ES2355185T3 - 32 proteínas humanas secretadas. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a)un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23; (b)un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23; (c)un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 23; (d)un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23; (e)un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud de SEQ ID NO: 60; (f)un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO:60; (g)un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de SEQ ID NO: 60 o un fragmento de polipéptido del mismo codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud y tiene actividad biológica; (h)un polinucleótido que codifica un polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 60 o que está codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23; (i)un polinucleótido que es al menos el 95% idéntico a al menos 150 nucleótidos contiguos de un polinucleótido como el definido en uno cualquiera de (a) a (h); y (j)un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (i); o la hebra complementaria del polinucleótido (a) a (j).

Description

32 proteínas humanas secretadas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polinucleótidos recién identificados y a los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, a usos de tales polinucleótidos y polipéptidos y a su producción.

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Antecedentes de la invención

A diferencia de las bacterias, que existen como un único compartimento rodeado por una membrana, las células humanas y otros eucariotas están subdivididos por membranas en muchos compartimentos funcionalmente distintos. Cada compartimento delimitado por una membrana, u orgánulo, contiene diferentes proteínas esenciales para la función del orgánulo. La célula usa "señales de clasificación", que son motivos de aminoácidos ubicados dentro de la proteína, para dirigir las proteínas a orgánulos celulares particulares.

Un tipo de señal de clasificación, denominada secuencia señal, péptido señal o secuencia líder, dirige una clase de proteínas a un orgánulo denominado retículo endoplasmático (RE). El RE separa las proteínas unidas a la membrana de todos los otros tipos de proteínas. Una vez localizadas en el RE, ambos grupos de proteínas pueden dirigirse adicionalmente a otro orgánulo denominado aparato de Golgi. En este caso, el aparato de Golgi distribuye las proteínas a vesículas, incluyendo vesículas secretoras, la membrana celular, lisosomas y los otros orgánulos.

Las proteínas dirigidas al RE mediante una secuencia señal puede liberarse al espacio extracelular como una proteína secretada. Por ejemplo, pueden fusionarse vesículas que contienen proteínas secretadas con la membrana celular y liberar su contenido al espacio extracelular, un proceso denominado exocitosis. La exocitosis puede producirse de manera constitutiva o tras recibir una señal desencadenante. En este último caso, las proteínas se almacenan en vesículas secretoras (o gránulos secretores) hasta que se desencadena la exocitosis. De manera similar, pueden secretarse también proteínas que residen en la membrana celular al espacio extracelular mediante escisión proteolítica de un "ligador" que sujeta la proteína a la membrana.

A pesar del gran avance realizado en los últimos años, sólo se ha identificado un pequeño número de genes que codifican para proteínas humanas secretadas. Estas proteínas secretadas incluyen insulina humana, interferón, factor VIII, hormona de crecimiento humana, activador de plasminógeno tisular y eritropoyetina comercialmente valiosas. Por tanto, en vista del papel predominante de las proteínas secretadas en la fisiología humana, existe una necesidad de identificar y caracterizar proteínas humanas secretadas novedosas y los genes que las codifican. Este conocimiento permitirá detectar, tratar y prevenir trastornos médicos usando proteínas secretadas o los genes que las codifican.

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Sumario de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos novedosos y a los polipéptidos codificados. Además, la presente invención se refiere a vectores, células huésped, anticuerpos y métodos recombinantes para producir los polipéptidos y polinucleótidos. Se proporcionan también métodos de diagnóstico para detectar trastornos relacionados con los polipéptidos, y composiciones farmacéuticas. La invención se refiere además a métodos de selección para identificar parejas de unión de los polipéptidos.

Específicamente, la presente invención se refiere a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23;

(b)

un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(c)

un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 23;

(d)

un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(e)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud de SEQ ID NO: 60;

(f)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO:60;

(g)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de SEQ ID NO: 60 o un fragmento de polipéptido del mismo codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud y tiene actividad biológica;

(h)

un polinucleótido que codifica un polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 60 o que está codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(i)

un polinucleótido que es al menos el 95% idéntico a al menos 150 nucleótidos contiguos de un polinucleótido tal como se definió en uno cualquiera de (a) a (h);

(j)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (i); y

\quad

o la hebra complementaria del polinucleótido (a) a (j).

