ES2353964T3 - Procedimiento para la inmunoterapia de tumores. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para preparar células dendríticas reactivas a un antígeno, que comprende: proporcionar una representa de células dendríticas; y poner en contacto las células dendríticas con el antígeno, un estimulante de CD40 y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR).
Description
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de células dendríticas reactivas, y en particular a la utilización de las células dendríticas reactivas para la vacunación tumoral, con el fin de crear un modelo animal de insuficiencia orgánica y para la utilización en el cribado in vitro de fármacos.
Las infecciones e inflamación se consideran en la actualidad factores de riesgo importantes de enfermedades cardiovasculares1, la causa principal de muerte en las sociedades occidentales. En efecto, la elevación de marcadores inflamatorios en el suero predice el prognóstico de los pacientes con enfermedades cardiacas coronarias2 y cardiomiopatía dilatada3,4. En particular la cardiomiopatía dilatada, la causa más común de
5,6,7
insuficiencia cardiaca en pacientes jóvenes, se ha asociado a respuestas autoinmunológicas tras la infección con virus cardiotrópicos, debido a que muchos de
6,7,8
estos pacientes representan autoanticuerpos contra proteínas cardiacas. Se han implicado mecanismos autoinmunológicos similares en la insuficiencia cardiaca tras la infección con el protozoo Trypanozoma cruzii7. La autoinmunidad se caracteriza mediante varios criterios clásicos24, incluyendo autoantígenos definidos, especificidad de órgano y células T autorreactivas y/o autoanticuerpos que pueden transferir la enfermedad.
Los modelos animales apoyan la idea de que la infección microbiana puede desencadenar respuestas autoinmunológicas contra el tejido cardiaco7. Los ratones con fondos genéticos definidos desarrollan miocarditis prolongada, con células T autorreactivas, tras la infección por Coxsackie B37 y Trypanozoma cruzii9. En las mismas cepas de ratón, la inmunización con α-miosina específica del corazón o un epítopo de dieciséis aminoácidos de la cadena pesada de la α-miosina conjuntamente con un
7,10,11
adyuvante fuerte induce miocarditis mediada por células T. Cabe mencionar que se ha demostrado que los corazones de ratones normales contienen un gran número de células residentes en el tejido que presentan péptidos endógenos específicos del corazón12 . Sin embargo, se desconoce si las células dendríticas que presentan autoantígenos endógenos podrían contribuir a una enfermedad cardiaca autoinmunológico y a la posible insuficiencia cardiaca. Se requiere un modelo animal que permita a los investigadores estudiar los mecanismos mediante los que se desarrolla la cardiomiopatía en pacientes jóvenes y, más importante, que permita identificar los compuestos que interfieren con dicho desarrollo.
Las células dendríticas son agentes cruciales en la inducción de respuestas
13,14,15 16,17
inmunológicas específicas de antígeno, así como de inmunotolerancia. Las células dendríticas inmaduras se alojan en los tejidos periféricos, en los que muestrean activamente su ambiente mediante endocitosis y macropinocitosis. Tras encontrarse con un patógeno, experimentan un programa del desarrollo denominado maduración de células dendríticas, que incluye la inducción de actividad coestimulantea, procesamiento de antígenos, expresión incrementada de moléculas del MHC, y migración a los nódulos linfáticos, donde pueden cebar células T específicas de antígeno no expuestas 13 . Las células dendríticas también procesan antígenos endógenos procedentes de residuos y
13,15,16
células muertas. Por lo tanto, se ha propuesto que las células dendríticas podrían
13,17
inducir las células T autorreactivas en el caso de que se activasen correctamente. Existe evidencia creciente de que el procesamiento de células moribundas y de los propios tejidos en ausencia de estimulación apropiada convierte a las células dendríticas en tolerogénicas para las respuestas inmunológicas mediadas por células T CD8+18 y T CD4+19 . La investigación actual se ha centrado, por lo tanto, en el papel de las células dendríticas en el mantenimiento de la autotolerancia. Algunas investigaciones señalan que las células dendríticas pueden inducir inflamación específica de órgano en un modelo transgénico de expresión de antígenos víricos20, pero todavía sólo se dispone de datos indirectos de que las células dendríticas activadas puedan inducir autoinmunidad frente a
13,21
autoantígenos. Además, nunca se ha demostrado que las células dendríticas pulsadas con autoproteínas sean realmente capaces de inducir autoinmunidad en ratones "no expuestos". Las células dendríticas expresan múltiples receptores de tipo Toll y, por lo tanto, estas células se encuentran idealmente dispuestas en la interfaz entre las inmunidades adaptativa e innata21. El sistema inmunológico innato es una antigua forma universal de defensa del huésped frente a la infección21 .
Las células dendríticas comprenden una población celular heterogénea con una distribución de tejidos amplia. La utilización de células dendríticas para la investigación y para aplicaciones más prácticas se ha visto limitada por la baja frecuencia de las células dendríticas en la sangre periférica, la limitada accesibilidad de los órganos linfoides y el estado terminal de diferenciación de las células dendríticas. El número de células dendríticas necesario para la activación mediante los procedimientos actuales es del orden de por lo menos 1x106 células. Se requiere un procedimiento para la activación de las células dendríticas que exija menos células, del orden de entre 5x104 y 2x105 células.
La investigación ha demostrado que el sistema inmunológico puede eliminar las células tumorales en cierto grado; los tumores, sin embargo, con frecuencia prevalecen. Se han propuesto diversos procedimientos para la inmunoterapia en el tratamiento de cánceres, pero todavía no se dispone de un procedimiento terapéutico que induzca con éxito una respuesta inmunoterapéutica eficaz y específica contra un tumor diana. Se requiere un procedimiento que genere consistente y específicamente una respuesta inmunológica contra un tumor in vivo, resultando en la erradicación del mismo.
Se da a conocer en el documento WO nº 03/020889 A un procedimiento para la mutación de las DC con antígenos y un modificador de la respuesta inmunológica.
Weir et al. (Inmunology and Cell Biology 80(1):14-20, (2002)) describen la utilización de células dendríticas para la inducción de encefalomielitis autoinmunológica en ratones mediante la puesta en contacto de DC con un autoantígeno y la toxina pertussis como coestimulante.
Steinbrink et al. (Journal of Immunology 159(10):4472-4780, (1997)) demostraron la eficacia de IL-10 sobre DC maduras e inmaduras. Las DC inmaduras tratadas con IL-10 no podían activar las células T CD4+ posteriormente.
Eriksson et al. (Journal of Experimental Medicine 197(3):323-331, (2003)) investigaron todos los efectos de IL-1 sobre la activación de las DC. Se demostró que los ratones con un defecto en su receptor de IL-1 eran inmunes frente a la miocarditis autoinmunológica experimental mediada por DC.
Se da a conocer un procedimiento para activar las células dendríticas y que sean reactivas frente a un antígeno seleccionado. En este procedimiento, se exponen las células dendríticas al antígeno seleccionado, a un estimulante de CD40 y a un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR), que activa una ruta de TLR en las células dendríticas.
En el caso de que el antígeno seleccionado al que se exponen las células dendríticas sea un autoantígeno o un antígeno específico de tejido, la reintroducción de las células dendríticas activadas en un animal no humano cuyos tejidos sean portadores de dicho antígeno conduce al desarrollo de enfermedad autoinmunológica en el animal. Lo expuesto anteriormente proporciona un procedimiento para crear un modelo animal de una enfermedad autoinmunológico o de un daño autoinmunológico específico de tejido. La selección de un autoantígeno asociado a una enfermedad autoinmunológica permite modelar la enfermedad autoinmunológico, tal como se describe en la presente memoria.
En el caso de que el antígeno seleccionado al que se exponen las células dendríticas sea un antígeno tumoral, la reintroducción de las células dendríticas activadas en el paciente que presenta un tumor proporciona un nuevo procedimiento de inmunoterapia, tal como se describe en la presente memoria.
Según una forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar células dendríticas que son reactivas a un antígeno, que comprende:
-proporcionar una representa de células dendríticas, y
-poner en contacto las células dendríticas con el antígeno, un estimulante de CD40 y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR).
Según otra forma de realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para preparar un medicamento destinado al tratamiento de un tumor en un animal, que comprende proporcionar un antígeno tumoral expresado por el tumor, proporcionar una representa de células dendríticas del animal, provocar que las células dendríticas sean reactivas al antígeno tumoral mediante el procedimiento descrito anteriormente, en el que el medicamento está destinado a reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.
Según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar un modelo animal no humano de una enfermedad autoinmunológica que comprende proporcionar un antígeno asociado con la enfermedad autoinmunológica, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, provocar que las células dendríticas sean reactivas al antígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica mediante el procedimiento descrito anteriormente, y reintroducir las
células dendríticas reactivas en el animal.
Según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para preparar un modelo animal no humano de insuficiencia orgánica, que comprende proporcionar un autoantígeno específico de órgano, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, preparar las células dendríticas que son reactivas frente al autoantígeno mediante el procedimiento descrito anteriormente y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.
