ES2353008T3

ES2353008T3 - Métodos y composiciones para inducir apoptosis en células de cáncer.

Info

Publication number: ES2353008T3
Application number: ES03812460T
Authority: ES
Inventors: Quinn L. Deveraux; Deborah A. Knee; Garret M. Hampton; Klaus Wagner; Pedro Aza-Blanc; Marc Nasoff
Original assignee: IRM LLC
Current assignee: IRM LLC
Priority date: 2002-11-27
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2011-02-24
Anticipated expiration: 2023-11-25
Also published as: CN1750843B; CN1750843A; ZA200504103B

Abstract

Un método ex vivo para inducir apoptosis en una célula de cáncer, el método comprende poner en contacto la célula con: i. un anticuerpo del Receptor 5 (DR5) anti-muerte; y ii. un agente que induce apoptosis, en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en SEQ ID NO: 8.

Description

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS

La actual solicitud reivindica el beneficio de las siguientes cuatro Solicitudes de Patente Provisionales Estadounidenses: 60/504,901, presentada en Septiembre 22, 2003; 60/494,714, presentada en Agosto 12, 2003; 60/448,960, presentada en Febrero 21, 2003; y 60/429,842, presentada en Noviembre 27, 2002.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

La apoptosis es un programa de células suicidas altamente conservadas esencial para el desarrollo y la homeostasis de tejido de todos los organismos metazoarios. Los cambios en la ruta apoptótica que evitan o retrasan la renovación celular normal pueden ser tan importantes en la patogenia de enfermedades como lo son las anormalidades en la regulación del ciclo celular. Al igual que la división celular, que se controla a través de las interacciones complejas entre las proteínas reguladoras del ciclo celular, la apoptosis se regula de forma similar bajo circunstancias normales mediante la interacción de productos de genes que evitan o inducen la muerte celular.

El ligando que induce apoptosis relacionada con TNF (TRAIL, también denominado como Apo2L) es un miembro de la familia de la citoquina TNF. Luego de la unión a DR4 o DR5, dos miembros de la superfamilia del receptor TNF, TRAIL induce la muerte celular mediante apoptosis. Ver, por ejemplo, Pan et al., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, et al., Science 277:818-21 3 (1997); Walczak et al, EMBO J. 16:5386-97 4 (1997). In vitro, se ha mostrado que el TRAIL mata células de tumor, pero es relativamente no tóxico para las células normales. La WO 01/83560 describe un anticuerpo anti-DRY y su uso en la inhibición de la proliferación celular.

Se necesitan terapias adicionales para tratar el cáncer. La presente invención supera estos y otros problemas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para inducir apoptosis en una célula de cáncer. En algunas realizaciones, el método ex vivo comprende el poner en contacto la célula con (i.) un anticuerpo anti-DR5; y (ii.) un agente que induce apoptosis, en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:8).

En algunas realizaciones, el agonista es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el agonista es un anticuerpo de cadena sencilla.

En algunas realizaciones, el agente evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcR10. En algunas realizaciones, el agente evita la activación de NFκB. En algunas realizaciones, el agente evita la degradación de IκB. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor proteasoma. En algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma se selecciona del grupo que consiste de PS-341, MG-262 y MG-132.

En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis (IAP). En algunas realizaciones, el inhibidor es SMAC o un imitador de SMAC.

En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de plexin B1 (PLXNB1), proteína 7 que contiene el dominio SET (SET7), quinasa de quinasa de quinasa 5 de la proteína activada por mitógeno (MAP3K5), quinasa similar a STE20 (JIK), quinasa treonina 1/serina que interactúa con la quinasa MAP (MKNK1), proteína de transmembrana multiespan de retículo endoplásmico putativo (RFT1), 5-quinasa, tipo I, gama (PIP5K1C), proteína quinasa 2 activada por proteína quinasa activada por mitógeno (MAPKAPK2), proteína quinasa de quinasa 5 activada por mitógeno (MAP2K5), quinasa 6 dependiente de ciclina (CDK6), receptor activina A tipo II similar a I (ACVRL1), homólogo de oncogén (v-fgr) de sarcoma viral de felino Gardner-Rasheed (FGR), proteína hipotética FLJ21802 (FLJ21802), quinasa tirosina del receptor musculo esquelético (MUSK), cromosoma 20 abierto al cuadro de lectura 88 (C20orf88), gemación no inhibida por benzimidazoles 1 (homólogo de levadura) (BUB1), proteína quinasa S6 ribosómica, 90kD, polipéptido 5 (RPS6KA5), homólogo de oncogén relacionado con sarcoma viral v-yes-1 Yamaguchi (LYN), proteína quinasa 7 activada por mitógeno (MAPK7), y homólogo 1 de oncogén vírico timoma de murino v-akt (AKT1).

En algunas realizaciones, el agente es un activador de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de partícula de reconocimiento de señal 72kD (SRP72), Quinasa tirosina linfoide B, Bid, Caspasa-8 (BLK), producto de gen similar a Quinasa Piruvato, isozima M2 (EOC148283), quinasa alfa 3 de glucógeno sintasa (GSK3A), proteína hipotética FLJ32312 (FLJ32312), proteína quinasa 10 activada por mitógeno (MAPK10), TCF4: factor de transcripción 4, homólogo 2 de oncogén vírico de leucemia de murino v-abl Abelson (arg, gen relacionado con Abelson) (ABL2), homólogo 1 de oncogén de virus de sarcoma UR2 aviar v-ros (ROS1) y homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis aviar v-myc.

En algunas realizaciones, la célula de cáncer es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático.

En algunas realizaciones, el agente es un antagonista de PAK1. En algunas realizaciones, el agente es un antagonista de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 y JIK. En algunas realizaciones, el agente es una molécula siARN.

La presente invención también proporciona la reivindicación 10.

En algunas realizaciones, el agente evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10. En algunas realizaciones, el agente evita la activación de NFκB. En algunas realizaciones, el agente evita la degradación de IκB. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor proteasoma. En algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma se selecciona del grupo que consiste de PS-341, MG-262 y MG-132.

En algunas realizaciones, la célula de cáncer es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático. En algunas realizaciones, el agente es un antagonista de PAK1. En algunas realizaciones, el agente es un antagonista de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de UbcH10, nsurf, stk12, Ask1 y JIK. En algunas realizaciones, el agente es una molécula siARN.

La presente invención también proporciona una composición fisiológica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (i.) un anticuerpo anti-DR5; y (ii.) un agente que induce apoptosis en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 SEQ ID NO:6 y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 SEQ ID NO:8.

En algunas realizaciones, el agonista es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el agonista es un anticuerpo de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el agente evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10. En algunas realizaciones, el agente evita la activación de NFκB. En algunas realizaciones, el agente evita la degradación de IκB. En algunas realizaciones, el agente es un inhibidor proteasoma. En algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma se selecciona del grupo que consiste de PS-341, MG-262 y MG-132.

También se describen aquí anticuerpos con la especificidad de unión de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:8). En algunas realizaciones, los anticuerpos comprenden una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia exhibida en (SEQ ID NO:8) Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:8).

La presente invención también proporciona células que expresan un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:8).

La presente invención también proporciona métodos ex vivo para inducir apoptosis en una célula de cáncer que comprende poner en contacto la célula con anticuerpos anti-PR5 con la especificidad de unión de un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 SEQ ID NO:8. En algunas realizaciones, el anticuerpo antiDR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y una región variable de cadena liviana como la presentada en la Figura 35 (SEQ ID NO:8).

DEFINICIONES

"Anticuerpo" se refiere a un polipéptido que comprende una región de estructura de un gen inmunoglobulina o sus fragmentos que une específicamente y reconoce un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kapa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon, y mu, así como también los genes de región variable de inmunoglobulina miriada. Las cadenas livianas se clasifican como kapa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gama, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente.

Las inmunoglobulinas de ocurrencia natural tienen una estructura de núcleo común en la que dos cadenas livianas idénticas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas idénticas (aproximadamente 55 o 70 kD) forman un tetrámero. La porción amino-terminal de cada cadena se conoce como la región variable (V) y se puede distinguir de las regiones constantes más conservadas

(C) del resto de cada cadena. Dentro de la región variable de la cadena liviana es una porción de terminal C conocida como la región J. Dentro de la región variable de la cadena pesada, existe una región D en adición a la región J. La mayor parte de la variación de la secuencia de aminoácido en las inmunoglobulinas se confina en tres ubicaciones separadas en las regiones V conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de complementariedad (CDR) que se involucran directamente en la unión a antígeno. Procediendo desde el terminal amino, estas regiones se designan CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente. Los CDR se mantienen en su lugar por las regiones de estructura más conservada (FR). Procediendo desde el terminal amino, estas regiones se designan FR1, FR2, FR3, y FR4, respectivamente. Las ubicaciones de las regiones CDR y FR y un sistema de numeración se ha definido por, por ejemplo, Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)).

Una unidad estructural de inmunoglobulina de ejemplo (anticuerpo) comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de las cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). El terminal N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables del reconocimiento de antígeno. Los términos cadena liviana variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas liviana y pesada respectivamente.

Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Así, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de los enlaces disulfuro en la región articulada para producir F(ab)’2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena liviana unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F (ab)’2 se puede reducir bajo condiciones moderadas para romper el enlace de disulfuro en la región articulada, convirtiendo por lo tanto el dímero F (ab)’2 en un monómero Fab’. El monómero Fab’ es esencialmente Fab con parte de la región articulada (ver FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3d ed. 1993). Aunque se definen varios fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de nuevo químicamente o al utilizar metodología de ADN recombinante. Así, el término anticuerpo, tal como se utiliza aquí, también incluye fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos completos, o aquellos sintetizados de nuevo utilizando metodologías de ADN recombinantes (por ejemplo, Fv de cadena único) o aquellos identificados utilizando colecciones de exhibición de fago (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, se puede utilizar cualquier técnica conocida en el arte (ver, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Anticuerpos "monoclonales" se refiere a anticuerpos derivados de un clon único. Las técnicas para la producción de los anticuerpos de cadena única (Pat. Estadounidense No. 4,946,778) se puede adaptar para producir anticuerpos para los polipéptidos de esta invención. También, los ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, se pueden utilizar para expresar anticuerpos humanizados. Alternativamente, se puede utilizar tecnología de exhibición de fago para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente para seleccionar antígenos (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en la que (a) la región constante, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia con el fin de que el sitio de unión a antígeno (región variable) se une a una región constante de una clase diferente o alterada, la función efectora y/o especie, o una molécula completamente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.;

o (b) la región variable, o una porción de la misma, se altera, reemplaza o intercambia con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retiene la reactividad de un anticuerpo no humano mientras es menos inmunogénico en humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, al retener las regiones CDR no humanas y reemplazar las partes restantes del anticuerpo con sus contrapartes humanas. Ver, por ejemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994).

La frase "une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo o "específicamente (o selectivamente) inmunoreactivo con," cuando se refiere a una proteína o péptido, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros biológicos. Así, bajo condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos específicos se unen a una proteína particular por lo menos dos veces al anterior y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a un anticuerpo bajo tales condiciones puede requerir que un anticuerpo se seleccione para su especificidad de una proteína particular. Esta selección se puede lograr al sustraer anticuerpos que reaccionan de manera cruzada con, por ejemplo, moléculas DR5 de otras especies. Una variedad de formatos de inmunodetección se pueden utilizar para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, inmunoensayos ELISA de fase sólida se utilizan rutinariamente para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína (ver, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), para una descripción de formatos de inmunoensayo y condiciones que se pueden utilizar para determinar inmunoreactividad específica). Típicamente una reacción específica o selectiva será por lo menos dos veces la señal anterior o ruidosa y más típicamente más de 10 a 100 veces el anterior.

Los términos "péptido-imitador" e "imitador" se refiere a un compuesto químico sintético que tiene sustancialmente las mismas características funcionales y estructurales de un polipéptido de ocurrencia natural y no natural (por ejemplo, SMAC). Se utilizan comúnmente análogos de péptido en la industria farmacéutica como fármacos no péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos no péptido se denominan "imitadores de péptido" o "péptidoimitadores" (Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987), que se incorporan aquí como referencia). Los imitadores de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto profiláctico o equivalente o terapéutico mejorado. Generalmente, los péptidoimitadores son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica), tal como el encontrado en un polipéptido de interés, pero que tiene uno o más ligados de péptido opcionalmente reemplazados por un ligado seleccionado del grupo que consiste de, por ejemplo, -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis y trans), COCH2-, -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-. El imitador se puede componer completamente de análogos sintéticos, no naturales de aminoácidos, o, es una molécula quimérica de aminoácidos de péptido parcialmente natural y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. El imitador también puede incorporar cualquier cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácido natural tanto como tales sustituciones que tampoco alteran sustancialmente la estructura y/o actividad imitadora. Por ejemplo, una composición imitadora está dentro del alcance de la invención si esta es capaz de llevar a cabo por lo menos una unión o actividad enzimática de un polipéptido de interés.

"siARN" se refiere a ARNs de interferencia pequeña, que son capaces de provocar interferencia y pueden originar silenciamiento post-transcripcional de genes específicos en las células, por ejemplo, células de mamífero (que incluyen células humanas) y en el cuerpo, por ejemplo, cuerpos de mamífero (incluyendo humanos). El fenómeno de interferencia de ARN se describe y se discute en Bass, Nature 411: 428-29 (2001); Elbahir et al., Nature 411: 494-98 (2001); y Fire et al., Nature 391: 806-11 (1998); y WO01/75164, en donde también se discuten métodos para elaborar ARN de interferencia. Los siARN basados en las secuencias y ácidos nucleicos que codifican el producto de gen descrito aquí tiene típicamente un poco de 100 pares base y puede ser, por ejemplo, aproximadamente 30 bps o menos, y se puede hacer mediante los métodos conocidos en la técnica, que incluye el uso de cepas de ADN complementarias o métodos sintéticos. Los siARN son capaces de originar interferencia y pueden originar silenciamiento post-transcripcional de genes específicos en las células, por ejemplo, células de mamífero (que incluye células de humano) y en el cuerpo, por ejemplo; cuerpos de mamífero (que incluye humanos). Los siARN de ejemplo de acuerdo con la invención pueden tener hasta 29 bps, 25 bps, 22 bps, 21 bps, 20 bps, 15 bps, 10 bps, 5 bps o cualquier entero cerca a este o entre estos. Las herramientas para diseñar siARN inhibidores óptimos incluyen aquellos disponibles de DNAengine Inc. (Seattle, WA) y Ambion, Inc. (Austin, TX).

Una técnica de ARNi emplea construcciones genéticas dentro de las cuales se colocan las secuencias codificantes y anticodificantes en regiones que flanquean una secuencia de intrón en orientación de división apropiada con sitios de división donantes y aceptores. Alternativamente, las secuencias espaciadoras de varias longitudes se pueden emplear para separar regiones de auto complementariedad de secuencia en la construcción. Durante el procesamiento del transcripto de construcción de gen, se dividen las secuencias de intrón, permitiendo las secuencias codificante y anticodificante, así como también secuencias corte y empalme, para unir ARN bicatenario formado. Las ribonucleasas seleccionadas luego unen y dividen el ARN bicatenario, iniciando por lo tanto la cascada de eventos que conducen a la degradación de secuencias de gen de mARN específicas, y genes específicos de silenciamiento.

"Ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y sus polímeros en forma mono o bicatenaria. El término abarca ácido nucleicos que contienen análogos de nucleótido conocidos o residuos o ligados de estructura modificada, que son sintéticos, de ocurrencia natural, y de ocurrencia no natural, que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan en una forma similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, péptido-ácidos nucleicos (PNA).

A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente sus variantes conservativamente modificadas (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias, así como también la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, se pueden lograr sustituciones de codón degeneradas al generar secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (todos los codones) se sustituye con residuos deoxiinosina y/o con base mezclada (Batzer et al., Nucleic acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). El término "ácido nucleico" abarca los términos gen, cADN, mARN, oligonucleótido, y polinucleótido.

Los términos "polipéptido," "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácido. Los términos aplican a los polímeros de aminoácido en los que uno o más residuos de aminoácido es un imitador químico artificial de un aminoácido de ocurrencia natural correspondiente, así como también con polímeros de aminoácido de ocurrencia natural y polímero de aminoácido de ocurrencia no natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos sintéticos y de ocurrencia natural, así como también análogos de aminoácido e imitadores de aminoácido que funcionan en una forma similar a los aminoácidos de ocurrencia natural. Los aminoácidos de ocurrencia natural son aquellos codificados por el código genético, así como también aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido de ocurrencia natural, es decir, un alfa. El carbono que se vincula a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero retienen la misma estructura química básica como un aminoácido de ocurrencia natural. Los imitadores de aminoácido se refieren a compuestos químicos tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una forma similar a un aminoácido de ocurrencia natural.

Las "variantes conservativamente modificadas" aplican a las secuencias de aminoácido y ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellos ácido nucleicos que codifican secuencias de aminoácido idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácido, en secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Así, en cada posición en donde se especifica una alanina mediante un codón, el codón se puede alterar en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones de silenciamiento," que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido también describe cada variación de silenciamiento posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente solo el codón para metionina, y TGG, que es ordinariamente solo el codón para triptofan) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con lo anterior, cada variación de silenciamiento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como secuencias de aminoácido, un experto reconocerá que sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína que altera, agrega o eliminar un único aminoácido o un porcentaje pequeño de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" en donde la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Tales variantes conservativamente modificadas están en adición a y no excluyen variante polimórficas, homólogos interespecie, y alelos de la invención.

Los siguientes ocho grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservadoras para cada uno:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofan (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) cuando se compara con la secuencia de referencia (por ejemplo, un polipéptido de la invención), que no comprende adiciones o eliminaciones, para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las que el residuo de ácido nucleico base o aminoácido idéntico ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad," en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas secuencias. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos específicos que son los mismos (es decir, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad sobre una región específica, o, cuando no es específica, sobre la secuencia completa), cuando se compara y se alinea para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región diseñada cuando se mide utilizan uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o mediante alineación manual e inspección visual. La invención proporciona polipéptidos o polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente, ejemplificados aquí (por ejemplo, los CDR ejemplificados en las Figuras 23-25). Opcionalmente, existe identidad sobre una región que tiene por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos en longitud, o más, preferiblemente sobre una región que tiene 100 a 500 o 1000 o más nucleótidos en longitud.

Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, en la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de referencia y prueba se ingresan a un computador, se diseñan subsecuencias coordinadas, si es necesario, y se diseñan los parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Se pueden utilizar parámetros de programa predeterminados, o se pueden diseñar parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencia luego calcula las identidades del porcentaje de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia, con base en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se utiliza aquí, incluye referencia a un segmento de uno cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en la que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineación de las secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, mediante la búsqueda del método similar de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403410, respectivamente. El software para desarrollar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencia de alta clasificación de identificación (HSP) al identificar palabras de longitud corta de la secuencia de consulta, que coincide o satisface alguna clasificación T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere a un umbral de clasificación de palabra en la vecindad (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra inicial vecina actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en lo que respecta a cómo se puede incrementar la clasificación de alineación acumulada. Se calculan las puntuaciones acumuladas utilizando, para las secuencias de nucleótido, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalidad para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácido, se utiliza una matriz de clasificación para calcular la clasificación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la clasificación de alineación acumulada cae por la cantidad X desde su valor máximo alcanzado; la clasificación acumulada va de cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de clasificación negativa; o se alcanza el final de la secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótido) se utiliza como predeterminado para una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cepas. Para las secuencias de aminoácido, el programa BLASTP se utiliza como predeterminado para una longitud de palabra 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de clasificación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA89:10915) alineaciones (B) de 50, extativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cepas.

El algoritmo BLAST también desarrolla un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Una medición de la similitud mediante el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad en la que una coincidencia entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácido podría ocurrir por cambio. Por ejemplo, se considera un ácido nucleico similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menos de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menos de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menos de aproximadamente 0.001.

Una indicación que dos secuencias de ácido nucleico o los polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se reticula inmunológicamente con los anticuerpos elevados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe adelante. Así, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservadoras. Otra indicación que las dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan uno con el otro bajo condiciones exigentes, como se describe adelante. Todavía otra indicación que las dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

El término "agonista de agente de afinidad" se refiere a un agente de afinidad (es decir, una molécula que une específicamente una molécula objetivo) capaz de activar un receptor para inducir una respuesta que media el receptor parcial o completo. Por ejemplo, un agonista de DR5 que une a DR5 e induce la señalización mediada por DR5. En algunas realizaciones, un agonista de agente de afinidad DR5 se puede identificar mediante su capacidad para unir a DR5 e inducir apoptosis cuando se pone en contacto con células Jurkat. Un "agonista de anticuerpo" se refiere a la situación en donde el agente de afinidad es un anticuerpo.

El término "agente que induce apoptosis" se refiere a un compuesto que induce o promueve apoptosis en por lo menos un tipo celular cuando se pone en contacto con el tipo celular. Los agentes que inducen apoptosis de ejemplo incluyen, por ejemplo, agonistas o imitadores de los siguientes: SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, o Bad; BH3, p53, ligando TRAIL, Fadd, Myc, y Mekk1, partícula de reconocimiento de señal 72kD (SRP72), Quinasa tirosina linfoide B, Bid, Caspasa-8 (BLK), producto de gen similar a Quinasa Piruvato, Isozima M2 (LOC148283),quinasa alfa 3 de glucógeno sintasa (GSK3A), proteína hipotética FLJ32312 (FLJ32312), proteína quinasa 10 activada por mitógeno (MAPK10), TCF4: factor de transcripción 4, homólogo 2 de oncogén vírico de leucemia de murino v-abl Abelson (arg, Gen relacionado con Abelson) (ABL2), homólogo 1 de oncogén de virus sarcoma UR2 aviar v-ros (ROS1) y homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis aviar v-myc., así como también antagonistas o inhibidores de los siguientes: 26S Inhibidor proteasomas, c-flip, ruta NFκB, miembros de la familia IAP (por ejemplo, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/Livin, survivin), miembros de la ruta proteasoma (por ejemplo, E1, E2 y E3); quinasas PI3, Akt1, 2, y 3, Rip, Nik; CD40; miembros de la familia Bcl2 (por ejemplo, Bcl2, Bc1-x1, A1, Mc11), conjugasa ubiquitina UbcH10, osteoprotegrina, plexina B1 (PLXNB1), proteína 7 que contiene el dominio SET (SET7), quinasa de quinasa de quinasa 5 de la proteína activada por mitógeno (MAP3K5), quinasa similar a STE20 (JIK), quinasa treonina/serina 1 que interactúa con la quinasa MAP (MKNK1), proteína de transmembrana multiespan de retículo endoplásmico putativo (RFT1), 5-quinasa, tipo I, gama (P1PSK1C), proteína quinasa 2 activada por proteína quinasa activada por mitógeno (MAPKAPK2), proteína quinasa de quinasa 5 activada por mitógeno (MAP2K5), quinasa 6 dependiente de ciclina (CDK6), receptor activina A tipo II similar a I (ACVRL1), homólogo de oncogén (v-fgr) de sarcoma viral de felino Gardner-Rasheed (FGR), proteína hipotética FLJ21802 (FLJ21802), quinasa tirosina del receptor músculo esquelético (MUSK), cromosoma 20 abierto al cuadro de lectura 88 (C20orf88), gemación no inhibida por benzimidazoles 1 (homólogo de levadura) (BUB1), proteína quinasa S6 ribosómica, 90kD, polipéptido 5 (RPS6KA5), homólogo de oncogén relacionado con sarcoma viral v-yes-1 Yamaguchi (LYN), quinasa 7 de proteína activada por mitógeno (MAPK7), y homólogo 1 de oncogén vírico timoma de murino v-akt (AKT1), PAK1 (que incluye, por ejemplo, cualquiera de los siguientes quinasa 1 activada por P21(CDKN1A), PAKA, P65-PAK, P68-PAK, alpha-PAK, MUK2, PAK1B (quinasa 1B activada por p21), quinasa 1 activada por P21/Cdc42/Rac1-(levadura relacionada con Ste20), efector Cdc42/Rac de quinasa PAK-A, quinasa de proteína MUK2), nsurf, stk12 (que incluye, por ejemplo, quinasa 12 serina/treonina, quinasa 2 relacionada con aurora, quinsa 2 similar a aurora/IPL1, AIK2, ARK2, AIM-1, y AIM1), quinasa 1 que regula la señal de apoptosis (Ask1), TLK1 (por ejemplo, No. de acceso NM_012290), NLK (por ejemplo, No. de acceso NM_016231), GRAF (por ejemplo, No. de acceso NM_015071), GCK (por ejemplo, No. de acceso NM_000162), ERK5 (por ejemplo, No. de acceso NM_002749), FGR (por ejemplo, No. de acceso NM_005248), ACVRL1 (por ejemplo, No. de acceso NM_ 000020), MEEK5 (por ejemplo, No. de acceso NM_002757), PIP5K1C (por ejemplo, No. de acceso XM_047620), MAPKAPK2 (por ejemplo, No. de acceso NM_004759), RFT1 (por ejemplo, No. de acceso NM_052859),MKNK1(por ejemplo, No. de acceso NM_003684),PLXNB1 (por ejemplo, No. de acceso NM_002673). Los agentes que inducen apoptosis de ejemplo adicionales incluyen, por ejemplo, agentes que mejoran la expresión y/o estabilidad de DR5, agentes que mejoran la actividad o estabilidad caspasa, y agentes que inducen o mejoran una respuesta al daño del ADN. Los agonistas o imitadores en la anterior lista incluyen los mismos productos de gen, por ejemplo, p53 es un agonista p53. El antagonista incluye agentes que inhiben directamente la actividad y agentes que inhiben indirectamente la actividad a través de la expresión o estabilidad reducida del mARN de molécula objetivo (por ejemplo, siARN) o proteína.

