un polipéptido que contiene un epítopo de mantenimiento de acuerdo con la definición anterior, que está flanqueado por uno varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo de mantenimiento se define como un ácido nucleico que codifica un epítopo de mantenimiento de acuerdo con la definición anterior. Se proporcionan epítopos de reconocimiento ilustrativos en la solicitud de patente de EE.UU. publicada Nº 20030220239 A1, y en la solicitud PCT publicada Nº WO04022709A2, presentada el 5 de septiembre de 2003; y la solicitud de patente de EE.UU. publicada Nº 20040180354 A1. Cada una de las solicitudes enumeradas tiene como título original en inglés "EPITOPE SEQUENCES".

Epítopo inmunitario.- En una realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un fragmento de polipéptido que es un epítopo del MHC, y que es presentado en una célula en la cual los inmunoproteasomas son predominantemente activos. En otra realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un polipéptido que contiene un epítopo inmunitario de acuerdo con la definición anterior, que está flanqueado por uno o varios aminoácidos adicionales. En otra realización preferida, un epítopo inmunitario se define como un polipéptido que incluye una secuencia de agregados de epítopos, que tiene al menos dos secuencias de polipéptidos que tienen una afinidad conocida o predicha para un MHC de la clase I. En otra realización preferida, se define un epítopo inmunitario como un ácido nucleico que codifica un epítopo inmunitario de acuerdo con cualquiera de las definiciones anteriores.

Célula diana.- En una realización preferida, una célula diana es una célula asociada con un estado patógeno que puede ser activada por los componentes del sistema inmunitario, por ejemplo, una célula infectada con un virus u otro parásito intracelular o una célula neoplásica. En otra realización, una célula diana es una célula que ha de ser la diana de las vacunas y métodos descritos. Ejemplos de células dianas de acuerdo con esta definición incluyen, pero sin estar necesariamente limitados a ellos: una célula neoplásica y una célula que aloja un parásito intracelular, tal como, por ejemplo, un virus, una bacteria o un protozoo. Las células dianas pueden incluir también células que son la diana de los linfocitos T citotóxicos (CTL) como una parte de un ensayo para determinar o confirmar la liberación apropiada de epítopos y procesar por una célula que expresa el inmunoproteasoma, para determinar la especificidad o inmunogenicidad (o poder inmunógeno) de los linfocitos T para un epítopo deseado. Dichas células pueden ser transformadas para expresar la secuencia de liberación o las células pueden ser pulsadas simplemente con péptido/epítopo.

Antígeno asociado a dianas (abreviadamente TAA por la expresión inglesa Target-Associated Antigen).- Es una proteína o polipéptido presente en una célula diana.

Antígeno asociado a tumores (TuAA).- Es una TAA, en donde la célula diana es una célula neoplásica. En realizaciones alternativas, un TuAA es un antígeno asociado con células no cancerosas del tumor, tales como células de la neovasculatura tumoral u otras células estromales dentro del medio ambiente del tumor.

Epítopo de HLA (Human Leukocyte Antigen = antígeno de leucocitos humanos).- Es un polipéptido que tiene una afinidad de unión conocida o predicha para una molécula compleja de HLA humano de la clase I o la clase II.

Anticuerpo.- Es una inmunoglobulina natural (Ig), poli- o mono-clonal o cualquier molécula compuesta en su totalidad o en parte de un dominio de unión a Ig, ya sea derivada bioquímicamente o mediante el uso de DNA recombinante o por cualquier otro medio. Ejemplos incluyen entre otros, F(ab), Fv monocatenarios y fusiones de la región variable de Ig con proteínas de la cubierta de fagos.

Similitud sustancial.- Este término se usa para referirse a secuencias que difieren de una secuencia de referencia de un modo no importante como se aprecia por examen de la secuencia. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las mismas secuencias de aminoácidos son sustancialmente similares a pesar de diferencias en las posiciones degeneradas o diferencias menores en longitud o composición de cualesquiera regiones no codificantes. Las secuencias de aminoácidos que difieren sólo por sustitución conservadora o variaciones de longitud menor son sustancialmente similares. Adicionalmente, las secuencias de aminoácidos que comprenden epítopos de mantenimiento que difieren en el número de residuos flanqueantes N-terminales o epítopos inmunitarios y agregados de epítopos que difieren en el número de residuos flanqueantes en cualquier extremo, son sustancialmente similares. Los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente similares son también por si mismos sustancialmente similares.

Similitud funcional.- Este término se usa para referirse a las secuencias que difieren de una secuencia de referencia de un modo no importante como se aprecia por examen de una propiedad biológica o bioquímica, aunque las secuencias pueden no ser sustancialmente similares. Por ejemplo, dos ácido nucleicos pueden ser útiles como sondas de hibridación para las mismas secuencias aunque codifiquen diferentes secuencias de aminoácidos. Dos péptidos que inducen respuestas a los CTL con reacción cruzada son funcionalmente similares incluso si difieren en sustituciones no conservadoras de aminoácidos (y por tanto no pueden caber dentro de la definición de similitud sustancial). Pares de anticuerpos o los receptores de los linfocitos T, que reconocen los mismos epítopos pueden ser funcionalmente similares entre sí a pesar de cualesquiera diferencias estructurales que puedan existir. Los ensayos para la similitud funcional de inmunogenicidad se pueden realizar inmunizando con el antígeno "alterado" y analizando la capacidad de una respuesta producida, incluyendo pero sin limitación, una respuesta de anticuerpo, una respuesta de CTL, producción de citoquinas, y similares, para reconocer el antígeno diana. Por consiguiente, dos secuencias pueden ser diseñadas para diferir en ciertos aspectos, aunque retengan la misma función.

Casete de expresión.- Es una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido, unida operativamente a un promotor y otros elementos del control de la transcripción y la traducción, incluyendo pero sin limitación: potenciadores, codones de terminación, sitios de entrada a los ribosomas internos, y sitios de poliadenilación. El casete puede incluir también secuencias que facilitan los movimientos desde una molécula hospedante a otra.

Epítopo embebido.- En algunas realizaciones, un epítopo embebido es un epítopo que está totalmente contenido dentro de un polipéptido más largo; en otras realizaciones, el término también puede incluir un epítopo en el que solamente el N-terminal o el C-terminal está embebido de tal modo que el epítopo no está totalmente en una posición interior con respecto al polipéptido más largo.

Epítopo maduro.- Es un péptido sin secuencia adicional más allá de la que presenta cuando el epítopo está unido en la hendidura de unión péptido-MHC.

Agregado de epítopos.- Es un polipéptido o una secuencia de ácido nucleico que lo codifica, esto es un segmento de una secuencia de proteína, que incluye una secuencia de proteína natural, que comprende dos o más epítopos conocidos o predichos con afinidad unión para un elemento de restricción del MHC compartido. En realizaciones preferidas, la densidad de epítopos dentro del aglomerado es mayor que la densidad de todos los epítopos conocidos o predichos con afinidad de unión para el elemento de restricción de MHC compartido dentro de la secuencia completa de la proteína.

Secuencia de liberación.- Es una secuencia diseñada o manipulada por ingeniería genética que comprende o que codifica un epítopo de mantenimiento embebido en una secuencia más grande que proporciona un contexto que permite que los epítopos de mantenimiento sean liberados por actividades de procesamiento que incluyen, por ejemplo, la actividad del inmunoproteasoma, el recorte N-terminal y/o otros procesos o actividades, solos o en cualquier combinación.

Precursores de linfocitos T (CTLp).- Los precursores de CTL son linfocitos T que pueden ser inducidos para exhibir actividad citolítica. Secundariamente la actividad lítica in vitro, mediante la cual se observan generalmente los CTLp, puede aparecer por cualquier combinación in vivo de CTL vírgenes, efectores y de memoria.

Linfocitos T de memoria.- Es un linfocito T, independientemente de su localización en el cuerpo, que ha sido previamente activado por un antígeno, pero que está en un estado fisiológico quiescente que requiere una nueva exposición al antígeno para conseguir la función efectora. Fenotípicamente son generalmente CD62L^{-} CD44^{hi} CD107\alpha^{-} IGN-\gamma LT\beta^{-} TNF-\alpha^{-} y están en la fase G0 del ciclo celular.

Efector de linfocitos T.- Es un linfocito T que, al encontrar un antígeno, exhibe fácilmente una función efectora. Los linfocitos T efectores son capaces generalmente de salir del sistema linfático y entrar en la periferia inmunológica. Fenotípicamente son generalmente CD62L^{-} CD44^{hi} CD107\alpha^{+} IGN-\gamma^{+} LT\beta^{+} TNF-\alpha^{+} y activamente cíclicos.

Función efectora.- En términos generales se define como la activación de los linfocitos T, que incluye la adquisición de actividad citolítica y/o secreción de citoquinas.

Inducir una respuesta de linfocitos T.- Incluye, en muchas realizaciones, el proceso de generar una respuesta de linfocitos T a partir de células vírgenes o en algunos contextos, células quiescentes; activar linfocitos T.

Amplificar una respuesta celular.- Incluye en muchas realizaciones, el procesamiento o aumento del número de células, el número de células activadas, el nivel de actividad, la tasa de proliferación o un parámetro similar de los linfocitos T implicados en una respuesta específica.

Sincronización.- Incluye en muchas realizaciones una inducción que confiere una estabilidad particular en el perfil inmunitario del linaje inducido de linfocitos T.

Receptor de tipo toll (abreviadamente en lo sucesivo TLR por la expresión inglesa Toll-Like Receptor).- Los receptores de tipo toll (TLR) son una familia de receptores de reconocimiento de modelos que se activan por componentes específicos de microsondas y ciertas moléculas hospedantes. Como parte del sistema inmunitario innato, contribuyen a la primera línea de defensa contra muchos agentes patógenos, pero también desempeñan una función en la inmunidad adaptativa.

Ligando de los receptores de tipo toll (TLR).- Es cualquier molécula capaz de unirse un receptor de tipo toll y activarlo. Ejemplos incluyen, sin limitación: poli IC A sintético, el RNA bicatenario que induce interferón. El polímero esta hecho de una cadena de poliácido inosínico y poliácido citídilico, RNA bicatenario, oligodesoxi-ribonucleótido de CpG no metilado u otras secuencias inmunoestimuladoras (ISS), lipopolisacárido (LPS), \beta-glucanos e imidazoquinolinas, así como sus derivados y análogos.

Adyuvantes inmunopotenciadores.- Son los adyuvantes que activan los pAPC o linfocitos T incluyendo, por ejemplo: ligandos de TLR, ligandos de los receptores de reconocimiento de modelos endocíticos (PRR), saponinas de quillaja, tucaresol, citoquinas, y similares. Algunos adyuvantes preferidos se describen en Marciani, D.J. Drug Discovery Today, 8:934-943, 2003.

Secuencias inmunoestimuladoras (abreviadamente en lo sucesivo ISS por la expresión inglesa ImmnunoStimulatory Sequence).- Generalmente es un oligodesoxi-ribonucleótido que contiene una secuencia de CpG no metilada. La secuencia CpG puede estar también embebida en DNA producido bacterialmente, particularmente plásmidos. Otra realizaciones incluyen diversos análogos; entre las realizaciones preferidas están las moléculas con uno o más enlaces fosforotioato o bases no fisiológicas.

Vacuna.-En realizaciones preferidas una vacuna puede ser una composición inmunógena que proporciona prevención de una enfermedad o ayuda a dicha prevención. En otras realizaciones, una vacuna es una composición que puede proporcionar la curación de una enfermedad o ayuda a dicha curación. En otras realizaciones, una composición de vacuna puede proporcionar la mejora de una enfermedad o ayudar a dicha mejora. Otras realizaciones de una composición de vacuna inmunógena se pueden usar como agentes terapéuticos y/o profilácticos.

Inmunización.- Un proceso para inducir una protección parcial o completa contra una enfermedad. Alternativamente, un proceso para inducir o amplificar una respuesta del sistema inmunitario a un antígeno. La segunda definición puede connotar una respuesta inmunitaria protectora, particularmente pro-inflamatoria o inmunidad activa, pero también puede incluir una respuesta reguladora. Así, en algunas realizaciones la inmunización se distingue de tolerancia (que es un proceso mediante el cual el sistema inmunitario evita producir inmunidad pro-inflamatoria o activa) mientras que en otras realizaciones este término incluye tolerancia.

Fragmento codificador.- Un término de extremos abiertos tal que un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos particular puede consistir en codones que especifican ese (poli)péptido, pero también puede comprender secuencias adicionales bien traducibles, o para el control de la transcripción, traducción o replicación o para facilitar la manipulación de alguna construcción de ácido nucleico hospedante.

Cobertura.- La fracción o proporción células tumorales que expresan un TuAA particular o al menos un TuAA de un conjunto de TuAA seleccionado.

Redundancia.- Es el grado en el cual una población de células tumorales o un subconjunto de ellas, expresa más de uno de un subconjunto seleccionado de TuAA.

Co-dirección a una diana.- En realizaciones preferidas, co-dirección a una diana implica inducir y/o amplificar una respuesta inmunitaria contra una célula diana, mientras que también se induce una respuesta inmunitaria contra al menos otro agente en la proximidad y/o medio de un tumor. En algunas realizaciones, los agentes dentro de la vecindad y/o medio dentro del tumor incluyen, pero sin limitación, células cancerosas, células estromales, incluyendo las asociadas con la neovasculatura, células endoteliales, fibroblastos, células inflamatorias, células epiteliales, factores autocrinos y factores paracrinos. En algunas realizaciones, las células neoplásicas y las células estromales son específicamente las dianas. En otras realizaciones, se induce y/o se amplifica una respuesta inmunitaria contra la neovasculatura y otras células linfoides no transformadas dentro del microambiente del tumor. En todavía otras realizaciones, se induce una respuesta inmunitaria contra células cancerosas y factores autocrinos y/o paracrinos producidos por células en el microambiente tumoral.