Según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona el procedimiento descrito anteriormente, en el que el antígeno es el péptido myhc-a.
Según otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para cribar un compuesto candidato para su capacidad de modular el desarrollo de una enfermedad autoinmunológico en un animal no humano, que comprende proporcionar un autoantígeno asociado a la enfermedad autoinmunológico, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, provocar que las células dendríticas sean reactivas al autoantígeno mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal, en el que las células dendríticas entran en contacto con el compuesto candidato en un momento seleccionado de entre antes del contacto con el autoantígeno, durante el contacto con el autoantígeno, después del contacto con el autoantígeno y antes del contacto con el estimulante de TLR, durante el contacto con el estimulante de TLR y después del contacto con el estimulante de TLR, y comparar la reacción autoinmunológica en el animal con la reacción autoinmunológica en un animal tratado con células dendríticas que sean convertido en reactivas al mismo autoantígeno y no expuesto al compuesto.
La presente invención se pondrá más claramente de manifiesto a partir de la descripción detallada siguiente de determinadas formas de realización de la invención, haciendo referencia a los dibujos, en los que:
la figura 1 representa fotomicrografías de secciones de tejido cardíaco de ratón a ampliaciones de 0x (paneles a y b), 140x (paneles c y d) y 560x (paneles e y f). Los paneles 1a y 1c representan tejido cardiaco normal, mientras que los paneles 1b, 1d, 1e y 1f representan tejido cardiaco inflamado producido en respuesta a células dendríticas activadas pulsadas con una parte de los residuos 614 a 629 del péptido cadena pesada α de la miosina (myhc-α).
La figura 2, panel a, representa la producción de IFN-γ y de IL-4 de las células T CD4+ de ratones inoculados con células dendríticas activadas y pulsadas con myhc-α u OVA, expresada como pg/ml; el panel 2b representa la producción in vivo de anticuerpos autoIgG en ratones inoculados con células dendríticas activadas y pulsadas con myhc-α o con péptido ova de control (OVA); el panel 2c representa secciones de tejido cardiaco que representan miocarditis en ratones SCID en los que se habían inyectado células T CD4+ previamente expuestas a myhc-α, pero no en ratones en los que se habían inyectado células T CD4+ previamente expuestas a OVA.
La figura 3 representa los datos que indican disfunción contráctil y la aparición de cardiomiopatía dilatada en ratones en los que se habían inoculado DC activadas y pulsadas con myhc-α. La figura 3a representa las proporciones de peso de corazón a peso corporal; la figura 3b representa el diámetro diastólico del extremo ventricular izquierdo (LVEDD); la figura 3c representa ecocardiogramas de los ratones de control y de ensayo. La figura 3d representa la velocidad de acortamiento de fibras circunferenciales (VCFC) y la figura 3e representa el acortamiento fraccional (FC).
La figura 4 representa tejido cardiaco de ratón en sección transversal a ampliaciones de 0x y 140x tras la inoculación con DC activadas y pulsadas con myhc-α. Las figuras 4a y 4d representan tejido cardiaco al inocular células dendríticas CD40-/-en huéspedes CD40+/+ . Las figuras 4b y 4e representan tejido cardiaco al inocular células
+/+ -/
dendríticas CD40en huéspedes CD40. Las figuras 4c y 4f representan tejido cardiaco
+/+ +/+
al inocular células dendríticas CD40en huéspedes CD40.
La figura 5 representa tejido cardiaco de ratón en sección transversal a una magnificación de 560x 10 días después de la inoculación de DC pulsadas con myhc-α activadas con (panel a) LPS/anti-CD40, (panel b) ARNds/anti-CD40, (panel c) CpG/antiCD40, y (panel d) PGN/anti-CD40.
Las figuras 6a, 6b y 6c representan la expresión de moléculas coestimulanteas
+/+ -/
sobre células dendríticas CD40(azul) y CD40(rojo) tras la estimulación con LPS/antiCD40 durante 12 horas. Los histogramas de FACS se proporcionan en las ventanas
++ +
siguientes: células vivas CD11cCD11bde MHC de clase II(ICAM, B7.1, B7.2) o células vivas CD11c+ CD11b+.
La figura 7 representa la producción de las citoquinas TNF-α, IL-12p 70, IL6 e IL-1β por parte de células dendríticas estimuladas durante 12 horas con los estimulantes de receptor de tipo Toll indicados (1 µg/ml de LPS, 100 µg/ml de poli(I:C)(ARNds) o CpG-ODN 10 µM), en ausencia o en presencia del anticuerpo estimulante anti-CD40 (α CD40: 5 µg/ml). Los datos se expresan como medias (±SD) de pocillos de cultivo por cuadruplicado y representan uno de varios experimentos con datos similares.
La figura 8, panel a, representa en forma esquemática un modelo propuesto de patogénesis autoinmunológica en la que la lesión de tejidos libera autoantígenos que resultan capturados y presentados por células dendríticas. En el caso de la activación de un receptor de tipo Toll, se produce una respuesta de células T autorreactivas, que resulta amplificada por interacciones CD40-CD40L.
La figura 8b representa tejido cardiaco de ratones de control en los que se habían inyectado 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (i.p.) sin LPS no induce miocarditis (0 de 6 ratones). La figura 8c representa el tejido cardiaco de ratones en los que se habían inyectado 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (i.p.) conjuntamente con LPS (10 µg i.p. los días 0, 1 y 2) resultaron en inflamación cardiaca (flecha) en 7 de 8 ratones. Se indica que la inoculación de LPS solo no indujo inflamación cardiaca (0 de 5 ratones, no representados). p<0,0001 para LPS/cardiomiocitos vs. cardiomiocitos (prueba exacta de Fisher). La figura 8d representa los títulos de autoanticuerpo IgG anti-myhc-α 10 después de la inoculación i.p. de LPS y 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (LPS) o el control de únicamente cardiomiocitos apoptóticos. La inoculación de cardiomiocitos solos no indujo títulos de anticuerpo relevantes (control). Se representan los datos de ratones individuales.
En una forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para estimular que las células dendríticas se conviertan en reactivas frente a un antígeno.
La expresión "células dendríticas", tal como es conocido por el experto en la materia, se refiere a células del sistema inmunológico que incorporan y presentan autoantígenos y antígenos foráneos y que forman dendritas durante la maduración.
Pueden obtenerse células dendríticas mediante diversos procedimientos descritos en la literatura científica. Entre las fuentes de tejido adecuadas se incluyen sangre periférica, médula ósea y tejidos linfáticos, tales como bazo o nódulos linfáticos. Las células dendríticas pueden obtenerse, por ejemplo, mediante el cultivo de médula ósea, tal como describen Lutz et al.40, o pueden aislarse directamente a partir de suspensiones de células de bazo o de nódulo linfático mediante enriquecimiento con perlas magnéticas específicas para marcadores de superficie de células dendríticas, por ejemplo CD11c+.
La mayoría (~80%) de la población de células dendríticas aisladas mediante el procedimiento de Lutz et al. de la médula ósea murina se encontró que eran CD11c+ CD11b+. La invención no se encuentra limitada a este subconjunto de células dendríticas y el procedimiento de la invención puede aplicarse a cualquier población de células dendríticas procedentes de cualquier fuente. Resultan preferidas las células dendríticas inmaduras.
Las células dendríticas aisladas pueden, opcionalmente, enriquecerse adicionalmente mediante selección positiva de las CD11c+, por ejemplo utilizando perlas magnéticas (MACSTM , Miltenyi Biotech). Dichas poblaciones celulares más purificadas pueden resultar preferidas para el uso clínico humano.
En una forma de realización de la invención, se ponen en contacto las células dendríticas aisladas con un antígeno seleccionado contra el que se desea que las células se conviertan en reactivas y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR).
Las células dendríticas aisladas pueden ponerse en contacto con el antígeno seleccionado durante un periodo de tiempo adecuado, seguido de la puesta en contacto de las células dendríticas con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR) durante un periodo de tiempo adicional.
Para un antígeno que sea un péptido corto que no requiera procesamiento por parte de las células dendríticas, resulta suficiente un tiempo de exposición a antígeno de entre 30 y 60 minutos. Para antígenos más complejos, tales como proteínas completas o preparaciones celulares crudas, la exposición a antígenos debería ser de entre aproximadamente 12 y 24 horas.
Generalmente, una concentración de antígenos comprendida en el intervalo de entre 1 y 20 µg/ml resulta adecuada para la exposición a antígenos. Los niveles elevados de algunos anticuerpos pueden resultar tóxicos para las células dendríticas, pero el experto en la materia podrá determinar fácilmente una concentración o intervalo óptimo de antígeno.
El periodo de tiempo para la activación de TLR por parte del estimulante de TLR puede ser de entre 1 y 4 horas, preferentemente de entre aproximadamente 1 y 2 horas, particularmente en el caso de que se utilicen concentraciones elevadas de estimulante de TLR, tal como se describe en la presente memoria.