Un agente que "evita o reduce la expresión" de una proteína se refiere a compuestos que, por ejemplo, unen a, parcialmente o totalmente bloquean el estímulo, reducen, evitan, retrasan la expresión. La expresión de una proteína se puede reducir mediante por lo menos, por ejemplo, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, 95% o 100%.

"La activación de NFκB" se refiere a la inducción de ubicación nuclear de NFκB, ADN unido por NFκB o transcripción que resulta del ADN que se une por NFκB.

"Evita la degradación de IκB" se refiere a la degradación de IκB por la proteasoma, liberando por lo tanto NFκB para ingresar al núcleo celular.

Un "inhibidor proteasoma" se refiere a un agente que inhibe la ruta de proteasoma-ubiquitina, evitando por lo tanto la degradación de IκB y ubicación nuclear posterior de los socios de IkB, NFκB. La proteasoma incluye, por ejemplo, el complejo de proteasoma 26S.

Un "Inhibidor de proteína de apoptosis (IAP)" se refiere a un polipéptido de la familia de proteína que inhibe la actividad caspasa. Todos pero una de las proteínas IAP conocidas presentan una repetición de dos veces o tres veces de un motivo de secuencia característico, la Repetición Inhibidora Baculovirus (BIR; residuos ~70; la survivina es un IAP humano recientemente descubierto que contiene una región BIR). Esta región BIR contiene un número de residuos conservados, con la secuencia consensus: R-X(20-23)-G-X(11)-C-X(2)-C-X (16)-H-X(6)-C. Los IAP de ejemplo incluyen, por ejemplo, el cromosoma X ligado por el inhibidor de apoptosis (XIAP; número de acceso Genbank U32974), proteínas celulares IAP (c-IAP-1/HIAP-2/hMIHB y c-IAP-2/HIAP-1/hMIHC; Liston et al., Nature 379:349-353 (1996); Rothe et al., Célula 83:1243-1252 (1995)); la proteína inhibidora de apoptosis neuronal (NAIP; Roy et al., Célula 80:167-178 (1995)); y survivina (Ambrosini et al., Nature Med. 3:917-921 (1997)). Ver, por ejemplo, Solicitud de Patente Estadounidense No. 2002/0132786 y 2002/0009757 así como también Patente Estadounidense No. 6,187,557.

"SMAC" se refiere a un polipéptido mitocondrial, que se libera junto con el citocromo c de la mitocondria en respuesta al estímulo apoptótico. El SMAC promueve la activación caspasa al unir y neutralizar los IAP. Ver, por ejemplo, Du et al., Cell 102:33-42 (2000); Verhagen et al., Célula 102:43-53 (2000).

"Moduladores" se utilizan aquí por referirse a moléculas que inhiben o mejoran la actividad de la expresión de un producto de gen. "Antagonistas" o "inhibidores" son compuestos que, por ejemplo, inhiben la expresión de un producto de gen o se unen a, bloquean parcialmente o totalmente el estímulo, reducen, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan, o subregulan la actividad del producto de gen o que une o subregula un receptor al que se une el producto de gen. "Agonistas" o "activadores" son compuestos que, por ejemplo, inducen o activan la expresión de un producto de gen o se unen a, estimulan, incrementan, abren, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o sobreregulan la actividad del producto de gen o que se unen o sobreregulan un receptor al que se une el producto de gen. Los agonistas o antagonistas pueden incluir, por ejemplo, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas (por ejemplo, menos de 1500 Daltons), versiones genéticamente modificadas de los mismos productos de gen, etc. Los antagonistas incluyen, por ejemplo, moléculas siARN para reducir la expresión de un transcripto que codifica un producto de gen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 exhibe apoptosis inducida por TRAIL en células Jurkat.

La Figura 2 exhibe especificidad de los anticuerpos funcionales DR5.

La Figura 3 exhibe el efecto de tres diferentes agonistas de anticuerpo DR5 en células Jurkat.

La Figura 4 ilustra la actividad Caspasa-3 en células Jurkat tratadas.

La Figura 5 ilustra el efecto de anticuerpos funcionales DR4/DR5 en estirpes celulares de cáncer de colon y melanoma.

La Figura 6 ilustra el efecto de anticuerpos funcionales DR4/DR5 en estirpes celulares de cáncer de mama.

La Figura 7 ilustra la respuesta de dosis de un agonista de anticuerpo DR5 en células normales y de tumor.

La Figura 8 ilustra el agonista de anticuerpo DR5 "A" con respecto a la activación de Caspasa-3.

La Figura 9 ilustra el agonista de anticuerpo DR5 afecta el volumen de tumor 205 en el colon.

La Figura 10 ilustra la respuesta de dosis anti-DR5 en un modelo subcutáneo COLO205.

La Figura 11 ilustra la actividad tumoricida de anticuerpos monoclonales DRS in vivo.

La Figura 12 ilustra rutas para la activación y apoptosis de Caspasa.

La Figura 13 ilustra la apoptosis inducida por anti-DR4 o anti-DR5 en células A2058 en la presencia de un imitador SMAC.

La Figura 14 ilustra el efecto del imitador SMAC en células normales y de tumor.

La Figura 15 ilustra un estudio Pk y PD del imitador SMAC.

La Figura 16 ilustra la ruta NFκB y su relación con la proteasoma.

La Figura 17 ilustra que el inhibidor proteasoma MG132 que mejora la apoptosis inducida por el anticuerpo DR5.

La Figura 18 ilustra varias proteasomas inhibidoras.

La Figura 19 ilustra el efecto inhibidor de proteasomas en A2058.

La Figura 20 ilustra el efecto inhibidor de proteasomas en una estirpe celular de hepatocarcinoma.

La Figura 21 ilustra el efecto inhibidor de proteasomas en células mamarias normales.

La Figura 22 ilustra la expresión de anticuerpos DR5 quiméricos de ratón-humanos.

La Figura 23 ilustra las secuencias de nucleótido para las regiones variables pesada y liviana del anticuerpo A.

La Figura 24 ilustra la región variable de cadena pesada para el anticuerpo anti-DR5.

La Figura 25 ilustra la región variable de cadena liviana para el anticuerpo anti-DR5.

La Figura 26 ilustra una metodología de detección para identificar los productos de gen que median la apoptosis que induce TRAIL al introducir siARN para la expresión de gen específica transgénica en un ensayo basado en célula.

La Figura 27 también ilustra una metodología de detección para identificar los productos de gen que median la apoptosis inducida por TRAIL al introducir siARN para la expresión específica de gen transgénica en un ensayo con base en célula.

La Figura 28 proporciona a lista de aciertos identificados en la detección de siARN descrita anteriormente. "Relación" se refiere a la relación de células viables (es decir, no apoptóticas) luego de la adición de TRAIL comparado con la ausencia de TRAIL. Las relaciones inferiores (menores de 50) indican que los productos de gen interfieren con la apoptosis. Las relaciones mayores (mayores de 50) indican los productos de gen que contribuyen a la apoptosis.

La Figura 29 ilustra datos siARN para Gsk3α y Gsk3β. La parte superior de la Figura ilustra que los siARN son específicos para Gsk3α o Gsk3β. El fondo de la gráfica de barras de la Figura ilustra la actividad Caspasa luego de la introducción de un siARN en la presencia o ausencia de TRAIL.

La Figura 30 ilustra una red reguladora para apoptosis inducida por TRAIL. De nota particular, el myc es pro-apoptótico. Por lo tanto, la inhibición de myc inhibe la apoptosis inducida por TRAIL y la activación de myc que activa sinérgicamente la apoptosis inducida por TRAIL o antiDR4 o anti-DR5.

La Figura 31 muestra efectos aditivos de siUbcH10 para agentes antineoplásico citotóxicos en células de tumor asesinas. La Figura también muestra que el pretratamiento de las células de tumor con siUbcH10 incrementa significativamente la apoptosis inducida por los anticuerpos anti-DR5.

La Figura 32 muestra regulación por disminución UbcH10 con siUbcH10 que sensibiliza las células de tumor con muerte celular mediada por TRAIL/DR5.

La Figura 33 ilustra la sensibilización de células HCT116 o Bax-para combinar por lo tanto el ligando TRAIL con las proteosomas inhibidoras 26S MG-132, MG-262, o Lactacistina (LC).

La Figura 34 ilustra el efecto del inhibidor proteasoma MG-262 en la expresión de varias proteínas de ruta de apoptosis mitocondrial.

La Figura 35 ilustra las secuencias para la región variable de cadena pesada y cadena liviana para el anticuerpo A, SEQ ID NO: 5, 6, 7 y 8.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Introducción

La presente invención demuestra el resultado sorprendente para administrar agonistas de anticuerpo anti-DR5 con un agente que induce apoptosis que induce apoptosis en células de cáncer en una forma sinérgica. Así las células de cáncer que son resistentes para tratamiento mediante uno de estos componentes solo se matarán cuando se pone en contacto con un anticuerpo agonista anti-DR5 y un segundo agente que induce apoptosis. Adicionalmente, de aquellas células que irían a través de apoptosis luego de poner en contacto con uno de los componentes mencionados anteriormente, poner en contacto con el anticuerpo agonista anti-DR5 y una proteína que induce apoptosis conducirá a la inducción más rápida de apoptosis.

La presente invención también proporciona anticuerpos de agonista DR5 de alta potencia.

II. anticuerpos anti-DR4 o DR5

1. Introducción

Se puede utilizar cualquier anticuerpo anti-DR5 de acuerdo con los métodos de la invención. DR4 (también denominado como Receptor de Muerte 4) y DR5 (también denominado como Receptor de Muerte 5) son dos receptores del ligando TRAIL. Ver, por ejemplo, Pan et al., Science 277:815-8 (1997); Sheridan, et al., Science 277:818-213 (1997); Walczak et al, EMBO J. 16:5386-97 4 (1997). Se han descrito previamente anticuerpos anti-DR5 en, por ejemplo, PCTWO01/83560 (anticuerpo TRA-8; ATCC PTA-1428) y PCT WO 02/079377. Adicionalmente, se describen aquí agonistas de anticuerpo anti-DR5. Las regiones variables de las cadenas liviana y pesada de un agonista de anticuerpo anti-DR5 de ejemplo se proporcionan en las Figuras 23-25. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-DR5 competen con el anticuerpo ejemplificado para unión a DR5. En algunas realizaciones, los agonistas de anticuerpo DR5 tienen CDR que son sustancialmente similares a los CDR ejemplificados en las Figuras 24, 25 o ambos.

Se puede utilizar cualquier tipo de agonista de anticuerpo de acuerdo con los métodos de la invención. Generalmente, los anticuerpos utilizados son anticuerpos monoclonales. Se pueden generar anticuerpos monoclonales mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, utilizando hibridomas, expresión recombinante y/o exhibición de fago).

No es necesario reticular los anticuerpos de la invención o de otra forma tratar antes de administración. Sin embargo, en algunas realizaciones, se reticulan los anticuerpos de la invención. La reticulación (por ejemplo, utilizando reticuladores químicos hetero-u homobifuncionales) es bien conocida en la técnica. Alternativamente, se pueden administrar Fabs multivalente estables (por ejemplo, trímeros o tetrámeros, etc.). Ver, por ejemplo, PCT WO 99/27964.

Se pueden hacer anticuerpos anti-DR5 alternativos que tiene la especificidad de un anticuerpo que comprende las secuencias de región variable de cadena liviana y pesada exhibidas en la Figuras 24 y 25.

En numerosas realizaciones, los anticuerpos anti-DR5 de la invención no unen a otros polipéptidos. En algunas realizaciones, los anticuerpos ant-DR5 no unen ningún otro receptor en la familia del receptor TNF (por ejemplo, TNFR2, TNFR3, OX40, CD40, FAS, DcR3, CD27, CD30, CD137, DR4, DcR1, DcR2, RANK, OPG, DR3, TR2, NGFR, TNFR1, y TAC1). En algunas realizaciones, los anticuerpos ant-DR5 no unen a DR4, DTR1, DTR2 o OPG.

Los anticuerpos anti-DR5 de la invención pueden ser extremadamente potentes. Por ejemplo, en algunas realizaciones, en un ensayo de ablación de tumor subcutáneo estándar, los anticuerpos de la invención pueden reducir el tamaño de tumor mediante 50% en una concentración de 1 o menos mg/kg de peso corporal (y en algunas realizaciones, 0.50 mg/kg, 0.05 mg/kg, o 0.01 mg/kg o menos) cuando se administra a un animal 3 veces una semana durante dos semanas y ablación de tumores completamente cuando se utiliza diez veces esa cantidad.

En algunos casos, los anticuerpos anti-DR5 de la invención se diseñan por carecer o tener una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo reducida (ADCC). Por ejemplo, en algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región Fc IgG-1, IgG-2, IgG-2A, IgG 3

o IgG-4.

Se puede utilizar un número de diferentes andamios moleculares sintéticos para exhibir las secuencias variables de cadena liviana y pesada exhibidas en la Figuras 24 y 25. Una publicación que describe el uso del dominio de fibronectina tipo III (FN3) como un andamio molecular específico el cual presenta péptidos que incluyen CDRS es Koide, A. et al. J. Mol. Biol 284:1141-1151 (1988). Otras alternativas de andamios incluyen, por ejemplo, "minianticuerpos" (Pessi, A. et al., Nature 362:367-369 (1993)), tendamistat (McConnell, S. J. y Hoess, R H. J. Mol. Biol. 250:460-470 (1995)), y dominio VH "camelizado" (Davies J. y Riechmann, L. BiolTechnology 13:475-479 (1995)). Otros andamios que no se basan en la inmunoglobulina como la estructura de andamiaje se revisan en Nygren, P. A. y Uhlen, M. Curr. Opin. Struct. Biol. 7:463-469 (1997). La Patente Estadounidense No. 6,153,380 describe andamios adicionales. El término "agentes de afinidad" abarca moléculas que comprenden andamios moleculares sintéticos tal como aquellos descritos anteriormente por exhibe dominios de unión con una especificidad de unión para DR5, que incluye las especificidades descritas para los anticuerpos descritos aquí.

2. Anticuerpos Humanizados

En algunas realizaciones, el anticuerpo utilizado de acuerdo con la presente invención es un anticuerpo quimérico (por ejemplo, ratón/humano) hecho de regiones de un agonista anti-DR5 de anticuerpo no humano junto con regiones de anticuerpos humanos. Por ejemplo, una cadena H quimérica puede comprender la región de unión a antígeno de la región variable de cadena pesada (por ejemplo, la secuencia presentada en la Figura 24 o la Figura 35) del anticuerpo no humano ligado a por lo menos una porción de una región constante de cadena pesada humana. Esta cadena pesada quimérica o humanizada se puede combinar con una cadena quimérica L que comprende la región de unión a antígeno de la región variable de cadena liviana (por ejemplo, la secuencia presentada en la Figura 25 o la Figura 35) del anticuerpo no humano ligado a por lo menos una porción de la región constante de cadena liviana humana. En algunas realizaciones, la región constante de cadena pesada puede ser un anticuerpo IgM o IgA.

Los anticuerpos quiméricos de la invención pueden ser inmunoglobulinas monovalentes, divalentes, o polivalentes. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena quimérica H asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena quimérica L, como se anotó anteriormente. Un anticuerpo quimérico divalente es un tetrámero (H2 L2) formado por dos dímeros HL asociados a través de por lo menos un puente disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivalente se basa en una agregación de cadenas.

Las secuencias de nucleótido y aminoácido de la región variable de un agonista de anticuerpo anti-DR5 de ejemplo se proporcionan en las Figuras 22-24. Las secuencias de ADN de los anticuerpos de la invención se pueden identificar, aislar, clonar, y transferir a una célula procariótica o eucariótica para la expresión mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos se describen generalmente en Sambrook et al., supra, así como también CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel et al., eds., 1989). Los vectores de expresión y células anfitrionas adecuadas para la expresión de anticuerpos recombinantes y anticuerpos humanizados en particular, son bien conocidos en la técnica. Las siguientes referencias son representadoras de los métodos y vectores adecuados para la expresión de inmunoglobulinas recombinantes que se pueden utilizar para llevar a cabo la presente invención: Weidle et al., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai et al., J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood et al., J. Immunol., 145 (a):3011-3016 (1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al., Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al., Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 2:64 (1991); King et al., Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary et al., Nature, 339:394-397 (1989); Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051-12055 (1994); Singer et al., J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3):215-219 (1994); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992). Más aún, están comercialmente disponibles vectores adecuados para la expresión de anticuerpos recombinantes.

Las células anfitrionas para expresar las inmunoglobulinas funcionales incluyen, por ejemplo, células de mamífero tal como células de Ovario de Hámster Chino (CHO); células COS; células de mieloma, tal como células NSO y SP2/O; bacterias tal como Escherichia coli; células de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae; y otras células anfitrionas.

3. Anticuerpos de Cadena Única

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos de cadena única. Se pueden utilizar ejemplos de las técnicas para producir Fv de cadena única y anticuerpos que incluyen aquellos descritos en la Patente estadounidense Nos. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

4. Anticuerpos Humanos

En algunas realizaciones, se utilizan anticuerpos humanos de acuerdo con la presente invención. Se pueden hacer anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluye métodos de exhibición de fago utilizando colecciones de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver, por ejemplo, Lonberg y Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995), Patente Estadounidense Nos. 4,444,887 y 4,716,111; y publicaciones PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención se generan utilizando exhibición de fago. Por ejemplo, los dominios de anticuerpo funcional se exhiben en la superficie de las partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótido que los codifican. Se puede utilizar tal fago para exhibir los dominios de unión a antígeno expresados de un repertorio o colección de anticuerpo combinatorio (por ejemplo, humano o murino). El dominio de unión a antígeno que expresa fago que une a DR5 se puede seleccionar o identificar con DR5, por ejemplo, utilizando DR5 marcado. El fago utilizado en estos métodos es típicamente fago filamentoso que incluye dominios de unión fd y M13 expresados desde el fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados de disulfuro fusionados recombinantemente a la proteína de gen III o gen VIII de fago. Ejemplos de métodos de exhibición de fago que se pueden utilizar para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen aquellos descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191280 (1994); Solicitud PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y Patente Estadounidense Nos. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108.

5. Anticuerpos agonistas generados

Se pueden identificar anticuerpos agonistas al generar anticuerpos anti-DR5 y luego probar cada anticuerpo por la capacidad de activar eventos mediados por DR5, por ejemplo, induciendo apoptosis en una célula de cáncer. Se puede utilizar una variedad de ensayos conocidos en la técnica para detectar la inducción de apoptosis.

En un ensayo, se ponen en contacto células DOHH-2 o células Jurkat con agonista de anticuerpo candidato y luego se monitorea para viabilidad como una función de concentración de anticuerpo. La viabilidad celular reducida (por ejemplo, originada por apoptosis incrementada) con concentración de anticuerpo incrementada indica que el anticuerpo es un agonista. La viabilidad celular se puede evaluar al agregar azul Alamar, que da fluorescencia en la presencia de células vivas, pero no muertas. Como se describe en los ejemplos, los anticuerpos agonistas se pueden identificar al detectar hibridomas elevados contra DR5 y luego detectar el sobrenadante de hibridoma por la capacidad de inducir apoptosis en células DOHH-2 o células Jurkat. Los controles positivos y negativos apropiados se pueden utilizar para confirmar los resultados. Por ejemplo, una estirpe celular que no va a través de apoptosis TRAIL mediada por DR5 no debe traer apoptosis en response a un agonista anti-DR5 candidato.

III. Agentes que inducen Apoptosis

La presente invención proporciona el efecto sinérgico de los agonistas de agente de afinidad anti-DR5 con un segundo agente que induce apoptosis. Los agentes que inducen apoptosis incluyen cualquier agente que induce apoptosis en las células. En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis induce en forma preferida apoptosis en células de cáncer comparado con células de no cáncer. Típicamente los agentes que inducen apoptosis son agonistas o activadores de apoptosis o antagonistas de inhibidores de apoptosis.

