ES2354201T3 - Recipientes y kits para la determinación de funciones celulares y métodos para la determinación de las mismas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNOS CONTENEDORES PARA LA DETERMINACION DE LAS FUNCIONES CELULARES QUE SON FACILES DE MANEJAR Y SON MENOS PELIGROSOS, PERMITIENDO UNA DETERMINACION DE ALTA PRECISION. ESPECIFICAMENTE, UN CONTENEDOR PARA LA DETERMINACION DE LAS FUNCIONES CELULARES QUE SE VA USAR CON LAS SUSTANCIAS FISIOLOGICAMENTE ACTIVAS DE ANALISIS PRODUCIDAS POR LOS HEMATOCITOS, CONSTITUIDO DE FORMA TAL QUE SE DISMINUYE LA CANTIDAD DE MATERIALES INDUCTORES DE LA PRODUCCION DE LAS SUSTANCIAS FISIOLOGICAMENTE ACTIVAS, HASTA UN NIVEL TAL QUE NO CAUSE QUE LOS HEMATOCITOS PRODUZCAN LAS SUSTANCIAS, TAL COMO SE DETERMINA EXTRAYENDO AGUA DEL CONTENEDOR, EN UNA CANTIDAD IGUAL AL DE UNA MUESTRA DE SANGRE QUE SE VA ANALIZAR; Y OTRO CONTENEDOR PARA LA MISMA, EN DONDE LOS MATERIALES QUE INDUCEN LA PRODUCCION DE SUSTANCIAS, CUANDO SE PONEN EN CONTACTO CON LA SANGRE, SE COLOCAN EN UN ESTADO CAPAZ DE PONERSE EN CONTACTO CON LA SANGRE, DISMINUYENDOSE LA CANTIDAD DE LOS MATERIALES EN EL CONTENEDOR DE FORMA QUE NOAFECTE AL ANALISIS DE LAS SUSTANCIAS.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un kit para la medición de funciones celulares implicadas en reacciones inmunes e inflamatorias, y más particularmente a un kit para la medición de funciones celulares que se realiza 5 mediante la determinación de citoquinas como sustancias fisiológicamente activas, producidas por células sanguíneas incluyendo granulocitos, monocitos, macrófagos, linfocitos o similares.

Descripción de la técnica anterior

Los leucocitos, tales como granulocitos, monocitos, macrófagos y 10 linfocitos, desempeñan diversos papeles en reacciones bioprotectoras diversificadas, incluyendo reacciones inmunes e inflamatorias en sangre u órganos respectivos. Se sabe que estas células muestran funciones importantes en diversas morbilidades incluyendo enfermedades infecciosas; enfermedades inflamatorias tales como hepatitis y nefritis; enfermedades 15 alérgicas inmunes tales como artritis reumatoide y asma; y cáncer, y las funciones de estas células son suprimidas o potenciadas según varíe la morbilidad.

También se sabe que diversos fármacos, tales como fármacos anti-inflamatorios, inmunosupresores, inmunopotenciadores y fármacos 20 anticancerosos, son útiles en la terapia de estas enfermedades, en las que las funciones de estas células son suprimidas o potenciadas simultáneamente. Es importante, por lo tanto, examinar las funciones de estas células, mediante lo cual las morbilidades de diversas enfermedades, efectos y efectos secundarios de fármacos puedan identificarse para determinar esquemas terapéuticos, 25 dosis de los fármacos y la temporización de la administración del fármaco.

En vista de las razones descritas anteriormente, un ensayo de actividad fagocítica de granulocitos, un ensayo de actividad bactericida de granulocitos (capacidad de producción de oxígeno activo), un ensayo de transformación de linfocitos y similares se han estado realizado convencionalmente en salas o 30 centros de reconocimiento hospitalarios para medir dichas funciones celulares. También en los últimos años, se ha estado realizando un ensayo de antígeno de superficie que utiliza un citómetro de flujo y anticuerpos monoclonales marcados por fluorescencia contra antígenos de superficie respectivos de diversas células inmunocompetentes. Sin embargo, los métodos de ensayo 35

convencionales han requerido técnicas especializadas tales como separación y cultivo de células, medición microscópica o similares, para necesitar por consiguiente mediciones que requieren tiempo, instalaciones de RI y equipos caros.

Además, los monocitos en sangre, así como macrófagos en los que los 5 monocitos se movían a tejidos diferenciados y maduros, tienen un amplio espectro de funciones, por ejemplo, como entrar en juego en la exclusión de cuerpos extraños mediante fagocitosis y formación inmune mediante presentación de antígenos, o como secreción de diversas sustancias fisiológicamente activas, tales como citoquina y prostaglandina, para regular de 10 este modo una reacción inflamatoria o inmune. Al igual que los granulocitos y los linfocitos, estos monocitos y macrófagos desempeñan papeles importantes también en diversas morbilidades. Es muy importante, por lo tanto, identificar las funciones de estas células. Particularmente en enfermedades infecciosas, a diferencia de los granulocitos y linfocitos, los monocitos y macrófagos muestran 15 ligeros cambios en términos del número de células y amplifican principalmente sus funciones, de modo que la medición de los cambios en las funciones celulares se vuelve más importante (documento “Macrophages”, escrito por Tohru Tokunaga, Kodansha Scientific, 1ª Ed. Publicada en 1986).

El factor α de necrosis tumoral (en lo sucesivo en este documento 20 denominado como TNFα), interleuquina-1β (en lo sucesivo en este documento denominada como IL-1β), e interleuquina-6 (en lo sucesivo en este documento denominada como IL-6), llamadas todas monoquina, son citoquinas que son producidas principalmente por leucocitos incluyendo monocitos y macrófagos, entre las células sanguíneas, y que entran en juego en diversas reacciones 25 inflamatorias e inmunes.

Diversos métodos descritos hasta la fecha examinan las funciones de producción de citoquinas descritas anteriormente de la sangre o leucocitos separados de la sangre. Por ejemplo, en los boletines de Patente Abiertas a Inspección Pública Nº. Hei 2-196961 y Hei 3-285692, se describen métodos 30 que hacen reaccionar a lipopolisacárido (LPS) o lectina con sangre para inducir la producción de citoquinas, tales como TNFα o IL-1β, que posteriormente se determinan cuantitativamente. Además, en los boletines de Patente Abiertas a Inspección Pública Nº Hei 6-209992 y Hei 7-67955, se describen métodos que hacen reaccionar a sangre con materiales poliméricos que tienen una 35 rugosidad de superficie o estructuras químicas específicas para inducir la producción de TNFα. Además, en los boletines de Patente Abierta a Inspección Pública Nº Hei 7-299732 y Hei 7-151752, se describen ensayos de biorreacción que hacen reaccionar a sangre con materiales poliméricos que tienen una rugosidad de superficie específica para determinar la cantidad de TNFα o IL-1β 5 producida. Además, en un boletín de Tokkohyo Nº Hei 7-500905, se describe un método que mide la inmunoactividad de una sustancia ensayada determinando la producción de citoquinas, tales como TNFα o IL-1β, inducida a partir de leucocitos de sangre periférica humana.

Sin embargo, los métodos descritos anteriormente para la medición de 10 funciones celulares que se han realizado convencionalmente en salas o centros de hospitalarios reconocimiento, así como los métodos descritos en los boletines de las patentes abiertas a inspección pública mencionadas anteriormente, presentan los siguientes problemas. Esto es, todos estos ensayos requieren operaciones especializadas, tales como una operación de 15 recogida de sangre de un ser humano examinado usando un inyector y seguidamente la transferencia de forma manual de la sangre a diversos reactores tal como mediante pipeteo, separación celular para separar los leucocitos y las otras, cultivo celular con en fin de medir las funciones celulares o similares. Esto conlleva el riesgo de que la persona que realiza el examen 20 contraiga diversas enfermedades infecciosas, tales como hepatitis y SIDA, cuando la persona entra en contacto con la sangre. Además, existe la posibilidad de que diversas bacterias o polvos se incorporen accidentalmente a una muestra de sangre durante dichas operaciones. Existe otro riesgo de influir negativamente en los resultados de la medición cuando esos contaminantes u 25 operaciones estimulan físicamente a las células en la sangre sin necesidad.

Particularmente en los métodos convencionales que emplean un reactor específico para recoger la sangre en su interior y determinan la producción de citoquinas, específicamente de TNFα o IL-1β inducidas a partir de leucocitos, ha habido una ocasión en la que la endotoxina, tal como LPS obtenido de 30 bacterias gram-negativas, se ha incorporado originalmente en un equipo para la recogida de sangre, tal como un inyector, o en un reactor. Dado que incluso una muy pequeña cantidad de endotoxina puede inducir la producción de TNFα o IL-1β a partir de leucocitos, era imposible obtener resultados de medición fiables cuando, por ejemplo, la entrada de una pequeña cantidad de polvos 35 durante un proceso de fabricación o contaminación a través del agua de limpieza empleada daba como resultado la incorporación de una pequeña cantidad de endotoxina en el equipo para la recogida de sangre o reactor descrito anteriormente.

En vista de los problemas descritos anteriormente, se busca un método 5 para la medición de funciones celulares cuyas operaciones sean más sencillas, menos arriesgadas y más precisas que los métodos convencionales.

En otro aspecto, convencionalmente se han utilizado anticoagulantes cuando se miden diversas sustancias fisiológicamente activas en sangre, funciones de células sanguíneas, antígenos de superficie de células 10 sanguíneas o similares.

Sin embargo, no existe un patrón general para el contenido de endotoxina en anticoagulante, aparte de una directriz que se da en el documento “Endotoxin testing method” en el vademecum de la 13ª Farmacopea Japonesa revisada, que, para anticoagulantes empleados como 15 un fármaco para inyección, establece oficialmente 5 EU/kg como patrón para una especificación de dosis pirógena mínima a un conejo.

La endotoxina es un lipopolisacárido que constituye una membrana externa a la pared celular de bacterias gram-negativas, y una muy ligera cantidad de la misma basta para estimular a las células sanguíneas, tales como 20 leucocitos, para producir sustancias fisiológicamente activas tales como diversas citoquinas incluyendo TNFα, IL-1β, IL-6, o factores estimuladores de la colonia de granulocitos-macrófagos. Estas muestran diversas acciones fisiológicas tales como actividad pirógena y choque inducido por endotoxinas (Nippon Igaku-kan “Inflammation and cytokines '87 Inflammation Seminar”, 25 págs. 103-108).

Además, las sustancias fisiológicamente activas, tales como las citoquinas descritas anteriormente producidas a partir de células sanguíneas, interactúan entre sí de modo autocrino o paracrino para provocar la producción adicional de histaminas, metabolitos de araquidonato o diversas citoquinas, 30 para modificar diversas funciones de células sanguíneas, y para provocar cambios cuantitativos y cualitativos de antígenos de superficie de las células sanguíneas.

Por consiguiente, si los anticoagulantes están contaminados con endotoxina, y si el contenido de dicha endotoxina está a un nivel suficiente para 35 provocar la producción de las sustancias fisiológicamente activas, se volvería imposible realizar mediciones precisas de diversas sustancias fisiológicamente activas en sangre, o funciones de células sanguíneas y de antígenos de superficie de células sanguíneas.

El documento WO 94/26935 se refiere a un método y a un dispositivo 5 para detectar y medir la cantidad de una molécula asociada a células en una muestra de fluido biológico, con el que puede detectarse un gran número de moléculas asociadas a células que comprenden citoquinas.

El documento Taktak Y. S. et al, “Assay of pyrogens by interleukin-6 release from monocytic cell lines”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, Vol. 10 43, Nº 9, 1991, páginas 578 - 582 describe un método de determinación de pirógenos mediante la liberación de interleuquina-6 en productos farmacéuticos.

Sumario de la invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar un kit para la 15 medición de funciones celulares, que pueda eliminar los problemas impuestos en los métodos convencionales para la medición de las funciones celulares, que sea de operaciones más sencillas y menos arriesgado que los convencionales, y que pueda medir funciones celulares con una mayor precisión que los convencionales. 20

De acuerdo con la invención, para cumplir el objeto descrito anteriormente, se proporciona un kit como se define en la reivindicación 1. El kit comprende un recipiente para la medición de las funciones celulares, para su uso en la determinación de sustancias fisiológicamente activas producidas a partir de células sanguíneas, en el que una cantidad de material capaz de 25 inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente, cuando se extrae mediante la recogida de agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a la medición, está a un nivel insuficiente para inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas. 30

Dado que, en este recipiente para la medición de las funciones celulares, como se ha descrito anteriormente, la cantidad de material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas, cuando se extrae recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, está limitada a un nivel insuficiente para inducir la producción de 35 las sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas, es decir, el recipiente para la medición de las funciones celulares contiene en sí mismo la cantidad limitada especificada anteriormente del material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas, la sangre recogida apenas se somete a estimulación innecesaria durante un periodo 5 desde la recogida hasta la medición, de modo que se permite una conservación a largo plazo de la misma. Esto permite la medición precisa de las sustancias fisiológicamente activas presentes en la sangre recogida y permite el uso del recipiente en el examen de forma precisa de morbilidades de pacientes que tienen diversas enfermedades. 10

Este primer recipiente para la medición de las funciones celulares se emplea para obtener valores de control. Se usa en el kit en combinación con un segundo recipiente para la medición de las funciones celulares como se describe a continuación.

En el primer recipiente para la medición de las funciones celulares de 15 acuerdo con la invención de la presente solicitud, el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente es una endotoxina, y su contenido en el recipiente para la medición de las funciones celulares antes del uso está especificado para no superar las 0,5 EU/ml como una concentración en un líquido extraído cuando se extrae 20 recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición.

En el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, un material que induce la producción de sustancias fisiológicamente activas en sangre después del contacto con la sangre, está alojado en su interior de tal 25 manera que pueda entrar en contacto con la sangre, y que la cantidad, presente en el recipiente antes del uso, del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente esté limitada para no influir negativamente sobre los valores medidos de las sustancias fisiológicamente activas como se ha descrito anteriormente. 30

En el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, aunque el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas en sangre está alojado de tal manera que pueda entrar en contacto con la sangre, el contenido del material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas, originalmente 35 presente en el recipiente antes del alojamiento del mismo, está preferentemente limitada, como se ha descrito anteriormente, para no influir en los valores medidos de las sustancias fisiológicamente activas. Por consiguiente, la producción de sustancias fisiológicamente activas puede determinarse de forma muy precisa cuando la sangre se introduce y se pone en 5 contacto con el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas para producir, de este modo, las sustancias fisiológicamente activas.

En el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el material que induce la producción de las 10 sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente es endotoxina, y una concentración de endotoxina en un líquido completo resultante cuando se pone en contacto con la sangre está limitada, estando en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml.

Además, en ambos recipientes para la medición de las funciones 15 celulares de acuerdo con la invención, se incorporan además anticoagulantes en su interior para impedir la coagulación de la sangre.

Además, la cantidad del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas contenido en el anticoagulante descrito anteriormente está preferentemente a un nivel insuficiente para inducir la 20 producción de las sustancias fisiológicamente activas a partir de células sanguíneas cuando se mezcla con la sangre.

