ES2353721T3 - Administración y producción controladas de agentes biológicamente activos mediante bacterias intestinales. - Google Patents

Abstract

Bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante que comprende y expresa una proteína o un polipéptido biológicamente activo, comprendiendo la bacteria un operón xilanasa que comprende un promotor de xilanasa de Bacteroides ovatus que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína o el polipéptido terapéutico heterólogo biológicamente activo.

Description

La presente invención se refiere a la producción y secreción de proteína(s) o polipéptido(s) biológicamente activo(s) por la microflora intestinal, a métodos de administración de los mismos y a métodos de control de la 5 producción y secreción de dicha(s) proteína(s) o polipéptido(s) biológicamente activo(s). La presente invención es particularmente útil en el desarrollo de nuevas inmunoterapias y especialmente para el tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias. 10

ANTECEDENTES

La comunidad microbiana en el intestino grueso humano consiste en una gama diversa de bacterias que son predominantemente anaerobios obligados. Estas bacterias actúan 15 juntas degradando sustratos de la dieta que alcanzan el colon (incluyendo insulina, fructo-oligosacáridos y almidón resistente), produciendo una gama de productos que son importantes para la enfermedad y la salud humana.

La respuesta inmunitaria de la mucosa puede verse 20 influida por la manipulación de la flora bacteriana residente normal. Esta flora posee una gran variedad de propiedades biológicas e inmunomoduladoras que pueden influir, directa o indirectamente, en el desarrollo y la función del sistema inmunitario de la mucosa. Trastornos crónicos del intestino, 25 por ejemplo la enfermedad inflamatoria del intestino (EII) que incluye los trastornos de la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, afectan a una proporción significativa de la población en países desarrollados. Se han usado modelos animales de inflamación de la mucosa para probar y determinar 30 los mecanismos inmunitarios implicados en la patogenia de estas enfermedades. La colitis ulcerosa se desarrolla de manera espontánea en ratones interleucina (IL) 2-/- e IL10-/- ambos de los cuales se usan como modelos de EII. Se han descrito también muchos otros modelos de ratón de EII, la 35

mayoría de los cuales tienen deleciones seleccionadas como diana de genes de respuesta inmunitaria. El tratamiento actual de EII se limita a terapias con fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores incluyendo IL10 recombinante y anticuerpos frente al factor de necrosis tumoral- (TNF-). Sin embargo, 5 estas terapias no son curativas y pueden provocar efectos secundarios adversos tales como toxicidad e inmunosupresión. Por tanto, existe una necesidad de una forma de inmunoterapia más controlada y dirigida.

Se sabe de la técnica anterior usar bacterias 10 comensales, o bacterias que se producen de manera natural en el canal alimentario, tales como Lactobacillus spp. y Streptococcus spp. para tratar la inflamación intestinal y ciertas formas de EII en seres humanos (Shanahan 2001), sin embargo estos resultados tienen pruebas de éxito limitadas y 15 eficacia inconstante. Se sabe de la técnica anterior usar Lactococcus lactis de grado alimentario modificada por ingeniería genética para secretar interleucina-10 (IL10), que cuando se administra por vía intragástrica a dos modelos murinos de EII se demostró que era tan eficaz tanto en la 20 prevención como en el tratamiento de la enfermedad que la terapia con esteroides más convencional (Steidler et al. 2000). Este sistema de Lactococcus se ha usado también para producir IL2 e IL6 biológicamente activa (Steidler et al. 1995; Steidler et al. 1998). Sin embargo, una desventaja 25 importante asociada con estos sistemas de la técnica anterior es que L. lactis no puede colonizar el intestino debido a la incapacidad del organismo para unirse al epitelio del intestino y/o su dependencia nutricional de la provisión de aminoácidos y péptidos que no están disponibles in vivo. Por 30 consiguiente, cualquier terapia o tratamiento in vivo requeriría la dosificación repetida al sitio apropiado con el organismo modificado.

Otra desventaja y preocupación de bioseguridad del uso de esta bacteria aerobia particular es que podría sobrevivir 35

fuera del huésped/paciente durante un tiempo suficiente para transmitirse a otros.

Una desventaja aún adicional de los sistemas de la técnica anterior es que no hay ningún medio de controlar la expresión constitutiva de las moléculas de interleucina 5 inmunológicamente activas y estas moléculas activas por sí mismas, cuando se producen en exceso, pueden tener efectos adversos. Por consiguiente, los sistemas probióticos genéticamente modificados de la técnica anterior carecen de control y regulación de la actividad de las bacterias 10 probióticas tras su administración. Esto representa un problema de seguridad grave para la terapia en seres humanos.

Para abordar las deficiencias en la técnica anterior y para desarrollar adicionalmente bacterias comensales como sistemas de administración novedosos para moléculas 15 biológicamente activas, se han desarrollado organismos probióticos modificados por ingeniería genética en los que la producción de agentes inmunoterapéuticos por bacterias comensales in situ puede regularse y controlarse mediante factores de la dieta. 20

Es un objeto de la presente invención modificar por ingeniería genética una bacteria comensal intestinal de modo que produzca y secrete proteína(s) o polipéptido(s) biológicamente activo(s) de una manera regulada como base para inmunoterapias novedosas para trastornos intestinales 25 crónicos.

BREVE SUMARIO DE LA DESCRIPCIÓN

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus 30 recombinante que comprende y expresa una proteína o un polipéptido biológicamente activo, comprendiendo la bacteria un operón xilanasa que comprende un promotor de xilanasa de Bacteroides ovatus y una secuencia de ácido nucleico que

codifica para la proteína o el polipéptido terapéutico heterólogo biológicamente activo.

A lo largo de toda la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras “comprenden” y “contienen” y variaciones de las palabras, por ejemplo “que 5 comprende” y “comprende”, significan “incluyendo pero sin limitarse a”, y no pretenden excluir (ni excluyen) otros restos, aditivos, componentes, números enteros o etapas.

