ES2353636T3 - Proteína portadora de poliepítopos. - Google Patents

Abstract

Una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T.

Description

La presente invención se refiere a proteínas portadoras de poliepítopos. Cuando se conjugan con polisacáridos capsulares, estas proteínas portadoras son útiles como componentes de vacunas que son capaces de estimular una respuesta inmune de linfocitos T-dependientes particularmente, las proteínas de la presente invención se pueden usar para conferir protección frente a la infección procedente de bacterias encapsuladas en niños de edades comprendidas entre los 3 meses y aproximadamente los 2 años.

Bacterias encapsuladas tales como Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae constituyen una causa significativa de morbilidad y mortalidad en neonatos y niños en todo el mundo (Tunkel y Scheld, 1993). En los países en desarrollo, alrededor de un millón de niños mueren cada año debido exclusivamente a pulmonía. Además, incluso en países desarrollados, el aumento del fenómeno de resistencia a los antibióticos significa que existe una gran necesidad de mejorar las vacunas existentes.

La cápsula constituida por polisacáridos de H. influenzae, N. meningitidis y S. pneumoniae representa un factor de virulencia principal en la colonización nasofaríngea y la invasión sistémica por bacterias encapsuladas (Moxon y Kroll, 1990). Por consiguiente, la mayor parte de la investigación dirigida hacia el hallazgo de inmunógenos protectores se ha centrado en los polisacáridos capsulares. El hallazgo de que estos polisacáridos eran capaces de estimular la formación de anticuerpos protectores condujo al desarrollo de numerosas vacunas que han sido eficaces en la protección de adultos contra la enfermedad (Andreoni y col. 1993; Goldblatt y col. 1992).

El problema con las vacunas de polisacáridos capsulares desarrolladas hasta la fecha es que adolecen de una incapacidad inherente de proteger a niños menores de dos años de edad de la enfermedad (Holmes y Granoff 1992). Esto es un inconveniente significativo cuando se aprecia que esta población de niños tiene un riesgo más elevado de infección. Se cree que el fracaso en el bloqueo de la infección deriva de la reacción inmune de los linfocitos T de tipo independiente (TI) que es la única respuesta de anticuerpos utilizada por el cuerpo frente a los antígenos polisacáridos. Este tipo de respuesta no implica moléculas de restricción MHC de Clase II para la presentación de los linfocitos T: como consecuencia, se evita la ayuda de los linfocitos T. Aunque la respuesta TI funciona bien en adultos, está inactivada en muchos niños pequeños debido a una combinación de factores tales como la inmadurez funcional de las células B, la inactivación de la señalización mediada por los receptores de las células B y la debilidad de las células B en respuesta a la estimulación por el antígeno

Para superar este inconveniente, se están estudiando actualmente dos enfoques concretos de vacuna. El primero es el desarrollo de vacunas antiidiotípicas que contienen péptidos que mimetizan idiotipos de carbohidratos (McNamara 1984; Agadjanyan, 1997). El segundo enfoque implica vacunas conjugadas que se diseñan para transformar antígenos polisacáridos de linfocitos T independientes (TI) en antígenos T dependientes (TD) mediante el enlace covalente del polisacárido a un péptido portador.

Las vacunas conjugadas de H. influenzae de tipo B (Hib) representan un ejemplo sobresaliente del desarrollo de otras vacunas frente a infecciones que son debidas a bacterias encapsuladas. De hecho, la meningitis y otras infecciones producidas por Hib han disminuido drásticamente en países donde se ha conseguido la vacunación generalizada con conjugados de Hib (Robins, 1996). Puede ser posible la eliminación completa del patógeno, pero depende de diversos factores, entre los que se incluyen una mejora adicional de las vacunas existentes (Liptak, 1997).

Se han seleccionado los toxoides de los antígenos del tétanos y la difteria procedentes de vacunas pediátricas ampliamente distribuidas como proteínas portadoras con el objetivo de aprovechar una población ya estimulada en el momento de la inyección de la vacuna conjugada. La vacunación previa con vacunas pediátricas de difteria-tétanos (DT) o difteria-tétanos-pertussis (DTP) significa que se puede aprovechar en la actualidad el estímulo del portador para potenciar la respuesta inmune a los conjugados polisacáridos.

Se han producido satisfactoriamente muchas de dichas vacunas y han sido eficaces en la reducción del número de muertes producidas por estos patógenos. Los portadores usados en estas vacunas son antígenos grandes tales como el toxoide del tétanos, la toxina del mutante CRM197 de la difteria no tóxica y el complejo de proteínas de la membrana externa del grupo B de N. meningitidis (OMPC). Sin embargo, en el futuro, se piensa que a medida que aumente el número de vacunas conjugadas que contengan las mismas proteínas portadoras, es probable que llegue a ser un problema la supresión de las respuestas inmunes de los anticuerpos ya existentes al portador.

Se está dirigiendo ahora la mayor parte de la investigación al desarrollo de moléculas portadoras mejoradas que contengan péptidos portadores que comprendan epítopos CD4 de los linfocitos T cooperadores (Th), pero que no posean funciones supresoras de los linfocitos T (Ts) (Etlinger y col. 1990). Los péptidos que retienen únicamente funciones cooperadoras (epítopos CD4+) son más adecuados como portadores, debido a que su efecto es suficiente para inducir el linfocito T cooperador, pero el portador es lo suficientemente pequeño para limitar o evitar completamente la producción de anticuerpos dirigidos contra el portador.

Varias publicaciones demuestran la capacidad de dichos péptidos de conferir linfocitos T cooperadores a haptenos cuando se unen a los anteriores de forma covalente (Etlinger, 1990; Valmori 1992; Sadd 1992; Kumar 1992; Kaliyaperumal, 1995; De Velasco, 1995 y Bixler 1989).

Sin embargo, hasta la fecha, estas publicaciones no han dado como resultado el desarrollo de vacunas eficaces. Sigue existiendo de esta manera una gran necesidad de desarrollo de nuevas estrategias para mejora de vacunas que sean eficaces para combatir enfermedades producidas por bacterias encapsuladas en niños y niños pequeños.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T. Preferiblemente, la proteína portadora está conjugada con un polisacárido. Estos compuestos son útiles como compuestos inmunógenos que pueden a la vez ser útiles como componentes de vacunas protectoras frente a enfermedades producidas por bacterias patógenas.

Una proteína portadora es una entidad polipeptídica antigénica que induce la formación de anticuerpos dirigidos contra un antígeno conjugado con ésta por el sistema inmune de un organismo en el cual se introduce el conjugado del portador-antígeno. La necesidad de usar proteínas portadoras es el resultado del hecho de que aunque muchos epítopos cortos son protectores, son poco inmunógenos. Esto niega la utilidad de estos epítopos en la generación de nuevas vacunas eficaces. Conjugando una proteína portadora inmunógena con una molécula que no es inmunógena, es posible conferir la elevada inmunogenicidad de la proteína portadora a la molécula conjugada. Dichas moléculas conjugadas estimulan la generación de una respuesta inmune frente a la parte no inmunógena de la molécula conjugada y de esta manera se han usado eficazmente en vacunas que protegen frente a patógenos para los cuales no podría generarse de otra forma inmunidad protectora.

Por tanto, se han usado históricamente proteínas muy inmunógenas (tales como el toxoide del tétanos) como portadoras con el fin de inducir una respuesta de los linfocitos Th que proporcionan ayuda a los linfocitos B para la producción de anticuerpos dirigidos contra epítopos no inmunógenos. Sin embargo, no se ha conseguido generalmente efectividad global con esta solución, debido a que la respuesta del anticuerpo a un hapteno (el epítopo) acoplado a una proteína portadora se puede inhibir cuando el hospedador receptor se ha inmunizado previamente con la proteína portadora no modificada. Este fenómeno se denominó como supresión específica de epítopo y se ha estudiado ahora en una variedad portadora de hapteno.

El acoplamiento de polisacáridos bacterianos con proteínas portadoras ha demostrado mejorar la inmunogenicidad del polisacárido y da como resultado antígenos con características novedosas. Además, el acoplamiento de un polisacárido timo independiente (TI) con una proteína vuelve al polisacárido timo dependiente (TD).

Un epítopo CD4+ de linfocito T es un epítopo peptídico que estimula la actividad de

aquellos linfocitos T que son moléculas MHC de Clase II restringidas. Este subconjunto de linfocitos T incluye a los linfocitos Th. Los expertos en la materia conocen bien muchos epítopos CD4+ y han demostrado conferir haptenos a linfocitos T cooperadores cuando se enlazan covalentemente a los anteriores (Etlinger y col, 1990; Valmori 1992; Sadd 1992; Kumar 1992; Kaliyaperumal, 1995).

Los epítopos CD4+ de linfocitos T usados en las proteínas portadoras de la presente invención comprenden idealmente péptidos que tienen una longitud tan corta como es posible. El epítopo retendrá de esta manera sus características hasta un grado suficiente para inducir linfocitos T cooperadores, pero que sigan siendo suficientemente pequeños para minimizar la excesiva producción de anticuerpos dirigidos contra el portador. Esto es preferible, debido a que se piensa que es probable que la supresión de respuestas inmunes por anticuerpos preexistentes en epítopos portadores llegue a ser un problema en el futuro si el número de vacunas conjugadas que contienen proteínas portadoras comunes sigue creciendo. Además, el uso de péptidos cortos como epítopos portadores da como resultado la selección racional de epítopos Th adecuados, evitando a la vez tramos de secuencia que contengan epítopos de linfocitos B o T supresores que serían perjudiciales para la función de la proteína de estimular una respuesta inmune TI.

Las proteínas adecuadas de las que se pueden seleccionar los epítopos CD4+ incluyen la toxina del tétanos (TT), el circunsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno superficial de la hepatitis B, la proteína central nuclear de la hepatitis B, la proteína de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, el toxoide de la difteria, el mutante CRM197 del toxoide de la difteria, el complejo de proteínas de la membrana externa del grupo B de N. meningitidis (OMPC), la pneumolisina de la toxina pneumocócica, y las proteínas de choque térmico de Mycobacterium bovis y M. leprae. El epítopo HSP70 408-427 de M. leprae no se encuentra en la secuencia homóloga humana correspondiente (Adams y col., 1997 Infect Immun,

65: 1061-70); ya que una posible limitación en el uso de los motivos HSP en las formulaciones de vacuna tiene la posibilidad de inducir respuestas autoinmunes debido a la elevada homología entre los Hasp microbiano y humano, este epítopo es particularmente preferido. Los expertos en la materia conocen bien otros epítopos peptídicos portadores adecuados. Los epítopos CD4+ de los linfocitos T seleccionados de estos antígenos son reconocidos por los linfocitos T CD4+ humanos.

Se ha encontrado que el número de epítopos de linfocitos T presentes en la proteína portadora tiene una significativa influencia en conferir linfocitos T cooperadores a las moléculas de oligosacáridos conjugadas con las anteriores. La proteína portadora del poliepítopo debería contener de 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T. Preferiblemente, la proteína portadora del poliepítopo contiene 10, 11 ó 19 de linfocitos T CD4+ degenerados.

Se ha encontrado que el uso de varios epítopos universales en la proteína portadora reduce el problema de restricción genética de la respuesta inmune generada contra los antígenos peptídicos.

Adicionalmente a los epítopos CD4+, las proteínas portadoras de la presente invención pueden comprender otros péptidos o fragmentos de proteínas, tales como epítopos procedentes de citocinas inmunomoduladoras tales como interleucina 2 (IL-2) o el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF). Se pueden usar también péptidos promiscuos (Panina-Bordignon y col 1989), los así denominados péptidos “universales” (Kumar y col., 1992), péptidos agrupados (Ahlers y col., 1993) o péptidos que contienen epítopos de linfocitos T y B (Lett y col, 1994) para reclutar varios sistemas efectores del sistema inmune, según se requiera.

Como será evidente para los expertos en la materia, se puede producir la proteína portadora del poliepítopo mediante cualquier medio adecuado. Dos procedimientos preferidos de construcción de proteínas portadoras de acuerdo con la invención se dirigen a la síntesis y a la producción de proteínas recombinantes. Preferiblemente, las proteínas portadoras de poliepítopos de la presente invención se producen por medios recombinantes, mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico codificante. La expresión recombinante tiene la ventaja de que la producción de la proteína portadora es barata, segura, fácil y no implica el uso de compuestos tóxicos que puedan requerir eliminación posterior.

Cuando se expresan en forma recombinante, las proteínas portadoras de la presente invención se generan mediante la expresión de un ácido nucleico codificante en una célula hospedadora Se puede usar cualquier célula hospedadora dependiendo de los requerimientos individuales de un sistema de vacunas concreto. Preferiblemente, se usan hospedadores bacterianos para la producción de proteínas recombinantes, debido a la facilidad con la que se pueden manipular y hacer crecer dichas bacterias. El hospedador bacteriano de elección es Escherichia coli.

Preferiblemente, si se producen de manera recombinante, las proteínas portadoras se expresan a partir de plásmidos que contienen una inserción de ácido nucleico. Dichas inserciones se pueden diseñar mediante hibridación de los dupletes de oligonucleótidos que codifican los epítopos CD4+ de linfocitos T. Se pueden diseñar los extremos 5’ y 3’ de los enlazantes sintéticos con el fin de que se hibriden entre sí. Esta técnica permite hibridar los oligonucleótidos en un orden aleatorio, dando como resultado una mezcla de minigenes potencialmente diferentes que comprenden una cualquiera de varias posible combinaciones epítopos. A continuación se clona esta mezcla en cualquier vector de expresión adecuado y se lleva a cabo entonces un procedimiento de selección de clones que se expresan. Esta estrategia asegura que se seleccionan únicamente aquellos clones que producen una proteína portadora que no es perjudicial para la salud de la célula en la que se expresan. De manera inversa, se ha encontrado que la selección arbitraria del orden de los epítopos es menos satisfactoria.