Los agentes que inducen apoptosis de ejemplo incluyen, por ejemplo, agonistas o imitadores de los siguientes: SMAC, Bax, Bik, Bok, Bim, Bak, Bid, Noxa, Puma, Hrk, o Bad; BH3, p53, ligando TRAIL, Fadd, Myc, y Mekk1, partícula de reconocimiento de señal 72kD (SRP72), Quinasa tirosina linfoide B, Bid, Caspasa-8 (BLK), producto de gen similar a Quinasa Piruvato, Isozima M2 (LOC148283), quinasa alfa 3 de glucógeno sintasa (GSK3A), proteína hipotética FLJ32312 (FLJ32312), proteína quinasa 10 activada por mitógeno (MAPK10), TCF4: factor de transcripción 4, homólogo 2 de oncogén vírico de leucemia de murino v-abl Abelson (arg, Gen relacionado con Abelson) (ABL2), homólogo 1 de oncogén de virus de sarcoma UR2 aviar v-ros (ROS1) y homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis aviar v-myc., así como también antagonistas o inhibidores de los siguientes: proteasomas de inhibidor 26S, c-flip, ruta NFκB, miembros de la familia IAP (por ejemplo, XIAP, cIAP1, cIAP2, NAIP, MLIAP/Livin, survivina), miembros de la ruta de proteasoma (por ejemplo, E1, E2 y E3); quinasas PI3, Akt1, 2, y 3, Rip, Nik; CD40; miembros de la familia Bc12 (por ejemplo, Bc12, Bcl-x1, A1, Mcl1), conjugasa ubiquitina UbcH10 (secuencias de polinucleótido que codifican variantes de UbcH10 humano incluyen, por ejemplo, Nos. de acceso NM_181803, NM_181802, NM_181801, NM_181800, NM_181799, N_007019, y BC050736), osteoprotegrina, plexina B 1 (PLXNB 1), Proteína 7 que contiene el dominio SET (SET7), quinasa de quinasa de quinasa 5 de la proteína activada por mitógeno (MAP3K5), quinasa similar a STE20 (JIK), quinasa treonina/serina 1 que interactúa con la quinasa MAP (MKNK1), proteína de transmembrana multiespan de retículo endoplásmico putativo (RFT1), 5-quinasa, tipo I, gama (PIP5K1C), proteína quinasa 2 activada por proteína quinasa activada por mitógeno (MAPKAPK2), proteína quinasa de quinasa 5 activada por mitógeno (MAP2K5), quinasa 6 dependiente de ciclina (CDK6), receptor activina A tipo II similar a I (ACVRL1), homólogo de oncogén (v-fgr) de sarcoma viral de felino Gardner-Rasheed (FGR), proteína hipotética FLJ21802 (FLJ21802), quinasa tirosina del receptor músculo esquelético (MUSK), cromosoma 20 abierto al cuadro de lectura 88 (C20orf88), gemación no inhibida por benzimidazoles 1 (homólogo de levadura) (BUB1), proteína quinasa S6 ribosómica, 90kD, polipéptido 5 (RPS6KA5), homólogo de oncogén relacionado con sarcoma viral v-yes-1 Yamaguchi (LYN), proteína quinasa 7 activada por mitógeno (MAPK7), y homólogo 1 de oncogén vírico timoma de murino v-akt (AKT1), PAK1 (que incluye, por ejemplo, cualquiera de los siguientes quinasa 1 activada por P21(CDKN1A)-, PAKA, P65-PAK, P68-PAK, alpha-PAK, MUK2, PAK1B (quinasa 1B activada por p21), quinasa 1 activada por P21/Cdc42/Rac1 (levadura relacionada con Ste20), efectos Cdc42/Rac de quinasa PAK-A, proteína quinasa MUK2), nsurf, stk12 (que incluye, por ejemplo, quinasa 12 serina/treonina 12, quinasa 2 relacionada con aurora, quinasa 2 similar a aurora/IPL1, AIK2, ARK2, AIM-1, y AIM1), quinasa 1 que regula la señal de apoptosis (Ask1), TLK1 (por ejemplo, No. de acceso NM_012290), NLK (por ejemplo, No. de acceso NM_016231), GRAF (por ejemplo, No. de acceso NM_015071), GCK (por ejemplo, No. de acceso NM_000162), ERK5 (por ejemplo, No. de acceso NM_002749), FGR (por ejemplo, No. de acceso NM_005248), ACVRL1 (por ejemplo, No. de acceso NM_000020), MEKK5 (por ejemplo, No. de acceso NM_002757), PIP5K1C (por ejemplo, No. de acceso XM_047620), MAPKAPK2 (por ejemplo, No. de acceso NM_004759), RFT1 (por ejemplo, No. de acceso NM_052859), MKNK1 (por ejemplo, No. de acceso NM_003684), PLXNB1 (por ejemplo, No. de acceso NM_002673). Los agentes que inducen apoptosis de ejemplo adicionales incluyen, por ejemplo, agentes que mejoran la expresión DR5 y DR4 y/o estabilidad, agentes que mejoran la actividad o estabilidad caspasa, y agentes que inducen o mejoran la respuesta al daño del ADN. Los agonistas o imitadores en la lista anterior incluyen los productos de gen en sí mismos (por ejemplo, p53 es un agonista p53), así como también anticuerpos de agonista. Los antagonistas incluyen agentes que inhiben directamente la actividad (por ejemplo, anticuerpos antagonistas) y agentes que inhiben indirectamente la actividad a través de la expresión o estabilidad reducida de un mARN de molécula objetivo (por ejemplo, siARN) o proteína.

Los agentes que inducen apoptosis que se pueden identificar al objetivar estos productos de gen incluyen compuestos de varias naturalezas químicas. Por ejemplo, se pueden detectar moduladores de estos productos de gen con colecciones de polipéptidos, imitadores betaturn, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas N sustituidas oligoméricas, oligocarbamatos, polipéptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o sus combinaciones.

En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis es un polinucleótido. Por ejemplo, este puede ser un siARN que objetiva un gen que inhibe la apoptosis inducida por TRAIL (por ejemplo, UbcH10 o las moléculas listadas en la primera porción de la Figura 27). En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis es un compuesto de molécula pequeña (por ejemplo, una molécula con un peso molecular de menos de 1500 Daltons y en algunos casos, menos de 1000 Daltons). Por ejemplo, el agente que induce apoptosis puede ser un compuesto de molécula pequeña que inhibe la expresión o actividad de un producto de gen que inhibe la apoptosis inducida por TRAIL (por ejemplo, UbcH10 o moléculas listadas en la primera porción de la Figura 27). El agente que induce apoptosis también puede ser un compuesto de molécula pequeña que mejora la expresión o actividad de un producto de gen que promueve la apoptosis inducida por TRAIL (por ejemplo, UbcH10 o moléculas listadas en la porción de fondo de la Figura 27). Los métodos para detectar moduladores (que incluye moduladores de molécula pequeña) de un gen y su polipéptido codificado, y los métodos para preparar siARN u otros polinucleótidos inhibidores de un gen conocidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense Nos. 6,573,099 y 6,506,559; Principles and Practice of High Throughput Screening, K. Murray (Ed.), CRC Press (2003); High Throughput Screening: Methods and Protocols, W. Janzen (Ed.), Humana Press (2002); publicaciones PCT WO 95/35503, WO 95/30642, y WO 91/18980; Schultz et al., Bioorg Med Chem Lett 8:24092414, 1998; y Weller et al., Mol Divers. 3:61-70, 1997. Los métodos adicionales que se pueden emplear para detectar los moduladores de estos genes y sus productos se describen en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 3rd Ed. (2000); y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999).

En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis se conjuga con el agonista de anticuerpo anti-DR5. En otras realizaciones, el agente que induce apoptosis no se conjuga con el agonista de anticuerpo anti-DR5.

En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis no es TNF-alfa, TNF-beta, AIM I, AIM II, ligando Fas, o VEGI.

1. SMAC

En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis es SMAC/Diablo o un imitador de SMAC o agonista. El SMAC/ Diablo promueve la actividad caspasa para unir el Inhibidor de Proteínas de Apoptosis (IAP). Ver, por ejemplo, Du et al., Célula 102:33-42 (2000); Verhagen et al., Célula 102:43-53, 2000; Solicitud de Patente Estadounidense No. 2002/0110851. La administración o expresión de SMAC en las células se abarca mediante la presente invención. Los fragmentos SMAC, tal como los péptidos de terminal N de SMAC (por ejemplo, los tetra o heptapéptidos de Terminal N (Guo et al., Blood 99(9):3419-3426 (2002); Srinivasula et al., J. Biol. Chem. 275:36152-36157 (2000)), también se pueden expresar o administrar. Ver, también, Solicitud de Patente Estadounidense 2002/0132786.

Adicionalmente, también se pueden utilizar compuestos imitadores SMAC de acuerdo con la presente invención. Estos compuestos pueden tener propiedades farmacéuticas útiles y como tal pueden ser más eficientes para administración con anticuerpos anti-DR5. Los imitadores SMAC de ejemplo incluyen, por ejemplo, péptidos que comprenden un tetrapéptido que une la superficie de ranura con el dominio BIR de un IAP, que incluye tetrapéptidos de la Fórmula X1X2X3X4, en donde X1 es A, X2 es V, T, o I, X3 es P o A y X4 es F, Y, I o V u otros péptidos SMAC, agonistas o imitadores de péptido descritos en la PCT WO 02/26775. Otros imitadores SMAC de ejemplo incluyen LBP672. Ver, por ejemplo, la Figura 15 y Ejemplo 54.

2. Inhibidores de proteasoma 26S

En algunas realizaciones, el agente que induce apoptosis es un Inhibidor proteasoma 26S. Los inhibidores proteasoma son agentes que inhiben la ruta proteasoma-ubiquitina, que previene por lo tanto la degradación de IκB y la ubicación nuclear posterior del socio de IκB, NFκB. La proteasoma tiene dos componentes funcionales: la subunidad catalítica del núcleo 20S y la subunidad reguladora 19S. Las subunidades 20S y 19S de un complejo 26S que degrada las proteínas objetivo para degradación con la adición de ubiquitina. El inhibidor proteasoma de ejemplo incluyen por ejemplo, PS-341 (NSC no. 681239, también conocido como bortezomib) y sus análogos (ver, por ejemplo, Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6:493-500 (2002)). PS-341 y otros inhibidores proteasoma útiles de acuerdo con el métodos de la presente invención se describen en la Patente Estadounidense No. 5,780,454.

Los inhibidores de proteasoma de ejemplo adicionales incluyen, por ejemplo, lactacistina,

5 PS-273 (NSC no. 681226); PS-293 (NSC no. 681227); PS-296 (NSC no. 681228); PS-303 (NSC no. 681229); PS-305 (NSC no. 681231); PS-313 (NSC no. 681234); PS-321 (NSC no. 681236); PS-334 (NSC no. 681237); PS-364 (NSC no. 681242); PS-325 (NSC no. 683086); PS-352 (NSC no. 683094); PS-383 (NSC no. 683098), YU101 (ac-hFLFL-epóxido) (ver, por ejemplo, Elofsson, et al., Chem. Biol. 6:811-822 (1999)), MG262, MG132, MG115, PSI (inhibidor proteasoma N-benciloxicarbonil

10 Ile-Glu(O-tertbutil)-Ala-leucinal). Los ensayos para identificar inhibidores de proteasoma están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Discoverx (Fremont, CA). Aunque la combinación de los inhibidores proteasoma 26S con agonistas DR5 (por ejemplo, anticuerpos anti-DR5 de la presente invención) pueden tener una terapia efectiva para un amplio rango de trastornos hiperproliferativos, la combinación puede ser particularmente efectiva contra células de

15 cáncer con defectos en Bax u otros componentes de la ruta de apoptosis mitocondrial (por ejemplo, Bcl-x1 o Bcl-2). Por ejemplo, los pacientes con cáncer de colon tienen frecuentemente células de tumor que son defectuosas Bax. Por lo tanto, el inhibidor proteasoma combinado con un antagonista DR4 o DR-5 es particularmente efectivo para tratar cánceres de colon que involucran defectos de Bax u otros defectos de apoptosis mitocondrial.

20 En algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma es un compuesto de la Fórmula I

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en donde R1 es arilo sustituido o no sustituido; arilalquilcarbonilo, en donde el grupo funcional arilo se sustituye o no se sustituye; heterociclilo sustituido o no sustituido; o heterociclilalquilcarbonilo, en

25 donde el grupo funcional heterociclilo se sustituye o no se sustituye; R2 es arilo sustituido o no sustituido o sustituido o heteroarilo no sustituido; R3 es hidrógeno, arilo sustituido o no sustituido o alquilo que se sustituye o no se sustituye

por cicloalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, o heteroarilo sustituido o no sustituido que comprende por lo menos un átomo de nitrógeno; 30 R4 es un grupo funcional de la Fórmula IA,

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en donde A1 y A2 son hidroxi o hidroxi sustituido, o juntos con el átomo de boro unido y los dos átomos de oxígeno unidos forman un anillo de la Fórmula IA*,

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35 en donde W es alquileno, alquileno sustituido, cicloalquileno sustituido o no sustituido, bicicloalquileno sustituido o no sustituido o tricicloalquileno sustituido o no sustituido;

y R5 es alquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterociclilo sustituido o no sustituido, o cicloalquilo sustituido o no sustituido; o sus sales.

dentro del contexto de la Fórmula I, los términos generales utiliados tienen los siguientes significados: [

Arilo preferiblemente tiene un sistema de anillo de no más de 20 átomos de carbono, especialmente no más de 12 átomos de carbono, es preferiblemente mono-, bi-o tric-cíclico, y se sustituye o no se sustituye, preferiblemente en cada caso con fenilo sustituido o no sustituido o (especialmente 1-o 2-)naftilo, uno o más sustituyentes preferiblemente se seleccionan independientemente del grupo que consiste de un radical alifático; libre, hidroxi eterificado o esterificado; libre o carboxi esterificado; formilo; alcanoilo; amino mono, disustituido o no sustituido; mercapto; sulfo; alquil-tio; carbamoilo; N-alquil-carbamoilo; N, N-di-aquil-carbamoilo; fenilo; naftilo; heterociclilo, especialmente piridilo; ciano y nitro, más preferiblemente se seleccionan de alquilo, por ejemplo metilo, etilo o propilo; alcoxi, por ejemplo metoxi o etoxi; amino disustituido, por ejemplo dimetilamino; halógeno, por ejemplo cloro o bromo; halógeno-alquilo, por ejemplo trifluorometilo; y fenilo, (especialmente 1-o 2-)-naftilo, y heterociclilo, especialmente como se define adelante, especialmente piridilo, por ejemplo 3-, 4-o especialmente 2-piridilo, cada uno de los cuales se sustituye o no se sustituye con uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes, especialmente independientemente seleccionados de otros sustituyentes arilo ya mencionados. Arilo R1 es más preferiblemente bifenililo, especialmente 2-, 4-o preferiblemente 3-bifenililo, piridilfenilo, especialmente 4-, 3-o más especialmente 2-piridil-(2-, 4-o preferiblemente 3-)fenilo, o alquil-fenilo inferior, especialmente propil-fenilo, tal como 2-, 4-o especialmente 3-isopropilfenil. Arilalquilcarbonilo R1 (con arilo no sustituido o preferiblemente sustituido) es preferiblemente arilalquilcarbonilo inferior con arilo como se definió anteriormente, más preferiblemente fenilalquiloxifenil inferior-alquilcarbonilo inferior, especialmente 2-, 4-o preferiblemente 3-benciloxifenil-acetil o -propionilo, piridil-alquiloxifenil inferior-alquilcarbonilo inferior, especialmente 2-, 4-o preferiblemente 3-(piridin-2-, -4-o preferiblemente -3-)-acetil o propionilo, o fenil-alquilcarbonilo inferior, especialmente fenil-2-o preferiblemente 3-fenil-propionil o fenilacetilo, en donde fenilo se sustituye o no se sustituye mediante hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados de alcoxi inferior, especialmente metoxi, halógeno, especialmente fluoro o cloro, o halógeno-alquilo inferior, tal como trifluorometilo. Arilo sustituido o no sustituido R2 o (independientemente) R3 es preferiblemente mono-, di-o fenilo trisustituido, especialmente sustituido por hasta cuatro sustituyentes independientemente seleccionados de los sustituyentes mencionados para arilo, especialmente de hidroxi, alcoxi inferior (más preferido), preferiblemente metoxi, halógeno, preferiblemente fluoro o cloro, y halógeno-alquilo inferior, preferiblemente trifluorometilo, especialmente fenilo sustituido por hasta tres alcoxi inferior, preferiblemente metoxi, sustituyentes, o en el caso de R3 fenilo no sustituido, o adicionalmente naftilo sustituido o no sustituido, especialmente 1-o 2-naftilo que se sustituye o no se sustituye por hasta cuatro sustituyentes independientemente seleccionados de los sustituyentes mencionados para arilo, especialmente de hidroxi, alcoxi inferior (más preferido), preferiblemente metoxi, halógeno, preferiblemente fluoro o cloro, y halógeno-alquilo inferior, preferiblemente trifluorometilo.

El heterociclilo no sustituido es preferiblemente un radical heterocíclico que es insaturado, saturado o parcialmente saturado en el anillo de unión y es preferiblemente monocíclico o en un sentido más amplio el anillo bicíclico o tricíclico; tiene 3 a 24, más preferiblemente 4 a 16 átomos del anillo; en donde por lo menos en el anillo unido al radical de la molécula de la Fórmula I uno o más, preferiblemente uno a cuatro, especialmente uno o dos átomos de carbono de un radical arilo correspondiente se sustituyen por un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre, el anillo de unión preferiblemente tiene 4 a 12, especialmente 5 a átomos del anillo; heteroarilo que es sustituido o no sustituido por uno o más, especialmente 1 a 3, sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de los sustituyentes definidos anteriormente como sustituyentes de arilo sustituido; y especialmente es un radical heteroarilo seleccionado del grupo que consiste de imidazolilo, tienilo, furilo, tetrahidrofurilo, piranilo, thiantrenilo, isobenzofuranilo, benzofuranilo, cromenilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, imidazolilo, imidazolidinilo, benzimidazolilo, pirazolilo, pirazolidinilo, piraniolo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piperidilo, piperazinilo, piridazinilo, morpholinilo, tiomorfolinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, indolilo, indazolilo, triazolilo, tetrazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, isoquinolilo, quinolilo, tetrahidroquinolilo, tetrahidroisoqionolilo, decahidroquinolilo, octahidroisoquinolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalilo, quinazolinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, carbazolilo, β-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, perimidinilo, fenantrolinilo, furazanilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, isocromanilo y cromanilo, cada uno de estos radicales es sustituido o no sustituido por uno a dos radicales seleccionados del grupo que consiste de alquilo inferior, especialmente metilo o terc-butilo, alcoxi inferior, especialmente metoxi, y halo, especialmente bromo

o cloro; piridilo, especialmente 2-o 3-piridilo, o indolilo se prefiere especialmente, en un aspecto más amplio alquilpiridilo inferior, pirimidinilo o alquilpirimidinilo inferior, halo-alquilpiridilo inferior, alcoxi inferiorpiridilo, di-alquilo inferior-piridilo, o halo-piridilo. El heterociclilo se sustituye o no se sustituye por uno o más, preferiblemente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de aquellos mencionados anteriormente para arilo (en donde heterociclilo como sustituyente de heterociclilo no lleva el sustituyente heterociclilo adicional diferente de piridilo o indolilo) y de arilo como se definió anteriormente, especialmente fenilo, especialmente aquel mencionado como el preferido. Se prefiere el heterociclilo no sustituido.

En heterociclilalquilcarbonilo R1 , el grupo funcional heterociclilo se sustituye preferiblemente o especialmente heterociclilo no sustituido como se mencionó anteriormente; el preferido es heterociclilo sustituido o preferiblemente no sustituido-alquilo inferior, especialmente con el terminal heterociclilo sustituido o preferiblemente no sustituido, con heterociclilo como se describió anteriormente; se prefiere piridil-alquilcarbonilo inferior, tal como -acetilo o -propionilo.

Como R1, se prefiere arilo sustituido o no sustituido o aril-alquilcarbonilo inferior sustituido.

Heteroarilo R2 es preferiblemente heteroarilo sustituido o no sustituido como se mencionó anteriormente, especialmente indolilo que se sustituye o no se sustituye por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de aquellos mencionados anteriormente para arilo sustituido, especialmente de hidroxi, alcoxi inferior (más preferido), preferiblemente metoxi, halógeno, preferiblemente fluoro o cloro, y halógeno-alquilo inferior, preferiblemente trifluorometilo.

R2 es preferiblemente arilo sustituido.

Un radical alifático preferiblemente tiene hasta 12 átomos de carbono, preferiblemente hasta 7 átomos de carbono, más preferiblemente hasta 4 átomos de carbono, y es un radical de hidrocarburo alifático, tal como un alquinilo sustituido o no sustituido, alquenilo o preferiblemente radical alquilo, más preferiblemente alquilo inferior, especialmente metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, secbutilo, iso-butilo o terc-butilo.

Alquilo, que puede ser ramificado o lineal, preferiblemente tiene hasta 12 átomos de carbono, y es más preferiblemente alquilo inferior. Alquilo R3 es preferiblemente alquilo inferior, especialmente isobutilo.

El prefijo "inferior" denota un radical que tiene hasta y que incluye 7, preferiblemente hasta y que incluye 4, átomos de carbono.

Alquilo inferior es, preferiblemente, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tercbutilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo o n-heptilo, preferiblemente isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopropilo, etilo o metilo, más preferiblemente isopropilo, etilo o metilo.

Hidroxi eterificado es, por ejemplo, alcoxi, especialmente alcoxi inferior, tal como etoxi o metoxi, ariloxi, especialmente feniloxi, aril-alcoxi inferior, especialmente fenil-alcoxi inferior, heterocicliloxi, especialmente piridiloxi, o heterociclilalcoxi inferior, especialmente piridil-alcoxi inferior (arilo y heterociclilo preferiblemente tiene los mismos significados dados anteriormente).

Hidroxi esterificado es preferiblemente hidroxi esterificado por un ácido carboxílico orgánico, tal como un ácido alcanoico, por ejemplo alcanoiloxi inferior.

Carboxi esterificado es, por ejemplo, alcoxicarbonilo, especialmente alcoxicarbonilo inferior, tal como por ejemplo metoxicarbonilo.

Amino mono o disustituido es, preferiblemente, N-alquilamino o N,N-dialquilamino, especialmente N-alquilamino inferior o N,N-di-alquilamino inferior, tal como N-metilamino o N,Ndimetilamino.

Halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente flúor, cloro o bromo.

El cicloalquilo sustituido o no sustituido tiene preferiblemente hasta 12, más preferiblemente 3 a 8 átomos carbonilo del anillo y se sustituye por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de aquellos mencionados por arilo sustituido, o preferiblemente no sustituido. Se prefiere ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

En alquilo R3 sustituido con cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquilo es preferiblemente como se definió anteriormente, más preferiblemente alquilo inferior, especialmente isopropilo, y es (preferiblemente terminalmente) sustituido por cicloalquilo como se definió anteriormente.

En alquilo R3 sustituido con arilo sustituido o no sustituido, alquilo es preferiblemente como se definió en el último párrafo, y arilo se define como atrás y se sustituye por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de aquellos mencionados para arilo sustituido, o no sustituido; especialmente arilo es fenilo sustituido por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, especialmente fluoro, hidroxi o alcoxi inferior, especialmente metoxi, o este es fenilo no sustituido.

En alquilo R3 sustituido con heterociclilo sustituido o no sustituido, alquilo es preferiblemente como se define para alquilo R3 sustituido con cicloalquilo, y heterociclilo se define como anteriormente y se sustituye por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes independientemente seleccionados de aquellos mencionados para heterociclilo sustituido, o no sustituido.

Si A1 y A2 son cada uno hidroxi sustituido, el hidroxi sustituido es preferiblemente alquiloxi, especialmente alquiloxi inferior, ariloxi, especialmente con arilo sustituido o no sustituido como se definió anteriormente, o cicloalquiloxi con cicloalquilo sustituido o no sustituido como se definió anteriormente.

Si A1 y A2 juntos con el átomo de boro unido y los átomos de oxígeno forman un anillo o la Fórmula IA* mostrada anteriormente, entonces W preferiblemente lleva los dos átomos de oxígeno unidos al átomo de boro en dos diferentes átomos de carbono que son espacialmente cercanos o átomos de carbono vecinos, especialmente en la vecindad ("1,2-") o en la posición "1,3" (relacionados uno al otro).

Alquileno es preferiblemente un grupo funcional alquileno C2-C12-, preferiblemente C2-C7 no ramificado, por ejemplo etileno, o propileno, en un aspecto más amplio butileno, pentileno o hexileno, unido mediante dos átomos de carbono diferentes como ya se describió, preferiblemente vecino o en la posición "1,3". Uno o más, especialmente uno, de los átomos de carbono no unido a los átomos de oxígeno unidos a un átomo de boro se puede reemplazar por un heteroátomo seleccionado de O, S o preferiblemente N (que lleva el número requerido de átomos H, respectivamente), por ejemplo en 1,5(3-aza-pentileno).