A lo largo de toda la descripción y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, el singular abarca el plural a 10 menos que el contexto requiera otra cosa. En particular, cuando se usa el artículo indefinido, debe entenderse que la memoria descriptiva contempla la pluralidad así como la singularidad, a menos que el contexto requiera otra cosa.

Debe entenderse que los rasgos distintivos, los números 15 enteros, las características, los compuestos, los restos o los grupos químicos descritos conjuntamente con un aspecto, realización o ejemplo particular de la invención pueden aplicarse a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en el presente documento a menos que sea incompatible 20 con el mismo.

Un operón puede definirse como una unidad funcional que consiste en un promotor, un operador y varios genes estructurales. Un ejemplo es el operón xilanasa. Los genes estructurales codifican comúnmente para varias enzimas 25 funcionalmente relacionadas, y aunque se transcriben como un ARNm (policistrónico), cada uno tiene su sitio de iniciación de la traducción separado. En el operón típico, la región operadora actúa como elemento de control de la activación o desactivación de la síntesis de ARNm. El operón xilanasa se 30 activa en presencia de xilano.

Preferiblemente, el promotor es constitutivo y más preferiblemente es el promotor de xilanasa. Por tanto, se apreciará que la expresión de una o más proteínas o polipéptidos biológicamente activos se controla mediante la 35

presencia de xilano en la dieta. Por tanto, puede decirse que las bacterias comprenden un elemento regulador inducible por xilano.

Preferiblemente, el operón xilanasa de la bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus incluye además una 5 secuencia señal de secreción de enterotoxina de Bacteroides fragilis.

El xilano es un polisacárido soluble en agua, gomoso, que se encuentra en paredes de células vegetales y que produce xilosa tras su hidrólisis. Por tanto, es un componente o 10 factor común de la dieta, por consiguiente la inclusión o exclusión del xilano en la dieta controla la expresión de la proteína o el polipéptido biológicamente activo. Por tanto, las bacterias modificadas de la presente invención proporcionan ventajosamente un sistema de expresión fácilmente 15 controlable que evita la dosificación invasiva repetida de un individuo puesto que las bacterias modificadas de la presente invención también pueden colonizar el intestino mientras que se minimiza de manera concomitante cualquier efecto secundario adverso. 20

Preferiblemente, la bacteria es un anaerobio obligado.

Preferiblemente, la bacteria no es patógena para el hombre.

“Biológicamente activo” se refiere a la capacidad de realizar una función biológica. La proteína o el polipéptido 25 biológicamente activo usado en la presente invención puede ser o bien homólogo para la bacteria o bien heterólogo para la misma, derivado de fuentes o bien virales o bien procariotas o bien eucariotas.

Los ejemplos específicos de tales polipéptidos y 30 proteínas usados en la presente invención incluyen preferiblemente insulina, hormona del crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroidea, somatostatina, hormona estimulante del tiroides, polipéptido intestinal vasoactivo, factores trébol, factores de reparación 35

celulares y tisulares, factor de crecimiento transformante , factor de crecimiento de queratinocitos, una citocina de grupo estructural 1 que adopta una estructura de haz de 4 hélices  antiparalelas tal como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-, 5 EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL o IFN/, una citocina de grupo estructural 2 que a menudo están asociadas a la superficie celular, forman homotrímeros simétricos y las subunidades adoptan la conformación de “barril ” (“-jelly roll”) descrita para ciertas proteínas de la envuelta viral 10 tales como la familia TNF de citocinas, por ejemplo TNF, TNF, ligandos de CD40, CD27 o FAS, la familia IL-1 de citocinas, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, los factores de crecimiento derivados de las plaquetas, factor de crecimiento transformante  y factores de 15 crecimiento nerviosos, una citocina de grupo estructural 3 que comprende moléculas / de cadena corta, que se producen como moléculas precursoras transmembrana grandes que contienen cada una al menos un dominio EGF en la región extracelular, por ejemplo la familia de citocinas del factor de crecimiento 20 epidérmico, las quimiocinas caracterizadas por su posesión de secuencias de aminoácidos agrupadas alrededor de residuos de cisteína conservados (los subgrupos de quimiocinas C-C o C-X-C) o las citocinas relacionadas con la insulina, una citocina de grupo estructural 4 que presenta estructuras en mosaico 25 tales como las heregulinas o neuregulinas compuestas por diferentes dominios, por ejemplo dominios EGF, de tipo inmunoglobulina y kringle.

Alternativamente, el polipéptido biológicamente activo puede ser un receptor o antagonista para polipéptidos 30 biológicamente activos tal como se definió anteriormente.

La bacteria expresa la proteína o el polipéptido biológicamente activo y el antígeno a partir del ácido nucleico contenido dentro de la misma. El ácido nucleico puede

comprender uno o más constructos de ácido nucleico en los que el ácido nucleico que codifica para el polipéptido biológicamente activo y el ácido nucleico que codifica para el antígeno están bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas para su expresión en la bacteria. 5

La bacteria también puede expresar la proteína o el polipéptido biológicamente activo como una vacuna.

Preferiblemente, la bacteria de la presente invención puede modificarse para expresar una pluralidad de proteínas o polipéptidos biológicamente activos. 10

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante que comprende y expresa una proteína o un polipéptido biológicamente activo, comprendiendo la bacteria 15 operón xilanasa que comprende un promotor de xilanasa de Bacteroides ovatus y una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína o el polipéptido terapéutico heterólogo biológicamente activo.

Preferiblemente, la composición farmacéutica se 20 proporciona como una composición en un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable

Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende una cualquiera o más de las características mencionadas anteriormente en el presente documento. 25

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante tal como se describió anteriormente en el presente documento para el tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria, en la que el 30 polipéptido o la proteína se selecciona del grupo que comprende una hormona del crecimiento, un factor trébol, factor de crecimiento transformante , factor de crecimiento de queratinocitos, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, G-CSF, GM-CSF, IFN-, TNF, TNF, un 35

miembro de la familia IL-1 de citocinas, un miembro de la familia de citocinas del factor de crecimiento epidérmico, o una quimiocina.