Se pueden diseñar los enlazantes que codifican epítopos de tal manera que se introduzcan dos codones entre los epítopos individuales cuando tiene lugar la hibridación. Restos de aminoácidos tales como glicina o lisina son ejemplos de restos adecuados para uso en los separadores. En particular, el uso de restos de lisina en los separadores permite la conjugación adicional de la proteína portadora con el polisacárido capsular. Adicionalmente, el sitio de inserción en el plásmido de expresión en el que se clona el ácido nucleico que codifica la proteína portadora puede permitir la unión de la proteína portadora del poliepítopo con una etiqueta, tal como el péptido o la polihistidina “flag”. Esta disposición facilita la posterior purificación de la proteína recombinante.

Se puede clonar el ácido nucleico que codifica la proteína portadora del poliepítopo bajo el control de un promotor inducible, permitiendo de esta manera la precisa regulación de la expresión de la proteína portadora. Los expertos en la materia conocerán bien los sistemas inducibles adecuados e incluyen el bien conocido sistema lac (Sambrook y col. 1989).

El técnico experto conocerá bien los procedimientos de expresión recombinante de las proteínas portadoras de acuerdo con la invención, pero, con fines de claridad, se describen brevemente en el presente documento.

Se conocen en la materia los sistemas de expresión en mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de mamífero y de iniciar la transcripción en la dirección 3’ (3’) de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción, que se sitúa normalmente próxima al extremo 5’ de la secuencia de codificación, y una secuencia TATA, localizada normalmente 25-30 pares de bases (pb) en la dirección 5’ del sitio de inicio de la transcripción. Se piensa que la secuencia TATA dirige a la ARN polimerasa II con el fin de comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero contendrá también un elemento promotor en la dirección 5’, localizado normalmente 100 a 200 pb en la dirección 5’ de la secuencia TATA. Un elemento promotor en la dirección 5’ determina la velocidad a la cual se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación [Sambrook y col. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.].

Los genes víricos de mamíferos se expresan a menudo mucho y tienen una amplia gama de hospedadores; por tanto, las secuencias que codifican genes víricos de mamíferos proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Entre los ejemplos se incluyen el promotor temprano de SV40, el promotor LTR del virus del tumor mamario de ratón, el promotor tardío mayor del adenovirus (Ad MLP), y el promotor del virus del herpes simple. Adicionalmente, secuencias derivadas de genes no víricos, tales como el gen de la metalotioneína de murino, proporcionan también secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser tanto constitutiva como regulada (inducible), dependiendo de que se pueda inducir el promotor con glucocorticoides en células sensibles a hormonas.

La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, aumentará normalmente los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a promotores homólogos u heterólogos, comenzando la síntesis en el sitio normal de inicio del ARN. Los potenciadores son también activos cuando se sitúan en la dirección 5’ o en la dirección 3’ a partir del sitio de inicio de la transcripción, tanto en orientación normal como invertida, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos desde el promotor [Maniatis y col. (1987) Science 236:1237; Alberts y col. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª ed.]. Los elementos potenciadores derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que tienen usualmente una gama más amplia de hospedadores. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 [Dijkema y col (1985) EMBO J. 4:761] y los potenciadores/promotores procedentes de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous [Gorman y col. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] y del citomegalovirus humano [Boshart y col. (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, algunos potenciadores son regulables y se convierten en activos únicamente en presencia de un inductor, tal como una hormona o ión metálico [Sassone-Corsi y Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis y col. (1987) Science 236:1237].

Se puede expresar una molécula de ADN intracelularmente en células de mamíferos. Se puede unir directamente una secuencia promotora con la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir el término N de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, se pueden segregar también proteínas extrañas procedentes de la célula en los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia líder que facilita la secreción de la proteína extraña en células de mamíferos. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína procedente de la célula. La líder tripartita del adenovirus es un ejemplo de secuencia líder que facilita la secreción de una proteína

extraña en células de mamíferos.

Usualmente, las secuencia de terminación y de poliadenilación de la transcripción reconocidas por las células de mamíferos son regiones reguladoras localizadas 3’ respecto del codón de detención de la traducción, y de esta manera, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia de codificación. El término 3’ del ARNm maduro está formado por la escisión post-transcripcional y la poliadenilación específicas del sitio [Bimstiel y col. (1985) Cell 41:349; Proudfoot y Whitelaw (1988) "Termination and 3’ end processing of eukaryotic RNA. En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover): Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Entre los ejemplos de terminador de la transcripción/señales de poliadenilación se incluyen los derivados de SV40 [Sambrook y col (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Algunos genes se pueden expresar más eficazmente cuando están presentes intrones (denominados también secuencias de intervención). Se han expresado eficazmente algunos ADNc procedentes de vectores que carecen de señales de corte y empalme (denominados también sitios donantes y aceptores de corte y empalme) [véase por ejemplo, Gothing y Sambrook (1981) Nature 293:620]. Los intrones son secuencias no codificantes intervinientes dentro de una secuencia de codificación que contiene sitios donantes y aceptores de corte y empalme. Se eliminan mediante un procedimiento denominado “corte y empalme”, que sigue a la poliadenilación de la transcripción primaria [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett y col. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Krainer y Maniatis (1988) "RNA splicing." En Transcription and splicing (ed. B.D. Hames y D.M. Glover)].

Usualmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, una señal de poliadenilación, y una secuencia de terminación de la transcripción, se introducen conjuntamente en las construcciones de expresión. Se pueden incluir también en la construcción de expresión, si se desea, potenciadores, intrones son sitios donantes y aceptores de corte y empalme funcionales, y secuencias líder. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un hospedador, tal como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de replicación en mamíferos incluyen los derivados de virus animales, que requieren de factores de actuación en trans para replicarse. Por ejemplo, plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] o poliomavirus, para replicar un número extremadamente elevado de copias en presencia del antígeno T vírico apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados del virus del papiloma bovino y del virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, lo que le permite de esta manera mantenerse, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y la amplificación. Ejemplos de dichos vectores lanzadera de mamíferos-bacterias incluyen pMT2 [Kaufman y col. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946 y pHEBO [Shimizu y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

El procedimiento de transformación usado depende del hospedador que se va a transformar Se conocen en la materia procedimientos de introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos e incluyen la transfección mediada por dextrano, la precipitación con fosfato de calcio, la transfección mediada por polibreno, la fusión de protoplastos, la electroporación, la encapsulación del polinucleótido(s) en liposomas, y la microinyección del ADN en los núcleos.

Se conocen en la materia líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedadores para la expresión e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), entre las que se incluyen, pero no se limitan a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, HEP G2), y otras muchas líneas celulares.

Se puede insertar también el polinucleótido que codifica la proteína en un vector de expresión de insecto adecuado, y se une de manera operable a los elementos de control dentro del vector. La construcción del vector emplea técnicas que se conocen en la materia. Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, normalmente, un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma de baculovirus, y un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o los genes heterólogos que se van a expresar, un baculovirus natural con una secuencia homóloga a la del fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus), y células hospedadoras de insectos y medios de crecimiento apropiados.

Tras insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma vírico natural se transfectan en una célula hospedadora de insecto donde se permite que se recombinen el vector y el genoma vírico. El virus recombinante empaquetado se expresa y las placas recombinantes se identifican y purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de células de baculovirus/insectos están comercialmente disponibles en forma de kit comercializados por, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit “MaxBac”). Los expertos en la materia conocen generalmente estas técnicas y se describen completamente en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nº 1555

(1987) (a partir de ahora en el presente documento "Summers y Smith").

Antes de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, un líder (si se desea), una secuencia de codificación de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente en una construcción de translocación intermedia (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un único gen y elementos reguladores unidos de manera operable; múltiples genes, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de manera operable; o múltiples genes, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de translocación intermedias se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un hospedador, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, lo que le permite de esta manera mantenerse en un hospedador adecuado para la clonación y la amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Se han diseñado otros muchos vectores, conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de inicio de la polihedrina de ATG a ATT, y que introduce un sitio de clonación BamHI de 32 pares de bases en la dirección 3’ desde el ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17:31.

El plásmido contiene también normalmente la señal de poliadenilación de la polihedrina (Miller y col. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen procariota de resistencia a la ampicilina (amp) y el origen de replicación para la selección y propagación en E. coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen normalmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus y de iniciar la transcripción en la dirección 5’ a 3’ (5’ a 3’) de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente próxima al extremo 3’ de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de la transcripción incluye usualmente un sitio de unión a la ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus puede tener también una segunda región denominada potenciador, que, si está presente, es normalmente distal al gen estructural. La expresión puede ser tanto regulada como constitutiva.

Los genes estructurales, abundantemente transcritos al final de un ciclo de infección vírica, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Entre los ejemplos se incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína polihédrica vírica. Friesen y col., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression." en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publ. EPO Nos. 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak y col., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

Se puede derivar el ADN que codifica las secuencias señales adecuadas de los genes de proteínas segregadas de insectos o baculovirus tales como el gen de la polihedrina de baculovirus (Carbonell y col. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, debido a que las señales de las modificaciones postraduccionales de células de mamíferos (tales como la escisión del péptido señal, la escisión proteolítica, y la fosforilación) parecen ser reconocidas por las células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y la acumulación nuclear parecen también conservarse entre células de invertebrados y células de vertebrados, y se pueden usar también líderes de origen no insecto, tales como los derivados de los genes que codifican el interferón γ humano, Maeda y col., (1985), Nature 315:592; human gastrin-releasing peptide, Lebacq-Verheyden y col., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humana, Smith y col., (1985) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima y col., (1987) Gene 58:273; y glucocerebrosidasa humana, Martin y col. (1988) DNA, 7:99, para proporcionar la secreción en insectos.

Se puede expresar un polipéptido o poliproteína recombinante intracelularmente, o, se puede segregar si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas. Una buena expresión intracelular de las proteínas extrañas no segregadas requiere normalmente genes heterólogos que tienen idealmente una secuencia líder corta que contiene señales de inicio de la traducción adecuadas que preceden a una señal de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, se pueden segregar poliproteínas o proteínas recombinantes que no se segregan naturalmente procedentes de células de insectos creando moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos. El fragmento de secuencia líder codifica normalmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirige la translocación de la proteína en el retículo endoplásmico.

Tras la inserción de la secuencia de ADN y/o del gen que codifica el producto de expresión precursor de la proteína, una célula de insecto hospedadora se transforma simultáneamente con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico del baculovirus natural – usualmente mediante transfección simultánea. El promotor y la secuencia de terminación de la transcripción de la construcción comprenderán normalmente una sección de 2-5 kb del genoma de baculovirus. Se conocen en la materia los procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus (véanse Summers y Smith más arriba; Ju y col. (1987); Smith y col., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el gen de la polihedrina, mediante recombinación homóloga con doble entrecruzamiento; la inserción puede ser también en un sitio de restricción del enzima en el gen de baculovirus deseado. Miller y col., (1989), Bioessays 4:91. La secuencia de ADN, cuando se clona en lugar del gen de la polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada por las secuencias 5’ y 3’ específicas de la polihedrina y se sitúa en la dirección 3’ del promotor de la polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus recientemente formado se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. Se produce la recombinación homóloga a frecuencia baja (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); de esta manera, la mayoría de los virus producidos tras la transfección simultánea siguen siendo virus naturales. Por tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es un cribado visual que permite distinguir a los virus recombinantes. La proteína polihedrina, que está producida por el virus natural, se produce a niveles muy elevados en los núcleos de las células infectadas al final de la infección vírica. La proteína polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que contienen también partículas incluidas. Estos cuerpos de inclusión, de hasta 15 Om de tamaño, son muy refráctiles, lo que las proporciona una apariencia viva brillante que se visualiza fácilmente con el microscopio óptico Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus naturales, se plaquea el sobrenadante de la transfección sobre una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Concretamente, se criban las placas con el microscopio óptico para la presencia (indicativa de virus naturales) o ausencia (indicativa de virus recombinantes) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel y col. eds) en 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers y Smith, más arriba; Miller y col. (1989).

Se han desarrollado vectores de expresión de baculovirus recombinantes para la infección en algunas células de insectos. Por ejemplo, se han desarrollado baculovirus recombinantes para, entre otros: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda,y Trichoplusia ni (Pub. PCT Nº. WO 89/046699; Carbonell y col., (1985) J. Virol. 56:153: Wright (1986) Nature 321:718: Smith y col., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y, véase generalmente, Fraser, y col. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Las células y los medios de Cultivo celulares están comercialmente disponibles para la expresión directa y mediante fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de expresión de baculovirus; las personas expertas en la técnica conocen generalmente la tecnología del cultivo celular. Véase, por ejemplo, Summers y Smith, más arriba.

A continuación se pueden hacer crecer las células de insecto modificadas en un medio

nutriente apropiado, que permite el mantenimiento estable del plásmido(s) presente en el insecto hospedador modificado. Cuando el producto génico de expresión está bajo control inducible, se puede hacer crecer el hospedador hasta una densidad elevada, y se induce la expresión. Alternativamente, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará continuamente en el medio y el medio nutriente debe hacerse circular continuamente, retirando a la vez el producto de interés y aumentando los nutrientes agotados. Se puede purificar el producto mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación en gradiente de densidad; extracción con disolvente, o similares. Según sea apropiado, se puede purificar el producto, según se requiera, con el fin de eliminar sustancialmente cualquier proteína de insecto que se segrega también en el medio o como resultado de la lisis de las células de insecto, con el fin de proporcionar un producto que esté al menos sustancialmente exento de residuos del hospedador, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.

