ES2353413T3 - 3-beta-hidroxi-17-(1h-bencimidazol-1-il)androsta-5,16-dieno para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata.**Fórmula**

Description

La presente solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la solicitud provisional US nº de serie 60657380 presentada el 2 de marzo de 2005.

El Gobierno de los Estados Unidos de América tiene los derechos de utilización en la presente invención, y el derecho, en circunstancias limitadas, a requerir al propietario de la patente a autorizar a otros en términos razonables como se estipula mediante los términos de la Concesión nº CA27440 concedida por el National Institutes of Health (NIH).

La presente memoria describe nuevas entidades químicas, particularmente benzoazoles, pirimidinoazoles (azabenzoazoles) y diazinas C-17 esteroideos. También se describen métodos para la síntesis de los benzoazoles, pirimidinoazoles y diazinas. En un caso, los métodos para sintetizar benzoazoles o pirimidinoazoles comprenden una etapa de reacción de sustitución de “adición-eliminación” vinílica nucleófila de 3β-acetoxi-17cloro-16-formilandrosta-5,16-dieno o sus análogos y nucleófilos de benzoazol o pirimidinoazol. En otro caso, los métodos para sintetizar diazinas comprenden una reacción de acoplamiento cruzado catalizada por paladio de 17-yodoandrosta-5,16-dien3β-ol o sus análogos con tributilestannil diazinas.

Los compuestos descritos aquí son inhibidores potentes de la enzima CYP17 humana, así como antagonistas potentes de los receptores de andrógeno (AR) tanto de tipo salvaje como mutantes. Los inhibidores de CYP17 más potentes fueron: 3β-hidroxi17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-5,16-dieno (S, nombre codificado VN/124-1), 3β-hidroxi17-(51-pirimidil)androsta-5,16-dieno (15) y 17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-4,16-dien-3ona (6), con valores de IC50 de 300, 500 y 915 nM, respectivamente. Los compuestos 5, 6, 14 y 15 (Esquemas 1 y 2) fueron eficaces evitando la unión de 3H-R1881 (metiltrienolona, un andrógeno sintético estable) tanto al AR mutante y de LNCaP como al AR de tipo salvaje, pero con una eficacia de unión de 2,2 a 5 veces mayor a este último. Los compuestos 5 y 6 también mostraron ser potentes antagonistas de AR puros. Los estudios de crecimiento celular mostraron que 5 y 6 inhiben el crecimiento de células de cáncer de próstata LNCaP y LAPC4 estimuladas con DHT, con un valor de IC50 en el intervalo micromolar bajo (es decir, < 10 µM). Sus potencias inhibidoras fueron comparables a la de casodex, pero notablemente superiores a la de flutamida. Se investigó la farmacocinética de los compuestos 5 y 6 en ratones. Tras la administración s.c. de 50 mg/kg de 5 y 6, se produjeron niveles plasmáticos pico de 16,82 y 5,15 ng/ml, respectivamente, después de 30 a 60 minutos, ambos compuestos se aclararon rápidamente del plasma (semividas terminales de 44,17 y 39,93 minutos, respectivamente), y ninguno fue detectable a 8 h. De forma notable, el compuesto 5 se convirtió rápidamente en un metabolito identificado provisionalmente como 17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-3-ona. Cuando se ensayó in vivo, 5 demostró ser muy eficaz inhibiendo el crecimiento de xenoinjerto de tumor de próstata humano LAPC4 dependiente de andrógeno, mientras que 6 fue ineficaz. El compuesto 5 (50 mg/kg/dos veces al día) dio como resultado una reducción del 93,8% (P = 0,00065) en el volumen tumoral final medio en comparación con los controles, y también fue significativamente más eficaz que la castración. Según nuestro conocimiento, este es el primer ejemplo de un agente antihormonal (un inhibidor de la síntesis de andrógenos (inhibidor de CYP 17/antiandrógeno) que es significativamente más eficaz que la castración en la supresión del crecimiento del tumor de próstata dependiente de andrógenos. A la vista de estas impresionantes propiedades anticancerígenas, el compuesto 5 y otros se pueden usar para el tratamiento de cáncer de próstata humano.

El cáncer de próstata (PCA) es la neoplasia más habitual y la causa relacionada con la edad de muerte por cáncer a nivel mundial. Aparte del cáncer de pulmón, el PCA es la forma más habitual de cáncer en hombres, y la segunda causa principal de muerte en norteamericanos. Este año (2004), en los Estados Unidos de América, se diagnosticará un estimado de 230.000 nuevos casos de cáncer de próstata, y alrededor de 23.000 hombres morirán por esta enfermedad (Jemal et al., Cancer Statistics, 2004. CA Cancer J Clin., 2004, 54, 8-29). Durante el período de 1992 a 1999, la incidencia anual media de PCA entre hombres afroamericanos fue 59% mayor que entre hombres caucásicos, y la tasa de mortalidad anual media fue más del doble que la de los hombres caucásicos (American Cancer Society -Cancer Facts and Figures 2003). Los andrógenos desempeñan un papel importante en el desarrollo, crecimiento y progresión de PCA (McConnell, J. D., “Physiological basis of endocrine therapy for prostatic cancer”, Urol. Clin. North Am., 1991,

18: 1-13). Los dos andrógenos más importantes a este respecto son testosterona (T) y dihidrotestosterona (DHT). Los testículos sintetizan alrededor de 90% de T, y el resto (10%) es sintetizado por las glándulas suprarrenales. T se convierte además en el andrógeno más potente DHT mediante la enzima esteroide 5α-reductasa, que está localizada principalmente en la próstata (Bruchovsky et al., “The conversion of testosterone to 5α-androstan-17β-ol-3-one by rat prostate in vivo and in vitro”, J. Biol. Chem., 1968, 243, 2012-2021). En 1941, Huggins et al. introdujo la privación de andrógenos como terapia para PCA avanzado y metastásico (Huggins et al. “Studies on prostatic cancer: 2. The effects of castration on advanced carcinoma of the prostate gland.”, Arch. Surg., 1941, 43, 209-212). Después, se ha demostrado que la terapia de ablación de andrógenos produce las respuestas más beneficiosas en múltiples situaciones en pacientes con PCA (Denmeade et al. “A history of prostate cancer treatment”. Nature Rev. Cancer, 2002, 2: 389-396). La orquidectomía (ya sea quirúrgica o médica con un agonista de GnRH) sigue siendo la opción de tratamiento estándar para la mayoría de los pacientes con cáncer de próstata. La orquidectomía médica y quirúrgica reduce o elimina la producción de andrógenos por los testículos, pero no afecta a la síntesis de andrógenos en las glándulas suprarrenales. Varios estudios han dado a conocer que una terapia de combinación de orquidectomía con antiandrógenos, para inhibir la acción de andrógenos adrenérgicos, prolonga significativamente la supervivencia de pacientes con PCA (Crawford, et al., “A controlled trial of leuprolide with and without flutamide in prostatic carcinoma, N. Engl. J. Med., 1989, 321, 419-424; Crawford, et al., “Treatment of newly diagnosed state D2 prostate cancer with leuprolide and flutamide or leuprolide alone, Phase III: intergroup study 0036”, J. Urol., 1992, 147: 417A; y Denis, L., “Role of maximal androgen blockade in advanced prostate cancer”, Prostate, 1994, 5 (Supl.), 17s-22s). En un artículo reciente de Mohler y colegas (Mohler et al., “The androgen axis in recurrent prostate cancer”, Clin. Cancer Res., 2004, 10, 440-448), se demostró claramente que T y DHT se producen en tejidos de PCA recurrente a niveles suficientes para activar el receptor de andrógenos. Además, usando la obtención de perfiles a base de microconjuntos de modelos de xenoinjerto isogénico de PCA, Sawyer y colegas (Chen et al., “Molecular determinants of resistance to antiandrogen therapy.” Nat. Med., 2004, 10, 33-39) encontraron que un modesto incremento en ARNm del receptor de andrógenos fue el único cambio asociado consistentemente con el desarrollo de resistencia a terapia antiandrogénica. Los compuestos potentes y específicos que inhiben la síntesis de andrógenos en los testículos, glándulas suprarrenales y otros tejidos pueden ser más eficaces para el tratamiento de PCA (Njar, V.C.O.; Brodie, A. M. H., “Inhibitors of 17αhydroxylase-C17,20-lyase (CYP17): Potential agents for the treatment of prostate cancer”, Current Pharm. Design, 1999, 5: 163-180).

En los testículos y en las glándulas suprarrenales, la última etapa en la biosíntesis de T implica dos reacciones clave, que actúan secuencialmente y que están catalizadas ambas por una única enzima, la citocromo P450 monooxigenasa 17α-hidroxilasa/17,20liasa (CYP17) (Hall, P. F., “cytochrome P-450 C21scc: one enzyme with two actions: Hydroxylase and lyase”, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 1991, 40, 527-532). El quetoconazol, como agente antifúngico y en virtud de la inhibición de enzimas P450, es también un inhibidor modesto de CYP17, y se ha usado clínicamente para el tratamiento de PCA (Trachtenberg et al., “Ketoconazole: A novel and rapid treatment for advanced prostatic cancer”, J. Urol. 1983, 130, 152-153). Se da a conocer que la programación cuidadosa del tratamiento puede producir respuestas prolongadas en pacientes con cáncer de próstata de otro modo refractarios a las hormonas (Muscate et al., “Optimal dosing of ketoconazole and hydrocrtisone leads to long responses in hormone refractory prostate cancer”, Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 1994, 13:22 (Abstract)). Además, se encontró que el quetoconazol retiene actividad en pacientes con PCA avanzado con progresión, a pesar de la retirada de flutamida (Small et al., “Ketoconazole retains activity in advanced prostate cancer patients with progression despite flutamide withdrawal”, J. Urol., 1997, 157, 1204-1207). Aunque ahora se ha retirado el quetoconazol del uso debido a la hepatotoxicidad y otros efectos secundarios, esto sugiere que inhibidores más potentes y selectivos de CYP17 podrían proporcionar agentes útiles para tratar esta enfermedad, incluso en etapas avanzadas y en algunos pacientes que pueden parecer refractarios a las hormonas.