Inmunoterapia y diagnosis del cáncer

La inmunoterapia del cáncer ha estado fuertemente influenciada por el trabajo sobre el melanoma y el cáncer de próstata, puesto que han estado entre las dianas a las que más pronto y más ampliamente se ha dirigido la investigación es este campo. Muchos de los antígenos usados en los diversos intentos para desarrollar vacunas terapéuticas para estos cánceres han sido marcadores de diferenciación, esto es antígenos específicos para ese tipo de células. Como resultado, el paradigma actual es desarrollar agentes inmunoterapéuticos para un tipo particular de cáncer. Los pacientes son tratados entonces con el agente simplemente porque han sido diagnosticados con un tipo particular de cáncer. En algunos casos, se evalúa primeramente un tumor del paciente para la expresión de una antígeno diana particular. Sin embargo, muchos de los TuAA ahora conocidos, incluso algunos inicialmente clasificados como marcadores de diferenciación, se expresan en muchos tipos de cáncer. Para tal fin puede ser útil clasificar los tumores por los TuAA que expresan en lugar de sus tejidos de origen o además de dichos tejidos. Por tanto, en algunas realizaciones, se puede usar un solo agente inmunoterapéutico, preferiblemente multivalente, para tratar una amplia variedad de tipos de tumores. Esto no quiere decir que cualquier antígeno o combinación de antígenos particulares será uniformemente útil, a través de la totalidad, incluso de muchos, tipos de tumores. Por el contrario, la frecuencia de expresión puede variar considerablemente de un tipo a otro. Además, entre los TuAA ampliamente expresados es común que sean expresados en solamente una fracción de cualquier tipo de tumor particular. Realmente, esto es parte del ímpetu de aplicar agentes inmunoterapéuticos basados en estos antígenos a diversos tipos de tumores. No obstante, tanto los antígenos individuales, como sus combinaciones, tendrán frecuencias asociadas con tipos de tumores particulares. Por tanto, los agentes inmunoterapéuticos diseñados de acuerdo con las frecuencias más favorables observadas pueden ser más eficaces y/o eficientes cuando se aplican a dichos tipos de tumores
particulares.

A pesar de la prevalencia de ciertos TuAA o sus combinaciones, en tipos de tumores particulares, no siempre es suficiente tratar simplemente a los pacientes que tengan un tipo de tumor particular con un agente inmunoterapéutico que se dirija a un antígeno o antígenos prevalentes como diana(s) expresados por dicho tipo de tumor. Preferiblemente, los tejidos de tumores de pacientes deben ser cribados para la expresión de TuAA para los cuales haya disponible un agente inmunoterapéutico correspondiente, ya sea comercializado o en curso de pruebas clínicas. Dado que crece el número y variedad de inmunoterapias para cáncer será cada vez más ventajoso cribar cualesquiera tejidos de tumores de pacientes particulares para la expresión de una variedad de TuAA que se pueden expresar por dicho tipo de tumor de modo que proporcionen al profesional clínico la más amplia elección en hacer compatible un estado canceroso con las inmunoterapias disponibles.

Aunque mucha parte de esta descripción pone el énfasis en agentes que inducen activamente inmunidad mediada por linfocitos T restringidos a la clase I del MHC, los procesos de compatibilización descritos son igualmente aplicables con inmunoterapias de todas clases, activas o pasivas, celulares o humorales o cualquiera de sus combinaciones. Los métodos reivindicados en la presente memoria se adaptan a este ambiente de desarrollo en donde hay un número importante de inmunoterapias que tienen como dianas diversos antígenos. Los métodos abarcados en la presente memoria optimizan la compatibilización entre un tipo o estado de cáncer de un paciente particular y los agentes inmunoterapéuticos disponibles. Esto está en contraste con la práctica existente que está diseñada para calificar sencillamente a un paciente como elegible (o inelegible) para el tratamiento con un agente particular.

Preferiblemente, se ensambla un panel de TuAA que se expresa con una frecuencia relativamente alta en un tipo de tumor particular y se establecen los ensayos. Por consiguiente, una realización de la invención descrita en la presente memoria incluye el ensamblaje del panel y el establecimiento de ensayos apropiados. Puede ser ventajoso incluir un TuAA que se expresa ampliamente en una variedad de tipos de tumor del panel.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden empezar con un ensayo de un tejido tumoral del supuesto tipo correspondiente para expresión de un panel preseleccionado de antígenos. En algunas realizaciones, un panel de TuAA ensamblado para un tipo de tumor se puede usar para cribar otros tipos de tumores que pueden expresar al menos algunos antígenos. En algunas realizaciones, se desarrolla un perfil de expresión usando los resultados del ensayo. La selección de un agente inmunoterapéutico apropiado puede basarse en qué medida la composición del agente inmunoterapéutico, tal como inmunógenos (o agentes efectores en el caso de inmunoterapia pasiva), corresponde a los antígenos detectados del panel. El panel puede incluir más antígenos que probablemente han de ser las dianas de cualquier agente inmunoterapéutico de composición bien definida o ser detectados en cualquier muestra de tejidos.

Por tanto, no es necesario que un agente inmunoterapéutico comprenda inmunógenos que correspondan a cada antígeno del panel. Ni se requiere que todos los antígenos del panel sean la diana de algún conjunto de agentes inmunoterapéuticos que podrían razonablemente ser combinados en un régimen de inmunoterapia. También, aunque ventajoso, no se requiere que haya una perfecta compatibilidad entre la composición del (de los) agente(s) inmunoterapéutico(s) y el perfil de de expresión del tumor. Es usual la heterogeneidad de expresión de antígenos por un tumor del paciente. Por tanto, existe una posibilidad significativa de que un antígeno sea indetectable en una muestra de tejidos, y que sin embargo sea expresado en otros sitio. Esto es especialmente cierto para los antígenos más comúnmente expresados por el tipo de tumor particular. Por tanto, un agente inmunoterapéutico multivalente en el cual uno, alguno o la totalidad de los inmunógenos constituyentes corresponda a TuAA expresado por la porción analizada de un tumor de un paciente puede ser usado para tratar a ese paciente de acuerdo con el criterio del experto clínico. Similarmente el paciente puede ser tratado con una combinación de agentes multi- y mono-valentes agentes para optimizar la compatibilidad entre el perfil de expresión y los antígenos que constituyen las dianas. Los agentes inmunoterapéuticos pasivos en particular son frecuentemente monovalentes, pero el facultativo clínico experto entenderá no obstante como pueden ser combinados con otros agentes inmunoterapéuticos pasivos o activos en un régimen inmunoterapéutico útil. Las inmunoterapias pasivas conocidas corrientemente en la técnica incluyen: trastuzumab (HERCEPTIN®) que tiene como diana TuAA HER2/Neu; bevacizumab (AVASTIN®) que tiene como diana VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial) para inhibir la vascularización de tumores; cetuximab (ERBITUX^{TM}) que tiene como diana el antígeno receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, HER1, c-erbB-1); y panitumumab que también tiene como diana el antígeno receptor del factor de crecimiento epidérmico. Adicionalmente hay en desarrollo varios agentes inmunoterapéuticos mono- y multivalentes activos. Estos incluyen APC8015 (PROVENCE®) que tiene como diana ácido prostático-fosfatasa; APC8024 que tiene como diana HER2/Neu; MKC1106 que tiene como diana PRAME, PSMA, SSX-2, y NY-ESO-1; pSEM (SYNCHROVAX^{TM} ^{M} SEM) que tiene como diana Melan-A; MKC1207 que tiene como diana Melan-A y tirosinasa; pTA2 M (SYNCHROTOPE® TA2M que tiene como diana tirosinasa; DCVAX®-próstata que tiene como diana PSMA; ALVAC (2)-gp100M que tiene como diana gp100; ALVAC MAGE 1,3 que tiene como diana MAGE-1 y MAGE-3; ALVAC CEA que tiene como diana CEA; la vacuna NY-ESO-1/ISCOMATRATM que tiene como diana NY-ESO-1; PANVAC^{TM}-VF que tiene como diana CEA; y MUC-1; y PROSTVAC®-VF que tiene como diana PSA.

La diagnosis del tipo de cáncer puede ser un desafío que conduce a incertidumbre. Ensayos de cribado similares se pueden usar para establecer o confirmar la diagnosis de tipo de tumores incluyendo un marcador específico de un linaje del panel. El marcador puede ser el propio TuAA, como en la tirosinasa para el melanoma y PSA para la próstata, por ejemplo. Alternativamente, el marcador puede ser cualquier antígeno que sea razonablemente específico para el tipo de célula en cuestión y cuya expresión se mantiene en las células neoplásicas, por ejemplo, mamaglobina para tejidos de mama.

Tecnología del análisis

Se conocen en la técnica muchas tecnologías para llevar a cabo las etapas de análisis/ensayos de la invención. Generalmente, se puede adaptar cualquier método fiable de detectar proteínas o mRNA específicos. Se prefieren las técnicas basadas en características como la capacidad de analizar un gran número de muestras y/o proporcionar resultados rápidamente o que el análisis no sea costoso de realizar o lo óptimo de estos parámetros. Los tejidos tumorales para análisis se pueden obtener como tejidos en masa mediante cirugía o en forma celular a partir de sangre, médula ósea, aspirados de células, lavado peritoneal, aspirados pleurales o lavados bronquiales o similares.

La etapa de análisis puede incluir una determinación de al menos uno de los parámetros: ausencia, presencia, abundancia o estado de un TuAA en el panel. En algunas realizaciones, la determinación incluye el análisis de al menos uno de: mRNA, péptido, polipéptido, proteína madura y complejo MHC-péptido. En algunas realizaciones, la determinación incluye análisis de al menos uno de: estado de procesamiento de un polipéptido, empalme diferencial de un ácido nucleico, mutación de un ácido nucleico en comparación con una secuencia de línea germinal, variación de una secuencia de un ácido nucleico o polipéptido de una secuencia de consenso en una población, localización celular, localización sub-celular, y co-expresión con un marcador.

Comúnmente la detección de proteínas específicas implica el uso de anticuerpos. La inmunohistoquímica (IHC) es ampliamente aplicable, pero también se pueden usar la hibridación de Western, el radioinmunoensayo (RIA), y la citometría de flujo; también pueden usarse determinaciones de proteínas colectivamente. También se pueden usar los tetrámeros de los TCR y anticuerpos que reconocen los complejos péptido-MHC específicos. El tejido tumoral puede ser usado como diana o estimulador en una amplia variedad de ensayos inmunológicos (Elispot, reactividad de hibridomas con linfocitos T, microcitotoxicidad y similares). Dichos ensayos son específicos para un epítopo diana, no sólo para el antígeno precursor, y por tanto pueden denominarse ensayos de determinación de epítopos. La detección de mRNA específicos se puede conseguir usando cualquiera de las diversas modalidades de RT-PCR (transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa) y técnicas similares de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, 3SR), hibridación de Northern, extracción de matrices de genes con mRNA o cDNA, e hibridación in situ; determinaciones de transcritos colectivamente. También se pueden usar reactivos que detectan la presentación de epítopos particulares de linfocitos T de antígenos. Estos incluyen, por ejemplo, líneas de linfocitos T e hibridomas, y más preferiblemente, anticuerpos específicos para el complejo péptido-MHC y tetrámeros de los TCR (véase, por ejemplo, Li et al. Nature Biotech. 23:349-354, 2005).

Las técnicas de PCR son sensibles y generalmente fáciles de poner a punto, sin embargo, no pueden detectar el mosaicismo de la expresión de antígenos dentro de una muestra. La IHC (y otras técnicas que se realizan in situ), aunque potencialmente requiere un trabajo más intenso, permiten la variación espacial de la expresión dentro de una muestra que ha de observarse. Por tanto, se pueden hacer distinciones entre co-expresión de antígenos en las mismas células versus la co-expresión en células diferentes en la misma muestra. Ambas situaciones pueden ser deseables, proporcionando la primera mayor redundancia de dirección a dianas y una probabilidad reducida de que surjan mutantes de escape por pérdida de antígenos, revelando esto último cómo puede ser tenida como diana una mayor proporción del tejido tumoral total. Dicha información también es relevante para el uso de antígenos con perfiles de expresión más complejos. Por ejemplo, el PSMA, que puede ser expresado por las células de la próstata y la neovasculatura tumoral, puede ser usado como un marcador de linaje de la próstata si su expresión puede ser asociada específicamente a las células neoplásicas, bien sea través del uso de una metodología de detección in situ o una micro-disección antes de analizar la expresión.

En las realizaciones preferidas de la invención el agente inmunoterapéutico induces una respuesta de linfocitos T, incluyendo especialmente una respuesta a MHC de la clase I-linfocitos T restringidos. Por tanto, puede ser ventajoso confirmar la expresión del MHC por el tejido tumoral. Los reactivos para la detección de MHC, incluyendo por PCR y métodos basados en anticuerpos, son ampliamente conocidos en la técnica. Los reactivos específicos de clase, locus y tipo, son de uso común. La expresión de la clase I también puede ser determinada por detección de \beta2-microglobulina. Los reactivos específicos de clase, locus y tipo ofrecen la ventaja de un método ampliamente aplicable y uniforme. Los reactivos específicos de tipo permiten una confirmación simultánea de expresión y el tipo de MHC. Las técnicas basadas en anticuerpos pueden ofrecer la ventaja de detectar directamente la expresión de proteína en la superficie de las células, que es de relevancia clínica, en contraste con la RT-PCR y similares, a partir de las cuales solo puede inferirse la expresión de las proteínas de superficie. Los análisis basados en tetrámeros de los receptores de linfocitos T (TRC) permiten simultáneamente la confirmación de tanto la expresión del MHC como el antígeno diana (realmente, incluso epítopos diana) y son inherentemente específicos del tipo.