En la presente invención, el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas es endotoxina, mientras que las sustancias fisiológicamente activas son citoquinas. 25

Al menos una especie seleccionada entre factor α de necrosis tumoral (TNFα), interleuquina-1β (IL-1β) e interleuquina-6 (IL-6) puede mencionarse como las citoquinas descritas anteriormente.

Además, un interior del recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, está preferentemente al vacío. 30

Además, los recipientes para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, se combinan con un reactivo capaz de cuantificar las sustancias fisiológicamente activas inducidas para constituir de este modo un kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la reivindicación 1. Un reactivo de inmunoensayo enzimático se emplea como el reactivo capaz 35 de cuantificar las sustancias fisiológicamente activas inducidas.

La invención de la presente solicitud es un kit para la medición de las funciones celulares. Como se ha mencionado, el kit tiene un primer recipiente para la medición de las funciones celulares en el que una cantidad de un material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente 5 activas descritas anteriormente, cuando se extrae recogiendo agua que no contiene el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas y tiene un volumen tal que es igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, se traduce en un nivel insuficiente para inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas a partir de 10 células sanguíneas, y en el que está contenido anticoagulante; un segundo recipiente para la medición de las funciones celulares en el que un material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas en sangre cuando se pone en contacto con la sangre, así como anticoagulante, están alojados de tal manera que puedan entrar en contacto con la sangre, y 15 en el que la cantidad, originalmente presente en el recipiente antes del alojamiento de la misma, del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente está preferentemente limitada para no influir negativamente sobre los valores medidos de las sustancias fisiológicamente activas como se ha descrito 20 anteriormente; y un reactivo para determinar cuantitativamente las sustancias fisiológicamente activas. Es decir, el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención tiene una constitución que combina el primer recipiente para la medición de las funciones celulares, el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, y el reactivo para 25 cuantificación definido anteriormente.

En el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el reactivo para cuantificación especificado anteriormente incluye un primer reactivo de inmunoensayo enzimático para su uso en la determinación de la cantidad de sustancias fisiológicamente activas en la sangre recogida en 30 el primer recipiente para la medición de las funciones celulares; y un segundo reactivo de inmunoensayo enzimático que se emplea para determinar la cantidad de sustancias fisiológicamente activas producida mediante una reacción del material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas con la sangre recogida en el segundo recipiente para 35 la medición de las funciones celulares, y que es diferente en sensibilidad a las sustancias fisiológicamente activas del primer reactivo de inmunoensayo enzimático, como se define en la reivindicación 1.

Además, en el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el material que induce la producción de las sustancias 5 fisiológicamente activas descrito anteriormente es endotoxina, y una concentración de endotoxina en un líquido completo resultante cuando se pone en contacto con la sangre se traduce en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml.

La presente invención se explicará a continuación en detalle.

(Primer recipiente para la medición de las funciones celulares) 10

Para el primer recipiente para la medición de las funciones celulares, se requiere que la cantidad de material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente, cuando se extrae recogiendo agua desprovista del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas y de un volumen igual a un volumen de 15 líquido que se someterá a medición, esté a un nivel insuficiente para inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas.

El método de extracción se realiza realmente recogiendo, en el recipiente anterior para la medición de las funciones celulares, agua 20 desprovista del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas y de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, y extrayendo con agitación durante una hora a 37ºC.

Las sustancias fisiológicamente activas anteriores son citoquinas y el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas 25 es una endotoxina.

El contenido de endotoxina en una solución extraída resultante de la extracción descrita anteriormente está especificada para no superar las 0,5 EU/ml (unidad de endotoxina internacional). Si el contenido de la endotoxina anterior supera las 0,5 EU/ml, es probable que la endotoxina provoque una 30 marcada inducción de citoquinas, en la sangre recogida, y las citoquinas inducidas posiblemente estimulen a diversas células inmunocompetentes para provocar cambios en las funciones de las mismas, haciendo, por consiguiente, imposibles las mediciones precisas de las funciones celulares.

El volumen de líquido que se someterá a medición, como se ha descrito 35 anteriormente, se refiere a un volumen total de líquidos empleado cuando se realizan las diversas mediciones que se describen a continuación, por ejemplo una suma de un volumen de sangre a medir, un volumen de una solución de anticoagulante que se describe a continuación añadida cuando fuera necesario, un volumen de una solución potenciadora de la coagulación sanguínea, y un 5 volumen de líquido para disolver o suspender estimuladores.

Debe entenderse, en este caso, que no es necesario que la cantidad en volumen del agua libre de endotoxina cuando se usa para realizar la extracción descrita anteriormente sea exactamente igual al volumen de líquido que se someterá a medición, y puede ser inferior al volumen de líquido que se 10 someterá a medición siempre que la extracción pueda realizarse con éxito. Incluso en tal caso, pueden obtenerse la función y efecto de la presente invención, siempre que el contenido de endotoxina en la solución extraída no supere las 0,5 EU/ml.

Aunque existen diversos métodos para determinar el contenido de 15 endotoxina anterior, un método mencionado en la presente memoria descriptiva para determinar el contenido de endotoxina es una colorimetría, de acuerdo con el documento “Endotoxin testing method” en el vademecum de la 13ª Farmacopea Japonesa revisada. La colorimetría usa, como indicación, un color producido en un sustrato sintético cromóforo cuando se hidroliza, y puede 20 realizarse, por ejemplo, usando un producto disponible en el mercado ENDOSPECIE (fabricado por Seikagaku Kogyo Co.).

Como método para retirar o desactivar una endotoxina, pueden emplearse diversas técnicas bien conocidas que incluyen la desactivación mediante calentamiento, tratamiento con ácido o álcali; ultrafiltración usando un 25 filtro de membrana; y retirada usando resinas de quitosana aniónicas, polimixina B que puede unirse específicamente a endotoxina, o adsorbentes que fijan anticuerpos contra endotoxina. Además, los instrumentos y recipientes empleados para las operaciones de retirada de endotoxina se someten a tratamiento por calor seco a 250ºC durante una hora o más, si están hechos de 30 vidrio, o se sumergen en una solución acuosa 0,2 M de hidróxido sódico y se lavan con agua libre de endotoxina, si están hechos de plástico, para asegurar la completa desactivación de la endotoxina antes de su uso. Además, el agua libre de endotoxina debe usarse sistemáticamente cuando se necesite agua, y una atmósfera operativa es preferentemente una atmósfera tal que cualquier 35 contaminación secundaria por endotoxina está limitada dentro de un intervalo factible, como se proporciona en una sala limpia.

Un interior del recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, preferentemente está sometido al vacío. La presión interna puede reducirse en tal medida que la sangre atmosférica pueda 5 succionarse al interior del recipiente para la medición de las funciones celulares después de comunicación de la misma con el interior del recipiente para la medición de las funciones celulares. La presión interna puede determinarse dependiendo de una cantidad de sangre que se va a succionar. Es decir, cuanto mayor sea una cantidad de sangre objetivo a succionar, mayor grado de 10 reducción de la presión puede haber que realizar.

La forma del primer recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, no está particularmente especificada, y puede ser tubular según lo ejemplificado mediante tubos para la recogida de sangre, tubos de ensayo y similares, o similar a una placa según lo 15 representado por microplacas. Preferentemente, es adecuado para operar al vacío.

Son ilustrativos del tipo de material para el recipiente para la medición de las funciones celulares vidrios y plásticos. Las resinas termoplásticas y termoendurecibles pueden ambas emplearse como plásticos mencionados 20 anteriormente. Como ejemplos de las resinas termoplásticas se mencionan polietileno, polipropileno, poliestireno, polimetilmetacrilato, cloruro de polivinilo, polietileno tereftalato, copolímero de estireno-acrilonitrilo, copolímero de estireno-anhídrido maleico, copolímero estireno-acrilato, copolímero de estireno-metilmetacrilato, copolímero de etileno-propileno, copolímero de 25 etileno-ácido acrílico, y copolímero de etileno-acrilato. Como ejemplos de las resinas termoendurecibles se mencionan resinas de poliéster insaturadas, resinas epoxi y resinas epoxi-acrilato.

En el caso en el que se emplea una parte tubular como primer recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, se 30 usa generalmente un tapón para mantener el interior del recipiente a una presión reducida. Como tipos de material ejemplares para el tapón se mencionan gomas de butilo, gomas de butilo cloradas, elastómeros termoplásticos y similares.

Si se emplea la parte tubular como primer recipiente para la medición de 35 las funciones celulares, de acuerdo con la invención, la cantidad de sangre a recoger varía dependiendo de un volumen del recipiente para la medición de las funciones celulares, pero puede ser generalmente de aproximadamente 0,5 - 2 ml en caso de que se use un recipiente que tiene un volumen de 4 - 5 ml.

Por otro lado, si se emplea una parte similar a una microplaca como 5 recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la primera invención, la cantidad de sangre a recoger puede ser de aproximadamente 0,05 - 2 ml.

Se introduce anticoagulante en el recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, para impedir la coagulación 10 sanguínea. El anticoagulante descrito anteriormente puede estar presente en forma líquida o sólida en el recipiente. Como los anticoagulantes anteriores se mencionan compuestos de heparina, compuestos de ácido cítrico, compuestos de ácido oxálico y similares. La heparina sódica es más preferible dado que no inhibe las reacciones biológicas de las células. Cuando se recoge la sangre en 15 el recipiente, una concentración reducida de heparina sódica en la sangre posiblemente provoca la coagulación sanguínea mientras que es probable que una mayor concentración de la misma provoque una inesperada activación o inactivación de las células. Por consiguiente, una cantidad preferida de heparina sódica alojada en el recipiente es de 4 - 50 U/ml. 20

Es necesario que el anticoagulante se añada al interior del primer recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, en particular en el caso donde la determinación se realiza como para sustancias fisiológicamente activas producidas (liberadas o inducidas) haciendo reaccionar a células, tales como monocitos, macrófagos, linfocitos, leucocitos o 25 similares, con material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas.

Además, cuando sea necesario, puede alojarse coagulante en el recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención. Dicho caso puede surgir cuando se determinan las sustancias 30 fisiológicamente activas mediante coagulación sanguínea. Puede mencionarse trombina y similares como ejemplos de dichos coagulantes.

Un método ejemplar de fabricación del recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, se explicará a continuación en referencia a la fabricación del recipiente tubular. Éste se fabrica añadiendo 35 anticoagulante o coagulante, dependiendo de lo que sea necesario, en un recipiente tubular que tiene un interior cuya presión puede reducirse y en el que una cantidad de endotoxina, cuando se extrae recogiendo agua libre de endotoxina de un volumen igual al volumen de líquido que se someterá a medición, se traduce en un nivel insuficiente para inducir la producción de 5 sustancias fisiológicamente activas a partir de células sanguíneas; llevando al recipiente a un estado de vacío predeterminado; y colocando un tapón en el recipiente.

Como el recipiente anterior, se prefiere un cuerpo tubular de extremo cerrado, por ejemplo, que está abierto en un extremo y cerrado en el extremo 10 opuesto. Una parte de abertura está configurada preferentemente para ser bloqueada por un cuerpo de tapón. Además, el primer recipiente para medición de acuerdo con la invención se fabrica preferentemente en una atmósfera lo más limpia posible para evitar la infección con endotoxinas o diversas bacterias, y se somete preferentemente a tratamiento de esterilización bien 15 conocido después de completar su fabricación, si es posible.

En el uso del recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el recipiente para la medición de las funciones celulares especificado anteriormente se pone en primer lugar en comunicación con un vaso sanguíneo para permitir que la sangre sea succionada al interior 20 del recipiente para la medición de las funciones celulares anterior. En la comunicación del anterior vaso sanguíneo con el recipiente para la medición de las funciones celulares especificado anteriormente, puede emplearse una aguja inyectora que se utiliza para técnicas de recogida de sangre al vacío convencionales, es decir una aguja (denominada generalmente una aguja 25 inyectora múltiple) que tiene en un extremo de una base de la aguja una parte de aguja para clavarse en el vaso sanguíneo y en el otro lado de la base de la aguja otra parte de aguja para clavarse en el tapón en el recipiente especificado anteriormente, y en el que la parte de aguja para clavarse en el vaso sanguíneo descrita anteriormente comunica con otra parte de aguja para 30 clavarse en el tapón.

La determinación de sustancias fisiológicamente activas en sangre se realiza determinando las sustancias fisiológicamente activas en sangre recogida mediante el uso del recipiente para la medición de las funciones celulares. En este caso, la sangre recogida mediante el uso del primer 35 recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención es transferida a otro recipiente o sometida a la medición de sustancias fisiológicamente activas mediante el uso sucesivo del recipiente. En un caso tal que la determinación de las sustancias fisiológicamente activas se realiza mediante el uso sucesivo del recipiente, el recipiente, posteriormente a 5 la recogida de sangre, generalmente se deja reposar o se centrifuga para separar los hemocitos y plasmas que contienen sustancias fisiológicamente activas que se determinan cuantitativamente mediante reactivos para la respectiva cuantificación de las mismas.

Como ejemplos de las sustancias fisiológicamente activas anteriores se 10 mencionan TNF-α; interleuquinas tales como IL-1β, IL-4, IL-5 y IL-6; interferones tales como INFα, INFβ e INFγ; factores estimuladores de colonias; factores quimiotácticos tales como IL-8, RANTES y diversas citoquinas; prostaglandinas; PGE2 y PGI2; leucotrienos tales como LTB4 y LTC4; diversos mediadores químicos tales como monóxido de nitrógeno, oxígeno activo, 15 histaminas, y factor activador de plaquetas (PAF). También se mencionan factores de adhesión tales como ICAM1 soluble, receptores de citoquinas solubles tales como receptor de IL-2 soluble, metaloproteinasas de la matriz, y enzimas granulares intracelulares tales como elastasa específica de macrófagos. 20

Como un método ejemplar de determinación de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente se menciona un inmunoensayo enzimático que utiliza anticuerpos monoclonales o policlonales contra sus sustancias fisiológicamente activas objetivo, peroxidasas, enzimas tales como fosfatasas alcalinas, y sustratos cromóforos de enzimas respectivas. 25

Como materiales ejemplares capaces de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas se mencionan diversos microorganismos tales como endotoxina, bacterias de BCG muertas y Corynebacterium; lípido A sintético; copolímero de pirano; lectinas (tales como fitohemaglutinina, concanavalina A, mitógeno de la hierba camín); OK432 (Picibanil); PSK 30 (Krestin); lentinan, zymosan; LPS (lipopolisacárido); ionóforo de calcio; ésteres de forbol; vehículos fijados a inmunoglobulina; formilpéptidos tales como formil-metionil-leucil-fenilalanina (FMLP); y diversas citoquinas.

También pueden usarse antígenos específicos (por ejemplo, polvos domésticos; antígenos de ácaros; diversos antígenos del polen tales como 35 extractos de polen de Artemisa, extractos de polen de cedro, extractos de arroz y similares; antígenos de hongos; antígenos parasíticos tales como extractos del género Ascaris y similares; antígenos de alimentos tales como ovoalbúmina, trigo, soja, langosta, cangrejo, carne y similares; y toxina de avispa) que se utilizan para el examen de alergenos tales como asma, 5 polinosis, rinitis alérgica, dermatitis atópica, alergia gastrointestinal, alergia parasítica y similares.