Se ha dado a conocer una variedad de potentes inhibidores esteroideos y no esteroideos de CYP17, y algunos han demostrado ser potentes inhibidores de la producción de testosterona en modelos de roedores (Njar y Brodie, anteriormente). Recientemente, Jarman y colegas han descrito el impacto hormonal de su inhibidor más potente de CYP17, abiraterona, en pacientes con cáncer de próstata (O’Donnell et al., “Hormonal impact of the 17α-hydroxylase/C17,20-lyase inhibitors abiraterone acetate (CB7630) in patients with prostate cancer”, Br. J. Cancer, 2004, 90: 2317-2325). Algunos de nuestros potentes inhibidores de CYP17 también han mostrado que inhiben 5areductasa, y/o son potentes antiandrógenos con una potente actividad antitumoral ((Njar y Brodie, anteriormente, y Long et al., “Antiandrogenic effects of novel androgen synthesis inhibitors on hormone-dependent prostate cancer”. Cancer Res., 2000, 60, 6630-6640). Ilustrativas además de los antecedentes de la invención son las patentes U.S. nos 5.994.335; 6.200.965; y 6.444.683. Se han dado a conocer intentos para hacer modelos del farmacóforo tridimensional de inhibidores de CYP17 humana (Clement et al, J. Med. Chem 2003, 46, 2345-2351). Este documento describe un intervalo de compuestos como inhibidores de la enzima CYP17 in vitro.

Se ha descubierto una serie de potentes inhibidores de CYP17/antiandrógenos, los 17-benzoazoles, 17-pirimidinoazoles y 17-diazinas (véanse, por ejemplo, los Esquemas 1 y 2 para ejemplos de preparación de compuestos que se pueden aplicar análogamente a otras estructuras, como se describe más abajo. El estímulo para preparar estos esteroides heteroarílicos C-17 se basó en el deseo de incorporar restos bencimidazólicos, benzotriazólicos, pirimidinoazólicos y diazínicos, denominados “subestructuras privilegiadas” (Nicolaou et al., “Natural product-like combinatorial libraries based on privileged structures. 1. General principles and solid-phase synthesis of benzopyrans”, J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 9939-9953. “Estructuras privilegiadas” es una expresión introducida originalmente por Evans et al. (J Med. Chem., 1988, 31, 2235

5 2246) para describir motivos estructurales capaces de interaccionar con una variedad de dianas moleculares no relacionadas), en las nuevas moléculas. Estos armazones, especialmente en los armazones de bencimidazol, continúan recibiendo una gran atención en la química médica debido a su diversa cartera de actividades biológicas y también como entidades de una variedad de fármacos útiles (Nicolaou et al., anteriormente).

10 Se describen aquí compuestos esteroideos heteroarílicos C-17 de la siguiente fórmula general I:

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15 en la que:

-la estructura anular ABC es las porciones anulares A, B y C de un esteroide o su análogo, que están opcionalmente sustituidas; 20 -el enlace ----en la posición 16,17 es un enlace sencillo; y -X es un bencimidazol opcionalmente sustituido.

También se describen sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos.

25 La sustitución opcional para la estructura anular ABC incluye uno o más de: alquilo y alquilo halogenado (preferentemente C1-6); alquenilo y alquenilo halogenado (preferentemente C1-6), incluyendo el caso en el que el doble enlace está unido directamente a la estructura anular; halógeno; amino; aminoalquileno; hidroxiimino; e hidroxi. Además opcionalmente, los sustituyentes de hidrógeno en átomos de carbono

30 adyacentes de la estructura anular ABC se pueden eliminar y sustituir por un enlace adicional entre los átomos de carbono adyacentes para dar como resultado un doble enlace entre estos carbonos en la estructura anular. Las sustituciones opcionales preferidas en la estructura anular ABC son grupos metilo en las posiciones 10 y/o 13 de la estructura anular.

35 La sustitución opcional para la estructura bencimidazólica incluye halógeno, amino, aminoalquileno, hidroxi, -SH, -S-alquilo, alquilo y alquilo halogenado (preferentemente C1-6). Estos sustituyentes opcionales estarán sobre átomos de carbono anulares del bencimidazol.

40

-5La estructura del bencimidazol tiene la siguiente fórmula:

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bencimidazol 5 en la que el * indica el punto de unión al resto esteroideo.

En un caso, la estructura anular ABC tiene un anillo C que no tiene sustitución excepto sustitución preferentemente alquílica, particularmente metílica, en el carbono 10 compartido con el anillo D que es adyacente a la unión a la sustitución heteroarílica C-17,

es decir, la posición 13.

En otro caso, los anillos A, B y C de la estructura anular ABC tienen una estructura convencional basada en 3β-hidroxi-androsta-5,16-dieno o 3-oxo-androsta-5,1615 dieno. Pero en otro caso, los anillos A y B tienen una de las siguientes estructuras 1-25:

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Lo siguiente enumera los nombres químicos de compuestos que tienen los anillos AB como en 1-25, y los anillos C y D convencionales, en los que X es bencimidazol.

Compuesto 1:3β-Hidroxi-3α-metil-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 2:3β-Fluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 3:3β-Cloro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 4:3β-Bromo-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto : 3p-Yodo-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 6:3β-Amino-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 7: 17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-3,5,16-trieno Compuesto 8: 17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-2,4,16-trieno Compuesto 9: 17-(1H-bencimidazol-1-il)-3-metilenoandrosta-5,16-trieno Compuesto : 17-(1H-bencimidazol-1-il)-3-metilenoandrosta-4,16-trieno Compuesto 11: 3,3-Difluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 12: 3,3-Difluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-4,16-dieno Compuesto 13: 17-(1H-bencimidazol-1-il)-3-metilenoandrosta-2,4,16-trieno Compuesto 14: 17-(1H-bencimidazol-1-il)-3-metilenoandrosta-2,4,6,16-tetraeno Compuesto : 3,3-Difluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-2,4,16-trieno Compuesto 16: 3,3-Difluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-2,4,6,16-tetraeno Compuesto 17: 3-Hidroxiimino-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-5,16-dieno Compuesto 18: 3-Hidroxiimino-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-4,16-dieno Compuesto 19: 3-Hidroxiimino-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-2,4,16-trieno Compuesto : 3-Hidroxiimino-17-(1H-bencimidazol-1-il)-androsta-2,4,6,16-dieno Compuesto 21: 3-Hidroxi-17-(1H-bencimidazol-1-il)-estra-1,3,5(10),16-tetraeno Compuesto 22: 3-Fluoro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-estra-1,3,5(10),16-tetraeno Compuesto 23: 3-Cloro-17-(1H-bencimidazol-1-il)-estra-1,3,5(10),16-tetraeno Compuesto 24: 3-Bromo-17-(1H-bencimidazol-1-il)-estra-1,3,5(10),16-tetraeno Compuesto : 3-Yodo-17-(1H-bencimidazol-1-il)-estra-1,3,5(10),16-tetraeno

Los ejemplos de sustituyentes opcionales para el anillo heteroarílico, X, se muestran mediante las siguientes estructuras 26-40, en las que X es bencimidazol.

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Se describe un compuesto de la siguiente estructura M5

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5 Se estudiaron las actividades inhibidoras de estos compuestos en comparación con CYP17 y esteroide 5α-reductasas, la unión a y la transactivación de receptores androgénicos, y sus efectos antiproliferativos frente a dos estirpes celulares de cáncer de próstata humano, LNCaP y LAPC-4. Se evaluó la farmacocinética de los compuestos 5 y 6 en ratones, y también se evaluaron las actividades antitumorales in vivo frente a

10 carcinoma de próstata LAPC-4 humano en ratones. Según se sabe, todos los compuestos descritos aquí, con la excepción del compuesto 15, representan entidades nuevas (Haidar et al., “Novel steroidal pyrimidyl inhibitors of P450 17 (17α-hydroxylase/C17-20-lyase)”, Arch. Pharm. Med Chem., 2001, 334, 373-374; y Haidar et al., “Effects of novel 17αhydroxylase/C17,20-lyase (P45017, CYP17) inhibitors on androgen biosynthesis in vitro

15 and in vivo”, J Steroid Biochem. Molec. Biol, 2003, 84, 555-562).

La preparación de los nuevos 17-benzoazoles y 17-diazinas se esquematiza en

los Esquemas 1 y 2, respectivamente. Estos métodos se pueden aplicar análogamente a

otros análogos descritos aquí.

20 El intermedio clave en nuestra síntesis de los 17-benzoazoles, 3β-acetoxi-17cloro-16-formilandrosta-5,16-dino (2) se obtuvo a partir de (1) mediante nuestro procedimiento normal como se describe previamente (Njar et al., “Nucleophilic vinylic “addition-elimination” substitution reaction of 3β-acetoaxy-17-chloro-16-formylandrosta

25 5,16-diene: A novel and general route to 17-substituted-Δl6-steroids. Part 1. Synthesis of novel 17-azolyl-Al 6 steroids; inhibitors of 17α-hydroxylase/17,20-lyase (P45017α)”, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777-2782; y “Novel 17-azolyl steroids; potent inhibitors of cytochrome P450 17α-hydroxylase/17,20-lyase (P45017α): Potential agents for the treatment of prostate cancer”, J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912). El tratamiento de 2 con

30 bencimidazol en presencia de K2CO3 en DMF a aproximadamente 80ºC dio el 3β-acetoxi17-1H-bencimidazol 3 deseado, con un rendimiento casi cuantitativo. El compuesto 3 se desformiló suavemente con paladio al 10% sobre carbón activado en benzonitrilo a reflujo para dar el compuesto 4 con un rendimiento del 93%, a partir del cual la hidrólisis dio el 3β-hidroxi-17-bencimidazol 5 requerido. La oxidación de Oppenauer modificada de 5 dio el

Δ4

35 -3-oxoanálogo correspondiente, 6.