Los materiales que estimulan o activan miembros de la familia de TLR son bien conocidos por el experto en la materia y se describen en la literatura científica. Puede utilizarse cualquier ligando de TLR como estimulante de TLR para activar las células dendríticas en el procedimiento de la invención. Entre los TLR adecuados se incluyen, por ejemplo, lipopolisacáridos (LPS: E. coli 0111:B4:Sigma), poli(I:C) (Amersham), CpG-ODN
o peptidoglicano (PGN: S. aureus:Fluka).
Tal como indican los datos dados a conocer en la presente memoria, la activación de las células dendríticas mediante el procedimiento de la invención no se encuentra limitado a la estimulación de un TLR particular, debido a que se han utilizado con éxito estimulantes que estimulan diferentes TLR.
En otra forma de realización de la invención, las células dendríticas se ponen en contacto tanto con un estimulante de TLR como con un anticuerpo anti-CD40. Los anticuerpos anti-CD40 pueden obtenerse comercialmente.
La coactivación de las células dendríticas con un estimulante de TLR y un anticuerpo anti-CD40 incrementó tanto la reactividad como la vida de las células tratadas, en comparación con la activación por parte de un estimulante de TLR por sí solo. Las concentraciones de anticuerpo anti-CD40 en el intervalo de 3 a 5 µg/ml proporcionaron buenos resultados, pero pueden utilizarse concentraciones fuera de dicho intervalo.
Las células dendríticas reactivas preparadas mediante el procedimiento mencionado anteriormente son la base de varios procedimientos nuevos.
Por ejemplo, en el caso de que el antígeno seleccionado con el que se exponen las células dendríticas sea un antígeno tumoral, pueden utilizarse células dendríticas reactivas a dicho antígeno en la inmunoterapia del tumor a partir del que se obtuvo el antígeno.
Según la presente forma de realización, la invención proporciona un procedimiento para preparar un medicamento destinado al tratamiento de un tumor en un animal, tal como un ser humano, proporcionando un antígeno tumoral expresado por el tumor, la proporcionando una representa de células dendríticas del animal; la puesta en contacto de las células dendríticas con el antígeno tumoral in vitro durante un periodo de tiempo adecuado; la puesta en contacto in vitro de las células dendríticas con por lo menos un estimulante LTR, y opcionalmente también con un anticuerpo anti-CD40, durante un periodo de tiempo adecuado, tal como se ha indicado anteriormente, en el que el medicamento está destinado a reintroducir las células dendríticas activadas en el animal.
Inicialmente, se proporciona una representa de biopsia del tumor para permitir la identificación de uno o más antígenos expresados por el tumor. La representa de biopsia puede cribarse para antígenos tumorales caracterizados conocidos. En el caso de que uno
o más de ellos se identifique, puede utilizarse una proteína o péptido antigénico sintético correspondiente para la puesta en contacto con las células dendríticas. En el caso de que no se identifique ningún antígeno tumoral conocido, se prepara una suspensión de células individuales a partir de la biopsia de tumor y la suspensión celular se convierte en apoptótica mediante un procedimiento conocido, por ejemplo mediante irradiación o la adición de compuestos químicos. La preparación celular apoptótica se utiliza para poner en contacto las células dendríticas del sujeto y para exponer las células a antígenos tumorales.
Se proporciona una representa de células dendríticas a partir del animal portador de tumor, por ejemplo a partir de sangre periférica o médula ósea, tal como se ha indicado anteriormente.
Preferentemente, las células dendríticas se cultivan en presencia de una citoquina, tal como IL-10, para suprimir la maduración y las células se ponen en contacto in vitro con el antígeno tumoral sintético o con la preparación celular apoptótica durante 12 a 24 horas.
El animal portador de tumor puede ser un ser humano.
Las células dendríticas se lavan para eliminar las citoquinas, en el caso de que se utilicen, y se ponen en contacto con por lo menos un estimulante de TLR y opcionalmente un anticuerpo anti-CD40, tal como se ha indicado anteriormente. Las células tratadas se lavaron y, para la reintroducción en el animal portador del tumor, por ejemplo mediante infusión intravenosa o inyección subcutánea, puede resultar necesaria la administración repetida de células para mantener la respuesta inmunológica del animal contra el tumor. Para la inmunoterapia humana, el médico responsable del tratamiento puede determinar las dosis adecuadas de células y la temporización de las administraciones repetidas, de acuerdo con procedimientos convencionales de determinación de dosis adecuadas.
Entre los tumores que pueden tratarse con el medicamento están comprendidos de manera no limitativa, melanomas, carcinomas de células renales, leucemias y linfomas.
El procedimiento de la invención también puede utilizarse para producir modelos animales no humanos de diversas enfermedades autoinmunológicas, y para ayudar a la comprensión del desarrollo de estas enfermedades y proporcionar una herramienta de cribado para la evaluación de compuestos candidatos para su capacidad de detener o interferir en el proceso de la enfermedad, permitiendo la identificación de compuestos farmacéuticos potenciales para el tratamiento de enfermedades.
Para crear dichos modelos animales no humanos, células dendríticas proporcionadas por el animal se estimulan para que se conviertan en reactivos a un autoantígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica mediante el procedimiento indicado en la presente memoria y después se reintroducen en el animal para permitir el desarrollo de la enfermedad.
Para producir un modelo animal no humano de, por ejemplo, enfermedad cardiaca autoinmunológica, se ponen en contacto células dendríticas de un animal con un antígeno específico del corazón, tal como el péptido myhc-a indicado en la presente memoria, y un estimulante de TLR, en el procedimiento de la invención, y después se reintroducen en el animal, tal como se ha indicado en la presente memoria, para producir miocarditis.
De manera similar, pueden producirse modelos animales no humanos de otras enfermedades, tales como asma o artritis. Por ejemplo, pueden utilizarse como antígeno, colágeno u otras proteínas estructurales que forman la matriz del cartílago articular para crear un modelo animal de artritis, proinsulina como antígeno para un modelo de diabetes, péptidos miosina como antígeno para un modelo de miocarditis autoinmunológica, MOG u otros péptidos derivados de mielina para la encefalomielitis autoinmunológica y antígenos de las vías respiratorias extraños para el asma.
Los modelos animales no humanos pueden crearse utilizando una diversidad de mamíferos, incluyendo ratones, ratas y cerdos.
En otra forma de realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para activar células dendríticas para inducir autoinmunidad específica de órgano que puede utilizarse como modelo para estudiar la insuficiencia de un órgano. El procedimiento tal como se ha descrito anteriormente se utiliza con la modificación de que el autoantígeno utilizado para pulsar las células dendríticas es específico de un órgano y tras la reintroducción de las células dendríticas activadas en el animal, resulta en insuficiencia de un órgano. Se utilizó el péptido de cadena pesada de α-miosina murina
11,23
(myhc-α614-629) [Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH](myhc-α) como autoantígeno para inducir cardiomiopatía dilatada y la posterior insuficiencia cardiaca. El sistema modelo puede utilizarse para dilucidar los mecanismos implicados en enfermedades en las que la insuficiencia orgánica presenta un componente autoinmunológico, por ejemplo la diabetes, la artritis, el lupus, etc.
En otra forma de realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para activar células dendríticas y utilizar estas células como ensayo de cribado in vitro de fármacos para identificar compuestos que pueden influir sobre el desarrollo de autoinmunidad específica de órgano. Se utiliza el procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo utilizando un modelo animal de una enfermedad autoinmunológica, y comprende además las etapas que consisten en aplicar compuestos de ensayo a las células dendríticas antes de pulsar con antígeno, durante el pulsado, después del pulsado antes de la activación de TLR, durante la activación de TLR o después de la activación de TLR. Los compuestos aplicados pueden influir sobre el desarrollo o progresión de la autoinmunidad en el órgano diana, inhibiendo o acelerando. Tras la reintroducción de las células dendríticas activadas en el animal de ensayo, se realiza una determinación de si los compuestos aplicados han influido sobre el desarrollo o avance de la autoinmunidad en el animal.
Se ha demostrado que la inoculación de células dendríticas pulsadas con autopéptido específico de músculo cardíaco induce a miocarditis autoinmunológica mediada por células T CD4+. La inflamación cardiaca mediada por células dendríticas avanzó y empeoró convirtiéndose en cardiomiopatía dilatada e insuficiencia cardiaca incluso tras la resolución de los infiltrados inflamatorios agudos. Resulta importante que la autoinmunidad mediada por células dendríticas y la enfermedad cardíaca únicamente se produjeron al activar las células dendríticas mediante receptores de tipo Toll. Además, la patogénesis de la enfermedad dependía de la coestimulación con CD40. De esta manera, la activación concertada de los sistemas inmunológicos innato y adaptativo convierte a las células dendríticas en autoagresivas.