Preferiblemente, el uso comprende además una cualquiera o más de las características mencionadas anteriormente en el 5 presente documento.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante tal como se describió anteriormente en el presente documento para su uso en el tratamiento de una 10 enfermedad intestinal inflamatoria, en la que el polipéptido o la proteína se selecciona del grupo que comprende una hormona del crecimiento, un factor trébol, factor de crecimiento transformante , factor de crecimiento de queratinocitos, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-15 CSF, G-CSF, GM-CSF, IFN-, TNF, TNF, un miembro de la familia IL-1 de citocinas, un miembro de la familia de citocinas del factor de crecimiento epidérmico, o una quimiocina.

Preferiblemente, la bacteria expresa más de un 20 polipéptido o proteína o antígeno o enzima o vacuna biológicamente activo o una combinación de los mismos.

Por tanto, se apreciará que en esta realización de la invención se proporcionan, por ejemplo y sin limitación, bacterias que pueden expresar IL2 y bacterias que pueden 25 expresar IL12 y/o IL9 y opcionalmente bacterias que pueden expresar un factor de reparación celular y tisular

Preferiblemente, la bacteria incluye una cualquiera o más de las características descritas anteriormente en el presente documento. 30

Bacteroides ovatus es una bacteria Gram-negativa del colon comensal principal en seres humanos y roedores para la que están disponibles sistemas de clonación que permiten la introducción de ADN foráneo en el organismo y su integración en el genoma (Tancula et al. 1992). Este organismo es también 35

uno de los pocos que pueden degradar el polisacárido xilano. Se proporcionan pruebas de la modificación por ingeniería genética satisfactoria de B. ovatus para producir IL2 murina (MuIL2) intracelularmente bajo el control del promotor de xilanasa que es activo en presencia de xilano. Estos 5 resultados demuestran que B. ovatus puede inducirse para que produzca MuIL2 biológicamente activa en respuesta a xilano. También se ha modificado por ingeniería genética una segunda cepa para que secrete MuIL2 añadiendo la secuencia señal de secreción de enterotoxina de B. fragilis a la proteína. Las 10 cepas recombinantes producían MuIL2 sólo en presencia de xilano tal como se determinó mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de lisados celulares y sobrenadantes de cultivo. Se usó la línea celular dependiente de IL2, CTLL-2, para demostrar que MuIL2 producida por ambas cepas de B. 15 ovatus era biológicamente activa. Además, esta actividad podía bloquearse mediante un anticuerpo neutralizante anti-IL2.

El uso de las bacterias de la invención como vehículos de administración de fármacos ofrece un medio de administración de factores inmunomoduladores, tales como 20 citocinas, y otras moléculas biológicamente activas directamente al sitio de acción para tratar la inflamación crónica del intestino.

Las ventajas de esta forma única de administración terapéutica es que es un medio conveniente y sencillo de 25 administrar proteínas biológicamente activas directamente a su sitio de acción, evitando los inconvenientes y la exposición sistémica asociados con la terapia parenteral.

La presente invención se describirá a modo de ejemplo sólo con una breve referencia a las siguientes figuras en las 30 que:

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra una construcción esquemática del plásmido pBOMuIL2. 35

La figura 2 muestra un gráfico de barras de los niveles de de MuIL2 en lisados celulares (LS) y sobrenadantes de cultivo (SN) de cepas BOMuIL2 de B. ovatus, BOMuIL2-S de B. ovatus y cepas control (V975 y BT2) hechas crecer con xilano durante 24 h (+X) o sin xilano. 5

La figura 3 muestra el resultado de un bioensayo de MuIL2 en sobrenadantes de cultivo de BOMuIL2-S de B. ovatus hecha crecer con xilano.

La figura 4 muestra un gel del aumento de la expresión de ARNm de MuIL2 en respuesta a xilano determinado mediante 10 RT-PCR con cepas de prueba (BOMuIL2 y BOMuIL2-S) o cepas control (V975 y BT2) de B. ovatus hechas crecer durante 24 h en RGM sin xilano seguido por 1 h con xilano.

La figura 5 muestra el mapa del constructo de B. ovatus que expresa o bien KGF o bien TGF humano. 15

La figura 6A muestra la producción de citocinas humanas por B. ovatus que expresa TGF humano en respuesta a xilano y la figura 6B muestra la producción de citocinas humanas por B. ovatus que expresa KFG humano en respuesta a xilano. 20

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Cepas bacterianas, plásmidos y manipulaciones generales del ADN

Se hicieron crecer DH5 y J53/R751 de E. coli en medio 25 LB. Se complementaron cultivos de J53/R751 de E. coli con 200 g de trimetoprim ml-1. Se hizo crecer de manera anaerobia V975 de B. ovatus a 37ºC en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI) complementado con 10 g de hemina ml-1 o en medio de crecimiento rutinario (RGM) preparado tal como se 30 describe por Hespell et al. (1987) y complementado con glucosa al 0,1% (p/v). Cuando se requería xilano, se preparó una fracción soluble en agua caliente de xilano de avena-escanda mediante el método de Hespell y O’Bryan (1992) y se añadió al

medio a una concentración del 0,2% (p/v). Se llevó a cabo la transferencia de plásmidos a B. ovatus a partir de J53/R751 de E. coli mediante conjugación tal como se describe por Valentine et al. (1992). Se seleccionó pBT2 (Tancula et al. 1992) en E. coli usando 50 g de kanamicina ml-1. Se 5 seleccionaron transconjugantes de B. ovatus en agar BHI-hemina que contenía 200 g de gentamicina ml-1 y 5 g de tetraciclina ml-1. Posteriormente, se hicieron crecer los transconjugantes en medio que contenía 1 g de tetraciclina ml-1. Se transformó E. coli mediante el método de Hanahan (1983). Se llevaron a 10 cabo las manipulaciones generales del ADN tal como se describe por Sambrook et al. (1990).