También se mencionan materiales que fijan los materiales ilustrados anteriormente capaces de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas en diversos materiales de alto peso molecular naturales o sintéticos, 10 mediante técnicas de fijación bien conocidas (tales como enlaces covalentes, adsorción física y similares).

La forma de los materiales capaces de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas descritos anteriormente no está limitada particularmente, y pueden estar en forma líquida o particulada, por ejemplo. 15 Además, pueden estar fijados en vehículos. En el caso de la forma líquida, los materiales descritos anteriormente capaces de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas se diluyen generalmente para su uso, tal como usando, como líquido diluyente, una solución tampón tal como tampón fosfato, tampón de Hanks o similares, un medio de cultivo normal tal como 20 MEM, RPMI-1640 o similares, una solución salina fisiológica (por ejemplo, fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), o agua para inyección (por ejemplo, fabricada por Otsuka Seiyaku Co.).

La forma existente del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente puede ser sólida o 25 líquida. En el caso en el que dicho material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas es soluble en agua, puede estar extendido sobre una superficie de la pared interna del recipiente o añadirse al recipiente antes de transformarlo en forma de polvo. Por ejemplo, en el caso en que el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas 30 se diluye con agua para inyección, se prefiere introducir el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas en el recipiente para una posterior solidificación en seco del mismo. En el caso en que el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas es insoluble en agua, puede dejarse preferentemente permanecer a dicho 35 material insoluble en agua sumergido en el líquido diluyente descrito anteriormente, por ejemplo, dado que es probable que la posible retención de burbujas en una superficie del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas provoque una excesiva hemólisis cuando se pone en contacto con la sangre, tal como mediante mezclado por volteo, 5 para dar como resultado una influencia adversa sobre un sistema de medición.

En el caso en el que el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas se fija a un vehículo, si el vehículo de fijación es un material soluble en agua, dicho material soluble en agua puede estar extendido sobre una pared interna del recipiente o añadirse al recipiente 10 antes de transformarlo en forma de polvo. Si el vehículo de fijación es un material insoluble en agua, puede dejarse preferentemente que dicho material insoluble en agua permanezca sumergido en el líquido diluyente descrito anteriormente, por ejemplo, dado que es probable que la posible retención de burbujas en una superficie del material insoluble en agua provoque una 15 excesiva hemólisis cuando se ponen en contacto con la sangre, tal como mediante mezclado por volteo, para dar como resultado una influencia adversa sobre un sistema de medición.

Se prefiere que la cantidad del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas para adición al recipiente se ajuste 20 apropiadamente a un nivel de concentración óptimo, dependiendo del tipo de material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas.

En el método para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la primera invención, en el caso en que se prepara otro reactor por separado del recipiente de la primera invención, la forma del otro reactor no se especifica 25 particularmente, y puede ser tubular como se ejemplifica mediante tubos para la recogida de sangre, tubos de ensayo y similares, o similar a una placa como se ejemplifica mediante microplacas y similares. El reactor está adaptado preferentemente de modo que una cantidad de endotoxina, cuando se extrae recogiendo agua libre de endotoxina de un volumen igual al volumen de líquido 30 que se someterá a medición, se traduce en un nivel insuficiente para inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas a partir de células sanguíneas. En este caso, la medición del volumen de líquido descrito anteriormente que se someterá a medición es equivalente a la dada anteriormente en la explicación del recipiente para la medición de las funciones 35 celulares.

En el caso en el que el reactor se prepara por separado del recipiente para la medición de las funciones celulares, como se ha descrito anteriormente, puede emplearse dicho reactor al cual se ha añadido el material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas, y que se ha 5 llevado a un estado de vacío predeterminado. Para dicho reactor, su comunicación con el recipiente para la medición de las funciones celulares en el que se ha recogido la sangre, tal como la proporcionada por el inyector múltiple, facilita la transferencia de la sangre recogida al reactor. Además, la carga previa de material capaz de inducir la producción de sustancias 10 fisiológicamente activas simplifica un proceso de reacción.

En el caso anterior, se prefiere que la cantidad de material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas para su adición al reactor se ajuste apropiadamente a un nivel de concentración óptimo, dependiendo del tipo de material capaz de inducir la producción de sustancias 15 fisiológicamente activas. Un método ejemplar de fabricación de este reactor se menciona a continuación. El material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas y, en caso necesario, el anticoagulante se añaden a un recipiente tubular que tiene un interior cuya presión puede reducirse. A continuación, el reactor se lleva a un estado de vacío 20 predeterminado antes de que se coloque el tapón en éste. El reactor para su uso en la presente invención se fabrica preferentemente en una atmósfera lo más limpia posible para evitar infección con endotoxina o diversas bacterias, y se somete preferentemente a un tratamiento esterilizante bien conocido después de completar su fabricación, si fuera posible. 25

Como el reactor mencionado anteriormente, se prefiere un cuerpo tubular de extremo cerrado, por ejemplo, que está abierto en un extremo y cerrado en el extremo opuesto. La parte de abertura está configurada preferentemente para ser bloqueada con éxito mediante un cuerpo de tapón. El cuerpo tubular de extremo cerrado anterior es preferentemente un cuerpo 30 similar a un tubo de ensayo adecuado para el funcionamiento de una centrífuga, posterior a la reacción, para la medición del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente, y su tamaño preferido es de 5 - 30 mm de diámetro externo y 20 - 150 mm de altura. 35

(Segundo recipiente para la medición de las funciones celulares)

El segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se caracteriza porque un material, capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas en sangre cuando entra en contacto con la sangre, está alojado en su interior de tal manera que pueda 5 entrar en contacto con la sangre. Este material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas también puede denominarse en lo sucesivo en este documento como un material inductor de sustancias fisiológicamente activas. Como las sustancias fisiológicamente activas se mencionan las citoquinas. 10

El material inductor de sustancias fisiológicamente activas es una endotoxina. La endotoxina actúa sobre monocitos y macrófagos en sangre para promover la activación de estas células e inducir la producción de citoquinas. Como la endotoxina anterior se menciona la endotoxina constituida por polisacárido de la pared celular (LPS) obtenido de microorganismos, por 15 ejemplo. Además, pueden emplearse materiales que fijaban la endotoxina en diversos materiales de alto peso molecular naturales o sintéticos mediante una técnica de fijación.

La cantidad de uso de endotoxina se selecciona de modo que una concentración de endotoxina en un líquido completo (una suma de sangre, una 20 solución anticoagulante, una solución con endotoxina disuelta y demás) cuando se pone en contacto con sangre preferentemente está dentro de 0,6 - 100.000 EU/ml, más preferentemente dentro de 0,8 - 80.000 EU/ml. A medida que la concentración cae por debajo de 0,6 EU/ml, la cantidad de TNFα, IL-1β e IL-6 inducidas posiblemente se vuelve excesivamente pequeña. A medida que la 25 concentración supera las 100.000 EU/ml, la cantidad de TNFα, IL-1β e IL-6 inducidas posiblemente se vuelve excesivamente pequeña. Esto se añade también al coste.

En el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el material inductor de sustancias fisiológicamente 30 activas descrito anteriormente se proporciona de tal manera que puedan entrar en contacto con la sangre dentro del recipiente. Dicho estado para que pueda entrar en contacto con la sangre es, por ejemplo, cuando el material inductor de sustancias fisiológicamente activas está alojado en el recipiente.

La forma general del material inductor de sustancias fisiológicamente 35 activas es una forma de polvo o una forma líquida tomada cuando el material inductor se disuelve en un disolvente tal como agua. El estado del material inductor presente en el recipiente puede ser una forma sólida, en gel o líquida. En el caso de material inductor soluble en agua, éste puede disolverse en un disolvente adecuado para extenderlo posteriormente sobre una superficie de la 5 pared interna del recipiente o la adición al recipiente antes de convertirlo en forma de polvo.

Cualquiera de los tampones tales como tampón fosfato, tampón de Hanks y similares, y medios normales tales como MEM, RPM-1640 y similares puede utilizarse como disolvente descrito anteriormente, siempre que sea un 10 tampón fisiológico. Además, puede utilizarse un agua para inyección disponible en el mercado (agua sin LPS, fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) así como solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.).

Además, la cantidad de material inductor de sustancias fisiológicamente activas incorporado en el segundo recipiente para su uso en la invención debe 15 estar regulada antes de su uso para no influir en los valores medidos de las anteriores sustancias fisiológicamente activas producidas de forma inductiva. Como es evidente a partir de los EJEMPLOS descritos a continuación, a medida que el contenido de endotoxina tal como LPS aumenta, se produce una marcada inducción de citoquinas. Por consiguiente, para realizar de forma 20 precisa la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, el contenido del material inductor de sustancias fisiológicamente activas no debe ser mayor del nivel insuficiente para inducir citoquinas.

El contenido de endotoxina descrita anteriormente, cuando agua libre de endotoxina de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a 25 medición se recoge en el recipiente para la posterior extracción con agitación a 37ºC durante una hora, de la misma manera que en el primer recipiente, se hace preferentemente no superior a las 0,5 EU (unidad de endotoxina internacional)/ml, como una concentración en la solución extraída.

Diversas técnicas descritas en la explicación del primer recipiente 30 pueden emplearse como métodos para retirar o desactivar la endotoxina.

Además, dado que el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, de acuerdo con la invención, se emplea para medir funciones de células presentes en la sangre, el anticoagulante puede estar preferentemente alojado en el anterior recipiente para impedir la coagulación 35 de la sangre.

La forma existente, tipo y carga del anticoagulante anterior son las mismas que en el caso del primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención. Además, en lo que respecta a los tipos de material del recipiente para la medición de las funciones celulares de 5 acuerdo con la presente invención, pueden emplearse aquellos que son los mismos que para el primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención.

Además, en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, un interior del mismo está 10 preferentemente al vacío, permitiendo de este modo una fácil succión de sangre al interior del recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la segunda invención. En tal caso, se desea el uso de un tapón para mantener al interior a una presión reducida, de forma similar al caso del primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la 15 invención, y diversos materiales ilustrados en la explicación del primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención pueden ejemplificarse como tipos de material del tapón.

La cantidad de sangre recogida en la medición de las funciones celulares usando el segundo recipiente para la medición de las funciones 20 celulares de acuerdo con la invención depende de un volumen del recipiente para la medición de las funciones celulares, pero de aproximadamente 0,5 - 2 ml es suficiente cuando el recipiente para la medición de las funciones celulares empleado tienen un volumen de 4 - 5 ml.

Como un método ejemplar de fabricación del segundo recipiente para la 25 medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se menciona un método en el que el material inductor de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente, así como el anticoagulante, se añaden a un recipiente que tiene un interior cuya presión puede reducirse, el recipiente se lleva a un estado de vacío predeterminado, y el tapón se coloca en el recipiente. 30

Como el recipiente descrito anteriormente, se prefiere un cuerpo tubular de extremo cerrado, por ejemplo, que está abierto en un extremo y cerrado en el extremo opuesto. La parte de abertura está configurada preferentemente para ser bloqueada por un cuerpo de tapón. Más preferido que el cuerpo tubular de extremo cerrado anterior es el adecuado para funcionamiento de una 35 centrífuga realizado después de la reacción de inducción de citoquinas y para determinar la cantidad de citoquinas inducidas, y su tamaño preferido es de 5 - 30 mm de diámetro externo y aproximadamente 20 - 150 mm de altura.

Además, el recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se fabrica preferentemente en una atmósfera lo más 5 limpia posible para evitar infección con endotoxina o diversas bacterias, y se somete preferentemente a un tratamiento esterilizante bien conocido después de completar su fabricación, si fuera posible.

A continuación se explicará un método de medición de las funciones celulares utilizando el segundo recipiente para la medición de las funciones 10 celulares de acuerdo con la invención.

En primer lugar, el recipiente para la medición de las funciones celulares descrito anteriormente se pone en comunicación con un vaso sanguíneo o un recipiente para la recogida de sangre de modo que una muestra de sangre sea succionada al interior del recipiente para la medición de las funciones celulares. 15 A continuación se aplica una agitación moderada al recipiente para la medición de las funciones celulares para poner en contacto a las células sanguíneas con el material inductor de sustancias fisiológicamente activas descrito anteriormente para una posterior reacción inductiva. A medida que la reacción cesa, el recipiente se deja reposar o se centrifuga para separar hemocitos y 20 plasmas, y seguidamente las citoquinas en los plasmas se determinan cuantitativamente mediante reactivos capaces de cuantificar citoquinas respectivas.

La técnica descrita anteriormente para poner en comunicación al primer recipiente para la medición de las funciones celulares con el recipiente para la 25 recogida de sangre puede utilizarse para poner en comunicación al recipiente para la recogida de sangre descrito anteriormente con el recipiente para la medición de las funciones celulares descrito anteriormente.

Si la temperatura a la que la sangre se hace reaccionar con el material inductor de citoquinas anterior se rebaja, la actividad metabólica de las células 30 posiblemente se rebaja para dar como resultado una cantidad reducida en exceso de citoquinas inducidas, y si se eleva, posiblemente se produce el daño celular para dar como resultado una cantidad de citoquinas inducidas excesivamente reducida. Por consiguiente, ésta está controlada preferentemente a 26 - 45ºC, más preferentemente a 30 - 42ºC. 35

Si el periodo de tiempo durante el cual la sangre se hace reaccionar con el material inductor de citoquinas anterior se acorta, la cantidad de citoquinas inducidas se vuelve posiblemente excesivamente pequeña, y si éste se prolonga excesivamente, la producción de los resultados de la medición se retrasa. Además, la cantidad de citoquinas inducidas muestra una tendencia a 5 reducirse gradualmente desde un máximo que tiene lugar a aproximadamente 4 horas. El periodo de tiempo preferido es, por lo tanto, de 1 - 6 horas, más preferentemente de 2 - 4 horas.

En el método de medición de las funciones celulares que utiliza el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con 10 la invención, lo más preferido es que un líquido completo recogido en el recipiente para la medición de las funciones celulares se cultive a 30 - 40ºC durante 2 - 6 horas para inducir citoquinas.

El inmunoensayo enzimático descrito en la explicación del recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención puede 15 utilizarse para determinar cuantitativamente las citoquinas inducidas.