Con el fin de obtener la expresión de la proteína, se incuban células hospedadoras recombinantes derivadas de los transformantes, en condiciones que permitan la expresión de la secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula hospedadora seleccionada. Sin embargo, las condiciones son fácilmente determinables para los técnicos normalmente expertos en la materia, basándose en lo que se sabe en la materia.

Se conocen en la materia las técnicas de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción en la dirección 3’ (3’’) de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que se sitúa normalmente próxima al extremo 5’ de la secuencia de codificación. La región de inicio de la transcripción incluye normalmente un sitio de unión a la ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también una segunda región denominada operador, que puede solapar un sitio de unión adyacente de la ARN polimerasa en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite la transcripción regulada negativa (inducible), a medida que una proteína represora del gen puede unirse al operador e inhibir por tanto la transcripción de un gen específico. Se puede producir la expresión constitutiva en ausencia de elementos reguladores negativos, tales como el operador. Adicionalmente, se puede conseguir la regulación positiva mediante una secuencia de unión a la proteína activadora del gen, que si está presente se localiza usualmente próxima (5’) a la secuencia de unión a la ARN polimerasa. Un ejemplo de proteína activadora del gen es la proteína activadora del catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud y col. (1984) Annu.

Rev. Genet. 18:173]. La expresión regulada puede ser por tanto positiva como negativa, potenciando o reduciendo por tanto la transcripción.

Las secuencias que codifican enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Entre los ejemplos se incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcares, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang y col. (1977) Nature 198:1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotora derivadas de enzimas biosintéticos tales como triptófano (trp) [Goeddel y col. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton y col. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Patente de los Estados Unidos Nº 4.738,921; Publ. EPO Nos . 036 776 y 121 775]. El sistema promotor de la g-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." En Interferon 3 (ed. I. Gresser)], los sistemas promotores del bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292:128] y T5 [Patente de los Estados Unidos Nº 4.689.406] proporcionan también secuencias promotoras útiles.

Adicionalmente, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago se pueden unir con las secuencias de operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [Patente de los Estados Unidos Nº. 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido trp-lac comprendido por las secuencias del promotor trp y el operón lac que está regulado por el represor lac [Amann y col. (1983) Gene 25:167; de Boer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se produce naturalmente de origen no bacteriano puede también acoplarse con una ARN polimerasa compatible para producir elevados niveles de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor y col. (1985) Proc Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Adicionalmente, un promotor híbrido puede también estar comprendido por un promotor de bacteriófago y una región operadora de E. coli (Publ. EPO Nº 267 851).

Adicionalmente a una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión al ribosoma eficaz es también útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión al ribosoma se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos en la dirección 5’ del codón de inicio [Shine y col. (1975) Nature 254:34]. Se piensa que la secuencia SD promueve la unión del ARNm con el ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia SD y el extremo 3’ del ARNr de 16S de E. coli [Steitz y col. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expresar genes eucariotas y genes procariotas con sitio de unión al ribosoma débil [Sambrook y col. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Una molécula de ADN se puede expresar intracelularmente. Una secuencia promotora se puede unir directamente a la molécula de ADN, en cuyo caso, el primer aminoácido en el término N será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina del término N de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación tanto in vitro como in vivo con peptidasa N terminal de metionina bacteriana (Publ EPO Nº 219 237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para dirigir la expresión. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se fusiona con el extremo 5’ de las secuencias de codificación heterólogas Tras la expresión, está construcción proporcionará una fusión de dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, se puede unir el gen celular del bacteriófago lambda al término 5’ de un gen extraño y expresarse en la bacteria. La proteína de fusión resultante retiene un sitio con el fin de que un enzima de procesamiento (factor Xa) escinda la proteína del bacteriófago del gen extraño [Nagai y col. (1984) Nature 309:810]. Se pueden preparar también proteínas de fusión con secuencias procedentes de los genes lacZ [Jia y col. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff y col. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], y Chey [Publ. EPO No. 324 647]. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio de escisión. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubiquitina Dicha proteína de fusión se prepara con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente un sitio para el enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de la ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, se puede aislar la proteína extraña natural [Miller y col. (1989) Bio/Technology 7:698].

Alternativamente, se pueden segregar proteínas extrañas de la célula creando moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia de péptido señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en la bacteria [Patente de los Estados Unidos Nº 4.336.336]. El fragmento de secuencia señal codifica usualmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirige la secreción de la proteína procedente de la célula. La proteína se segrega tanto en los medios de crecimiento (bacterias gram positivas) como en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la células (bacterias gram negativas). Preferiblemente, existen sitios de procesamiento, que se escinden tanto in vivo como in vitro codificados entre el fragmento de péptido señal y el gen extraño.

Se puede derivar el ADN que codifica las secuencias señal adecuadas procedente de genes para las proteínas bacterianas segregadas, tales como el gen de la proteína de la membrana externa de E. coli (ompA) [Masui y col. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb y col. (1984) EMBO J. 3:2437] y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. Como ejemplo adicional, se puede usar la secuencia señal del gen de la alfa amilasa procedente de varias cepas de Bacillus para segregar proteínas heterólogas de B. subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; Publ. EPO Nº. 244 042].

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas 3’ respecto del codón de detención de la traducción, y de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo y bucle que ayudan en la terminación de la transcripción. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.

Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, una secuencia señal (si se desea), una secuencia de codificación de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se introducen conjuntamente en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un hospedador, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, que le permita de esta manera mantenerse en un hospedador procariota tanto para la expresión como para la clonación y la amplificación. Adicionalmente, un replicón puede ser un plásmido tanto con un elevado como con un bajo número de copias. Un plásmido con un elevado número de copias tiene un número de copias que caría entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y normalmente 10 a aproximadamente 150. Un plásmido hospedador que contiene un elevado número de copias contendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede seleccionar un vector tanto con un elevado como con un bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el hospedador.

Alternativamente, se pueden integrar las construcciones de expresión en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen usualmente al menos una secuencia homóloga a la del cromosoma bacteriano que permite al vector integrarse. Las integraciones parecen ser el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (Publ. EPO Nº 127 328). Los vectores de integración pueden estar también comprendidos por secuencias de bacteriófagos o transposones.

Normalmente, las construcciones de expresión extracomosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de las cepas bacterianas que se han transformado. Se pueden expresar marcadores seleccionables en el hospedador bacteriano y pueden incluir genes que vuelven a la bacteria resistente a fármacos tales como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y tetraciclina [Davies y col. (1978), Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, tales como los de las rutas biosintéticas de la histidina, triptófano y leucina.

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden introducirse conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos normalmente por un marcador seleccionable que está tanto mantenido en un replicón como desarrollado en un vector de integración, según se ha descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de integración para la transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes bacterias Bacillus subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; Publ. EPO Nos 036 259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake y col. (1981) Nature 292:128; Amann y col. (1985) Gene 40:183; Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Publ. EPO Nos 036 776, 136 829 y 136 907], Streptococcus cremoris [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [Patente de los Estados Unidos Nº 4.745.056].

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para introducir ADN exógeno en hospedadores bacteriano, e incluyen usualmente tanto la transformación de bacterias tratadas con CaCl2 como con otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. Se puede introducir también el ADN en células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación varían normalmente con las especies bacterianas que se van a transformar. Véanse por ejemplo, [Masson y col. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; Publ. EPO Nos. 036 259 y 063 953; Publ. PCT Nº. WO 84/04541, Bacillus], [Miller y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang y col. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen y col. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower y col. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. En Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer y S. Nicosia); Mandel y col. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy y col. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler y col. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin y col. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203. Staphylococcus], [Barany y col. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti y R. Curtiss III); Perry y col. (1981) Infect. Immun. 32: 1295; Powell y col. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti y col. (1987) Proc. 4º Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].

Un técnico normalmente experto en la materia conoce también los sistemas de expresión en levaduras. Un promotor de levadura es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la traducción en la dirección 3’ (3’) de una secuencia de codificación (por ejemplo, un gen estructural) en el ARNm. Un promotor tendrá una región de inició de la transcripción que se sitúa normalmente próxima al extremo 5’ de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de la transcripción incluye usualmente un sitio de unión a la ARN polimerasa (la “Secuencia TATA”) y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor de levadura puede tener también una segunda región denominada una secuencia activadora en la dirección 5’ (UAS), que, si está presente, es normalmente distal al gen estructural: La UAS permite la expresión regulada (inducible). Se produce la expresión constitutiva en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser tanto positiva como negativa, aumentando o reduciendo por tanto la transcripción.

La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por tanto, las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Entre los ejemplos se incluyen la alcohol deshidrogenasa (ADH) (Publ. EPO Nº 284 044), la enolasa, la glucocinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la gliceraldehído-3fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), la hexocinasa, la fosfofructocinasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, y la piruvato cinasa (PyK) (Publ. EPO Nº 329 203). El gen PHO5 de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, proporciona también secuencias promotoras útiles [Myanohara y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Adicionalmente, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores de levaduras. Por ejemplo, se pueden unir las secuencias UAS de un promotor de levadura con la región de activación de la transcripción de otros promotores de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de dichos promotores híbridos incluyen la secuencia reguladora de la ADH unida a la región de activación de la transcripción de GAP (Patentes de los Estados Unidos Nos 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que están constituidos por las secuencias reguladoras de cualquiera de los genes ADH2, GAL4, GAL10,o PHO5 combinadas con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glucolítica tal como GAP o Pyk (Publ. EPO Nº 164 556). Además, un promotor de levadura puede incluir promotores que se producen naturalmente de origen no de levadura que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, entre otros, [Cohen y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff y col. (1981) Nature 283:835; Hollenberg y col. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg y col. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis y A. Puhler); Mercerau-Puigalon y col. (1980) Gene 11:163; Panthier y col. (1980) Curr. Genet. 2:109;].

Se puede expresar una molécula de ADN intracelularmente en levadura. Se puede unir directamente una secuencia promotora con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el término N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de inicio ATG. Si se desea, se puede escindir la metionina en el término N procedente de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a los sistemas de expresión en levaduras, así como para los sistemas de expresión en mamíferos, baculovirus y bacterias. Normalmente, una secuencia de ADN que codifica la porción N terminal de una proteína de levadura endógena, u otra proteína estable, se fusiona en el extremo 5’ de las secuencias de codificación heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, la levadura o el gen de la superóxido dismutasa humana (SOD), se puede unir en el término 5’ de un gen extraño y expresarse en la levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no un sitio escindible. Véase por ejemplo, Publ EPO Nº 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de la ubiquitina. Dicha proteína de fusión se prepara con la región de la ubiquitina que retiene preferiblemente un sitio para un enzima de procesamiento (por ejemplo, proteasa de procesamiento específica de ubiquitina) para escindir la ubiquitina procedente de la proteína extraña. Mediante este procedimiento, por tanto, se puede aislar la proteína extraña natural (por ejemplo, documento WO88/024066).

Alternativamente, se pueden segregar también proteínas extrañas procedentes de la célula en los medios de crecimiento creando moléculas de ADN quimérico que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción en la levadura de la proteína extraña. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que se pueden escindir tanto in vivo como in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica usualmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína procedente de la célula.

Se pueden derivar secuencias señal adecuadas que codifiquen ADN procedente de genes de proteínas segregadas de levadura, tales como el gen de la invertasa de levadura (Publ. EPO Nº 012 873; Publ. LPO Nº 62.096.086) y el gen del factor A (Patente de los Estados Unidos Nº 4.588.684). Alternativamente, existen líderes de origen no de levadura, tales como el líder del interferón que proporcionan también la secreción en levaduras (Publ. EPO Nº 060 057).

Un tipo preferido de líderes de secreción son los que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levadura, que contiene una secuencia señal “pre”, y una región “pro”. Los tipos de fragmentos de factor alfa que se pueden emplear incluyen el líder del factor alfa pre-pro de longitud completa (aproximadamente 83 restos de aminoácidos) así como los líderes del factor alfa truncado (normalmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos) (Patentes de los Estados Unidos Nos 4.546.083 y 4.870.008; Publ. EPO Nº 324 274.Los líderes adicionales que emplean un fragmento líder del factor alfa que proporciona la secreción incluyen líderes híbridos del factor alfa preparados con una secuencia pre de una primera levadura, pero con una región pro procedente de un segundo factor alfa de levadura. (Véase por ejemplo, Publ. PCT Nº WO 89/02463).

Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son regiones reguladoras localizadas 3’ respecto del codón de detención de la traducción, y de esta manera, junto con el promotor, flanquean la secuencia de codificación. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de secuencias terminadoras de la transcripción y de otras secuencias de terminación reconocidas por las levaduras, son aquellas que codifican las enzimas glucolíticas.

Normalmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, un líder (si se desea), una secuencia de codificación de interés, y una secuencia de terminación de la transcripción, se introducen conjuntamente en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaz de mantenimiento estable en un hospedador, tal como una levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, lo que le permite de esta manera mantenerse, por ejemplo, en una levadura para la expresión y en un hospedador procariota para la clonación y la amplificación. Los ejemplos de dichos vectores lanzadera de levaduras-bacterias incluyen YEp24 [Botstein y col. (1979) Gene 8:17-24], pC1/1 [Brake y col. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642-4646], y Yap17 [Stinchcomb y col. (1982) J Mol. Biol. 158:157]. Adicionalmente, un replicón puede ser un plásmido con un número tanto elevado como bajo de copias. Un plásmido con un elevado número de copias tendrá generalmente un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y usualmente aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedador que contiene un plásmido con un elevado número de copias tendrá preferiblemente al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Se puede seleccionar un vector con un número de copias tanto elevado como bajo, dependiendo del efecto del vector y de la proteína extraña sobre el hospedador. Véase por ejemplo, Brake y col., más arriba.