Diseño del panel

Se prevén diversas modalidades de los métodos descritos. La primera se refiere principalmente a la identificación de antígenos que están disponibles para ser utilizados como dianas en un tejido tumoral de un paciente particular. Por tanto, en algunas realizaciones, el panel de antígenos analizado para llevar a la práctica el método descrito en la presente memoria se ensambla a partir de los TuAA más comúnmente expresados para los cuales están disponibles (comercializados o en curso de desarrollo) agentes inmunoterapéuticos que tienen dichos TuAA como dianas. Los antígenos pueden ser incluidos en un panel sobre una base prospectiva, por ejemplo, debido a la expresión común o altamente específica en uno u otro sub-conjunto de tumores o en anticipación del desarrollo de un producto terapéutico correspondiente. Por tanto, las mismas observaciones en las investigaciones que indican que un antígeno sería una buena diana para inmunoterapia (por ejemplo, la especificidad, la prevalencia, y el nivel de expresión; la presentación para productos basados en linfocitos T o expresión en la superficie para productos basados en anticuerpos; y que pueden ser aumentadas por inclusión en un redundancia o amplitud inmunoterapéutica multivalente de dirección a dianas) también podrían justificar la inclusión de ese antígeno en los paneles de diagnóstico de la invención.

Un antígeno cuya expresión es específica para un tipo de tumor particular, tal como en tirosinasa en melanoma, es adecuado para paneles usados en el cribado de ese tipo de tumor. Un antígeno que se expresa en una variedad de tipos de tumores, incluso si no son altamente prevalentes en uno particular, puede ser adecuado para inclusión en los paneles usados para cribar esa variedad de tipos de tumores o en paneles usados como cribado general, por ejemplo, no vinculados a un tipo de tumor individual. En algunas realizaciones, el panel de antígenos específicamente excluye marcadores de perfiles de expresión de complejos asociados con cáncer, y similares, que no son dianas apropiadas de inmunoterapia.

El origen histológico de un tumor es generalmente de interés clínico, por ejemplo, en diseñar una estrategia de tratamiento o confirmar que una aparente recidiva está relacionada con el presunto cáncer original. Para este fin pueden ser incluidos marcadores de linajes en los paneles de antígenos.

Comercialización de agentes inmunoterapéuticos contra el cáncer

Las realizaciones de la invención descritas en la presente memoria se refieren a métodos para identificar pacientes que pueden beneficiarse de las inmunoterapias contra cánceres particulares que también pueden ser útiles en la identificación de candidatos para participar en pruebas clínicas de dichos productos y en la comercialización de las vacunas. Muchos de los trabajos de diagnóstico para el cáncer se realizan en laboratorios centralizados. Ya sea para reclutamiento o ya sea para comercialización, se establece un convenio con uno o más de estos laboratorios. El convenio puede suponer un contrato de honorarios por la atención médica o una sociedad o una empresa conjunta. El laboratorio incluye ensayos de perfiles de la expresión de los TuAA, como se describen en la presente memoria, en su panel estándar de ensayos realizado en las muestras de tumores presentadas y los resultados se reúnen con los de otros ensayos. Cuando una muestra de tumor se identifica como positiva para uno o más antígenos correspondientes a los inmunógenos constituyentes de una vacuna, se incluye una advertencia en el mismo comunicado que el informe del ensayo que alerte al doctor (o paciente si los resultados del ensayo son remitidos directamente al paciente) de la disponibilidad de una prueba clínica en la que puede ser incluido el paciente o de un producto del que el paciente puede beneficiarse.

Antígenos asociados a tumores

Ejemplos de TuAA útiles en las realizaciones descritas en la presente memoria incluyen tirosinasa (SEQ. ID NO. 1), melan-A, (SEQ. ID NO. 2), SSX-2, (SEQ. ID NO. 3), PSMA (antígeno de membrana específico de la próstata) (SEQ. ID NO. 4), MAGE-1 (SEQ. ID NO. 5), MAGE-3 (SEQ. ID NO. 6), NY-ESO-1 (SEQ. ID NO. 7), PRAME (SEQ. ID NO. 8), Her2/Neu (SEQ. ID NO. 9), PSA (SEQ. ID NO. 10), C35 (SEQ. ID NO. 11), SSX-4 (SEQ. ID NO. 12), gp100 (SEQ. ID NO. 13), factor de transcripción tiroideo 1 (TTF1) (SEQ. ID NO. 14), mamaglobina (SEQ. ID NO. 15), proteína inducible por prolactina (Brst2) (SEQ. ID NO. 16), isoforma 1 de mesotelina (SEQ. ID NO. 17), isoforma 2 de mesotelina (SEQ. ID NO. 18), PSCA (SEQ. ID NO. 19) y SCP-1 (SEQ. ID NO. 20). Las secuencias codificadoras naturales de estas 20 proteínas o cualquier segmento de ellas, pueden determinarse a partir de sus secuencias de cDNA o secuencias codificadoras completas (abreviadamente en lo sucesivo cds por la expresión inglesa complete DNA sequences), las SEQ. ID NOS. 21-40, respectivamente. Las secuencias descritas en la Tabla 1 se incluyen en el Listado de Secuencias del final de la presente memoria descriptiva.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1 SEQ. ID NOS

1

La tirosinasa es una enzima biosintética de la melanina que es considerada uno de los marcadores más específicos de la diferenciación melanocítica. La tirosinasa se expresa en algunos tipos de células, principalmente en melanocitos, y con frecuencia se encuentran altos niveles en los melanomas. La utilidad de la tirosinasa como un TuAA se recoge en la Patente de EE.UU. 5.747.271 titulada "METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUALS SUFFERING FROM A CELLULAR ABNORMALITY SOME OF WHOSE ABNORMAL CELLS PRESENT COMPLEXES OF HLA-A2/TYROSINASE DERIVED PEPTIDES, AND METHODS FOR TREATING SAID INDIVIDUALS".

La GP100, también conocida como PMe117, es otra proteína biosintética de la melanina expresada a altos niveles en los melanomas. La GP100 como un TuAA está descrita en la Patente de EE.UU. 5.844.075 titulada "MELANOMA ANTIGENS AND THEIR USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC METHODS".

La Melan-A, también conocida como MART-1 (Antígeno de melanomas reconocido por linfocitos T), es otra proteína biosintética de la melanina expresada en altos niveles en los melanomas. La utilidad de Melan-A/MART-1 como un TuAA se recoge en las Patentes de EE.UU. Nº 5.874.560 y 5.994.523 ambas tituladas "MELANOMA ANTIGENS AND THEIR USE IN DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC METHODS" así como en la Patente de EE.UU. Nº 5.620.886, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID SEQUENCE CODING FOR A TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR PROCESSED TO AT LEAST ONE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRESENTED BY HLA-A2".

El SSX-2, también conocido como Hom-Mel-40, es un miembro de una familia de antígenos del cáncer testicular (CT) altamente conservado (Gure, A.O. et al. Int. J. Cancer, 72:965-971, 1997). Su identificación como TuAA se recoge en la Patente de EE.UU. 6.025.191 titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH ENCODE A MELANOMA SPECIFIC ANTIGEN AND USES THEREOF". Los antígenos del cáncer testicular se encuentran en una variedad de tumores, pero generalmente están ausentes de los tejidos de adultos normales excepto los testículos. La expresión de diferentes miembros de la familia SSX se ha encontrado en diversas líneas de células tumorales. Debido al alto grado de identificación de las secuencias entre los miembros de la familia SSX, se generarán epítopos similares de más de un miembro de la familia que podrán unirse a una molécula MHC, de modo que algunas vacunas dirigidas contra
un miembro de esta familia puede tener una reacción cruzada y ser eficaces contra otros miembros de esta familia.

Los MAGE-1 (antígeno-1 asociado a melanomas), MAGE-2 (antígeno-2 asociados a melanomas) y MAGE-3 (antígeno-3 asociado a melanomas) son miembros de otra familia de antígenos del cáncer testicular descubiertos originalmente en el melanoma pero encontrados en una variedad de tumores. La identificación de proteínas MAGE como TuAA se muestra en la Patente de EE.UU. 5.342.774, titulada "NUCLEOTIDE SEQUENCE ENCODING THE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR, MAGE-1" y en numerosas patentes posteriores. Actualmente existen 17 entradas para MAGE (humano) en la base de datos SWISS Protein. Se da una amplia similitud entre estas proteínas, tal que en muchos casos, un epítopo procedente de una puede inducir una respuesta cruzada en otros miembros de la familia. Unos cuantos miembros de la familia MAGE no han sido observados en tumores, principalmente MAGE-H1 y MAGE-D1, que se expresan en los testículos y el cerebro, y células estromales de la médula ósea, respectivamente. La posibilidad de una reactividad cruzada en el tejido normal mejora por el hecho de que están entre las proteínas menos similares a las otras proteínas MAGE.

El GAGE-1 es un miembro de la familia GAGE de antígenos del cáncer testicular (Van den Eynde, B., et al., J. Exp. Med. 182: 689-698, 1995; Patentes de EE.UU. Nº 5.610.013; 5.648.226; 5.858.689; 6.013.481; y 6.069.001). La base de datos PubGene recoge actualmente 12 miembros accesibles distintos, algunos de los cuales son conocidos indistintamente como PAGE o XAGE. GAGE-1 a GAGE-8 tienen un grado muy alto de identidad de secuencias, por tanto la mayoría de los epítopos pueden ser compartidos entre múltiples miembros de la familia.

BAGE es un antígeno del cáncer testicular que se expresa comúnmente en el melanoma, particularmente en el melanoma metastásico, así como en carcinomas de pulmón, mama, vesícula y escamoso de la cabeza y el cuello. Su utilidad como un TuAA se recoge en las Patentes de EE.UU. Nº 5.683.886, titulada "TUMOR REJECTION ANTIGENS WHICH CORRESPOND TO AMINO ACID SEQUENCES IN TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR BAGE, AND USES THEREOF" y 5.571.711, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR BAGE TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSORS".

El NY-ESO-1, también conocido como CTAG-1 (Antígeno-1 del cáncer testicular) y CAG-3 (Antígeno-3 de cáncer), es un antígeno del cáncer testicular encontrado en una amplia variedad de tumores. El NY-ESO-1 como un TuAA está descrito en la Patente de EE.UU. 5.804.381, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING AN ESOPHAGEAL CANCER ASSOCIATED ANTIGEN, THE ANTIGEN ITSELF, AND USES THEREOF". Un locus parálogo que codifica antígenos con amplia identidad de secuencias, LAGE-1a/s y LAGE-1b/L, ha sido descrito en ensambladuras públicamente disponibles del genoma humano y se ha llegado a la conclusión que surge por empalmes alternativos. Adicionalmente, CT-2 (o CTAG-2, Antígeno-2 del cáncer testicular) parece que es un alelo, mutante o discrepancia de secuenciación de LAGE-1b/L. Debido a la amplia identidad de secuencias, muchos epítopos procedentes de NY-ESO-1 pueden inducir también inmunidad a tumores que expresan estos otros antígenos. El NY-ESO-1 y el LAGE son virtualmente idénticos hasta el aminoácido 70. Desde el aminoácido 71 hasta el 134 el mayor tramo de identidad entre las dos proteínas es 6 residuos, pero están presentes secuencias que potencialmente reaccionan de forma cruzada. Desde el aminoácido 135 al 180, NY-ESO y LAGE-1a/s son idénticos excepto en un sólo residuo, pero no está incluido LAGE-1b/L debido al empalme alternativo. Los antígenos CAMEL y LAGE-2 parece que proceden del mRNA del LAGE-1, pero a partir de marcos de lectura alternativos, dando así lugar a secuencias de proteínas no relacionadas. Más recientemente, la secuencia completa del clon RP5-865E18, RP5-1087L19 del cromosoma X de Homo sapiens de GenBank Accession AF277315.5, describe tres locus independientes en esta región que se denominan LAGE1 (correspondiente al CTAG-2 en las ensambladuras del genoma), LAGE2-A y LAGE2-B 3 (ambos correspondientes al CTAG-1 en las ensambladuras del genoma).

El PRAME, también conocido como MAPE, DAGE y OIP4, fue observado originalmente como un antígeno de melanomas. Posteriormente, se ha reconocido como antígeno del cáncer testicular (CT), pero a diferencia de muchos antígenos de CT, tales como, MAGE, GAGE y BAGE, PRAME se expresa en leucemias mieloides agudas. PRAME es un miembro de la familia MAPE, que consiste ampliamente en proteínas hipotéticas con las que comparte similitud limitada de secuencias. La utilidad de PRAME como un TuAA se recoge en la Patente de EE.UU. 5.830.753, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES CODING FOR TUMOR REJECTION ANTIGEN PRECURSOR DAGE AND USES THEREOF".

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El PSMA (antígeno de membranas específico de la próstata), un TuAA descrito en la Patente de EE.UU. 5.538.866 titulada "PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN" que se incorpora en su totalidad en la presente memoria como referencia, es expresado por el epitelio de la próstata normal y, a mayor nivel, en el cáncer prostático. Adicionalmente, se ha observado también su expresión en el carcinoma de ovarios. Se ha encontrado también en la neovasculatura de tumores no prostáticos. El PSMA puede así formar la base de vacunas dirigidas tanto al cáncer de próstata como de ovarios y a la neovasculatura de otros tumores. Este último concepto está descrito más completamente en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20030046714 A1, presentada el 7 de marzo de 2002, titulada "ANTI-NEOVASCULAR PREPARATIONS FOR CANCER". En resumen, a medida que crecen los tumores se produce el crecimiento interno de nuevos vasos sanguíneos. Se entiende que esto es necesario para mantener el crecimiento puesto que los centros de tumores no vascularizados son generalmente necrósicos y se ha indicado que los inhibidores de la angiogénesis provocan la regresión de los tumores. Dichos nuevos vasos sanguíneos o neovasculatura, expresa antígenos no encontrados en vasos establecidos, y por tanto pueden ser específicamente empleados como dianas. Induciendo CTL contra los antígenos neovasculares, los vasos pueden romperse, interrumpiendo el flujo de nutrientes a los tumores y la eliminación de sus residuos, lo que conduce a la regresión.