Una realización de una técnica para medir funciones celulares usando el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se explicará a continuación en detalle. En primer lugar, el material inductor de citoquinas descrito anteriormente se hace reaccionar con sangre en 20 el recipiente para la medición de las funciones celulares descrito anteriormente para inducir citoquinas. Una vez completada la inducción, el recipiente para la medición de las funciones celulares se centrifuga a 1200 G para separar los componentes de hemocitos y los componentes de plasma. A continuación, los plasmas separados se añaden usando una pipeta a un pocillo de una 25 microplaca en la que se han fijado anticuerpos monoclonales anti-citoquina para una posterior reacción a 37ºC durante 2 horas. A continuación, la solución de plasma después de la reacción se retiró por medio de retirada por succión o similares, y además, el pocillo se lava con un tampón de lavado de pH neutro que contiene un tensioactivo no iónico, tal como Tween 20, para retirar 30 adicionalmente componentes que no reaccionaron. A continuación se añaden con la pipeta anticuerpos policlonales anti-citoquina fijados a peroxidasas de rábano rusticano al pocillo para una reacción a 37ºC durante 1 hora. El pocillo se lava a continuación con el anterior tampón de lavado para retirar las peroxidasas de rábano rusticano que no reaccionaron, y seguidamente una 35 solución de sustrato que contiene peróxido de hidrógeno y tetrametilbenzidina se añade para la reacción durante 5 - 10 minutos. Una solución 1 M de ácido sulfúrico se añade para interrumpir la reacción antes de determinar un color producido en el sustrato debido a una reacción enzimática a partir de absorbancia a 450 nm. El valor determinado se evalúa contra una curva de 5 calibrado preparada usando citoquinas de concentración conocida para determinar el nivel de citoquinas inducidas.

(Kit para la medición de las funciones celulares)

Cada uno de los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se combina con un reactivo 10 capaz de cuantificar sustancias fisiológicamente activas, es decir un reactivo de inmunoensayo enzimático, para proporcionar un kit utilizable para la medición de las funciones celulares. Es decir, se proporciona un kit para la medición de las funciones celulares que tiene el primer recipiente para la medición de las funciones celulares y el reactivo capaz de determinar cuantitativamente las 15 sustancias fisiológicamente activas inducidas y además tiene el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares y el reactivo capaz de determinar cuantitativamente las sustancias fisiológicamente activas inducidas.

(Anticoagulantes preferidos)

En la presente invención, la cantidad de material capaz de inducir la 20 producción de sustancias fisiológicamente activas contenido en el anticoagulante descrito anteriormente está controlada idealmente a un nivel insuficiente para producir las sustancias fisiológicamente activas a partir de células sanguíneas cuando se mezcla con sangre. Es decir, la reducción de la cantidad de las sustancias fisiológicamente activas originalmente contenida en 25 el anticoagulante limita eficazmente la producción de estimulación innecesaria dada a la sangre recogida antes del ensayo. La producción de sustancias fisiológicamente activas en la sangre recogida debido a la acción del anticoagulante es regulada de este modo, de modo que la determinación de diversas sustancias fisiológicamente activas, la medición de las funciones 30 celulares, y la determinación de antígenos de superficie de células sanguíneas pueden realizarse de forma más precisa. Además, una muestra de sangre puede conservarse durante un periodo de tiempo prolongado desde la recogida hasta el ensayo.

De nuevo en tal caso, los materiales inductores de sustancias 35 fisiológicamente activas pueden ser los descritos anteriormente, y uno preferido en una endotoxina. El contenido aumentado de endotoxina hace que la producción de las citoquinas mencionadas anteriormente, tales como TNFα, IL-1β, IL-6 y demás, interfiera en una medición precisa. Por consiguiente, el contenido de endotoxina en el anticoagulante está regulado idealmente a un 5 nivel insuficiente para producir citoquinas, como sustancias fisiológicamente activas, en la sangre recogida.

Como será evidente a partir de los Ejemplos descritos a continuación en este documento, la producción de citoquinas, tales como TNαF, IL-1β, IL-6 y demás, es inducida posiblemente si el contenido de endotoxina en el 10 anticoagulante supera las 0,5 EU/ml en sangre reactiva. Por consiguiente, se desea regular el contenido de endotoxina en anticoagulante de modo que el contenido de endotoxina en un líquido reactivo no supere las 0,5 EU/ml.

La cantidad del anticoagulante descrito anteriormente depende de la cantidad de sangre a recoger, pero generalmente es de 0,5 - 5 mg/ml en 15 sangre, si se usa tetraacetato sódico de etilendiamina, se usa del 3 - 5% en peso en sangre, si se usa citrato sódico, y de 4 - 50 U/ml en sangre, si se usa heparina sódica.

Por consiguiente, se prefiere en la presente invención que el contenido de endotoxina en anticoagulante pueda seleccionarse adecuadamente 20 dependiendo de las cantidades respectivamente de anticoagulante y sangre recogida, de modo que el contenido de endotoxina en sangre recogida de como resultado un nivel que no supera las 0,5 EU/ml.

Por ejemplo, cuando se recoge 1 ml de sangre para examinarla, heparina sódica, si se seleccionó para su uso, se añade generalmente en una 25 cantidad de 4 - 50 U/ml, y por consiguiente el contenido de endotoxina preferida de la misma no supera las 00,125 EU/unidad de heparina, más preferentemente no supera las 0,01 EU/unidad de heparina.

Las diversas técnicas descritas en la explicación de la invención para retirar o desactivar la endotoxina, por ejemplo, puede emplearse para fabricar 30 anticoagulante que contiene una cantidad reducida de endotoxina.

Sin embargo, la inactivación de endotoxina con tratamiento con calor, ácido o álcali a veces acompaña a la desactivación de un cierto propio anticoagulante. Por consiguiente, se prefiere la ultrafiltración usando una membrana o la retirada usando un adsorbente. 35

(Medición de las funciones celulares)

La expresión “medición de las funciones celulares” como se usa en la presente invención pretende incluir un método de medición de forma directa las funciones de una célula sanguínea que puede clasificarse en un eritrocito, una plaqueta y un leucocito, un método de evaluación de las funciones celulares 5 mediante la determinación de sustancias fisiológicamente activas, y la medición de antígenos de superficie de células sanguíneas.

La medición de las funciones de la célula sanguínea que se clasifica en el eritrocito, plaqueta y leucocito mencionado anteriormente incluyen hemaglutinación, aglutinación de plaquetas, migración de leucocitos, ensayo de 10 inhibición de la migración de leucocitos, reducción de leucocitos en nitroazul de tetrazolio, actividad fagocítica de leucocitos, transformación de linfocitos, ensayo citotóxico de linfocitos, ensayo de actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos, capacidad de producción de citoquinas, ensayo de liberación de histamina y similares, por ejemplo. 15

Además, la medición de antígenos de la superficie celular se refiere a la medición de antígenos de la superficie celular mediante un ensayo de formación de roseta o citometría de flujo, e incluye la medición de receptores de Fc y diversos antígenos de CD, por ejemplo.

(Kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención) 20

El kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención tiene el primer recipiente para la medición de las funciones celulares descrito anteriormente, el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares y el reactivo como se define en la reivindicación 1.

Para medir las funciones celulares usando el kit para la medición de las 25 funciones celulares de acuerdo con la invención, el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se pone en comunicación con un recipiente para la recogida de sangre, una muestra de sangre se introduce en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, y a continuación el segundo recipiente 30 para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se agita para hacer reaccionar a las células sanguíneas con el material inductor de sustancias fisiológicamente activas.

Además, para obtener un valor de control, el recipiente para la recogida de sangre se pone en comunicación con el primer recipiente para la medición 35 de las funciones celulares de acuerdo con la invención para introducir la muestra de sangre en el primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención.

A continuación, los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares, en los que se ha introducido sangre de una manera tal 5 como se ha descrito anteriormente, se dejan reposar o se centrifugan para separar los hemocitos y los plasmas, y las sustancias fisiológicamente activas en plasmas en los recipientes respectivos para medición de las funciones celulares se determinan cuantitativamente por separado mediante el uso del primer y segundo reactivos de inmunoensayo enzimático que tiene 10 sensibilidades de medición respectivas diferentes entre sí.

La comunicación del recipiente para la recogida de sangre con los recipientes respectivos para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención puede conseguirse usando la técnica descrita anteriormente.

A medida que la temperatura de reacción de la sangre y la endotoxina 15 en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención disminuye, se produce una actividad metabólica de las células reducida, así como una inducción de citoquinas reducida. A medida que ésta aumenta, se produce la lesión celular y la inducción reducida de citoquinas. Por consiguiente, ésta es preferentemente de 26 - 45ºC, más 20 preferentemente de 30 - 42ºC.

En vista de la producción eficaz de citoquinas y la prevención de hemólisis excesiva, el periodo de reacción de la sangre y la endotoxina es preferentemente de 1 - 12 horas, más preferentemente de 2 - 6 horas.

En el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la 25 presente invención, las sustancias fisiológicamente activas en la sangre recogida en el recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, es decir, las sustancias fisiológicamente activas producidas en la sangre debido a su reacción con el material inductor de sustancias fisiológicamente activas se determina cuantitativamente mediante el 30 segundo reactivo de inmunoensayo enzimático. Las sustancias fisiológicamente activas producidas en sangre, debido no a su reacción con el material inductor de sustancias fisiológicamente activas se determinan cuantitativamente mediante el primer reactivo de inmunoensayo enzimático. El diferencial resultante permite la determinación de la producción exacta de 35 sustancias fisiológicamente activas inducidas por el material inductor de sustancias fisiológicamente activas.

Generalmente, la cantidad de citoquinas en sangre (la cantidad de citoquinas en sangre recogida en el primer recipiente para la medición de las funciones celulares) antes de su reacción con endotoxina es de varios pg/ml - 5 varios cientos de pg/ml, y la cantidad de citoquinas en sangre después de su reacción con endotoxina varía entre varios cientos de pg/ml y varios miles de pg/ml o superior.

Sin embargo, no existe ningún reactivo tal que tiene una sensibilidad de medición suficiente para cuantificar citoquinas en un amplio intervalo de varios 10 pg/ml - varios miles de pg/ml. Por consiguiente, para la determinación de citoquinas en una cantidad de 1.000 pg/ml o superior, se diluyeron plasmas con una solución de dilución adecuada. Sin embargo, la operación de dilución de plasmas es complicada, requiere por separado la solución de dilución y un recipiente de dilución, y por consiguiente conduce a un periodo de medición 15 marcadamente prolongado. Además, el valor medido se obtiene multiplicando los grados de dilución, lo que plantea el problema de reducir la exactitud del valor medido.

Por el contrario, de acuerdo con la invención, la cantidad de citoquinas en sangre (es decir, la cantidad de citoquinas en sangre recogida en el primer 20 recipiente para la medición de las funciones celulares) antes de su reacción con endotoxina puede determinarse mediante el primer reactivo de inmunoensayo enzimático de alta sensibilidad, tal como de una sensibilidad de medición de 10 - 1.000 pg/ml, mientras que la cantidad de citoquinas en sangre (es decir, la cantidad de citoquinas en sangre recogida en el segundo recipiente 25 para la medición de las funciones celulares) después de su reacción con endotoxina puede determinarse mediante el segundo reactivo de inmunoensayo enzimático de baja sensibilidad, tal como de una sensibilidad de medición de 500 - 10.000 pg/ml. De este modo, puede eliminarse la complicada operación de dilución descrita anteriormente. 30

Además, si la citoquina descrita anteriormente está constituida por TNFα o IL-β, la sensibilidad preferida del primer reactivo de inmunoensayo enzimático es de 10 - 500 pg/ml y la del segundo reactivo de inmunoensayo enzimático es de 500 - 10,000 pg/ml, si es IL-6, la sensibilidad preferida del primer reactivo de inmunoensayo enzimático es de 10 - 1.000 pg/ml y la del segundo reactivo de 35 inmunoensayo enzimático es de 1.000 - 20.000 pg/ml.

Cada uno de los primer y segundo reactivos de inmunoensayo descritos anteriormente se compone de un anticuerpo monoclonal o policlonal contra sus citoquinas objetivo, enzimas tales como peroxidases o fosfatasas alcalinas, y sustratos cromóforos en enzimas respectivas. El inmunoensayo enzimático 5 “sándwich”, en el que el anticuerpo monoclonal contra sus citoquinas objetivo está prefijado en una superficie sólida como la de una microplaca, se prefiere, dado que no requiere la fijación antes de la medición y tiene una reproductibilidad excelente.

Una técnica de fijar los anticuerpos monoclonales sobre las superficies 10 sólidas puede seleccionarse arbitrariamente entre la técnica de adsorción física o enlace químico conocida, pero se prefiere la adsorción física por su funcionamiento sencillo.

La preparación de los primer y segundo reactivos de inmunoensayo enzimático que tienen diferentes sensibilidades puede realizarse ajustando 15 selectivamente concentraciones respectivamente de anticuerpos monoclonales o policlonales contra las citoquinas objetivo, enzimas tales como peroxidasas o fosfatasas alcalinas, y sustratos cromóforos en enzimas respectivas.

Por ejemplo, en el caso en el que se emplea el inmunoensayo enzimático “sándwich”, la cantidad del anticuerpo monoclonal mencionado 20 anteriormente contra sus citoquinas objetivo para la fijación sobre la microplaca puede ajustarse, de modo que pueden prepararse los primer y segundo reactivos de inmunoensayo enzimático que tienen diferentes sensibilidades. Es decir, la cantidad de citoquinas objetivo que pueden unirse a los anticuerpos monoclonales cambia dependiendo de la cantidad de anticuerpo monoclonal 25 fijado en la superficie de la microplaca, lo que permite la preparación de reactivos que tienen diferentes sensibilidades de medición.

Dichas diferentes sensibilidades de medición también pueden conseguirse preparando diferentes concentraciones de anticuerpo monoclonal marcado con enzima o anticuerpo policlonal marcado con enzima contra sus 30 citoquinas objetivo, que difieren de las citoquinas objetivo del anticuerpo monoclonal fijado, como reactivo para detectar citoquinas unidas al anticuerpo monoclonal fijado.

También existe un método en el que un modo de unión específico tal como avidina-biotina se incorpora en el sistema de inmunoensayo enzimático 35 descrito anteriormente, por ejemplo un método en el que se usa anticuerpo marcado con biotina o/y enzima marcada con avidina como una alternativa al anticuerpo marcado con enzima contra su citoquina objetivo que difiere de las citoquinas objetivo del anticuerpo monoclonal fijado.

Una preparación ejemplar de las microplacas con anticuerpo monoclonal 5 fijado se explicará a continuación, que puede emplearse para los presentes primer y segundo reactivos de inmunoensayo enzimático que tienen diferentes sensibilidades de medición.

En primer lugar, El anticuerpo monoclonal específico contra sus citoquinas objetivo se disuelve en una solución tampón, tal como tampón 10 fosfato, para preparar dos tipos de soluciones diluidas de niveles de concentración diferentes entre sí (cada nivel de concentración preparado se selecciona adecuadamente dependiendo de la magnitud de la constante de unión del anticuerpo monoclonal empleado y sus citoquinas objetivo).

Cada uno de los dos tipos de soluciones con anticuerpo monoclonal 15 disuelto se añade en una cantidad dada a una microplaca para incubación a 2 - 8ºC durante un día y una noche. Posteriormente al lavado con un tampón de lavado de pH neutro que contiene un tensioactivo no iónico tal como Tween 20, se añade una cantidad dada de solución de tampón fosfato con albúmina de suero bovino al 1 - 4% en peso disuelta, a la microplaca para la incubación a 20 37ºC durante 2 horas. Después de la retirada de los líquidos de la microplaca, ésta se seca a temperatura ambiente.