Alternativamente, se pueden integrar las construcciones de expresión en el genoma de la levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen normalmente al menos una secuencia homóloga con un cromosoma de levadura lo que permite al vector integrarse, y contienen preferiblemente dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen el resultado de recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura [Orr-Weaver y col. (1983) Methods in Enzymol. 101:228245]. Se puede dirigir un vector de integración a un locus específico en la levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector. Véase Orr-Weaver y col, más arriba. Pueden integrarse una o más construcciones de expresión, afectando posiblemente los niveles de proteína recombínate producida [Rine y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Se pueden producir las secuencias cromosómicas incluidas en el vector tanto como un único segmento en el vector, lo que da como resultado la integración del vector completo, como dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean la construcción de expresión en el vector, lo que da como resultado una integración estable de únicamente la construcción de expresión.

Usualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de las cepas de levaduras que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en la levadura hospedadora, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, y el gen de la resistencia a G418, que confiere resistencia en las células de levadura a la tunicamicina y a G418, respectivamente. Adicionalmente, un marcador seleccionable adecuado puede proporcionar también a la levadura la capacidad de crecer en presencia de iones de compuestos tóxicos, tales como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite a la levadura crecer en presencia de iones de cobre [Butt y col. (1987) Microbiol, Rev. 51:351].

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos se pueden introducir conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos usualmente por un marcador seleccionable que está tanto mantenido en un replicón como desarrollado en un vector de integración, según se ha descrito anteriormente.

Se han desarrollado vectores de expresión y transformación, tanto replicones extracromosómicos como vectores de integración para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para, entre otras, las siguientes levaduras: Candida albicans [Kurtz, y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, y col. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, y col. (1985)

Nos

Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes de los Estados Unidos . 4.837.148 y 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse (1981) Nature 300:706], y Yarrowia lipolytica [Davidow, y col. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, y col. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Se conocen bien en la material los procedimientos para introducir ADN exógeno en levaduras hospedadoras, e incluyen normalmente tanto la transformación de esferoplastos como de células de levadura intactas tratada con cationes alcalinos. Véanse por ejemplo [Kurtz y col. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze y col. (1985) J Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson y col. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp y col. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das y col. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt y col. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg y col. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze y col. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Patentes de los Estados Unidos Nos 4.837.148 y 4.929.555; Pichia]; [Hinnen y col. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito y col. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300:706: Schizosaccharomyces]; [Davidow y col. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin y col. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

Los expertos en la materia conocen bien los procedimientos para el aislamiento y la purificación de proteínas recombinantes y se resumen, por ejemplo, en Sambrook y col (1989). Particularmente en bacterias tales como E. coli, la proteína recombinante formará cuerpos de inclusión dentro de la célula bacteriana, facilitando de esta manera su preparación. Si se produce en cuerpos de inclusión la proteína portadora puede necesitar replegarse a su conformación natural. Se conocen bien en la técnica los procedimientos para renaturalizar proteínas a su

estado plegado natural.

Las especies en las que las proteínas portadoras de la presente invención pueden ser inmunógenas y de esta manera, eficaces en la estimulación de una respuesta inmune, incluyen todos los mamíferos, especialmente, los seres humanos. El la mayor parte de los casos, se preferirá que las proteínas portadoras de la presente invención sean activas estimulando una respuesta inmune en seres humanos. La población de seres humanos que tienen una mayor necesidad de protección de la enfermedad producida por bacterias encapsuladas son niños de entre aproximadamente 3 meses y 2 años de edad. Es durante este periodo que los niños no reciben generalmente protección a través de la leche materna y no poseen un sistema inmune suficientemente bien desarrollado por sí mismos para generar una respuesta inmune contra antígenos polisacáridos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan también moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas portadoras de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Como será aparente para un experto en la materia, dichas moléculas de ácido nucleico se diseñarán usando el código genético con el fin de codificar el epítope que se desee.

Adicionalmente, con el fin de confeccionar precisamente las propiedades exactas de las proteínas portadoras codificadas, el técnico experto apreciará que se pueden realizar cambios a nivel de los nucleótidos de las secuencias de epítopos conocidas, mediante adición, sustitución, deleción o inserción de uno o más nucleótidos. La mutagénesis sitio-dirigida (MSD) es el procedimiento de preferencia usado para generar proteínas portadoras mutadas de acuerdo con la presente invención. Existen muchas técnicas de MSD conocidas ahora por el técnico experto, que incluyen la mutagénesis oligonucleótido-dirigida usando la PCR según se muestra, por ejemplo, en Sambrook y col., (1989) o usando kits comercialmente disponibles.

La mayor parte de las proteínas portadoras producidas mediante dichas técnicas de mutagénesis serán menos eficaces que las proteínas naturales. Sin embargo, puede ser que en algunos casos, dichos cambios produzcan moléculas con una mejora de la función de la proteína portadora según se desea, tal como mayor inmunogenicidad en algún organismo.

Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con este aspecto de la presente invención pueden comprender ADN, ARN o ADNc y pueden comprender adicionalmente análogos de nucleótidos en la secuencia de codificación. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico comprenderán ADN.

Un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína portadora. Un aspecto más adicional proporciona un procedimiento que comprende introducir el ácido nucleico codificado en una célula u organismo hospedador. La introducción del ácido nucleico puede emplear cualquier técnica disponible. En células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato de calcio, ADN-dextrano, electroporación, transfección o transducción mediada por liposomas usando retrovirus u otros virus tales como vaccinia. En células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación con cloruro de calcio, la electroporación o la transfección usando bacteriófagos. La introducción del ácido nucleico puede continuarse produciendo o permitiendo la expresión procedente del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospedadoras en condiciones que permitan la expresión del gen.

En una realización, el ácido nucleico se integra en el genoma de la célula hospedadora. Se puede promover la integración mediante la inclusión de secuencias que promuevan la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas normalizadas (véase Sambrook y col., 1989).

De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, se proporciona una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T , conjugada con un polisacárido. Por polisacárido se entiende cualquier polímero lineal o ramificado constituido por restos de monosacáridos, unidos normalmente mediante enlaces glucosídicos, y por tanto se incluyen oligosacáridos. Preferiblemente, el polisacárido contendrá entre 2 y 50 unidades de monosacáridos, más preferiblemente entre 6 y 30 unidades de monosacáridos.

El componente polisacárido puede estar basado en o derivado de componentes polisacáridos de los polisacáridos capsulares de muchos patógenos bacterianos Gram positivo y Gram negativos tales como H. influenzae, N. meningitidis y S. pneumoniae. Esta cápsula representa u factor de virulencia principal que es importante para la colonización nasofaríngea y la invasión sistémica. Otras bacterias a partir de las cuales se pueden conjugar los componentes polisacáridos con las proteínas portadoras de la presente invención incluyen Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa,y Shigella dysenteriae. Los componentes polisacáridos adecuados para el uso de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen el oligosacárido Hib, el lipopolisacárido de Pseudomonas aeruginosa (Seid y Sadoff, 1981), los lipopolisacáridos de Salmonella (Konadu y col., 1996) y el polisacárido específico de O de Shigella dysenteriae (Chu y col, 1991). El técnico experto en la materia conocerá bien otros componentes polisacáridos adecuados para el uso de acuerdo con la presente invención.

Se pueden producir fragmentos de polisacárido capsular bacteriano mediante cualquier procedimiento adecuado, tal como mediante hidrólisis ácida o irradiación ultrasónica (Szn y col., 1996). El técnico experto en la materia conocerá bien otros procedimientos de preparación de los componentes polisacáridos.

Los componentes polisacáridos de la vacuna conjugada deberían preferiblemente

acoplarse con la proteína portadora mediante un enlace covalente. Un procedimiento particularmente preferido de acoplamiento de polisacárido y proteína es mediante aminación reductora. Otros procedimientos incluyen. Activación del polisacárido con bromuro de cianógeno seguida por reacción dihidrazida de ácido adípico (separador) y mediante conjugación de grupos carbóxido de la proteína portadora usando carbodiimidas solubles (Shneerson y col., 1986); funcionalización de la proteína portadora con dihidrazida de ácido adípico seguida por acoplamiento con polisacáridos activados con bromuro de cianógeno (Dick y col., 1989); modificación química de la proteína portadora y del polisacárido seguida por su acoplamiento (Marburg y col, 1986; Marburg y col, 1987 y 1989). En algunos casos, se pueden conjugar polisacáridos que contienen grupos carbóxido tales como polisacáridos meningocócicos del grupo C directamente con proteínas usando carbodiimidas solubles. Se pueden activar también los polisacáridos usando agentes alternativos tales como CDAP-1 (tetrafluoroborato de 1-ciano-4dimetilaminopiridinio) y a continuación conjugarse directamente con la proteína portadora (Konadu y col, 1996). Los polisacáridos u oligosacáridos tratados con periodato pueden conjugarse todos con proteínas por medio de aminación reductora (Jennings y Lugowsky, 1982; Anderson, 1983; Insel, 1986). Alternativamente, se pueden derivatizar químicamente los oligosacáridos obtenidos mediante hidrólisis ácida introduciendo en sus grupos terminales reductores un separador de hidrocarburo que soporta un término de éster activo; se puede conjugar este oligosacárido activado con la proteína portadora seleccionada (Costantino y col, 1992)

Se puede acoplar la molécula de polisacárido con la proteína portadora mediante una molécula separadora, tal como ácido adípico. Se puede usar esta molécula separadora para facilitar el acoplamiento de la proteína con el polisacárido. Después que se ha llevado a cabo la reacción de acoplamiento, se puede purificar el conjugado mediante diafiltración u otros procedimientos conocidos para eliminar los componentes de proteína o polisacárido sin reaccionar.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento de producción de una proteína portadora de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, que comprende las etapas de:

(a)

construir moléculas de oligonucleótidos que codifican epítopos de péptidos;

(b)

hibridar las moléculas de oligonucleótidos para formar dupletes;

(c)

introducir los dupletes de oligonucleótidos en un vector de expresión con el fin de

codificar una proteína de fusión;

(d) introducir el vector de expresión en una célula hospedadora bacteriana para

permitir la expresión de la proteína de fusión;

(e) aislar la proteína de fusión producida procedente de un cultivo de dicha bacteria. Opcionalmente, este procedimiento puede comprender adicionalmente conjugar la proteína portadora con una molécula de polisacárido. Preferiblemente, la célula hospedadora bacteriana usada en este procedimiento es una células hospedadora bacteriana E. coli.

De acuerdo con el aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición que comprende una proteína portadora que contiene 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T conjugada con un polisacárido, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Dichas composición puede diseñarse racionalmente con el fin de proporcionar protección contra la enfermedad producida por bacterias patógenas tales como H. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas y S. typhi y, de acuerdo con esto, se puede usar como vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser tanto profilácticas (es decir, para evitar la infección) como terapéuticas (es decir, para tratar la enfermedad tras la infección).

Por excipiente farmacéuticamente aceptable se entiende cualquier compuesto que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales en el individuo que recibe la composición. El excipiente debería ser adecuado para la administración oral, subcutánea, intramuscular, tópica o intravenosa. Los compuestos adecuados son normalmente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lípidos (tales como gotículas o liposomas) y partículas víricas inactivas. El técnico experto en la materia conoce bien dichos compuestos. Adicionalmente, estos compuestos pueden funcionar como agentes inmunoestimuladores (“adyuvantes”). Además se puede conjugar el antígeno con un toxoide bacteriano.

Los adyuvantes preferidos para potenciar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio (alum), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimuladores específicos tales como péptidos de muramilo o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59™ (documento WO 90/14837), que contiene escualeno al 5%, Tween™ 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5% (conteniendo opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE, aunque no se requiere) formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizados (b) SAF, que contiene Escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4 %, polímero L121 bloqueado con Pluronic, y thr-MDP tanto microfluidizado en emulsión submicrométrica como sometido para generar una emulsión de tamaño de partículas más grande, y (c) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), que contiene Escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana procedentes del grupo constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (DMT), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox™); (3) se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ o partículas generadas de los anteriores tales como ISCOM (complejos inmunoestimuladores); (4) adyuvantes completo e incompleto de Freund (CFA e IFA), (5) citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo, IFNγ) factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), etc; y (6) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores para aumentar la eficacia de la composición. Se prefieren alum y MF59™.

Tal como se ha mencionado anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-Disoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-snglicero-3-hydroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las composiciones inmunógenas (por ejemplo, el antígeno, el vehículo farmacéuticamente aceptable, y el adyuvante) contendrán normalmente diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponantes del pH, y similares.

Normalmente, las composiciones inmunógenas se preparan como inyectables, tanto en soluciones como en suspensiones líquidas, se pueden preparar también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. Se puede emulsionar o encapsular también la preparación en liposomas para aumentar el efecto adyuvante, según se ha descrito anteriormente.

Las composiciones inmunógenas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de la proteína portadora, así como cualquier otro de los componentes anteriormente mencionados, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz” se entiende que la administración de la cantidad a un individuo, tanto en una única dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y del estado físico del individuo que se va a tratar, del grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc), de la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, del grado de protección deseado, de la formulación de la vacuna, del juicio clínico de la situación médica, y de otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté comprendida dentro de un amplio intervalo que se puede determinar mediante pruebas rutinarias.

Las composiciones inmunógenas se administran parenteralmente de manera

convencional, por ejemplo, mediante inyección, tanto subcutánea como intramuscularmente. Se pueden administrar también a superficies mucosales (por ejemplo, por vía oral o intranasal), o en forma de formulaciones pulmonares, supositorios, o aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de múltiples dosis. Se puede administrar la vacuna junto con otros agentes inmunoreguladores.