El empalme alternativo del mRNA de PSMA conduce a una proteína con un comienzo aparente en Met_{58}, delecionando con ello la supuesta región de anclaje de membrana del PSMA como está descrito en la Patente de EE.UU. 5.935.818, titulada "ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULE ENCODING ALTERNATIVELY SPLICED PROSTATE-SPECIFIC MEMBRANES ANTIGEN AND USES THEREOF". Una proteína denominada proteína similar a PSMA, número de acceso en Genbank AF261715, es casi idéntica a los aminoácidos 309-750 de PSMA, pero tiene un perfil de expresión diferente. Por tanto, los epítopos más preferidos son aquellos con un extremo terminal N localizado desde el aminoácido 58 hasta el 308.

El PSA (antígeno específico de la próstata) es una peptidasa de la familia de la calicreína y un antígeno de diferenciación de la próstata. También se ha estudiado su expresión en el tejido de mama. Nombres alternativos incluyen gamma-seminoproteína, calicreína 3, seminogelasa, seminina y antígeno P-30. El PSA presenta un alto grado de identidad de secuencias con los diversos productos de empalmes alternativos calicreína-1 y -2 prostática/glandular, así como calicreína 4, que también se expresa en tejido de próstata y de mama. Otras calicreínas comparten generalmente menos identidad de secuencias y tienen diferentes perfiles de expresión. No obstante, en el diseño de una vacuna debe considerarse la reactividad cruzada que podría ser provocada por cualquier epítopo particular, junto con la probabilidad de que dicho epítopo fuera liberado por tratamiento en tejidos no diana (más generalmente por el proteasoma de mantenimiento).

El PSCA (antígeno de células madre de la próstata) también conocido como SCAH-2, es un antígeno de diferenciación que se expresa preferiblemente en las células epiteliales de la próstata y se sobre-expresa en los cánceres de próstata. Se observa un menor nivel de expresión en algunos tejidos normales incluyendo las células neuroendocrinas del tubo digestivo y túbulos colectores del riñón. El PSCA está descrito en la Patente de EE.UU. 5.856.136, titulada "HUMAN STEM CELL ANTIGENS".

La proteína del complejo sinaptonémico 1 (SCP-1), también conocida como HOM-TES-14, es una proteína asociada a la meiosis y también un antígeno del cáncer testicular (Tureci, O., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5211-5216, 1998). Como un antígeno del cáncer su expresión no está regulada por el ciclo celular y se encuentra frecuentemente en gliomas y carcinomas de mama, de células renales y de ovario. Tiene alguna similitud con las miosinas, pero con muy pocas identidades en las que los epítopos de reacción cruzada no son una posibilidad inmediata.

El dominio ED-B de la fibronectina es también una diana potencial. La fibronectina se somete a empalme alternativo regulado en el desarrollo, siendo codificado el dominio ED-B por un único exón que se usa principalmente en los tejidos oncofetales (Matsuura, H. and S. Hakomori, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6517-6521, 1985; Carnemolla, B. et al. J. Cell Biol. 108: 1139-1148, 1989; Loridon-Rosa, B. et al. Cancer Res. 50:1608-1612, 1990; Nicolo, G. et al. Cell Differ. Dev. 32: 401-408, 1990; Borsi, L. et al. Exp. Cell Res. 199:98-105, 1992; Oyama, F. et al. Cancer Res. 53:2005-2011, 1993; Mandel, U. et al. APMIS 102:695-702, 1994; Famoud, M.R. et al. Int. J. Cancer 61:27-34, 1995; Pujuguet, P. et al. Am. J. Pathol. 148:579-592, 1996; Gabler, U. et al. Heart 75:358-362, 1996; Chevalier, X Br. J. Rheumatol. 35:407-415, 1996; Midulla, M. Cancer Res. 60:164-169, 2000).

El dominio ED-B también se expresa en fibronectina de la neovasculatura (Kaczmarek, J. et al. Int. J. Cancer, 59:11-16, 1994; Castellani, P. et al. Int. J. Cancer, 59:612-618, 1994; Neri, D. et al. Nat. Biotech. 15:1271-1275, 1997; Karelina, T.V. and A.Z. Eisen Cancer Detect. Prev. 22: 438-444, 1998; Tarli, L. et al. Blood 94: 192-198, 1999; Castellani, P. et al. Acta Neurochir. (Wien) 142:277-282, 2000, cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad como referencia en la presente invención). Como dominio oncofetal, el dominio ED-B se encuentra generalmente en la fibronectina expresada por las células neoplásicas además de ser expresada por la neovasculatura. Por tanto, las vacunas inductoras de CTL que tienen como diana el dominio ED-B pueden presentar dos mecanismos de acción: la lisis directa de las células tumorales y la interrupción del suministro de sangre al tumor por destrucción de la neovasculatura asociada al tumor. Puesto que la actividad de CTL puede deteriorarse rápidamente después de la retirada de la vacuna, puede ser mínima la interferencia con la angiogénesis normal. El diseño y ensayos de las vacunas que tienen como diana la neovasculatura están descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Pub. 20030046714 A1; titulada "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CANCER" presentada el 7 de marzo de 2002.

El antígeno carcinoembriónico (CEA) es una proteína oncofetal paradigmática descrita por primera vez en 1965 (Gold and Freedman, J. Exp. Med. 121: 439-462, 1965). Referencias más detalladas pueden encontrarse en Online Mendelian Inheritance in Man; registro *114890. Oficialmente se le ha dado el nuevo nombre de molécula de adhesión a células relacionadas con el antígeno carcinoembriónico 5 (CEACAM5). Su expresión está fuertemente asociada a los adenocarcinomas del revestimiento epitelial del tubo digestivo y en el colon fetal. El CEA es un miembro de la familia de supergenes de las inmunoglobulinas y el miembro definitorio de la subfamilia CEA.

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La survivina, también conocida como proteína que contiene repeticiones de IAP baculoviral 5 (BIRC5), es otra proteína con un perfil de expresión oncofetal. Es un miembro del inhibidor de la familia de genes de la proteína apoptósica (IAP). Está ampliamente sobre-expresada en los cánceres (Ambrosini, G. et al., Nat. Med. 3:917-921, 1997; Velculiscu V.E. et al., Nat. Genet. 23:387-388, 1999) y se cree que su función como un inhibidor de la apoptosis contribuye al fenotipo maligno.

El HER2/NEU es un oncogén relacionado con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (van de Vijver, et al., New Eng. J. Med. 319:1239-1245, 1988) y es aparentemente idéntico al oncogén c-ERBB2 (Di Fiore, et al., Science 237: 178-182, 1987). La sobreexpresión de ERBB2 ha sido implicada en la transformación neoplásica del cáncer de próstata. Como el HER2, se amplifica y sobre-expresa en el 25-30% de los cánceres de mama entre otros tumores en los que el nivel de expresión está correlacionado con la agresividad del tumor (Slamon, et al., New Eng. J. Med 344:783-
792, 2001). Una descripción más detallada está disponible en Online Mendelian Inheritance in Man; registro *164870.

La MESOTELINA es un antígeno encontrado originalmente en los mesoteliomas, pero también conocido por estar sobre-regulado en muchos cánceres pancreáticos y de ovario. Su uso como diana de vacunas, así como epítopos útiles, está descrito en Thomas, A.M. et al., J. Exp. Med. 200:297-306, 2004.

Más ejemplos de antígenos asociados a tumores incluyen MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15(58), CEA, RAGE, NY-ESO (LAGE), SCP-1, Hom/Mel-40, PRAME, p53, H-Ras, HER-2/neu, BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos E6 y E7 del papilomavirus humano (HPV), TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, \beta-catenina, CDK4, Mum-1, p16, TAGE, PSMA, PSCA, CT7, telomerasa, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, \beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16
TA-90 (proteína de unión a Mac-2\proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.

Más antígenos asociados a tumores están descritos en Chen, YT, "Identification of human tumor antigens by serological expression cloning: an online review on SEREX" Cancer Immun. 2004 [actualizada el 10 de marzo de 2004; citado el 1 de abril de 2004] en la página web cancerimmunotherapy.org/SEREX/; y Renkvist, N. et al., "A listing of tumor antigens recognized by T cells" Cancer Immunology Immunotherapy, 50:3-15 (2001).

La Tabla 2, adaptada de Scanlan et al., "The cancer/testis genes: Review, standardization, and commentary" Cancer Immunity, 4:1 (23 de enero de 2004) proporciona un listado de antígenos CT. La Tabla 3 proporciona la frecuencia de la expresión de mRNA en diversos tipos de tumores para los antígenos de CT de la Tabla 2. Scanlan et al., "The cancer/testis genes: Review, standardization, and commentary" Cancer Immunity, 4:1 (23 de enero de 2004).

TABLA 2

2

3

4

5

6

Más antígenos asociados a la neovasculatura tumoral incluyen VEGFR2 (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2) descrito en la Patente de EE.UU. Nº 6.342.221 y Tie-2, una tirosina quinasa receptora específica del endotelio que está descrita en el documento WO9943801.

Además de la interrupción del flujo sanguíneo a tumores que puede conseguirse utilizando agentes anti-neovasculatura, tales como los citados anteriormente, la utilización conjunta como dianas de moléculas expresadas en células cancerosas, así como también de moléculas expresadas en células estromales no transformadas subyacentes (incluyendo, por ejemplo, la neovasculatura, así como el tejido intersticial) puede mejorar también la eficacia de los agentes inmunoterapéuticos multivalentes en limitar el crecimiento de los tumores y promover la regresión del cáncer por otros mecanismos. La estroma abarca la neovasculatura, así como los fibroblastos y en general todas las células no linfoides y no transformadas en un microambiente tumoral. Por ejemplo, el ataque mediado inmunitario de las células endoteliales (por medio de los linfocitos T citotóxicos (CTL) o de las células citotóxicas dependientes de anticuerpos (ADCC)) puede dar como resultado la permeabilización de la neovasculatura y la iniciación de episodios inflamatorios que a su vez dan como resultado el reclutamiento y la translocación de efectores inmunitarios, tales como los CTL, que tienen como dianas las células neoplásicas en el tumor primario y las lesiones metastásicas. En comparación con las estrategias que tienen como dianas solamente células cancerosas, los métodos de utilización conjunta como dianas el tejido estromal asociado mejoran la eficacia del primero. Similarmente, en comparación con las estrategias que sólo tienen como diana la neovasculatura, los métodos que utilizan conjuntamente como dianas células cancerosas mejoran el efecto terapéutico global atacando las lesiones, incluyendo las de tamaño limitado y la vascularización, especialmente las situadas adversamente en los órganos vitales. Respecto a la neovasculatura, la utilización conjunta como dianas de los VEGFR (tal como II), CD55 y PSMA, así como de otras moléculas expresadas por la neovasculatura, puede realizarse generando CTL o anticuerpos con capacidad para iniciar ADCC o la lesión celular activada por el complemento. Alternativamente, se puede producir una lesión endotelial inicial por inmunoterapia pasiva utilizando los anticuerpos anti-angiogénicos disponibles.

Además o alternativamente, la co-utilización como dianas de antígenos asociados a dianas, junto con factores promotores del crecimiento, de la metástasis o de la supervivencia producidos por células cancerosas o células no transformadas que se encuentran en el compartimento extracelular (difundidos o asociados con la matriz extracelular), pueden también dar como resultado un efecto terapéutico más sustancial. Co-utilizando como dianas los antígenos expresados dentro o sobre las células cancerosas así como factores que ejercen efectos autocrinos o paracrinos (crecimiento, supervivencia y/o capacidad invasiva), el proceso patógeno puede retrasarse o interrumpirse en grado significativo. La co-utilización como dianas de factores autocrinos o paracrinos (tales como, aunque sin estar limitados a ellos, moléculas activadoras de NF-kB-CXCL1, CXCL8, CCL2; o factores de crecimiento tales como, aunque sin estar limitados a ellos, la hormona coriónico-gonadotrópica y gastrina) puede realizarse por co-inducción de anticuerpos neutralizantes o en segundo lugar por células que reconocen los CTL que producen dichos factores.

En general, la co-utilización como dianas de múltiples elementos de importancia biológica para el crecimiento tumoral y la metástasis puede limitar la progresión del proceso maligno incluyendo los procesos de selección clonal, evasión inmune y escape. Por tanto, la co-utilización como dianas de antígenos asociados a la estroma proporciona un modo adicional de ataque en el que son inhibidas y/o interrumpidas dichas actividades.

Un experto en la técnica apreciará que cualquier otro antígeno o proteína asociado a las células estromales vasculares o asociadas a otros tumores pueden ser una diana para las composiciones inmunógenas, incluyendo las que se conocen actualmente y las que todavía no han sido identificadas.

Composiciones

Las composiciones inmunógenas, incluyendo, por ejemplo, las vacunas, se pueden preparar utilizando antígeno completo o un péptido epitópico. Los inmunógenos peptídicos se pueden preparar fácilmente utilizando, por ejemplo, medios estándares de síntesis de péptidos conocidos en la técnica. Los inmunógenos pueden ser preparados comercialmente por una de las numerosas compañías que realizan síntesis químicas. Un ejemplo de dicha compañía es American Peptides, Inc., en la que el distribuidor es CLINALFA AG (Laufelfingen, Suiza). Los antígenos o inmunógenos se pueden preparar de acuerdo con las normas de buenas prácticas de fabricación (abreviadamente GMP por la expresión inglesa Good Manufacturing Practices) y la pureza se puede valorar por HPLC analítica. El producto se puede caracterizar por análisis de aminoácidos y analizar para determinar la esterilidad y la ausencia de
pirógenos.

Las composiciones inmunógenas pueden incluir también adyuvantes u otros modificadores de la respuesta biológica (abreviadamente BRM por la expresión inglesa Biological Response Modifiers). Métodos particularmente ventajosos para utilizar adyuvantes y BRM están descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060153844 A1 titulada, "METHODS TO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BY TARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS INTO LYMPHOID ORGANS", presentada el día 29 de diciembre de 2004.