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La presente invención se refiere también al gen correspondiente a la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 23 o que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

La presente invención se refiere además a un vector que comprende el polinucleótido de la invención.

La presente invención se refiere también a un método de preparación de una célula huésped recombinante que comprende introducir el polinucleótido o el vector de la invención.

La presente invención se refiere además a una célula huésped recombinante que contiene el polinucleótido, o el vector de la invención o producido mediante el método mencionado anteriormente de preparación de una célula huésped recombinante.

La presente invención se refiere también a un método de preparación de un polipéptido codificado por el polinucleótido de la invención que comprende;

(a)

cultivar la célula huésped recombinante mencionada anteriormente que expresa dicho polipéptido en condiciones tales que se exprese dicho polipéptido; y

(b)

recuperar dicho polipéptido.

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La presente invención se refiere además a un polipéptido codificado por el polinucleótido de la invención o que puede obtenerse mediante el método de preparación de un polipéptido mencionado anteriormente.

La presente invención se refiere también a un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a un antagonista que comprende un polinucleótido antisentido con respecto al polinucleótido de la invención que puede unirse a dicho polinucleótido y bloquear su traducción en el polipéptido codificado.

La presente invención se refiere también a un método para identificar antagonistas o agonistas del polipéptido de la invención que comprende:

(a)

producir células que expresan dicho polipéptido;

(b)

poner en contacto el polipéptido producido en la etapa (a) con una muestra de prueba que contiene posiblemente un antagonista o agonista; y

(c)

identificar un antagonista o agonista observando la unión y la inhibición o estimulación de la actividad de dicho polipéptido.

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La presente invención se refiere además a un método in vitro de diagnóstico de un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico en un sujeto que comprende:

(a)

determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido o el gen de la invención; y

(b)

diagnosticar un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico basándose en la presencia o ausencia de dicha mutación.

La presente invención se refiere también a un método in vitro de diagnóstico de un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico en un sujeto que comprende:

(a)

determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de la invención en una muestra biológica; y

(b)

diagnosticar un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico basándose en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.

La presente invención se refiere además a un método para identificar una pareja de unión al polipéptido de la invención que comprende:

(a)

poner en contacto dicho polipéptido con una pareja de unión; y

(b)

determinar si la pareja de unión efectúa una actividad del polipéptido.

Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de la invención, el polipéptido de la invención, un ADN que codifica y que puede expresar dicho polipéptido in vivo, el anticuerpo de la invención, el antagonista de la invención y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere también a una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido o el anticuerpo de la invención.

Finalmente, la presente invención se refiere también a un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas del método mencionado anteriormente para identificar antagonistas o agonistas y (d) formular el compuesto identificado en la etapa (c) en una forma farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada Definiciones

Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de ciertos términos usados en toda esta memoria descriptiva.

En la presente invención, "aislado" se refiere a material sacado de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural), y por tanto se altera "por la mano del hombre" con respecto a su estado natural. Por ejemplo, un polinucleótido aislado podría ser parte de un vector o una composición de materia, o podría estar contenido dentro de una célula, y todavía estar "aislado" porque el vector, la composición de materia o la célula particular no es el entorno original del polinucleótido.

En la presente invención, una proteína "secretada" se refiere a aquellas proteínas que pueden dirigirse al RE, vesículas secretoras o el espacio extracelular como resultado de una secuencia señal, así como a aquellas proteínas liberadas al espacio extracelular sin contener necesariamente una secuencia señal. Si la proteína secretada se libera al espacio extracelular, la proteína secretada puede experimentar procesamiento extracelular para producir una proteína "madura". La liberación al espacio extracelular puede producirse mediante muchos mecanismos, incluyendo exocitosis y escisión proteolítica.

Tal como se usa en el presente documento, un "polinucleótido" se refiere a una molécula que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en SEQ ID NO:23 o el ADNc contenido dentro del clon depositado con el depósito de la ATCC n.º 209075 o variantes del mismo tal como se definió en de (a) a (j), anteriormente. Por ejemplo, el polinucleótido puede contener la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc de longitud completa, incluyendo las secuencias no traducidas en 5' y 3', la región codificante, con o sin la secuencia señal, la región codificante de proteína secretada, así como fragmentos, epítopos, dominios y variantes de la secuencia de ácido nucleico según las definiciones en de (a) a (j), anteriormente. Además, tal como se usa en el presente documento, un "polipéptido" se refiere a una molécula que tiene la secuencia de aminoácidos no traducida generada a partir del polinucleótido tal como se definió anteriormente de manera amplia.