Como alternativa a las vacunas basadas en proteínas, se puede emplear la vacunación con ADN [por ejemplo, Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648]. De acuerdo con esto, más bien que comprender un péptido, oligopéptido, o compuesto polipéptido, las vacunas de la invención pueden comprender ácido nucleico que codifica estos compuestos.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para la formulación de una composición inmunógena que comprende formular una proteína portadora de acuerdo con el primer aspecto de la invención, conjugada con un polisacárido, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un adyuvante.

De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una composición de una proteína portadora conjugada con un polisacárido, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un adyuvante, para uso en la vacunación de un mamífero.

Se describirán ahora diversos aspectos y formas de realización de la presente invención con más detalle por medio de ejemplos, con referencia concreta a las proteínas portadoras N6 (con fines de comparación) y N10 conjugadas con el polisacárido capsular HIB. Se apreciará que se pueden hacer modificaciones detalladas sin apartarse del alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación esquemática de la construcción de la proteína N6.

La Figura 2 ilustra las construcciones de N6 y N10 y sus secuencias de ADN y aminoácidos respectivas. Están subrayados la etiqueta de histidina, el péptido flag, el sitio de corte Fxa y los epítopos de los linfocitos T CD4+.

La Figura 3 es un gel SDS-PAGE teñido mediante la tinción de Coomasie de los extractos de proteínas totales preparados a partir de clones inducidos de E. coli que producen las diferentes proteínas de los poliepítopos. Banda A: control negativo (células TG1 que contienen el vector pQE30 sin inserción); banda B: células TG1 que contienen el plásmido pQE30-N10; banda C; células TOP10 que contienen el plásmido pTrc-NIO; banda D: células TOP10 que contienen el plásmido pTrc-N6; banda E: marcadores de bajo peso molecular.

La Figura 4 es una inmunotransferencia del gel SDS-PAGE que se ilustra en la Figura 3.

Se incubó la transferencia Western con un antisuero de conejo específico del péptido flag y a continuación con un anticuerpo peroxidado dirigido contra IgG de conejo. A continuación se desveló la reacción inmune usando 4-cloro-1-naftol como sustrato de la peroxidasa.

La Figura 5 es un gel SDS-PAGE teñido mediante la tinción de Coomasie que contiene diferentes muestras obtenidas durante el procedimiento de purificación de la proteína N6. Banda

A: material de partida (proteína total de las células TOP10 inducidas de E. coli que contienen el plásmido pTrc-N6; banda B: proteínas solubles (sobrenadante obtenido tras centrifugación de la muestra de proteína total): banda C: proteínas solubles en urea 1 M (sobrenadante obtenido tras lavar las proteínas insolubles con urea 1 M); banda D: cuerpos de inclusión (aglomerado obtenido tras lavar las proteínas insolubles con urea 1 M); banda E: proteína N6 obtenida de la purificación en resina Ni2+ NTA usando la técnica de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC); banda F: marcadores de bajo peso molecular.

La Figura 6 es una inmunotransferencia del gel SDS-PAGE que se ilustra en la Figura 5. Se incubó la transferencia Western con un antisuero de conejo específico del péptido flag y a continuación con un anticuerpo peroxidado dirigido contra IgG de conejo. A continuación se reveló la reacción inmune usando 4-cloro-1-naftol como sustrato de la peroxidasa.

La Figura 7 es una representación esquemática de la construcción N11 y su secuencia de ADN y proteína respectivas. Están subrayados la etiqueta hexa-histidina, el péptido flag, el sitio de corte FXa, y los epítopos del los linfocitos T CD4+.

La Figura 8 es una representación esquemática de la construcción N19 y su secuencia de ADN y proteína respectivas. Están subrayados la etiqueta de hexa-histidina, el péptido flag, el sitio de corte FXa, y los epítopos de los linfocitos T CD4+.

La Figura 9 es un SDS-Page y una tinción de Coomasie de las proteínas procedentes del clon Top10-Trc-N11 de E. coli.

Banda A: extracto total de un cultivo no inducido.

Banda B: extracto total de un cultivo inducido usando IPTG.

Banda C: proteína N11 purificada (solubilización de células completas con cromatografía

de guanidinio e IMAC). Figura 10:

A: SDS-Page y tinción de Coomasie. Análisis de las fracciones obtenidas de la cromatografía IMAC llevada a cabo para purificar la proteína N19. Banda a: marcadores de peso molecular preteñidos. Banda b: flujo pistón. Bandas c a m: fracciones de gradiente que muestran la proteína N19 purificada; las bandas que tienen un peso molecular inferior al de N19 y visibles en las bandas superpuestas f, g, y h representan productos de degradación de la proteína N19.

B: SDS-Page y tinción de Coomasie. Análisis de las fracciones obtenidas de la cromatografía IMAC de la proteína N19 conjugada al polisacárido Hib. Se va a conjugar toda la proteína N19 resultante, tal como se juzgó por el elevado peso molecular del conjugado y por la ausencia de proteína N19 no conjugada de 43.000 kDa.

C: Las mismas muestras de conjugados usadas en la imagen B se sometieron a inmunotransferencia Western usando un anticuerpo dirigido contra flag. Aquí también se puede apreciar que toda la proteína N19 migro con un peso molecular muy elevado tras la conjugación con el polisacárido Hib, y que no existe proteína N19 no conjugada que migre a 43.000 kDa. Figura 11: Respuesta proliferativa de dos clones de linfocitos T humanos específicos de

P30TT (clon GG-22) y P2TT (clon KSIMK-140) tras estimulación con los péptidos sintéticos respectivos (controles) y con las proteínas de los poliepítopos conjugadas o no conjugadas (cpm: recuento por minuto).

Figura 12: Ensayo de proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Se estimularon las PBMC procedentes de tres donantes sanos, RR, EB y MC inmunes al toxoide del tétanos, con toxoide del tétanos, P2TT, N6, N6-Hib y N10-Hib.

Figura 13: Resultados de las pruebas de inmunogenicidad llevadas a cabo para comparar el efecto portador de N10, N19, y CRM-197, y para vigilar los fenómenos de inmunosupresión inducidos por el portador. Títulos anti-Hib obtenidos tras inmunizar ratones CD1 estimulados y no estimulados con diferentes conjugados.

Descripción detallada de la invención Materiales y procedimientos Resumen de los procedimientos y de las técnicas normalizadas

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que se encuentran comprendidas dentro del conocimiento del técnico experto en la materias. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y

S.J.

Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986);

B.

Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer y

Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Segunda Edición (Springer-Verlag, N.Y.), y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell eds 1986).

5

Plásmidos, cepas y clones de linfocitos T

Se derivó el plásmido PEMBLex2 de pEMBL8M (Dente L. y Cortese R, Meth. Enzymol. (1987), 155: 111-9) insertando un promotor λPL y un polienlazante en los sitios EcoRI y HindIII. Se adquirieron los vectores pTrc-His y pQE30 comerciales de Invitrogen y Qiagen

10 respectivamente. Las cepas de E. coli usadas como receptores de los plásmidos anteriores fueron K12�H1�Trp para pEMBLex2, TOP10 para pTrc-His y TG1 para pQE30. El Dr. A. Lanzavecchia (Basilea, Suiza) proporcionó amablemente los clones de linfocitos T humanos KSMIK 140 y GG-22 específicos de P2TT y P30TT respectivamente.

15 Construcción de plásmidos recombinantes que expresan la proteína portadora del poliepítopo N6 Se sintetizaron parejas de oligodesoxirribonucleótidos complementarios que codificaban los epítopos de linfocitos T, P2TT, P21TT, P23TT, P30TT1, P32TT y PfT3 T (Tabla 1) y un péptido Flag usando el sintetizador de ADN ABI394 (Perkin Elmer) y los reactivos de Cruachem

20 (Glasgow, Escocia). Se hibridaron por separado las parejas de oligonucleótidos en tampón T4 ADN ligasa (Boehringer Mannheim) y se mezclaron cantidades equimolares de cada reacción de hibridación y se ligaron a temperatura ambiente durante 3 horas usando T4 ADN ligasa (Boehringer Mannheim). A continuación se introdujo la reacción de la ligasa sobre un gel de agarosa al 1% y se

25 sometió a electroforesis. Se aislaron las bandas correspondientes a los fragmentos de ADN de tamaño esperado, se purificaron y se clonaron en el vector de expresión pEMBLex2 usando protocolos normalizados (Sambrook y col., 1989). Tras la transformación, se usó un antisuero de conejo específico del péptido Flag para llevar a cabo el cribado de las colonias (Sambrook y col., 1989) con el fin de identificar los clones que producían proteínas recombinantes. Se analizaron

30 los extractos de proteínas procedentes de los clones positivos usando SDS-PAGE para seleccionar adicionalmente los clones sobre la base del tamaño de la proteína recombinante.

35

Tabla I. epítopos CD4+ de linfocitos T insertados en las proteínas portadoras de poliepítopos recombinantes

Epítopo del linfocito T

Posición de los aminoácidos Secuencia de aminoácidos Referencias

P2TT

1084-1099 VSIDKFRIFCKANPK Demotz y col. 1993 Eur. J Immunol 23:425

P32TT

1174-1189 LKFIIKRYTPNNEID S Demotz y col. 1993 Eur. J Immunol 23:425

P21TT

1064-1079 IREDNNITLKLDRCN N Dr. Lanzavecchia, com. pers.

PF T3

380-398 EKKIAKMEKASSVF NVVN Hammer y col. 1993 Cell 74: I97

P30TT

947-967 FNNFTVSFWLRVPK VSASHLE Demotz y col. 1993 Eur. J Immunol 23:425

P2TT

830-843 QYIKANSKFIGITE Demotz y col. 1993 Eur. J Immunol 23:425

HA

307-319 PKYVKQNTLKLAT Alexander y col. 1994 Immunity 1: 751

HBVnc

50-69 PHHTALRQAILCWG ELMTLA Alexander y col. 1994 Immunity 1: 751

HBsAg

19-33 FFLLTRILTIPQSLD Greenstein y col. 192 J Immunol 148:3970

MT

17-31 YSGPLKAEIAQRLE DV Alexander y col. 1994 Immunity 1: 751

HSP70

408-427 QPSVQIQVYQGER EIASHNK Adams y col. 1997 Infect Immun 65:1061

Péptido Flag

MDYKDDDD

Tras la secuenciación de nucleótidos de los clones seleccionados, se demostró que un

5 clon denominado pEMBLN6 contenía seis epítopos de linfocitos T diferentes con secuencias no repetitivas. A continuación se amplificó mediante la PCR la inserción N6 y se transfirió a un vector de expresión pTrc-His (Invitrogen) usando técnicas normalizadas (Sambrook y col., 1989). En la Figura 1 se resume la generación de los plásmidos que expresan N6

10 Construcción de plásmidos recombinantes que expresan la proteína N10 portadora del poliepítopo. Usando oligodesoxirribonucleótidos sintéticos y técnicas de clonación normalizadas (Sambrook y col., 1989), se añadieron cuatro epítopos CD4+ de linfocitos T adicionales a la

proteína N6: HBVnc, HA, HbsAg, y MT (Tabla 1). Se introdujeron secuencialmente HBVnc y HA en pTrc-N6 por medio de dos etapas de clonación consecutivas; al plásmido resultante se añadieron los epítopos HbsAg y MT en una única etapa de clonación.

Tras la secuenciación del ADN, se identificó una construcción correcta (pTrc-N10) que codificaba los 10 epítopos esperados del poliepítopo de la proteína. A continuación se transfirió la inserción que codificaba N10 desde pTrc-N10 a pQE30 (Qiagen) por medio de la PCR. A continuación se confirmó la secuencia de la construcción pQE-N10 resultante mediante la secuenciación del ADN.

Construcción del plásmido recombinante que expresa la proteína N11 portadora del poliepítopo.

Se sintetizaron dos oligodesoxirribonucleótidos complementarios y se hibridaron para obtener un enlazante de ADN que codificaba el epítopo CD4+ HSP70 de los linfocitos T de (Tabla I). Se insertó el enlazante en el plásmido pTrc-N10 en la dirección 3’ de la región que codificaba N10 y en marco con ésta. Tras la transformación en la cepa TOP10 de E. coli, se seleccionaron los transformantes usando los análisis de expresión de la proteína y secuenciación del ADN. Se almacenaron a -80ºC lotes de glicerol de un clon seleccionado (TOP10/pTrc-N11) que tenían la secuencia de codificación correcta y que expresaban una proteína del peso molecular esperado.

Construcción de plásmidos recombinantes que expresan la proteína N19 portadora de poliepítopo.

Se amplificó mediante la PCR el fragmento de ADN que abarcaba la región de codificación entre P23TT y HbsAg usando el plásmido pTrc-N10 como plantilla y dos cebadores de oligonucleótidos que permitían la inserción de los sitios de restricción BgIII y PstI respectivamente en los extremos 5’ y 3’ del producto de la PCR. Se digirió el plásmido pTre-N10 con los enzimas de restricción BamHI y PstI y se unió con el producto de la PCR digerido con BgIII y PstI. Tras la transformación en células TOP10 y la selección de los transformantes usando los análisis de expresión de la proteína y secuenciación del ADN, se almacenaron a -80ºC lotes de glicerol de un clon seleccionado (TOP10/pTre-N19) que tenía la secuencia de codificación correcta y que expresaba una proteína del peso molecular esperado.

Se digirió el plásmido pTrc-N19 con EcoRV y PstI y se clonó la inserción en pQE-N10 digerido con las mismas enzimas. Tras la transformación en células TG1 y la selección de los transformantes usando los análisis de expresión de la proteína y secuenciación del ADN, se almacenaron a -80ºC lotes de glicerol de un clon seleccionado (TG1/pQE-N19) que tenían la secuencia de codificación correcta y que expresaban una proteína del peso molecular esperado.

Purificación de las proteínas portadoras de poliepítopos.