Alquileno sustituido es preferiblemente un grupo funcional alquileno inferior no ramificado como se definió anteriormente que se sustituye o no se sustituye por uno o más, especialmente hasta tres, sustituyentes preferiblemente independientemente seleccionados de alquilo inferior, tal como metilo o etilo, por ejemplo en 1-metiletileno, 1,2-dimetiletileno, hidroxi, por ejemplo en 2-hidroxipropileno, o hidroxialquilo inferior, tal como hidroximetilo, por ejemplo en 1-hidroximetil-etileno.

Cicloalquileno sustituido o no sustituido es preferiblemente cicloalquileno C3-C12-, más preferiblemente C3-C8-unido por vía de dos átomos de carbono diferentes como se describe para W, preferiblemente vecino o en la posición "1,3"-, tal como ciclohexileno o ciclopentileno, en el que uno

o más, especialmente uno, de los átomos de carbono no unido a los átomos de oxígeno se puede reemplazar por un heteroátomo seleccionado de O, S o N (que lleva el número requerido de átomos H, respectivamente), por ejemplo en tetrahidrofurileno o tetrahidropiranileno, y se puede sustituir o no sustituir por uno o más, especialmente hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados de alquilo inferior, tal como metilo o etilo, hidroxi, hidroxi-alquilo inferior, tal como metoxi, o mono-o oligosacaridil unido mediante un átomo de oxígeno ("oligosacaridil" preferiblemente que comprende hasta cinco grupos funcionales sacaridil).

Bicicloalquileno sustituido o no sustituido es preferiblemente bicicloalquileno C5-C12-unido mediante dos átomos de carbono diferentes como se describe para W, preferiblemente vecino o en la posición “1,3”, en el que uno o más, especialmente uno, de los átomos de carbono que no se une a los átomos de oxígeno se une al átomo de boro se puede reemplazar mediante un heteroátomo seleccionado de O, S o N (que lleva el número requerido de átomos H, respectivamente), y se puede sustituir o no sustituir por uno o más, especialmente hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados de alquilo inferior, tal como metilo o etilo, hidroxi e hidroxialquilo inferior, tal como metoxi. Se prefiere pinanileno (2,3-(2,6,6-trimetil-biciclo[3.1.1]heptano)).

Tricicloalquileno sustituido o no sustituido es preferiblemente tricicloalquileno C8-C12-unido mediante dos átomos de carbono diferentes como se describe para W, preferiblemente vecino o en la posición “1,3”, en el que uno o más, especialmente uno, de los átomos de carbono que no se une a los átomos de oxígeno se une al átomo de boro se puede reemplazar mediante un heteroátomo seleccionado de O, S o N (que lleva el número requerido de átomos H, respectivamente), y se puede sustituir o no sustituir por uno o más, especialmente hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados de alquilo inferior, tal como metilo o etilo, hidroxi e hidroxialquilo inferior, tal como metoxi.

Más preferiblemente, R4 es -B(OH)2 o 2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec4-ilo, especialmente (1S, 2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-ilo.

En alquilo sustituido o no sustituido R5, alquilo, que puede ser ramificado o lineal, preferiblemente tiene hasta 12 átomos de carbono, y es más preferiblemente alquilo inferior. Alquilo R5 es preferiblemente alquilo inferior, especialmente isopropilo. Los sustituyentes, de los que uno o más, especialmente hasta dos, pueden estar presente, se seleccionan independientemente de arilo sustituido o no sustituido (especialmente fenilo o hidroxifenilo), heterociclilo sustituido o no sustituido (especialmente imidazolilo o indolilo), cicloalquilo sustituido o no sustituido, cada uno como se definió anteriormente; hidroxi (preferido), carboxi (preferido), carbamoilo, mercapto, alquiltio inferior, por ejemplo metiltio, fenilo, hidroxifenilo, indolilo, imidazolilo, amino, trialquilamino inferior, por ejemplo trimetilamino, alcanoilamino inferior, por ejemplo acetilamino, guanidino, N-alquilo inferiorguanidino, por ejemplo N-metilguanidino, o cualquier otro sustituyente que completa un aminoácido que comprende R5. Preferiblemente, R5 puede ser metilo, isopropilo, isobutilo, sec-butilo, mercaptometilo, 2-metiltioetilo, fenilmetilo, hidroxifenilmetilo, indol-3-ilmetilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, carbamoilmetilo, 2-carbamoiletilo, 4-aminobutilo, 3guanidinopropilo, 5-imidazolilmetilo, carboximetilo o 2-carboxietilo.

Los átomos de carbono asimétricos de un compuesto de la Fórmula I que están presentes pueden existir en la configuración (R), (S) o (R,S), preferiblemente en la configuración (R) o (S), más preferiblemente en la configuración indicada en la Fórmula I* adelante. Los sustituyentes en un enlace doble o un anillo puede estar presente en la forma cis-(= Z-) o trans (= E-). Los compuestos así pueden estar presentes como mezclas de isómeros o preferiblemente como isómeros puros.

Los grupos formadores de sal en un compuesto de la Fórmula I son grupos o radicales que tienen propiedades básicas o acídicas. Los compuestos que tienen por lo menos un grupo básico o por lo menos un radical básico, por ejemplo amino, un grupo amino secundario no forma un enlace péptido o un radical piridilo, puede formar sales de adición ácida, por ejemplo con ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico, o con ácidos carboxílicos o sulfónicos orgánicos adecuados, por ejemplo ácidos mono-o di-carboxílicos alifáticos, tal como ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propionico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico o ácido oxálico, o aminoácidos tal como arginina o lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tal como ácido benzoico, ácido 2-fenoxi-benzoico, ácido 2-acetoxi-benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácidos carboxílicos aromáticos-alifáticos, tal como ácido mandélico o ácido cinnámico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, tal como ácido nicotínico o ácido isonicotínico, ácidos sulfónicos alifáticos, tal como metano-, etano-o ácido 2-hidroxietanosulfónico, o ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo benceno-, p-tolueno-o naftaleno-ácido 2-sulfónico. Cuando están presentes varios grupos básicos se pueden formar sales de adición mono-o poli-ácidas.

Los compuesto de la Fórmula I tienen grupos acídicos, por ejemplo un grupo de ácido borónico libre (-B(OH)2, que, en la Fórmula IA* A1 y A2 son cada uno hidroxi) o un grupo carboxi, pueden formar sales de metal o amonio, tal como sales de metal álcali o metal alcalinotérreo, por ejemplo sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, o sales de amonio con amoniaco o aminas orgánicas adecuadas, tal como monoaminas terciarias, por ejemplo trietilamina o tri-(2-hidroxietil)amina, o bases heterocíclicas, por ejemplo N-etilpiperidina o N,N’-dimetilpiperazina. Son posibles mezclas de sales.

Los compuestos de la Fórmula I que tienen grupos acídicos y básicos pueden formar sales internas.

Los compuestos de ejemplo de la Fórmula I incluyen aquellos en donde R1 es aril-alquilcarbonilo inferior sustituido o arilo sustituido o no sustituido,

R2 es arilo sustituido o heterociclilo sustituido o no sustituido,

R3 es alquilo inferior, arilo sustituido o no sustituido o alquilo inferior que se sustituye por arilo sustituido o no sustituido,

R4 es un grupo funcional de la Fórmula IA dada anteriormente en donde A1 y A2 son hidroxi, alquiloxi inferior, ariloxi con arilo sustituido o no sustituido o cicloalquiloxi con cicloalquilo sustituido o no sustituido, o en donde A1 y A2, juntos con el átomo de boro unido y los dos átomos de oxígeno unidos forman un anillo de la Fórmula IA* dada anteriormente en donde W se sustituye o no se sustituye con alquileno inferior unido mediante dos átomos de carbono diferentes que son espacialmente cercanos o vecinos, especialmente en la vecindad o, relativamente uno con el otro, en la posición "1,3", y

R5 es alquilo inferior, o sus sales.

Los compuestos de ejemplo de la Fórmula I incluyen aquellos en donde

R1 es feniloxifenil-alquilcarbonilo inferior; fenil-alcoxifenil inferior-alquilcarbonilo inferior; piridiloxifenilalquilcarbonilo inferior; fenil-alquilcarbonilo inferior sustituido por alcoxi inferior, especialmente metoxi, halógeno, especialmente fluoro o cloro, o halógeno-alquilo inferior, especialmente trifluorometilo; o preferiblemente fenilo o naftilo sustituido o no sustituido, en donde en ambos casos los sustituyentes si están presentes son independientemente uno o más, especialmente uno a tres, sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, alcanoiloxi inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, formilo, alcanoilo inferior, amino, Nalquilamino inferior, N,N-di-alquilamino inferior, mercapto, sulfo, alquiltio inferior, carbamoilo, N-alquilo inferior-carbamoilo; N,N-di-alquilo inferior-carbamoilo, fenilo, naftilo, piridilo, ciano y nitro, más preferiblemente alcoxi inferior alcoxi, especialmente metoxi o etoxi;

R2 es fenilo sustituido por uno o más, especialmente uno a tres, grupos funcionales independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, alcoxi inferior, especialmente metoxi, halógeno, especialmente fluoro o cloro, y halógeno-alquilo inferior, especialmente trifluorometilo;

R3 es alquilo inferior, especialmente isobutilo, fenilo o fenilo sustituido por uno o más, especialmente hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de hidroxi, alcoxi inferior, especialmente metoxi, halógeno, especialmente fluoro o cloro, y halógenoalquilo inferior, especialmente trifluorometilo;

R4 es -B(OH)2 (especialmente preferido) o 2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-ilo, especialmente (1S, 2S, 6R, 8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-ilo; y

R5 es alquilo inferior, especialmente isopropilo;

o sus sales. Los compuestos de ejemplo de la Fórmula I incluyen aquellos en donde R1 es feniloxifenilacetilo, benciloxifenilacetilo, piridiloxifenilacetilo, bifenililo, piridilfenilo,

alquilfenilo inferior o fenilpropioniloxi sustituido en donde los sustituyentes fenilo son hasta tres sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de metoxi, fluoro, cloro y trifluorometilo;

R2 es fenilo sustituido con hasta tres sustituyentes metoxi, especialmente 2,3,4trimetoxifenilo o 3,4,5-trimetoxifenilo;

R3 es isobutilo o fenilo que se sustituye o no se sustituye con hasta tres grupos funcionales

independientemente seleccionados de hidroxi, fluoro y metoxi;

R4 es (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il o

especialmente-B(OH)2; y

5 R5 es isopropilo; o sus sales.

Los compuestos de ejemplo de la Fórmula I incluyen aquellos en donde

R1 es bifenililo, alquil-fenilo inferior, fenil-alquilo inferior-carbonilo, fenoxi-fenil-alquilo

inferior-carbonilo, fenilalcoxi inferior-fenil-alquilo inferior-carbonilo o piridil-fenilo; R2 es sustituido por 1 a 3 radicales alcoxi inferior o fenil-alcoxi inferior-fenilo; 10 R3 es alquilo inferior o fenil-alquilo inferior; R4 es 4,4,5,5-tetrametil -[1,3,2]dioxaborolan-2-ilo; (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4

bora-triciclo [6.1.1.02,6]dec-4-ilo -B(OH)2; y

R5 es alquilo inferior; o sus sales.

Otros compuestos de ejemplo de la Fórmula I o sus sales, incluyen aquellos en donde la 15 estereoquímica es como se describe en la Fórmula I*

imagen1

en donde la configuración mostrada representa la configuración absoluta y en donde R1, R2,

R3, R4 y R5 tienen los significados como se define para un compuesto de la Fórmula I, especialmente

aquellos significados descritos aquí anteriormente que son preferidos.

Otros compuestos de ejemplo de la Fórmula I o sus sales, incluyen aquellos en donde la estereoquímica es como se describe en la Fórmula I**

imagen1

en donde la configuración mostrada representa la configuración absoluta y en donde R1, R2, R3, R4 y R5 tienen los significados como se define para un compuesto de la Fórmula I, especialmente 25 aquellos significados descritos aquí anteriormente que son preferidos. Otros compuestos de ejemplo de la Fórmula I o sus sales, incluyen mezclas de diastereómeros, en donde la estereoquímica es como se describe en la Fórmula I***

imagen1

en donde la configuración mostrada representa la configuración absoluta y en donde R1, R2, 30 R3, R4 y R5 tienen los significados como se define para un compuesto de la Fórmula I, especialmente aquellos significados descritos aquí anteriormente que son preferidos. más especialmente se prefieren los compuestos de la Fórmula I descritos en los Ejemplos, o sus sales farmacéuticamente aceptables.

Los compuestos de la Fórmula I o sus sales se preparan de acuerdo con los procesos conocidos. Los procesos preferiblemente comprenden

a) hacer reaccionar un análogo dipéptido de la Fórmula II,

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en donde R3, R4 y R5 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, con un aminoácido de la Fórmula III,

imagen1

o su derivado reactivo, en donde R1 y R2 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, los grupos funcionales presentes en un compuesto de la Fórmula II y/o III, con la excepción de los grupos 10 que participan en la reacción, se protegen si es necesario mediante grupos protectores fácilmente removibles, y se remueven cualesquier grupos protectores presentes, o

b) para la producción de un compuesto de la Fórmula I en donde R1 es arilalquilcarbonilo o heterociclilalquilcarbonilo y los otros grupos funcionales R2 a R5 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, haciendo reaccionar un compuesto amino de la Fórmula IV,

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en donde R2, R3, R4 y R5 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, con un ácido carbónico de la Fórmula V,

imagen1

o su derivado reactivo, en donde R1 es arilalquilcarbonilo o heterociclilalquilcarbonilo,

20 Los grupos funcionales presentes en un compuesto de la Fórmula IV y/o V, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, se protegen si es necesario mediante grupos protectores fácilmente removibles, y se remueven cualesquier grupos protectores,

y, si se desea, convertir un compuesto de la Fórmula I obtenido mediante un proceso a) o b) en otro compuesto de la Fórmula I, convertir un compuesto obtenido libre de la Fórmula I en una sal, 25 convertir una sal obtenida de un compuesto de la Fórmula I en una sal diferente o en su forma libre,

y/o separar una mezcla de compuestos isoméricos de la Fórmula I en los isómeros individuales.

Los diferentes estereoisómeros posibles de los compuestos de la Fórmula I se pueden preparar al utilizar eductos con la configuración apropiada. Por ejemplo, se pueden preparar compuestos de la Fórmula I* o sus sales al

30 a) hacer reaccionar un análogo dipéptido de la Fórmula II*, en donde R3, R4 y R5 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, con un aminoácido de la Fórmula III*,

imagen1

5 o su derivado reactivo, en donde R1 y R2 tienen los significados dados bajo la Fórmula I,

Los grupos funcionales presentes en un compuesto de la Fórmula II* y/o III*, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, se protegen si es necesario mediante grupos protectores fácilmente removibles, y se remueven cualesquier grupos protectores presentes, o

b) para la producción de un compuesto de la Fórmula I* en donde R1 es arilalquilcarbonilo o 10 heterociclilalquilcarbonilo y los otros grupos funcionales R2 a R5 tienen los significados dados bajo la Fórmula I, haciendo reaccionar un compuesto amino de la Fórmula IV*,

imagen1

15

o su derivado reactivo, en donde R1 es arilalquilcarbonilo o heterociclilalquilcarbonilo, los grupos funcionales presentes en un compuesto de la Fórmula IV* y/o V, con la excepción de los grupos que participan en la reacción, se protegen si es necesario mediante grupos protectores fácilmente removibles, y se remueven cualesquier grupos protectores presentes, y, si se desea,

20 convertir un compuesto de la Fórmula I* obtenido mediante el proceso a) o b) en otro compuesto de la Fórmula I*, convertir un compuesto libre obtenido de la Fórmula I* en una sal, o convertir una sal obtenida de un compuesto de la Fórmula I* en una sal diferente o en su forma libre. Los productos finales de la Fórmula I pueden contener sustituyentes que también se pueden utilizar como grupos protectores en materiales de partida para la preparación de otros productos

25 finales de la Fórmula I, por ejemplo en el caso de R4 diferente a -B(OH)2. Así, dentro del alcance de este texto, solo un grupo fácilmente removible que no es constituyente del producto final deseado particular de la Fórmula I se denomina un grupo "protector", a menos que el contexto indique otra cosa. La protección de los grupos funcionales para tales grupos protectores, los grupos protectores

30 en sí mismos, y sus reacciones de división se describen por ejemplo en trabajos de referencia estándar, tal como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y New York 1973, en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Tercera edición, Wiley, New York 1999, en "The Péptidos"; Volumen 3 (editores: E. Gross y J. Meienhofer), Academic Press, Londres y New York 1981, en "Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weilo, 4ta edición, Volumen 15/I, Georg Tieme Verlag, Stuttgart 1974, en H.-D. Jakubke y H. Jescheit, "Aminosäuren, Peptide, Proteìnae" (Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, y Basel 1982, y en Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Tieme Verlag, Stuttgart 1974.

Una características de los grupos protectores es que ellos se pueden remover fácilmente (es decir sin la ocurrencia de reacciones secundarias indeseadas) por ejemplo mediante solvólisis, reducción, fotólisis o alternativamente bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo mediante división enzimática).

La remoción de un grupo protector para el grupo -B(OH)2-(con el fin de obtener un compuesto de la Fórmula I en donde R4 es -B(OH)2) preferiblemente tiene lugar con un ácido por ejemplo cloruro de hidrógeno, en un disolvente apropiado, por ejemplo un alcanol inferior, tal como metanol, o un alcano inferior, tal como hexano, o su mezcla, a temperaturas de 0 a 50 ˚C, por ejemplo a temperatura ambiente.

Por lo menos se pueden utilizar dos procesos para sintetizar el inhibidor de proteasomas de la Fórmula I. En el proceso "a", la reacción se lleva a cabo al disolver los compuestos de las Fórmulas II y III en un disolvente adecuado, por ejemplo N,N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, N-metil2-pirrolidona, cloruro de metileno, o una mezcla de dos o más de tales disolventes, y mediante la adición de una base adecuada, por ejemplo trietilamina, diisopropiletilamina (DIEA) o Nmetilmorfolina y un agente acoplador adecuado que forma un derivado reactivo preferido del ácido carbónico de la Fórmula III in situ, por ejemplo diciclohexilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol (DCC/ HOBT); O-(1,2-dihidro-2-oxo-1-piridil)-N,N, N’,N’-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TPTU); O-benzotriazol-1-il)-N,N,N’, N’-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU); o clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC). Para revisión de otros agentes de acoplamiento posibles, ver por ejemplo Klauser; Bodansky, Synthesis 1972, 453-463. La mezcla de reacción se agita preferiblemente en una temperatura de entre aproximadamente -20 y 50 ˚C, especialmente entre 0 ˚C y temperatura ambiente, para producir un compuesto de la Fórmula I. La reacción se lleva a cabo preferiblemente bajo un gas inerte, por ejemplo nitrógeno o argón.

En el proceso "b", la reacción se lleva a cabo preferiblemente bajo condiciones análogas a aquellas descritas para el proceso a).

Las sales de un compuesto de la Fórmula I con un grupo formador de sales pueden preparar en una forma conocida per se. Las sales de adición ácida de los compuestos de la Fórmula I así se pueden obtener mediante tratamiento con un ácido o con un reactivo de intercambio de anión adecuado.

Las sales se pueden convertir usualmente en compuestos libres, por ejemplo al tratar con agentes básicos adecuados, por ejemplo con carbonatos de metal álcali, hidrogencarbonatos, o hidróxidos, típicamente carbonato de potasio o hidróxido de sodio.

Las mezclas estereoisoméricas, por ejemplo mezclas de diastereómeros, se pueden separar en sus isómeros correspondientes en una forma conocida per se por medio de métodos de separación adecuados. Las mezclas diastereoisoméricas por ejemplo se pueden separar en sus diastereómeros individuales por medio de cristalización fraccionada, cromatografía, distribución de disolvente, y procedimientos similares. Esta separación puede tener lugar en un nivel de uno de los compuestos de partida o en un compuesto de la Fórmula I en sí mismo. Se pueden separar las enantiómeros a través de la formación de sales diastereoméricas, por ejemplo mediante la formación de sal con un ácido quiral puro-enantiómero o por medio de cromatografía, por ejemplo mediante HPLC, utilizando sustratos cromatográficos con ligandos quirales.

5 Los compuestos de la Fórmula I en donde R4 es diferente a -B(OH)2 se pueden convertir en compuestos de la Fórmula I en donde R4 es -B(OH)2 de acuerdo con procedimientos estándar, utilizando por ejemplo ácido isobutil-borónico (i-BuB(OH)2 en la presencia de un ácido especialmente hidrohálico en una mezcla de agua/metanol/hexano, a temperaturas que varían preferiblemente de 0 a 50 ˚C, por ejemplo a temperatura ambiente.

10 En ambos procesos a) y b), para la conversión o para la síntesis de los intermedios o el material de partida, los disolventes de los cuales aquellos se pueden seleccionar que son adecuados para la reacción en cuestión incluyen por ejemplo agua, ésteres, típicamente alquilo inferior-alcanoato inferior, por ejemplo, dietil acetato, éteres, típicamente éteres alifáticos, por ejemplo dietiléter, o éteres cíclicos, por ejemplo tetrahidrofurano, hidrocarburos aromáticos líquidos, típicamente benceno

15 o tolueno, alcoholes, típicamente metanol, etanol o 1-o 2-propanol, nitrilos, típicamente acetonitrilo, hidrocarburos halogenados, típicamente diclorometano, amidas ácidas, típicamente dimetilformamida, bases, típicamente bases de nitrógeno heterocíclico, por ejemplo piridina, ácidos carboxílicos, típicamente ácidos alcanocarboxílicos inferiores, por ejemplo ácido acético, anhídridos de ácido carboxílico, típicamente anhídridos de ácido alcano inferior, por ejemplo anhídrido acético,

20 hidrocarburos ramificados, cíclicos o lineales, típicamente ciclohexano, hexano, o isopentano, o mezclas de estos disolventes, por ejemplo soluciones acuosas, a menos que se indique otra cosa en la descripción del proceso. También se pueden utilizar tales mezclas de disolvente en el proceso, por ejemplo a través de cromatografía o distribución. Nuevos materiales de partida y/o intermedios, así como también los procesos para su

25 preparación, son de esta forma el objeto de esta invención. En la realización preferida, se utilizan tales materiales de partida y las condiciones de reacción seleccionadas tal como para permitir la fabricación de los compuestos preferidos.