Un antígeno se puede suministrar al sistema de un animal directa o indirectamente. Por ejemplo, un polipéptido se puede suministrar directamente como el polipéptido o indirectamente, por ejemplo, utilizando una construcción o vector de DNA o un virus recombinante que codifica el antígeno deseado. Para este fin puede ser adecuado cualquier vector que dirija la expresión en una célula que presenta un antígeno profesional. En el suministro indirecto, los antígenos se expresan en la célula y a continuación son presentados por la Clase I del MHC sobre la superficie de la célula para estimular una respuesta de CTL. La expresión de una forma segregada del antígeno puede ser útil para inducir una respuesta de anticuerpos que reconocen antígenos que son proteínas de membranas.

En una realización preferida, se puede suministrar un antígeno codificado en forma de un vector de expresión plasmídico sin cubierta. Construcciones particularmente útiles están descritas en la Solicitud de Patente de EE.UU. presentada el 17 de noviembre de 2002 (Nº de Pub. 20030228634 A1), titulada "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN"; Solicitud de Patente de EE.UU. presentada el 20 de agosto de 2002 (Nº de Pub. 2003-0138808); Solicitud PCT presentada el 19 de agosto de 2003 (Nº de Pub. WO 2004/018666); Patente de EE.UU. Nº 6.709.844, titulada "AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATION INTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION" y en la Solicitud de Patente de EE.UU. presentada el 7 de diciembre de 2001 (Nº de Pub. 20030215425 A1), titulada "EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS". Metodología, composiciones, péptidos y análogos peptídicos adicionales están descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060063913 A1, presentada el 17 de junio de 2004, titulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; Solicitud de Patente de EE.UU. 20060094661 A1 titulada "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS"; "COMMERCIALIZING AN ANTIGEN"; Solicitud de Patente de EE.UU. 20060165711 A1, presentada el 29 de diciembre de 2004, titulada, "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES"; y la Solicitud de Patente de EE.UU. 20080124352 A1, presentada el 29 de diciembre de 2004, titulada "METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THE INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE". La viabilidad y los métodos generales relacionados con el uso del DNA sin cubierta para inmunización están descritos en la Patente de EE.UU. Nº 5.589.466, titulada "INDUCTION OF A PROTECTIVE IMMUNE RESPONSE IN A MAMMAL BY INJECTING A DNA SEQUENCE" y en la Patente de EE.UU. N.º 5.679.647, titulada "METHODS AND DEVICES FOR IMMUNIZING A HOST AGAINST TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS THROUGH ADMINISTRATIONS OF NAKED POLYNUCLEOTIDES WHICH ENCODE TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENIC PEPTIDES". Las primeras se refieren sólo a inyección intramuscular o intradérmica mientras que las últimas se refieren sólo a la administración a piel o mucosa.

En una realización preferida, el antígeno se puede administrar directamente al sistema linfático. La administración intranodal para la generación de CTL se recoge en la Patente de EE.UU. Nº 6.994.851, presentada el 1 de septiembre de 1999 y Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20020007173 A1, y en la Solicitud PCT WO9902183A2 titulada cada una "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE". La inyección intra-ganglios linfáticos (i.ln.) de un solo bolo sólo requería el 0,1% de la dosis requerida para obtener un nivel similar de respuesta de CTL por inyección intramuscular (i.m.). Por consiguiente, puede establecerse una respuesta protectora contra la infección viral sistémica con un solo bolo administrado i.In., pero no con una dosis próxima al límite práctico administrado i.m. Las inyecciones i.m. repetidas de bolo no pudieron establecer una respuesta protectora contra una infección por virus periférica o un tumor trasplantado, mientras que dosis inferiores administradas i.In. fueron completamente eficaces. Protocolos de inmunización intranodal particularmente útiles se recogen en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20050079152 A1 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20050118186 A1 presentada el 17 de junio de 2004, ambas tituladas "METHODS TO CONTROL MAGNITUDE AND QUALITY THE MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNE RESPONSE" y en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20050079152 A1 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060165711 A1 presentada el 29 de diciembre de 2004, ambas tituladas "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE", en su totalidad.

Una clase de epítopos que pueden ser ventajosos en las composiciones inmunógenas anticancerosas son los epítopos de mantenimiento. Son producidos por la acción del proteasoma de mantenimiento (o estándar). Los epítopos de mantenimiento pueden ser liberados del producto de traducción de vectores de expresión por medio de un tratamiento proteolítico por el inmunoproteasoma de células presentadoras de antígenos profesionales (pAPC). En una realización de la invención, las secuencias que flanquean el(los) epítopo(s) de mantenimiento pueden ser alteradas para promover la escisión por el inmunoproteasoma en el(los) lugar(es) deseado(s). Los epítopos de mantenimiento, sus usos e identificación están descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20070269464 A1 y la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20030215425 A1, presentada el 7 de diciembre de 2001, titulada "EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS" y la Patente de EE.UU. Nº 6.861.234, titulada "METHOD OF EPITOPE DISCOVERY".

Ejemplos de epítopos de mantenimiento están descritos en las Solicitud de Patente de EE.UU. 20030220239 A1; Solicitud de Patente de EE.UU. 20040180354 A1; Solicitud de Patente de EE.UU. Nº Pub. 20030220239A1 y Solicitud PCT Nº de Pub. WO04022709A2 ambas tituladas "EPITOPE SEQUENCES".

En otras realizaciones de la invención, el(los) epítopo(s) de mantenimiento pueden estar flanqueados por secuencias arbitrarias o por secuencias que incorporan residuos que se sabe que favorecen los sitios de escisión por el inmunoproteasoma. Como se usa en la presente memoria la expresión "secuencias arbitrarias" se refiere a secuencias elegidas sin referencia al contexto de secuencias naturales del epítopo, a su capacidad para promover el procesamiento o a su función inmunológica. En otras realizaciones de la invención, pueden estar dispuestos múltiples epítopos de cabeza a cola. Estas matrices pueden estar constituidas completamente de epítopos de mantenimiento. Igualmente, las matrices pueden incluir alternativamente epítopos de mantenimiento e inmunitarios. Alternativamente, las matrices pueden incluir epítopos de mantenimiento flanqueados por epítopos inmunitarios, completos o truncados distalmente. Además, las matrices pueden ser de cualquier otro tipo similar. No existe restricción para la colocación de un epítopo de mantenimiento en las posiciones terminales de la matriz. Los vectores pueden contener adicionalmente secuencias, o sus segmentos, que codifican proteínas auténticas que contienen aglomeraciones de epítopos como fuente de epítopos inmunitarios. El término "auténticas" se refiere a secuencias de proteínas naturales.

Las aglomeraciones de epítopos y sus usos están descritos en las Solicitudes de Patente de EE.UU. 20030215425 A1 titulada "EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS" y 20030046714 A1 titulada "ANTI-NEOVAS-CULATURE PREPARATIONS FOR CANCER".

En otra realización de la invención, se puede suministrar una antígeno codificado en forma de un vector viral. Se adaptó una amplia matriz de virus con genomas modificados para marcos de lectura interpuestos pero con frecuencia ninguna de las proteínas virales, o al menos un número reducido de ellas, son conocidas en la técnica, incluyendo sin limitación, retrovirus incluyendo lentivirus, adenovirus, parvovirus incluyendo virus adenoasociados, herpesvirus y poxvirus incluyendo virus vaccinia. Dichos vectores virales facilitan el suministro del componente de ácidos nucleicos en la célula permitiendo la expresión. Un subconjunto de estos vectores, tales como retrovirus y parvovirus, promueven la integración de sus componentes de ácidos nucleicos en el genoma hospedante, mientras que otros no lo hacen.

Las bacterias pueden servir también como vectores, es decir se pueden utilizar para suministrar una molécula de ácido nucleico capaz de provocar la expresión de un antígeno. Por ejemplo, se ha ideado una cepa de Listeria monocytogenes que realiza su propia lisis al entrar en el citosol de macrófagos (su diana normal), liberando con ello un plásmido a partir del cual se expresa posteriormente el antígeno (Dietrich, G. et al., Biotechnology, 16: 181-185, 1998, que se incorpora en la presente invención en su totalidad como referencia). Igualmente se han utilizado Shigela flexneri y Escherichia coli (Sizemore, D.R. et al., Science, 270: 299-302, 1995, y Courvalin, P. et al., Life Sci. 318:1207-1212, 1995, respectivamente).

El uso de vectores microbianos para el suministro de ácidos nucleicos se puede complicar por las reacciones inmunitarias que provocan los propios vectores. Cuando se requiere una administración prolongada o repetida, el anticuerpo producido por el tratamiento anterior puede evitar que cantidades útiles del vector alcancen su hospedante destinado. Sin embargo, por administración directa intra-ganglio linfático, por ejemplo, la combinación de la proximidad a células hospedantes y la dosis eficaz mucho más reducida hace posible administrar una dosis capaz de superar o anular un título de anticuerpos existente.

La palabra vector se ha utilizado, aquí y en otros lugares, con referencia a diversas modalidades y modificada de forma muy diversa (por ejemplo, vector de expresión, vector viral, vector de suministro, etc.). El principio subyacente es que un ácido nucleico capaz de provocar la expresión de un antígeno, en lugar del antígeno propiamente dicho, llega al final a una proteína C activada (abreviadamente APC por la expresión inglesa Activated Protein C). Salvo modificado, explícitamente o por un contexto local, el término vector como se utiliza en la presente memoria pretende abarcar todas las posibilidades.

Las técnicas antes descritas son distintas de la propuesta de modificar el genoma microbiano, incluyendo el DNA extra-cromosómico, de tal forma que el antígeno se produce como un componente del microbio, que se administra a continuación él mismo como el inmunógeno. Ejemplos de microbios utilizados en la propuesta de modificación genómica incluyen virus, bacterias, hongos y protozoos. En realizaciones descritas en la presente memoria, las composiciones, incluyendo las vacunas, pueden comprender el antígeno ya sintetizado o un ácido nucleico capaz de provocar una APC para expresar el antígeno in vivo. En realizaciones alternativas, se utilizan las combinaciones de estas dos técnicas. Por ejemplo, una realización contempla el uso de un vector viral como se ha descrito antes que incorpora también un epítopo diana en una cápsida o proteína de la envolvente.

Los antígenos se pueden usar solos o se pueden suministrar en combinación con otros antígenos o con otros compuestos, tales como las citoquinas. Las citoquinas que se sabe que potencian la estimulación inmunitaria de las respuestas de CTL, incluyen, por ejemplo, GM-CSF, IL-12, IL-2, TNF, IFN, IL-18, IL-3, IL-4, IL-8, IL-9, IL-13, IL-10, IL-14, IL-15, G-SCF, TFN alfa, IFN beta, IFN gamma, TGF alfa, TGF beta y similares. Las citoquinas son conocidas en la técnica y están disponibles fácilmente en la bibliografía o comercialmente. Se ha demostrado que muchos tumores de animales o seres humanos producen citoquinas, tales como IL-4, IL-10, TGF-B, que son potentes moduladores de la respuesta inmunitaria y que protegen los tumores de la destrucción mediada por la respuesta inmunitaria. La producción de IL-4, IL-10 o TGF-B por los tumores puede conseguir este efecto protector suprimiendo la inducción de la inmunidad celular, incluyendo la elaboración de respuestas de CTL. Alternativamente, las citoquinas que soportan las respuestas de CTL se pueden añadir exógenamente para ayudar a mantener el equilibrio entre la inducción de respuestas mediadas por células anti-tumorales y de respuestas humorales no destructivas del tumor. Varias de dichas citoquinas exógenas muestran utilidad en los modelos experimentales de vacunación de ratones que se sabe que potencian las respuestas de CTL, incluyendo el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (abreviadamente en lo sucesivo GM-CSF por la expresión inglesa Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), IFN e IL-2. Un ejemplo de citoquina exógena eficaz que puede utilizarse es el GM-CSF. Se ha comprobado que el GM-CSF potencia la expresión de las llamadas moléculas "co-estimuladoras", tales como B7-1 o B7-2 en las células presentadoras de antígenos (APC). Estas moléculas co-estimuladoras son elementos importantes en la variedad de interacciones que tienen lugar durante la estimulación de CTL por APC. Por otra parte, se sabe que el GM-CSF induce la activación de las APC y facilita el crecimiento y diferenciación de las APC, haciendo con ello que estas APC sean células estimuladoras de los CTL importantes disponibles tanto en mayor número como en potencia.

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Las composiciones inmunógenas pueden contener además antígenos no diana con el fin de mejorar la respuesta al antígeno diana. Así la co-inducción de una respuesta auxiliar, tal como inmunidad de los linfocitos Th y/o B contra antígenos no propios o extraños no expresados en el proceso tumoral o en el organismo, puede dar como resultado una mejora sustancial en la magnitud y calidad de la respuesta inmunitaria a los antígenos diana "propios" o "propios modificados" expresados en el tumor o la estroma subyacente. Por ejemplo, la co-iniciación de una respuesta inmune de los linfocitos Th frente a un antígeno no diana, tal como toxoide tetánico, puede dar como resultado la generación de células auxiliares con efecto presencial con relación a la generación de respuestas de CTL o linfocitos B frente al tumor diana o a antígenos propios. Se puede utilizar cualquier secuencia definida que exprese o abarque restos peptídicos que se unen a al menos una proteína de la clase II del MHC expresadas por el organismo receptor, en el que dichas secuencias son no homólogas o contienen segmentos no homólogos con relación a los antígenos propios. Preferiblemente, dichas secuencias son de origen microbiano y demuestran ser inmunógenas en poblaciones definidas por HLA o más amplias. Además del toxoide tetánico (entero o porciones, incluyendo, aunque sin estar limitado a ellas, porciones del 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de un toxoide entero), otros ejemplos incluyen, aunque sin estar limitados a ellas, secuencias derivadas de HBV del núcleo, hemaglutinina de la gripe, antígeno del Plasmodio circumesporozoito y proteína de la envolvente de HTLV-1 y fragmentos de estas secuencias que son 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de la longitud completa de las secuencias respectivas. En algunas realizaciones, la porción del toxoide tetánico es del 5% al 90% de un toxoide entero, en otras realizaciones, la porción es del 15% al 80% de un toxoide entero, todavía en otras realizaciones, la porción del toxoide es del 25% al 70% de un toxoide entero, incluso en otras realizaciones, la porción del toxoide es del 35% al 60% de un toxoide entero, y finalmente en otras realizaciones, la porción del toxoide es del 45% al 55% de un toxoide entero. Similarmente, la co-administración de un epítopo de linfocitos B fuertemente inmunógeno (un antígeno no propio) con o sin un epítopo de Th (un antígeno no propio) con epítopos diana (propios, tumorales) de un modo cognado (es decir, en la misma molécula), puede dar como resultado una mejor respuesta inmunitaria o incluso interrupción de la tolerancia (linfocitos T) frente a la diana terapéutica, por medio de los complejos inmunes anticuerpo-antígeno y la ayuda de los linfocitos T presenciales.