Se purificaron todas las proteínas recombinantes portadoras de poliepítopos usando una estrategia similar. De manera breve, se hicieron crecer cultivos de E. coli en 500 ml de medio LB que contenía 100 µg/ml de ampicilina, a 37ºC. A una DO600 de 0,3-0,5, se indujo la expresión de las proteínas portadoras de los poliepítopos durante 3-5 horas añadiendo IPTG 0,1-1 mM. Se desestabilizaron las células mediante sonicación o prensa francesa, se recogió la fracción insoluble mediante centrifugación, se disolvieron con tampón A (Clorhidrato de guanidinio 6 M, NaH2PO4, Tris básico 10 mM, pH 8) y se adsorbieron con 2 ml de resina Ni2+NTA (Qiagen).

A continuación, se empaquetó la resina en una columna y se lavó con tampón A. Se retiró el clorhidrato de guanidinio de la columna lavando con tampón B (Urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris básico 10 mM) pH 8. Tras un lavado con tampón B pH 6,5, se eluyeron las proteínas recombinantes con un gradiente de 20 ml de tampón B desde pH 6,5 a pH 4. Las fracciones que contenían las proteínas recombinantes purificadas se combinaron y se dializaron frente a PBS, pH 7,2. Se analizaron las proteínas mediante SDS-PAGE y se determinó el contenido de proteína usando el procedimiento Bradford. Alternativamente, se solubilizaron los aglomerados celulares obtenidos de cultivos de E. coli calentando a 37ºC en tampón A, se centrifugaron los lisados a

15.000 g durante 20 min. Los sobrenadantes se sometieron a cromatografía en columna en una columna Chelating Sepharose Fast Flow activada por níquel (Pharmacia). Tras un lavado con tampón A y un lavado con tampón B, pH 7, se separaron las proteínas recogiendo las fracciones a partir de un gradiente 0-200 mM de imidazol en tampón B, pH 7. Las fracciones que contenían las proteínas recombinantes purificadas (tal como se consideró mediante SDS-PAGE y la tinción de Coomasie) se combinaron y se dializaron frente a PBS, pH 7,2.

Preparación y activación de oligosacáridos Hib

Se puede preparar el polisacárido capsular Hib de acuerdo con el protocolo descrito en Gotschlich y col. (1981) J. Biol. Chem. 256: 8915-8921.

Se hidrolizaron 1,99 l de una solución de 10 mg/ml de polisacárido Hib en ácido acético 0,01 M a 76ºC durante 5 horas. Tras enfriamiento, neutralización y filtración a través de un filtro de 0,2 µm, la población de oligosacárido resultante tenía un grado de polimerización promedio (avDP) de 8 tal como se midió mediante la relación química entre la ribosa y los grupos reductores.

A continuación se añadió NaCl al hidrolizado hasta que se consiguió una concentración de 0,16 M, a continuación se diluyó 1:1 con NaCl 0,16 M / acetato 10 mM, pH 6 y se sometió a ultrafiltración de flujo tangencial en una membrana de 10 kDa con el fin de eliminar las especies de elevado peso molecular.

La ultrafiltración comprendió aproximadamente 11 veces la concentración seguida por 15 ciclos de diafiltración frente a NaCl 0,16 M / acetato 10 mM. Se descartó el retentato. Se diluyó el permeato 1:1 con agua y se filtró a través de un filtro de 0,22 µm. El análisis químico desveló avDP de 8,1.

Se cargó el permeato obtenido a partir de UF de 10 kDa, a un caudal lineal de 150 cm/h, en una columna Q-Sepharose Fast Flow [10 cm (DI); 5,5 cm (h)] equilibrada con NaCl 0,08 M / acetato 0,05 M, pH 6. Tras la adsorción, se retiraron fragmentos de bajo peso molecular (hasta de 5 repeticiones, lavando la columna con 10 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y a continuación se eluyó con 3 volúmenes de columna de NaCl 0,5 M / acetato de sodio 0,005 M, pH6. Se filtró el eluato a través de un filtro de 0,2 µm y a continuación se analizó para el avDP y la cromatografía analítica de intercambio iónico. El avDP resultó a 17,3, la cromatografía analítica de intercambio iónico sobre Mono Q HR 5/5 desveló la ausencia de cualquier fragmento pequeño hasta DP 5.

A continuación se llevó a cabo la aminación reductora, para introducir un grupo amino terminal; al oligosacárido obtenido de la cromatografía Q-Sefarosa se añadieron concentraciones finales de 35 mg/ml de cloruro de amonio y 12 mg/ml de cianoborohidruro. Tras agitar, la solución se filtró a través de un filtro de 0,2 µm y se incubó a 37ºC durante 120 horas. A continuación se purificaron los aminooligosacáridos de los reactivos en exceso mediante precipitación con EtOH de 95º (concentración final 81º) en frío durante 15-20 horas. A continuación se recuperó el oligosacárido precipitado mediante centrifugación, se solubilizó en NaCl 0,4 M usando aproximadamente ¼ del volumen de partida y se precipitó de nuevo en EtOH de 81º en frío durante 15-20 horas.

Se recuperó de nuevo el aminooligosacárido mediante centrifugación y se solubilizó en aproximadamente 300 ml de NaCl 0,02 M. Tras haber tomado una muestra para análisis, se secó a continuación la solución resultante usando un evaporador rotatorio.

El análisis colorimétrico de los grupos amino confirmo la introducción de un grupo amino primario en el oligosacárido.

A continuación se llevó a cabo la derivatización del éster activo como sigue. Se solubilizó el aminooligosacárido en agua destilada a una concentración de 40 µmol de grupos amino por ml. A continuación se diluyó la solución 10 veces con DMSO. Se añadió trietilamina en una relación molar de los grupos amino de 2:1. A continuación se añadió N-hidroxisuccinimido diéster de ácido adípico en una relación molar de los grupos amino de 12:1. La mezcla de reacción se mantuvo con agitación suave durante 2 horas a RT. A continuación se purificó el oligosacárido activado de los reactivos en exceso mediante precipitación en 10 volúmenes de 1-4 dioxano con agitación. Después de 30 minutos en el frío, se recogió el precipitado sobre un filtro de vidrio sinterizado, se lavó sobre el filtro con dioxano y a continuación se secó a vacío. Se analizó el oligosacárido activado seco para su contenido de grupos éster activos mediante un procedimiento colorimétrico; esta prueba mostró la presencia de 62,1 µmol de éster activo por mg de oligosacárido seco.

A continuación se usó el oligosacárido activado anteriormente obtenido para los experimentos de conjugación.

Conjugación de la proteína portadora del poliepítopo con oligosacáridos capsulares Hib y purificación de los conjugados.

33,4 nmoles de proteína portadora recombinante y 669 nmoles de oligosacárido Hib activado en un volumen final de 0,5 ml de tampón fosfato 10 mM, pH 7, se agitaron suavemente a RT durante la noche y se llevaron a 5 ml de (NH4)2SO4 1 M, fosfato 10 mM, pH 7. Se sometió la muestra a FPLC en una columna Phenyl Sepharose 5/5 HR de 1 ml (Pharmacia). Se recogieron ambas fracciones de 1 ml durante el lavado ((NH4)2SO4 1 M, fosfato 10 mM, pH 7) y la elución (fosfato 10 mM, pH 7). Se obtuvieron dos picos correspondientes al material no adsorbido y al material eluido. Las fracciones combinadas correspondientes al material no adsorbido y las fracciones combinadas correspondientes al pico de la elución se sometieron a la determinación del contenido de proteína y ribosa y a SDS-PAGE y análisis de transferencia Western.

Se desarrolló también un protocolo para conjugar proteínas recombinantes con oligosacáridos directamente en resina Ni2+-NTA. Se purificaron las proteínas recombinantes tal como se ha descrito anteriormente, pero se omitió la etapa final de diálisis. Se midió el contenido de proteína del combinado de la fracción de urea 8 M con el ensayo Bradford. Se ajustó el pH de las proteínas eluidas a pH 8 y se llevó a cabo de nuevo la adsorción en 1 ml de resina Ni2+-NTA preequilibrada en un modo discontinuo. Se eliminó la urea lavando con 4x25 ml de tampón fosfato 100 mM, pH 7,5. Se suspendió la resina en 1 ml de tampón fosfato 100 mM, pH 7,5 y se añadió a la suspensión oligosacárido Hib activado en un exceso molar de 20 veces (con respecto a la proteína que se adsorbió en la resina). Se agitó suavemente la mezcla durante la noche a RT empaquetada en una columna, y se lavó con 50 ml de tampón fosfato 100 mM pH 7,5 para eliminar el oligosacárido no conjugado.

Se llevó a cabo la elución del conjugado con tampón fosfato 100 mM a pH 4. Se combinaron las fracciones de los picos y se dializaron frente a PBS, pH 7,2. Se analizó el conjugado mediante la tinción de Coomasie de los geles SDS-PAGE y la inmunotransferencia Western usando un anticuerpo de conejo dirigido contra flag. Se determinó la relación proteína/carbohidrato del glicoconjugado tras el ensayo Bradford y la determinación del contenido de ribosa.

Cultivos de PBMC y clones de linfocitos T.

El medio de cultivo de las PBMC fue RPM1 1640 (Gibco Laboratories, Paisley. Escocia) suplementado con L-glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, piruvato de sodio 1 mM, gentamicina (50 µg/ml), y suero humano al 5% (RPMI-HS) o suero de ternera fetal al 10% (RPMIFCS). Para el crecimiento de las líneas de linfocitos T y los clones, se suplemento el RPMI-HS con 500 U de interleucina 2 recombinante (rIL-2: Hoffmann La Roche, Nutley, NJ) por ml.

Ensayo de proliferación de PBMC.

Se descongelaron PBMC congeladas (105) procedentes de adultos sanos inmunes al toxoide del tétanos y se cultivaron en pocillos duplicados de microplaca de fondo plano de 96 pocillos, en 0,2 ml de RPMI-HS (Di Tommaso y col, 1997). Se añadieron a los pocillos las proteínas recombinantes y los toxoides del tétanos (Chiron, Siena) a la concentración final de 10 µg/ml. Tras 5 días de cultivo, se añadió 1µCi de [3H] timidina (actividad específica. 5Ci/mmol, Amersham) a cada pocillo y se midió la radioactividad incorporada al ADN tras 16 horas más mediante recuento por centelleo en medio líquido.

Ensayo de proliferación de clones de linfocitos T.

El Dr. A. Lanzavecchia (Basilea, Suiza) proporcionó amablemente dos clones de linfocitos T humanos, KSMIK 140, y GG-22, específicos de P2TT y P30TT respectivamente, y los respectivos péptidos. Se cultivaron los linfocitos T (2 x 104) en 0,2 ml de RPMI-FCS en microplacas de fondo plano de 96 pocillos en pocillos duplicados. Se añadieron los péptidos sintéticos y las proteínas recombinantes conjugadas o no conjugadas a los cultivos a una concentración final de 10 µg/ml. Tras 2 días, se añadió 1 µCi de [H3] timidina y se midió la radioactividad incorporada mediante recuento por centelleo en medio líquido tras 16 horas más.

En algunos experimentos, se preincubaron las proteínas portadoras y sus conjugados con APC durante 2-4 horas, a continuación se lavaron y cultivaron las APC con los clones de linfocitos T. Se usó este procedimiento para limitar la posible degradación proteolítica por las proteasas del suero y por tener más confianza en que la presentación del epítopo fuera debida a epítopos procesados intracelularmente.

Ensayos de inmunogenicidad

En un primer experimento, se inyectaron subcutáneamente dosis iguales de los glicoconjugados y del polisacárido (2,5 µg como polisacárido) en presencia de 0,5 mg de hidróxido de aluminio como adyuvante, en grupos de ocho ratones BALB/c y C57BL/6 (hembras, 7 meses de edad) en los días 0, 21 y 35. Se extrajo sangre de los ratones en el día -1 (preinmune), 20(pre-2), 34 (pre-3) y 45 (post-3) y se recogieron y almacenaron los sueros individuales a -80ºC antes del ensayo ELISA.

En un segundo experimento, se inyectaron subcutáneamente dosis iguales de los glicoconjugados y del polisacárido (2,5 µg como polisacárido) en presencia de 0,5 mg de hidróxido de aluminio como adyuvante, en grupos de ocho ratones Swiss ‘D1 y BALB/c (hembras, 7 semanas de edad) en los días 0, 10 y 20. A continuación se proporcionó un estímulo de 2,5 µg de polisacárido Hib purificado (HibCPS) en presencia de 0,5 mg de hidróxido de aluminio a cada ratón en el día 70. Se extrajo sangre de los ratones en el día -1 (pre-inmune), 35 (postvacunación), 68 (pre-estímulo) y 85 (post-estímulo) y se recogieron y almacenaron los sueros individuales a -80º C antes del ensayo ELISA.

En un tercer experimento, se inyectaron subcutáneamente dosis iguales de CRM-Hib, N10-Hib, y N19-Hib (2,5 µg como polisacárido) en presencia de 0,5 mg de hidróxido de aluminio como adyuvante en grupos de 6 ratones Swiss CD1 (hembras, 7 semanas de edad) en los días 0, 15 y 28 con el fin de comparar los efectos portadores. Se sometieron también diferentes grupos de ratones al mismo programa pero se estimularon previamente con portadores no conjugados con el fin de comprobar los potenciales fenómenos de inmunosupresión. En los últimos grupos, se inyectaron dosis iguales de proteínas portadoras (50 µg) en 0,5 mg de alum en el día -30. Se sangraron todos los ratones en el día -32 (pre-estimulación), -2 (pre-inmune), 14 (post-1), 27 (post-2), y 45 (post-3) y se recogieron y almacenaron los sueros a -80ºC antes del ensayo ELISA.

ELISA.