La inmunización con células dendríticas pulsadas con myhc-α resultó en la dilatación de las cámaras cardiacas, contractilidad alterada y causó cambios fibróticos tras la resolución de los infiltrados inflamatorios agudos. Estos datos concuerdan con el hecho de que los corazones explantados o biopsias de pacientes con cardiomiopatía posinfecciosa no necesariamente representan infiltrados inflamatorios, incluso en presencia de autoanticuerpos5. De esta manera, los resultados reflejan la patogénesis de la cardiomiopatía dilatada posinfecciosa en varones. Tras la inmunización con células dendríticas de ratones, se generaron autoanticuerpos contra el epítopo myhc-α, así como contra otros epítopos de miosina. Surge la cuestión de si estos autoanticuerpos contribuyen o incluso median en la insuficiencia cardiaca tras la resolución de los infiltrados inflamatorios agudos. Por ejemplo, los autoanticuerpos contra una proteína de superficie de los cardiomiocitos median en la insuficiencia cardiaca en ratones BALB/c que no presentan el receptor de PD-1 de inmunorregulación negativa31 . Alternativamente, la disfunción cardiaca podría reflejar la incapacidad del corazón de adaptarse a la destrucción de tejido que resulta en el remodelado patológico y fibrosis.
Las infecciones y la inflamación se consideran en la actualidad importantes factores de riesgo de enfermedad cardiovascular1, la causa principal de muerte en las sociedades occidentales. Estos resultados indican que la presentación de autoantígeno conjuntamente con la estimulación de los TLR sobre las células dendríticas resulta suficiente para desencadenar una enfermedad cardiaca autoinmunológica, lo que podría explicar la disfunción cardiaca en pacientes con sepsis32 y la asociación clínica entre un peor prognóstico tras el infarto de miocardio y la magnitud de la respuesta inflamatoria
1,2,3,4
sistémica. Además, se han propuesto mecanismos autoinmunológicos en la insuficiencia cardiaca tras la infección por el protozoo Trypanozoma cruzii9. El sistema experimental de la presente memoria establece un nuevo modelo de enfermedad in vivo para estudiar la fisiopatología de la insuficiencia cardiaca posinflamatoria y para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento. Resulta importante que los datos en el contexto de la presente invención proporcionen una conexión causal directa entre enfermedad cardiaca autoinmunológica y el desarrollo de cardiomiopatía dilatada e insuficiencia cardiaca.
Las enfermedades autoinmunológicas afectan hasta a 10% de la población en general. Además, se ha implicado la susceptibilidad genética, desencadenantes ambientales y agentes infecciosos en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunológicas7,33. Sin embargo, en la mayoría de enfermedades autoinmunológicas, los agentes infecciosos causativos no han sido identificados y se desconoce cómo diferentes patógenos pueden romper la inmunotolerancia y desencadenar autoinmunidad específica de tejido.
Estos resultados indican que la activación de los TLR resulta esencial para inducir una enfermedad cardiaca autoinmunológica específica de tejido y proporcionan un marco molecular para la patogénesis de la autoinmunidad. En el contexto del daño cardíaco y las infecciones microbianas, las células dendríticas pulsadas con autopéptidos podrían ser estimuladas por ARN vírico que actuase a través del TLR3, mientras que las bacterias podrían inducir los TLR2, 4 y 9 a través de productos de la pared celular, tales como peptidoglicanos, LPS o ADN no metilado21 . Además, los productos del protozoo cardiotrópico T. cruzii se ha demostrado recientemente que activan TLR2 sobre células dendríticas34 . De esta manera, la autoinmunidad no requiere necesariamente el mimetismo antigénico entre antígenos microbianos y autoproteínas33. Por el contrario, el daño a los tejidos concertadamente con la activación del sistema inmunológico innato aparentemente desencadena la autoinmunidad en individuos genéticamente susceptibles (figura 7a). En contraste, la incorporación de autoantígeno liberado bajo condiciones de equilibrio estable o en presencia de únicamente estimulación mínima de células dendríticas podría resultar en tolerancia y en la regulación negativa de las células T
17,18,19
autorreactivas.
La autoinmunidad en el ser humano y en modelos animales experimentales con frecuencia representa un patrón de enfermedad recidivante 7,33. Por ejemplo, los pacientes con cardiomiopatía dilatada con frecuencia representan un rápido empeoramiento de sus funciones cardiacas tras la infección por cualquier causa 4. Inesperadamente, la activación in vivo de los TLR en ratones tras la resolución de la miocarditis inducida por myhc-α resulta en una recaída de los infiltrados cardiacos y en un rápido empeoramiento de las funciones cardiacas (U. Eriksson y Josef M. Penninger, no publicado). Por lo tanto, la estimulación in vivo no específica del sistema inmunológico innato puede inducir rápidamente inflamación específica de tejido en animales previamente expuestos. Por lo tanto, se propone que las exacerbaciones y recaídas de enfermedades autoinmunológicas podrían ocurrir en seres humanos genéticamente susceptibles que experimentan una estimulación no específica de los TLR in vivo.
Estos resultados demuestran que las células dendríticas pueden inducir autoinmunidad específica de órgano de aparición rápida en ratones no expuestos en respuesta a un antígeno endógeno. El modelo propuesto de miocarditis inducida por células dendríticas proporciona un nuevo paradigma experimental de autoinmunidad inducida e insuficiencia cardiaca. La capacidad de las células dendríticas pulsadas con autoantígeno de inducir autoinmunidad masiva debe extenderse a otros sistemas, tales como el asma o la artritis. La utilización del sistema modelo ayudará en el diseño y desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para enfermedades autoinmunológicas que actúan selectivamente sobre las células dendríticas y optimizan los protocolos de vacunación del cáncer basados en células dendríticas específicas de tejido. Debido a que tanto la autoinmunidad mediada por células dendríticas como la enfermedad cardiaca únicamente se producen al activarse las células dendríticas a través de receptores de tipo Toll, estos resultados proporcionan una teoría unificadora sobre cómo el daño a los tejidos y múltiples inductores infecciosos pueden inducir enfermedades autoinmunológicas y cardiomiopatía crónica.
Los ejemplos se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.
Los procedimientos de química, biología molecular, bioquímica de proteínas y péptidos y de inmunología a los que se hace referencia pero que no se describen explícitamente en la presente exposición y en los ejemplos, se encuentran publicados en la literatura científica y son bien conocidos para el experto en la materia.
Para el análisis estadístico, se analizaron datos dicotómicos mediante la prueba exacta de Fisher. Se utilizó la prueba de U de Mann-Whitney para la evaluación de las puntuaciones de gravedad. Se compararon las respuestas de proliferación y los niveles de citoquinas utilizando ANOVA y pruebas t.
EJEMPLO 1. Las células dendríticas activadas y pulsadas con autoantígenos inducen miocarditis
Para determinar si las DC pulsadas con autoproteínas pueden inducir autoinmunidad frente a antígenos endógenos, se utilizó para inocular ratones el péptido alfa-miosina específico del músculo cardiaco anteriormente identificado, residuos 614 a
11,23
629(myhc-α). Todos los ratones utilizados eran ratones de tipo salvaje, ratones SCID sin células B y T, o ratones IL4Rα-/-, y todos presentaban un fondo de BALB/c y se obtuvieron de Jackson Laboratories. Los ratones se mantuvieron bajo condiciones específicas libres de patógenos. Las células dendríticas derivadas de médula ósea se generaron tal como describen Lutz et al.40. El análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS) demostró que más de 80% de las células dendríticas eran CD11c+CD11b+, que se enriquecieron adicionalmente mediante selección positiva de CD11c+ utilizando perlas magnéticas (MACSTM, Miltenyi Biotech). Tras el pulsado durante la noche con 10 µg/ml del péptido de cadena pesada de la α-miosina (myhc-α614-629 [Ac
11,23
SLKLMATLFSTYASAD-OH], las células dendríticas se activaron durante 4 horas con un estímulo de TLR que incluía 1 µg/ml de LPS (E. coli 0111:B4, Sigma), 100 µg/ml de poli(I:C) (Amersham), CpG-ODN 10 µM o 10 µg/ml de PGN (S. aureus, Fluka) con o sin 5 µg/ml de anticuerpo anti-CD40 (clon 3/23, Pharmingen), o 1 µg/ml de RANK-L (R&D Biosystems). Para algunos experimentos, se estimularon células dendríticas con 500 U/ml de TNF-α o 10 ng/ml de IL-1β (ambos de PreproTech) en presencia o en ausencia de anticuerpo anti-CD40.
Se inyectaron en ratones BALB/c (haplotipo H2d) células dendríticas derivadas de
+ + +++
médula ósea de MHC de clase IICD11cCD11bCD80CD86CD8 -pulsadas con myhcα activadas con el LPS inducido por TLR y/o un anticuerpo anti-CD40 estimulante. Se inyectaron por vía i.p. en los ratones 50.000 a 200.000 células dendríticas/ratón. Los ratones de control recibieron células dendríticas activadas pulsadas con péptido ova (OVA). Se sacrificaron los ratones y se extirparon los corazones en diferentes puntos temporales tras la primera inoculación de DC. Se puntuó la miocarditis en grados de 0 a 4, en los que 0 indica la ausencia de infiltrados inflamatorios, 1 significa pequeños focos de células inflamatorias entre miocitos, 2 significa focos de más de 100 células inflamatorias, 3 significa que más de 10% de una sección transversal se encuentra implicada, y 4
significa que se encuentra implicada más de 30% de una sección transversal.