Administración del antígeno

Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría particular, se cree que los linfocitos T no tienen una memoria funcional a largo plazo. La memoria de los linfocitos B mediada por anticuerpos parece, por otro lado, que tiene una memoria efectora a largo plazo. Por tanto, la administración de un antígeno que induce una respuesta de CTL se realiza más preferiblemente durante un cierto tiempo para mantener el sistema inmunitario del paciente apropiadamente estimulado para atacar a las células diana. En una propuesta, la presencia de antígeno se mantiene virtualmente de modo continuo en el sistema linfático para mantener la función de CTL efectora como se ha descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Pub. 20020007173 A1, titulada "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE". En otra propuesta, se induce repetidamente la memoria de los linfocitos T y se amplifican de nuevo y reactivan como se ha descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº 10/871707, titulada "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNE RESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FOR PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE" (Nº de Pub. 2005-0079152 A1), presentada el 17 de junio de 2004. Aunque se ha sugerido que se pueden preparar antígenos y adyuvantes como microesferas o liposomas biodegradables, ninguna de estas preparaciones ha proporcionada hasta ahora una respuesta de CTL que sea útil para atacar las células cancerosas o patógenos a largo plazo. Preferiblemente, la administración del antígeno se mantiene durante el periodo de tiempo deseado a un nivel suficiente para mantener el nivel de antígeno hasta obtener la respuesta deseada. En una realización, se puede usar un depósito que tenga una composición de antígeno fluida para administrar el antígeno de tal modo que alcance el sistema linfático del animal. Aunque buena parte de la siguiente descripción se centra en el uso de infusión para administrar el antígeno, también es posible utilizar inyecciones de bolos directamente al sistema linfático, cuyo número y frecuencia dependerá de la persistencia del antígeno conferida por la forma y formulación particulares del antígeno usado.

Al final el antígeno encuentra su camino en el sistema linfático para estimular más eficazmente los CTL. La administración de antígeno puede implicar la infusión en diversos compartimentos del cuerpo, incluyendo aunque sin estar limitado a ellos, los compartimentos subcutáneo, intravenoso, intraperitoneal e intralinfático, prefiriéndose éste último. Aunque cada uno de estos compartimentos de infusión da como resultado la absorción de antígeno por el sistema linfático, las cantidades relativas de antígeno necesarias para inducir una respuesta beneficiosa de CTL varía de acuerdo con el sitio de infusión. En general, la infusión directa de antígeno en el sistema linfático se considera el medio más eficaz de inducir una respuesta de CTL, sin embargo, puede utilizarse cualquier vía de administración. Los sistemas de bombeo son capaces de suministrar cantidades sustanciales de antígeno en un intervalo adecuado para inducir una respuesta de CTL por el suministro a todos los compartimentos del cuerpo. La estimulación de CTL que sigue a la administración del antígeno por las diversas vías variará dependiendo de las propiedades de los diferentes antígenos, incluyendo factores que influyen sobre el comportamiento del antígeno en el cuerpo y su velocidad de equilibrio (o longevidad) en la linfa, tales como la estabilidad del antígeno en los líquidos corporales, la solubilidad del antígeno en los líquidos corporales, la afinidad de unión al HLA y la potencia como estimulador de CTL.

En una realización preferida, la introducción del antígeno se realiza tan directamente como sea posible en el sistema linfático para evitar la destrucción del antígeno en el cuerpo por metabolismo. Cuando la introducción de una composición fluida de antígeno se realiza subcutáneamente, se necesitan mayores cantidades de antígeno para garantizar que suficiente antígeno alcanza el sistema linfático. En la presente memoria se describe dicha inyección subcutánea, dependiendo de factores tales como coste, estabilidad del antígeno, con qué rapidez llega el antígeno al sistema linfático, lo bien que llega al equilibrio con la linfa y otros factores que reconocerá el médico de cabecera o especialista. La administración subcutánea puede requerir generalmente 100 a 1000 veces más antígeno que la administración directa al sistema linfático. Por consiguiente, es preferible introducir la composición del antígeno por medio de un dispositivo para administración local en el sistema linfático, por ejemplo, el bazo, un ganglio linfático o un vaso linfático. El dispositivo para administración local puede estar situado fuera del paciente o ser implantado en el paciente. En cualquier caso, el dispositivo puede tener un depósito que contenga la composición fluida del antígeno, una bomba para transferir la composición y un canal de transmisión que parta desde el depósito y esté dirigido a la región preferida de administración del cuerpo del paciente. En cualquier caso es preferible que sea portátil.

Para el dispositivo colocado fuera del cuerpo del paciente (el dispositivo externo), existen numerosos dispositivos utilizados para administrar insulina a paciente diabéticos que son útiles para la administración del antígeno de acuerdo con las realizaciones descritas en la presente memoria. En general estos dispositivos pueden comprender un depósito para contener la composición del antígeno (en lugar de insulina), una bomba programable para bombear la composición fuera del depósito, un canal o tubo de transmisión para transmitir la composición y medios para introducir la composición en el cuerpo del animal para que alcance finalmente el sistema linfático.

Preferiblemente, el depósito para la composición del antígeno debe ser suficientemente grande para administrar la cantidad deseada de antígeno durante cierto tiempo y fácilmente rellenable o reemplazable sin requerir que el usuario inserte de nuevo los medios para introducir la composición del antígeno en el sistema linfático.

Para preparar las composiciones de antígeno descritas en la presente memoria, puede prepararse una composición (preferiblemente acuosa) que sea compatible con el sistema linfático y fisiológicamente aceptable por el animal que va a ser tratado. Consideraciones importantes incluyen, por ejemplo, las propiedades fisicoquímicas del antígeno, tales como punto isoeléctrico, peso molecular, glicosilación u otra modificación posterior a la traducción y la composición global de aminoácidos. Estas propiedades junto con cualquier comportamiento conocido del fármaco en diferentes soluciones (por ejemplo, diferentes tampones, co-factores, etc.) así como su comportamiento in vivo pueden guiar la elección de los componentes de la formulación. Un parámetro que influye sobre todas las vías de degradación principales es el pH de la solución. Por tanto, las formulaciones iniciales también evalúan la dependencia del pH de las reacciones de degradación y del mecanismo para la degradación, que con frecuencia puede ser determinado a partir de la dependencia del pH para determinar la estabilidad de la proteína en cada solución. Los métodos rápidos de cribado implican generalmente el uso de una estabilidad acelerada a temperaturas elevadas (por ejemplo, 40ºC) utilizando técnicas conocidas.

En general las composiciones de antígenos útiles en las realizaciones descritas en la presente memoria pueden ser adecuadas para inyección parenteral, en cantidades muy pequeñas. Por tanto una composición debe estar exenta de contaminación y tener un pH compatible con el sistema linfático. Sin embargo, debido a que se administrarán cantidades muy pequeñas de la composición antigénica, es necesario que no tenga el mismo pH que la sangre o la linfa y que no sea de base acuosa. El intervalo preferido de pH compatible es de aproximadamente 6,7-7,3 y puede prepararse utilizando agua para inyección que cumpla las especificaciones de la USP (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Edition; Chapters 86-88).

Para antígenos menos solubles, se puede utilizar un co-disolvente o tensioactivo adecuado, tal como dimetilsulfóxido (DMSO) o tensioactivos de marca PLURONIC. En general, una solución salina típica que está tamponada con un ácido débil fisiológicamente aceptable y su base conjugada, por ejemplo, un sistema tampón de fosfato o citrato, será la base de la composición del antígeno. En algunos casos, puede ser útil una pequeña cantidad de un antioxidante para estabilizar la composición y evitar la oxidación. Factores que deben tenerse en consideración para preparar las composiciones de antígeno pueden encontrarse en el libro de 1994 American Chemical Society titulado "Formulation and Delivery of Proteins and Peptides" (Acs Symposium Series, Nº 567) por Jeffery L. Cleland y Robert Langer (Editor).

Para los antígenos codificados por ácidos nucleicos pueden aplicarse consideraciones similares, aunque está ausente la variedad de propiedades fisicoquímicas encontradas con los polipéptidos, de modo que las formulaciones aceptables tendrán aplicabilidad casi universal. Como se ve en los Ejemplos 6-10, el DNA plasmídico en solución salina tamponada con fosfato (PBS) es una formulación aceptable y eficaz. En algunas realizaciones, el DNA se administra de forma continua o intermitente a intervalos cortos, desde un depósito llevado por el paciente o implantado en su cuerpo. Es preferible que el DNA se mantenga en una forma estable y soluble a la temperatura corporal o próxima a ella durante un periodo de tiempo mínimamente medido en días. En dichas aplicaciones en las que el ácido nucleico formulado se administrará desde un depósito durante un periodo de varios días o mayor, la estabilidad del ácido nucleico a la temperatura ambiente o corporal durante dicho periodo de tiempo, así como su esterilidad continuada, tiene la mayor importancia. Para estos fines es útil la adición de agentes bacteriostáticos (por ejemplo, alcohol bencílico o etílico) y agentes quelantes (por ejemplo, EDTA). Las formulaciones que contienen aproximadamente alcohol etílico al 0,5-2 %, EDTA 0,25-0,5 mM se comportan generalmente bien. Dichas formulaciones también son apropiadas para inyecciones de bolos.

En general la cantidad del antígeno en la composición de antígeno variará de un paciente a otro y de un antígeno a otro, dependiendo de factores tales como la actividad del antígeno para inducir una respuesta y el caudal de linfa en el sistema del paciente. En general, la composición de antígeno se puede administrar a una velocidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 microlitros/hora o aproximadamente 24 a aproximadamente 12000 microlitros/día. La concentración del antígeno es tal que en 24 horas se administrarán aproximadamente 0,1 microgramos a aproximadamente 10.000 microgramos del antígeno. El caudal se basa en el conocimiento de que aproximadamente cada minuto alrededor de 100 a alrededor de 1000 microlitros de líquido linfático fluye por un ganglio linfático inguinal de adulto. El objetivo es maximizar la concentración local de la formulación de la vacuna en el sistema linfático. Será necesario realizar una investigación empírica en los pacientes para determinar el nivel más eficaz de infusión para una preparación de vacuna dada en seres humanos.

Para introducir la composición de antígeno en el sistema linfático del paciente dicha composición se dirige preferiblemente a un vaso linfático, a un ganglio linfático, al bazo o a otra porción apropiada del sistema linfático. Preferiblemente, la composición se dirige a un ganglio linfático, tal como un ganglio inguinal o axilar insertando un catéter o aguja en el ganglio y manteniendo el catéter o aguja durante toda la administración. Las agujas o catéteres adecuados disponibles son de metal o plástico (por ejemplo, poliuretano, poli(cloruro de vinilo) [PVC], teflón, polietileno y similares). Para insertar el catéter o aguja en por ejemplo el ganglio inguinal, se pincha dicho ganglio bajo control ecográfico utilizando una cánula Vialon^{TM} Insyte-W^{TM} y un catéter de 24G3/4 (Becton Dickinson, USA) que se fija utilizando un apósito transparente Tegaderm^{TM} (Tegaderm^{TM} 1624, 3M, St. Paul, MN 55144, USA). Este procedimiento es realizado generalmente por un radiólogo experimentado. La ubicación de la punta del catéter en el ganglio linfático inguinal es confirmada por la inyección de un volumen mínimo de solución salina, que aumenta inmediata y visiblemente el tamaño del ganglio linfático. Este procedimiento permite la confirmación de que la punta está dentro del ganglio. Este procedimiento puede realizarse para garantizar que la punta no se desliza fuera del ganglio linfático y puede repetirse varios días después del implante del catéter. En caso de que la punta se deslice fuera del ganglio linfático, se puede implantar un nuevo catéter.

Formulación y protocolo de tratamiento

Existen varias propuestas que utilizan la combinación de TuAA con vacunas de DNA. Una primera propuesta es incluir todos los antígenos o epítopos de todos los antígenos en una combinación dada en un solo vector de expresión de DNA. Esta propuesta tiene las ventajas de simplicidad de fabricación y administración a los pacientes. Sin embargo, en algunos casos, la competición entre los epítopos puede limitar la utilidad de esta propuesta. Es decir, es posible que solo el epítopo más inmunógeno provoque una respuesta inmunitaria cuando se administra a los pacientes una vacuna con varios epítopos que representan todos los TuAA de la combinación. También es más difícil diseñar y construir una vacuna de DNA en la que todos los epítopos se expresen con altos rendimientos. No obstante, debido a que el procedimiento para tratar pacientes es simple y uniforme en cada tipo de cáncer, el coste es probablemente inferior al de otras propuestas descritas a continuación.

Una propuesta alternativa es incluir sólo un antígeno o epítopos de un antígeno en un vector de expresión de DNA. Esta propuesta tiene las ventajas de simplicidad en el diseño y construcción del vector de DNA, flexibilidad y administración adaptada a los pacientes. Si está disponible un gran número de vacunas de TuAA individuales, entonces se puede adaptar el tratamiento a cada paciente individual basándose en el perfil de expresión de los TuAA de su tumor. Por ejemplo, si la combinación estándar para tratar un tipo dado de cáncer es TuAA A, B y C (donde A, B, y C designan diferentes antígenos asociados a tumores), pero un tumor de un paciente expresa los TuAA, A, C y Z (pero no B), entonces el paciente puede ser tratado con vacunas separadas de cada uno de A, C y Z. Esta flexibilidad y adaptabilidad mejora el índice de éxito de la inmunoterapia debido a que se puede conseguir para cada paciente la redundancia de antígeno. Sin embargo, el procedimiento para tratar al paciente puede ser más complejo. Por ejemplo, la administración utilizando esta propuesta puede incluir un esquema de administración secuencial (un antígeno cada vez) o una inyección en múltiples sitios del paciente anatómicamente separados aproximadamente al mismo tiempo.