Construcción de cepas de B. ovatus control y productoras de MuIL2 15

Cepa BOMuIL2 productora de MuIL2. Se amplificó por PCR el gen de MuIL2 a partir de ADNc clonado en pUC13 usando cebadores MuIL2F1 (GCGCATATGGCACCCACTTC AAGCTCCAC; SEQ ID NO:1 sitio NdeI en negrita) y MuIL2R1 (GCGGGATCCTT ATTGAGGGCTTGTTGAGATGATG; SEQ ID NO:2 sitio BamHI en negrita). 20 Se amplificó una parte del operón xilanasa de B. ovatus que abarcaba la mitad 3’ del gen orf y la región entre este gen y el gen xyl a partir del plásmido pOX1 (Whitehead y Hespell 1990) usando los cebadores ORFF1 (GCGGGATCCATGGAGCA TGAATGCGTCA; SEQ ID NO:3 sitio BamHI en negrita) y ORFR1 25 (CATATGTTA TATTTTTGAGTAATAAACATTCTAC; SEQ ID NO:4 sitio NdeI en negrita). Se clonaron los productos de PCR MuIL2 y ORF en pGEM-T (Promega) para crear los plásmidos pGEM-MuIL2 y pGEM-ORF respectivamente. Se eliminó MuIL2 de pGEM-MuIL2 con NdeI y se ligó en pGEM-ORF digerido con Ndel para crear pORF-MuIL2. 30 Se secuenció el inserto para verificar el constructo. Se eliminó el constructo ORF-MuIL2 de pORF-MuIL2 mediante digestión con BamHI y se clonó en el sitio BamHI de pBT2 para crear pBOMuIL2. Se transfirió este plásmido a B. ovatus

mediante conjugación y se confirmó la integración del plásmido en el genoma de transconjugantes mediante PCR.

Cepa BOMuIL2-S secretora de MuIL2. Se construyó la cepa BOMuIL2-S de B. ovatus del mismo modo que la cepa BOMuIL2 excepto porque se amplificó por PCR el gen de MuIL2 usando los 5 cebadores BFTSIGIL2F (GACATATGAAGAATGTAAAGTTACTTTTAA TGCTAGGAACCGCGGCATTATTAGCTGCAGCACCCACTTCAAGCTCCAC; SEQ ID NO:5 la región que codifica para la secuencia señal está subrayada, sitio NdeI en negrita) y MuIL2R1. Esto condujo a la creación de los plásmidos pGEM-MuIL2-S, pORF-MuIL2-S y pBOMuIL2-S. 10

Cepa control BT2. Se construyó la cepa control que contenía pBT2 sin el gen de MuIL2 tal como sigue. La misma parte del gen orf que se usó anteriormente se amplificó por PCR con los cebadores ORFF1 y ORFR2 (GGATCCTTATATTTTTGAGTAAT AAACATTCTAC; SEQ ID NO:6 sitio BamHI en negrita) y se clonó en 15 pGEM-T para crear pGEM-ORFB. Se eliminó el inserto con BamHI y se clonó en el sitio BamHI de pBT2 para crear pBT-ORF. Se transfirió este plásmido a B. ovatus tal como se describió anteriormente.

20

Preparación de muestras de B. ovatus que producen MuIL2.

Se hicieron crecer las cepas V975, BT2, BOMuIL2 y BOMuIL2-S de B. ovatus en 10 ml de RGM con o sin xilano durante 24 h. Se hicieron crecer también las cepas BOMuIL2 y BOMuIL2-S durante 16 h sin xilano y luego con xilano durante 25 otras 8 h. Tras la incubación, se recogieron las células (5000 g, 30 min., 4ºC). Se retiraron los sobrenadantes y se congelaron. Se lavaron las células una vez en 10 ml de RGM y se resuspendieron en 5 ml de agua destilada. Se rompieron las células mediante sonicación sobre hielo durante 4 x 20 s a 12 30 m (Soniprep 150, MSE). Se eliminaron mediante centrifugación las células que no se rompieron y los residuos celulares (13.000 g, 20 min., 4ºC). Se liofilizaron los lisados y sobrenadantes y se resuspendieron en 0,5 ml de agua destilada.

35

Ensayos para la detección de MuIL2

Se usó un ELISA que incorporaba anticuerpo de rata nativo anti-IL2 de ratón (clon JES6-1A12) y anticuerpo de rata biotinilado anti-IL2 de ratón (clon JES65H4) como anticuerpos de captura y detección respectivamente, para cuantificar los 5 niveles de MuIL2 producidos por cepas recombinantes de B. ovatus y se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante (BD Pharmingen). Se usó MuIL2 recombinante (rMuIL2; Sigma) como control para obtener una curva patrón. Se usó un bioensayo de IL2 usando la línea celular indicadora CTLL-2 10 (Gillis et al. 1978) para detectar la presencia de MuIL2 biológicamente activa en muestras (Wadhwa et al. 2000). En resumen, se incubaron las células con diluciones de muestras de prueba o rMuIL2 de control en placas de 96 pocillos por duplicado durante 18 h. Entonces se pulsaron las células con 15 0,5 Ci de [3H]timidina, se recogieron tras 4 h y se estimó la radiactividad incorporada al ADN mediante recuento por centelleo. Se realizó también el ensayo en presencia de un anticuerpo neutralizante de IL2 (clon JES6-1A12). Se añadió éste a las muestras a una concentración de 5 g ml-1 1 h antes 20 de la adición de células.

