ES2352203T3 - Compuesto para uso en el diagnóstico de daño agudo del sistema nervioso central. - Google Patents

Abstract

Los bloqueantes del canal de KATP (KCCs) son útiles para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico del daño agudo del SNC en unmamífero, incluido un humano, porque su administración, particularmente en el caso de la glibenclamida, potencia el efecto microglial neuroprotector. Por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de la fase aguda de enfermedades del SNC tales como ictus, convulsión, lesión axonal, daño traumático, neurodegeneración, lesión de la médula espinal y enfermedades autoinmunes e infecciosasdel SNC. Los KCCs, modificados isotópicamente, son también útiles para la preparación de agentes diagnósticos para la detección yel seguimiento del daño agudo del SNC.

Description

La presente invención está relacionada con bloqueantes del canal de KATP modificados isotópicamente para uso en la diagnosis del daño agudo del sistema nervioso central (SNC) en mamíferos, incluyendo humanos, en que el daño ha sido causado por una lesión del SNC.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La microglía se distribuye en territorios no solapados a través del sistema nervioso central (SNC). En términos funcionales, la microglía representa la red de células inmunes accesorias en el cerebro, la médula espinal y las neuroestructuras del ojo, funcionando como un sensor intrínseco de amenazas. La sensibilidad elevada de las células microgliales a los cambios del microambiente del SNC las capacita para funcionar como centinelas (cfr. G.W. Kreutzberg, Trends Neurosci. 1996, vol. 19, págs. 312-8). Los beneficios derivados de una microglía activada permanecen controvertidos debido a su rol dual, de protección del SNC del daño así como de amplificación de los efectos de las respuestas inflamatorias y autoinmunes y de mediación de la neurodegeneración celular (cfr. WJ. Streit et al., Prog. Neurobiol. 1999, vol. 57, págs. 56381).

El daño al SNC cambia rápidamente la expresión génica neuronal y estimula la microglía que está cercana como soporte. La activación de la microglía, la primera etapa en la protección de la lesión del SNC (cfr. L. Minghetti et al., Prog. Neurobiol. 1998. vol. 54, págs. 99-125), es suficiente para limitar nuevo daño tisular. Después de una lesión, las células microgliales de activación temprana segregan citocinas antiinflamatorias (p.ej. IL-10 y TGF-beta) y expresan los transportadores del glutamato para prevenir una lesión excitotóxica.

Así, en esta fase aguda, la eliminación de glutamato por los astrocitos activos es ayudada por una expresión microglial de novo del transportador de glutamato (cfr. A. V. Vallat- Decouvelaere at al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2003, vol. 62, págs. 475-85) para evitar el daño excitotóxico. En este evento temprano post-lesión, la expresión por la célula microglial ramificada de transportadores del glutamato EAAT1 , EAAT2 y EAAT3 evita la muerte neuronal excitatoria mediada por el glutamato (cfr. F. Lopez-Redondo et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 2000, vol. 76, págs. 429-35; F35 Chretien et al., Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2002, vol. 28, págs. 410-7).

Actualmente, se han propuesto muy pocos tratamientos en práctica clínica para prevenir el daño agudo del SNC. Están orientados a inhibir o prevenir la activación de mecanismos implicados en la muerte neuronal, pero su efectividad es limitada y a veces contradictoria. Se han propuesto algunos agentes, como el mesilato de tirilazad y el Ebselen (2-fenil1,2-bencisoselenazol-3(2H)-ona) para neutralizar radicales libres y evitar su toxicidad; otros han sido propuestos para reducir la toxicidad del calcio intracelular (p.ej. nimodipino)

o para interferir con la neurotransmisión GABAérgica (p.ej. clometiazol) o con la neurotransmisión por glutamato (p.ej. magnesio). Sin embargo, actualmente, no existe ningún tratamiento para evitar la lesión aguda del SNC que presente una buena eficacia y una seguridad elevada para el paciente.

En realidad, en la mayoría de los casos, después de un daño agudo, los pacientes quedan bajo observación clínica durante varios días en ausencia de un tratamiento específico, simplemente a la espera de una evolución beneficiosa. Por ello, es deseable proporcionar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento temprano del daño agudo del SNC.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores sorprendentemente han encontrado que la microglía activada humana y de roedores expresa un canal de KATP similar a los conocidos en los tejidos cardíaco y muscular, neuronas y células beta pancreáticas. Los canales de KATP encontrados inicialmente en corazón (cfr. A. Noma, Nature 1983, vol. 305, págs. 147-8) también se han descrito en páncreas, músculo esquelético, músculo liso, pituitaria, células tubulares del riñón, células vasculares y neuronas específicas de algunas áreas del cerebro.