Una muestra representativa de los nuevos compuestos se sometió entonces a

estudios in vitro e in vivo amplios como se describe con detalle en las siguientes

secciones.

40 Un método para tratar cáncer de próstata o hiperplasia prostática comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto. El término “tratar”, como se describe aquí, también se describe convencionalmente, por ejemplo el manejo o cuidado de un sujeto con el fin de combatir, aliviar, reducir, aliviar, mejorar, etc., uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad de la próstata. Los ejemplos de enfermedades de la próstata que se pueden tratar incluyen, por ejemplo, hiperplasia prostática (BPH), y cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma prostático).

El nivel de dosis específica y frecuencia de la dosificación pueden variar, dependiendo de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto activo específico, su estabilidad metabólica y duración de acción, velocidad de excreción, modo y tiempo de administración, la edad, peso corporal, estado de salud, género, dieta, etc., del sujeto, y la gravedad del cáncer o hiperplasia de próstata. Se puede administrar cualquier cantidad eficaz del compuesto, por ejemplo desde alrededor de 1 mg hasta aproximadamente 500 mg por día, más específicamente aproximadamente 50 mg a aproximadamente 150 mg por día. Los compuestos se pueden administrar en cualquier forma mediante cualquier vía eficaz, incluyendo, por ejemplo, la oral, parenteral, entérica, intraperitoneal, tópica, transdérmica (por ejemplo, usando cualquier parche estándar), oftálmica, nasal, local, no oral, tal como aerosol, pulverización, inhalación, subcutánea, intravenosa, intramuscular, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intra-arterial, e intratecal, etc. Un compuesto de la presente invención se puede administrar solo, o en combinación con cualesquiera otros ingredientes, activos o inactivos, por ejemplo con vehículos fisiológicamente aceptables, para obtener composiciones farmacéuticas adecuadas.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la materia puede utilizar, usando la descripción anterior, la presente invención en su grado más completo. Por lo tanto, las siguientes realizaciones específicas preferidas se han de interpretar como meramente ilustrativas, y no limitantes de ningún modo del resto de la descripción.

En lo anterior y en los siguientes ejemplos, todas las temperaturas se dan sin corregir en grados Celsius, y todas las partes y porcentajes están en peso, excepto que se indique de otro modo.

EJEMPLOS

Estudios Biológicos

Estudios de Inhibición de CYP17: Se llevó a cabo un ensayo de inhibición de CYP17 según nuestro procedimiento dado a conocer anteriormente, en el que se usó como fuente de enzima E. coli que expresa citocromo P450c17 intacta (Grigoryev et al., “Cytochrome P450c17-expressing Escherichia coli as a first-step screening system for 17α-hydroxylase-C17,20-lyase inhibitors”, Anal. Biochem.; 1999, 267, 319-330; y “Effects of new 17α-hydroxylase/C17,20-lyase inhibitors on LNCaP prostate cancer cell growth in vitro and in vivo”, Br. J. Cancer, 1999, 81, 622-630. Los valores de IC50 de los compuestos se determinan a partir de las curvas de respuesta frente a la dosis, y se dan en la Tabla 1. Los valores de IC50 para quetoconazol, abiraterona (un inhibidor de CYP17 en ensayos clínicos (O’Donnell, anteriormente), Diagrama 1) y 3β-hidroxi-17-(1H-imidazol-1il)androsta-5,16-dieno (VN/85-1, Compuesto 16, Diagrama 1, que se cree que es el inhibidor de CYP17 más potente (Njar et al., Current Pharm. Design, 1999, 5:163-180; y J.

Med. Chem., 1998, 41, 902-912, anteriormente) también se determinan en el mismo sistema de ensayo, para comparación. Algunos de los nuevos 17-heterociclos muestran una potente inhibición de CYP17, con valores de IC50 de 300-915 nM. Los bencimidazoles 5 y 6 son 4 a 6 veces más potentes que los benzotriazoles 9 y 10. Este resultado sugiere que la naturaleza electrónica del 17-heterociclo influye en la actividad inhibidora. Además, los compuestos con la funcionalidad Δ5-3β-ol, 5 y 9, son al menos 3 veces más potentes que los análogos correspondientes con la funcionalidad Δ4-3-ona, 6 y 10, respectivamente. Estos resultados contrastan con los resultados previos para los inhibidores de CYP17 17azólicos simples. En esa serie de inhibidores, no hay ninguna diferencia notable en las potencias inhibidoras entre los Δ5-3β-ol azoles y los análogos Δ4-3-ona correspondientes (Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912, anteriormente). Una posible explicación es que los benzoazoles más voluminosos se unen de forma diferente al sitio activo de la enzima, de manera que la interacción o interacciones del resto en la posición 3 es importante para la unión.

Se investigó la unión del sustrato o de los ligandos inhibidores al hemocomponente de algunos citocromos P450 usando espectroscopía de diferencia UV-vis (Jefcoat C. R., “Measurement of substrate and inhibitor binding to microsomal cytochrome P450 by optical difference spectroscopy”, Methods Enzymol., 1978, 52, 258279). Este enfoque se extendió siguiendo el procedimiento estándar dado a conocer previamente (Njar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777-2782; y J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912). Cada uno de los compuestos 5 y 9 inducen un espectro de diferencia de tipo II, indicando coordinación del nitrógeno esteroideo (N-3 del anillo bencimidazólico o benzotriazólico) al hemohierro de CYP17, con formación de hierro de bajo espín. Las posiciones de los picos para el máximo de Soret para el complejo de la enzima con 5 y 9 (426 nm) está de acuerdo con los datos disponibles para la unión de ligandos nitrogenados a sistemas de CYP, y también está de acuerdo con nuestros resultados con otros inhibidores de CYP17 17-azolílicos (Njar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1996, 6, 2777-2782; y J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912). La interacción del nitrógeno benzoazólico con el hemohierro de CYP17 sugiere una tolerancia voluminosa en la posición 17, debido a que las afinidades de unión de 5 y 9 son idénticas a las del 16 menos estéricamente exigente, con un grupo 17-imidazol.

De las dos 17-diazinas ensayadas, la 17-pirimidina 15, con un valor de IC50 de 500 nM, es alrededor de 8 veces más potente que la 17-pirazina 14 (IC50 = 3810 nM). Al igual que con los benzoazoles, este resultado sugiere que la naturaleza electrónica del 17heterociclo influye en la actividad inhibidora. Finalmente, se evaluaron los valores de IC50 en el mismo sistema de ensayo para quetoconazol, y abiraterona (Tabla 1). El compuesto más potente en esta serie, 17-bencimidazol 5, muestra mejoras de alrededor de 4 y alrededor de 3 veces en la inhibición de CYP17 con respecto a estos compuestos, respectivamente, aunque es menos potente que 16.

Inhibición in vitro de las isozimas 5imagen2 -reductasas tipo 1 y 2 humanas: En base a los hallazgos previos de que algunos inhibidores de CYP 17 son capaces de inhibir enzimas 5α-reductasas humanas, se evaluó brevemente esta nueva serie de inhibidores de CYP17. Las actividades inhibidores de los compuestos 5, 6, 9, 10 y finasterida como referencia se determinan usando la estirpe celular DU-145 (enzima tipo 1 humana) y homogenados humanos de tejido de BPH (enzima tipo 2 humana), como se describe por Hartmann et al., “Synthesis and evaluation of 2’-substituted 4-(4’-carboxy-or 4’carboxymethylbenzylidene)-N-acylpiperidines: Highly potent and in vivo active steroid 5αreductase type 2 inhibitors”, J. Med. Chem., 2002, 45, 3406-3417. En la Tabla 1 se presentan los valores de IC50 o los valores del porcentaje de inhibición a una concentración de 10 µM para algunos compuestos. Sólo el compuesto 6 muestra una potente inhibición de las enzimas tanto tipo 1 como 2 (IC50 = 770 y 480 nM, respectivamente), aunque es varias veces menos potente que finasterida (IC50 = 60 y 2 nM, respectivamente).

Ensayos de unión al receptor de andrógenos de LNCaP y PC-3AR: Debido a que se demostró previamente que algunos de nuestros inhibidores de CYP 17 son potentes antiandrógenos tanto para AR mutante como para AR de tipo salvaje (Long et al., Gregoriyev et al. y Njar et al., J. Med Chem., 1998, 41, 902-912, anteriormente), fue interesante evaluar la capacidad de esta serie de inhibidores de CYP17 para unirse a estos receptores. La competición por el AR se determina usando R1881 marcado ([3H]R1881) en las células CNCaP sensibles a andrógenos, que expresan AR mutante, y las células PC-3 independientes de andrógenos transfectadas de forma estable con el AR de tipo salvaje (denominadas PC-3AR). Los compuestos 5, 6, 14 y 15, en el intervalo de concentraciones nanomolar, compiten eficazmente con R1881 marcado por la unión a ambos tipos de AR, de una manera dependiente de la dosis (Figura no mostrada). Los compuestos 5, 6, 14 y 15, con valores de IC50 de 384, 242, 336 y 374 nM, respectivamente (Tabla 1), frente al AR de tipo salvaje, son 29 a 45 veces más potentes que el antiandrógeno usado clínicamente, flutamida (IC50 = 10.985 nM). Como se muestra en la Tabla 1, las afinidades de unión de 5 y 6 por el AR mutante son comparables a las de casodex, un antiandrógeno actualmente usado, pero nuevamente superiores a las de flutamida. Sin embargo, la actividad biológica de flutamida deriva principalmente de un metabolito, hidroxiflutamida, que es un antagonista de AR mucho más potente.