Las secciones de corazón procedentes de ratones 10 días después de la inoculación de células dendríticas activadas con LPS/anti-CD40 pulsadas con myhc-α o con péptido OVA se representan en la figura 1. Los corazones de control, que mostraban una ausencia de inflamación en ratones inmunizados con células dendríticas pulsadas con OVA, se representan en las figuras 1a y 1c. En las figuras 1b y 1d, la presencia de inflamación masiva tras la inoculación de células dendríticas pulsadas con myhc-α se indica mediante una flecha. Se representan imágenes representativas de corazones completos y ampliaciones más grandes (x140) (tinción de H&E). Para la inmunohistoquímica de secciones congeladas de corazón se utilizaron los anticuerpos siguientes: anti-MHC II (biotinilado, Serotec, MCA46B), anti-CD3 (KT3-1.1), anti-CD4 (YTS 191), anti-CD8 (YTS 169) y anti-CD11c (2,5 mg/ml, clon HL3, Pharmingen). Las figuras 1e y 1f representan secciones transversales teñidas inmunohistoquímicamente, que ilustran que los infiltrados estaban constituidos por un número reducido de células CD8+ (1e, flecha) y un número elevado de células CD4+ (1f, flecha). Ampliaciones originales x560.
Ni la inoculación de las células dendríticas activadas pulsadas con un péptido OVA no específico ni la inoculación de células dendríticas no activadas pulsadas con myhc-α indujeron inflamación del corazón (figura 1a,c, Tabla 1). La activación de las células dendríticas con anticuerpo anti-CD40 solo tampoco resultó efectivo en la inducción de miocarditis. Además, la inoculación de células dendríticas pulsadas con myhc-α activadas con LPS y anti-CD40 durante 24 horas utilizando protocolos de maduración previamente
13,14
establecidosno resultó en inflamación cardiaca (datos no representados).
El pulsado de las células dendríticas con myhc-α seguido de una activación in vitro muy corta con anti-CD40 y LPS durante 4 horas convirtió a las células dendríticas en reactivas. La inoculación de estas células dendríticas indujo una miocarditis masiva en ratones Balb/c (figura 1b,d, Tabla 1). La aparición de la enfermedad fue muy rápida, iniciándose 5 días después de la inmunización con células dendríticas y alcanzando un máximo el día 10. Cabe indicar que incluso una sola inoculación de células dendríticas pulsadas con myhc-α indujo enfermedad, aunque a una prevalencia menor en comparación con inoculaciones repetidas. Además, las células dendríticas pulsadas con myhc-α activadas con LPS solo durante 4 horas también indujeron una inflamación cardiaca moderada a una prevalencia inferior (Tabla 1). Estos resultados proporcionan la primera evidencia experimental de que las células dendríticas pueden inducir una inflamación específica de órgano de aparición rápida en ratones no expuestos en respuesta a un antígeno endógeno.
Tabla 1. Las células dendríticas pulsadas con myhc-α inducen enfermedad cardiaca autoinmunológica
- Receptor
- Antígeno Activación [in vitro] Inoculación de células dendríticas (día) Prevalencia (día 10) Grado de gravedad el día 10 [mediana (datos individuales)]
- Tipo salvaje
- myhc-α LPS/α-CD40 0,2,4 10/10*† 3(1,2,2,3,3,3,3,4,4,4)
- Tipo salvaje
- myhc-α No 0,2,4 0/5† 0
- Tipo salvaje
- OVA LPS/α-CD40 0,2,4 0/8* 0
- Tipo salvaje
- myhc-α LPS/α-CD40 0 3/6 3(0,0,0,3,3,3)
- Tipo salvaje
- OVA LPS/α-CD40 0 0/5 0
- Tipo salvaje
- myhc-α LPS 0,2,4 4/7 1(0,0,0,1,1,2,2)‡
- Tipo salvaje
- myhc-α α-CD40 0,2,4 0/5† 0
- Tipo salvaje
- myhc-α LPS/RANK-L 0,2,4 2/5 0(0,0,0,1,2)
5 *P<0,0001, †P<0,0005 (prueba exacta de Fisher), ‡P<0,0028 (prueba de U de Mann-Whitney)
EJEMPLO 2. La inmunización con células dendríticas induce autoinmunidad
10 Para determinar si las células dendríticas inducían miocarditis y satisfacían los criterios de autoinmunidad, en primer lugar resultó necesario determinar la presencia de autoantígenos definidos. Se purificaron células T CD4+ a partir de bazos de ratones inmunizados con células dendríticas activadas por LPS/anticuerpo anti-CD40 y pulsadas con myhc-α utilizando perlas magnéticas (kit de aislamiento de células T CD4+, Miltenyi
15 Biotech GmbH). Las células T CD4+ se cultivaron durante 40 horas con esplenocitos singénicos irradiados (2.000 rad) y 10 µg/ml de myhc-α u ovoalbúmina en medio AIM-V sin suero (Gibco). Se midieron los niveles de citoquinas utilizando kits ELISA Quantikine disponibles comercialmente (R&D Biosystems, Minneapolis, EEUU). Alternativamente, se evaluó la proliferación mediante la medición de la incorporación de [3H]metil-timidina tras
20 el cultivo durante 72 horas. Para las mediciones de citoquina, las células dendríticas se sembraron en placas de 24 pocillos a una concentración de 1x106/ml y se incubaron durante 12 horas con diversos estímulos de TLR, incluyendo 1 µg/ml de LPS, 100 µg/ml de poli(I:C), CpG-ODN 10 µM ó 10 µg/ml de PGN con o sin 5 µg/ml de anti-CD40. Se midieron los niveles de citoquinas utilizando kits ELISA Quantikine (R&D Biosystems,
25 Minneapolis). Para el análisis de FACS, las preparaciones de células dendríticas se preincubaron durante 30 minutos a 4ºC con Fc-block (Pharmingen) y suero de rata al 1% en tampón de tinción de Pharmingen antes de la tinción con los anticuerpos marcados con fluorocromo apropiados de Pharmingen.
30 Se midieron los niveles de IFN-γ y de IL-4 tras 40 horas y se representan los datos en la figura 2a. Los valores indican medias (±S.D.) de 5 ratones individuales en los que **p<0,005 para IL-4 y *p<0,0001 (ANOVA y prueba t no apareada) para la producción de IFN-γ de células T CD4+ aisladas a partir de ratones en los que se habían inyectado células dendríticas pulsadas con myhc-α en comparación con ratones en los que se
35 habían inyectado células dendríticas pulsadas con OVA (n.d.=no detectable).
La miocarditis inducida por células dendríticas era específica de antígeno debido a que las células dendríticas pulsadas con antígenos no relevantes no indujeron ninguna enfermedad (Tabla 1). Además, no se observaron infiltrados en otros órganos, tales como músculo esquelético, pulmones o riñones (no representado), indicando que la inflamación inducida por las células dendríticas era específica de órgano y que no se limitaba al corazón. La inmunohistoquímica reveló que la mayoría de las células T que infiltraban el corazón de los animales enfermos eran CD4+ y que únicamente unas cuantas células eran positivas para CD8+ (figura 1e,f). La reestimulación in vitro de las células T CD4+ purificadas a partir de ratones en los que se había inyectado DC con myhc-α resultó en la proliferación (no mostrada) y en la producción de IFN-γ y de IL-4 (figura 2a). En contraste, las células T CD4+ reestimuladas con péptido OVA no específico no proliferaron y no produjeron IL-4 y sólo cantidades reducidas de IFN-γ. Estos datos representan que las células dendríticas ceban inmunológicamente las células T CD4+ específicas de myhc-α in vivo.
Para determinar si la miocarditis inducida por células dendríticas satisfacía los criterios de autoinmunidad, resultó necesario determinar si se encontraban presentes los autoanticuerpos que podía transferir enfermedades. Se evaluaron las respuestas de anticuerpos contra los péptidos myhc-α y kk específicos del corazón mediante ELISA tal como se ha descrito11, utilizando anticuerpos IgG antirratón de cabra marcados con HRP (Southern Biotechnology Associates). Los títulos se determinaron a la DO405 nm a la mitad del máximo. Se detectaron los autoanticuerpos IgG anti-myhc-α y anti-kk 10 días después de la inoculación de células dendríticas activadas pulsadas con myhc-α, pero no después de células dendríticas pulsadas con OVA. Se representan los títulos de ratones individuales en la figura 2b.