En la presente descripción, la secuencia de longitud completa identificada como SEQ ID NO:X se generó a menudo solapando secuencias contenidas en múltiples clones (análisis de cóntigos). Se depositó un clon representativo que contenía toda o la mayor parte de la secuencia para SEQ ID NO:X en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) ("ATCC"). Tal como se muestra en la tabla 1, cada clon se identifica mediante un ID (identificador) de ADNc y el número de depósito de la ATCC. La ATCC se ubica en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU. El depósito de la ATCC se realizó siguiendo los términos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes.

Un "polinucleótido" de la presente invención incluye también aquellos polinucleótidos que pueden hibridar, en condiciones de hibridación rigurosas, con secuencias contenidas en SEQ ID NO: 23, el complemento de las mismas, o el ADNc dentro del clon depositado con el depósito de la ATCC n.º 209075, siempre que la secuencia hibridante tenga al menos una identidad de secuencia del 95% con al menos 150 nucleótidos contiguos de un polinucleótido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a (h) o codifique para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1(a) a (i). "Condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a una incubación durante la noche a 42ºC en una disolución que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado, fragmentado 20 \mug/ml, seguido por lavado de los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 65ºC.

Se describen también moléculas de ácido nucleico que hibridan con los polinucleótidos de la presente invención en condiciones de hibridación de rigurosidad inferior. Los cambios en la rigurosidad de la hibridación y la detección de la señal se logran principalmente a través de la manipulación de la concentración de formamida (porcentajes inferiores de formamida dan como resultado una disminución de la rigurosidad); las condiciones de sal, o la temperatura. Por ejemplo, las condiciones de rigurosidad inferior incluyen una incubación durante la noche a 37ºC en una disolución que comprende 6X SSPE (20X SSPE = NaCl 3 M; NaH_{2}PO_{4} 0,2 M; EDTA 0,02 M, pH 7,4), SDS al 0,5%, formamida al 30%, ADN bloqueante de esperma de salmón 100 ug/ml; seguido por lavados a 50ºC con 1XSSPE, SDS al 0,1%. Además, para lograr una rigurosidad incluso inferior, pueden hacerse lavados realizados tras la hibridación rigurosa a concentraciones de sal superiores (por ejemplo 5X SSC).

Obsérvese que pueden lograrse variaciones en las condiciones anteriores a través de la inclusión y/o sustitución de reactivos bloqueantes alternativos usados para suprimir el fondo en experimentos de hibridación. Los reactivos bloqueantes típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado y formulaciones registradas comercialmente disponibles. La inclusión de reactivos bloqueantes específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación descritas anteriormente, debido a problemas con la compatibilidad.

Por supuesto, un polinucleótido que hibrida sólo con secuencias de poliA+ (tales como cualquier extensión de poliA+ terminal en 3' de un ADNc mostrado en la lista de secuencias) o con un tramo complementario de restos de T (o U), no estaría incluido en la definición de "polinucleótido", puesto que un polinucleótido de este tipo hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviese un tramo de poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de ADNc bicatenario).

El polinucleótido de la presente invención puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ADN o ARN no modificado o ADN o ARN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden estar compuestos por ADN mono y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, ARN mono y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones mono y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarias o, más normalmente, bicatenarias o una mezcla de regiones mono y bicatenarias. Además, los polinucleótidos pueden estar compuestos por regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Un polinucleótido también puede contener una o más bases modificadas o estructuras principales de ADN o ARN modificadas para lograr estabilidad o por otros motivos. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases poco comunes tales como inosina. Puede hacerse una variedad de modificaciones en el ADN y ARN; por tanto, "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.