Efectos de los agentes sobre la transcripción mediada por AR mutante de LNCaP: Después, nos preguntamos si los compuestos 5 y 6 actúan como agonistas o antagonistas de AR. Se llevó a cabo un estudio sobre la activación transcripcional regulada por andrógenos en células LNCaP transfectadas transitoriamente con un constructo de informador de luciferasa de probasina AARZ-Luc (ensayo de actividad de luciferasa) (Kim et al., “Synergism of cytoplasmic kinases in IL6-induced ligandindependent activation of androgen receptor in prostate cancer cells”, Oncogene, 2004, 23:1838-1844; y Zhang et al., “A Small composite probasin promoter confers high levels of prostate-specific gene expression through regulation by androgens and glucocorticoids in Vitro and in Vivo”, Endocrinology, ‘2000’, 141 :4698-4710). Los compuestos 5, 6 o casodex, cada uno a 0,1 y 10,0 µM, no tienen ningún efecto sobre la actividad de luciferasa, mientras que la expresión de luciferasa aumenta aproximadamente 99,6 veces tras el tratamiento con 1,0 nM de DHT durante 18 h (Figura 1). Además, la expresión de luciferasa inducida por exposición a 1,0 nM de DHT disminuye de manera dependiente de la concentración por 5, 6 y casodex, y de manera similar (Figura 1). Juntos, estos resultados sugieren que los compuestos 5 y 6, como casodex, no poseen actividad agonista o agonista parcial de AR, y se pueden considerar como fuertes antagonistas de andrógenos puros. Aunque no se ensayaron los compuestos con células PC-3AR/LU, que expresan AR de tipo salvaje, es probable que también se puedan comportar de manera similar. Se ha demostrado previamente que algunos de nuestros inhibidores de CYP17 fueron más comparables con casodex que con flutamida (Long et al., anteriormente), y este parece ser el caso con estos nuevos compuestos. En general, nuestros nuevos compuestos interaccionan fuertemente con ambos tipos de AR, una indicación de que los compuestos pueden ser útiles para el tratamiento de pacientes con tumores que expresan AR de tipo salvaje o AR mutado, o para pacientes con expresión de AR amplificada.

Efectos de benzoazoles sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata CNCaP y LAPC-4 in vitro: Se examinaron las capacidades de los compuestos 5 y 6 para inhibir la proliferación en células LNCaP mutantes estimuladas por 1 nM de DHT. Esta concentración de DHT estimuló la proliferación de células LNCaP en alrededor de 2 veces en comparación con las células tratadas con el vehículo (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2A, cada uno de los compuestos 5 y 6 inhiben la proliferación de células LNCaP inducida por DHT de una manera dependiente de la dosis, con valores de IC50 de 6,0 y 1,8 µM, respectivamente. Como control positivo, se usó casodex, y muestra una inhibición similar de la proliferación de células LNCaP inducida por DHT (Figura 2A, IC50 = 8,6 µM). De forma sorprendente, el tratamiento de la estirpe celular prostática LAPC4 sensible a andrógenos con 10 nM de DHT no induce significativamente, la proliferación celular (Figura 2B). Otros investigadores también han dado a conocer que la respuesta de células LAPC4 a andrógenos no es tan pronunciada como la observada en células LNCaP (Thompson et al., “Androgen antagonist activity by the antioxidant moiety of vitamin E, 2,2,5,7,8-pentamethyl-6-chromanol in human prostate carcinoma cells”, Molec. Cancer Thera., 2003, 2, 797-803). Sin embargo, cada uno de los compuestos 5, 6 y casodex muestra una inhibición, dependiente de la dosis, de esta estirpe celular (Figura 2B) como con las células LNCaP. El orden de potencia inhibidora de la proliferación de células LAPC4 es 6 < 5 < casodex, con valores de IC50 de 1,0, 3,2 y 10 µM, respectivamente. Juntos, estos resultados sugieren que 5 y 6 pueden actuar bloqueando la acción de DHT en la proliferación celular estimulante, en correlación con sus propiedades de unión y activación del receptor de andrógenos descritas anteriormente. Los compuestos 5 y 6 están entre los antiandrógenos más potentes descritos hasta la fecha.

Farmacocinética de 5 y 6, y metabolismo de 5: Se estudiaron las propiedades farmacocinéticas en ratones SCID machos para los dos compuestos líder, 5 y 6, siguiendo nuestro procedimiento recientemente descrito para otros inhibidores de CYP17 (Nnane et al., “Pharmacokinetic profile of 3p-hydroxy-17-(1H-123-triazol-1-yl)androsta-5,16-diene (VN/87-1), a potent androgen synthesis inhibitor in mice”, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 2001, 71, 145-152; y Handratta et al., “Potent CYP17 inhibitors: improved syntheses, pharmacokinetics and antitumor activity in the LNCaP human prostate cancer model”, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 2004, 92, 155-165). Los resultados se resumen en la Tabla 2 y en las Figuras 3-5.

En la HPLC de fase inversa, 5 [tiempo de retención (rt) = 21,6 min.] se resolvió bien a partir del patrón interno (16, rt = 11,5 min.), un metabolito (rt = 17,3 min.) y otros compuestos endógenos en plasma de ratón (Figura 3). Las curvas de calibración derivadas para 5 son lineales y reproducibles (datos no mostrados), la variabilidad inter-e intraensayos es menor que 10%, y su límite de detección es 100 ng/ml. El ensayo de HPLC se validó y se usó para monitorizar 5 en plasma de ratones.

Tras la administración subcutánea, la concentración plasmática de 5 disminuye exponencialmente, con una semivida media de alrededor de 44,17 minutos y una constante de velocidad de eliminación de 56,6 min-1. El compuesto 5 se aclara a una tasa de 1986,14 ml/h/kg de la circulación sistémica, y no se detectó 6 h después de la administración. en la Tabla 2 se muestran los parámetros farmacocinéticos no compartimentales calculados, basados en el perfil de la concentración plasmática tras la administración subcutánea de 5. En la Figura 4 también se muestran las curvas de concentración plasmática frente al tiempo tras la administración s.c. de 5 (50 y 100 mg/kg) a ratones SCID machos. Tras la administración s.c. de 5, la concentración plasmática observada en ratones alcanza niveles pico 30,0 min. tras la dosis. El compuesto 5 es bien absorbido desde el sitio subcutáneo, y el área bajo la curva para los perfiles de concentración plasmática frente al tiempo tras la administración s.c. aumenta proporcionalmente con la dosis a medida que la dosis administrada cambia de 50 a 100 mg/kg. Además, la semivida de eliminación, y el tiempo medio de residencia, son relativamente constantes a medida que la dosis de 5 aumenta desde 50 hasta 100 mg/kg (Tabla 1). Estos resultados indican que el perfil farmacocinético de 5 es independiente de la dosis.

La Figura 5 muestra que se forma una cantidad significativa de un metabolito polar [tiempo de retención, 17,3 min.; véase la Figura 3] a partir de 5, y está presente en el plasma durante los estudios farmacocinéticos in vivo. La cantidad máxima del metabolito es 67,72%, obtenida alrededor de 2 h después de la dosificación. Este metabolito muestra un tiempo de retención idéntico al del compuesto 6. Este metabolito se identificó provisionalmente mediante LC-MS; su masa molecular (m/z 391 = M + H+) es consistente con la estructura de compuesto 3-oxo-Δ5,16-tetrahidro 5 (es decir, 17-(1H-bencimidazol-1il)androst-3-ona). El metabolismo se puede haber formado a partir de 5 vía oxidación del

y Δ16

3β-OH → 3-oxo, seguido de la reducción (reductasas) de ambos dobles enlaces Δ5. Se identificó previamente un metabolito similar (formado como resultado de la oxidación de un 3β-OH → 3-oxo, seguido de la isomerización del doble enlace de Δ5) en ratones machos de un 17-imidazol esteroideo estrechamente relacionado (Handratta et al., anteriormente).

Se puede sintetizar un metabolito principal de 5, es decir, 17-(1H-bencimidazol-1il)androst-3-ona, a partir de trans-androsterona; véase el Esquema 3. También se espera que tenga actividad análoga.

La farmacocinética in vivo de 6 en ratones es diferente de la del compuesto 5 debido a la Cmax relativamente baja y la velocidad de eliminación significativamente mayor (Figura 4 y Tabla 2). Además, no se pudo detectar ningún metabolismo o metabolismos de compuesto 6 en el plasma, contrariamente a nuestra observación con el compuesto 6.

Efectos de 5 y 6 en xenoinjertos de LAPC4 que se hacen crecer en ratones SCID: En base a las impresionantes y múltiples actividades biológicas in vitro, es decir, inhibición potente de CYP17, potente actividad antoproliferativa de células de cáncer de próstata y actividades antiandrogénicas, 5 y 6 se seleccionan para estudios de eficacia antitumoral in vivo en modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata humano LAPC4 dependiente de andrógenos.

En el primer experimento, se determina el efecto de los compuestos 5 y 6 sobre el crecimiento de tumores de cáncer de próstata LAPC4 bien establecidos en ratones SCID, y como tratamiento de referencia se usó la castración. Los ratones que poseen tumores se asignan (n = 5/grupo) para recibir una de dos dosis de 5 ó 6 (0,15 mmoles/kg una vez al día o 0,15 mmoles/kg dos veces al día). Los volúmenes tumorales se miden semanalmente y se comparan con controles que reciben vehículo o con ratones castrados.