Se recubrieron placas Nunc Maxisorp de fondo plano de 96 pocillos mediante incubación durante la noche a 4ºC con 1 µg/ml (como polisacárido) de una albúmina de suero humano (HSA) y polisacárido conjugado de H. influenzae de tipo b. Tras el lavado, se recubrieron los pocillos usando gelatina al 1% (p/v) en PBS, pH 7,2 durante 3 horas más a 37ºC. Se diluyeron muestras de suero 1:50 en tampón fosfato 5 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 75 mM, BSA al 1 % (p/v) y Tween-20 al 0,05% (p/v) y se dispensaron por duplicado en los pocillos. Se combinaron muestras de sueros de ratones no tratados y se diluyeron 1:50 como anteriormente y se dispensaron en 8 pocillos. Tras incubación durante la noche a 4ºC, se lavaron las placas tres veces con tampón fosfato 5 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 75 mM y Tween-20 al 0,05% (p/v). A continuación, se añadieron a cada pocillo IgG de cabra dirigida contra IgG de ratón conjugada con fosfatasa alcalina diluida 1:1000 y tampón fosfato 5 mM, pH 7,2 que contenía NaCl 75 mM, BSA al 1% (p/v) y Tween-20 al 0,05% (p/v), y se incubaron 3 horas a 37ºC.

Tras lavado repetido, se añadieron a cada pocillo 100 µl de un sustrato cromógeno, p

nitrofenilfosfato, en una solución de dietilenamina. Se detuvo la reacción después de 20 min añadiendo solución de NaOH 4 N. A continuación, se leyó la placa a 405 mM con una longitud de onda de referencia de 595 mM. Se expresaron los títulos como absorbancias a 405 mM (A405mm). Se consideró que los ratones reaccionaban cuando se encontró que la A405 mm promedio era igual

5 a o mayor que cuatro veces el promedio de las absorbancias de los ocho pocillos con los sueros de los animales no tratados. De acuerdo con la Farmacopea Europea [PA/PH/Exp15/T(93)3ANP] cuatro de los ocho ratones deberían reaccionar.

En el segundo experimento, se consideró que los ratones reaccionaban cuando se encontró que la A405m promedio era cuatro veces el promedio de las absorbancias de los ocho 10 sueros pre-inmunes del mismo grupo de tratamiento.

Se evaluó la respuesta anti-portadora tal como se ha descrito anteriormente de la respuesta anti-Hib usando placas recubiertas con N10 o N6 (concentración de recubrimiento = 2 µg/ml).

15 Resultados Construcción de las proteínas portadoras de poliepítopos. Usando las soluciones descritas en materiales y procedimiento, los inventores crearon clones de E. coli que expresaban diferentes proteínas portadoras. La siguiente tabla relaciona únicamente los seis clones que los inventores utilizaron para purificar las proteínas

20 recombinantes portadoras de poliepítopos

Nombre del clon

Proteína portadora del poliepítopo expresada Número de aminoácidos P. mol. Teórico (kDa) Cepa hospedadora de E. coli Vector de expresión

Top10-Trc-N6

N6 143 16 Top10 pTrc-His

Top10-Trc-N10

N10 218 24 Top10 pTrc-His

TG1-QE-N10

N10 218 24 TG1 pQE30

Top10-Trc-N11

N11 240 27 Top10 pTrc-His

Top10-Trc-N19

N19 390 43 Top10 pTrc-His

TG1-QE-N19

N19 390 43 TG1 pQE30

El clon que expresaba la proteína N6 comprendía el plásmido pTrc-N6 transformado en la cepa Top10 de E. coli. Según se dedujo a partir de la secuenciación del ADN plásmido, este 25 plásmido codifica una proteína que tiene una cola amino terminal de hexahistidina seguida en la

secuencia por un péptido flag, un sitio FXa, y los siguientes epítopos de linfocitos T: P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, y P2TT. Todos los epítopos estaban separados por una secuencia de aminoácidos KG (Fig. 2).

Los dos clones que produjeron proteína N10 fueron la cepa Top10 de E. coli que contenía el plásmido pTrc-N10, y la cepa TG1 de E. coli que contenía el plásmido pQE-N10. Ambos clones contenían la secuencia de codificación de N6 fusionada a una secuencia carboxi terminal que codificaba cuatro epítopos de linfocitos T adicionales que fueron, por este orden: HBVnc, HA, HBsAg, y MT (Fig. 2).

El clon que produjo la proteína N11 comprendía el plásmido pTrc-n10 transformado en la cepa Top10 de E. coli. Según se dedujo a partir de la secuenciación del ADN plásmido, este plásmido codificaba una proteína constituida por la secuencia de N10 fusionada a una secuencia carboxi terminal que codificaba el epítopo de los linfocitos T de HSP70 (Fig. 7).

Los dos clones que produjeron la proteína N19 fueron la cepa Top10 de E. coli que contenía el plásmido pTrc-N19, y la cepa TG1 de E. coli que contenía el plásmido pQE-N19. Ambos clones contenían la secuencia de codificación de N19 fusionada a una secuencia carboxi terminal que codificaba nueve epítopos de linfocitos T adicionales que fueron, por este orden: P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, y HBsAg (Fig. 8).

Expresión y purificación de la proteína.

Las Figuras 3 y 4 representan gráficamente la expresión de la proteína de las tres proteínas sintéticas. La adición de cuatro nuevos epítopos (HBVnc, HA, HbsAg, y MT) a N6 en pTrc-His (banda D) para obtener la proteína N10 (banda C) dio como resultado una marcada reducción de la expresión de la proteína. Un intento para aumentar el nivel de expresión de N10 implicó sencillamente cambiar el vector de expresión (de pTrc-His a pQE30) y la cepa de E. coli (de Top10 a TG1). Según se observa en las Figuras 3 y 4, la cantidad de N10 expresada por pQE30-N10 en TG1 (banda B) fue notablemente mayor que la de la misma proteína expresada por pTrc-N10 (banda C). Se piensa que esto es posible debido al hecho de que la proteína N6 se ensamblo eficazmente en la cepa de E. coli en el orden de epítopos más adecuado para el organismo, mientras que la adición de cuatro epítopos adicionales fue forzada eficazmente y de esta manera fue menos natural. Sin embargo, el hecho de que el nivel de expresión de N10 aumentara notablemente mediante un cambio sencillo en el vector de expresión (de pTrc-His a PQE30) y la cepa de E. coli (de TOP-10 a TG1) sugiere que factores adicionales, diferentes de la combinación de epítopos, juegan un papel en la expresión de la proteína.

La Figura 9 muestra la expresión de la proteína y la purificación de la proteína N11 (SDSPAGE y tinción de Coomasie). El extracto total procedente de un cultivo inducido (banda B) muestra una banda inducida, que corresponde de manera grosera al peso molecular esperado de la proteína N11, que no está presente en un extracto no inducido (banda A). Se estableció la identidad de la banda inducida también mediante transferencia western usando un anticuerpo dirigido contra flag, y también se dedujo de la secuenciación del ADN plásmido (figura 7). Se llevó a cabo la purificación de N11 (figura 9, banda C) solubilizando los aglomerados de células completas en guanidinio y sometiendo el extracto completo a cromatografía IMAC, con este procedimiento los inventores obtuvieron 14 mg de proteína N11 recombinante procedentes de un matraz de cultivo de un litro con Top10-Trc-N11. La adición del epítopo de linfocitos T de HSP70 al término carboxi de N10 dio como resultado una construcción (pTrc-N11) que fue capaz de mejorar notablemente la expresión de la proteína portadora del poliepítopo en comparación a la expresión obtenida de pTrc-N10.

Tal como se realizó para la proteína N10, se mejoró también la expresión de la proteína N19 cambiando el vector de expresión (de pTrc-His a pQE30) y la cepa hospedadora (de Top10 a TG1). Se usó TG1 (QE-N19) para purificar la proteína N19 portadora del poliepítopo. Sometiendo los cuerpos de inclusión solubilizados a la cromatografía IMAC, los inventores purificaron (véase la figura 10A) 5,42 mg de proteína N19 procedentes de un matraz de cultivo de un litro. Se identificó la identidad de N19 en SDS-Page como una banda inducida que tenía el peso molecular esperado, en inmunotransferencia western usando un anticuerpo dirigido contra flag, y se dedujo también tras la secuenciación del ADN plásmido (figura 8).

Todos los clones que expresaban las proteínas recombinantes portadoras de poliepítopos las producen principalmente en forma de cuerpos de inclusión. La purificación de las proteínas N6 y N10 a partir de cuerpos de inclusión solubilizados con urea 8 M usando un procedimiento de cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) dio como resultado la pérdida de un elevado porcentaje de proteína que fue eludible con un gradiente de pH de 6,5-4 (no se muestran los datos).

Por el contrario, casi toda la proteína etiquetada con histidina se eluyó con el gradiente de pH 6,5-4 cuando se solubilizaron los cuerpos de inclusión de partida con clorhidrato de guanidina 6 M (Figuras 5 y 6). Usando este protocolo, se purificaron 7,8 mg de N6 a partir de un litro de cultivo. La proteína N10 que se empleó en los experimentos de inmunización y proliferación de linfocitos T se purificó a partir de un clon pTrc-N10.

Dada la baja expresión de la proteína recombinante mostrada por este clon los inventores decidieron purificar la proteína N10 solubilizando células completas con guanidinio con el fin de aprovechar las proteínas solubles e insolubles (cuerpos de inclusión) para la purificación IMAC. Con este procedimiento, se obtuvieron1,5 mg de proteína N10 purificada a partir de un litro de cultivo. Se piensa que el mayor éxito de la solubilización usando guanidinio 6 M es debido a la capacidad de este compuesto para solubilizar las proteínas portadoras en forma monomérica.

Conjugación del oligosacárido Hib con proteínas portadoras de poliepítopos.

Usando el protocolo FPLC de la fenil sefarosa, los inventores obtuvieron un conjugado N6-Hib purificado que tenía un contenido en proteína de 79,4 µg/ml, y un contenido en oligosacárido de 42,7 µg/ml.

Los inventores observaron que un 30% de la proteína conjugada era incapaz de unirse a la fenil sefarosa en presencia de (NH4)2SO4 1 M. Adicionalmente, se perdió previamente un 3040% de la proteína portadora durante una etapa de diálisis para eliminar la urea antes de la reacción de conjugación. Para superar estos problemas se comprobó si era posible llevar a cabo las reacciones de conjugación cuando se adsorbió la proteína en una resina Ni2+-NTA. Los inventores observaron que el oligosacárido Hib era incapaz de unirse a la resina Ni2+-NTA a cualquier pH, sugiriendo que la factibilidad de esta solución y la predicción de que no habría interferencia debida al polisacárido influenciaría la elución de la proteína una vez hubiera tenido lugar la conjugación.

Se estableció de esta manera una reacción que implicaba la adsorción de la proteína en resina Ni2+-NTA en presencia de urea 8 M, eliminación de la urea, conjugación con el oligosacárido, lavado, y elución del conjugado. No se observaron fenómenos de agregación para el conjugado eluido. Usando este procedimiento, los inventores obtuvieron un conjugado N6-Hib purificado que tenía un contenido en proteína de 320 µg/ml y un contenido en oligosacárido de 370 µg/ml, y un conjugado N10-Hib purificado que tenía un contenido en proteína de 113 µg/ml y un contenido en oligosacárido de 114 µg/ml.

Usando una relación molar 1:10 de proteína a carbohidrato para conjugar el carbohidrato a las proteínas portadoras recombinantes, los inventores observaron que una fracción de la proteína permanecía sin conjugar (tal como se dictaminó mediante la tinción de Coomasie del gel SDS-PAGE y la inmunotransferencia Western; no se muestran los datos). Cuando se usó una relación estequiométrica 1:20 de proteína a carbohidrato, se encontró que todas las proteínas recombinantes purificadas estaban completamente conjugadas, de hecho, analizando los geles teñidos mediante la tinción de Coomasie y las inmunotransferencias usando un anticuerpo dirigido contra Flag. Los inventores observaron que tras la conjugación de N6 y N10 con oligosacáridos Hib, estas moléculas incrementaron su peso molecular, apareciendo como unas manchas con elevado peso molecular, y las proteínas no fueron más visibles en el peso molecular esperado para los monómeros de N6 y N10. Esto sugirió que las proteínas sintéticas se habían conjugado completamente con los polisacáridos Hib (no se muestran los datos).

La conjugación del oligosacárido Hib activado con la proteína n19 dio como resultado un contenido en proteína de 173 µg/ml y un contenido en oligosacárido de 127 µg/ml La Figura 10B representa gráficamente un análisis SDS-Page y la tinción de Coomasie de las fracciones obtenidas de la cromatografía IMAC de la proteína N19 conjugada con el polisacárido Hib. Resultó que toda la proteína N19 estaba conjugada, tal como se dictaminó mediante el elevado peso molecular del conjugado y por la ausencia de proteína N19 de 43.000 kDa no conjugada. La Figura 10C muestra la inmunotransferencia western correspondiente usando un anticuerpo dirigido contra flag. También aquí se puede apreciar que toda la proteína N19 migó en forma de peso molecular muy elevado tras la conjugación con el polisacárido Hib, y que no había proteína N19 no conjugada que migraba a 43.000 kDa.

Reconocimiento de las proteínas portadoras y sus conjugados por os linfocitos T humanos.

Para investigar si los epítopos de linfocitos T contenidos en los polipéptidos eran reconocidos por los linfocitos T, los inventores usaron clones de linfocitos T específicos de los epítopos TT universales, p2TT y p30TT (Demotz y col. 1993). La Figura 11 muestra que N6 es reconocida por ambos clones no solo como polipéptido sencillo sino también después que se ha conjugado con el polisacárido. Increíblemente, N6-Hib es reconocida incluso mejor que la proteína N6 no conjugada por el clon de linfocitos T específico de P2TT. N10-Hib es reconocida por el clon específico de p2TT pero reconocida peor por el clon específico de P30TT. En ambos casos N10-Hib ejerce la misma actividad estimulatoria que el péptido sintético. No se ensayó el clon de N10 en estos experimentos.