El hecho de que la microglía activada exprese canales de KATP, convierte a los bloqueantes del canal de KATP ("KATP channel closers", KCC) incluyendo las sulfonilureas, en dianas terapéuticas para proteger del daño agudo al SNC. Los KCC han sido utilizados hasta el momento para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Los inventores han encontrado que los KCC, y en particular la glibenclamida, potencian la reacción microglial aguda y evitan la excitotoxicidad de cerebro inducida por AMPA (ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico) en varias patologías del SNC tales como ictus, convulsión, lesión axonal, daño traumático, neurodegeneración, lesión de la médula espinal y enfermedades autoinmunes e infecciosas. Los KCC promueven la eliminación del glutamato sináptico y la secreción de citocinas antiinflamatorias por la microglía ramificada en los periodos tempranos de supervivencia.

Así, la presente invención se refiere al uso de un KCC modificado isotópicamente para el uso en el diagnóstico de daño agudo del SNC en un mamífero, incluido un humano, y en el que dicho daño incluye la activación de microglía que expresa canales KATP, en el que dicho uso comprende la administración de una cantidad efectiva de un KCC modificado isotópicamente junto con cantidades apropiadas de diluyentes y vehículos aceptables.

Los KCC son típicamente sulfonilureas. Ejemplos de ellas son la glibenclamida, la tolbutamida, la gliclazida, la gliquidona, la tolazamida, la clorpropamida, la glipizida, la

gliburida, la glimepirida y la glisentida. En una realización particular de la invención, el KCC es la glibenclamida.

En una realización particular de la invención, el daño agudo del SNC es causado por una lesión del SNC, como lesión cerebral, lesión de la médula espinal, isquemia global, isquemia focal, hipoxia, ictus, convulsión, epilepsia, status epiléptico, enfermedad vascular del SNC, enfermedad neuroocular (p.ej. neuropatía óptica inflamatoria y retinitis) y trauma.

De acuerdo con la presente invención, los KCC previenen los efectos excitotóxicos agudos del SNC.

Un experto en la materia seleccionará una vía de administración adecuada para los KCC, incluyendo la glibenclamida, como la oral, bucal, parenteral, de liberación retardada ("depot"), rectal, o por inhalación o insuflación (tanto por la boca como por la nariz). Son preferidas las formulaciones orales y parenterales. Se prefiere que su administración se asocie con una ventana terapéutica estrecha después del daño agudo.

Para la administración oral, los KCC pueden estar en forma, por ejemplo, de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden estar en forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo apropiado antes de uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse con medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables. Las preparaciones para la administración oral pueden formularse para dar una liberación controlada del principio activo.

Las preparaciones líquidas para cirugía perioperatoria del SNC, incluyendo los procedimientos cerebrales, medulares y neurooftálmicos pueden estar en forma de, por ejemplo, soluciones o suspensiones, o pueden presentarse como un producto

seco para su aplicación directa (p.ej. polvo, gel o impregnado sobre un soporte sólido) o reconstituido con agua u otro vehículo adecuado (p.ej. agua estéril libre de pirógenos) antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes emulsionantes (p.ej. lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p.ej. aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (p.ej. metil o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales tampón, y de forma opcional, múltiples agentes activos (p.ej. antibióticos) en un vehículo fisiológico apropiado como una solución salina o solución de Ringer lactada. La solución se aplica por irrigación continua de una herida durante los procedimientos de cirugía y de diagnóstico para potenciar la neuroprotección del SNC.

Los KCC pueden formularse para la administración parenteral por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosis por unidades (p.ej. en ampollas o en contenedores multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden estar en formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes como estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su reconstitución con un vehículo adecuado (p.ej. agua estéril libre de pirógenos) antes de su uso.

Los KCC pueden también formularse para su administración local, por ejemplo, por inyección carotidea, punción lumbar o cisternal, infusión intracerebroventricular o tisular, como soluciones para su administración mediante un aparato de suministro adecuado o alternativamente como una mezcla en polvo con un vehículo adecuado para su administración mediante un dispositivo de suministro adecuado.

Los KCC pueden formularse también como composiciones rectales como supositorios o enemas de retención (p.ej. conteniendo bases convencionales de supositorios como la manteca de cacao u otros glicéridos).

Para la administración intranasal y ocular, los KCC pueden formularse como soluciones para su administración mediante un dispositivo dosificador o de dosis unitarias o alternativamente como una mezcla en polvo con un vehículo adecuado para su administración mediante un dispositivo de suministro adecuado.