La castración conduce a una reducción del 55% del volumen tumoral final, según se compara con el control (Figura 6). La administración de 0,15 mmoles/kg una vez al día y 0,15 mmoles/kg dos veces al día de 5 da como resultado la reducción de los volúmenes tumorales finales medios de 41% y 86,5%, respectivamente, en comparación con los tumores en animales del control tratados con vehículo (Figura 6). En contraste con la excelente inhibición del crecimiento tumoral para ratones tratados con 5, los ratones tratados con el compuesto 6 son ineficaces a la dosis baja, o incluso muestran estimulación del crecimiento tumoral en comparación con el control (Figura 6). La incapacidad de 6 para inhibir in vivo el crecimiento tumoral de LAPC4 es especialmente decepcionante debido a que el compuesto es muy eficaz inhibiendo in vitro el crecimiento de células de PCA, y es un antiandrógeno puro muy potente (véase la Figura 1). La disparidad enormemente significativa en la eficacia antitumoral in vivo de 5 y 6 no se puede atribuir fácilmente a diferencias en las propiedades farmacocinéticas de los dos compuestos. La razón o razones subyacentes para las impresionantes diferencias en la eficacia antitumoral in vivo de estos dos compuestos estrechamente relacionados son desconocidas en este momento. Sin embargo, puede ser atribuible a que 6 se convierte en los animales en el metabolito o metabolitos que pueden ser un agonista potente del receptor de andrógenos, provocando así la estimulación del crecimiento tumoral. Durante el estudio, todos los ratones se pesaron una vez por semana. Los pesos corporales de todos los grupos tratados aumentaron ligeramente, y fueron similares al incremento observado con el grupo de control. Todos los ratones parecían sanos, y no se observaron efectos adversos, sugiriendo que los compuestos no poseían toxicidad significativa.

El segundo experimento in vivo ensaya la capacidad de 5 para inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata LAPC4 que crecen en ratones SCID, y como tratamientos de referencia se usaron 16 (Diagrama 1), un potente inhibidor de CYP17/antiandrógeno previamente identificado (Gregoriyev et al. y Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912, anteriormente), y la castración. En este experimento, el tratamiento comienza en el día en el que los ratones se inocularon subcutáneamente con células LAPC4 dependientes de hormonas y se castraron o se les inyectó sc dos veces al día con 5 ó 16. La Figura 7 muestra los efectos de los diversos tratamientos sobre la emergencia y sobre el tamaño de los tumores durante las 21 semanas de terapia.

Todos los otros grupos desarrollaron un tumor palpable y medible en la semana 10 de terapia, excepto el grupo tratado con 16 (0,15 mmoles/kg dos veces al día), que desarrolla tumores palpables y medibles en la 11ª semana. El volumen tumoral total en los ratones del control aumentó 8 veces a lo largo de 14 semanas de tratamiento, cuando los ratones se sacrificaron debido a los grandes tumores. De este modo, los volúmenes tumorales para los otros grupos se comparan con los del grupo del control en la semana 14 de tratamiento. El volumen tumoral en ratones castrados aumenta sólo 4,1 veces (una reducción de alrededor de 50% en comparación con el control), y es similar al incremento de 3,7 veces (reducción de 53,8% en comparación con el control) observado en ratones tratados con 16. En ratones tratados con 5 (0,15 mmoles/kg dos veces al día), el volumen tumoral aumenta sólo 0,5 veces, lo que representa una reducción de 93,8% frente a los ratones del control (P = 0,00065). En la 16ª semana, el volumen tumoral medio en los animales tratados con el compuesto 5 se encuentra que es menor (casi insignificante y durmiente) que su volumen tumoral medio en la 10ª semana, cuando aparecen tumores medibles. Además, 5 provoca un efecto inhibidor significativo sobre tumores, en comparación con 16 o con la castración, P = 0,005 y 0,05, respectivamente. En general, los tumores en los ratones del control, castrados y tratados con el compuesto 16 crecen rápidamente, mientras que el tumor de los ratones tratados con 5 crece muy lentamente y de manera bifásica (Figura 7). El compuesto 5 es el agente más eficaz, y significativamente es mucho más eficaz que la castración a la hora de inhibir el crecimiento tumoral. Es interesante observar que aunque 16 es 6 veces más potente que 5 inhibiendo CYP 17, éste último muestra una actividad antitumoral in vivo superior. La razón o razones responsables de este fenómeno son desconocidas en este momento, pero pueden ser debidas en parte a mejores propiedades farmacocinéticas y o farmacodinámicas de 5.

Para determinar si los tumores de próstata tratados con el compuesto 5 “durmientes” (véase la Figura 7, 16ª semana) son capaces de crecer a una dosis menor de 5, su dosis se redujo hasta 0,15 mmoles/kg tres veces a la semana (una reducción de 78,6% en la dosificación) a partir de las semanas 16-19, y los volúmenes tumorales se midieron semanalmente. Durante este período de tratamiento con una dosis reducida del compuesto, los tumores volvieron a crecer (Figura 7). Después de este intervalo de 3 semanas, se reanudó el tratamiento farmacéutico con la dosis habitual, y el crecimiento tumoral se ralentizó y alcanzó una meseta. Estos datos sugieren una naturaleza citostática de este tratamiento, e infiere en la necesidad de una administración continua para lograr el efecto antitumoral.

Al final del experimento, se determinaron los niveles de 5 en los tumores y órganos de los ratones tratados con 5. Se miden los niveles de 5 mediante HPLC en los tumores, testículos e hígado 1 h después de la administración de la dosis final (inserto de Figura 7). De forma interesante, se detectó una pequeña (∼ 15% con relación a 5) cantidad de metabolito sólo en los tejidos hepáticos. Este metabolito tiene el mismo tiempo de retención que el metabolito observado en el plasma (véase más arriba). La concentración más elevada de 39,0 ± 8,4 µg/mg de tejido de 5 se mide en los tumores s.c. Las concentraciones en el hígado y en los testículos son menores, pero detectables. El nivel de 5 en los tumores es significativamente mayor que los niveles medidos en el plasma, lo que puede ser un resultado de la acumulación del compuesto durante el período del experimento. De este modo, la inhibición del crecimiento tumoral por 5 se puede explicar en parte por concentraciones mayores en xenoinjertos tumorales, lo que puede ejercer un efecto citotóxico/citostático directo sobre las células de cáncer de próstata. Se debería señalar que hay signos para sugerir un posible efecto citotóxico directo de quetoconazol (un inhibidor modesto de CYP 17) sobre células de cáncer de próstata33 . Además, la acumulación de 5 en los testículos permitiría la inhibición de la síntesis de testosterona en los animales.

Aunque está bien establecido que LAPC4 son dependientes de andrógenos, estas células se pueden hacer independientes de andrógenos, y como tales representan un modelo adecuado que imita el desarrollo de cáncer de próstata en pacientes (Chen et al., anteriormente, y Kline et al., “Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice”. Nat. Med., 1997, 3, 402-408). Como se muestra en la Figura 7, somos capaces de reproducir este fenómeno. Además, los resultados muestran que el tratamiento con 16 o con la castración suprime eficazmente el crecimiento tumoral durante un cierto período (fase dependiente de andrógenos), pero fue ineficaz después (posiblemente como resultado de una fase independiente de andrógenos), puesto que los tumores crecen rápidamente justo como en ratones del control intactos. El crecimiento tumoral en los ratones tratados con 5 está fuertemente suprimido durante el período de tratamiento. Esto sugiere que 5 puede tener efectos sobre el cáncer de próstata independiente de andrógenos. Sin embargo, también es plausible que el tratamiento con este compuesto permita que los tumores de LAPC4 sigan siendo dependientes de andrógenos durante un período más prolongado, y por lo tanto sean sensibles a la terapia antiandrogénica.

Estudios recientes que demuestran claramente el aumento de implicación de AR en PCA avanzado y recurrente (Mohler et al., y Chen et al., anteriormente) tienen un interés renovado en el receptor de andrógenos como diana para el desarrollo de fármacos para tratar PCA (Tindall et al., “Symposium on androgen action in prostate cancer”, Cancer Res., 2004, 64, 7178-7180).Debido a sus potentes propiedades, 5 puede ser un excelente candidato.

Conclusiones:

Los datos refuerzan nuestro concepto previo de modificación del sustituyente C17

Δ16

de esteroides para producir potentes inhibidores de CYP17 así como potentes antagonistas de AR. Se muestra que los 17-bencimidazoles 5 y 6 se coordinan al hemohierro de CYP 17, una propiedad que puede ser en parte responsable de su actividad inhibidora de la enzima. Los compuestos 5 y 6 muestran actividades in vitro casi equipotentes para la inhibición de CYP17, antagonismo de AR, e inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata. Sorprendentemente, los compuestos son muy diferentes en sus actividades antitumorales, ya que 5 provoca una notable supresión del crecimiento de xenoinjertos tumorales de LAPC4, y, por el contrario, 6 (0,15 mmoles/kg dos veces al día) potencia el crecimiento tumoral. El presente estudio proporciona pruebas irrefutables de que 5 es un potente inhibidor del crecimiento de tumores prostáticos humanos, y es notablemente más eficaz que la castración. Este es el primer ejemplo de un inhibidor de CYP 17/antiandrógeno que demuestra actividad antitumoral in vivo frente a un tumor de cáncer de próstata en un grado que es magníficamente más eficaz que la castración. Estas actividades biológicas impresionantes hacen a 5 un potente candidato para el desarrollo posterior como fármaco potencial para el tratamiento de cáncer de próstata en seres humanos. La excelente actividad antitumoral del compuesto 5, que contiene un grupo bencimidazólico, hace a los bencimidazoles un grupo preferido.

Sección experimental

Química: Los procedimientos y técnicas generales fueron idénticas a los dados a conocer previamente (Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902-912). Los espectros de infrarrojos se registraron en un espectrómetro Perkin Elmer 1600 FTIR, usando disoluciones en CHCl3. Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se determinan en un espectrómetro de masas 3-Tesla Finnigan FTMS-2000 FT, modo ESI (Ohio State University, Departamento de Química). Como criterio de pureza para compuestos diana clave, se proporcionaron datos espectrales de masas de alta resolución con datos cromatográficos de HPLC que indican homogeneidad de los compuestos. Los espectros de masas de baja resolución (LRMS) se determinaron en un Finnegan LCR-MS. Los puntos de fusión (p.f.) se determinan con un aparato de puntos de fusión de Fischer Johns, y están sin corregir. La deshidoepiandrosterona y el acetato de deshidroepiandrosterona se adquirieron de Aldrich, Milwaukee, WI. La 5tributilestannilpirimidina y la 2-tributilestannilpirazina se adquirieron de Frontier Scientific, Inc., Logan, UT.