Detección de la transcripción de MuIL2 mediante RT-PCR

Se hicieron crecer B. ovatus V975, BT2, BOMuIL2 y BOMuIL2-S en RGM sin xilano durante 16 h. Se tomó una muestra 25 de preinducción de los cultivos de BOMuIL2 y BOMuIL2-S antes de que se añadiese xilano para inducir la transcripción del operón xilanasa. Se tomaron muestras de los cuatro cultivos tras 1 h. Se extrajo el ARN total de las muestras celulares usando el kit RNeasy (Qiagen) seguido por tratamiento con 30 TURBO DNA-free (Ambion) para eliminar cualquier ADN contaminante residual. Se realizó la RT-PCR usando el sistema de RT-PCR AccessQuick (Promega) y cebadores para la fusión orf-Muil2 (CCGATGGTACCTGCCATTAAA (SEQ ID NO:7) y

CTGTGCTTCCGCTGAGG) SEQ ID NO:8 o el gen gyrA (CTCCATGTCGG TCATCGTTTC (SEQ ID NO:9) y CAAAGGATAACGCATTGCCCA (SEQ ID NO:10)) como control positivo. Como control negativo, se realizó la reacción sin la adición de transcriptasa inversa.

5

Construcción de cepas de B. ovatus

Con el fin de construir una cepa de B. ovatus que pueda expresar MuIL2 de una manera inducible por xilano, se amplificaron por PCR el gen de MuIL2 (menos la secuencia señal nativa) y la parte en 3’ del gen orf del operón xilanasa y se 10 ligaron en pGEM-T para dar el plásmido pORF-MuIL2. Se colocó un codón de iniciación ATG antes de la secuencia que codifica para MuIL2 madura como parte de un sitio NdeI. Esto garantizó la traducción de la proteína. El uso de este sitio NdeI para la clonación dio como resultado un único cambio de bases (G a 15 A) en la región no codificante entre orf y el gen de MuIL2 en comparación con la región de tipo natural entre orf y xyl. Sin embargo, no se esperaba que esto afectase a la expresión de MuIL2. La construcción del plásmido pBOMuIL2 en la figura 1 comprende la parte en 3’ del gen orf de B. ovatus y el gen de 20 MuIL2 completo amplificado mediante PCR, ligados entre sí en pBluescript y luego subclonados en pBT2 para crear pBOMuIL2. Sólo se muestran en la figura los sitios de restricción usados para la clonación. tet, resistencia a tetraciclina para la selección en B. ovatus; kan, resistencia a kanamicina para la 25 selección en E. coli; oriV, origen de replicación; repA, repB, repC codifican para funciones de replicación y mob se requiere para la movilización de E. coli a B. ovatus. Se transfirió entonces el plásmido pBOMuIL2 (figura 1) satisfactoriamente a V975 de B. ovatus. Se construyó la cepa secretora de MuIL2, 30 BOMuIL2-S de B. ovatus, del mismo modo excepto porque el cebador directo usado para amplificar por PCR el gen de MuIL2 contenía la secuencia que codificaba para la secuencia señal de secreción de enterotoxina de B. fragilis. Se construyó también una cepa control, BT2 de B. ovatus, clonando sólo el 35

gen orf en pBT2. Se confirmó la construcción satisfactoria de las cepas de expresión MuIL2 y MuIL2-S, y la cepa control BT2 mediante PCR y secuenciación de nucleótidos (datos no mostrados).

5

EJEMPLO 1

Se emprendió un estudio para evaluar la capacidad para colonizar el intestino de ratón de la cepa de B. ovatus modificada genéticamente, B. ovatus-MuIL2, diseñada para producir el factor de crecimiento murino interleucina-2 (IL-2) 10 en presencia de xilano.

Puesto que la utilidad del uso de B. ovatus-MuIL2 para tratar ratones IL2-/- depende de la demostración de que puede colonizar el colon de ratón, se determinó si B. ovatus-MuIL2 podía colonizar el colon de ratones de tipo natural. Se 15 infectaron ratones C57BU6, libres de patógenos específicos (SPF), de tipo natural, mantenidos con una dieta convencional (que contenía xilano), con un único inóculo de 110 ufc de B. ovatus-MuIL2 mediante sonda nasogástrica oral. Se evaluó la colonización 7, 14, 21 y 28 días más tarde mediante cultivo de 20 sedimentos fecales en condiciones anaerobias en presencia de antibióticos permisivos para el crecimiento de todos los Bacteroides sp., o para el crecimiento de B. ovatus-MuIL2 sola. En futuros experimentos, la identidad de B. ovatus-MuIL2 en cultivos fecales se verificará más exhaustivamente mediante 25 técnicas de hibridación en filtro de colonias usando un clon de ADNc de IL2 murina de longitud completa como sonda. Tal como se muestra en la tabla 1, B. ovatus-MuIL2 estaba presenta en los sedimentos fecales de 3/5 animales hasta 28 días tras la inoculación, lo que concuerda con su capacidad para 30 colonizar al menos transitoriamente el colon de ratón. Los cólones de los animales 2, 3 y 5 analizados a los 28 días tras la inoculación contenían grandes números (2-8x107 ufc/g que teóricamente podrían producir 20-80 pg de MuIL2) de B. ovatus-MuIL2, lo que concuerda con los recuentos de bacterias 35

fecales. En cambio, los cólones de los ratones n.º 1 y 4 no contenían B. ovatus-MuIL2, lo que concuerda con un fallo en la colonización. La eficacia y duración de la colonización podría mejorarse aumentando el número de bacterias en el inóculo infeccioso, o mediante la administración repetida de 5 bacterias.

Tabla 1. Recuentos de bacterias anaerobias fecales de ratones “infectados” con B. ovatus-MuIL2

Bacteroides totales (x108 ufc/g)

B. ovatus-MuIL2 (x104 ufc/g)

Ratón

T0 T7 T14 T21 T28 T0 T7 T14 T21 T28

1

12 1,6 7,5 5,4 5,8 - nd nd nd nd

2

17 3,6 4,8 2,9 8,3 - 0,67 2,74 5,4 10,1

3

15 4,1 3,7 3,5 3,7 - 0,53 3,2 4,9 9,3

4

18 7,8 1,1 6,0 1,3 - nd nd nd nd

5

13 5,1 2,5 7,0 3,4 - 0,21 4,61 7,9 12,2

nd, no detectable.