La miocarditis inducida por células dendríticas se vio acompañada de una fuerte respuesta de autoanticuerpos IgG contra el péptido myhc-α específico del corazón (figura 2b). También se detectaron autoanticuerpos contra un péptido específico del corazón denominado kk25 que era independiente del péptido myhc-α inmunizador (figura 2b), confirmando que las células dendríticas podían inducir inflamación cardiaca y que este suceso presenta además la generación de autoanticuerpos contra los péptidos cardíacos endógenos. Resulta importante que la reestimulación in vitro y la transferencia de células T CD4+ cebadas con myhc-α, pero no con OVA, en ratones SCID inmunodeficientes singénicos resultó en miocarditis de los animales huésped (figura 2c). En contraste, la transferencia de células T CD8+ no indujo enfermedad (no representado). Además, la
-/--/
inoculación de ratones IFN-γRe IL-4Rαcon células dendríticas de tipo salvaje pulsadas con myhc-α resultó en fuerte miocarditis en ambas cepas (Tabla 1). De esta manera, la inducción de enfermedad por parte de las células dendríticas aparentemente es independiente de la polarización Th1/Th2. De esta manera, este modelo de miocarditis inducida por células dendríticas satisface todos los criterios de las enfermedades autoinmunológicas mediadas por células T CD4+ y proporciona un nuevo paradigma experimental para inducir autoinmunidad.
Se aislaron las células T CD4+ y CD8+ a partir de bazos de ratones inmunizados con células dendríticas activadas y pulsadas con myhc-α utilizando perlas magnéticas (MACSTM, Miltenyi Biotech). Tras 48 horas de cultivo de DC singénicas irradiadas (1.500 Rad) y pulsadas con myhc-α en presencia de 5 µg/ml de mAb anti-CD28 (Pharmingen), se
7+ +
transfirieron 1x10células T CD4por cada ratón (>98% de células CD4) i.p. a ratones SCID (BALB/c). Todos los receptores se sacrificaron 10 días después. No se apreció miocarditis en los ratones SCID (n=5) tras la transferencia de células T CD4+ aisladas de ratones inmunizados con células dendríticas pulsadas con OVA. Prueba exacta de Fisher, p<0,05.
EJEMPLO 3. La inmunización con células dendríticas activadas y pulsadas con myhc-α resulta en disfunción contráctil y cardiomiopatía dilatada
Todavía no se ha establecido una conexión causal entre la cardiomiopatía dilatada y la miocarditis autoinmunológica posinfecciosa. En el modelo de ratón de la presente invención, la inflamación alcanzó un máximo 5 a 10 días después de la inoculación de células dendríticas e inició su resolución aproximadamente el día 12 después de la última inoculación de células dendríticas (resultados no representados). Resultó importante determinar si la miocarditis inducida por células dendríticas progresaría a cardiomiopatía tras la resolución de los infiltrados inflamatorios.
Se llevaron a cabo evaluaciones ecocardiográficas tal como se ha descrito41 . Se examinaron ratones anestesiados con isoflurano mediante ecocardiografía transtorácica utilizando una sonda de 12 MHz (Hewlett Packard). Se registraron la velocidad de eyección, las dimensiones del ventrículo izquierdo después de la sístole (LVESD) y después de la diástole (LVEDD) y se calculó el porcentaje de acortamiento fraccional (FS) según la fórmula siguiente: FS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD. Se calculó la VCFC como FS/tiempo de eyección corregido para la tasa cardíaca.
La figura 3a representa las proporciones de pesos de corazón/cuerpo (mg/g) y los datos ecocardiográficos de corazones de ratones que habían recibido inyecciones de células dendríticas activadas y pulsadas con myhc-α en comparación con controles que habían recibido inyecciones de células dendríticas pulsadas con OVA 4 semanas después de la inmunización. Valores promedio ±S.D. Las proporciones de pesos de corazón/cuerpo fueron de n=8 por grupo y *p<0,005. La figura 3b representa los diámetros incrementados del ventrículo izquierdo al final de la diástole (LVEDD) en ratones que recibieron inyecciones de células dendríticas pulsadas con myhc-α con n=8 por grupo y **p<0,05. La figura 3c representa ecocardiogramas representativos de un ratón inmunizado con células dendríticas pulsadas con myhc-α y un animal de control inmunizado con células dendríticas pulsadas con OVA. Las flechas indican la distancia entre la contracción sistólica (LVESD) y la relajación diastólica (LVEDD). Se observa un agrandamiento masivo de las dimensiones cardiacas en el animal inmunizado con células dendríticas myhc-α, indicativo de cardiomiopatía dilatada. La figura 3d representa una reducción de la velocidad de acortamiento circunferencial de fibras (VCFC) (n=5, **p<0,05), mientras que la figura 3e representa una reducción del acortamiento fraccional (% de FS) (n=8, *p<0,005) en ratones inmunizados con células dendríticas pulsadas con myhc-α a modo de lecturas funcionales de la alteración de la contractilidad.
En contraste con los animales de control que habían recibido inyecciones de células dendríticas pulsadas con OVA, las proporciones de pesos de corazón/cuerpo se incrementaron progresivamente en los ratones que habían recibido inyecciones de células dendríticas pulsadas con myhc-α (figura 3a). Estos corazones agrandados no presentaban infiltrados inflamatorios pero mostraban fibrosis intersticial (no representada), que con frecuencia aparece en la insuficiencia cardiaca. Inesperadamente, la ecocardiografía de ratones 4 semanas después de la inmunización con células dendríticas mostró dimensiones incrementadas del ventrículo izquierdo al final de la diástole (LVEDD) y al final de la sístole (LVESD), indicativas de cardiomiopatía dilatada (figura 3b,c). Además, los ratones inmunizados con células dendríticas pulsadas con myhc-α desarrollaron una disfunción cardiaca severa según se determinó a partir de las alteraciones de la velocidad de acortamiento circunferencial de fibras (VCFC) (figura 3d) y la reducción del acortamiento fraccional (FS) (figura 3e). De esta manera, la inmunización con células dendríticas pulsadas con myhc-α resulta en cambios fibróticos, dilatación de las cámaras cardiacas y alteraciones de la contractilidad. Estos datos proporcionan una conexión causal directa entre enfermedad cardiaca autoinmunológica y el desarrollo de cardiomiopatía dilatada y la insuficiencia cardiaca.
EJEMPLO 4. Papel de CD40 en la autoinmunidad mediada por células dendríticas.
La activación de las células dendríticas mediante interacciones de ligando-receptor
26,2728 29
CD154-CD40, 4-1BB-4-1BB-Lo RANK-RANK-Lresulta crítica para la maduración de las células dendríticas y para la expresión de moléculas coestimulanteas y la producción de citoquinas. Resultó necesario determinar cuál de entre dichas interacciones moleculares se encontraba implicada en la capacidad de las células dendríticas inyectadas de iniciar una respuesta "autoagresiva".
Para el bloqueo in vivo de CD40-CD40L, se inyectaron 200 µg del anticuerpo bloqueante anti-CD40L (MR-1)30 en ratones. Se bloquearon las interacciones 4-1BBL-41BB utilizando el anticuerpo monoclonal TKS-1 [200 µg] tal como ha sido descrito28. Los controles recibieron un anticuerpo de isotipo no específico (Pharmingen). Las interacciones RANK-RANKL se bloquearon in vivo utilizando una proteína de fusión de OPG humana a razón de 250 µg/ratón39. Todos los agentes bloqueantes se inyectaron i.p. a razón de 200 µl de PBS/ratón cada dos días.
La adición de RANK-L recombinante a cultivos de células dendríticas pulsadas con myhc-α durante la activación con LPS no incrementó la susceptibilidad a miocarditis más allá de la observada con LPS solo (Tabla 1). Además, el bloqueo in vivo de las interacciones RANK-RANK-L por el receptor señuelo OPG aparentemente no presentó ningún efecto sobre la gravedad o incidencia de enfermedades mediadas por células dendríticas (Tabla 2 y datos no representados). De manera similar a RANKL-RANK, la inhibición de 4-1BB en cultivos celulares dendríticos in vitro (no representado) o in vivo utilizando el anticuerpo bloqueador de TSK-128 (no representados) no presentó ninguna influencia evidente sobre la incidencia de la enfermedad o la gravedad de la misma.
En contraste, la coestimulación in vitro de células dendríticas myhc-α con LPS y un anticuerpo anti-CD40 estimulante incrementó de manera manifiesta la inflamación cardiaca inducida por células dendríticas (Tabla 1). Dado que las células dendríticas activadas interactúan in vivo con las células T que expresan CD40L, se trataron los ratones inoculados con células dendríticas con un anticuerpo bloqueante de CD40L30. El bloqueo in vivo de las interacciones CD40-CD40L evitó prácticamente por completo la enfermedad (Tabla 2). El papel de la coestimulación de CD40 a continuación se confirmó genéticamente a partir del hecho de que las células dendríticas CD40-/-pulsadas con myhc-α no inducían miocarditis en ratones CD40+/+ (Tabla 2, figura 4a,d). Las figuras 4a y 4d indican la ausencia de inflamación cardiaca en tejido cardiaco tras la inoculación de
células dendríticas CD40-/-en ratones receptores de tipo salvaje. Resulta importante que la
+/+ -/
inoculación de células dendríticas CD40en ratones CD40(figura 4b,e) desencadenó la inflamación cardiaca en un grado similar al observado en receptores de tipo salvaje (figura 4c,f y Tabla 2). Las figuras 4b y 4e indican inflamación cardiaca (flechas) tras la 5 inoculación de células dendríticas de tipo salvaje en receptores CD40-/-. Las figuras 4c y 4f indican infiltrados inflamatorios en ambos ventrículos (flechas) tras la inoculación de células dendríticas de tipo salvaje en receptores de tipo salvaje. Se representan imágenes representativas del corazón completo y ampliaciones mayores (x140). Tinción H&E. Los datos proceden de ratones 10 días después de la inoculación de células dendríticas
10 pulsadas con myhc-α/tratadas con anti-CD40.