3imagen3 -Acetoxi-17-cloro-16-formilandrosta-5,16-dieno (2): Este compuesto preparado a partir de 3β-acetoxiandrost-5-en-17-ona (1) como se describe previamente, proporcionó datos analíticos y espectrales como se describe (Njar et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 902 -912).

3imagen3 -Acetoxi-17-(1H-bencimidazol-1-il)-16-formilandrosta-5,16-dieno (3): Una mezcla de 3β-acetoxi-17-cloro-16-formilandrosta-5,16-dieno (2,25 g, 6,65 mmoles), bencimidazol (2,35 g, 19,9 mmoles), y K2CO3 (2,76 g, 23,9 mmoles) en DMF seca (20 ml) se agita a aprox. 80°C en Ar durante 1,5 h. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vierte sobre agua enfriada con hielo (250 ml), y el precipitado resultante se filtra, se lava con agua, y se seca para dar un sólido blanco sucio bruto (aprox. 2,9 g). La purificación mediante FCC [éter de petróleo/EtOAc/Et3N (6:4:0,3)] da 2,7 g (88,7%) de compuesto 3 puro: p.f. 227-230°C; IR (CHCl3) 3691, 3024, 2951, 2359, 1725, 1670, 1604, 1491, 1452, 1375, 1253, 1032, 897, 852, 818, 700, 657, 618, 576, 565, 550, 529, 511, 476 cm-1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 1,07 (s, 6H, 18-y 19-CH3), 2,04 (s, 3H, 3β-OCH3), 4,60 (m, 1H, 3α-H), 5,43 (br s, 1H, 6-H), 7,35 (br. s, 2H, H aromáticos), 7,85 (s, 1H, H aromático), 7,98 (s, 1H, H aromático), 7,98 (s, 1H, 21-H) y 9,59 (s, 1H, 16-CHO). HRMS calc. 481,2462 (C29H34O3N2.Na+), encontrado 481,2454.

3imagen3 -Acetoxi-17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-5,16-dieno (4): Una disolución de 3β-acetoxi-17-(1H-bencimidazol-1-il)-16-formilandrosta-5,16-dieno (3, 2,04 g, 4,45 mmoles) en benzonitrilo seco (10 ml) se puso a reflujo en presencia de paladio al 10% sobre carbón activado (1,02 g, es decir, 50% en peso de 3) durante 5 h. Después de enfriar hasta la temperatura ambiente, el catalizador se eliminó mediante filtración a través de una almohadilla de Celite. El filtrado se evaporó, y el residuo se purificó mediante FCC [éter de petróleo/EtOAc/Et3N (7,5:3:0,5)] para dar 1,41 g (73,8%) de compuesto 4 puro:

p.f. 159-160°C; IR (CHCl3) 3687, 2947, 2854, 2358, 2340, 1725, 1633, 1609, 1557, 1489, 1454, 1373, 1291, 1253, 1195, 1136, 1031, 985, 910, 839, 735, 665, 590, 544, 533, 513, 502, 488 cm-1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 1,02 (s, 3H, 18-CH3), 1,07 (s, 3H, 19-CH3), 2,04 (s, 3H, 3β-OCH3), 4,62 (m, 1H, 3α-H), 5,43 (br s, 1H, 6-H), 5,98 (s, 1H, 16-H), 7,30 (m, 2H, H aromáticos), 7,49 (s, 1H, H aromático), 7,81 (s, 1H, H aromático), y 7,95 (s, 1H, 21-H). HRMS calc. 453,2512 (C28H34O2.Na+), encontrado 453,2511.

3imagen3 -Hidroxi-17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-5,16-dieno (5): El acetato 4 (1,3 g, 3,02 mmoles) se disolvió en metanol (20 ml) en una atmósfera de Ar inerte, y la disolución resultante se trató con KOH metanólico al 10% (8 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h, y después se concentró a presión reducida a aprox. 40°C hasta un volumen de 10 ml. Esta disolución se vertió en agua con hielo (300 ml), y el precipitado blanco resultante se filtró, se lavó con agua y se secó. La cristalización en EtOAc/MeOH dio 5 (1,10 g, 94%), p.f. 189-190°C; IR (CHCl3) 2934, 2339, 1609, 1490, 1453, 1291, 1040, 837, 808, 705, 663, 608, 578, 550, 517 cm-1 ; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 1,02 (s, 3H, 18-CH3), 1,07 (s, 3H, 19-CH3), 3,55 (m, 1H, 3α-H), 5,41 (br s, 1H, 6H), 5,99 (s, 1H, 16-H), 7,30 (m, 2H, H aromáticos), 7,54 (s, 1H, H aromático), 7,80 (s, 1H, H aromático), y 7,96 (s, 1H, 21-H). HRMS calc. 411,2407 (C26H32ON2.Na+), encontrado 411,2396.

17-(1H-bencimidazol-1-il)androsta-4,16-dieno-3-ona (6): Se separaron por destilación aprox. 10 ml a partir de una mezcla de compuesto 5 (660 mg, 1,70 mmoles), 1metil-4-piperidona (2,5 ml), y tolueno (40 ml). Después se añadió isopropóxido de aluminio (521 mg, 2,55 mmoles), y la mezcla se puso a reflujo en Ar durante 4 h. Después de enfriar, la mezcla se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó sucesivamente con NaHCO3 acuoso al 5% (x3) y salmuera (x2), y después se secó (Na2SO4). El disolvente se evaporó, y el producto bruto se purificó mediante FCC [CH2Cl2/EtOH (25:1)] para dar el compuesto del título 6 (544 mg, 82%): p.f. 201-204°C; IR (CHCl3) 2946, 2858, 1622, 1611, 1490, 1453, 1376, 1291, 1270, 1228, 1189, 893; 850; 837, 722, 662, 615, 568, 553, 537, 519 cm 1; RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ 1,04 (s, 3H, 18-CH3), 1,24 (s, 3H, 19-CH3), 5,78 (s, 1H, 4H), 5,99 (s, 1H, 16-H), 7,31 (m, 2H, H aromáticos), 7,48 (m, 1H, H aromático), 7,81 (s, 1H, H aromático), y 7,95 (s, 1H, 21-H). HRMS calc. 409,2250 (C26H30ON2.Na+), encontrado 409,2250.

Ensayo in vitro de CYP17: Las actividades inhibidoras de CYP17 in vitro de los compuestos se evalúan usando nuestro ensayo rápido de liberación de ácido acético (AARA), utilizando como fuente de enzima E. coli que expresa P450c17 intacta (Grigoryev, anteriormente). Implica el uso de [21-3H]-17α-hidroxipregnenolona como sustrato, y la actividad de CYP17 se mide mediante la cantidad de ácido acético tritiado formado durante la escisión de la cadena lateral C-21 del sustrato. Esto establece que el método es comparable en términos de exactitud y fiabilidad con el procedimiento de análisis mediante HPLC usado por investigadores en el campo (Grigoryev, anteriormente). Los valores de IC50 se obtienen directamente a partir de gráficas que relacionan el porcentaje de inhibición frente a la concentración de inhibidor a lo largo de intervalos apropiados. Cada compuesto se ensaya a un mínimo de cinco concentraciones diferentes. Los ensayos se llevan a cabo por triplicado, y los valores de IC50 dados a conocer son la media de experimentos por triplicado. Las desviaciones estándar fueron ± 5% de los valores medios.

Ensayo de 5imagen2 -reductasa tipo 1 y 2 humana: Las actividades inhibidoras de los compuestos y de finasterida como referencia se determinan usando la estirpe celular DU 145 (para la enzima tipo 1 humana) y homogenado de próstata humana (tejido de BPH para enzima tipo 2), según el procedimiento descrito por Hartmann y colegas (Picard et al., “Synthesis and evaluation of 2’-substituted 4-(4’-carboxy-or 4’carboxymethylbenzylidene)-N-acylpiperidines: Highly potent and in vivo active steroid 5αreductase type 2 inhibitors”, J. Med. Chem., 2002, 45, 3406-3417). Se determinan los valores del porcentaje de inhibición a una concentración de 10 µM, o, en el caso de compuestos más potentes, los valores de IC50.

Ensayos de unión competitiva al receptor de andrógenos (AR) y de luciferasa:

Ensayo de unión a/competición por el AR: Pocillos en cápsulas de múltiples pocillos de 24 pocillos se revisten con poly-L-lisina (0,05 mg/ml) durante 5 minutos, se secaron, se aclararon con agua destilada esterilizada, y se secaron durante 2 horas. Para determinar la cinética de la unión de R1881 al AR de LNCaP y al AR de tipo salvaje, se cultivaron en placas células LNCaP y PC3AR (2-3 x 105) en cápsulas de múltiples pocillos de 24 pocillos en medio libre de esteroides, y se dejó que se adhiriesen. Al siguiente día, el medio se sustituyó por RPMI libre de suero, libre de esteroides, suplementado con 0,1% de BSA y que contiene [3H]R1881 (0,01-10 nM) en presencia o ausencia de un exceso de 200 veces de DHT frío, para determinar la unión no específica, y 1 µM de acetónido de triamcinolona para saturar los receptores de progesterona y de glucocorticoides. Tras un período de incubación de 2 horas a 37ºC, las células se lavaron dos veces con DPBS enfriada con hielo, y se solubilizaron en DPBS que contiene 0,5% de SDS y 20% de glicerol. Los extractos se eliminan, y la radioactividad asociada a las células se contó en un contador de centelleo. El dato se analiza, incluyendo la determinación de Kd y Bmax, mediante regresión no lineal usando el software Graphpad Prism. Cuando se establece la concentración requerida para casi saturar AR en ambas estirpes celulares, se determina la capacidad de los compuestos de ensayo (0,1 nM-10 µM) para desplazar [3H]R1881 (5,0 nM) de los receptores, como se describe anteriormente. La IC50 de cada compuesto se determina mediante regresión no lineal con software Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc, San Diego, CA). Ensayo de transactivación de luciferasa: el ensayo de activación transcripcional se lleva a cabo como se describe previamente por Kim et al., anteriormente, con pequeñas modificaciones. Se genera el constructo informador de luciferasa de probasina ARR2-Luc mediante inserción del promotor mínimo de probasina ARR2, proporcionado amablemente por Dr R Matusik de Vanderbilt University Medical Center (Endocrinology, 2000, 141: 4698-4710), en la región ligadora policlonal del vector potenciador de PGL3 (Promega). Como control interno, se usa el pRL-null (Promega). De forma breve, las células LNCaP que se hicieron crecer en placas de 24 pocillos revestidas con poly-L-lisina se transfectaron con ARR2-Luc en medio RPMI 1640 libre de rojo fenol que contiene 5% de FBS filtrado con carbón (Hyclone). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incuban con medio RPMI 1640 libre de rojo fenol y de suero con o sin DHT e inhibidores durante 18 h. Las actividades de luciferasa se miden por triplicado usando un sistema de ensayo de luciferasa dual según la instrucción del fabricante (Promega). Los resultados se presentan como el número de veces de inducción, esto es, la actividad relativa de luciferasa de las células tratadas dividida por la del control.