Una vez evaluado que todos los epítopos de linfocitos T contenidos en las proteínas potadoras se presentan correctamente a los linfocitos T, los inventores se preguntaron si estas proteínas portadoras mantienen su capacidad estimuladora cuando se presentan a una población heterogénea de linfocitos tales como PBMC. Esto sería predictivo de si las proteínas portadoras de los inventores pueden funcionar como tales una vez inyectadas en sujetos inmunes a antígenos cuyos epítopos están incluidos en las propias proteínas portadoras. Con este fin, los inventores usaron PBMC de donantes inmunes a TT (A. Di Tommaso y col., 1997), debido a que los epítopos TT son los más representados en los polipéptidos de los inventores. La Figura 12 muestra que todas las formulaciones fueron capaces de estimular la proliferación de PBMC.

Sin embargo, la incubación de PBMC con un péptido sintético que representaba uno de los epítopos incluidos en ambas construcciones N6 y N10 fracasó en ejercer un efecto estimulatorio. Como control positivo, se incubaron también PBMC con 10 µg/ml de TT, que en todos los casos indujo una respuesta proliferativa. De manera interesante, la proteína N6 portadora del poliepítopo volvió a ser la estimuladora de PBMC más potente de aquellos ensayos en dos de tres voluntarios.

Ensayos de inmunogenicidad.

Se evaluó el efecto portador de las proteínas N10 y N6 en comparación con CRM197 en ratones con algunas vacunas glicoconjugadas. Una vez acopladas a los oligosacáridos Hib, se inyectaron las proteínas portadoras en diferentes estirpes de ratones para verificar el potencial de su efecto portador. En ratones BLAB/C, se encontró una respuesta anti-Hib equivalente cuando se usaron CRM197 y N10 como proteínas portadoras, mientras que se encontró una respuesta menor cuando se usó N6 como proteína portadora. Este resultado fue evidente cuando se expresaron los resultados usando títulos, aunque de reacción fracasaron en evidenciar la respuesta anti-Hib menor obtenida con la proteína portadora N6.

En ratones C57BL/6, la proteína N6 proporcionó un resultado negativo, mientras que se obtuvieron resultados positivos con CRM197 y N10, incluso si la extensión era menor. Ambos resultados fueron evidentes usando títulos o porcentajes de reacción para expresar los resultados. Cuando los resultados se expresaron como porcentajes de reacción, el elevado efecto portador de CRM197 y N10 se evidenció bien con respecto a N6, cuyos resultados fueron menores del 50% en el los extracción de sangres en el día -34 y en el día -45, tras una respuesta primaria comparable (extracción de sangre pre-2, día 20).

La Tabla II informa de los resultados de los experimentos en ratones BALB/C y C57BL/6.

En ratones Swiss CD1, los títulos obtenidos con la proteína portadora N10 fueron equivalentes a los obtenidos con CRM197. Los títulos anti-Hib aumentaron tras la inmunización hasta el 71º día, cuando se proporcionó un estímulo de polisacáridos para evaluar si se inducía o no una memoria inmunológica en los ratones tratados. No se observó efecto estimulador con ninguna proteína portadora, aunque cuando se usaron CRM197 o N10 como proteínas portadoras, los títulos no disminuyeron. En esta estirpe de ratones la inmunización con el glicoconjugado N6-Hib proporciona resultados muy similares a los de los controles (polisacárido y alum). No se evidenció efecto estimulador incluso en ratones BALB/C que provocan una menor respuesta con respecto a los ratones Swiss CD1.

En la tabla III se resumen los resultados.

La inmunización de diferentes estirpes de ratones con oligosacáridos Hib conjugados con las proteínas portadoras artificiales dio como resultado un buen efecto portador ejercido por N10, mientras que N6 proporcionó resultados insatisfactorios. Esto sugiere que el tamaño de la proteína o el número de epítopos de linfocitos T tiene una elevada influencia en proporcionar linfocitos T auxiliares a los oligosacáridos.

Los inventores usaron ratones CD1 exogámicos para llevar a cabo un experimento de

inmunogenicidad en el que se comparó el efecto portador de la proteína N19 con los efectos portadores de N10 y CRM197. Adicionalmente, con el fin de explorar el potencial de los fenómenos de inmunosupresión inducidos por el portador, se proporcionaron tres dosis de N10Hib, N 19-Hib y CRM-Hib a grupos de ratones que no recibieron estímulo portador y a grupos de ratones a los que se estimuló un mes antes con 50 µg del portador no conjugado respectivo (véase materiales y procedimientos).

TABLA II

RATONES BALB/C

QUE REACCIONAN (%)

A405 x 1000 (de GMT)

DÍA

EXTRACCIÓN DE SANGRE N-10-Hib N5+146-Hib CRM-Hib N-10-Hib N5+146-Hib CRM-Hib

0

PRE-INMUNE 0 0 0 10 17 12

20

PRE-2 33,3 33,3 50 135 162 257

34

POST-2/PRE-3 100 100 100 2022 1356 1969

45

POST-3 100 100 100 1717 1368 1616

RATONES C57BL/6

QUE REACCIONAN (%)

A405 x 1000 (de GMT)

DÍA

EXTRACCIÓN DE SANGRE N-10-Hib N5+146-Hib CRM-Hib N-10-Hib N5+146-Hib CRM-Hib

0

PRE-INMUNE 0 0 0 28 38 31

20

PRE-2 83,3 83,3 83,3 136 192 609

34

POST-2/PRE-3 83,3 33,3 100 1451 306 2612

45

POST-3 100 33,3 100 1731 222 2240

10 TABLA III

RATONES SWISS CD1

TÍTULOS DE GMT (A405nm x 103)

DÍA

EXTRACCIÓN DE SANGRE CRM-Hib N5+146-Hib N10-Hib PsHib ALUM

-1

PRE-INMUNIZACIÓN 59 98 156 166 175

35

POST-INMUNIZACIÓN 1577 471 1007 227 243

68

PRE-ESTIMULACIÓN 2082 889 1789 590 461

85

POST.ESTIMULACIÓN 2073 630 1767 364 479

RATONES SWISS CD1

QUE REACCIONAN (%)

DÍA

EXTRACCIÓN DE SANGRE CRM-Hib N5+146-Hib N10-Hib PsHib ALUM

-1

PRE-INMUNIZACIÓN 0 0 0 0 0

35

POST-INMUNIZACIÓN 100 50 62,5 0 0

68

PRE-ESTIMULACIÓN 87,5 87,5 100 25 25

85

POST-ESTIMULACIÓN 87,5 62,5 85,7 12,5 37,5

El programa del experimento fue el siguiente

Días

Grupo

-32 -30 -2 0 14 15 27 28 45

1

extracción de sangre DT* extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre

2

extracción de sangre extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre CRM-Hib extracción de sangre

3

extracción de sangre N10 extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre

4

extracción de sangre extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre N10-Hib extracción de sangre

5

extracción de sangre N19 extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre

6

extracción de sangre extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre N19-Hib extracción de sangre

* Para la estimulación se usó una toxina de la difteria químicamente modificada (DT: toxoide de la difteria) en vez del mutante no tóxico (CRM-197) de la toxina de la difteria

5

En la Figura 13 se representan gráficamente los resultados. Se obtuvieron los mejores títulos anti-Hib en ratones no estimulados usando N19-Hib, mientras que CRM-Hib y N10-Hib proporcionaron títulos menores. De acuerdo con la proporción directa conocida entre el tamaño de las moléculas portadoras y el efecto portador ejercido, N19-Hib estimuló una respuesta anti

10 Hib claramente mejorada en comparación con N10-Hib. Adicionalmente, N19-Hib parece también ligeramente superior cuando se compara con CRM-Hib sugiriendo la factibilidad de las proteínas portadoras “clásicas” sustitutas con las proteínas recombinantes portadoras del poliepítopo CD4+. En contraste con el ensayo previo de inmunogenicidad llevado a cabo en ratones CD1, en el que los efectos portadores de N10 y CRM-197 fueron similares, en este nuevo ensayo, el título anti-Hib promedio estimulado por N10-Hib fue notablemente menor al de uno obtenido con CRM-Hib.

En ratones estimulados, se obtuvieron los mejores resultados con N19-Hib, que estimuló una mejor respuesta también cuando se comparó con la respuesta obtenida en ratones no estimulados, sugiriendo una potenciación debida a la estimulación con la proteína N19. Se obtuvo también una ligera potenciación tras la estimulación con N10. De manera inversa, la respuesta anti-Hib obtenida con CRM-Hib en ratones estimulados fue notablemente menor a la respuesta obtenida en ratones no estimulados, confirmando la inmunosupresión inducida por el portador observada a menudo con los portadores en el uso ordinario.

Como N10 y N19 contienen cinco y diez epítopos de linfocitos T del toxoide del tétanos respectivamente, los inventores sometieron a N10-Hib y N19-Hib a un ensayo de inmunogenicidad en ratones CD1 estimulados con toxoide del tétanos. La meta de este experimento era comprobar si ratones estimulados con anti-Hib experimentaron una mejora en el título en comparación con ratones no estimulados. Se manera sorprendente, la estimulación con el toxoide del tétanos potenció la inmunorespuesta a Hib en ratones inmunizados con N10-Hib pero no en ratones que recibieron N19-Hib (no se muestran los datos).

De los ensayos de inmunogenicidad llevados a cabo se pueden extraer las siguientes pocas conclusiones:

1.

El efecto portador de la proteína portadora del poliepítopo está directamente relacionado con su tamaño.

2.

Las proteínas recombinantes N10 y N19 portadoras de poliepítopos pueden igualar o exceder CRM-197 como portadoras.

3.

Las proteínas portadoras de poliepítopos no sufre de supresión inducida por el portador.

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Claims (31)

1.-Una proteína portadora que comprende 10 a 20 epítopos CD4+ de linfocitos T.

2.-La proteína portadora de la reivindicación 1, que contiene 10, 11 ó 19 epítopos CD4+ de linfocitos T degenerados.

3.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los epítopos CD4+ derivan de una bacteria o virus patógenos.

4.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los epítopos CD4+ se derivan de la toxina del tétanos, la proteína del circunsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno superficial de la hepatitis B, la proteína central nuclear de la hepatitis B, la proteína de la matriz de la gripe, la hemaglutinina de la gripe, el toxoide de la difteria, el mutante CRM 197 de la toxina de la difteria, el complejo de proteínas de la membrana externa del grupo B de Neisseria meningitidis, la toxina pertussis o la proteína 70 del choque térmico.

5.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la que los epítopos CD4+ se seleccionan de los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT y hsp70 CD4+ tal como se han definido en la Tabla

1.

6.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg y MT CD4+ tal como se han definido en la Tabla 1.

7.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT y hsp70 CD4+ tal como se han definido en la Tabla 1.

8.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT y P2TT CD4+ tal como se han definido en la Tabla

1. 9.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

52 anteriores, en la que los epítopos CD4+ son epítopos CD4+ humanos 10.-Una proteína portadora que comprende una o más copias de:

imagen1

11.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en forma oligomérica.

12.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, conjugada con un polisacárido.

13.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polisacárido es un polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo B.

14.-Una proteína portadora de acuerdo con la reivindicación 12, en la que el polisacárido se deriva de uno cualquiera de los siguientes organismos: S. pneumoniae, N. meningitidis, S. aureus, Klebsiella,o S. typhimurium.

15.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14

en la que el polisacárido está conjugado con la proteína mediante enlace covalente.

16.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que el polisacárido está conjugado a la proteína mediante aminación reductora.

17.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12-16, en la que existen entre dos y diez unidades de proteína por cada unidad de polisacárido.

18.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como producto farmacéutico.

19.-Uso de la proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 como producto farmacéutico.

20.-La proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como una vacuna o como un componente de una vacuna.

21.-Uso de una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 como una vacuna o componente de vacuna.

22.-Una vacuna que comprende una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

23.-Una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, para uso en la vacunación de un mamífero.

24.-La proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para uso como inmunógeno protector en el control de enfermedades producidas por bacterias encapsuladas.

25.-Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

26.-La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 25 que comprende ADN.

27.-Un vector de clonación o de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25-26.

28.-Una célula hospedadora transformada o transfectada con el vector de la reivindicación 27.

29.-Un animal transgénico no humano que ha sido transformado mediante una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26 o mediante un vector de acuerdo con la reivindicación 27.

30.-Un procedimiento para preparar una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende expresar un vector de acuerdo con la reivindicación 27 en una célula hospedadora y cultivar dicha célula hospedadora en condiciones en las que dicha proteína se expresa, y recuperar dicha proteína expresada de esta manera.

31.-Un procedimiento de producción de una proteína portadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende las etapas de:

a) construir moléculas de oligonucleótidos que codifican epítopos de péptidos;

b) hibridar las moléculas de oligonucleótidos para formar dupletes;

c) introducir los dupletes de oligonucleótidos en un vector de expresión de tal manera que codifique una proteína de fusión;

d) introducir el vector de expresión en una célula hospedadora para permitir la expresión de la proteína de fusión; y

e) aislar la proteína de fusión producida a partir de un cultivo de dichas células hospedadoras.

32.-El procedimiento de la reivindicación 31, que comprende además la etapa de conjugar la proteína de fusión con un polisacárido.

33.-El procedimiento de la reivindicación 30, la reivindicación 31 o la reivindicación 32, en el que la célula hospedadora es una bacteria E. coli.