Los materiales de partida de las Fórmulas II -V o sus precursores conocidos, se pueden preparar de acuerdo con procesos conocidos, o se pueden obtener comercialmente; en particular, ellos 30 se pueden preparar utilizando procesos idénticos o en analogía a aquellos descritos en los Ejemplos. Un compuesto de la Fórmula II, en donde los sustituyentes son como se definió anteriormente bajo la Fórmula I, se puede obtener por ejemplo mediante las siguientes reacciones: Primero, un análogo de ácido borónico de un aminoácido de la Fórmula VI

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que comprende por ejemplo la configuración como se indica en la Fórmula VI*

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en donde R3 tiene los significados dados anteriormente para los compuestos de la Fórmula I y R4 tiene los significados diferentes a -B(OH)2 mencionados anteriormente para los compuestos de la Fórmula I, especialmente es (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[ 6.1.1.02,6]dec-4ilo, o su sal de adición ácida, especialmente sus sales con ácido trifluoroacético, se condensa con un aminoácido de la Fórmula VII

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que comprende por ejemplo la configuración como se indica en la Fórmula VII*

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o su derivado reactivo, en donde R5 tiene los significados dados anteriormente para los compuestos de la Fórmula I y PR1 es un grupo amino protegido, preferiblemente tercbutoxicarboniloamino, bajo condiciones de reacción análogas a aquellas descritas para la reacción a)

10 anterior (también una reacción de condensación, también preferiblemente con formación in situ de los derivados de ácido carbónico activos), produciendo así un compuesto de la Fórmula II en forma N protegida que luego es N desprotegida, utilizando por ejemplo las condiciones descritas en los textos estándar mencionados anteriormente, en el caso de terc-butoxicarboniloamino por ejemplo con ácido clorhídrico en un disolvente apropiado, por ejemplo dioxano y/o cloruro de metileno dando un

15 compuesto de la Fórmula II que se puede utilizar directamente en el proceso a). Se conocen ácidos borónicos de la Fórmula VI, disponibles comercialmente y/o se pueden sintetizar de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, los compuestos de la Fórmula VI en donde R3 es alquilo inferior, especialmente isobutilo y R4 es como se describe para los compuestos de la Fórmula VI, preferiblemente (1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo [6.1.1.02,6]dec

20 4-ilo, se puede preparar al hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula VIII,

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en donde R4 tiene los significados ya descritos, en un disolvente apropiado, por ejemplo cloruro de metileno, con litio n-alquilo inferior, especialmente n-butillitio, y posteriormente con cloruro de zinc, produciendo un compuesto de la Fórmula IX,

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en donde R4 tiene los significados dados anteriormente bajo la Fórmula VI. Este compuesto

luego se hace reaccionar con LiN(SiCH3)2, y el compuesto resultante de la Fórmula luego se hace

reaccionar en la presencia de ácido trifluoro acético para producir la sal de la Fórmula X,

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en donde R4 tiene los significados dados bajo la Fórmula VI, que es un compuesto de la Fórmula VI y luego se puede utilizar directamente para reacción con el compuesto de la Fórmula VII como se mostró anteriormente.

Se conoce un compuesto de la Fórmula III, comercialmente disponible y/o se puede obtener de acuerdo con procedimientos estándar. Por ejemplo, un compuesto de la Fórmula III en donde R1 es arilo, especialmente bifenililo, se puede preparar al hacer reaccionar un compuesto de la Fórmula XI,

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que comprende por ejemplo la configuración como se indica en la Fórmula XI*

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en donde R2 tiene los significados dados para un compuesto de la Fórmula I, que se conoce, comercialmente disponible o se puede obtener de acuerdo con procedimientos estándar, con un compuesto de la Fórmula XII,

15 R1-X (XII) en donde R1 es arilo y X es halógeno, especialmente bromo, en un disolvente apropiado, por ejemplo en dimetilformamida, en la presencia de una base, especialmente un carbonato de metal álcali, por ejemplo carbonato de potasio, en temperaturas entre 50 y 100 ˚C, por ejemplo a 90 ˚C, preferiblemente bajo gas inerte, por ejemplo nitrógeno o argón. Esto produce directamente los

20 compuestos correspondientes de la Fórmula III. Se conocen derivados de aminoácido de la Fórmula VII, comercialmente disponibles o se pueden obtener de acuerdo con procedimientos estándar. Ellos se utilizan preferiblemente en la forma protegida amino, por ejemplo con terc-butoxicarboniloamino en lugar del grupo amino libre.

Los compuestos de la Fórmula IV se pueden obtener por ejemplo al hacer reaccionar un 25 compuesto de la Fórmula II que comprende por ejemplo la configuración como se indica en la Fórmula II*, como se define en el proceso a), con un aminoácido N protegido de la Fórmula XIII,

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que comprende por ejemplo la configuración como se indica en la Fórmula XIII*

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o su derivado reactivo, en donde R2 es como se define bajo la Fórmula I y PR2 es amino protegido, especialmente terc-butoxicarboniloamino, bajo condiciones de reacción de condensación

5 preferida como se describe bajo el proceso a) anterior. Del compuesto resultante, un compuesto de la Fórmula IV en donde el grupo amino N terminal está presente en forma protegida, luego se remueve el grupo protector N, por ejemplo en el caso de terc-butoxicarboniloamino con cloruro de hidrógeno en dioxano.

En otras realizaciones, el agente que induce apoptosis es un inhibidor proteasoma de la

10 familia de ácido 2,4-diamino-3-hidroxicarboxílico de compuestos. Ver, PCT WO 00/64863. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma es un ácido 2,4-diamino-3hidroxicarboxílico de la Fórmula XIV,

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en donde 15 A y B independientemente representan un enlace o un grupo funcional aminoacilo sustituido

o no sustituido; R1 representa hidrógeno; un grupo protector amino; o un grupo de la Fórmula R5Y-en donde R5 representa hidrógeno o un alquilo sustituido o no sustituido, grupo alquenilo, alquinilo,

arilo, arilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, heterociclilo o heterociclilalquilo; y 20 Y representa -CO-; -NH-CO-; -NH-CS-; -SO2-; -O-CO-; o -O-CS-; R2 representa la cadena lateral de un aminoácido natural; un grupo alquilo, arilalquilo,

heteroarilalquilo o cicloalquilalquilo; o trimetilsililmetilo, 2-tienilmetilo o estirilmetilo; R3 representa halógeno, alquilo, alcoxi o hidroxialcoxi; y R4 representa 2(R)-hidroxiindan-1 (S)-ilo; (S)-2-hidroxi-1-feniletilo; o 2-hidroxi-bencil

25 sustituido o no sustituido en la posición 4 por metoxi; en donde el ácido 2,4-diamino-3hidroxicarboxílico está en forma libre, es su sal farmacéuticamente aceptable o en una composición farmacéutica.

El alquilo sustituido o no sustituido preferiblemente es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono; por ejemplo metilo, etilo, isopropilo o terc-butilo; este es 30 especialmente de 1 o 4 átomos de carbono. El sustituyente es por ejemplo fenoxi, hidroxi o amino

protegido y no protegido.

Arilo sustituido o no sustituidoalquilo es por ejemplo fenilalquilo de en conjunto 7 a 10 átomos de carbono, tal como bencilo o 2-feniletilo. Este se sustituye o no se sustituye en el grupo funcional arilo o alquilo mediante por ejemplo hidroxi, tal como en bencil-CH(OH)-o fenilo CH(CH2OH)-, mediante alquilo, amino o alquilamino; o es por ejemplo naftilalquilo de 1 a 4 átomos de carbono en la parte alquileno, especialmente naftilmetilo.

Un grupo protector amino preferiblemente es benciloxicarbonilo, cicloalquilalcoxicarbonilo, especialmente ciclohexilmetoxicarbonilo, o terc-butoxicarbonilo. Heteroarilo sustituido o no sustituidoalquilo preferiblemente es piridilalquilo, especialmente 2-piridilmetilo y 4-piridilmetilo.

Las partes arilo, heteroarilo y arilo de arilalquilo y heteroarilalquilo pueden ser mono-o policíclicas, tal como por ejemplo piridilo, naftilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC) o benzimidazolil. La parte alquileno de arilalquilo o heteroarilalquilo se puede sustituir mediante por ejemplo hidroxi.

Un grupo heterociclilo, y la parte heterociclilo de un grupo heterociclilalquilo, es un grupo heterocíclico saturado que tiene uno o más heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre. Este tiene preferiblemente 5 o 6 átomos constituyentes del anillo, y preferiblemente hasta 3 heteroátomos.

Cicloalquilalquilo preferiblemente es ciclohexilalquilo; este preferiblemente es de 1 a 4 átomos de carbono en la parte alquileno.

Halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo, preferiblemente cloro o bromo.

Alquilo y alcoxi preferiblemente son de 1 a 4 átomos de carbono, especialmente de 1 o 2 átomos de carbono, más especialmente metilo o metoxi.

Hidroxialcoxi preferiblemente es ω-hidroxialcoxi de 2 a 4 átomos de carbono, especialmente 2-hidroxietoxi.

Una sal es por ejemplo una sal de adición ácida tal como un clorhidrato.

Los compuestos de la Fórmula I tienen varios centros quirales y por lo tanto pueden existir en una variedad de estereoisómeros. La invención proporciona todos los estereoisómeros así como también mezclas racémicas a menos que se especifique otra cosa. Los isómeros se pueden resolver o separar mediante técnicas convencionales, por ejemplo cromatográficamente. Como aparece en la Fórmula I la configuración en el átomo de carbono que está en la posición 2 es R, en las posiciones 3 y 4 este es S.

R1 preferiblemente es hidrógeno, piridilalcoxicarbonilo, naftilalcoxicarbonilo, naftilalquilcarbonilo, bencil-CH (OH)-carbonilo, fenoximetilcarbonilo, fenilalquilcarbonilo o un grupo protector amino tal como terc.-butoxicarbonilo, cicloalquilalcoxicarbonilo, especialmente ciclohexilmetoxicarbonilo, o benciloxicarbonilo que se sustituye o no se sustituye mediante alquilo o amino; esto es especialmente naftilmetoxicarbonilo, naftilmetilcarbonilo, piridilmetoxicarbonilo, fenilpropionilo, aminofenilpropionilo, terc.-butoxicarbonilo, aminobencifoxicarbonilo, alquilbenciloxicarbonilo, dialquilbenciloxicarbonilo o benciloxicarbonilo, aún más preferiblemente benciloxicarbonilo.

Cuando A es un grupo funcional aminoacilo sustituido o no sustituido, este es preferiblemente un grupo funcional α-aminoacilo sustituido o no sustituido tal como alanina, leucina, isoleucina, asparagina, valina, terc-butilglicina, terc-leucina o histidina. Este preferiblemente es el grupo funcional protegido o no protegido de un α-aminoácido natural, preferiblemente de un aminoácido que es una parte constitutiva normal de proteínas, o terc leucina. Este preferiblemente tiene la configuración L. A es especialmente glicina, L-valina, L-tercleucina o un enlace, aún más preferiblemente L-terc-leucina.

R2 preferiblemente es la cadena natural de un aminoácido natural, preferiblemente de un αaminoácido, preferiblemente de un aminoácido que es una parte constitutiva normal de proteínas. Esto es por ejemplo isopropilo, aminocarbonilometilo, metilo, 1-metilpropilo, bencilo, 4-hidroxibencil o isobutilo, preferiblemente bencilo.

Cuando B es un grupo funcional aminoacilo sustituido o no sustituido, este es preferiblemente un grupo funcional α-aminoacilo sustituido o no sustituido, tal como fenilalanina, 5 valina, leucina, isoleucina, alanina o asparagina. Este es preferiblemente el grupo funcional sustituido

o no sustituido de un α-aminoácido natural, preferiblemente de un aminoácido que es una parte constitutiva normal de proteínas. Los α-aminoácidos con un segundo grupo carboxilo, por ejemplo ácido glutamínico, se esterifican preferiblemente con un alcohol C1-C3, especialmente metanol. Este tiene preferiblemente la configuración L. B es especialmente L-valina, metil éster de ácido L

10 glutamínico o un enlace, aún más preferiblemente L-valina. R3 preferiblemente es halógeno, metilo o metoxi, especialmente metoxi. R4 preferiblemente es 2(R)-hidroxiindan-1(S)-il o 2-hidroxibencil sustituido o no sustituido como se definió anteriormente, especialmente 2-hidroxi-4-metoxi-bencilo. Y preferiblemente es -CO-o -O-CO-, especialmente -O-CO-.

15 R5 preferiblemente es un alquilo sustituido o no sustituido, grupo arilalquilo o heteroarilalquilo, especialmente alquilo; cuando este es heteroarilalquilo sustituido o no sustituido este es preferiblemente piridilalquilo, especialmente 2-piridilmetilo; cuando este es alquilarilo sustituido o no sustituido este es preferiblemente bencil-CH(OH)-; cuando este es alquilo sustituido este es preferiblemente fenoximetilo.

20 En algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma es un derivado de amida de ácido 2-amino3-hidroxi-4-terc-leucil-amino-5-fenil-pentanoico. Ver, por ejemplo, PCT 01/89282. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el inhibidor proteasoma de la invención se relaciona con los compuestos de la Fórmula XV

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25 en donde n es 0 o 1; R1 y R2 son independientemente uno del otro un radical alifático, o un radical aromático, aromático-alifático, cicloalifático, cicloalifático-alifático, heterocíclico o heterocíclico-alifático, cada radical tiene no más de 20 átomos de carbono; R3 es hidrógeno, oxa-alquilo, un radical alifático o un radical con hasta 20 átomos de carbono

30 de la Fórmula -(Y)m-R6, en donde Y es alquilo, m es 0 o 1 y R6 es un radical monocíclico sustituido o no sustituido con 5 o 6 miembros del anillo que contienen hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre, en donde dicho radical monocíclico también se puede fusionar en un anillo benzo; R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno; un radical

35 alifático; libre, hidroxi eterificado o esterificado; libre o carboxi esterificado; formilo; alcanol; no sustituido, amino mono-o disustituido; mercapto; sulfo; alquil-tio; carbamoilo; N-alquil-carbamoilo; N,N-di-alquil-carbamoilo; ciano y nitro; en donde el carbono que contiene los radicales R4 y R5 tienen hasta 12 átomos de carbono, con la condición que R4 y R5 no son hidrógeno si n es 1, R1 es bencilo o terc-butilo, R2 es bencilo o 4-metoxibencilo, R3 es isopropilo y X es oxígeno y que R4 no es metoxi si n es 0 o 1, R2 ss 4-metoxi-bencilo, R3 es hidrógeno y X es oxígeno; y

X es nitrógeno, oxígeno o azufre;

o sus sales.

dentro del contexto de los derivados de amida de ácido 2-amino-3-hidroxi-4-terc-leucilamino-5-fenil-pentanoico, los términos generales utilizados aquí anteriormente y adelante tienen preferiblemente los siguientes significados: n es 0 o 1, preferiblemente 0.

Un radical alifático tiene hasta 12 átomos de carbono, preferiblemente hasta 7 átomos de carbono, más preferiblemente hasta 4 átomos de carbono, y es tal un radical de hidrocarburo alifático sustituido o no sustituido, que es por decir tal un alquinilo sustituido o no sustituido, alquenilo o preferiblemente radical alquilo, uno o más sustituyentes preferiblemente se seleccionan independientemente del grupo que consiste de libre, hidroxi eterificado o esterificado; libre o carboxi esterificado; formilo; alcanol; no sustituido, amino mono-o disustituido; guanidino; mercapto; sulfo; alquil-tio; carbamoilo; N-alquil-carbamoilo; N, N-di-alquil-carbamoilo; ciano y nitro.

Un radical alifático R1 es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente terc-butilo.

Un radical alifático R3 es preferiblemente alquilo inferior no sustituido o alquilo inferior sustituido por hidroxi, carboxi, amino, carbamoilo, guanidino, mercapto o alquil-tio, más preferiblemente una cadena lateral de los aminoácidos alanina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina o arginina, especialmente valina.

Un radical alifático R4 es preferiblemente metoxi.

Un radical aromático R1 o R2 tiene no más de 20 átomos de carbono, especialmente no más de 12 átomos de carbono, y se sustituye o no se sustituye, preferiblemente en cada caso fenilo o naftilo sustituido o no sustituido, especialmente 1-naftilo, uno o más sustituyentes preferiblemente se seleccionan independientemente del grupo que consiste de un radical alifático; libre, hidroxi eterificado o esterificado; libre o carboxi esterificado; formilo; alcanol; no sustituido, amino mono-o disustituido; mercapto; sulfo; alquil-tio; carbamoilo; N-alquil-carbamoilo; N, N-di-alquil-carbamoilo; ciano y nitro, más preferiblemente se seleccionan de alquilo, por ejemplo metilo, etilo o propilo; alcoxi, por ejemplo metoxi o etoxi; amino disustituido, por ejemplo dimetilamino; halógeno, por ejemplo cloro o bromo; y halógeno-alquilo, por ejemplo trifluorometilo.

En un radical aromático-alifático R1 o R2 que no tiene más de 20 átomos de carbono el grupo funcional aromático es como se definió anteriormente y el grupo funcional alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C1-C2, que se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no se sustituye. Un radical aromático-alifático R1 es preferiblemente bencilo o naftalen-1-ilmetilo. Un radical aromático-alifático R2 es preferiblemente bencilo sustituido en el grupo funcional benceno mediante 1-5, preferiblemente mediante 1-3 grupos metoxi; bencilo sustituido en el grupo funcional benceno, preferiblemente en la posición 4, mediante un grupo dimetil-amino; o naftalen-1-ilmetilo. Más preferiblemente un radical aromático-alifático R2 es 2,3,4-o 3,4,5-trimetoxi-bencil.

Un radical cicloalifático R1 o R2 tiene hasta 20, especialmente hasta 10 átomos de carbono, es mono-o policíclico y se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no sustituido, por ejemplo tal un radical cicloalquilo, especialmente tal un radical cicloalquilo de 5-o 6 miembros, tal como preferiblemente ciclohexilo.

En un radical cicloalifático-alifático R1 o R2 no más de 20 átomos de carbono el grupo funcional cicloalifático es como se definió anteriormente y el grupo funcional alifático alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C1-C2, que se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no sustituido, por ejemplo ciclohexil-metilo.

Un radical heterocíclico R1 o R2 contiene hasta 20 átomos de carbono, generalmente hasta 12 átomos de carbono, y se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o no sustituido y es preferiblemente un radical monocíclico saturado o insaturado tiene 5 o 6 miembros del anillo y 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre, por ejemplo, tienilo o piridilo, o un radical bi-o tricíclico en donde, por ejemplo, un radical benceno se fusiona con el radical monocíclico mencionado, especialmente, por ejemplo, indolilo, tal como 5-indolilo, o quiinolilo, tal como 8-quinolilo.

En un radical heterocíclico-alifático R1 o R2 que no tiene más de 20 átomos de carbono el grupo funcional heterocíclico es como se definió anteriormente y el grupo funcional alifático es preferiblemente alquilo inferior, tal como especialmente alquilo C1-C2, que se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no se sustituye. Un radical heterocíclico-alifático R1 o R2 es por ejemplo indolil-metilo, especialmente 5-indolil-metilo, o quinolil-metilo, especialmente 8-quinolil-metilo.

Oxa-alquilo R3 es un radical de la Fórmula -G(O-CH2-CH2)t-R7, en el que G y R7 son alquilo, preferiblemente alquilo inferior, y t es 1 a 3, preferiblemente 2, y es especialmente 2-(1,4-dioxahexil)-etilo.

En un radical de la Fórmula -(Y)m-R6 que tiene hasta 20 átomos de carbono, Y es alquilo, preferiblemente alquilo inferior, m es 0 o 1 y el radical R6 es un radical monocíclico saturado o insaturado que tiene 5 o 6 miembros del anillo y hasta 3 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de nitrógeno, oxígeno y azufre y alternativamente que contiene un anillo benzo fusionado, tal un radical se sustituye preferiblemente como se define para el radical aromático o preferiblemente no sustituido.

Un radical R6 se une preferiblemente a Y por medio de un átomo de carbono del anillo y es por ejemplo un miembro sustituido o no sustituido seleccionado del grupo que consiste de ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentadienilo, fenilo, pirrolidilo, pirazolidilo, imidazolidilo, tetrahydrofurilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, furilo, tienilo, piridilo, pirazinilo, piridazinilo, pirimidinilo, indenilo, naftilo, indolilo y quinolilo.

Más preferiblemente un radical de la Fórmula -(Y)m-R6 es piperidilo, especialmente 4piperidilo, piperazin-etilo, especialmente piperazin-1-iletilo, morfolinil-etilo, especialmente morfolin4-iletilo, piridil-metilo, tal como 2-, 3-o 4-piridil-metilo, o una cadena lateral de los aminoácidos fenilalanina, tirosina, triptofano o histidina.

X es preferiblemente oxígeno (-O-).

Alquilo es preferiblemente alquilo inferior.

Alquilo inferior es, por ejemplo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, tercbutilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo o n-heptilo, preferiblemente isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, isopropilo, etilo o metilo, más preferiblemente isobutilo, etilo o metilo.

hidroxi eterificado es, por ejemplo, alcoxi, especialmente alcoxi inferior, tal como etoxi o metoxi. El hidroxi esterificado es preferiblemente hidroxi esterificado por un ácido carboxílico orgánico, tal como ácido alcanoico, o un ácido mineral, tal como un ácido hídrohálico, por ejemplo alcanoiloxi inferior o especialmente halógeno, tal como yodo o especialmente flúor, cloro o bromo.

Alcanol es, por ejemplo, alquilcarbonilo, especialmente alquilcarbonilo inferior, tal como por ejemplo acetilo.

Amino mono-o disustituido es, por ejemplo, N-alquilamino o N, N-dialquilamino, especialmente N-alquilamino inferior o N,N-di-alquilamino inferior, tal como por ejemplo Nmetilamino o N,N-dimetilamino.

La estructura de la Fórmula XV como se mostró anteriormente indica la configuración absoluta.

Los grupos formadores de sal en un compuesto de la Fórmula XV son grupos o radicales que tienen propiedades acídicas o básicas. Los compuestos que tiene por lo menos un grupo básico o por lo menos un radical básico, por ejemplo un grupo amino libre, un radical pirazinilo o un radical piridilo, puede formar sales de adición ácida, por ejemplo con ácidos inorgánicos, tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico o un ácido fosfórico, o con ácidos carboxílicos orgánicos adecuados o ácidos sulfónicos, por ejemplo ácidos mono o dicarboxílicos alifáticos, tal como ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico o ácido oxálico, o aminoácidos tal como arginina o lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tal como ácido benzoico, ácido 2-fenoxi-benzoico, ácido 2-acetoxi-benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácidos carboxílicos aromáticos-alifáticos, tal como ácido mandélico o ácido cinnámico, ácidos carboxílicos heteroaromáticos, tal como ácido nicotínico o ácido isonicotínico, ácidos sulfónicos alifáticos, tal como metano-, etano-o ácido 2-hidroxietanosulfónico, o ácidos sulfónicos aromáticos, por ejemplo benceno-, ácido p-tolueno o naftaleno-2-sulfónico. Cuando están presentes varios grupos básicos se pueden formar sales de adición mono-o poli-ácidas.

Los compuestos de la Fórmula XV tienen grupos acídicos, por ejemplo un grupo carboxi libre en el radical Rio, puede formar sales de metal o amonio, tal como sales de metal álcali o metal alcalinotérreo, por ejemplo sales de sodio, potasio, magnesio o calcio, o sales de amonio con amoniaco o aminas orgánicas adecuadas, tal como monoaminas terciarias, por ejemplo trietil-amina o tri-(2-hidroxietil)-amina, o bases heterocíclicas, por ejemplo N-etil-piperidina o N,N’-dimetilpiperazina.

Los compuestos de la Fórmula XV tienen grupos básicos y acídicos pueden formar sales internas.

Para los propósitos de aislamiento o purificación, así como también en el caso de compuestos que se utilizan adicionalmente como intermedios, también es posible utilizar sales farmacéuticamente inaceptables.

Solo se utilizan sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables para propósitos terapéuticos, sin embargo, y por lo tanto se prefieren aquellas sales.

Debido a la relación cercana entre los compuestos novedosos en forma libre y en la forma de sus sales, que incluye aquellas sales que se pueden utilizar como intermedios, por ejemplo en la purificación de los compuestos novedosos para su identificación, aquí atrás y adelante, cualquier referencia a los compuestos libres se debe entender que incluyen las sales correspondientes, según sea apropiado y conveniente.