10

EJEMPLO 2

Se emprendió un estudio para evaluar la capacidad de la cepa modificada por ingeniería genética de B. ovatus, B. ovatus-MuIL2, diseñada para producir el factor de crecimiento murino interleucina-2 (IL-2) en presencia de xilano, para 15 afectar de manera adversa a la aparición o la gravedad de la inflamación intestinal que se produce espontáneamente en ratones genéticamente deficientes en IL-2 (ratones IL-2-/-).

Un problema al usar bacterias comensales en protocolos de inmunoterapia para EII es que las bacterias elegidas, en 20 animales y pacientes inmunocomprometidos, pueden ser “patógenas” y promover, amplificar o sostener la inflamación intestinal. Bacteroides, y en particular B. fragilis y B. vulgatis, se han asociado con el desarrollo de inflamación intestinal en modelos animales experimentales para EII y en 25 pacientes con EII. Un estudio también ha identificado un

aumento de los títulos de anticuerpos IgA e IgG reactivos con antígenos de B. ovatus en los sueros de pacientes con EII5. Sin embargo, no está claro si esto era una causa de la inflamación intestinal, o era secundario a la entrada de Bacteroides y otras bacterias comensales en la circulación 5 sistémica y al desencadenamiento de respuestas inmunitarias como resultado del daño a la barrera epitelial. En vista de estos hallazgos, se creyó que es necesario determinar si B. ovatus tiene algún efecto adverso sobre el desarrollo de la colitis en ratones IL2-/-, que de lo contrario confundiría o 10 contrarrestaría cualquier beneficio potencial que el tratamiento con B. ovatus-MuIL2 pudiese tener en estos animales.

Se infectaron dos grupos (n=6 cada uno) de ratones IL2-/- SPF de igual sexo y edad, de 3 semanas de edad, libres de 15 colitis mantenidos con una dieta convencional, con 1010 ufc de B. ovatus (V975) en 200 ul de PBS, o PBS solo cada 7 días durante 6 semanas, momento en el que los ratones IL2-/- no tratados han desarrollado enfermedad grave. A las 3 y 6 semanas tras la infección, se sacrificaron los animales y se 20 analizaron macroscópica e histológicamente los tejidos (bazo, ganglios linfáticos y colon) para determinar la patología de la enfermedad. Se usó una puntuación inflamatoria histológica validada para la evaluación ciega de la inflamación intestinal. 25

Estos hallazgos indican que B. ovatus ni acelera la aparición ni aumenta la gravedad de la colitis que se desarrolla normalmente en ratones IL2-/-. Sin embargo, esta evaluación macroscópica e histológica no excluye la posibilidad de que haya otros cambios más sutiles en, por 30 ejemplo, el número, la distribución y/o la actividad de células inmunitarias en los tejidos y el colon de animales tratados con B. ovatus. Por tanto, se llevarán acabo análisis inmunológicos más detallados.

35

EJEMPLO 3

Para evaluar la producción de MuIL2 por las cepas BOMuIL2 y BOMuIL2-S, se hicieron crecer cepas recombinantes (BOMuIL2, BOMuIL2-S y BT2) y la cepa de tipo natural (V975) en medio con o sin xilano. Además, se hicieron crecer BOMuIL2 y 5 BOMuIL2-S durante 16 h sin xilano (RGM con glucosa) seguido por otras 8 h con xilano para demostrar la naturaleza inducible de la producción. Se sometieron a ensayo los lisados celulares y los sobrenadantes de cultivo para detectar MuIL2 mediante ELISA y bioensayo. En la figura 2 se muestran 10 resultados representativos de 3 experimentos independientes, los niveles de MuIL2 en lisados celulares (LC) y sobrenadantes de cultivo (SN) de cepas BOMuIL2 de B. ovatus, BOMuIL2-S de B. ovatus y cepas control (V975 y BT2) hechas crecer con xilano durante 24 h (+X) o sin xilano. Se hizo crecer también 15 BOMuIL2-S sin xilano durante 16 h seguido por 8 h con xilano (+X8). Se hicieron crecer cepas control y de prueba de B. ovatus en RGM con o sin xilano. Se recogieron las células y se lisaron y se determinó la cantidad de MuIL2 en lisados y sobrenadantes de cultivo mediante ELISA. Se cuantificó MuIL2 20 mediante comparación con una serie de dilución de MuIL2 recombinante. Los puntos de datos son la media +/error estándar. Se detectó MuIL2 en el lisado celular de BOMuIL2 de B. ovatus hecha crecer con xilano (539,5 pg ml-1) y a una concentración inferior (44,2 pg ml-1) en sobrenadantes de 25 cultivo. Para la cepa BOMuIL2-S, se detectó 19,3 veces más MuIL2 (849,9 pg ml-1) en el sobrenadante del cultivo hecho crecer en presencia de xilano en comparación con BOMuIL2. Se detectó una concentración inferior de MuIL2 (184,3 pg ml-1) en el lisado celular de BOMuIL2-S. No se detectó MuIL2 en lisados 30 celulares o sobrenadantes de cultivo de las dos cepas control o de BOMuIL2 o BOMuIL2-S de B. ovatus cultivadas en ausencia de xilano.