Todavía otra propuesta es combinar epítopos procedentes de múltiples TuAA que tienen similar inmunogenicidad en un vector de expresión de DNA (para algunas combinaciones puede usarse más de un vector).

Se puede utilizar un perfil de la expresión del antígeno de un tumor particular para determinar que antígeno o combinación de antígenos se va a usar. Una metodología ilustrativa y combinaciones antigénicas específicas con un beneficio particular para dirigir una respuesta inmunitaria contra cánceres particulares están descritas en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20050118186 A1, Solicitud de Patente de EE.UU. N.º de Publ. 20050079152 A1, presentada el 17 de junio de 2004, Solicitud de Patente de EE.UU. 20060159694 A1, tituladas todas "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN VACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCER".

Los pacientes que pueden beneficiarse de dichos métodos de inmunización pueden ser seleccionados utilizando métodos que definan su perfil de expresión de la proteína MHC y su nivel general de respuesta inmunitaria. Además, su nivel de inmunidad se puede monitorizar utilizando técnicas estándar junto con el acceso a la sangre periférica. Finalmente, los protocolos de tratamiento se pueden ajustar basándose en la respuesta a las fases de inducción o amplificación y la variación en la expresión del antígeno. Por ejemplo, en lugar de amplificar después de algunas dosis de sincronización, se pueden administrar dosis de sincronización repetidas hasta que se obtenga una respuesta detectable y a continuación se puede administrar dosis de péptidos amplificadoras. Similarmente, se pueden interrumpir las dosis de péptidos amplificadoras o de mantenimiento programadas si disminuye su eficacia, aumentan los números de linfocitos T reguladores específicos de antígenos o se observa alguna otra prueba de tolerancia y se puede administrar más dosis de sincronización antes de reanudar la amplificación con el péptido. La integración de las técnicas de diagnóstico para valorar y controlar la respuesta inmunitaria con métodos de inmunización está descrita más completamente en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20050287068 A1 titulada "IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS".

La combinación de inmunoterapias activas, como se describe en la presente memoria, con otras modalidades de tratamiento puede aumentar la sensibilidad de los procesos tumorales a la respuesta inmunitaria provocada y de ese modo dar como resultado un aumento del beneficio terapéutico. La cirugía cito-reductora del tumor antes o durante la inmunoterapia activa aumenta el potencial para cualquier nivel particular de respuesta inmunitaria de disminuir o detener el progreso de la enfermedad o de ocasionar la regresión o eliminación del tumor. Además, la lesión tisular, la necrosis o la apoptosis iniciada con terapia de anticuerpos, radioterapia, bioterapia, quimioterapia, inmunoterapia pasiva o cirugía, puede facilitar la propuesta inmunoterapéutica por medio de la inflamación general dando como resultado el reclutamiento de células efectoras inmunitarias que incluyen los efectores específicos de los antígenos. En general, cualquier método para inducir una inflamación general transitoria o más permanente en uno o múltiples tumores/lesiones metastásicas puede facilitar la inmunoterapia activa. Alternativamente o además de permitir el reclutamiento de efectores, la inflamación general puede aumentar también la sensibilidad de las células diana al ataque mediado inmunitario (por ejemplo, puesto que los interferones aumentan la expresión de moléculas dianas sobre las célula cancerosas y la estroma subyacente). Todavía otras estrategias para aumentar la sensibilidad de las células tumorales al ataque mediado inmunitario -proporcionando factores que interfieran con la "respuesta a la tensión" o aumenten las moléculas diana en las células cancerosas o células estromales- pueden crear sinergia con la inmunoterapia activa.

Los siguientes ejemplos sólo tienen fines ilustrativos y no están destinados de ningún modo a limitar el alcance de las realizaciones.

Ejemplos Ejemplo 1 Análisis de los TuAA y selección de combinaciones

La presencia de TuAA se midió por transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En resumen, se aisló el RNA total de muestras de tumores por métodos estándar y se preparó cDNA con procedimientos de transcripción inversa estándar. El DNA complementario (cDNA) se amplificó con cebadores, específicos de genes y diseñados específicamente que se asocian sólo a cDNA pero no a DNA genómico. Los modelos de expresión de TuAA de 12 muestras de tumores de ovario y 7 de tumores colo-rectales fueron analizados por RT-PCR. Los resultados se resumen en la Tabla 4 siguiente.

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TABLA 4

7

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Ejemplo 2 Cáncer de ovario

En el caso de cáncer de ovario, todas las muestras analizadas eran positivas a PRAME. Por tanto la inclusión de PRAME en la combinación mejora la cobertura de los casos con cáncer de ovario.

Con el fin de conseguir la redundancia y mejora de antígenos y la cobertura en una gran población, se consideraron las combinaciones de otros antígenos además de PRAME. SSX-2 así como PSMA estaban presentes en 6 de los 12 casos individualmente, pero la combinación de SSX-2 y PSMA proporcionó cobertura a 9 de los 12 casos. Aunque NY-ESO-1 y SSX-2 estaban sólo presentes en 5 y 6 de los 12 casos, respectivamente, NYESO-1 o SSX-2 fueron detectados en 7 de los 12 casos.

Por tanto, para ensamblar los paneles, la combinación de PRAME, SSX-2 y PSMA o PRAME, NY-ESO-1 y SSX-2 proporcionó cobertura y redundancia preferidas en comparación con la combinación de PRAME y PSMA o la combinación de FRAME y SSX-2. La combinación de PRAME, SSX-2 y PSMA proporcionó una excelente cobertura de casos y buena redundancia de antígenos debido a que la mayoría de las muestras de tumores de ovario analizadas tenían al menos dos de los cuatro TuAA en la combinación presente. La combinación de PRAME, SSX-2, PSMA y NY-ESO-1 proporcionó una redundancia de antígenos más preferida y por tanto menor posibilidad de escape tumoral.

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Ejemplo 3 Cáncer colo-rectal

En el caso de cáncer colo-rectal, se detectaron cada uno de PRAME y PSMA en 5 de las 7 muestras analizadas. En 6 de los 7 casos, se detectaron PRAME o PSMA. Aunque SSX-2 sólo se detectó en 2 de los 7 casos, tanto las combinaciones SSX-2-PRAME como SSX2-PSMA aumentaron la cobertura a 6 de 7. Similarmente, aunque NYESO-1 se detectó en sólo 1 de los 7 casos, la combinación de NY-ESO-1-PRAME, así como la combinación de NYESO-1-PSMA aumentaron la cobertura a 6 de 7. La adición de SSX-2 o NYESO-1 a la combinación de PRAME y PSMA mejoró la cobertura a 7 de 7. Por tanto, para ensamblar los paneles, la combinación de PRAME, PSMA y NYESO-1 o la combinación de PRAME, PSMA y SSX-2 proporcionó buena cobertura de casos y de redundancia de antígenos para una mayoría de pacientes. La combinación de PRAME, PSMA, NY-ESO-1 y SSX-2 proporcionó más redundancia.

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Ejemplo 4 Cáncer de páncreas

Se utilizó transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para determinar la presencia de PRAME, SSX2, NY-ESO-1 y PSMA. En resumen, se aisló RNA total de 5 muestras de tumores de páncreas por métodos estándares y se preparó cDNA por procedimientos de transcripción inversa estándares. El DNA complementario (cDNA) se amplificó con cebadores específicos de genes y diseñados específicamente que se asocian sólo a cDNA pero no a DNA genómico.

En las muestras de cáncer de páncreas, se detectó la presencia de PRAME, NYESO-1, SSX-2 y PSMA en el 100%, 40%, 20% y 100% de las muestras, respectivamente (véase la Tabla 5). Por otra parte, se encontró que PSMA y la sobre-expresión de HER2-/neu estaban presentes en el 100% y el 21% de los tumores de páncreas, respectivamente (Chang SS et al, Cancer Res., 1999, 59:3192; Safran H et al, Am J Clin Oncol. 2001, 24: 496). Aunque la sobre-expresión de HER2/neu puede hacer del tejido canceroso una diana preferida, proporcionando así alguna especificidad a la inmunoterapia, el bajo nivel de expresión de HBR2/neu en los tejidos normales sigue siendo un problema. Por tanto, para ensamblar los paneles, la combinación de NYESO-1, SSX-2 más PRAME o PSMA proporciona excelente cobertura y alguna redundancia para el cáncer de páncreas. La inclusión tanto de PRAME como de PSMA mejora significativamente la redundancia.

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TABLA 5

8

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Ejemplo 5 Carcinoma de células renales

En el carcinoma de células renales se detectaron SSX-2, PSMA y PRAME con frecuencias de 5, 100 y 40%, respectivamente (Sahin, U et al., Clin Cancer Res. 2000, 6:3916; Chang SS et al., Urology 2001, 57:801; Neumann E et al., Cancer Res. 1998, 58: 4090). Por tanto, la combinación de PSMA y PRAME proporciona excelente cobertura y redundancia para el carcinoma de células renales. Añadiendo SSX-2 a la combinación de PSMA y PRAME se mejora la redundancia.

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Ejemplo 6 Cáncer de pulmón no microcítico

En el cáncer de pulmón no microcítico, la presencia documentada de NYESO-1, SSX-2, MAGE-3, BAGE, la sobre-expresión de Her2/neu y PSMA fueron del 21, 15, 60, 6, 16 y 100%, respectivamente (Scanlan MJ et al, Cancer Lett. 2000, 150:155; Chang SS et al, Cancer Res., 1999, 59: 3192; Selvaggi G et al, Cancer 2002, 94: 2669). Por tanto, la combinación de NYESO-1, SSX-2, MAGB-3 y PSMA proporciona cobertura y redundancia de antígenos para la inmunoterapia del cáncer de pulmón no microcítico.

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Ejemplo 7 Melanoma

En el melanoma, se había demostrado la presencia de Melan A, Tirosinasa, NYESO-1 y SSX-2 en el 92, 92, 41 y 35% de las muestras tumorales, respectivamente (Fetsch PA, et al, Cancer 1999, 87:37; Fetsch PA, et al, Cancer 2000, 90:252; Schultz-Thater E et al, Br J Cancer 2000, 83:204; Sahin, U et al, Clin Cancer Res. 2000, 6:3916). Por consiguiente, la combinación de Melan A, Tirosinasa, NYESO-1 y SSX-2 proporciona excelente cobertura y redundancia de antígenos para la inmunoterapia del melanoma. Se consigue una redundancia significativa utilizando juntos tirosinasa y melan-A o combinando NY-ESO-1 y SSX-2 con tirosinasa o melan-A.

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Ejemplo 8

Otros estudios que implican los tipos de tumores anteriores establecieron un apoyo más sólido a los modelos de expresión observados y a los paneles preferidos de TuAA. Se analizaron un total de 34 muestras de tejidos de ovario, 44 de colon, 18 renales y 13 pancreáticos obtenidas de diversos vendedores para determinar la expresión de antígenos asociados a tumores utilizando qRTPCR. Los resultados de estos ensayos mostraron que PRAME y PSMA se expresaban con frecuencia (variando del 68% al 100%) en los cuatro tipos de tumores estudiados. NY-ESO-1 y SSX2 se expresaron en el 20% al 40% de tumores pancreático y de ovario, aunque la expresión de NY-ESO-1 y SSX-2 en tumores colo-rectal y renal eran sustancialmente inferiores (6% a 12%).

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TABLA 6

9

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Ejemplo 9 Calendario de inmunización con plásmidos que expresan epítopos procedentes de dos antígenos

Se inmunizaron dos grupos de ratones HHD (n = 4) por medio de una inyección en el ganglio linfático con pSEM que expresa Melan-A _{26-35}A27L (ELA) y pCBP que expresa SSX-2_{41-49} como una mezcla; o con pSEM en el ganglio linfático inguinal izquierdo y pCBP en el ganglio linfático inguinal derecho dos veces, el día 0 y 4, como se muestra en la Figura 1. La cantidad de plásmido fue 25 \mug/plásmido/dosis. Dos semanas más tarde, se sacrificaron los animales y se midió la citotoxicidad frente a los linfocitos T2 pulsados o no con péptidos.

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Ejemplo 10 Co-administración de diferentes vectores que llevan antígenos distintos

Se sacrificaron los animales inmunizados como se ha descrito en el Ejemplo 9 y los esplenocitos de cada grupo se mezclaron y estimularon en paralelo con los dos péptidos (ELA o SSX-2_{41-49}). La citotoxicidad se midió por incubación con linfocitos diana T2 cargados de péptidos y marcados con ^{51}Cr. Los datos de la Figura 2 muestran la media de la citotoxicidad específica (n = 4/grupo) frente a diversas células diana.

Los resultados muestran que el uso de una mezcla de plásmidos interfiere con la respuesta provocada por el plásmido pCBP; sin embargo, la segregación de los dos plásmidos con relación al sitio de administración recupera la actividad de pCBP. Por tanto, la co-administración de diferentes vectores que llevan distintos antígenos puede dar como resultado el establecimiento de una jerarquía con relación a la inmunogenicidad. La segregación de los vectores puede recuperar la inmunogenicidad del componente menos dominante, dando como resultado una respuesta multivalente.