VII. Administración y Composiciones Farmacéuticas

Los anticuerpos y agentes de la invención se pueden administrar directamente al sujeto mamífero para tratamiento, por ejemplo, de trastornos hiperproliferativos que incluyen cáncer tal como, pero no limitado a: carcinomas, gliomas, mesoteliomas, melanomas, linfomas, leucemias, adenocarcinomas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervical, glioblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata, y linfoma de Burkitt, cáncer de cuello y cabeza, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer del esófago, cáncer de estómago, cáncer pancreático, cáncer hepatobiliar, cáncer de vesícula, cáncer del intestino delgado, cáncer rectal, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer del pene, cáncer uretral, cáncer testicular, cáncer cervical, cáncer vaginal, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer tiroide, cáncer paratiroide, cáncer adrenal, cáncer pancreático endocrino, cáncer carcinoide, cáncer óseo, cáncer de piel, retinoblastomas, mielomas múltiples, linfoma de Hodgkin, y linfoma no Hodgkin (ver, CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V.T. et al. eds 1997) para cáncer adicionales).

La administración de las composiciones de la presente invención es mediante cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir un compuesto quimioterapéutico en contacto íntimo con el tejido a ser tratado. Los anticuerpos y agentes se administran en cualquier forma adecuada, opcionalmente con portadores farmacéuticamente aceptables. Los métodos adecuados para administrar tales anticuerpos y agentes están disponibles y son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y, aunque más de una ruta se puede utilizar para administrar una composición particular, una ruta particular puede proporcionar frecuentemente una reacción más inmediata y más efectiva que la otra ruta.

Se determinan portadores farmacéuticamente aceptables en parte por la composición particular a ser administrada, así como también por el método particular utilizado para administrar la composición. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (ver, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)).

Los anticuerpos y agentes, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden hacer en formulaciones de aerosol (es decir, ellos se pueden "nebulizar") a ser administradas mediante inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores presurizados aceptables, tal como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares.

Las formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, amortiguantes, bacterioestatos, y solutos que presentan la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, y conservantes. En la práctica de esta invención, se pueden administrar composiciones, por ejemplo, mediante oralmente, tópicamente, intravenosamente, intraperitonealmente, intravesicalmente o intratecalmente. Opcionalmente, las composiciones se administran nasalmente. Las formulaciones de las composiciones se pueden presentar en contenedores sellados de dosis unitaria o multidosis, tal como ampollas y frascos. Se pueden preparar soluciones y suspensiones de polvos estériles, gránulos, y comprimidos del tipo descrito previamente. Los moduladores también se pueden administrar como parte de una combinación con uno más agentes activos adicionales (por ejemplo, quimioterapéuticos) dependiendo de la terapia o efecto deseado.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para efectuar una respuesta benéfica en el sujeto durante el tiempo. La dosis se determinará mediante la eficacia de los moduladores particulares empleados y la afección del sujeto, así como también el peso corporal o área de superficie del área a ser tratada. El tamaño de la dosis también se determinará mediante la existencia, naturaleza, y grado de cualesquier efectos colaterales adversos que acompañan la administración de un compuesto particular o vector en un sujeto particular. La administración se puede llevar a cabo mediante dosis únicas o divididas.

El agonista de anticuerpo y el agente que induce apoptosis se pueden administrar en una mezcla o cada uno se puede administrar separadamente. El agente de anticuerpo y el agente que induce apoptosis se pueden, pero no necesariamente, administrar concurrentemente.

VIII. Inhibidores de apoptosis

Como se describe aquí, una variedad de los productos de gen inhibe (por ejemplo, las moléculas listadas en la primera porción de la Figura 27; y UbcH10) o promueven (por ejemplo, las moléculas listadas en la porción de fondo de la Figura 27) apoptosis inducida por TRAIL (e inducida por anti-DR5). Aquellos productos de gen que inhiben la apoptosis inducida por TRAIL se pueden objetivar con inhibidores para incrementar sinérgicamente la apoptosis inducida por TRAIL, o anticuerpos anti-DR5. De forma similar, aquellos productos de gen que promueven la apoptosis inducida por TRAIL se pueden objetivar con activadores para incrementar sinérgicamente la apoptosis inducida por TRAIL, o anticuerpos anti-DR5.

Alternativamente, los activadores de los productos de gen que inhiben la apoptosis inducida por TRAIL se pueden utilizar para reducir la apoptosis en donde y cuando esto es perjudicial. De forma similar, los inhibidores de aquellos productos de gen que promueven la apoptosis inducida por TRAIL también se pueden utilizar para reducir apoptosis en donde y cuando esto es perjudicial. Un tal trastorno es púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) (Kwaan, H. C., Semin. Hematol., 24:71 (1987); Thompson et al., Blood, 80:1890, (1992)). Se han reportado relaciones de mortalidad asociadas con TTP incrementado por los Centros de EE.UU. para el Control de la Enfermedad (Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84, 1995).

El plasma de pacientes afligidos con TTP (que incluyen pacientes VIH+ y VIH-) induce apoptosis de células endoteliales humanas de origen microvascular dérmico, pero no de origen de vaso grande (Laurence et al., Blood, 87:3245 (1996)). El plasma de pacientes TTP así contiene uno o más factores que inducen directamente o indirectamente apoptosis. Como se describe en la solicitud PCT WO97/01633 está presente TRAIL en el suero de pacientes TTP, y pueden jugar un papel en inducir apoptosis de células endoteliales microvasculares.

Otra microangiopatía trombótica es síndrome hemolítico-urémico (HUS) (Moake, J. L., Lancet, 343:393 (1994); Melnyk et al., Arch. Intern. Med. 155:2077, (1995)). Una realización de la invención se dirige al tratamiento la afección que se denomina frecuentemente como "HUS de adulto" (aunque este también puede afectar niños). Un trastorno conocido como HUS asociado con la diarrea de la niñez difiere en etiología de HUS de adulto.

Otras afecciones caracterizadas por coagulación de los vasos sanguíneos pequeños. Tales afecciones incluyen pero no se limitan a las siguientes: problemas cardiacos vistos en aproximadamente 5-10% de pacientes con SIDA pediátricos se considera que se involucran en la coagulación de vasos sanguíneos pequeños. El rompimiento de la microvasculatura en el corazón se ha reportado en pacientes con esclerosis múltiple. Como un ejemplo adicional, se contempla el tratamiento de lupus eritematoso sistémico (SLE).

IX. Eficacia predicha de tratamientos anti-cáncer con agonistas anti-DR5

Los inventores han descubierto que la expresión del producto de gen Myc es necesaria pero no suficiente para la eficacia de anticuerpos anti-DR5 para inducir apoptosis en células de tumor. De acuerdo con lo anterior, la expresión de Myc en células de tumor (por ejemplo, de una biopsia) proporciona un marcador para identificar células (y por lo tanto sujetos) que es improbable que para responder a terapias objetivo DR5. Específicamente, si las células de tumor expresan menos Myc que las células tipo natural, es menos probable que la terapia objetivo DR5 sea efectiva que si se expresa Myc en o por encima de los niveles de expresión tipo natural. Así, la presente invención proporciona métodos para determinar la eficacia de las terapias con base en anticuerpo del agonista anti-DR5 al obtener una muestra de células de tumor de un sujeto y detectar los niveles de expresión de Myc en las células, en donde un nivel de expresión tipo natural es menor que Myc lo que indica que las terapias reducirán o no la eficacia en células de tumor asesinas.

EJEMPLOS

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar adicionalmente la invención pero no limita su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica y se abarca por las reivindicaciones adjuntas.

Abreviaturas: abs. absoluto i-BuB(OH)2 ácido Isobutil-borónico DIEA N-Etildiisopropilamina DMF N,N-Dimetil-formamida equiv equivalentes Espectrometría de Masa de ES-MSElectrorociado EtOAc acetato de etilo h horas HPLC Cromatografía Líquida de Alto Desempeño MeOH metanol min minutos

p.f. punto de fusión MPLC Cromatografía Líquida de Medio de Presión Rf relación de valores frontales obtenidos por TLC sobre gel de sílice 60 F254 (Merck,

Darmstadt)

ta temperatura ambiente

TBTU tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-1-il)-NN,N’,N’-tetrametiluronio

TFA ácido trifluoroacético

TLC Cromatografía de Capa Delgada

tR tiempo de retención

Relaciones de eluyentes y otras mezclas de disolvente se dan en volumen por volumen (v/v),

si no se menciona de otra forma. Visualización de TLC:

Las manchas de TLC de compuestos o intermedios finales que no son detectables mediante irradiación UV se visualizan utilizando una solución de teñido de permanganato de potasio seguido al calentar la placa.

La composición de solución de teñido de permanganato de potasio: 2.5 g de KMn04

5 (Permanganato de potasio) (Fluka, Buchs, Suiza) en 800 ml de H2O y 200 ml de 1N H2SO4. Condiciones HPLC analíticas: Sistema 1 Gradiente lineal 2-100% CH3CN (0.1% TFA) y H2O (0.1% TFA) en 10 min + 2 min 100%

CH3CN (0.1%TFA); detección a 215 nm, velocidad de flujo 0.7 mL/min a 25˚C. Columna: Nucleosil

10 120-3 C18 (125 x 3.0 mm). Sistema 2 Gradiente lineal 20-100% de CH3CN (0.1 % TFA) y H2O (0.1 % TFA) en 7 min + 2 min

100% de CH3CN (0.1% TFA); detección a 215 nm, velocidad de flujo 1 mL/min a 30˚C. Columna: Nucleosil 100-3 C18HD (125 x 4 mm). 15 Sistema 3

Gradiente lineal 20-100% de CH3CN (0.1% TFA) y H2O (0.1% TFA) en 7 min + 2 min 100% de CH3CN (0.1% TFA); detección a 215 nm, velocidad de flujo 1 mL/min a 30˚C. Columna: Nucleosil 100-3 C8 HD (125 x 4 mm).

Esquema sintético 1 (Ejemplos 1 y 2):

imagen1

Ejemplo 1: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)5 butil]-butiramida

Etapa A: Una solución al 4N de HCl en dioxano (5.7 mL, 22.77 mMol, 30 equiv) se agrega a una solución fría (0 ˚C) de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}-carbámico ((A) en el Esquema sintético 1) (0.352 g, 0.759 mMol) en CH2Cl2 abs. (5.5 mL), bajo una atmósfera de argón.

10 La mezcla resultante se le deja calentar a ta y se agita durante 10 min. Se agrega 4N de HCl adicional

(1.9 mL, 7.59 mMol, 10 equiv). La mezcla de reacción se agita durante 10 min y se concentra para proporcionar el clorhidrato crudo como una espuma amarilla.

Etapa B: DIEA abs. (0.72 mL, 4.14 mMol, 5 equiv) se agrega en forma de gotas (1.9 mL/min) a una solución fría (0 ˚C) del clorhidrato crudo (0.331 g, 0.828 mMol), ácido (S)-2-(Bifenil3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico ((B) en el Esquema sintético 1) (0.518 g, 0.994 mMol,

1.2 equiv), y TBTU (0.292 g, 0.910 mMol, 1.1 equiv) en DMF abs. (3.0 mL), bajo una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se le deja calentar a ta, se agita durante 40 min y se vierte en 0 ˚C H2O (45 mL). El precipitado resultante se recolecta mediante filtración por vacío, disuelto en EtOAc y se lava con H2O. La fase orgánica se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. El residuo se purifica mediante gel de sílice (25 g) de cromatografía de columna (CH2Cl2/MeOH, 90/10) para proporcionar el compuesto del título como una espuma amarilla.

Compuesto del título: ES-MS: 754.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.85 min (Sistema 1); Rf= 0.72 (CH2Cl2/ MeOH, 90/10). Los materiales de partida se preparan como sigue:

(a) ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (para Etapa B) El compuesto del título se prepara al calentar una suspensión de 3-bromobifenil (1.47 mL,

8.54 mMol, Aldrich 25,538-6), ácido (S)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (3,4,5-OCH3phe-OH) (3.27g, 12.81 mMol), K2CO3 (1.18g, 8.54 mMol) y CuI (163 mg, 0.854 mMol) en DMF abs.

(10.6 mL) durante 24 h a 90 ˚C, bajo una atmósfera de argón. La mezcla resultante se le permita enfriar a ta, luego se concentra in vacuo y se purifica mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) para proporcionar el compuesto del título.

Compuesto del título: ES-MS: 408.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 8.86 min (Sistema 1).

(b) ácido (S)-2-Amino-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (L-3,4,5-Trimetoxi-fenilalanina)

El compuesto del título se prepara de 3,4,5-trimetoxibenzaldehyde comercialmente disponible y N-acetilglicina de acuerdo con un procedimiento de la literatura (E.M. Oltz, R. C. Bruening, M. J. Smith, K. Kustin y K. Nakanishi in J. Am. Chem. 1998, 110 (18), 6162-6172). La resolución del metl éster N-acetil-3,4,5-trimetoxi-fenilalanina racémico se desarrolla mediante hidrólisis catalizada por enzima del L-éster utilizando Alcalase® (Novo Nordisk) como se describe en la literatura (J.J. Nestor, Jr., T. L. Ho, R. A. Simpson, B. L. Horner, G. H. Jones, G. I. McRae y B. H. Vickery in J. Med. Chem. 1982, 25 (7), 795-801; o O. D. Tyagi & P. M. Boll in Indian J. Chem. 1992, pp. 851-854).

Compuesto del título: [α]D20 = -18.9˚ (c =1.025, H2O); ES-MS: 256.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 2.08 min (Sistema 2).

(c) terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}-carbámico

El compuesto del título se prepara como se describe en etapa B del ejemplo 1 pero utilizando trifluoroacetato (S)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec4-il)-butilamonio ((C) en el Esquema sintético 1) (para preparación ver Kettner, C. A. y Shenvi, A. B.

J. Biol. Chem. 1984, 259, p. 15106-15114 y Matteson, D. S. y Sadhu, K. M. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, p. 5241-5242) (2.395 g, 6.32 mMol), Boc-L-valina (1.373 g, 6.32 mMol), TBTU (2.23 g, 6.95 mMol, 1.1 equiv), DIEA (3.3 mL, 18.95 mMol, 3.0 equiv) y DMF (24 mL).

Compuesto del título: ES-MS: 465.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.95 min (Sistema 1).

Ejemplo 2: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

i-BuB(OH)2 se agrega a una mezcla de (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-propionilamino]-3-metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S, 2S, 6R, 8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo [6.1.1.02,6] dec-4-il)-butil]-butiramida, metanol (4.3 mL), hexano (4.3 mL) y 1N HCl (1.45 mL). La mezcla de reacción se agita durante 2 h a ta y luego se diluye con metanol (8 mL) y hexano (8 mL). Las dos capas se separan. La capa de metanol se lava dos veces con hexano, se diluye con CH2Cl2, se lava conH2O, se seca (Na2SO4), se filtra y se concentra. El residuo se disuelve en CH2Cl2 y se purifica mediante gel de sílice (20 g) cromatografía de columna (CH2Cl2/MeOH, 80/20) para proporcionar el compuesto del título como una espuma amarilla pálida.

Compuesto del título: ES-MS: 618.2 [M-H]-; Rf= 0.03 (CH2Cl2/MeOH, 95/5). Esquema sintético 2 (Ejemplos 3 y 4):

imagen1

Ejemplo 3: (S)-3-Metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.102,6]dec-4-il)-butil]-2 -[(S)-2 -[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)10 propionilamino]-butramida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}carbámico ((A) en el Esquema sintético 2) mediante reiteración del procedimiento de 2 etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-tercButoxicarbonilamino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico ((D) en el Esquema sintético 2) y ácido (3Fenoxi-fenil)-acético ((F) en el Esquema sintético 2) (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente. El compuesto del título se obtiene como un sólido blanco.

Compuesto del título: ES-MS: 812.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.13 min (Sistema 1); Rf= 0.41 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 3.1: ácido (S)-2-Amino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico (L-2,3,4-Trimetoxifenilalanina)

El compuesto del título se prepara como se describe para ácido (S)-2-Amino-3-(3,4,5trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1).

Compuesto del título: ES-MS: 256.1 [M+H]+; HPLC: tR= 2.54 min (Sistema 2); [α]D20= 18.5˚ (c = 0.99, H2O).

Etapa 3.2: ácido S)-2-terc-Butoxicarbonilamino-3-(2,3,4-trimetoxi.fenil)-propiónico

El compuesto del título se sintetiza partiendo de ácido (S)-2-Amino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propiónico de acuerdo con un procedimiento conocido en la técnica (M. Bodanszky in Principles of Peptide Synthesis, Akad.-Verlag, 1984).

Compuesto del título: ES-MS: 356.1 [M+H]+; HPLC: tR= 5.35 min (Sistema 1); [α]D20= 2.5˚ (c = 0.985, MeOH).

Ejemplo 4: ácido (R)-3-Metil-1 -{(S)-3-metil-2 -[(S)-2 -[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-3(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-butirilamino}-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en ejemplo 2; ES-MS: 676.0 [M-H]-; Rf= 0.025 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 5: (S)-3-Metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-2 -[(S)-2-(3-fenil-propionil-amino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propionilamino]-butiramida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}carbámico mediante reiteración del procedimiento de dos etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(terc-butiloxicarbonil-amino)-3-(2,3,4-trimetoxifenil)-propiónico y ácido 3-Fenil-propiónico (Fluka, Buchs, Suiza) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente.

Compuesto del título: ES-MS: 734.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.25 min (Sistema 1); Rf= 0.41 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Ejemplo 6: ácido (R)-3-Metil-1 -{(S)-3-metil-2 -[(S)-2-(3-fenil-propionilamino)-3-(2,3,4trimetoxi-fenil)-propionilamino]-butirilamino}-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 598.2 [M-H]-; Rf= 0.025 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 7: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)-propionilamino]-3-metil-N [(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclor[6.1.102,6]dec-4-il)-bulil]butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxifenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 694.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 12.01 min (Sistema 1); Rf= 0.56 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 7.1: ácido 2(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para el ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando O-metil-L-tirosina (Bachem). La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 348.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.52 min (Sistema 1).

Ejemplo 8: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 558.0 [M-H]-; HPLC: tR= 6.47 min (Sistema 3); Rf= 0.086 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 9: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-propionilamino]-3-metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclor[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 724.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.75 min (Sistema 1); Rf= 0.41 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 9.1: ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando 3-(3,4-dimetoxifenil)-L-alanina (Aldrich). La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 378.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.10 min (Sistema 1).

Ejemplo 10: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 588.2 [M-H]-; Rf= 0.090 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 11: (S)-2 -[(S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]3-metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6S,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 720.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.85 min (Sistema 1); Rf= 0.43 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 11.1: ácido (S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando 1-bromo-3-isopropilbenceno (Lancaster). La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 374.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 8.95 min (Sistema 1).

Ejemplo 12: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 584.3 [M-H];Rf= 0.13 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 13: (S)-3-Metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9 9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil-2 -[(S)-2-(3-piridin-2-il-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(3-Piridin-2-il-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 755.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.97 min (Sistema 1); Rf= 0.23 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 13.1: 2-(3-Bromo-fenil)-piridina

El compuesto del título se prepara de acuerdo con los procedimientos de la literatura: Zhang, Biliang, Breslow, Ronald Ester Hydrolysis by a Catalytic Ciclodextrin Dimer Enzyme Mimic con a Metallobipiridyl Linking Group. J. Am. Chem. Soc. (1997), 119(7), 1676-1681; M. Van der Sluis, V. Beverwijk, A. Termaten, F. Bickelhaupt, H. Kooijman, A.L. Spek Synthesis of Novel Phosphaalkene-Based Bidentate Ligands Mes*P:CH(3-R-Ar) (R = Piridil, Carbaldimino) y Formation of Three-Membered Palladacycles Mes*(Me)P-CH(3-R-Ar)-PdCl by Carbopalladation of the P: C Double Bond. Organometallics (1999), 18(8), 1402-1407.

Compuesto del título: ES-MS: 235.0 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 6.64 min (Sistema 1); Rf= 0.17 (Hexano/Et2O, 80/20).

Etapa 13.2: ácido (S)-2-(3-Piridin-2-il-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para el ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando 2-(3-Bromofenil)-piridina. La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 409.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 6.64 min (Sistema 1).

Ejemplo 14: ácido (R)-3-Metil-1 -{(S)-3-metil-2 -[(S)-2-(3-piridin-2-il-fenilamino)-3-(3,4,5trimetoxi-fenil)-propionilamino]-butirilamino}-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 619.2 [M-H]-; Rf= 0.044 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 15: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 754.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 12.08 min (Sistema 1); Rf= 0.66 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 15.1: ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para el ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando ácido (S)-2-Amino-3-(2,3,4trimetoxi-fenil)-propiónico. La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 408.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.42 min (Sistema 1).

Ejemplo 16: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 618.3 [M-H];Rf= 0.23 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 17: (S)-2 -[(S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-(bifenil-3-ilamino)-propionilamino]-3-metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-(bifenil-3-ilamino)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 770.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 12.45 min (Sistema 1); Rf= 0.74 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 17.1: ácido (8)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-(bifenil-3-ilamino)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para el ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando ácido (S)-2-Amino-3-(4-benciloxifenil)-propiónico (O-bencil-L-tirosina). La purificación mediante MPLC (CH3CN/H2O/TFA) proporciona el compuesto del título; ES-MS: 424.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 10.40 min (Sistema 1).

Ejemplo 18: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-(bifenil-3-ilamino)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 633.9 [M-H]-; Rf= 0.65 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

Ejemplo 19: (R)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(R)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}-carbámico.

Compuesto del título: ES-MS: 754.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.73 min (Sistema 1); Rf= 0.52 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 19.1: terc-butil éster de ácido {(R)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2,6R,8S)-2,9,9trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}-carbámico

El compuesto del título se prepara como se describe para terc-butil éster de ácido {(S)-2Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico (ejemplo 1 (c)) pero utilizando Boc-D-valina (Fluka).

Compuesto del título: ES-MS: 465.4 [M+H]+.

Ejemplo 20: ácido (R)-1 -{(R)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 618.2 [M-H]-; Rf= 0.088 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 21: (S)-2 -[(R)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (R)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 754.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.71 min (Sistema 1); Rf=0.67 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 21.1: ácido (R)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se prepara como se describe para ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico (ejemplo 1) pero utilizando ácido (R)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-propiónico (3,4,5-OCH3-phe-OH).

Compuesto del título: ES-MS: 408.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 9.10 min (Sistema 1). Para la síntesis de ácido (R)-2-amino-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico ver ejemplo 1.

Después de la resolución enzimática, el D-aminoácido-metiléster restante se hidrolisa y se desacetila utilizando los protocolos conocidos en la técnica; [α]D20= + 19.7˚ (c =1.04, H2O) ES-MS:

256.2 [M+H]+; pico único a tR= 2.11 min (Sistema 2). Ejemplo 22: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(R)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metilbutilamino}-3-metil-butilborónico El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 618.2 [M-H]-; Rf= 0.20 (CH2Cl2/MeOH, 90/10). Ejemplo 23: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N -[3-metil-1-(4,4,5,5-tetrametil -[1,3,2] dioxaborolan-2-il)-butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[3-metil-1-(4,4,5,5-tetrametil -[1,3,2]dioxaborolan-2-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico.

El compuesto del título se obtiene como un producto crudo; ES-MS: 702.3 [M+H]+; HPLC: tR= 10.31 min (Sistema 1).

Etapa 23.1: terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[3-metil-1-(4,4,5,5-tetrametil [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-butilcarbamoil]-propil}-carbámico

El compuesto del título se prepara en analogía a la síntesis de terc-butil éster de ácido {(S)-2Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico (ejemplo 1 (c)).