Una realización de medición de las funciones celulares usando el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención se explicará a continuación en detalle. 25

En primer lugar, se introduce sangre en cada uno de los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares para una incubación a 37ºC durante 4 horas. Cada recipiente se centrifuga a 1.600 G para permitir que los hemocitos y los plasmas se separen. A continuación, los plasmas separados se añaden a los pocillos de respectivas microplacas a las 30 que el anticuerpo monoclonal contra sus citoquinas objetivo ha sido fijado en dos niveles de concentración diferentes, que han sido bloqueados en sitios no adsorbidos por las albúminas de suero bovino, y que se han secado, para reacción a 37ºC durante 2 horas. A continuación, la solución de plasma después de la reacción se desecha por medio de retirada por succión y 35 similares, seguida de lavado de los pocillos con un tampón de lavado de pH neutro que contiene un tensioactivo no iónico tal como Tween 20 para retirar adicionalmente los componentes que no reaccionaron. Seguidamente, el anticuerpo policlonal fijado a peroxidasa de rábano rusticano contra las citoquinas especificadas anteriormente se añade a los pocillos para reacción a 5 37ºC durante 1 hora. Para retirar la parte que no reaccionó de anticuerpo policlonal fijado a peroxidasa de rábano rusticano, los pocillos se lavan con el tampón de lavado mencionado anteriormente, y seguidamente una solución de sustrato que contiene peróxido de hidrógeno y tetrametilbenzidina se añade a los pocillos para reacción durante 5 - 10 minutos. A continuación se añade una 10 solución de ácido sulfúrico 2 M, la reacción se interrumpe, y un color producido en el sustrato como resultado de la reacción enzimática se mide a partir de absorbancia a 450 nm. La comparación del valor medido con una curva de calibrado preparada contra las citoquinas especificadas anteriormente de una concentración conocida determina cuantitativamente las citoquinas en sangre 15 según se traten en cada uno de los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares.

(Método para la medición de las funciones celulares)

El método para la medición de las funciones celulares se caracteriza por introducir sangre en el primer o segundo recipiente para la medición de las 20 funciones celulares y medir las funciones celulares. En este caso, el recipiente para la medición de las funciones celulares preferentemente aloja, por adelantado, el anticoagulante especificado anteriormente que contiene endotoxina en una concentración tan limitada como para no inducir a las células sanguíneas para que produzcan sustancias fisiológicamente activas 25 cuando se mezcla con la sangre.

Una realización del método para la medición de las funciones celulares se explica a continuación.

El anticoagulante, por ejemplo heparina sódica está alojado en un inyector que tiene una aguja para la recogida de sangre en una cantidad típica 30 de 10 U/ml por sangre a recoger, antes de que la sangre se recoja de una persona examinada en el interior del inyector.

Como alternativa, el anticoagulante puede alojarse en un tubo para la recogida de sangre al vacío en la misma cantidad que anteriormente antes de realizar la recogida de sangre. A continuación, esta sangre se centrifuga a 35 1.600 G, y la cantidad de TNFα, como ilustrativa de la sustancia fisiológicamente activa producida a partir de células sanguíneas, en plasma se determina usando el inmunoensayo enzimático.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos 5 en los Ejemplos 1 - 4 y los Ejemplos Comparativos 2 - 4, en el que el eje de abscisas indica la concentración de LPS y el de ordenadas indica la cantidad de TNFα inducido.

La figura 2 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos en los Ejemplos 1 - 4 y los Ejemplos Comparativos 2 - 4, en el que el eje 10 de abscisas indica la concentración de LPS y el de ordenadas indica la cantidad de IL-1β inducida.

La figura 3 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos en los Ejemplos 1 - 4 y los Ejemplos Comparativos 2 - 4, en el que el eje de abscisas indica la concentración de LPS y el de ordenadas indica la 15 cantidad de IL-6 inducida.

La figura 4 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos en los Ejemplos 5 - 10, en el que el eje de abscisas indica la concentración de LPS y el de ordenadas indica la cantidad de TNFα o IL-1β inducida. 20

La figura 5 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos en los Ejemplos 11 - 16, en el que el eje de abscisas indica la temperatura de reacción y el de ordenadas indica la cantidad de TNFα o IL-1β inducida.

La figura 6 es un gráfico que muestra resultados de medición obtenidos 25 en los Ejemplos 17 - 21, en el que el eje de abscisas indica el tiempo de reacción y el de ordenadas indica la cantidad de TNFα o IL-1β inducida.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La presente invención se explicará a continuación en detalle citando Ejemplos de la presente invención y Ejemplos Comparativos. Los Ejemplos de 30 Referencia no están dentro del alcance de la reivindicación 1.

Ejemplos 1 - 4 (Referencia), Ejemplos Comparativos 1 - 4

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares:

Un tubo para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) 35 hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) que contiene heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) a la concentración de 200 U/ml se añadió al tubo para la 5 recogida de sangre.

La endotoxina obtenida de la ceba UKT-B de E. coli (lote de producto estándar 8920 de la Farmacopea Japonesa) se disolvió en una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) para la posterior dilución por etapas. Una vez completada cada etapa de dilución, 0,05 ml de la 10 solución salina con endotoxina disuelta resultante se añaden a cada dos de los tubos para la recogida de sangre con heparina incorporada, de modo que se prepararon los tubos para la recogida de sangre que contenían respectivamente endotoxina en concentraciones de 0 EU/ml (Ejemplo Comparativo 1), 1 EU/ml (Ejemplo Comparativo 2), 2 EU/ml (Ejemplo 15 Comparativo 3), 5 EU/ml (Ejemplo Comparativo 4), 10 EU/ml (Ejemplo 1), 20 EU/ml (Ejemplo 2), 50 EU/ml (Ejemplo 3) y 100 EU/ml (Ejemplo ) para una solución completa que suma la solución salina fisiológica con heparina disuelta y la solución salina fisiológica con endotoxina disuelta.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para 20 encajar en el tubo y se había lavado previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el 25 interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre preparados de este modo se emplearon como los recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 1 - 4 y los Ejemplos Comparativos 1 - 4, 30 respectivamente.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (Recipientes):

El agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se introdujo en un inyector con una aguja. La aguja del inyector se clavó en el 35 tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina en solitario, para inyectar 0,9 ml del agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) en cada uno de los tubos para la recogida de sangre, seguido de agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer 5 la endotoxina. A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído se determinó mediante una técnica de sustrato cromóforo sintetizado usando un kit para la determinación de endotoxina, ENDOSPECIE ES6 (nombre del producto) fabricado por Seikagaku Kogyo Co.

Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido 10 extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre ensayados.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα, IL-1β e IL-6

Usando un inyector con una aguja, se recogió sangre heparinizada de un voluntario habitualmente sano. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho 15 de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían endotoxina a diversas concentraciones, para inyectar 0,9 ml de la muestra de sangre recogida en cada uno de los tubos para la recogida de sangre. A continuación, cada uno de los tubos para la recogida de sangre se montó en 20 una plataforma agitadora para mezclado por volteo en una cámara termostática precalentada a una temperatura de 37ºC para un posterior mezclado por volteo durante 4 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo para la recogida de sangre se centrifugó a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante. En el plasma recogido se determinó el 25 contenido de citoquinas (pg/ml), es decir, contenido respectivo de TNFα, IL-1β e IL-6, usando un kit de inmunoensayo enzimático que utilizaba anticuerpos monoclonales respectivos contra ellas.

Se emplearon los kits PREDICTA Human TNF-α ELISA KIT (límite de detección: 35 pg/ml), PREDICTA Human IL-1β ELISA KIT (límite de detección: 30 15 pg/ml) y PREDICTA Human IL-6 ELISA KIT (límite de detección: 35 pg/ml) (todos fabricados por Genzyme Inc.) para determinar las producciones en peso de TNFα, IL-1β e IL-6, respectivamente. La determinación se realizó usando n = 3 para cada una. Los resultados se muestran en las figuras 1 - 3.

En todas las figuras, la unidad EU/ml usada para la concentración de 35 LPS en el eje de abscisas indica la concentración de endotoxina en una solución completa cuando está en contacto con la sangre, y la cantidad inducida (pg/ml) en el eje de ordenadas indica un valor promedio de los valores obtenidos de los dos tubos para la recogida de sangre para cada concentración de citoquinas en plasma. Como es evidente a partir de los resultados, la 5 endotoxina a una concentración de 0,6 EU/ml o superior induce claramente las producciones de TNFα, IL-1β e IL-6. Los resultados del caso en el que la concentración de endotoxina era de 0 EU/ml (Ejemplo Comparativo 1) no se muestran en las figuras 1 - 3, dado que, en este caso, la concentración de cada citoquina producida estaba por debajo del límite de detección en la 10 determinación de la misma.

EJEMPLOS 5 - 10 (Referencia)

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares:

Un tubo para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) 15 hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) que contenía heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) a una concentración de 200 U/ml se añadieron al tubo. 20

La endotoxina obtenida de la cepa 055:B5 de E. coli (fabricada por LBL corp.) se disolvió en una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) para la posterior dilución por etapas. Una vez completada cada etapa de dilución, 0,05 ml de la solución salina con endotoxina disuelta resultante se añaden a cada dos de los tubos para la 25 recogida de sangre con heparina incorporada, de modo que se prepararon los tubos para la recogida de sangre que contenían respectivamente endotoxina en concentraciones de 8 EU/ml (Ejemplo 5), 80 EU/ml (Ejemplo 6), 800 EU/ml (Ejemplo 7), 8.000 EU/ml (Ejemplo 8), 80.000 EU/ml (Ejemplo 9) y 800.000 EU/ml (Ejemplo 10) para una solución completa que suma la solución salina 30 fisiológica con heparina disuelta y la solución salina fisiológica con endotoxina disuelta.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para encajar en el tubo y se había lavado bien previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una 35 abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente 5 mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre preparados de este modo se emplearon como los recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 5 - 10, respectivamente.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (Recipientes): 10

El agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se introdujo en un inyector con una aguja. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina en solitario, para inyectar 0,9 ml del agua libre de 15 endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) en cada uno de los tubos para la recogida de sangre, seguido de agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído se determinó mediante una técnica de sustrato cromóforo sintetizado usando un kit para la determinación de endotoxina, ENDOSPECIE ES6 (nombre del 20 producto) fabricado por Seikagaku Kogyo Co.

Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre ensayados.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα e IL-1β: 25

Usando un inyector con una aguja, se recogió sangre heparinizada de un voluntario habitualmente sano. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían endotoxina a diversas concentraciones, para inyectar 0,9 ml de la muestra de 30 sangre recogida en cada uno de los tubos para la recogida de sangre. A continuación, cada uno de los tubos para la recogida de sangre se montó en una plataforma agitadora para mezclado por volteo en una cámara termostática precalentada a una temperatura de 37ºC para un posterior mezclado por volteo durante 4 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo para la 35 recogida de sangre se centrifugó a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante. En el plasma recogido se determinó el contenido (pg/ml) de TNFα e IL-1β de la misma manera que la empleada en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la figura 4. En la figura 4, la unidad EU/ml 5 usada para la concentración de LPS en el eje de abscisas indica la concentración de endotoxina en sangre (en una solución completa) cuando está en contacto con la sangre, y la cantidad inducida (pg/ml) en el eje de ordenadas indica un valor promedio de los valores obtenidos de los dos tubos para la recogida de sangre para cada una de las concentraciones de TNFα e 10 IL-1β en plasma. Como es evidente a partir de los resultados, la concentración de endotoxina en el intervalo de 0,8 - 80.000 EU/ml induce producciones de TNFα y IL-1β. Además, cuando la concentración de endotoxina está en el intervalo de 8 - 800 EU/ml, las cantidades de TNFα y IL-1β inducidas se indican como que ambas aumentan lentamente. Cuando la concentración de 15 endotoxina alcanza las 8.000 EU/ml, las cantidades de TNFα e IL-1β inducidas ambas indicaban un aumento adicional. Sin embargo, cuando la concentración de endotoxina alcanza las 80.000 EU/ml, las cantidades de TNFα e IL-1β inducidas se vuelven cada una más pequeña que cuando la concentración de endotoxina es de 8.000 EU/ml. 20

El uso de endotoxina, como ilustrativo del material inductor de endotoxina, en el intervalo de 10 - 200 µg/ml (aproximadamente 80.000 - 200.0000 EU/ml convertido a la concentración de endotoxina) ya se ha descrito en el boletín de la Patente Abierta a Inspección pública Nº Hei 1-503331. Sin embargo, la presente invención permite el uso de endotoxina a 25 concentraciones más bajas, de modo que la inducción de citoquinas mediante mecanismos plurales no se produce, lo que se cree que es debido a una mayor concentración de endotoxina. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, se vuelve posible inducir citoquinas que reflejen de forma precisa las morbilidades del paciente. 30

EJEMPLOS 11 - 16 (Referencia)

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares:

Cada uno de los tubos para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de 35 agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) que contenía heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) a una concentración de 200 U/ml se añadieron a cada tubo. 5

La endotoxina obtenida de la cepa 055:B5 de E. coli (fabricada por LBL corp.) se disolvió en una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) a una concentración de 1.600 EU/ml. 0,05 ml de la solución salina con endotoxina disuelta resultante se añadieron a cada uno de los tubos para la recogida de sangre con heparina incorporada preparados 10 anteriormente.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para encajar en el tubo y se había lavado bien previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar 15 herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre preparados de este 20 modo se emplearon como los recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 11 - 16, respectivamente.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en Los tubos para la recogida de sangre (Recipientes):

El agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se 25 introdujo en un inyector con una aguja. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina en solitario, para inyectar 0,9 ml del agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) en cada uno de los tubos para 30 la recogida de sangre, seguido de agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído se determinó mediante una técnica de sustrato cromóforo sintetizado usando un kit para la determinación de endotoxina, ENDOSPECIE ES6 (nombre del producto) fabricado por Seikagaku Kogyo Co. 35

Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre ensayados.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα e IL-1β:

Usando un inyector con una aguja, se recogió sangre heparinizada de un 5 voluntario habitualmente sano. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1), para inyectar 0,9 ml de la muestra de sangre recogida en cada uno de los tubos para la recogida de sangre. A continuación, dos de los tubos para la recogida de 10 sangre en los que la muestra de sangre se había recogido se montaron en cada una de las plataformas agitadoras para mezclado por volteo respectivamente precalentada a una temperatura de 25ºC (Ejemplo 11), 30ºC (Ejemplo 12), 33ºC (Ejemplo 13), 37ºC (Ejemplo 14), 40ºC (Ejemplo 15) y 45ºC (Ejemplo 16) en una cámara termostática para un posterior mezclado por volteo 15 durante 4 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo para la recogida de sangre se centrifugó a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante. En el plasma recogido se determinó el contenido (pg/ml) de TNFα e IL-1β de la misma manera que la empleada en el Ejemplo 1. 20

Los resultados se muestran en la figura 5. En la figura 5, la temperatura de reacción en el eje de abscisas indica la temperatura a la que se ajustó la cámara termostática, y la cantidad inducida (pg/ml) en el eje de ordenadas indica un valor promedio de los valores obtenidos de los dos tubos para la recogida de sangre para cada una de las concentraciones de TNFα e IL-1β 25 beta en plasma.