Cultivo celular y ensayo de viabilidad: Células LNCaP se hacen crecer en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% de disolución de penicilina/estreptomicina. Para determinar el efecto de los nuevos compuestos sobre la proliferación celular, las células se transfieren a medio libre de esteroides tres días antes del comienzo de los experimentos. El medio libre de esteroides consiste en RPMI libre de rojo fenol suplementado con 5% de suero revestido con dextrano, tratado con carbón, y 1% de disolución de penicilina/estreptomicina. Entonces se llevan a cabo estudios de crecimiento cultivando las células (3 x 104) en cápsulas de múltiples pocillos de 24 pocillos (Corning, Inc. Corning; NY). Después de un período de adhesión de 24 horas, el medio se aspira y se sustituye por medio libre de esteroides que contiene vehículo o la concentración indicada de DHT (1 nM) y compuestos (0,1 µM-10 µM). Los pocillos del control se tratan con vehículo (etanol). Este medio se cambia cada tres días, y el número de células viables se compara mediante ensayo con WST-1 [4-[3-(4-yodofenil)-2-(4nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-bencenodisulfonato] en el séptimo día. Tras la incubación de las células durante el tiempo mencionado anteriormente, se añade disolución de WST-1 al 10% a cada pocillo, y se incuba a 37ºC durante tres horas. Tras la incubación, las placas se agitan ligeramente y se leen inmediatamente a 450 nm con un espectrofotómetro de barrido de múltiples pocillos. Todos los resultados representan la media de un mínimo de tres pocillos. El control adicional consiste en medio solo sin células.

Estudios farmacocinéticos: Todos los estudios con animales se llevaron a cabo según las guías y de acuerdo con el Animal Care Committee de la University of Maryland School of Medicine, Baltimore. Ratones SCID machos, que pesan 20-22 g (8-10 semanas), obtenidos de NCI, Frederick, MD, USA, se mantienen en un entorno controlado de alrededor de 25ºC, 50% de humedad relativa y ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad, y se les dejó acceso libre a comida y agua. Los compuestos 5 y 6 se formularon en β-ciclodextrina al 40% en agua, y a los ratones se les administra una única dosis subcutánea. Los animales se sacrifican en diversos tiempos hasta 6 h después de la administración del fármaco, y la sangre se obtiene mediante punción cardíaca bajo anestesia ligera con halotano (Ayerst, New York, NY, USA).

Análisis de HPLC: Las separaciones y cuantificación cromatográficas de los esteroides y de los patrones internos apropiados se logran mediante el método de HPLC de fase inversa en una columna Waters® Novapak® C18 (3,9 x 150 mm) protegida mediante un cartucho de guarda Waters® empaquetado con una película C18 como se describe previamente. De forma breve, el sistema de HPLC usado en este estudio consistió en un sistema de suministro de disolvente Waters®, un controlador Waters® (Milford, MA), acoplado a un automuestreador Waters® 717plus y un detector de conjunto de fotodiodos Waters® 996 operado a 242,7 nm. La composición de la fase móvil es agua/MeOH/CH3CN (35:35:30, v/v/v + 200 µl de Et3N y 0,77 g de NH4OAc por 1000 ml de fase móvil), a un caudal de 1,0 ml/min. El análisis mediante HPLC se lleva a cabo a temperatura ambiente, y la adquisición y manejo de datos se llevan a cabo con un manipulador cromatográfico Waters® Millennium.

Preparación de muestras: Los tubos de ensayo que contienen plasma de ratón (200 µl), 5 ó 6 y VN/85-1 (patrón interno, 10 µl de 100 µg/ml), se extraen con éter dietílico (2 x 2 ml) usando una mezcladora de vórtice durante 3 minutos, y se centrifugan a 3000 g durante 5 minutos. Las capas orgánicas se evaporan hasta sequedad bajo una corriente suave de aire. El residuo se reconstituye en una alícuota de la fase móvil (100 µl) y se filtra usando filtros de teflón de 0,2 µm antes del análisis mediante HPLC. Curva de calibración y validación del ensayo mediante HPLC: Las curvas de calibración para 5 en plasma y tejido, y para 6 en plasma, se construyen añadiendo cantidades variables de los compuestos de ensayo en tubos de extracción (duplicado) que contienen plasma (200 µl) y preparaciones tisulares (200 µl) procedentes de animales no tratados, para dar concentraciones finales de 0,1-100,0 µg/ml. También se preparan tubos de extracción de blanco apropiados, y se añade una alícuota del patrón interno en cada tubo de extracción para dar una concentración final de 5 µg/ml. Las muestras de calibración se toman a lo largo del procedimiento de preparación de muestras como se describe anteriormente. Se inyecta una alícuota del extracto reconstituido (50 µl) en el sistema de HPLC, y se representa gráficamente la relación de las áreas de los picos para cada analito a la del patrón interno frente a las concentraciones de 5 ó 6. La precisión y exactitud de los ensayos se determinan a partir de un intervalo de concentraciones conocidas de los inhibidores en el plasma de blancos, y se toman a lo largo del procedimiento de HPLC. El estudio se repite en tres ocasiones distintas.

Análisis de datos: Los cálculos farmacocinéticos se llevan a cabo como se describe previamente. Los cálculos farmacocinéticos no compartimentales se llevan a cabo usando WinNOnlin (Scientific Consulting Inc.). Se usó el análisis de varianza de una vía (ANOVA) en SigmaStat para Windows versión 1.0 para comparar diferentes grupos de tratamiento al nivel de confianza del 95%. Para la determinación de la significancia, se usa la prueba post-hoc de Bonferroni. Un valor de P menos que 0,05 se considera estadísticamente significativo.

Estudios antitumorales in vivo (xenoinjertos de cáncer de próstata de LAPC4): Todos los estudios con animales se llevaron a cabo según las guías y autorización del Animal Care Committee de la University of Maryland School of Medicine, Baltimore. Ratones machos con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) de 4-6 semanas adquiridos en el National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center (Fredrick, MD) se enjaulan en un entorno libre de patógenos en condiciones controladas de luz y humedad, y se les deja acceso libre a alimento y a agua. Los tumores se desarrollan a partir de células LAPC4 inoculadas subcutáneamente (s.c.) en los ratones esencialmente como se describe previamente (21). Las células LAPC4 se hacen crecer en IMEM con 15% de FBS más 1% de PS y 10 nM de DHT hasta una confluencia del 80%. Las células se raspan en DPBS, se recogen mediante centrifugación, y se suspenden en Matrigel (10 mg/ml) a 3 x 107 células/ml. A los ratones se les inyecta s.c. 100 µl de la suspensión celular en un sitio en cada flanco. Los tumores se miden semanalmente con calibres, y los volúmenes tumorales se calculan mediante la fórmula: 4/3π x r12 x r2 (r1 < r2).

En el primer experimento, los tumores de LAPC4 se dejan crecer durante 8-10 semanas tras la inoculación. Los grupos de 5 ratones con volúmenes tumorales totales comparables se castran o se tratan con 5 y 6 (0,15 mmoles/kg una vez al día y 0,15 mmoles/kg dos veces al día, 9 a.m. y 5 p.m.). Los ratones se castran con anestesia con metoxifluorano. Los compuestos 5 y 6 se prepararon a 17,2 mg/ml en una disolución al 0,3% de hidroxipropilcelulosa en disolución salina, y los ratones recibieron inyecciones s.c. diariamente. Los ratones del control y castrados se tratan con vehículo solamente. Los tumores se miden semanalmente durante las 4 semanas de tratamiento, y se calculan los volúmenes tumorales. Al final del período de tratamiento, los animales se sacrifican bajo anestesia con halotano; los tumores se extirpan, se pesan y se almacenan a -80ºC. Los animales son pesados también semanalmente y monitorizados para determinar el estado general de salud y signos de posible toxicidad debido al tratamiento.

En el segundo experimento, a los ratones se les inoculan células LAPC4 y se dividen en cuatro grupos de 5 ratones cada uno. El grupo del control y el grupo castrado recibieron vehículo, mientras que los otros dos grupos recibieron VN/85-1 (0,15 mmoles/kg dos veces al día, 9 a.m. y 5 p.m.) o 5 (0,15 mmoles/kg dos veces al día, 9 a.m. y 5 p.m.). Estos tratamiento se inician un día después de la inoculación de las células LAPC4; se continuaron durante 14 semanas para el grupo del control, 19 semanas para los grupos de VN/85-1 y de la castración), y durante 21 semanas para el grupo tratado con 5, y los tumores se miden y se procesan como se describe anteriormente.