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Ejemplo 11 Recuperación de la respuesta multivalente por adición de etapas de refuerzo con péptidos

Se inmunizaron cuatro grupos de ratones HHD (n = 6) por medio de una inyección en el ganglio linfático con pSEM y pCBP como una mezcla; o con pSEM en el ganglio linfático inguinal izquierdo y pCBP en el ganglio linfático inguinal derecho dos veces, el día 0 y 4, como se muestra en la Figura 3. Como control, se inmunizaron ratones con plásmido pSEM o pCBP. La cantidad del plásmido fue 25 \mug/plásmido/dosis. Dos semanas más tarde, a los animales se les administró como refuerzo péptidos melan A y/o SSX-2, reflejando la dosis de inmunización con plásmidos y la combinación. Dos semanas más tarde, los animales se sometieron a una prueba de virulencia con esplenocitos teñidos con CFSE y cargados o no con péptido Melan A o SSX-2, para evaluación in vivo de la citotoxicidad.

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Ejemplo 12 La amplificación peptídica recupera la inmunogenicidad del epítopo menos dominante

Se inmunizaron ratones como se ha descrito en el Ejemplo 11 y se sometieron a una prueba de virulencia con esplenocitos de cada miembro de la camada HHD revestidos con péptido ELA o SSX-2, empleando un ensayo de citotoxicidad in vivo con CFSE de triple pico que permite simultáneamente la valoración de la lisis específica de dos antígenos diana. A ratones inmunizados se les infundió intravenosamente un número igual de células de control con CFSE^{lo}, SSX-2_{41-49}-CFSE^{med} y ELA-CFSE^{hi} y 18 horas después se sacrificaron los ratones y se midió la eliminación de las células diana en el bazo (Figura 4) por fluorescencia con CFSE utilizando citometría de flujo. La Figura 4 muestra el porcentaje de lisis específica de los antígenos diana SSX-2 y Melan-A de ratones individuales, así como la media y el error típico de la media SEM para cada grupo.

Los resultados muestran que la inmunización de los animales con una mezcla de las dos vacunas que comprenden plásmidos seguida por péptidos generaron inmunidad a ambos antígenos y dieron como resultado la mayor respuesta inmunitaria, que representa un porcentaje medio de lisis específica de SSX-2 en el bazo de 30+/-11 y un porcentaje medio de lisis específica de Melan-A de 97+/-1.

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Ejemplo 13 Práctica clínica para inmunización por sincronización y amplificación

Los datos de las figuras 2 y 4 sugieren dos posibilidades para conseguir unas fuertes respuestas multivalentes en la práctica clínica, mostradas en la Figure 5. En la primera posibilidad (A), el uso de péptidos como refuerzo restaura las respuestas inmunitarias multivalentes incluso si se usan plásmidos y péptidos como mezclas. En la segunda posibilidad (B), la segregación de los componentes plásmido y peptídico respectivamente, permite la inducción de respuestas inmunitarias multivalentes.

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Ejemplo 14 MKC1207: Un agente terapéutico de sincronización y amplificación para melanoma

MKC1207 comprende el plásmido pSEM (Solicitud de Patente de EE.UU. 20030228634 A1 presentada el 7 de noviembre de 2002, en lo que se refiere a pMA2M) y los péptidos correspondientes a Melan-A 26-35 y tirosinasa 369-377. El plásmido codifica el análogo A27L del epítopo Melan-A y la secuencia del epítopo de tirosinasa natural. Los plásmidos codifican ambos de estos epítopos de tal manera que puedan ser expresados y presentados por pAPC. En realizaciones alternativas del agente terapéutico, los péptidos pueden comprender la secuencia natural o ser análogos, tal como los descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060057673 A1 titulada "EPITOPE ANALOGUES", presentada en la misma fecha que la solicitud de patente prioritaria de la presente.

En resumen, el plásmido se administra intranodalmente a los ganglios linfáticos inguinales como un inmunógeno sincronizador. Posteriormente los péptidos se administran intranodalmente, uno en el ganglio izquierdo y el otro en el derecho como inmunógenos amplificadores. El protocolo de sincronización y amplificación está descrito con mayor detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20050079152 A1 presentada el 17 de junio de 2004 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060165711 A1.

Los pacientes con melanoma pueden ser seleccionados de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención y administrarse MKC1207 a pacientes cuyo perfil de antígenos tumorales incluye Melan-A y/o tirosinasa. En una realización preferida el tejido tumoral de los pacientes expresa también HLA-A2, particularmente HLA-A*0201.

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Ejemplo 15 MKC1106: Un agente terapéutico tetravalente de sincronización y amplificación para carcinoma

MKC1106 comprende los plásmidos pCBP (descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20030228634 A1, presentada el 7 de noviembre de 2002) y pRP12 (descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20070004662 A1) tituladas "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES, EXPRESSED ON CANCER CELLS AND TUMOR STROMA", presentadas en la misma fecha que la solicitud de patente prioritaria de la presente y los péptidos correspondientes a NY-ESO-1 157-165, SSX-2 41-49, PRAME 425-433 y PSMA 288-297. Los plásmidos codifican ambos de estos epítopos de tal manera que puedan ser expresados y presentados por pAPC. En realizaciones alternativas del agente terapéutico, los péptidos pueden comprender la secuencia natural o ser análogos, tal como los descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060063913 A1, titulada "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS", en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060094661 A1, titulada "NY-ESO-1 PEPTIDE ANALOGS", en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060057673 A1 titulada "EPITOPE ANALOGS" y en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20070060524 A1, titulada "EPITOPE ANALOGS", cada una de las cuales fue presentada en la misma fecha que la solicitud prioritaria de la presente.

En resumen, los plásmidos se administran intranodalmente a los ganglios linfáticos inguinales, uno al izquierdo y otro al derecho, como un inmunógeno sincronizador. Posteriormente, los péptidos se administran intranodalmente en secuencia, dos en días separados al ganglio izquierdo y los otros dos en días separados al derecho como inmunógenos amplificadores. Se prefiere, aunque no se requiere absolutamente, que los péptidos sean administrados al mismo ganglio linfático que recibió el plásmido que codifica los epítopos correspondientes. El protocolo de sincronización y amplificación está descrito con más detalle en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20050079152 A1, presentada el 17 de junio de 2004 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. 20060165711 A1.

Los pacientes con carcinoma, especialmente aquellos con carcinoma de células de ovario, colo-rectales, pancreáticas o renales, pueden ser seleccionados de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención y se administró MKC1106 a pacientes cuyo perfil tumoral incluye PRAME, PSMA, NY-ESO-1 y/o SSX-2. El epítopo de NY-ESO-1 que es la diana de MKC1106 también se encuentra en LAGE 1a/s, de modo que la presencia de este antígeno en un perfil también sería considerado una coincidencia. Puesto que la expresión de los antígenos tumorales tiende a ser heterogénea, es probable que cualquier muestra de tejido particular no sea representativa de todos los antígenos expresados. Por tanto, no es necesario que un perfil de pacientes contenga los cuatro antígenos del paciente que va a ser candidato para tratamiento con MKC1106. Sin embargo, preferiblemente el perfil contiene 2, 3 o 4 de los antígenos.

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<110> Chiang, Chih-Sheng

\hskip1cm

Simard, John J.L.

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<120> COMBINACIONES DE ANTÍGENOS ASOCIADOS A TUMORES EN EL DIAGNÓSTICO DE DISTINTOS TIPOS DE CÁNCER

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<130> MANNK.050A

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<150> 60/580,969

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<151> 2004-06-17

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<160> 40

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 529

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

10

11

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<210> 2

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<211> 118

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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12

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<210> 3

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<211> 223

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

13

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<210> 4

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<211> 750

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

14

15

16

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<210> 5

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<211> 309

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

17

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<210> 6

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<211> 314

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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18

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<210> 7

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<211> 180

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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19

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<210> 8

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<211> 509

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 8

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20

21

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<210> 9

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<211> 1255

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

22

23

24

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<210> 10

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<211> 261

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

26

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<210> 11

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<211> 115

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

27

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<210> 12

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<211> 153

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 661

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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29

30

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<210> 14

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<211> 371

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

32

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<210> 15

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<211> 93

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

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<211> 146

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 622

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

35

36

37

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<210> 18

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<211> 630

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

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38

39

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<210> 19

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<211> 123

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

40

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<210> 20

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<211> 976

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

41

42

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2384

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1524

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1466

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2653

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

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46

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<210> 25

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<211> 2420

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 25

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48

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<210> 26

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<211> 4204

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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49

50

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<210> 27

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<211> 752

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 27

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51

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<210> 28

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<211> 2148

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 28

52

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<210> 29

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<211> 4530

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

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53

54

55

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<210> 30

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<211> 1464

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

56

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<210> 31

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<211> 781

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 31

57

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<210> 32

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<211> 1114

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 32

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58

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<210> 33

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<211> 2143

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 33

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59

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<210> 34

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<211> 2352

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 34

60

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<210> 35

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<211> 503

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 35

61

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<210> 36

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<211> 591

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 36

62

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<210> 37

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<211> 2388

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 37

63

630

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<210> 38

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<211> 2412

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 38

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64

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<210> 39

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<211> 946

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 39

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65

66

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<210> 40

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<211> 3503

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 40

67

Claims (31)

1. Un método de compatibilizar un estado canceroso en un paciente con uno o más agentes inmunoterapéuticos para usos en un régimen inmunoterapéutico, que comprende las etapas de:

clasificar el tejido tumoral del paciente sobre la base de analizar el tejido tumoral para dos o más antígenos asociados a tumores (TuAA) expresados en un panel preseleccionado, en donde el panel preseleccionado comprende dos o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, SSX-2, SSX-4, una proteína MAGE, MAGE-1, MAGE-3, PRAME, NY-ESO-1, LAGE, PSMA, PSCA, SCP-1, melan-A/MART-1 y tirosinasa para desarrollar, un perfil de antígeno para el tumor; y

seleccionar uno o más agentes inmunoterapéuticos para uso en un régimen inmunoterapéutico basado en el perfil, comprendiendo el régimen la administración de uno o más agentes inmunoterapéuticos dirigidos a dos o más antígenos dianas del perfil, en donde el tejido tumoral se clasifica por los TuAA que expresa y no por el tejido de origen.

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2. El método de la reivindicación 1, en donde el panel preseleccionado comprende además al menos un TuAA seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de cáncer testicular, un antígeno específico de tejido, un antígeno oncofetal, un antígeno de diferenciación, un factor de crecimiento, un receptor de factores de crecimiento, un factor de adhesión, una proteína de transducción de señales, un factor de transcripción, un producto de oncogén, un producto de un gen supresor de tumores, y un antígeno microbiano.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el estado canceroso es un carcinoma.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el carcinoma se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de mama, colo-rectal, de próstata, de páncreas, de pulmón, de ovario, de células renales y de melanocitos.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico es un agente inmunoterapéutico activo.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico comprende o codifica al menos un segmento de al menos uno de los TuAA expresados.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico es un agente inmunoterapéutico pasivo.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el agente inmunoterapéutico es un anticuerpo monoclonal.

9. El método de la reivindicación 1, que comprende al menos dos etapas de análisis realizadas en diferentes momentos durante el curso de la enfermedad, en donde se obtiene información comparativa de las etapas de análisis.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es melanoma y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en tirosinasa, melan-A/MART-1, NY-ESO-1, PRAME, una proteína SSX, y una proteína MAGE.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la proteína SSX es SSX-2 o SSX-4.

12. El método de la reivindicación 10, en donde la proteína MAGE es MAGE-1 o MAGE-3.

13. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer de mama y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en NY-ESO-1, Her2/neu, una proteína SSX, y una proteína MAGE.

14. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer colo-rectal y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en CEA, una proteína SSX, PRAME, NY-ESO, LAGE, PSCA, SCP-1, PSMA y una proteína MAGE.

15. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer de pulmón y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en PSMA, NY-ESO-1, SSX-2, y una proteína MAGE.

16. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer de próstata y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en NY-ESO-1, PSA, PSCA, PSMA, una proteína SSX, y una proteína MAGE.

17. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer de ovarios y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en PRAME, PSMA, PSCA, una proteína MAGE, SCP-1, una proteína SSX, CEA, Her-2/Neu, NY-ESO-1 y LAGE.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el cáncer de ovarios se selecciona del grupo que consiste en carcinoma seroso, carcinoma no seroso, carcinoma (célula) mucinoso y carcinoma de células claras.

19. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer renal y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, PRAME, NY-ESO, LAGE, PSCA, SCP-1, PSMA y una proteína MAGE.

20. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor es cáncer de páncreas y el panel de TuAA comprende al menos dos TuAA seleccionados del grupo que consiste en una proteína SSX, PRAME, NY-ESO, LAGE, PSCA, PSMA y una proteína MAGE.

21. El método de la reivindicación 1, en donde la expresión del antígeno se detecta mediante una técnica que comprende al menos una RT-PCR, determinación de transcritos, determinación de proteínas, determinación de epítopos o cualquiera de sus combinaciones.

22. El método de la reivindicación 1, en donde al menos un antígeno asociado a un tumor expresado es una antígeno de una célula neoplásica o un antígeno estromal asociado a un tumor o ambos.

23. El método de la reivindicación 22, en donde el antígeno estromal asociado a un tumor es un antígeno asociado a la neovasculatura.

24. El método de la reivindicación 23, en donde el antígeno asociado a la neovasculatura es PSMA y el antígeno de células neoplásicas se selecciona del grupo que consiste en NY-ESO-1, SSX2, LAGE y PRAME.

25. El método de la reivindicación 1, en donde el tejido tumoral comprende tejido tumoral primario.

26. El método de la reivindicación 1, en donde el tejido tumoral comprende tejido tumoral metastásico.

27. El método de la reivindicación 1, en donde el régimen comprende administrar tanto un agente inmunoterapéutico activo como un agente inmunoterapéutico pasivo.

28. El método de la reivindicación 1, en donde los dos o más antígenos expresados por el tumor incluyen un antígeno expresado por una célula neoplásica y un antígeno expresado por una célula estromal asociada a un tumor.

29. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico es adecuado para administración intranodal.

30. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inmunoterapéutico es adecuado para administración directamente al sistema linfático del paciente.

31. El método de la reivindicación 30, en donde el agente inmunoterapéutico comprende un adyuvante inmunopotenciador.