EJEMPLOS 17 - 21 (Referencia)

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares:

Cada uno de los tubos para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm 30 de diámetro) hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) que contenía heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) a una concentración de 200 U/ml se añadieron 35 a cada tubo.

La endotoxina obtenida de la cepa 055:B5 de E. coli (fabricada por LBL corp.) se disolvió en una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) a una concentración de 1.600 EU/ml. 0,05 ml de la solución salina con endotoxina disuelta resultante se añadieron a cada uno de 5 los tubos para la recogida de sangre con heparina incorporada preparados anteriormente.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para encajar en el tubo y se había lavado bien previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una 10 abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente 15 mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre preparados de este modo se emplearon como los recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 17 - 21, respectivamente.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (recipientes): 20

El agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se introdujo en un inyector con una aguja. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina en solitario, para inyectar 0,9 ml del agua libre de 25 endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) en cada uno de los tubos para la recogida de sangre, seguido de agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído se determinó mediante una técnica de sustrato cromóforo sintetizado usando un kit para la determinación de endotoxina, ENDOSPECIE ES6 (nombre del 30 producto) fabricado por Seikagaku Kogyo Co.

Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre ensayados.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα e IL-1β: 35

Usando un inyector con una aguja, se recogió sangre heparinizada de un voluntario habitualmente sano. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los 12 tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1), para inyectar 0,9 ml de la muestra de sangre recogida en cada uno de los tubos para la 5 recogida de sangre. A continuación, los tubos para la recogida de sangre en los que la muestra de sangre se había recogido se montaron en una plataforma agitadora para mezclado por volteo precalentada a una temperatura de 37ºC en una cámara termostática para un posterior mezclado por volteo durante 30 minutos (Ejemplo 17), 2 horas (Ejemplo 18), 4 horas (Ejemplo 19), 6 horas 10 (Ejemplo 20), y 24 horas (Ejemplo 21), respectivamente. En los anteriores Ejemplos, dos tubos para la recogida de sangre para cada Ejemplo se sometieron a mezclado por volteo durante el periodo de tiempo respectivo especificado anteriormente. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo para la recogida de sangre se centrifugó a 3.000 rpm a 4ºC durante 10 minutos 15 para recoger un plasma sobrenadante. En el plasma recogido se determinó el contenido (pg/ml) de TNFα e IL-1β de la misma manera que en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la figura 6. En la figura 6, el tiempo de reacción en el eje de abscisas indica el periodo de tiempo durante el cual se realizó el mezclado por volteo descrito anteriormente, y la cantidad inducida 20 (pg/ml) en el eje de ordenadas indica un valor promedio de los valores obtenidos de los dos tubos para la recogida de sangre para cada una de las concentraciones de TNFα e IL-1β en plasma.

EJEMPLO 22 (Referencia)

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones 25 celulares:

Cada uno de los tubos para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de una solución salina fisiológica para inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) 30 que contenía heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) a una concentración de 200 U/ml se añadieron a cada tubo.

A continuación, fitohemaglutinina-P esterilizada (PHA-P) (fabricada por Sigma Chemical Co.) se disolvió en una solución salina fisiológica para 35 inyección (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). 0,05 ml de la solución salina fisiológica resultante se añadieron a cada uno de los tubos para la recogida de sangre con heparina incorporada preparados anteriormente, de modo que cada tubo para la recogida de sangre contenía PHA-P en concentraciones de 100 µg/ml para una solución completa que suma la solución salina fisiológica con 5 heparina sódica disuelta y la solución salina fisiológica con PHA-P disuelta.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para encajar en el tubo y se había lavado bien previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar 10 herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío 15 preparados de este modo se emplearon respectivamente para el recipiente para la medición de las funciones celulares.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (Recipientes):

El agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se 20 introdujo en un inyector con una aguja. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina y PHA-P, para inyectar 0,9 ml del agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) en cada uno de los tubos para 25 la recogida de sangre, seguido de agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los cuatro tubos para la recogida de sangre 30 ensayados.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα, IL-1β e IL-6:

Las actividades de inducción de TNFα, IL-1β e IL-6 se determinaron de la misma manera que en (3) del Ejemplo 1, excepto que se emplearon los 35 tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío obtenidos en el anterior (1) que contenían heparina y PHA-P, en lugar de emplear los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que se obtuvieron en (3) del Ejemplo 1 que contenían endotoxina a diversas concentraciones.

EJEMPLO COMPARATIVO 5 5

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares:

Los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que contenían heparina y PHA-P se fabricaron de la misma manera que en el Ejemplo 22 (1) para emplearlos como los recipientes para la medición de las funciones 10 celulares, excepto que los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) hechos de polietilen tereftalato, diferentes de los empleados en el Ejemplo 22, se emplearon en lugar de los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) hechos de polietilen tereftalato como se empleaban en el Ejemplo 22. 15

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (Recipientes):

El contenido de endotoxina en cada tubo para la recogida de sangre se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 22 (2), excepto que se emplearon los cuatro tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío que 20 se obtuvieron en el anterior (1) que contenían heparina y PHA-P. Los resultados indicaban el contenido de endotoxina en los líquidos extraídos respectivamente en los cuatro tubos para la recogida de sangre ensayados que eran 0,65 EU/ml, 0,74 EU/ml, 0,58 EU/ml y 0,62 EU/ml, respectivamente.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα, IL-1β e IL-25 6:

Las actividades de inducción de TNFα, IL-1β e IL-6 se determinaron de la misma manera que en (3) del Ejemplo 22, excepto que se emplearon 10 de los tubos para la recogida de sangre sometidos al vacío obtenidos en el anterior (1) que contenían heparina y PHA-P, en lugar de emplear los tubos 30 para la recogida de sangre sometidos al vacío preparados en (3) del Ejemplo 22 que contenían heparina y PHA-P. Los resultados se muestran en las Tablas 1 - 3.

Tabla 1

Ej. 22 Ej. Comp. 5

Nivel de TNFα inducido (pg/ml)

Tubo para la recogida de sangre Nº 1 452,8 684,5

2

420,5 790,5

3

468,5 948,6

4

440,2 664,5

5

495,6 895,3

6

462,8 980,5

7

442,1 728,6

8

432,8 894,2

9

489,2 925,1

10

438,8 696

Valor medio (pg/ml)

454,33 820,78

SD* (pg/ml)

24,5 120,9

CV* (96)

5,4 14,7

* SD = Desviación Estándar CV = Coeficiente de variación

Tabla 2

Ej. 22 Ej. Comp. 5

Nivel de IL-1β inducida (pg/ml)

Tubo para la recogida de sangre Nº 1 274,6 496,3

2

254,5 582,1

3

268,4 396,1

4

252,4 557,9

5

236,8 689,3

6

257,1 325,6

7

249,6 445,8

8

262,8 625,4

9

257,1 322,4

10

244,6 555,8

Valor medio (pg/ml)

255,79 499,72

SD* (pg/ml)

11,1 124,9

CV* (96)

4,3 25,0

* SD = Desviación Estándar

CV = Coeficiente de variación

Tabla 3

Ej. 22 Ej. Comp. 5

Nivel de IL-6 inducida (pg/ml)

Tubo para la recogida de sangre Nº 1 6820 8820

2

6930 12520

3

6240 9630

4

7150 13050

5

6420 9420

6

6390 8420

7

6930 7430

8

6520 12490

9

6480 10060

10

6610 9420

Valor medio (pg/ml)

6654 10126

SD* (pg/ml)

300 1910

CV* (96)

4,5 18,9

* SD = Desviación Estándar CV = Coeficiente de variación

Como puede observarse a partir de las Tablas 1 - 3, el empleo de recipientes para la medición de las funciones celulares, que contienen 5 endotoxina en concentraciones que no superan las 0,5 EU/ml por líquido extraído, proporcionaban una mejor reproductibilidad.

EJEMPLOS 23 - 30 (Referencia)

(1) Método para fabricar un recipiente para la medición de las funciones celulares: 10

Cada uno de los tubos para la recogida de sangre de 4 ml (12,6 x 75 mm de diámetro) hecho de polietilen tereftalato se lavó bien 10 veces con 4 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.). Heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: Novo.Heparin # 1000) y PHA-L (fabricada por Sigma Chemical Co.) se disolvieron en una 15 solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) para preparar soluciones salinas fisiológicas que contenían 40 U/ml de heparina sódica y PHA-L a la concentración mostrada en la Tabla 4, respectivamente. 1 ml de las respectivas soluciones salinas fisiológicas se añadió a dos respectivos de los tubos para la recogida de sangre que se habían lavado anteriormente.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que se configuró para encajar en el tubo y se había lavado bien previamente con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.), se colocó superpuesto en una 5 abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente al vacío. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo gradualmente a una presión de 570 mm de Hg, la abertura de cada tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente 10 mediante el tapón. Los tubos para la recogida de sangre preparados de este modo se emplearon como los recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 23 - 30, respectivamente.

(2) Determinación del contenido de endotoxina en los tubos para la recogida de sangre (Recipientes): 15

1 ml de agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se introdujo en algunos respectivos (8 en total) de los recipientes para la medición de las funciones celulares que se obtuvieron en el anterior (1) que contenían diversas concentraciones de PHA-L para una posterior agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. A continuación, el contenido de 20 endotoxina en cada líquido extraído se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 1. Los resultados indicaban que el contenido de endotoxina en el líquido extraído no era mayor de 0,05 EU/ml para cada uno de los recipientes para la medición de las funciones celulares.

(3) Métodos para determinar las actividades de inducción de TNFα e IL-1β: 25

Usando un inyector con una aguja, se recogió sangre heparinizada de un voluntario habitualmente sano. La aguja del inyector se clavó en el tapón hecho de goma de butilo, colocado sobre cada uno de los recipientes para la medición de las funciones celulares de los Ejemplos 23 - 30 respectivamente obtenidos en el anterior (1), para inyectar 1,0 ml de la muestra de sangre recogida en 30 cada uno de los tubos para la recogida de sangre. A continuación, cada uno de los tubos para la recogida de sangre se montó en una plataforma agitadora para mezclado por volteo en una cámara termostática precalentada a una temperatura de 37ºC para un posterior mezclado por volteo durante 2 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada recipiente se centrifugó a 1.600 35 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante. En el plasma recogido se determinó el contenido (pg/ml) de TNFα e IL-1β de la misma manera que en (3) del Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

5

Tabla 4

Inductor y su concentración (µg/ml) Producción de citoquinas (pg/ml)

PHA-L

PHA-P TNFα IL-1β

Ej.

23 0,02 - 5

24

0,2 - 70 80

25

2 - 2178 403

26

10 - 2864 563

27

50 - 2956 567

28

100 - 2431 432

29

200 - 2250 425

30

500 - 153

31

- 0,2 25

32

- 2 63

33

- 10 164

34

- 50 496

EJEMPLOS 31 - 34 (Referencia)

El procedimiento puesto en práctica en el Ejemplo 23 se repitió para determinar cuantitativamente los TNFα e IL-1β producidos, excepto que se usó 10 PHA-P (fabricada por Sigma chemical Co.) a la concentración mostrada en la Tabla 4, en lugar de usar PHA-L como en el Ejemplo 23. Los resultados se muestran en la Tabla 4. El contenido de endotoxina en los líquidos, que se extrajeron respectivamente en recipientes para la medición de las funciones celulares en los Ejemplos 31 - 34 de la misma manera que se realizó en (2) del 15 Ejemplo 23, no eran superiores a 0,05 EU/ml.

EJEMPLO 35 (Referencia) Y EJEMPLO COMPARATIVO 6

Un tubo para la recogida de sangre al vacío disponible en el mercado, es decir un tubo para la recogida de sangre libre de LPS (fabricado por Sekisui chem. Ind. Co.: provisto de especificación de no LPS) se empleó como el 20 recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la primera invención (Ejemplo 35). Además, otro tubo para la recogida de sangre al vacío disponible en el mercado, es decir un tubo para la recogida de sangre (no provisto de especificación de no LPS) fabricado por la compañía A se empleó como tubo para la recogida de sangre comparativo (Ejemplo 5 Comparativo 6).

Para cada Ejemplo, se recogió sangre al vacío de un ser humano habitualmente sano (misma persona) en cinco tubos para la recogida de sangre (1 ml cada uno). Cada tubo para la recogida de sangre se almacenó a 20ºC durante 2 horas, y a continuación se centrifugó a 4ºC (1.600 G, 10 minutos) 10 para la posterior recogida del plasma. La cantidad de TNFα en el plasma recogido se determinó usando un producto llamado "PREDICTA Human TNFα ELISA KIT" fabricado por Genzyme Inc. Los valores determinados se promediaron para obtener un valor final para cada Ejemplo. Los resultados indicaban que la concentración de TNF-α determinada para el Ejemplo 35 no 15 era superior a 15 pg/ml, es decir, un límite de detección, mientras que para el Ejemplo Comparativo 6 era de 51 pg/ml.

Los tubos para la recogida de sangre separados del mismo lote que los tubos para la recogida de sangre libres de LPS para su uso en el Ejemplo 35 y aquellos del mismo lote que los tubos para la recogida de sangre fabricados 20 por la compañía A para su uso en el Ejemplo Comparativo 6 se determinó respectivamente su contenido de endotoxina de la siguiente manera. 1 ml de un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) se añadió a cada uno de los tubos para la recogida de sangre especificados anteriormente para una posterior agitación a 37ºC durante 1 hora para extraer la endotoxina. 25 A continuación, el contenido de endotoxina en el líquido extraído en cada tubo se determinó de la misma manera que en el Ejemplo 1. Como resultado, los contenidos de endotoxina determinados eran de 0,03 EU/ml en el tubo de recogida para su uso en el Ejemplo 35 y 958 EU/ml en el tubo de recogida para su uso en el Ejemplo Comparativo 6. 30

Como es evidente a partir de lo anterior, en la determinación de la concentración de TNFα en sangre, a menos que la sangre se recoja usando el recipiente para la recogida de sangre en el que la cantidad de endotoxina, cuando se extrae recogiendo agua libre de endotoxina un volumen igual al volumen de líquido que se someterá a medición, se traduce en un nivel 35 insuficiente para inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas, la sangre reacciona con LPS en el recipiente para la recogida de sangre para producir (inducir) las sustancias fisiológicamente activas tales como TNFα, así como someterse a estimulación innecesaria para cambiar gradualmente sus propiedades, y como resultado de 5 lo mismo la determinación precisa de la concentración de TNFα en sangre per se es obstaculizada.