Medida de los niveles de 5 (VN/124-1) en tumor, hígado y testículos: Los animales en el grupo tratado con VN/124-1 se sacrificaron 1 h después de la última administración de VN/124-1, y el tumor, el hígado y los testículos se cosecharon y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Las muestras de tejidos se homogeneizaron

5

10

15

-21

en tampón de fosfato (pH = 7,4, 0,5 ml/mg de tejido). El tejido homogeneizado (200 µl) es sembró con el patrón interno, VN/85-1 (10 µl a partir de una disolución madre de 100 µg/ml), y después se extrajo con Et2O (2 x 2 ml) sometiendo a vórtice durante 3 minutos, seguido de la centrifugación a 3000 g durante 5 minutos. El extracto de Et2O se separó y se evaporó hasta sequedad bajo una corriente suave de aire. El residuo se reconstituyó en 100 µl de la fase móvil de HPLC, se filtró a través de filtros de teflón de 0,2 µm, y después se analizó mediante HPLC como se describe anteriormente.

Los ejemplos anteriores se pueden repetir con éxito similar sustituyendo los agentes reaccionantes y/o condiciones de funcionamiento genérica o específicamente descritos de la presente invención por aquellos usados en los ejemplos anteriores.

Tabla 1: Actividades de CYP 17 y 5α-reductasa y unión al receptor de andrógenos de los nuevos compuestos 17-heteroarílicos.

Compuestoa

CYP17 IC50 5imagen2 -Reductasa %de inhibición Unión de AR IC50 (nM)c

(nM)b

a 10 µM

[IC50(nM)]b

tipo 1d

tipo 2e LNCaP PC3-AR

5

300,0 4 53 845 384

6

915,0 [770] [480] 1200 242

9

1250,0 nif 17 - -

10

5817,4 21 56 - -

14

3810,0 - - - 366

15

500,0 - - - 374

Para

comparación

VN/85-1

50,0 - - - -

Abiraterona

800,0 - - - -

Quetoconazol

1100,0 - - - -

Finasterida

- [60,0] [2,0] - -

Casodex

- - - 940 -

Flutamida

- - - 11600 10985

aSe ha dado a conocer previamente la síntesis de VN/85-1 (Njar et al., anteriormente). La abiraterona se sintetizó como se describe por Potter et al (A convenient, large-scale synthesis of abiraterone acetate [3β-acetoxy-17(3-pyridyl)androsta-5,16-diene], a potential new drug for the treatment of prostate cancer. Org. Prep. Proc. Int., 1997, 29, 123-128). bIC50 es la concentración de inhibidor requerida para inhibir la actividad enzimática en un 50%, cada una por duplicado para CYP17, por triplicado para 5α-reductasa y la unión a AR. cIC50 es la concentración de compuesto requerida para una sustitución del 50% de [3H]R1881 a partir del receptor de andrógenos. dEstirpe celular de tumor prostático (DU

e

145) que expresa enzima de tipo 1; sustrato: 5 nM de [1β3-H]androstendiona. Enzima procedente de tejido de BPH (enzima de tipo 2), 125 µg de proteína, sustrato: 210 nM de [1β,2β-3H]testosterona. fni = sin inhibición hasta 10 µM. -= no determinado.

Tabla 2: Parámetros farmacocinéticos para 5 (50 y 100 mg/kg) y 6 (50 mg/kg) después de la administración s.c.

Parámetroa 56

50 mg/kg 100 mg/kg 50 mg/kg t1/2 (min.) 44,17 ± 1,15 36,6 ± 1,6 37,93 ± 1,15 Kel (min.-1) 56,5 ± 0,94 68,49 ± 1,26 0,0183 ± 0,004 AUC (min. µg/ml) 1440,00 ± 60,23 1813,94 ± 10,94 647,10 ± 20,23 Tmax (min.) 30,00 ± 0,0 30,00 ± 0,0 60,00 ± 0,00 Cmax (µg/ml) 16,82 ± 0,37 32,23 ± 0,34 5,15 ± 0,09 MRT (min.) 65,40 ± 0,60 60,46 ± 1,54 79,95 ± 0,01 Vd (ml/kg) 2098,99 ± 4,11 3276,39 ± 26,71 4207,24 ± 6,25

-a Los valores se expresan como media ± S.E., n = 5.

5

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS ESQUEMAS Y FIGURAS

Diagrama 1: Estructuras de abiraterona y VN/85-1 (16).

10 Esquema 1: Síntesis de compuestos 17-benzoazólicos (5, 6, 9 y 10).

Esquema 2: Síntesis de compuestos 17-diazínicos (14 y 15).

Esquema 3: Síntesis de metabolitos de trans-androsterona, incluyendo VNLG/81.

15 Figura 1: Los efectos de 5, 6 y casodex sobre la actividad transcripcional de luciferasa mediada a través de LNCaP-AR en células de cáncer de próstata LNCaP-ARR2-lu. Las células en medio libre de esteroides se trataron con vehículo, o con concentraciones crecientes de 5 o casodex

20 con y sin 1 nM de DHT durante 18 h. Las células se evaluaron entonces para determinar la actividad de luciferasa como se describe en “Materiales y Métodos”. Las barras representan las unidades medias de luz [recuentos por segundo (cps)/unidad de proteína, es decir, actividad relativa de luciferasa] en pocillos triplicados a partir de tres

25 experimentos separados.

Figura 2: Los efectos de 5, 6 y casodex sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata (a) LNCaP y (b) LAPC4. Las células se hicieron crecer en medio libre de esteroides antes de cultivar en placas. Pocillos

30 triplicados se cotrataron entonces con concentraciones crecientes de 5, 6 o casodex y DHT como se describe en “Materiales y Métodos”. El porcentaje (comparado con el control) de inhibición del crecimiento después de 7 días de tratamiento se determinó usando el ensayo de WST-1. Los resultados representan la media y desviación estándar de

35 tres experimentos realizados por triplicado.

Figura 3: Cromatograma de HPLC típico de 5, 16 (patrón interno) y metabolito extraído de plasma de ratón. Los tiempos de retención para 16,

-23

metabolito y 5 fueron 11,5, 17,3 y 21,6 min., respectivamente).

5

Figura 4: Perfiles farmacocinéticos de 5 y 6 tras la administración de una única dosis de bolo subcutánea a ratones SCID machos. Cada punto de dato representa las concentraciones plasmáticas medias obtenidas de tres ratones. Las desviaciones estándar (no mostradas) fueron ± 5-8% de los valores medios.

10

Figura 5: Perfiles farmacocinéticos de 5 y metabolito tras una única dosis de bolo subcutánea (100 mg/kg dos veces a la semana) de 5 a ratones machos.

15 20

Figura 6: Actividad antitumoral in vivo de 5, 6 y orquidectomía sobre el crecimiento de tumores de próstata de LAPC4 en ratones SCID machos. Grupos de cinco ratones con tumores LAPC-4 se trataron con 5 (0,15 mmoles/kg/día o 0,30 mmoles/kg/día). Los volúmenes tumorales se midieron semanalmente, y el porcentaje de cambio en el volumen tumoral se determinó después de 28 días de tratamiento. Las desviaciones estándar de los volúmenes tumorales (no mostradas) fueron ± 10-12% de los valores medios.

25 30 35

Figura 7: Los efectos de 5, 16, y orquidectomía sobre la formación y crecimiento de tumores prostáticos de LAPC4 en ratones SCID machos. Se inyectaron s.c. 3 x 107 células LAPC-4 en el flanco dorsal de ratones SCID. Se castró a un grupo de ratones. Los otros grupos de ratones recibieron vehículo o 5 (0,15 mmoles/kg dos veces al día) o 16 (0,15 mmoles/kg dos veces al día). El tratamiento diario con 5 ó 16 se inició un día después de la inoculación celular. Los volúmenes tumorales se midieron semanalmente, y el porcentaje de cambio en el volumen tumoral se determinó después de 16 semanas de tratamiento. * Indica diferencia significativa de 5 frente al control, castración y 16 a la semana 14 (P = 0,00065, 0,05 y 0,0097, respectivamente). ** Indica diferencia significativa de 5 frente a la castración y 16 a la semana 16 (P = 0,047 y 0,0047, respectivamente). ↓-↓↓: Período de dosis administrada reducida de 5.

imagen1

Abiraterona VN/85-1 (16) Diagrama 1: Estructuras de abiraterona y VN/85-1

imagen1

Esquema 1. (i) POCl3-DMF, CHCl3, Ar, reflujo; (ii) bencimidazol, K2CO3, DMF, Ar, 80°C; (iii) Pd al 10% sobre carbón activado, PhCN, reflujo; (iv) KOH metánolico al 10%, Ar, rt.; (v) Al(i-PrO)3, 1-metil-4-piperidona, tolueno, reflujo; (vi) benzo-1H-1,2,3-triazol, K2CO3, DMF, Ar, 80°C; (vii) (PPh3)2RhCOCl-Ph2(CH2)3PPh2, xileno, Ar, reflujo.

imagen1

Esquema 2:

i) N2H4.H2O, N2H4.H2SO4, EtOH; ii) I2/THF, TG; iii) (2

tributilestannil)pirazina/Pd(PPh3)4;

iv) (5

10

tributilestannil)pirimidina/Pd(PPh3)4

Esquema 3: Síntesis de metabolitos de trans-androsterona, incluyendo VNLG/81

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Claims (3)

1. Compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata

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10 2. Compuesto según la reivindicación 1, para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata, en el que la enfermedad de la próstata es cáncer de próstata o hiperplasia prostática.

15 3. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata.

20 4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata, en la que la enfermedad es cáncer de próstata o hiperplasia prostática.

25 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, formulada para administración oral.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, formulada para suministro

30 mediante una vía seleccionada de parenteral, entérica, intraperitoneal, tópica, transdérmica, oftálmica, nasal, local, no oral, tal como aerosol, pulverización, inhalación, subcutánea, intravenosa, intramuscular, bucal, sublingual, rectal, vaginal, intra-arterial o intratecal.

35

7. Compuesto, uso o composición según cualquier reivindicación anterior, para uso en el tratamiento de una enfermedad de la próstata, en el que el compuesto de fórmula 1 o una sal farmacéuticamente aceptable está en combinación con cualquier otro ingrediente o ingredientes activos.