Tabla 2. Necesidad selectiva de CD40 en la inflamación cardiaca mediada por células dendríticas
- Activación [in vitro]
- Receptores Genotipo de las células dendríticas Tratamiento (in vivo) Prevalencia (día 10) Grado de gravedad el día 10 [mediana(datos individuales)]
- LPS/α-CD40
- Tipo salvaje Tipo salvaje Tratamiento simulado 7/7* 3(2,2,3,3,3,4,4)
- LPS/α-CD40
- Tipo salvaje Tipo salvaje OPG-Fc 7/7 3(1,2,3,3,4,4,4)
- LPS/α-CD40
- Tipo salvaje Tipo salvaje Anti-CD40L 3/8* 0(0,0,0,0,0,1,1,1,2)
- LPS/α-CD40
- Tipo salvaje CD40-/ Ninguno 1/7† 0(0,0,0,0,0,0,1)
- LPS/α-CD40
- CD40-/ Tipo salvaje Ninguno 5/5† 3(2,2,3,3,4)
15 *P<0,0256, †P<0,0152 (prueba exacta de Fisher)
EJEMPLO 5. La estimulación con TLR convierte a las células dendríticas en 20 autoagresivas
Aunque no se descubrió que la estimulación con CD40 resultase importante para el
desarrollo de la enfermedad cardiaca autoinmunológico, la inflamación cardíaca sólo pudo
iniciarse al coactivar las células dendríticas con LPS que estimulaba el receptor 4 de tipo
25 Toll (TLR 4). Además, las células dendríticas pulsadas con myhc-α activadas con LPS solo podían inducir una inflamación cardiaca moderada a prevalencia reducida (Tabla 1). Se han implicado diversas clases de patógenos en la patogénesis de la autoinmunidad y diferentes desencadenantes infecciosos pueden activar el sistema inmunológico innato mediante diferentes TLR21. Por lo tanto, se examinó si este efecto era específico de LPS o
30 si la activación de otros TLR también resultaba suficiente para inducir la autoinmunidad mediada por células dendríticas.
La estimulación con LPS (TLR 4) o peptidoglicano (que estimula los TLR 1, TLR 2 y TLR 6) o con ARNds (que estimula el TLR 3) o CpG (que estimulan el TLR 9)21 de las 35 células dendríticas pulsadas con myhc-α resultó en miocarditis severa (figura 5a-e). Se representan secciones de corazón de ratones 10 días después de la inoculación de células dendríticas pulsadas con myhc-α en las figuras 5a a 5d (magnificación x560) activadas con: LPS/anti-CD40 (figura 5a), ARNds/anti-CD40 (figura 5b), CpG/anti-CD40 (figura 5c), y PGN/anti-CD40 (figura 5d). La prevalencia de la enfermedad y la gravedad 40 de la inflamación en ratones individuales se representan en la figura 5, panel inferior. Se
representan imágenes representativas del corazón (tinción H&E).
Los infiltrados inflamatorios estaban constituidos por células mononuclares, principalmente macrófagos y células T CD4+, granulocitos y algunos eosinófilos. En todos los TLR sometidos a ensayo, la inducción de enfermedad dependía de las células T CD4+ según experimentos de transferencia adoptiva (no representados). De esta manera, los TLR pueden proporcionar una señal común para convertir las células dendríticas en "autoagresivas". Estos resultados demuestran que deben coincidir tres sucesos moleculares para que se produzca la miocarditis autoinmunológica mediada por células dendríticas: la incorporación de autoproteína en un fondo genéticamente susceptible, la coestimulación específica del sistema inmunológico del huésped mediante CD40, y más importante, la activación de los TLR. Inesperadamente, la estimulación de todos los TLR sometidos a ensayo en células dendríticas resultó suficiente para iniciar una respuesta autoagresiva.
EJEMPLO 6. CD40 y TLR cooperan en la producción de IL-1β y de IL-12 por parte de células dendríticas
Las figuras 6a y 6b representan la expresión de moléculas coestimulanteas en
+/+ -/
células dendríticas CD40(6a) y CD40(6b) tras la estimulación con LPS/anti-CD40 durante 12 horas. Las ventanas de los histogramas de FACS fueron células vivas CD11c+
++ ++
CD11bMHC de clase II(ICAM, B7.1, B7.2) o células vivas CD11cCD11b. El efecto inductor de enfermedad de la coestimulación con CD40 aparentemente no se debe a la expresión incrementada de moléculas coestimulanteas.
Tal como se representa en la figura 6c, la regulación positiva de los marcadores de activación, tales como las moléculas del MHC de clase II, CD80, CD86 e ICAM-1, no era
+/+ -/
diferente tas la estimulación de las células dendríticas CD40o CD40con anti-CD40 más LPS. Además, no se produjeron diferencias observables en la producción de TNF-α o de IL-6 tras la estimulación de las células dendríticas de tipo salvaje con diversos estímulos de TLR en ausencia o en presencia de la activación con CD40 (figura 6c). La figura 6c representa los niveles de producción de citoquinas en células dendríticas que fueron estimuladas durante 12 horas con los estimulantes de TLR indicados (1 µg/ml de LPS, 100 µg/ml de poli(I:C), CpG-ODN 10 µM, o 10 µg/ml de PGN) en ausencia o en presencia del anticuerpo anti-CD40 estimulante (5 µg/ml). Los datos se expresan como medias (±S.D.) de pocillos de cultivo por cuadruplicado y representan uno de entre varios experimentos con datos similares.
En contraste, los niveles de IL-1β y de IL-12p70 eran significativamente diferentes en células dendríticas estimuladas con CD40 o con TLR únicamente, y las activadas con estímulos de TLR más anti-CD40, tal como se representa en la figura 6c. Estas diferencias no se debían a variaciones de la apoptosis de las células dendríticas hasta las 24 horas de cultivo in vitro (no representado). De esta manera, la estimulación con CD40 y con TLR coopera en la inducción de las citoquinas IL-1β e IL-12p70 en las células dendríticas.
Para examinar si IL-1β e IL-12p70 resultaban de importancia para la enfermedad cardiaca inflamatoria mediada por células dendríticas, se inmunizaron ratones mutantes para los receptores IL-1R1 e IL-12β1 con células dendríticas pulsadas con péptido y
5
10
15
20
25
30
35
40
-20
activadas con anti-CD40 y TLR. En todos los casos se descubrió que resultaba necesaria la señalización tanto a través del sistema del receptor tipo 1 de IL-1 como a través del sistema IL12-IL12R para inducir la autoinmunidad (Tabla 3). Sin embargo, la inoculación de células dendríticas de tipo salvaje inducía miocarditis y células T CD4+ autoagresivas
-/--/
en ratones IL-1R1, pero no en ratones IL-12Rβ1. Por el contrario, los receptores de tipo salvaje inducían miocarditis tras la inoculación de células dendríticas IL-12Rβ1-/-, pero no tras la inoculación de células dendríticas IL-1R1-/-(Tabla 3). De esta manera, la inducción de miocarditis mediada por células T CD4+ requiere la señalización de IL-1R1 en células dendríticas pero no en células T CD4+. En contraste, la señalización de IL-12 en células dendríticas activadas y pulsadas con antígeno no resulta esencial para la capacidad de estas células de inducir autoinmunidad. Por el contrario, la señalización de receptor de IL12 resulta crítica en células T efectoras CD4+ debido a que la transferencia adoptiva de
-/--/
células T IL-12Rβ1reestimuladas que se han aislado a partir de ratones IL-12Rβ1
+/+
inmunizados con células dendríticas IL-12Rβ1no induce enfermedad en ratones SCID singénicos (no representado). El nuevo sistema experimental de la presente invención hace posible por primera vez distinguir selectivamente las funciones esenciales de las citoquinas y/o de las moléculas coestimulanteas en células dendríticas frente a células efectoras en un modelo de enfermedad autoinmunológica in vivo.