35

EJEMPLO 4

Un bioensayo de IL2 demostró que la MuIL2 producida por BOMuIL2-S era biológicamente activa (figura 3). La figura 3 muestra los resultados de un bioensayo de MuIL2 en sobrenadantes de cultivo de BOMuIL2-S de B. ovatus hecha 5 crecer con xilano. Se midió la proliferación de células CTLL-2 mediante la captación de [3H]timidina tras la incubación con diluciones de duplicación de: ■, sobrenadante de BOMuIL2-S de B. ovatus solo; □, sobrenadante de BOMuIL2-S de B. ovatus con anticuerpo anti-MuIL2. Se cuantificó MuIL2 mediante 10 comparación con una serie de dilución de MuIL2 recombinante. Los puntos de datos son la media +/error estándar. No se detectó actividad biológica en sobrenadantes de las cepas control ni en medio de cultivo solo (datos no mostrados). El bloqueo de la proliferación de la línea celular indicadora 15 mediante la adición de un anticuerpo anti-MuIL2 demostró que la actividad de estimulación del crecimiento en sobrenadantes de cultivo de pBOMuIL2-S de B. ovatus se debía a MuIL2. En la cepa BOMuIL2-S, se añadió un codón ATG al extremo en 5’ del gen de MuIL2 con el fin de facilitar la traducción. En 20 consecuencia, estaba presente un residuo de metionina en el extremo N-terminal de la proteína madura. Los resultados del bioensayo demostraron que esto no suprimía la actividad biológica de la proteína. Asimismo, la secreción de MuIL2 dirigida por la secuencia señal de secreción de enterotoxina 25 de B. fragilis no eliminaba la actividad biológica de MuIL2. Las concentraciones superiores de lisados celulares y sobrenadantes demostraron ser inhibitorias para la línea celular indicadora, de ahí la concentración inferior de MuIL2 medida en la dilución 1/40 de sobrenadante de BOMuIL2-S. 30

EJEMPLO 5

Para confirmar la transcripción de la fusión génica orf-MuIL2, se realizó una RT-PCR. Se hicieron crecer BOMuIL2 y BOMuIL2-S de B. ovatus en RGM con glucosa durante 16 h y se 35

tomó una muestra de células. Entonces se añadió xilano y se tomaron muestras tras 1 h. Se tomaron también muestras de cultivos de cepas control tras la inducción con xilano. Se extrajo el ARN total de las células y se realizó una RT-PCR con cebadores específicos para el constructo orf-MuIL2 y para 5 gyrA, un gen de control expresado de manera constitutiva comúnmente usado. Pudo detectarse que el nivel basal de transcripción en ambas cepas BOMuIL2 y BOMuIL2-S antes de la adición de xilano que aumentó 1 h tras la adición de xilano (figura 4). La figura 4 muestra el aumento de la expresión de 10 ARNm de MuIL2 en respuesta al xilano tal como se determina mediante RT-PCR. Cepas de prueba (BOMuIL2 y BOMuIL2-S) o control (V975 y BT2) de B. ovatus que se hicieron crecer durante 24 h en RGM sin xilano. Entonces se añadió xilano y se continuó la incubación durante 1 h. Se recogieron las células, 15 se extrajo el ARN total y se realizó la RT-PCR para detectar transcritos de MuIL2 y MuIL2-S. Se usó gyrA como control positivo. Carriles: 1, V975 hecha crecer con xilano durante 1 h; 2, BT2 hecha crecer con xilano durante 1 h; 3, BOMuIL2 hecha crecer sin xilano; 4, BOMuIL2 hecha crecer con xilano 20 durante 1 h; 5, BOMuIL2-S hecha crecer sin xilano; 6, BOMuIL2-S hecha crecer con xilano durante 1 h.

No se detectó transcripción del gen de MuIL2 en las dos cepas control. Aunque se detectó transcripción en las cepas productoras de MuIL2 antes de la adición de xilano, no fue 25 posible detectar la proteína MuIL2 en lisados celulares o sobrenadantes de cultivo (figura 2).

Los datos presentados en el presente documento demuestran que puede producirse MuIL2 biológicamente activa bajo una estricta regulación del operón xilanasa en B. ovatus, 30 un miembro de la microflora intestinal residente. Además, también pudo secretarse MuIL2 biológicamente activa por B. ovatus incorporando la secuencia señal de secreción de enterotoxina de B. fragilis. El nivel de MuIL2 en el sobrenadante de cultivo de la cepa BOMuIL2 era relativamente 35

bajo pero aumentó 19,3 veces mediante la adición de la secuencia señal de secreción (cepa BOMuIL2-S). El operón xilanasa se ha utilizado ventajosamente para lograr expresión génica regulada en virtud de la naturaleza inducible de este operón en presencia de xilano. Aunque el promotor de este 5 operón no se ha clonado ni caracterizado, se ha mostrado que la actividad de enzimas codificadas por genes en el operón está regulada por incremento en respuesta a xilano. El sistema de la presente invención también proporciona el control o la regulación in vivo mediante ingesta en la dieta de xilano. 10 Esta característica de la invención tiene la ventaja con respecto a otros sistemas inducibles de que el xilano permanece sin digerir a medida que pasa través del intestino hasta el colon y sólo se degrada en el colon por la acción de enzimas microbianas. 15

Aunque se detectó un nivel basal de transcripción en células hechas crecer sin xilano, la producción de MuIL2 estaba a un nivel demasiado bajo (< 20 pg ml-1) para su detección mediante ELISA en lisados celulares o sobrenadantes de cultivo. La incapacidad para detectar cualquier MuIL2 en 20 cultivos de pBOMuIL2 de B. ovatus inducidos con xilano tras la retirada del xilano demostró la rigurosidad del operón xilanasa y la necesidad de la presencia continuada de xilano para la producción de MuIL2 (datos no mostrados). Los niveles de MuIL2 producidos y secretados por B. ovatus son bajos, pero 25 dentro del intervalo fisiológico. Esto es crucial si va a usarse este sistema terapéuticamente puesto que debe producirse suficiente MuIL2 para que tenga un efecto biológico pero los niveles no deben ser tan grandes como para tener un efecto perjudicial. Se intenta ahora someter a prueba las 30 cepas de B. ovatus secretoras y productoras de MuIL2 en modelos de ratón de EII para determinar su capacidad para tratar y prevenir la enfermedad.