Compuesto del título: ES-MS: 413.3 [M+H]+.

Ejemplo 24: ácido 1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 618.2 [M-H]-; Rf= 0.076 (CH2Cl2/MeOH, 95/5); HPLC: dos picos a tR= 6.23 min y 6.36 min (relación 1:1) (Sistema 3).

Ejemplo 25: (S)-2 -{(S)-3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-2 -[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]propionilamino}-3-metil-N-(R)-3-metil-(1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-butiamida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}carbámico mediante reiteración del procedimiento de dos etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando Boc-L-3,4-dimetoxifenilalanina (Synthetech) y ácido (3Fenoxi-fenil)-acético (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente. El compuesto del título se obtiene como una espuma; ES-MS: 782.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.76 min (Sistema 1); Rf= 0.61 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

Ejemplo 26: ácido (R)-1-((S)-2 -{(S)-3-(3,4-Dimetoxi-fenil)-2 -[2-(3-fenoxi-fenil)acetilamino]-propionilamino}-3-metil-butirilamino)-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 646.2 [M-H]-; HPLC: pico único a tR= 5.90 min (Sistema 3); Rf= 0.12 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

Ejemplo 27: (S)-3-Metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-2 -[(S)-2 -[2-(3 -fenoxi-fenil)-acetilamino]-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-propionilamino]-butiramida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}carbámico mediante reiteración del procedimiento de dos etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-terc-Butoxicarbonilamino-3-(3,4,5trimetoxifenil)-propiónico y ácido (3-Fenoxi-fenil)-acético (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente. El compuesto del título se obtiene como una espuma amarilla; ES-MS: 812.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.36 min (Sistema 1); Rf= 0.53 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etapa 27.1: ácido (S)-2-terc-Butoxicarbonilamino-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico

El compuesto del título se sintetiza como se describe para ácido (S)-2-tercButoxicarbonilamino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico (Ejemplo 3) pero partiendo de ácido (S)-2Amino-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 356 [M+H]+; HPLC: tR= 4.83 min (Sistema 2); p.f.= 76-80 ˚C; [α]D20= +13.4˚ (c =1.01, metanol).

Ejemplo 28: ácido (R)-3-Metil-1 -{(S)-3-metil-2 -[(S)-2 -[2-(3-fenoxi-fenil)-acetilamino]-3(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-butirilamino}-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 676.2 [M-H];Rf= 0.14 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 29: (S)-2 -{(S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2 -[2-(3-benciloxi-fenil)-acetilamino]propionilamino}-3-metil-N -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-butiramida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-propil}carbámico mediante reiteración del procedimiento de dos etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-terc-butoxicarbonilaminopropiónico y ácido (3-Fenoxi-fenil)-acético (Trans World Chemicals, Inc.; Rockville, MD, USA) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente. El compuesto del título se obtiene como una espuma beige; ES-MS: 842.0 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 12.19 min (Sistema 1); Rf= 0.37 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Etapa 29.1: ácido (S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2-terc-butoxicarbonilamino-propiónico

El compuesto del título se sintetiza como se describe para ácido (S)-2-tercButoxicarbonilamino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico (Ejemplo 3) pero partiendo de O-Bencil-Ltirosina (Fluka).

Compuesto del título: ES-MS: 370.1 [M-H]-; HPLC: tR= 9.23 min (Sistema 1).

Ejemplo 30: ácido (R)-1-((S)-2 -{(S)-3-(4-Benciloxi-fenil)-2 -[2-(3-benciloxi-fenil)acetilamino]-propionilamino}-3-metil-butirilamino)-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 705.8 [M-H]-; Rf= 0.12 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 31: ácido (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-4-metil-pentanoico [(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-amida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-3-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-butil}-carbámico.

Compuesto del título: ES-MS: 768.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.79 min (Sistema 1); Rf= 0.72 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 31.1: terc-butil éster de ácido {(S)-3-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-butil}-carbámico

El compuesto del título se prepara como se describe para terc-butil éster de ácido {(S)-2Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico (ejemplo 1 (c)) pero utilizando Boc-L-leucina.

Compuesto del título: ES-MS: 479.2 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 10.05 min (Sistema 1).

Ejemplo 32: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-4-metil-pentanoilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 632.2 [M-H];Rf= 0.15 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 33: ácido (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-propionilamino]4-metil-pentanoico [(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butil]-amida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-3-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-butil}-carbámico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3(3,4-dimetoxi-fenil)-propiónico. Compuesto del título: ES-MS: 738.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.76 min (Sistema 1); Rf= 0.59 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 34: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-4-metil-pentanoilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 602.2 [M-H];Rf= 0.14 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 35: ácido (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)-propionilaminol-4metil-pentanoico [(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec4-il)-butil]-amida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-3-Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-butil}-carbámico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4metoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 708.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 12.03 min (Sistema 1); Rf= 0.70 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 36: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)propionilamino]-4-metil-pentanoilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 572.1 [M-H]-; Rf= 0.25 (CH2Cl2/MeOH, 90/10).

Ejemplo 37: (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-N -{(S)-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[ 6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionamida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbámico.

Compuesto del título: ES-MS: 726.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.24 min (Sistema 1); Rf= 0.41 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Etapa 37.1: terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbámico

El compuesto del título se prepara como se describe para terc-butil éster de ácido {(S)-2Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico (etapa 1.1, ejemplo 1) pero utilizando Boc-L-alanina (Fluka).

Compuesto del título: ES-MS: 437.4 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 10.91 min (Sistema 1).

Ejemplo 38: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-propionilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 590.0 [M-H];Rf=0.12(CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 39: (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-N -{(S)-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[ 6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil} -3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propionamida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbámico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 726.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.71 min (Sistema 1); Rf= 0.45 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Ejemplo 40: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propionilamino]-propionilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 590.0 [M-H]-; Rf= 0.033 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 41: (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)-N -{(S)-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}propionamida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbánico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4metoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 666.3 [M+H]+; MPLC: pico único a tR= 11.63 min (Sistema 1); Rf= 0.46 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Ejemplo 42: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)propionilamino]-propionilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 530.3 [M-H]-; Rf= 0.051 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 43: (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)-N -{(S)-1 -[(R)-3-metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}propionamida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbámico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4dimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 696.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.39 min (Sistema 1); Rf= 0.53 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Ejemplo 44: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4-dimetoxi-fenil)propionilamino]-propionilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 560.2 [M-H]-; Rf= 0.023 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 45: (S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-N -{(S)-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionamida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}-carbámico y ácido (S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propiónico.

Compuesto del título: ES-MS: 692.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.49 min (Sistema 1); Rf= 0.24 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5).

Ejemplo 46: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(3-Isopropil-fenilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-propionilamino}-3-metil-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 560.2 [M-H]-; Rf=0.22 (CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 47: (S)-N -{(S)-1 -[(R)-3-Metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2.9.9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbarnoil]-etil}-2-(3-fenil-propionilamino)-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)propionamida

El compuesto del título se prepara de terc-butil éster de ácido {(S)-1 -[(R)-3-Metil-1((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-butilcarbamoil]-etil}carbámico mediante reiteración del procedimiento de dos etapas (desprotección/acoplamiento) descrito en el ejemplo 1 pero utilizando ácido (S)-2-Amino-3-(2,3,4-trimetoxi-fenil)-propiónico y ácido 3-Fenil-propiónico (Fluka) como los patrones en cada reacción de acoplamiento (etapa B, ejemplo 1), respectivamente. Compuesto del título: ES-MS: 706.3 [M+H]+; HPLC: pico único a tR=

10.81 min (Sistema 1); Rf= 0.32 (CH2Cl2/MeOH, 95/5). Ejemplo 48: ácido (R)-3-Metil-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(3-fenil-propionilamino)-3-(2,3,4trimetoxifenil)-propionilamino]-propionilamino}-butilborónico

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 570.3 [M-H]-; Rf=0.22(CH2Cl2/MeOH, 95/5).

Ejemplo 49: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilaminol-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)-propionilamino]-3metil-N-(R)-2-fenil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-etil]butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil 5 éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-2-fenil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)-etilcarbamoil]-propil}-carbámico. Compuesto del título: ES-MS: 788.0 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.66 min (Sistema 1); Rf= 0.79 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5). Etapa 49.1: terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-2-fenil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,910 trimetil-3,5-dioxa-4-bora-tricido[6.1.1.02,6]dec-4-il)-etilcarbamoil]-propil}-carbámico

El compuesto del título se prepara en analogía a la síntesis de terc-butil éster de ácido {(S)-2Metil-1 -[(R)-3-metil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-tricydo[6.1.1.02,6]dec-4-il)butilcarbamoil]-propil}-carbámico (ejemplo 1 (c)). Compuesto del título: ES-MS: 499.1 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 10.78 min (Sistema 1).

15 Ejemplo 50: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(3,4,5-trimetoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-2-fenil-etilborónico El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 652.2 [M-H];Rf=0.22(CH2Cl2/MeOH, 95/5). Ejemplo 51: (S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)-propionilamino]-3-metil-N 20 -[(R)-2-fenil-1-((1S,2S,6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-bora-triciclo[6.1.1.02,6]dec-4-il)etil]butiramida

El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 1 pero utilizando terc-butil éster de ácido {(S)-2-Metil-1 -[(R)-2-fenil-1-((1S,2S, 6R,8S)-2,9,9-trimetil-3,5-dioxa-4-boratriciclo[6.1.102,6]dec-4-il)-etilcarbamoil]-propil}-carbámico y ácido (S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4

25 metoxi-fenil)-propiónico. Compuesto del título: ES-MS: 727.9 [M+H]+; HPLC: pico único a tR= 11.87 min (Sistema 1); Rf= 0.73 (CH2Cl2/ MeOH, 95/5). Ejemplo 52: ácido (R)-1 -{(S)-2 -[(S)-2-(Bifenil-3-ilamino)-3-(4-metoxi-fenil)propionilamino]-3-metil-butirilamino}-2-fenil-etilborónico 30 El compuesto del título se prepara como se describe en el ejemplo 2; ES-MS: 591.8 [M-H]

;Rf= 0.13 (CH2Cl2/MeOH, 95/5). Ejemplo 53: Inhibición de la actividad similar a quimiotripsina de la proteosoma 20S Los valores IC50 de ejemplo determinados de acuerdo con la prueba descrita anteriormente

para los compuestos de la Fórmula I se dan adelante (Tabla 1). 35 Tabla 1

Ejemplo: IC50 [µm] (resultados de uno o dos experimentos) Ejemplo IC50 [µm] (resultados de uno o dos experimentos)

1: 0.0046/0.0024 28 0.0008

2: 0.0028/0.0021 29 0.004

3: 0.0017/0.0014 30 0.0059

4: 0.0019/0.0015 31 0.0022

5: 0.0013/0.0006 32 0.0037

6: 0.0018/0.0019 33 0.0026

7: 0.0029/0.0032 34 0.0013

8: 0.0028/0.0045 35 0.0023

9: 0.0017/0.0022 36 0.0023

10: 0.0029/0.004 37 0.0013

11: 0.0039 38 0.0017

12: 0.0038 39 0.0019

13: 0.0013 40 0.0022

14: 0.0017 41 0.0012

15: 0.0071 42 0019

16: 0.0059 43 0.0018

17: 0.0093 44 0.001

18: 0.0015 45 0.0013

21: 0.0015 46 0.0019

22: 0.0017 47 0.0008

23: 0.0021 48 0.0007

24: 0.0021 50 0.0023

25: 0.0008 51 0.0043

26: 0.001 52 0.005

27: 0.0003

Ejemplo 54: Como parte de nuestro desarrollo de ensayo para la detección anti-DR5, clonamos,

5 expresamos y purificamos el ligando Trail y se prueba en células Jurkat para determinar si podemos asesinar células con el ligando. El ensayo comprende Azul Alamar, un tinte redox que es fluorescente cuando las células vivas reducen en tinte. Cuando las células se matan mediante apoptosis, el ambiente resultante se oxida y el tinte no se reduce y no se puede detectar fluorescencia. Como se ilustra en la Figura 1, TRAIL induce apoptosis en células Jurkat.

10 Se desarrolla un detección para agonistas de anticuerpo. Se inmunizan ratones con el receptor DR5 y se fusionan células B en mielomas. Los hibridomas resultantes se disponen en placas 384 pozos y luego de varios días de crecimiento, se agrega 20 ml del sobrenadante y el anticuerpo reticulado se agrega a pozos que contienen células Jurkat. Veinticuatro horas después se agrega tinte azul alamar y 24 horas después se lee la placa utilizando un Acquest. Se identifican varias placas

15 positivas que contienen anticuerpos que reaccionan positivamente. Se prueba la especificidad de los anticuerpos positivos. Tres hibridomas que dan una señal positiva en el ensayo se subclonan, se expanden y se purifican. Se clonan veintiún receptores TNF, se expresan y se purifican. Los receptores se cubren en los pozos y los tres anticuerpos se someten a análisis ELISA. Los resultados muestran que los anticuerpos solo son reactivos con DR5, y así, son

20 muy específicos. Ver, Figura 2. La Figura 3 exhibe un análisis de respuesta de dosis. Los agonistas de anticuerpo 3 muestran diferentes respuestas de dosis con relación a la muerte de células Jurkat. El anticuerpo A (SEQ ID 6 +

SEQ ID 8) tiene la mejor potencia y así se selecciona para estudios adicionales. El Imgenex-257 es un anticuerpo específico DR5 que no tiene actividad funcional.

Se determina la activación de caspasa 3. Para determinar si el anticuerpo mata las células mediante apoptosis y no por algún mecanismo no específico o indirecto, corremos ensayos de actividad caspasa-3. Se mezcla el anticuerpo o ligando con células en varias concentraciones y se generan extractos celulares de las células tratadas. Se agrega un sustrato fluorescente al lisato, que se pude utilizar para probar la caspasa activa 3, un indicador de apoptosis. El anticuerpo estimulado por apoptosis en una forma similar al ligando. La Figura 4 exhibe los resultados.

Se determinan los efectos del anticuerpo DR5 en estirpes celulares de colon y melanoma. La Figura 5 muestra curvas de respuesta de dosis contra varias estirpes celulares de tumor adheridas. Todas las estirpes celulares son sensibles a los anticuerpos que inducen apoptosis DR5 excepto la estirpe celular HCT 116 bax/bax, que es incapaz de llevar a cabo apoptosis.

La Figura 6 exhibe el mismo experimento llevado a cabo en varios estirpes celulares de cáncer de mama. El T47D y ZR-75-1 son resistentes a la actividad tumoricida de DR5, aunque, son sensibles MCF-7 y MDA-MB-231.

La Figura 7 muestra que las células de tumor son sensibles a la acción del anticuerpo pero las células normales, fibroblastos de pulmón humano (HLF) y células epiteliales de vena umbilical humana (HCTVEC) son resistentes como se indica por su carencia de una respuesta de dosis.

Para demostrar adicionalmente el punto que las células normales no se matan por el anticuerpo, los fibroblastos de pulmón humano, células epiteliales mamarias humanas y hepatocitos humanos primarios normales se evalúan para actividad caspasa 3 luego de tratamiento con el anticuerpo DR5. Ninguna de las células normales muestra actividad aunque, el linfoma folicular DOHH2 y las células Jurkat muestran activación Caspasa asociada con apoptosis. Ver, Figura 8.

Adicionalmente, CaOV3, una estirpe celular de cáncer de ovario, se elimina por el anticuerpo, aunque, los HLF y HMEC normales no se afectan completamente por el anticuerpo DR5.

Se prueba la eficacia In vivo de los anticuerpos. Se inyectan diez ratones con 5x106 colo 205 (células de tumor de colon) subcutáneamente en el día 0. El tratamiento con el anticuerpo DR5 (400 mg) se inicia en el día 11. Después de 2 inyecciones con 400 mg de DR5 los 5 animales tratados no muestran evidencia de tumor aunque los 5 ratones que dan PBS tienen tumores grandes. Así el anticuerpo parece ser efectivo in vivo.

El estudio se continúa a través del Día 32. Los ratones no tratados tienen tumores grandes o mueren. Los ratones tratados no muestran enfermedad. El experimento se determina en el día 50. Todos los ratones tratados mueren. Ninguno de los tratados muestran ningún relapso en el día 50. La Figura 9 que exhibe el estudio de eficacia Colo 205 se muestra gráficamente. Las flechas se refieren a los días de tratamiento.

El experimento previo representa un estudio de dosis única. Para determinar la potencia del anticuerpo, se lleva a cabo un estudio de respuesta de dosis grande. El tamaño del grupo se expande a 8 ratones por grupo y se dan 50, 200, y 400 mg dosis como se describe en el estudio de dosis único previo. Los resultados indican que el anticuerpo es efectivo en dosis bajas (por ejemplo, 50 mg). Ver, Figura 10.

Un estudio de respuesta de dosis más pequeño en un nuevo modelo de tumor, también desarrolla estirpe celular de melanoma A2058. Esta estirpe celular es más resistente al anticuerpo in vitro. El tamaño del grupo es 2 ratones. Los ratones tratados (400 mg) muestran actividad tumoricida in vivo, aunque los ratones tratados con 20 mg o tumores grandes que establecen PBS. Ver, Figura 11.

Ya que diferentes estirpes celulares muestran varios grados de sensibilidad en el anticuerpo DR5, exploramos el desarrollo de sinergistas de molécula pequeña que sensibilizan las estirpes celulares resistentes o parcialmente resistentes a la acción del anticuerpo. Investigamos este problema al analizar las rutas apoptóticas, que puede determinar donde la apoptosis se puede bloquear potencialmente, y que los tipos de sinergistas de moléculas pequeña pueden ser pro-apoptóticos en naturaleza.

La Figura 12 describe las rutas intrínsecas y extrínsecas para apoptosis. Los puntos claves con inhibidores que sobreexpresan las células de tumor de apoptosis (IAP) y el Bcl2 que bloquea la liberación de proteína proapoptóticas clave (cito C y SMAC) de la mitocondria. Los bloques establecidos por estas proteínas pueden venir mediante la adición de SMAC. El SMAC inhibe los IAP. Un imitador de SMAC llamado LB 672 se prueba por su efecto sinérgico posible para sensibilizar las células de tumor en la acción del agonista DR5.

La Figura 13 muestra el efecto de las células de melanoma SMAC imitadoras en A2058. Previamente, mostramos que estas células son parcialmente sensibles al anticuerpo. Esta gráfica muestra que las células tratadas con el anticuerpo SMAC y DR5 tienen ablación completamente aunque el compuesto 672 prácticamente no tiene actividad por su cuenta.

La Figura 14 exhibe gráficas de respuesta de dosis que muestran los efectos de diferentes concentraciones de SMAC en células de A2058 melanoma. De nuevo, estas células de tumor son parcialmente resistentes, pero se sensibilizan en niveles bajos de SMAC (50-100 nM). Sin embargo, de manera más importante, las células HMEC o HLF se sensibilizan por el SMAC que imita LB672.

La Figura 15 muestra las propiedades farmacocinéticas de SMAC.

Se emplea una segunda estrategia sinergista para probar el uso de inhibidor de proteasoma como sinergistas DR4/DR5. Como se muestra en la Figura 16, el inhibidor de proteasoma evita la proteasoma para degradar 1κB. Esto a su vez evita la liberación de NFκB. El NFκB se conoce para translocar al núcleo e iniciar la transcripción de BCL2, IAPS, y otros factores antiapoptóticos.

Primero probamos si los inhibidores de proteasoma pueden sensibilizar las células de tumor en DR5 mediante la adición de MG132, un inhibidor proteasoma débil comercialmente disponible. La Figura 17 muestra que en concentraciones razonablemente altas, el MG 132 sensible es resistente a células de colon SW 480 para la acción del anticuerpo.

También obtenemos varios inhibidores de proteasoma potentes. Los compuestos que muestran los efectos mejores son los boronatos. Las dosis toleradas máximas demuestran que estos compuestos son relativamente tóxicos, y así existe una ventana amplia entre la toxicidad y la eficacia tumoricida in vivo. Ver, Figura 18.

Los inhibidores proteasoma sensibilizan A2058-LUC a los anticuerpos DR5. Ver, Figura 19. Los inhibidores proteasoma sensibilizan la estirpe celular de hematoma resistente HUH-7 a los anticuerpos muy bien. Ver, Figura 20. Sin embargo, el compuesto tiene un efecto en las células HMEC normales. Adicionalmente, estas células no se sensibilizan con la acción del anticuerpo. Ver,

Figura 21.

Las regiones variables del anticuerpo A de ratón DR5 A se clonan y se insertan en un sistema de expresión SP20. Estos vectores codifican el Fc IgG1 humano. La quimera humana resultante es 80% humana y 20% de ratón. Las secuencias de ácido nucleico de las regiones variables de cadena pesada y liviana se exhiben en la Figura 22. La secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada se exhibe en la Figura 35 (SEQ ID NO:6) y la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena liviana se exhibe en la Figura 35 (SEQ ID NO:8). La quimera se expresa en células SP2/0 a 20 pg/ célula/día. El anticuerpo quimérico humano resultante se reticula con un Fc antihumano de cabra y se prueba para actividad funcional. La quimera tiene actividad tumoricida funcional para el anticuerpo de ratón. Ver, Figura 21.

Ejemplo 55:

5 Una colección de moléculas de siARN se transfiere en las células, se ponen en contacto células con TRAIL y las células se detectan para alterar la viabilidad comparado con la ausencia de TRAIL. Las células con viabilidad alterada luego se utilizan para identificar el siARN particular transfectado en la célula, determinando por lo tanto el gen inhibido por el siARN. Ver, Figuras 26 y

27.

10 La Figura 28 ilustra productos de gen que corresponden a los siARN que se seleccionan con base en la detección. Los productos de gen cuya inhibición con siARN conduce a la relación TRAIL (+/-) baja son inhibidores de apoptosis inducida por TRAIL.