Tabla 3. Papel de la señalización de IL-12 y de IL-1 en la enfermedad cardiaca inducida por células dendríticas
- Receptores
- Genotipo de las células dendríticas Inoculaciones de células dendríticas Prevalencia (día 10) Grado de gravedad el día 10 [mediana (datos individuales)]
- Tipo salvaje
- Tipo salvaje
- Días 0,2,4 6/6* 2(2,2,2,2,3,3)
- IL-12Rβ1-/
- Tipo salvaje Días 0,2,4 1/8*† 0(0,0,0,0,0,0,0,1)
- Tipo salvaje
- IL-12Rβ1-/ Días 0,2,4 6/8† 2(0,0,2,2,2,3,2,3)
- IL-1R1-/
- Tipo salvaje Días 0,2,4 5/5‡ 2(1,2,2,3,2)
- Tipo salvaje
- IL-1R1-/ Días 0,2,4 0/5‡ 0
*P<0,005, †P<0,05, ‡P<0,01 (prueba exacta de Fisher)
EJEMPLO 7. La lesión de tejidos conjuntamente con la activación del sistema inmunológico innato resultan suficientes para inducir la inflamación cardiaca in vivo
Aparte de la susceptibilidad genética, se han implicado inductores ambientales e infecciosos en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunológicas en modelos animales y humanos7,33. Sin embargo, todavía no se ha identificado con seguridad ninguno de dichos inductores infecciosos, y los mecanismos por los que diferentes patógenos podrían inducir autoinmunidad no han sido clarificados todavía. Los resultados proporcionados anteriormente indican que la estimulación de DC pulsadas con autoantígeno mediante CD40 y TLR convierten a dichas células presentadoras de antígeno en autoagresivas. Debido a que la activación de todos los TLR sometidos a ensayo resultó suficiente para el desarrollo de una enfermedad cardiaca autoinmunológica inducida por células dendríticas, y sin vincularse a ninguna teoría en particular, se planteó la hipótesis de que la lesión de los tejidos conjuntamente con un inductor inflamatorio no específico resultaría en la autoinmunidad in vivo. En el modelo propuesto de patogénesis autoinmunológico ilustrado esquemáticamente en la figura 7a, la lesión de los tejidos libera autoantígenos que resultan capturados y presentados por las células dendríticas. En el caso de la activación de un receptor de tipo Toll, surge una respuesta de células T autorreactivas que resulta amplificada por las interacciones CD40-CD40L.
Con el fin de someter a ensayo dicha hipótesis, se inyectaron en ratones diversos números de cardiomiocitos apoptóticos purificados a partir de ratones adultos conjuntamente con/sin 100 µg/ratón de anti-CD40 y 10 µg de LPS/ratón en tres días consecutivos. Se indujo la apoptosis de los cardiomiocitos mediante irradiación con UVA (10 J/m2) o mediante la adición de 10 µmoles/l de H2O2 en pocillos de cultivo.
A continuación, los cardiomiocitos apoptóticos se inyectaron en ratones Balb/c singénicos, seguido de la estimulación in vivo de los TLR. La inoculación de 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (i.p.) por sí mismos sin LPS no resultó en ninguna enfermedad (0 de 6 ratones), tal como se representa en la figura 7b. Sin embargo, la inoculación i.p. de únicamente 2x106 cardiomiocitos apoptóticos seguido de la activación in vivo de TLR 4 con LPS resultó en focos inflamatorios en los corazones, tal como se representa en la figura 7c. La inoculación de 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (i.p.) conjuntamente con LPS (10 µg i.p. los días 0, 1 y 2) resultó en inflamación cardiaca (flechas en la figura 7c) en 7 de 8 ratones. Cabe indicar que la inoculación de LPS solo no indujo inflamación cardiaca (0 de 5 ratones; no representado) a p<0,0001 para LPS y cardiomiocitos en comparación con únicamente cardiomiocitos (prueba exacta de Fisher). Además, la inoculación i.p. de cardiomiocitos tanto irradiados con U.V como tratados con H2O2 seguido de la activación in vivo de TLR 4 con LPS resultó suficiente para inducir la inflamación cardiaca. Resulta importante que esta inflamación cardiaca presentó además la generación de autoanticuerpos IgG contra el péptido myhc-α específico cardiaco, tal como se representa en la figura 7d. La figura 7d representa los títulos de autoanticuerpo IgG anti-myhc-α 10 días después de la inoculación i.p. de LPS y 2x106 cardiomiocitos apoptóticos (LPS). La inoculación de cardiomiocitos solamente no indujo títulos relevantes de anticuerpos (control). Se representan los datos de ratones individuales. En contraste, las inoculaciones de control de cardiomiocitos apoptóticos en ausencia de la activación con TLR no indujo autoanticuerpos cardiacos. Debe indicarse que las inoculaciones in vivo de LPS o de CpG,
o las inoculaciones de CD40 más LPS solo no resultó en miocarditis (no representado). Estos resultados representan que la liberación sistémica de cardiomiocitos dañados en combinación con la activación no específica del sistema inmunológico innato resultan suficientes para inducir la inflamación cardiaca.
La presente invención no se encuentra limitada a las características de las formas de realización descritas en la presente memoria, comprendiendo todas las variaciones y modificaciones comprendidas dentro del alcance según las reivindicaciones.
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-25
Claims (28)
1. Procedimiento para preparar células dendríticas reactivas a un antígeno, que comprende:
proporcionar una representa de células dendríticas; y
poner en contacto las células dendríticas con el antígeno, un estimulante de CD40 y con por lo menos un estimulante de receptor de tipo Toll (TLR).
- 2.
- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el antígeno durante un periodo de tiempo adecuado, seguido de la puesta en contacto de las células dendríticas con por lo menos un estimulante de TLR durante un periodo de tiempo adecuado.
- 3.
- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que las células dendríticas se proporcionan a partir del tejido de un animal, siendo el tejido seleccionado de entre el grupo constituido por sangre periférica, médula ósea, bazo y nódulo linfático.
- 4.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el estimulante de TLR se selecciona de entre el grupo constituido por lipopolisacárido, poli(I:C), CpG-ODN y peptidoglicano.
- 5.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el antígeno durante desde aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas.
- 6.
- Procedimiento según la reivindicación 5, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el estimulante de TLR durante hasta cuatro horas.
- 7.
- Procedimiento según la reivindicación 6, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el estimulante de TLR durante hasta dos horas.
- 8.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células dendríticas son CD11c+, CD11b+.
- 9.
- Procedimiento según la reivindicación 8, en el que las células dendríticas son las CD11c+.
- 10.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con antígeno en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 a 20 µg/ml.
- 11.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con un anticuerpo anti-CD40.
- 12.
- Procedimiento según la reivindicación 11, en el que el anticuerpo anti-CD40 se encuentra a una concentración comprendida en el intervalo de aproximadamente 3 a 5 µg/ml.
- 13.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el antígeno es un autoantígeno o un antígeno tumoral.
- 14.
- Procedimiento para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un tumor en un animal, que comprende proporcionar un antígeno tumoral expresado por el tumor, proporcionar una representa de células dendríticas procedentes del animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al antígeno tumoral in vitro mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el medicamento está destinado a la reintroducción de las células dendríticas reactivas en el animal.
15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el animal es un humano.
- 16.
- Procedimiento según la reivindicación 14 ó 15, en el que las células dendríticas están destinadas a la reintroducción en el animal mediante infusión intravenosa o mediante inyección subcutánea.
- 17.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que las células dendríticas se cultivan en presencia de una citoquina previamente a la puesta en contacto con el antígeno.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la citoquina es la IL-10.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el tumor se selecciona de entre un grupo constituido por un melanoma, un carcinoma de células renales, una leucemia y un linfoma.
20. Procedimiento de preparación de un modelo animal no humano de una
enfermedad autoinmunológica, que comprende proporcionar un antígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al antígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el antígeno es el colágeno
o una proteína de la matriz de cartílago y la enfermedad autoinmunológica es la artritis.
- 22.
- Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el antígeno es un antígeno específico del corazón y la enfermedad autoinmunológica es la miocarditis.
- 23.
- Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el antígeno es el péptido myhc-α.
- 24.
- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el animal se selecciona de entre el grupo constituido por un ratón, una rata y un cerdo.
- 25.
- Procedimiento de preparación de un modelo animal no humano de insuficiencia orgánica, que comprende proporcionar un autoantígeno específico de órgano, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al autoantígeno mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal.
- 26.
- Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el antígeno es el péptido myhc-α.
- 27.
- Modelo animal de una enfermedad autoinmunológica preparado mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.
- 28.
- Procedimiento para cribar un compuesto candidato para su capacidad de modular el desarrollo de una enfermedad autoinmunológica en un no humano, que comprende proporcionar un autoantígeno asociado a la enfermedad autoinmunológica, proporcionar una representa de células dendríticas de un animal, la conversión de las células dendríticas en reactivas al autoantígeno mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y reintroducir las células dendríticas reactivas en el animal, en el que las células dendríticas se ponen en contacto con el compuesto candidato en un momento seleccionado de entre antes del contacto con el autoantígeno, durante el contacto con el autoantígeno, después del contacto con el autoantígeno y antes del contacto con el estimulante de TLR, durante el contacto con el estimulante de TLR y
después del contacto con el estimulante de TLR, y comparar la reacción autoinmunológica en el animal con la reacción autoinmunológica en un animal tratado con las células dendríticas que se han convertido en reactivas al mismo autoantígeno y no expuestas al compuesto.
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