Los rangos de dosis adecuadas se encontrarán de forma rutinaria por un experto en la materia. Así, para uso en las condiciones referidas a la presente invención, los compuestos pueden usarse a las dosis apropiadas para otras condiciones para las cuales se conoce que los KCC son útiles. Puede ser necesario hacer variaciones rutinarias de la dosificación, dependiendo de la edad y del estado del paciente, y la dosificación precisa quedará en último término a discreción del médico o del veterinario responsable. La dosificación variará también con la vía de administración y del compuesto particular seleccionado. Un intervalo de dosis adecuada es por ejemplo 0,01 a 1000 mg/kg de peso por día, preferentemente de 0,1 a 200 mg/kg, y más preferentemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg.

Los KCC útiles en la presente invención pueden administrarse en combinación con otros KCC y/o en combinación con otros agentes terapéuticos y pueden ser formulados para su administración por cualquier ruta de forma conveniente. Las dosis apropiadas se encontrarán de manera rutinaria por los expertos en la materia.

La invención se refiere al uso de un KCC modificado isotópicamente para la preparación de un agente de diagnóstico para el daño agudo del SNC. El experto en la materia escogerá apropiadamente los isótopos y las técnicas para detectar y seguir la reacción microglial. Las técnicas funcionales de

imagen cerebral como la tomografía de emisión de positrones ("positron emission tomography", PET), la tomografía computarizada de emisión de fotones individuales ("single-photon emission computed tomography", SPECT) y la resonancia magnética nuclear ("nuclear magnetic resonance", NMR) pueden proporcionar una imagen que representa la distribución en el SNC de la reacción microglial. En el proceso de la enfermedad, la microglía, una vez activada, presenta una participación territorial altamente restringida. Ello le confiere valor diagnóstico para la localización espacial precisa de cualquier proceso activo de enfermedad. Los KCC pueden marcarse por ejemplo con 11C, 13C, 17F, 31P, 1H o 17O.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra el área de microgliosis hipocampal (A, en mm2) inducida por la microinyección estereotáxica de PBS (sham, S), glibenciamida (Glib), AMPA y AMPA+glibenclamida (AMPA+Glib). Un asterisco significa p<0,01 diferente de sham y el símbolo # significa p<0,01 diferente de AMPA (test LSD posthoc).

La figura 2 muestra el área (A, en mm2) de lesión hipocampal de la CA1 inducida por la microinyección estereotáxica de PBS (sham, S), glibenclamida (Glib), AMPA, o AMPA+glibenclamida (AMPA+Glib). Un asterisco significa p<0,01 diferente de sham, y el símbolo # significa p<0,01 diferente de AMPA (test LSD post-hoc).

EJEMPLOS:

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la glibenclamida potencia la reacción microglial y evita el daño excitotóxico hipocampal en rata inducido por AMPA. Se proporciona el ejemplo que demuestra tal efecto:

Este modelo se basa en la sobreactivación estereotáxica aguda de los receptores hipocampales del glutamato en rata que

resulta en un proceso neurodegenerativo caracterizado por una muerte neuronal con reacciones astrogliales y microgliales (cfr.

F. Bernal et al., Hippocampus 2000, vol. 10, págs. 296-304; F. Bernal et al., Exp. Neurol. 2000, vol. 161 , págs. 686-95). En este modelo neurodegenerativo las ratas se anestesiaron con equitesina (una mezcla de hidrato de cloral y pentobarbitona sódica; 0,3 ml/100 g de peso corporal, i.p.) y se colocaron en un aparato estereotáxico Kopf con la barra de los incisivos a 3,3 mm. Las inyecciones intracerebrales dirigidas al hipocampo dorsal se realizaron a 3,3 mm de caudal a bregma, 2,2 mm lateral y 2,9 mm ventral desde la duramadre (cfr. G. Paxinos et al., "The rat brain in stereotaxic coordinates", Sydney: Academic Press 1986). Un volumen de 0,5 μl se inyectó en un periodo de 5 min.

Cuatro grupos diferentes de ratas recibieron dos inyecciones en un intervalo de 2 horas como sigue: a) las ratas sham (n = 4) recibieron dos inyecciones de PBS; b) las ratas AMPA (n = 4) recibieron la primera inyección de 5,4 mM de AMPA y la segunda de PBS; c) las ratas glibenclamida (n = 4) recibieron dos inyecciones de 20 μM de glibenclamida; d) las ratas AMPA+glibenclamida (n = 4) recibieron 5,4 mM de AMPA + 20 μM de glibenclamida en la primera inyección y 20 μM de glibenclamida en la segunda inyección. Todas las ratas fueron sacrificadas 24 horas después de la lesión.