La Tabla 1 proporciona información adicional, que incluye los números de acceso Genbank, para los productos de gen identificados en la Figura 28. 15 Tabla 1

Anotación # acc Símbolo No trail relación Clasifica-Activadores de de tratado ción P apoptosis inducida por TRAIL

H.s plexina B1 NM_002673 PLXNB1 73.85 5.96 0.081 6.27E-05 (PLXNB1), mARN*

H.s.: Proteína 7 que NM_030648 SET7 79.06 7.30 0.092 0.000266 contiene el dominio SET (SET7), mARN

H.s.: quinasa de quinasa NM_005923 MAP3K5 86.84 8.58 0.099 0.000585 de quinasa 5 de la proteína activada por mitógeno (MAP3K5)

H.s.: Quinasa similar a NM_016281 JIK 86.41 8.67 0.102 0.000727 STE20 (JIK), mARN

H.s quinasa MAP que NM_003684 MKNK1 76.61 8.13 0. 105 0.000755 interactúa con quinasa 1 serina/treonina (MKNK1)

H.s. proteína de NM_052859 RFT1 77.39 7.99 0.105 0.000892 transmembrana multiespan de retículo endoplásmico putativo (RFT1) Homo sapiens XM_047620 PIP5K1C 83.06 8.88 0.107 0.001498 fosfatidilinositol-4fosfato 5-quinasa, tipo I, gama (PIP5K1C)

H.s proteína quinasa 2 NM_004759 MAPKAP 77.71 8.44 0.113 0.002227 activada por proteína K2

quinasa activada por

mitógeno

(MAPKAPK2),

variante de transcripto

1

H.s. proteína quinasa de: NM_002757 MAP2K5

quinasa 5 activada por

mitógeno (MAP2K5)

H.s. quinasa 6: NM_001259 CDK6

dependiente de ciclina

(CDK6), mARN

H.s. receptor activina A: NM_000020 ACVRL1

tipo II similar a I

(ACVRL1), mARN

H.s. homólogo de: NM_005248 FGR

oncogén (v-fgr) de

sarcoma viral de felino

Gardner-Rasheed

(FGR), mARN

H.s. proteína hipotética: NM_024644 FLJ21802

FLJ21802 (FLJ21802),

mARN

H.s quinasa tirosina del: NM_005592 MUSK

receptor musculo

esquelético (MUSK),

mARN"""

H.s. cromosoma 20: NM_080820 C20orf88

abierto al cuadro de

lectura 88 (C20orf88),

mARN

H.s gemación no: NM_004336 BUB1

inhibida por

benzimidazoles 1

(homólogo de levadura)

(BUB1), mARN"""

H.s proteína quinasa S6: NM_004755 RPS6KA5

ribosómica, 90kD,

polipéptido 5

(RPS6KA5), mARN"""

H.s homólogo de: NM_002350 LYN

oncogén relacionado

con sarcoma viral v

yes-1 Yamaguchi

(LYN), mARN"""

H.s. proteína quinasa 7: NM_002749.1 MAPK7

activada por

mitógeno(MAPK7),

mARN

H.s homólogo 1 de: NM_005163 AKT

94.66: 11.24 0.119 0.00381

84.10: 10.52 0.125 0.006206

84.64: 10.40 0.128 0.006776

106.43: 13.45 0.129 0.007914

96.15: 12.46 0.133 0.006866

96.32: 12.17 0.127 0.008166

76.58: 10.09 0.132 0.009842

75.76: 9.65 0.133 0.009722

77.84: 10.22 0.132 0.010693

62

SRP72: 77.23

CASP8: 99.30

Bid: 110.50

DR4: 87.26

BLK: 98.04

Como: 83.15

PKM2

GSK3A: 104.20

FLJ32312: 88.32

MAPK10/J

NK3

TCF4

ABL2

ROS1

MYC

71.11: 0.946 0.00073

84.45 91.95 70.90 77.87 60.32: 0.850 0.832 0.807 0.801 0.778 0.002444 0.003027 0.003725 0.004003 0.006752

76.91: 0.740 0.008469

65.01: 0.751 0.010144

oncogén vírico timoma

de murino v-akt

(AKT1), mARN""" Hs. partícula de reconocimiento de señal 72kD (SRP72), mARN

Inhibidores de apoptosis inducida por TRAIL NM_006947

Caspasa-8 Bid

DR4 Trail receptor 1

H.s: B tirosina quinasa linfoide (BLK), mARN

similar a Quinasa Piruvato, M2isozime (LOC148283),

H.s: quinasa alfa 3 de glucógeno sintasa (GSK3A), mARN

proteína hipotética FLJ32312 (FLJ32312),

H.s. proteína quinasa 10 activada por mitógeno (MAPK10), mARN

TCF4: factor de transcripción 4, LocusID: 6926

H.s: homólogo 2 de leucemia vírica de murino v-abl Abelson (arg, gen relacionado con Abelson) (ABL2), transcripto

H.s: homólogo 1 de oncogén de virus de sarcoma UR2 aviar v-ros (ROS1), mARN"

homólogo de oncogén vírico de mielocitomatosis aviar v-myc

NM_001228 NM_001196 NM_003844 NM_001715

XM_086132

NM_019884

NM_144709

NM_002753

NM_003199

NM_005158

NM_002944

NM_002467

Ejemplo 56:

Se identifican siARN que inhiben específicamente la expresión de Gsk3α o GSK3β, permitiéndonos por lo tanto determinar el efecto del producto de gen en apoptosis inducida por TRAIL. Como se ilustra en la Figura 29, la inhibición de Gsk3α, pero no de Gsk3β, reduce la

5 actividad Caspasa en las células comparado con controles. Así, el Gsk3α es un activador de apoptosis inducida por TRAIL. De forma similar, otros dos productos de gen SRP72 y FLJ32312, también se identifican como activadores de apoptosis.

La relación de varios componentes identificados aquí se proporciona en la Figura 30. La Figura ilustra la relación y efecto (por ejemplo, activador o inhibidor de apoptosis) de varios

10 componentes de la ruta de apoptosis inducida por TRAIL. Ejemplo 57: Una colección de siARN que objetiva 510 genes dispuesto en formato de 384 pozos se transfecta en células Hela. Las células se incuban durante 48 horas para permitir deterioro objetivo, y se trata con o sin TRAIL. Se mide la viabilidad 20 horas después de tratamiento de TRAIL utilizando

15 azul alamar. Se determina una relación de sensibilidad para cada siARN para comparación con un total de 60 valores obtenidos con siARN de control. Las células Hela tratadas con el ligando TRAIL resulta en -40% de reducción en la viabilidad cuando se mide mediante ensayos MTT en pozos de control. Se identifican siARN que inhiben significativamente o mejoran la muerte celular. Ver, Tablas 2 y 3, respectivamente.

20 Tabla 2-siARN inhibidores

Número acc.: Símbolo SR Valor p

NM_006947: SRP72 0.94 8.5E-22

NM_001715: BLK 0.79 5.9E-16

XM_086132: Como PKM2 0. 75 3.6E-14

NM_019884: GSK3A 0.73 3.6E-14

NM_144709: FLJ32312 0.72 1.8E-12

NM_002467: C-MYC 0.69 5.3E-11

NM_025133: FLJ12673 0.65 2.9E-09

NM_002944: ROS1 0.61 2.5E-08

NM_005158: ABL2 0.61 2.9E-08

NM_004705: DAP4 0.61 3.2E-08

NM_002753: JNK3 0.60 7.8E-08

NM_003199: TCF4 0.59 2.0E-07

NM_022575: VPS16 0.59 2. 1E-07

NM_000858: GUK1 0.59 3.3E-07

NM_006257: PRKCQ 0.55 8.9E-06

NM_006252: PRKAA2 0.54 5.3E-05

AK074085: FLJ00156 0.53 8.6E-05

NM_006254: PRKCD 0.53 1.0E-04

NM_001569: IRAK1 0.52 1.3E-04

NM_004422: DVL2 0.52 1.3E-04

Tabla 3 – siARN mejoradores

Número acc.: Símbolo SR Valor p

NM_012290: TLK1 0.15 3.7E-21

NM_016231: NLK 0.15 5.7E-22

NM_015071: GRAF 0.14 1.4E-21

NM_000162: GCK 0.14 2.5E-22

NM_005163: AKT1 0.14 1.1E-22

NM_002749: ERK5 0.14 6.8E-23

NM_002350: LYN 0.14 3.0E-24

NM_004755: RPS6KA5 0.13 5.6E-24

NM_004336: BUB1 0.13 8.2E-27

NM_005592: MUSK 0.12 3.2E-27

NM_024644: FLJ21802 0.12 9.5E-28

NM_005248: FGR 0.12 2.2E-28

NM_000020: ACVRL1 0.12 3.4E-28

NM_002757: MEKK5 0.11 1.4E-28

XM_047620: PIP5K1C 0.11 2.8E-33

NM_004759: MAPKAPK2 0.10 1.9E-18

NM_052859: RFT1 0.10 7.8E-35

NM_003684: MKNK1 0.10 9.3E-37

NM_016281: JIK 0.09 4.4E-37

NM_002673: PLXNB1 0.08 2.7E-38

Varios siARN identificados en la detección de muerte celular mejorada cuando se mide mediante ensayos de viabilidad se prueba por su capacidad de mejorar la activación caspasa mediante anticuerpos agonísticos DR5. El anticuerpo DR5 se titula para producir una cantidad mínima de

5 activación caspasa cuando se mide mediante péptidos fluorogénicos (DEVD-afc). Los siARN dirigidos contra nsma, nsurf, PAK1, stk12, Ask1 y JIK se transfectan en células Hela y luego se tratan con anticuerpos DR5. El siARN de control (nsma) tiene poco efecto aunque los siARN identificados mejoran significativamente la actividad caspasa.

Varios siARN adicionales (distintos de aquellos en la detección) que se dirigen hacia PAK1 10 se diseñan y se prueban por su efecto en la viabilidad en la presencia o ausencia del anticuerpo DR5.

El siARN incluye: siPAK1-0 AGAGCTGCTACAGCATCAA siPAK1-1 GACAUCCAACAGCCAGAAA siPAK1-2 GAGAAAGAGCGGCCAGAGA

15 hPAK1-6 UACCAGCACUAUGAUUGGA siPAK1-7 UCUGUAUACACACGGUCUG El PAK1-1 y PAK1-2 reducen fuertemente la viabilidad (ensayo MTT) en la estirpe celular de carcinoma de colo HCT116 bax +/-en 24 y 48 horas. Las células HCT116 bax -/-tienen ambas copias de bax eliminado, que presentan estas

20 células muy resistentes al tratamiento quimioterapéutico, que incluye los anticuerpos TRAIL1 y DR5. Sin embargo los siARN PAK1 permanecen efectivos para reducir la viabilidad. También se observan estos mismos resultados observados en las células de carcinoma de colon DLD1.

Para determinar si el silenciamiento o inhibición de PAK1 es células tóxicas a normales, probamos los siARN PAK1 en estirpe celular epitelial de ovario primario IOSE80. Los resultados demuestran que los siARN dirigidos contra PAK1 no reducen la viabilidad de células normal células. Así, PAK1 y otros productos de gen.

Adicionalmente, el siPAK1 no reduce significativamente la viabilidad en la estirpe celular epitelial primaria ("normal") HMEC, aunque este mejora fuertemente DR5 y DR4 que induce la reducción de la viabilidad en la estirpe celular de carcinoma de colon HCT15.

Ejemplo 58 Efecto sinérgico del antagonista UbcH10 y anticuerpo anti-DR5

Este ejemplo describe el efecto sinérgico de antagonista conjugasa ubiquitina humana UbcH10 (UBE2C) y anticuerpo anti-DR5 en inducir apoptosis en células de tumor. El UbcH10 juega un papel esencial en la regulación del ciclo celular. Empleando el análisis global de la expresión de gen y la inmunohistoquímica, los actuales inventores encuentran que el UbcH10 se sobreexpresa significativamente en carcinomas de sitios anatómicos múltiples, notablemente mama, estómago/esófago, colorecto, pulmón y ovario. Los datos indican que el UbcH10 juega un papel importante en el desarrollo del tumor. Luego se examina el potencial terapéutico para inhibir UbcH10 en el tratamiento de cánceres.

Reducción de crecimiento celular mediante silenciamiento mediado por ARN de expresión de UbcH10. Primero investigamos las consecuencias de silenciamiento de gen en células de tumor con altos niveles UbcH10, diseñamos tres diferentes secuencias y ARN de interferencia pequeña no traslapantes (siARN) (UbcH10-495, UbcH10-378, UbcH10-412). Cada siARN se prueba inicialmente en 2 estirpes celulares, T3M4 (derivado de un carcinoma pancreático) y DLD-1. (derivado de carcinoma colorectal). Todos los tres siARN objetivan a UbcH10, pero no al siARN de control, que resulta en disminución eficiente de la proteína UbcH10, que se correlaciona con su capacidad para suprimir el crecimiento celular. Estos datos subrayan la especificidad de los siARN UbcH10 e indica que los resultados no se deben a efectos "fuera del objetivo". Debido a que el complejo UbcH10-APC controla la degradación de ciclina B 1, también examinamos los niveles de ciclina B 1 mediante análisis Western blot luego de silenciamiento UbcH10. Nuestros resultados revelan una correlación inversa entre los niveles de la proteína UbcH10 en células tratadas con siUbcH10 y los niveles de ciclina B1. Adicionalmente, los análisis de ciclo celular luego de tratamiento siUbcH10 muestran disminución en la fase M (datos no mostrados), consistente con la descripción de la técnica. Microscópicamente, la regulación por disminución de UbcH10 no induce ningún cambio en la morfología de la célula que es indicador de apoptosis, tal como el redondeo de la célula, separación, condensación nuclear o producción de cuerpos apoptóticos. Más aún, el tratamiento siUbcH10 no resulta en procesamiento proteolítico de las dos caspasas ejecutora, caspasa-3 y -7 (14), cuando se mide por análisis Western blot y ensayos de actividad caspasa fluorescente.

La regulación por disminución UbcH10 es aditiva a los efectos de fármacos quimioterapéuticos estándar: El UbcH10 se sobreexpresa altamente en cánceres humanos comparado con la mayoría de tejidos normales. Para determinar el potencial terapéutico de UbcH10 objetivo, vigilamos varios agentes molecularmente objetivo y quimioterapéuticos conocidos para efectos específicos de tumor potenciales posteriores a silenciamiento UbcH10. Para estos estudios, empleamos el agente estabilizante de microtúbulo de paclitaxel, el inhibidor de huso, vinblastina, el agente de alquilación de ADN, mitomicina c, y un anticuerpo funcionalmente agonístico capaz de activar la apoptosis mediada por DR5/TRAIL, para cubrir un espectro de agentes con diferentes mecanismos de acción. Dos estirpes celulares de cáncer pancreático, T3M4 y Panc-1, y una estirpe celular de carcinoma de próstata independiente de pirógeno, CWR-RV1, se tratan con siUbcH10 durante 48 horas luego de la incubación con vinblastina, paclitaxel, mitomicina c, y anti-DR5 para 24 horas adicionales. Probamos resultados indican que el cotratamiento con venenos mitóticos y los fármacos que dañan en ADN luego de silenciamiento UbcH10 produce una reducción aditiva en la viabilidad celular en un número de estirpes celulares de tumor (Fig. 31). El tratamiento inicial de células de cáncer durante 48 horas con siUbcH10 reduce la cantidad de células viables por >50%, que se reducen adicionalmente mediante la adición de agentes citotóxicos durante 24 horas adicionales. Luego de normalización para los números de células silenciadas UbcH10, las concentraciones Ic90 o IC50 son idénticas, indicando un efecto aditivo. Todos los tres siARN independientes objetivan a UbcH10 que exhibe efectos similares con TRAIL en células T3M4 y Panc-1. Los datos son la media de triplicados y se obtienen resultados similares en cuatro experimentos independientes.

Regulación por disminución de células UbcH10 sensibles a muerte celular mediada por TRAIL/DR5: Los fibroblastos humanos primarios (BJ), células epiteliales mamarias humanas (HMEC), y células T3M4 se tratan secuencialmente con siUbcH10 (siUbcH10-495) durante 48 horas seguido por anticuerpos anti-DR5 agonísticos (500 ng/ml) durante 6 horas adicionales. Los siARN de control marcados con Fluorescente (FITC) se utilizan para asegurar la eficacia de transfección igual de todas las estirpes celulares que incluye células BJ y HMEC. Se analizan células mediante microscopía. Los resultados se muestran en las Figuras 31 y 32. Como se ilustra en las figuras, el pretratamiento de células T3M4 y Panc-1 con siUbcH10 incrementa significativamente la apoptosis inducida por anticuerpos anti-DR5 comparado con tratamiento de siARN o anti-DR5 solo, aunque este tiene un efecto negligible en las células CWR-RV1, que son insensibles a TRAIL (Fig. 31). Los datos indican que la incubación de estirpes celulares de cáncer, más notablemente, T3M4, con el anticuerpo antiDR5 posterior al tratamiento de siUbcH10 que exhibe dramáticamente la apoptosis mejorada. Esto no se ve en fibroblastos de piel humana primarios (BJ) o células epiteliales mamarias (HMEC) (Figs. 31 y 32). Esta observación parece reflejar un fenómeno general, ya que otras estirpes celulares de tumor resistente TRAIL así como también las células normales no se hacen sensibles a TRAIL mediante regulación por disminución de UbcH10.

Ejemplo 59 Sinergia de los agonistas anti-DR4 o anti-DR5 e inhibidores proteasoma contra células de tumor defectuosas Bax.

Los defectos en el sistema de reparación de ADN (reparación coincidente (MMR)) conduce a inestabilidad genética debido a los errores de replicación que no son correctos. Este tipo de inestabilidad genética es un evento clave en la progresión maligna de cáncer colorectal sin poliposis hereditaria (HNPCC) y un subconjunto de cánceres de colon esporádicos y las relaciones de mutación son particularmente altas en secuencias repetitivas cortas, tal como aquellos contenidos con los genes TGFbetaRII y BAX. Así, la pérdida Bax en estos tumores proporciona una severa ventaja de supervivencia para la inducción natural y quimioterapéutica de apoptosis.

La Figura 34 ilustra que la pérdida de Bax confiere resistencia al ligando TRAIL. Sin embargo, la inhibición de proteasoma restaura la sensibilidad a TRAIL. La inhibición de proteasoma mediante inhibidores basados con peptidilo MG-132 o MG262 o Lactacistina, un compuesto natural, restaura completamente la sensibilidad a TRAIL en células deficientes en Bax. Ver, Figura 34.

Los inhibidores de proteasoma evitan defectos en la ruta de apoptosis mitocondrial. Dependiendo del tipo de célula, la caspasa-8 activa puede conducir directamente a la activación de caspasas efectores en la dirección 3’ como caspasa-3 (denominado células tipo-I). En las células tipo-II (la mayoría de células incluyen HCT116), las dos rutas prototípicas, extrínseca (receptor de muerte) y intrínseca (mitocondrial), se interconectan mediante la división mediada por caspasa-8 del miembro de la familia bcl-2 proapoptótico Bid, que promueve la liberación mitocondrial del citocrome c y SMAC. Una vez liberado en el citoplasma, el citocromo c se asocia con Apaf-1 y pro-caspasa-9 formando el "apoptosoma", que conduce a la activación de pro-caspasa-9 y la activación posterior de

5 caspasas efectoras tal como caspasa-3. El SMAC citolítico, de una parte, une a los miembros de la familia de proteína IAP (inhibidor de apoptosis) y por lo tanto evita la inhibición de IAP de caspasa-3 y -9.

Estos eventos se observan fácilmente mediante análisis western blot en células Bax+/tratadas con TRAIL (liberación de SMAC y citocromo-c no mostrada). Ver, Figura 34. De forma 10 similar, en las células Bax -/-tratadas con TRAIL (T), el procesamiento de caspasa-8 y el procesamiento Bid ocurre como procesamiento de caspasa-3 normal, sin embargo, caspase-9 y completo y de la maduración (líneas 2, 3 y 4). Se espera que el Bax evite la pérdida de eventos en la dirección 3’ de la división de Bid debido al fragmento proapoptótico resultante de Bid requiere Bax para estos eventos. El TRAIL (T) + MG-262 (M) restaura completamente la ruta mitocondrial que

15 resulta en el procesamiento y la activación de caspasa-9 y caspasa-3 que conduce a muerte celular. El MG-262 (M) en sí mismo no tiene efecto en esta cascada proteolítica. Estos y otros datos indican que la inhibición de proteasoma es útil en volver a sensibilizar las células de tumor que contienen defectos en la ruta de apoptosis mitocondrial para la apoptosis inducida por los agonistas del receptor TRAIL. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle por vía de ilustración y ejemplo

20 para propósitos de claridad de entendimiento, será fácilmente evidente por un experto en la técnica en claridad de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método ex vivo para inducir apoptosis en una célula de cáncer, el método comprende poner en contacto la célula con:

i. un anticuerpo del Receptor 5 (DR5) anti-muerte; y

ii. un agente que induce apoptosis, en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en SEQ ID NO: 8.
2.

El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
3.

El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.
4.

El método de la reivindicación 1, en donde:

(i)

el agente evita o reduce la expresión de BCL-2:

(ii)

el agente es un inhibidor proteasoma;

(iii) el agente es un inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis (IAP);

(iv)

el agente es un antagonista de PAK1;

(v)

el agente es un antagonista de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de nsurf y JIK; o

(vi)

el agente es un siARN.
5.

El método de la reivindicación 4, en donde el agente que evita o reduce la expresión de BCL-2 evita la activación de NFκB.
6.

El método de la reivindicación 5, en donde el agente que evita la activación de NFκB evita la degradación de IκB.
7.

El método de la reivindicación 4 en donde el inhibidor proteasoma se selecciona del grupo que consiste de PS-341, MG-262 y MG-132.
8.

El método de la reivindicación 4, en donde el inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis es SMAC o un imitador de SMAC.
9.

El método de la reivindicación 1, en donde la célula de cáncer es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático.
10.

Uso de un anticuerpo anti-DR5 en la fabricación de un medicamento para inducir apoptosis en una célula de cáncer, en donde el anticuerpo anti-DR5 se prepara para ser coadministrado con un agente que induce apoptosis y, en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia, mencionado en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en la SEQ ID NO: 8.
11.

El uso de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo y el agente se administran separadamente,
12.

El uso de la reivindicación 10, en donde el anticuerpo y el agente se administran como una mezcla.
13.

El uso de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado
14.

El uso de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.
15.

El uso de la reivindicación 10, en donde

(i)

el agente evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10;

(ii)

el agente es un inhibidor proteasoma:

(iii) el agente es un inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis (IAP):

(iv)

el agente es un antagonista de PAY1;

(v)

el agente es un antagonista de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de UbcH10, nsurf y JIK; o

(vi)

el agente es a siARN.
16.

El uso de la reivindicación 15, en donde el agente que evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10 evita la activación de NFκB.
17.

El uso de la reivindicación 16, en donde el agente que evita la activación de NFκB evita la degradación de IκB.
18.

El uso de la reivindicación 15, en donde el inhibidor proteasoma se selecciona del grupo que consiste de PS-341, MG-262 y Mug-132.
19.

El uso de la reivindicación 15, en donde el inhibidor de un inhibidor de Apoptosis es SMAC o un imitador de SMAC.
20.

El uso de la reivindicación 10, en donde la célula de cáncer es una célula de cáncer de colon o una célula de cáncer pancreático.
21.

Una composición fisiológica que comprende, una cantidad terapéuticamente efectiva de

i. un anticuerpo anti-DR5; y

ii. un agente que induce apoptosis, en donde el anticuerpo anti-DR5 comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en la SEQ ID NO: 8.
22.

La composición fisiológica de la reivindicación 21 en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
23.

La composición fisiológica de la reivindicación 21, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.
24.

La composición fisiológica de la reivindicación 21 en donde:

(i)

el agente evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10;

(ii)

el agente es un inhibidor proteasoma;

(iii) el agente es un inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis (IAP);

(iv)

el agente es un antagonista de PAK1;

(v)

el agente es un antagonista de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de UbcH10, nsurf y JIK, o

(vi)

el agente es un ssARN.
25.

La composición fisiológica de la reivindicación 24, en donde el agente que evita o reduce la expresión de BCL-2 o UbcH10, evita la activación de NFκB.
26.

La composición fisiológica de la reivindicación 25, en donde el agente que evita la activación de NFκB, evita la degradación de IκB.
27.

La composición fisiológica de la reivindicación 24, en donde el inhibidor de una proteína inhibidora de Apoptosis (IAP) es SMAC o un imitador de SMAC.
28.

Un anticuerpo anti-DR5 que comprende una región variable de cadena pesada comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en la SEQ lD NO: 8.
29.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, que es un anticuerpo humanizado.
30.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, que es un anticuerpo de cadena sencilla,
31.

Una célula que expresa el anticuerpo de la reivindicación 28.
32.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 28, que es un anticuerpo tetrámero.
33.

Un método ex vivo para inducir apoptosis en una célula de cáncer, el método comprende poner en contacto la célula con un anticuerpo anti-DR5 que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia mencionada en la SEQ ID NO: 6 y una región variable de cadena liviana como se menciona en la SEQ ID 8.