EJEMPLO 36 (Referencia) Y EJEMPLOS COMPARATIVOS 7 - 9

Una solución de LPS a una concentración de 120 ng/ml, como estimulador, se distribuye en 5 tubos para la recogida de sangre para su uso en 10 el Ejemplo 35, 5 tubos para la recogida de sangre para su uso en el Ejemplo Comparativo 6, 5 tubos para la recogida de sangre al vacío que incorporaban heparina disponibles en el mercado fabricados por la compañía B y 5 tubos para la recogida de sangre al vacío que incorporaban heparina disponibles en el mercado fabricados por la compañía C, es decir 50 µl de la solución de LPS 15 para cada tubo para la recogida de sangre, para preparar reactores para hacer reaccionar a LPS con la sangre para inducir citoquinas. Los reactores preparados usando los tubos para la recogida de sangre del Ejemplo 35 se asignaron al Ejemplo 36, y los del Ejemplo Comparativo 6 al Ejemplo Comparativo 7, respectivamente. Los reactores preparados usando los tubos 20 para la recogida de sangre fabricados por la compañía B se asignaron al Ejemplo Comparativo 8, y aquellos por la compañía C al Ejemplo Comparativo 9. Entre tanto, en los tubos para la recogida de sangre separados del mismo lote que los tubos para la recogida de sangre fabricados por la compañía B a partir de los cuales se prepararon los reactores del Ejemplo Comparativo 8, se 25 determinó por separado su contenido de endotoxina de la misma manera que en el Ejemplo 35. Del mismo modo, en los tubos para la recogida de sangre separados del mismo lote que los tubos para la recogida de sangre fabricados por la compañía C a partir de los cuales se prepararon los reactores del Ejemplo Comparativo 9, se determinó por separado el contenido de endotoxina 30 de la misma manera que en el Ejemplo 35. Los resultados indicaban que los tubos para la recogida de sangre fabricados respectivamente por las compañías B y C, para el uso respectivo en los Ejemplos Comparativos 8 y 9, contenían endotoxina en concentraciones de 10 EU/ml y 389 EU/ml, respectivamente. 35

6 ml en total de sangre del corazón se recogieron de 5 ratones macho, de 8 - 10 semanas de edad usando un inyector para la posterior inyección en un recipiente para la recogida de sangre idéntico a los usados en el Ejemplo 35.

El inyector se había empapado previamente en una solución acuosa 0,2 5 M de hidróxido sódico durante una noche para desactivar la endotoxina, se lavaron lo suficiente con el agua libre de endotoxina, y se cargaron además con heparina en una cantidad tal para permitir que la sangre recogida después en el inyector contenga finalmente heparina a una concentración de 10 U/ml.

A continuación, una parte de la aguja de un inyector de múltiples agujas 10 se clavó en un tapón del recipiente para la recogida de sangre anterior y otra parte de aguja del mismo se clavó en un tapón después de otro tapón para los reactores para su uso respectivo en el Ejemplo 36 y los Ejemplos Comparativos 7 - 9 para distribuir la sangre recogida en esos reactores, es decir 300 µl de sangre recogida para cada reactor. 15

Cada reactor se mantuvo a continuación en agitación a 37ºC durante 4 horas, y seguidamente se centrifugó (1.600 G, 10 minutos) a 4ºC para la posterior recogida del plasma. La cantidad de TNF-α en el plasma recogido se determinó usando un producto llamado "FACTOR TEST MOUSE TNF-α ELISA KIT" fabricado por Genzyme Inc. Los valores determinados se promediaron 20 para obtener un valor final para cada Ejemplo. Además, el coeficiente de variación (%) [= (desviación estándar) / (valor promedio) x 100) se calculó para cada Ejemplo. Los resultados se dan en la Tabla 5.

Tabla 5 25

Producción de TNFα

Valor medio (pg/ml)

CV* (%)

Ej. 36

1036 3,7

Ej. Comp. 7

5610 23,7

Ej. Comp. 8

1078 15,1

Ej. Comp. 9

2961 10,5

* CV = Coeficiente de Variación

Como puede observarse a partir de la Tabla 5, la menor varianza (coeficiente de variación) en la producción de TNF-α (inducido) se observó en el Ejemplo 36 en el que se añadió una cantidad conocida de LPS al recipiente para la recogida de sangre libre de LPS.

En vista de los anteriores resultados, para establecer un método de medición mediante el cual las morbilidades del paciente y las otras puedan decidirse de forma precisa y de manera simplificada, se cree esencial para 5 almacenar la sangre recogida sin exponerla a estimulación innecesaria durante un periodo desde la recogida hasta someterla a las mediciones. Con este fin, es necesario, cuando se recoge la sangre, emplear un recipiente para la recogida de sangre que tiene un interior con presión reducida y contiene LPS a un nivel insuficiente para permitir que se produzcan sustancias fisiológicamente 10 activas (liberadas o inducidas), como puede apreciarse claramente.

También es evidente a partir de los anteriores resultados, que para medir de forma precisa las funciones de las células sanguíneas, es necesario emplear un recipiente para la recogida de sangre que no esté contaminado con endotoxina a una concentración suficiente para afectar de forma adversa a los 15 valores medidos. También es necesario distribuir la sangre recogida en recipientes para la recogida de sangre que contienen cada uno una cantidad predeterminada de estimulador para hacer reaccionar de este modo a la sangre recogida con el estimulador para la producción (liberación o inducción) de las sustancias fisiológicamente activas que posteriormente se determinan 20 cuantitativamente.

EJEMPLO 37 (Referencia)

Los instrumentos y recipientes para su uso en este Ejemplo se expusieron a calentamiento seco a 250ºC durante 2 horas o más, si estaban hechos de vidrio, o como alternativa, se empaparon en una solución acuosa 0,2 25 M de hidróxido sódico durante una noche para desactivar la endotoxina y se lavaron lo suficiente con el agua libre de endotoxina, si estaban hechos de plástico. Además, dicha operación se realizó en un banco de trabajo limpio.

10.000 unidades de heparina sódica (fabricada por Wako Junyaku Co.) se disolvieron en 10 ml de solución salina fisiológica para inyección (fabricada 30 por Otsuka Seiyaku Co.). La solución de heparina sódica resultante se sometió a ultrafiltración con centrifugado a 500 G a 4ºC durante 1 hora, usando un ultrafiltrador CENTRIPREP 100 (peso molecular fraccional 0,1 millones, fabricado por Amicon Co.). El ultrafiltrador para su uso se había empapado previamente en una solución acuosa 0,2 M de hidróxido sódico durante una 35 noche para desactivar la endotoxina y se lavó lo suficiente con el agua libre de endotoxina.

En la solución de heparina sódica ultrafiltrada de este modo se determinó el contenido de endotoxina, usando ENDOSPECIE ES-6 (fabricado por Seikagaku Ind. Co.). Los resultados indicaban que el contenido de 5 endotoxina en la solución de heparina sódica era de 0,01 EU/unidad de heparina.

A continuación, 0,1 ml de la solución de heparina sódica ultrafiltrada (1.000 U/ml) se añadieron a un inyector para la recogida de sangre de 10 ml (fabricada por Terumo Co.), suplementado con 10 ml de sangre recogida de un 10 voluntario humano habitualmente sano (concentración final de heparina en sangre de aproximadamente 10 U/ml). Una fracción de sangre inmediatamente después de la recogida, así como otra fracción de sangre que se dejó reposar en una cámara termostática a 37ºC durante 2 horas y 4 horas, se centrifugaron respectivamente a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma 15 sobrenadante para cada una.

En el plasma recogido se determinó el contenido de citoquinas, es decir los contenidos de TNFα, IL-1β e IL-6, usando kits de inmunoensayo enzimático que contienen anticuerpos monoclonales respectivos contra esas citoquinas. La determinación del contenido de cada citoquina se realizó usando n = 3, y el 20 valor promedio obtenido de las mismas se muestra en la Tabla 6.

EJEMPLO COMPARATIVO 10

La recogida de sangre se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 37, excepto que la solución de heparina sódica empleada no se sometió a un tratamiento por ultrafiltración. En el plasma recogido se determinó el contenido 25 de citoquinas, es decir el contenido de TNFα, IL-1β e IL-6, usando kits de inmunoensayo enzimático que contienen anticuerpos monoclonales respectivos contra esas citoquinas. La determinación del contenido de cada citoquina se realizó usando n = 3, y el valor promedio obtenido de los misma se muestra en la Tabla 6. 30

Además, en la solución de heparina sódica que se empleó en este Ejemplo Comparativo 10 se determinó el contenido de endotoxina de la misma manera que en el Ejemplo 37. Los resultados indicados eran de 1,2 EU/unidad de heparina.

35

Tabla 6

* Inmediatamente (pg/ml) * 2 horas (pg/ml) * 4 horas (pg/ml)

Ej. 37

TNFα 35 35 35

IL-1β

15 15 15

IL-6

35 35 35

Ej. Comp. 10

TNFα 35 2850±298 6580±596

IL-1β

15 548±42 3490±412

IL-6

35 1225±179 4865±329

* Periodo de tiempo después de la recogida de sangre

Como es evidente a partir de la Tabla 6, en el sistema que usa la solución de heparina sódica ultrafiltrada en la que el contenido de endotoxina se redujo a 0,01 EU/unidad de heparina (concentración de endotoxina en 5 sangre de aproximadamente 0,1 EU/ml), no se produjo TNFα, IL-1β ni IL-6 en una cantidad apreciable hasta que transcurrieron 4 horas desde la recogida de la sangre. Por otro lado, en el sistema que usa la solución de heparina sódica no tratada en la que el contenido de endotoxina era de 1,2 EU/unidad de heparina (concentración de endotoxina en sangre de aproximadamente 12 10 Eu/ml), debido a la presencia de una cantidad apreciable de endotoxina, las cantidades en aumento de TNFα, IL-1β e IL-6 se produjeron en sangre con el tiempo.

EJEMPLOS 38 - 40 (Referencia)

Los instrumentos y recipientes para su uso en este Ejemplo se 15 expusieron a calentamiento seco a 250ºC durante 2 horas o más, si estaban hechos de vidrio, o como alternativa, se empaparon en una solución acuosa 0,2 M de hidróxido sódico durante una noche para desactivar la endotoxina y se lavaron lo suficiente con el agua libre de endotoxina, si estaban hechos de plástico. Además, la operación se realizó en un banco de trabajo limpio. 20

Una solución de 0,01 ml que contiene 10 unidades de heparina sódica preparada en el Ejemplo 37 que contenía endotoxina a una concentración de 0,01 EU/unidad de heparina se añadió a cada uno de tubos para la recogida de sangre de 5 ml libres de endotoxina (12,6 x 75 mm de diámetro, fabricado por Sekisui Chem. Ind. Co.) hechos de polietilen tereftalato. 25

A continuación, endotoxina estándar obtenida de la cepa UKT-B de E. coli de la Farmacopea Japonesa se disolvió en 1,6 ml de una solución salina fisiológica para inyección para la posterior dilución por etapas. Una vez completada cada etapa de dilución, la solución salina fisiológica con endotoxina disuelta resultante se añade a los tubos para la recogida de sangre con heparina sódica incorporada, de modo que se prepararon los tubos para la 5 recogida de sangre que contenían respectivamente endotoxina en concentraciones de 0,1 EU/ml (Ejemplo 38), 0,2 EU/ml (Ejemplo 39) y 0,4 EU/ml (Ejemplo 40) por sangre recogida.

A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que estaba configurado para encajar en el tubo para la recogida de sangre, se colocó 10 superpuesto en una abertura de cada tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. A continuación, cada tubo para la recogida de sangre se colocó dentro de un recipiente cuya presión podía reducirse. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo a una presión suficiente para la succión de 1 ml de sangre, la abertura de cada tubo para la recogida de 15 sangre se cerró herméticamente mediante el tapón.

A continuación, se recogió sangre mediante vacío de un voluntario habitualmente sano en los tubos para la recogida de sangre, es decir 1 ml por cada uno. Cada uno de los tubos para la recogida de sangre se montó en una plataforma agitadora para mezclado por volteo en una cámara termostática 20 precalentada a una temperatura de 37ºC para un posterior mezclado por volteo durante 2 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo se centrifugó a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante.

En el plasma recogido se determinó el contenido de citoquinas, es decir, 25 contenido respectivo de TNFα, IL-1β e IL-6 de la misma manera que en el Ejemplo 37. La determinación del contenido de cada citoquina se realizó usando n = 3, y el valor promedio obtenido de las mismas se muestra en la Tabla 7.

EJEMPLO COMPARATIVOS 11, 12 30

El procedimiento del Ejemplo 38 se repitió para recoger sangre, excepto que la solución salina fisiológica con endotoxina disuelta preparada se añadió a los tubos para la recogida de sangre con heparina sódica incorporada, de modo que se prepararon los tubos para la recogida de sangre que contenían respectivamente endotoxina en concentraciones de 0,5 EU/ml (Ejemplo 35 Comparativo 11) y 1,0 EU/ml (Ejemplo Comparativo 39) por tubo para la recogida de sangre.

En el plasma recogido se determinó el contenido de citoquinas, es decir, contenido respectivo de TNFα, IL-1β e IL-6 de la misma manera que en el Ejemplo 37. La determinación del contenido de cada citoquina se realizó 5 usando n = 3, y el valor promedio obtenido de las mismas se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7

* Endotoxina (EU/ml)

TNFα (pg/ml) IL-1β (pg/ml) IL-6 (pg/ml)

Ej.

38 0,1 35 15 35

39

0,2 35 15 35

40

0,4 35 15 35

Ej. Comp.

11 0,5 485±29 154±12 189±21

12

1,0 3560±398 1548±162 2225±279

* Concentración en sangre

10

Como es evidente a partir de la Tabla 7, si el contenido de endotoxina en sangre supera las 0,5 EU/ml, induce producciones de TNFα, IL-1β e IL-6.

EJEMPLO 41

<Método para fabricar un kit para la medición de las funciones celulares>

Heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del 15 producto: NOVO.HEPARIN #1000) se diluyó con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) para obtener una solución de heparina sódica que contiene heparina a una concentración de 200 U/ml. 0,05 ml de la solución de heparina sódica se añadieron al tubo para la recogida de sangre, que se había preparado en el Ejemplo 1 que contenía endotoxina a una 20 concentración no superior a 0,05 EU, de modo que el tubo para la recogida de sangre contenía 10 Unidades de heparina. La solución resultante se secó al vacío. A continuación, un tapón hecho de goma de butilo, que estaba configurado para encajar en el tubo para la recogida de sangre, se colocó superpuesto en una abertura del tubo para la recogida de sangre para no cerrar 25 herméticamente la abertura. El tubo para la recogida de sangre se colocó a continuación dentro de un recipiente cuya presión puede reducirse. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo a una presión suficiente para la succión de 1 ml de sangre, es decir a una presión de 570 mm de Hg, la abertura del tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente mediante el tapón. De este modo se fabricó el primer recipiente para la medición de las funciones celulares. 5

Heparina sódica (fabricada por Novo.Nordisk A/S Co., nombre del producto: NOVO.HEPARIN #1000) se diluyó con un agua libre de endotoxina (fabricada por Otsuka Seiyaku Co.) para obtener una solución de heparina sódica que contenía heparina a una concentración de 200 U/ml. Mientras tanto, endotoxina obtenida de la cepa 055:B5 de E. Coli. (fabricada por LBL Co.) se 10 diluyó con un agua libre de endotoxina para obtener una solución con endotoxina disuelta que contenía endotoxina a una concentración de 2.000 EU/ml. 0,05 ml de la solución de heparina sódica se añadieron al tubo para la recogida de sangre, que se había preparado en el Ejemplo 1 que contenía endotoxina a una concentración no superior a 0,05 EU, de modo que el tubo 15 para la recogida de sangre contenía 10 Unidades de heparina. 0,05 ml de la solución con endotoxina disuelta se añadió posteriormente al tubo para la recogida de sangre. La solución resultante se secó al vacío. A continuación, un tapón hecho de goma de butilo se colocó superpuesto en una abertura del tubo para la recogida de sangre para no cerrar herméticamente la abertura. El tubo 20 para la recogida de sangre se colocó a continuación dentro de un recipiente cuya presión puede reducirse. Cuando la presión en el interior del recipiente se redujo a una presión suficiente para la succión de 1 ml de sangre, es decir a una presión de 570 mm de Hg, la abertura del tubo para la recogida de sangre se cerró herméticamente mediante el tapón. De este modo se fabricó el 25 segundo recipiente para la medición de las funciones celulares.