35

EJEMPLO 6

Se administró a ratones C57BU6 adultos una única dosis de cepa recombinante de B. ovatus que expresaba el gen de IL2 murina mediante sonda nasogásrica oral (108 ufc en PBS) y 3 y 7 días (T) más tarde se cultivaron las deposiciones para 5 determinar la presencia de todos los Bacteroides sp. nativos y los B. ovatus recombinantes usando condiciones de cultivo selectivas y el uso de antibióticos. Se cuantificaron las colonias bacterianas (ufc) tras 24 h.

Los resultados muestran que la cepa de B. ovatus 10 recombiante coloniza el colon de la mayoría (4/5) de los ratones durante hasta una semana tras una única dosis de bacterias. La presencia del B. ovatus recombinante no tiene un impacto apreciable sobre el tamaño de las poblaciones endógenas de Bacteroides. 15

Tabla 2: Colonización de ratones por cepas recombinantes de B. ovatus

Ratón

Bacteroides totales ufc g-1 B. ovatus recombinante ufc g-1

T0

T3 T7 T0 T3 T7

1

1,16 x 109 1,61 x 109 7,54 x 108 - 1208 1555

2

1,66 x 109 3,61 x 108 4,75 x 108 - 997 1054

3

1,50 x 109 4,06 x 108 3,73 x 108 - 5263 5409

4

3,81 x 109 7,77 x 108 1,08 x 109 - 0 0

5

1,32 x 109 5,05 x 108 2,50 x 108 - 2105 1636

EJEMPLO 7 20

La figura 5 muestra el mapa de constructo de B. ovatus que expresa o bien KGF o bien TGF humano. Se cultivaron cepas

recombinantes de B. ovatus que expresaban genes que codificaban para o bien KGF (BoHuKGF) o bien TGF (BoHuTGF) humano o cepas control (BoBTS) que no contenían genes heterólogos, en medios completos solos (medios) o en medios que contenían xilano durante 8 ó 24 h antes de someter a 5 ensayo los sobrenadantes de cultivo para detectar TGF y KGF mediante ELISA. Se cultivaron algunos cultivos de B. ovatus recombinante con xilano durante 8 h antes de eliminar los medios y cultivar durante otras 24 h en medios completos solos (BoHuKGF/TGF  xilano). La figura 6A muestra las gráficas de 10 las cantidades promedio (EEM) de citocina presente en los sobrenadantes de cultivo detectadas en 3 experimentos independientes con B. ovatus que expresa el gen que codifica para KGF TGF humano (BoHuTGF). La figura 6B muestra los mismos datos experimentales de B. ovatus que expresa el gen 15 que codifica para KFG humano (BoHuKGF).

En resumen, la capacidad para modificar por ingeniería genética bacterias comensales para producir moléculas inmnomoduladoras bajo el control de factores de la dieta, tal como se describió anteriormente en el presente documento, 20 ofrece la posibilidad de proporcionar una terapia más medida, específica y controlada para trastornos intestinales crónicos tales como EII. Este enfoque puede usarse para administrar una variedad de moléculas biológicamente relevantes, incluyendo citocinas, enzimas y vacunas, con aplicaciones en el 25 tratamiento y la prevención de una variedad de trastornos.

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25

Claims (9)

1. Bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante que comprende y expresa una proteína o un polipéptido biológicamente activo, comprendiendo la bacteria un operón xilanasa que comprende un promotor de 5 xilanasa de Bacteroides ovatus que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína o el polipéptido terapéutico heterólogo biológicamente activo.

2. Bacteria según la reivindicación 1, en la que el operón 10 xilanasa incluye además una secuencia señal de secreción de enterotoxina de Bacteroides fragilis.

3. Bacteria según cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína o el polipéptido biológicamente activo usado se deriva de fuentes o bien virales, o bien 15 procariotas o bien eucariotas.

4. Bacteria según cualquier reivindicación anterior, en la que la proteína o el polipéptido biológicamente activo se selecciona del grupo que comprende insulina, hormona del crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona 20 luteinizante, hormona paratiroidea, somatostatina, hormona estimulante del tiroides, vacunas, antígenos, polipéptido intestinal vasoactivo, factores trébol, factores de reparación celulares y tisulares, factor de crecimiento transformante , factor de crecimiento de 25 queratinocitos, una citocina de grupo estructural 1 que adopta un haz de 4 hélices  antiparalelas seleccionada del grupo que comprende IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFN-, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL o 30 IFN/, una citocina de grupo estructural 2 seleccionada del grupo que comprende TNF, TNF, ligandos de CD40, CD27 o FAS, familia IL-1 de citocinas, familia del factor de crecimiento de fibroblastos, factores de

crecimiento derivados de las plaquetas, factor de crecimiento transformante  y factores de crecimiento nerviosos, una citocina de grupo estructural 3, familia de citocinas del factor de crecimiento epidérmico, quimiocinas, citocinas relacionadas con la insulina, y 5 una citocina de grupo estructural 4 seleccionada del grupo que comprende EGF, dominios kringle y de tipo inmunoglobulina.

5. Bacteria según la reivindicación 4, en la que la proteína o el polipéptido biológicamente activo es un 10 receptor o antagonista para proteínas o polipéptidos biológicamente activos enumerados en la reivindicación 4.

6. Bacteria según cualquier reivindicación anterior modificada para expresar una pluralidad de proteínas o 15 polipéptidos biológicamente activos.

7. Composición farmacéutica que comprende una bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante según cualquier reivindicación anterior.

8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, que 20 comprende un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable.

9. Bacteria comensal intestinal de Bacteroides ovatus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó 6, para su uso en el 25 tratamiento de una enfermedad intestinal inflamatoria, en la que el polipéptido o la proteína se selecciona del grupo que comprende una hormona del crecimiento, un factor trébol, factor de crecimiento transformante , factor de crecimiento de queratinocitos, IL-2, IL-4, 30 IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, GM-CSF, G-CSF, GM-CSF, IFN-, TNF, TNF, un miembro de la familia IL-1 de citocinas, un miembro de la familia de

citocinas del factor de crecimiento epidérmico, o una quimiocina.