Las ratas fueron perfundidas transcardialmente con 300 ml de tampón fosfato 0,1 M (TF, pH 7,4) seguido de 300 ml de fijador enfriado en hielo (tasa de flujo 20 ml/min). El fijador consistía en paraformaldehído al 4% (p/v) en TF. Los cerebros fueron extraídos, crioprotegidos con sacarosa al 15% (p/v) en TF y después, congelados con hielo seco. Se obtuvieron secciones de criostato (12 μm) a nivel del hipocampo dorsal (-3,3 mm a bregma). Se realizó la histoquímica de la isolectina B4 (IB4) para identificar la reacción microglial (cfr. CA. Colton et al.,

J. Histochem. Cvtochem. 1992, vol. 40, págs. 505-12). La morfología hipocampal fue estudiada en secciones teñidas con

violeta de cresilo. El área de lesión y la evaluación de la microgliosis se realizaron en secciones teñidas con violeta de cresilo y positivas a la IB4 respectivamente. Estos parámetros fueron analizados utilizando un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador (OPTIMAS®, BioScan Inc., Washington, EE. UU.). Los microcitos reactivos teñidos con IB4 fueron contados a una magnificación x100 utilizando una rejilla ocular montada en un microscopio de luz de transmisión (Axiolab, Zeiss, Göttingen, Alemania). La ANOVA de un factor fue usada para comparar las diferencias entre grupos, seguida por el test LSD post-hoc. Los resultados fueron expresados como media ± el error estándar de la media (SEM). Todos los análisis fueron realizados con el programa de ordenador STATGRAPHICS (STSC Inc., Rockville, MD, EE. UU.).

La reacción microglial encontrada en los grupos sham y glibenclamida fue similar, alcanzando una área de 0,17 ± 0,04 mm2 y 0,16 ± 0,03 mm2 respectivamente. En las ratas AMPA, se evidenció una fuerte microgliosis con los microcitos ameboides extendidos a través de un área de 0,44 ± 0,07 mm2. En el grupo AMPA+Glib esta área de microgliosis se incrementó hasta un área de 1,04 + 0,11 mm2 (236% del grupo AMPA) (resultado del test ANOVA de un factor: F3,12 = 31,81; p = 0,0001 ) (cfr. figura 1 ).

En los cuatro grupos la densidad de los microcitos reactivos encontrada fue similar: 504 ± 82 células/mm2 para el sham, 614 ± 91 células/mm2 para el glibenclamida, 645 ± 59 células/mm2 para el AMPA y 568 ± 56 células/mm2 para el AMPA+Glib. Como se ilustra en la figura 2 con la cuantificación de la capa piramidal CA1, rica en células neuronales, en este último grupo, el aumento del 236% de la reacción microglial estaba asociado con una ausencia de una lesión hipocampal significativa. En esta capa, los 0,130 ± 0,015 mm2 de lesión observados en las ratas AMPA disminuyeron hasta 0,015 ± 0,0016 mm2 en el grupo AMPA+Glib, similar a las áreas de 0,009 ± 0,0015 mm2 y 0,012 + 0,0017 mm2 encontradas en los grupos sham y

glibenclamida respectivamente (resultado del test ANOVA de un factor: F3,11 = 52,14; p = 0,00001 ).

De estos resultados queda claro que la glibenclamida potencia la activación microglial y evita el daño excitotóxico hipocampal. Se observó una ausencia de lesión hipocampal en animales tratados con AMPA+glibenclamida en comparación con los animales tratados con AMPA.

Claims (4)

1.Un bloqueante del canal de KATP (KCC) modificado isotópicamente, para uso en el diagnóstico de daño agudo del SNC en un mamífero, incluido un humano, en el que el daño ha

5 sido causado por una lesión del SNC.

2.Un bloqueante del canal de KATP modificado isotópicamente para uso según la reivindicación 1, en el que el bloqueante del canal de KATP es una sulfonilurea.

3.Un bloqueante del canal de KATP modificado isotópicamente para

10 uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el bloqueante del canal de KATP (KCC) modificado isotópicamente está marcado con 11C, 13C, 17F, 31P, 1H o 17O.

4.Un bloqueante del canal de KATP modificado isotópicamente para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el

15 que la lesión del SNC se selecciona del grupo que consiste en lesión cerebral, lesión de la médula espinal, isquemia global, isquemia focal, hipoxia, ictus, convulsión, epilepsia, status epiléptico, enfermedad vascular del SNC, enfermedad neuroocular y trauma.

20 5.Un bloqueante del canal de KATP modificado isotópicamente para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el bloqueante del canal de KATP es glibenclamida.