Los primer y segundo reactivos para la determinación de TNFα se fabricaron de acuerdo con los siguientes procedimientos.

Anticuerpo monoclonal anti-TNFα humana (fabricado por Genzyme Inc.) se diluyó con un tampón carbonato 0,1 M (pH 9,5) para obtener una solución 30 diluida a una concentración de 1 µg/ml (solución de anticuerpo inmovilizado para el primer reactivo de determinación de TNFα, es decir para determinación con alta sensibilidad) y una solución diluida a una concentración de 100 ng/ml (solución de anticuerpo inmovilizado para el segundo reactivo de determinación de TNFα, es decir para determinación con baja sensibilidad), respectivamente. 35 100 µl de cada solución diluida se añadieron a cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos (placas de microvaloración Nunc MaxiSorp) para la posterior incubación a 2 - 8ºC durante un día y una noche. A continuación, cada pocillo se lavó mediante succión 3 veces con un tampón fosfato (pH 7,3) que contenía el 0,05% en peso de Tween 20. A continuación, 250 µl de un tampón fosfato 5 (pH 7,3) que contenía el 4% en peso de albúmina de suero bovino (fabricada por Sigma Chemical Co.) se añadió a cada pocillo para la posterior incubación a 37ºC durante 2 horas. Las soluciones incubadas se retiraron a continuación de cada pocillo de la microplaca que posteriormente se secó a temperatura ambiente. 10

Además, se usaron reactivos disponibles en el mercado para TNFα humano (fabricado por Genzyme Inc.), anticuerpo policlonal anti-TNFα humano marcado con viotina (fabricado por Genzyme Inc.), peróxido de hidrógeno, y una solución de sustrato que contiene tetrametilbenzidina (fabricada por KPL Co.). Además, un tampón fosfato (pH 7,3) que contenía el 0,05% en peso de 15 Tween 20 se usó como solución de lavado. Se preparó una solución 2 M de ácido sulfúrico para usarla como solución de interrupción.

<Medición de las capacidades de producción de TNFα>

Un inyector con una aguja se empleó para recoger sangre heparinizada de un voluntario habitualmente sano. La aguja se clavó con éxito en tapones 20 hechos de goma de butilo para los respectivos primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares para inyectar 1 ml de sangre de muestra en cada recipiente. A continuación, cada uno de los recipientes que alojan sangre se montó en una plataforma agitadora para mezclado por volteo colocada en una cámara termostática precalentada a una temperatura de 37ºC 25 para un posterior mezclado por volteo durante 4 horas. Una vez completado el mezclado íntimo, cada tubo se centrifugó a 1.600 G a 4ºC durante 10 minutos para recoger un plasma sobrenadante. El plasma recogido del primer recipiente para la medición de las funciones celulares se distribuyó en 4 pocillos para la determinación del contenido de TNFα de la misma manera que en (3) del 30 Ejemplo 1, usando el reactivo de alta sensibilidad especificado anteriormente. Por otro lado, el plasma recogido del segundo recipiente para la medición de las funciones celulares se distribuyó en 4 pocillos para la determinación del contenido de TNFα de la misma manera que en (3) del Ejemplo 1, usando el reactivo de baja sensibilidad especificado anteriormente. 35

EJEMPLO COMPARATIVO 13

La producción de TNFα se indujo de la misma manera que en el Ejemplo 41 en cada uno de los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares, y el plasma recogido de cada uno de ellos se distribuyó en 4 pocillos para la determinación del contenido de TNFα en plasma usando un 5 kit disponible en el mercado (PREDICTA Human TNF-α KIT). Cuando los valores medidos superaban su límite de detección, el plasma recogido se diluyó con un tampón fosfato (pH 7,3) que contenía el 1% en peso de albúmina de suero bovino a una proporción de dilución de aproximadamente 5 para otra medición. Los contenidos de TNFα se midieron multiplicando los valores 10 medidos por la proporción de dilución.

Los resultados del Ejemplo 41 y el Ejemplo Comparativo 13 se dan en la siguiente Tabla 8.

Tabla 8 15

Ej. 41 [Concentración de TNFα en plasma (pg/ml: Valor medio ± SD, CV (%))]

Nº 1

Nº 2 Nº 3 Nº 4

2º Recipiente para la medición de las funciones celulares

3870±280, 7,2 2570±180, 7,0 4870±380, 7,8 4520±340, 7,5

1º Recipiente para la medición de las funciones celulares

< *LD < *LD < *LD < *LD

Ej. Comp. 13 [Concentración de TNFα en plasma (pg/ml: Valor medio ± SD, CV (%))]

Nº 1 Nº 2 Nº 3 Nº 4

2º Recipiente para la medición de las funciones celulares

1520±400, 15,8 2070±310, 14,9 4510±620, 13,7 4020±780, 19,4

1º Recipiente para la medición de las funciones celulares

< *LD < *LD < *LD < *LD

* LD = Límite de detección

En la Tabla 8, CV indica un coeficiente de variación.

Como queda claro a partir de los resultados en la Tabla 8, el kit comercial no puede usarse en la determinación de la cantidad de TNFα inducida en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares 5 antes de que se realice la operación de dilución. El Ejemplo dio los resultados con mayor reproductibilidad, es decir los coeficientes de variación de aproximadamente el 7,5 %. Por otro lado, el Ejemplo Comparativo, en el que la medición de los contenidos de TNFα se realizó mediante el kit comercial después de la dilución en plasma, dieron los resultados con menor 10 reproductibilidad, es decir, los coeficientes de variación variaban entre aproximadamente el 15 y aproximadamente el 20%.

EFECTOS DE LA INVENCIÓN

De acuerdo con la presente solicitud, en el primer recipiente para la medición de las funciones celulares, para su uso en la determinación de 15 sustancias fisiológicamente activas producidas a partir de células sanguíneas, el recipiente se caracteriza porque la cantidad de material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas, cuando se extrae recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, está limitado a un nivel insuficiente para inducir la producción de 20 las sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas. Por consiguiente, la sangre recogida apenas se somete a estimulación innecesaria durante un periodo desde la recogida hasta la medición de modo que se permite una conservación a largo plazo de la misma. Esto permite la medición precisa de las sustancias fisiológicamente activas presentes en la sangre recogida y permite el uso del recipiente en el examen de forma precisa de morbilidades de pacientes que tienen diversas enfermedades.

Además, el primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención puede emplearse adecuadamente para obtener 5 valores de control, cuando se usa en combinación con el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares.

En el primer recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la presente solicitud, (el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente es endotoxina), 10 el contenido de endotoxina en el recipiente para la medición de las funciones celulares antes del uso está controlado preferentemente para que no supere las 0,5 EU/ml como una concentración en un líquido extraído cuando se extrae recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición. Esto permite la medición precisa de las sustancias fisiológicamente 15 activas presentes en la sangre recogida sin ser alterada por el contenido de endotoxina en el recipiente antes de la recogida de sangre.

En el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, aunque el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas en sangre está alojado de tal manera 20 que pueda entrar en contacto con la sangre, el contenido del material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas, originalmente presente en el recipiente antes de alojarlo, está limitado a un nivel insuficiente para influir en los valores medidos de las sustancias fisiológicamente activas. Por consiguiente, la producción de sustancias fisiológicamente activas puede 25 determinarse de forma muy precisa cuando la sangre se introduce y se pone en contacto con el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas para producir, de este modo, las sustancias fisiológicamente activas.

Además, en el segundo recipiente para la medición de las funciones 30 celulares de acuerdo con la invención, (el material que induce la producción de las sustancias fisiológicamente activas descritas anteriormente es endotoxina), la concentración de endotoxina en un líquido completo resultante cuando se pone en contacto con la sangre está limitada, estando en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml. Por consiguiente, la producción de sustancias fisiológicamente 35 activas puede determinarse de forma muy precisa cuando la sangre se introduce y se pone en contacto con el material capaz de inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas para producir, de este modo, las sustancias fisiológicamente activas.

En el primer o segundo recipiente para la medición de las funciones 5 celulares, el alojamiento adicional de anticoagulantes sirve para impedir la coagulación de la sangre en el recipiente para la medición de las funciones celulares.

Además, cuando la cantidad del material capaz de inducir la producción de sustancias fisiológicamente activas contenidas en el anticoagulante descrito 10 anteriormente está controlado en un nivel insuficiente para inducir la producción de las sustancias fisiológicamente activas a partir de las células sanguíneas cuando se mezcla con sangre, las sustancias fisiológicamente activas producidas pueden determinarse de forma muy precisa sin resultar influidas por los materiales inductores de sustancias fisiológicamente activas originalmente 15 contenidos en el anticoagulante.

Además, en el primer o segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, la reducción de la presión del interior del recipiente facilita la introducción de sangre en el recipiente para la medición de las funciones celulares. Por consiguiente, no se requieren las operaciones que incluyen 20 transferir manualmente la sangre a diversos reactores tal como pipeteando posteriormente a la recogida de sangre de un ser humano examinado, separación de células, cultivo celular y demás. Esto elimina el riesgo de que una persona que realiza el examen contraiga diversas enfermedades infecciosas, tales como hepatitis y SIDA. Además, el contenido de endotoxina 25 en el recipiente antes del uso está limitado para eliminar de este modo una posibilidad de que diversas bacterias o polvos se incorporen accidentalmente en una muestra de sangre. El problema potencial de provocar la activación innecesaria o caída de la activación de células debido a la presencia de contaminantes o la realización de diversas operaciones se evita de este modo. 30 Además, dado que se usa una sangre completa, no se requieren las técnicas especializadas que incluyen la separación y el cultivo de células, medición microscópica y demás. Esto acorta el periodo de tiempo para la medición y elimina la necesidad de introducir instalaciones de RI y equipos costosos tales como un citómetro de flujo. Como resultado, puede realizarse una medición de 35 las funciones celulares que es de funcionamiento más sencillo, menos costosa y más precisa que la convencional.

En el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la presente invención que incluye los primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares de acuerdo y el reactivo capaz de 5 determinar cuantitativamente las sustancias fisiológicamente activas inducidas, el uso del reactivo cuantificable definido anteriormente permite una fácil cuantificación de las sustancias fisiológicamente activas inducidas.

Además, la presente solicitud incluye el recipiente para la medición de las funciones celulares, el segundo recipiente para la medición de las funciones 10 celulares, y el reactivo para determinar cuantitativamente las sustancias fisiológicamente activas. Por consiguiente, cuando la sangre se introduce tanto en el primer como en el segundo recipientes para la medición de las funciones celulares, para la cuantificación mediante el reactivo especificado anteriormente, el valor de control puede obtenerse a partir del primer recipiente 15 para la medición de las funciones celulares mientras que los valores medidos correspondientes a la cantidad de sustancias fisiológicamente activas inducidas en sangre por el material inductor de sustancias fisiológicamente activas. Como resultado, se permite la cuantificación altamente precisa de las sustancias fisiológicamente activas en sangre. 20

En tal caso, los primer y segundo reactivos de inmunoensayo enzimático que tienen diferentes sensibilidades entre sí pueden usarse para el primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares, respectivamente, de acuerdo con los propósitos pretendidos de los mismos. Esto permite la cuantificación precisa de las sustancias fisiológicamente activas 25 inducidas.

Además, en el kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la invención, (el material inductor de sustancias fisiológicamente activas es endotoxina), el contenido de endotoxina en el segundo recipiente está controlado de modo que la concentración de endotoxina en un líquido completo 30 resultante cuando se pone en contacto con la sangre está en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml. Como resultado, la cantidad de sustancias fisiológicamente activas producidas en sangre cuando la endotoxina se puso en contacto con la sangre puede determinarse de forma muy precisa.

En el método para la medición de las funciones celulares, la sangre se 35 introduce en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, y se pone en contacto con el material inductor de sustancias fisiológicamente activas para inducir las sustancias fisiológicamente activas. Dado que el contenido de endotoxina en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares está limitado al intervalo especificado anteriormente, la 5 cantidad de sustancias fisiológicamente activas producidas en sangre puede determinarse de forma muy precisa.

En este caso, la producción de las sustancias fisiológicamente activas puede inducirse de forma fiable induciendo la producción de sustancias fisiológicamente activas a una temperatura en el intervalo de 26 - 45ºC, o como 10 alternativa, induciendo la producción de sustancias fisiológicamente activas en el periodo de tiempo de 1 - 6 horas.

En el método para la medición de las funciones celulares, la cantidad de las sustancias fisiológicamente activas producidas en sangre puede determinarse de forma fiable cuantificando las sustancias fisiológicamente 15 activas usando el reactivo capaz de determinarlas cuantitativamente.

Claims (3)

1. Un kit para la medición de las funciones celulares que comprende:

(a) un primer recipiente para la medición de las funciones celulares para su uso en la determinación de una citoquina producida por células sanguíneas, 5 en el que una cantidad de endotoxina, cuando se extrae recogiendo agua de un volumen igual a un volumen de líquido que se someterá a medición, antes del uso no supera las 0,5 EU/ml, y está alojado un anticoagulante.

(b) un segundo recipiente para la medición de las funciones celulares en el que están alojados endotoxina y anticoagulante de tal manera que puedan 10 ponerse en contacto con la sangre, en el que la concentración de endotoxina en un líquido completo resultante cuando se pone en contacto con la sangre en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, se traduce en el intervalo de 0,6 - 100.000 EU/ml; y

(c) un reactivo para cuantificar dicha citoquina, en el que dicho reactivo 15 incluye:

un primer reactivo de inmunoensayo enzimático que tiene una alta sensibilidad de medición de 10 - 1.000 pg/ml usado para determinar cuantitativamente la citoquina en la sangre recogida en el primer recipiente para la medición de las funciones celulares; 20

un segundo reactivo de inmunoensayo enzimático que tiene una baja sensibilidad de medición de 500 - 10.000 pg/ml usado para determinar cuantitativamente la citoquina producida mediante la reacción de la endotoxina con la sangre recogida en el segundo recipiente para la medición de las funciones celulares, teniendo el segundo reactivo de 25 inmunoensayo enzimático una sensibilidad de medición diferente, para la citoquina, a la del primer reactivo de inmunoensayo enzimático.

2. El kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo dichos primer y segundo recipientes un cuerpo 30 de recipiente que tiene una abertura y un tapón fijado para sellar la abertura, que no se retira durante la recogida de la sangre.

3. El kit para la medición de las funciones celulares de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que en cada interior de dichos 35 primer y segundo recipientes para la medición de las funciones celulares se ha reducido la presión.