El polipéptido de la presente invención puede estar compuesto por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isoésteres peptídicos, y puede contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los polipéptidos pueden modificarse o bien mediante procesos naturales, tales como procesamiento postraduccional, o bien mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones se describen bien en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier sitio en un polipéptido, incluyendo la estructura principal peptídica, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminal. Se apreciará que puede estar presente el mismo tipo de modificación en grados iguales o variables en varios sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales tras la traducción o pueden prepararse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación. (Véase, por ejemplo, PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2ª ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)).

"SEQ ID NO:X" se refiere a una secuencia de polinucleótido mientras que "SEQ ID NO:Y" se refiere a una secuencia de polipéptido, identificándose ambas secuencias mediante un número entero especificado en la tabla 1.

"Un polipéptido que tiene actividad biológica" se refiere a polipéptidos que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica a, una actividad de un polipéptido de la presente invención, incluyendo formas maduras, tal como se mide en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en el que exista dependencia de la dosis, no es necesario que sea idéntica a la del polipéptido, sino en su lugar sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada en comparación con el polipéptido de la presente invención (es decir, el polipéptido candidato presentará una mayor actividad o no más de aproximadamente 25 veces menos y, preferiblemente, no más de aproximadamente diez veces menos actividad, y lo más preferiblemente, no más de aproximadamente tres veces menos actividad en relación con el polipéptido de la presente invención).

Polinucleótidos y polipéptidos de la invención o descritos en el presente documento Características de la proteína codificada por el gen n.º: 1

Este gen se mapea en el cromosoma 3 y por tanto los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden usarse en un análisis de ligamiento como marcador para el cromosoma 3.

Este gen se expresa en varios tejidos fetales incluyendo cerebro, hígado y pulmón, y en menor grado en tejidos adultos, particularmente la piel.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, una variedad de cánceres, particularmente del cerebro, hígado y pulmón. De manera similar, polipéptidos y los anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema nervioso central, el sistema hepático y el sistema hepático, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, cerebro y otros tejidos del sistema nervioso, hígado, pulmón y piel, y tejidos cancerosos o dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles como diana para una variedad de agentes bloqueantes, ya que es probable que estén implicados en la promoción de una variedad de cánceres.

Características de la proteína codificada por el gen n.º 2

Los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden la secuencia: MSVPAFIDISEEDQAAELRAYL
KSKGAEISEENSEGGLHVDLAQIIEACDVCLEEDDKDVESVMNSVVSLLLILEPDKQEAUESLCEKLVKFREG
ERPSLRLQLLSNLFHGMDKNTPVRYTVYCSLIKVAASCGAIQYIPTELDQVRKWISDWNLTTEKKHTLLRLL
YEALVDCKKSDAASKVMVELLGSYTEDNASQARVDAHRCIVRALKDPNAFLFDHLLTLKPVKFLEGELLID
LLTIFVSAKLASYVKFYQNNKDFIDSLGLLHEQNMAKMRLLTFMGMAVENKEISFDTMQQELQIGADDVEA
FVIDAVRTKMVYCKIDQTQRKVVVSHSTHRTFGKQQWQQLYDTLNAWKQNLNKVKNSLLSLSDT (SEQ ID NO:85), MSVPAFIDISEED (SEQ ID NO:86), QAAELRAYLKSKG AE (SEQ ID NO:87), ISEENSEGGLHVD
LAQI (SEQ ID NO: 88), IEACDVCLKED DKDVESV (SEQ ID NO:89), VARPSSLFRSAWSCEW (SEQ ID NO:90), LRLQLLS NLFHG (SEQ ID NO:91), KDVESVMNSWSLLUL (SEQ ID NO:92), DAASKVMVELLGSYTED
NASQARVDA (SEQ ID NO:93), y/o VEAFVIDAVR (SEQ ID NO:94). También se dan a conocer polinucleótidos que codifica estos polipéptidos.

Este gen se expresa en hueso y en menor grado en cerebro, pulmón, células T, músculo, piel, testículos, bazo y macrófagos.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cáncer de huesos, artrosis y enfermedades autoinmunitarias. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario y el sistema esquelético, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, cerebro y otros tejidos del sistema nervioso, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, pulmón, músculo, piel y testículos y otro tejido reproductor, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:49 como restos: Arg-31 a Ser-37, Met-50 a Val-56, Glu-80 a Trp-87, Thr-94 a His-99, Tyr-129 a Ser-135, Tyr-193 a Phe-199, Ser-274 a Gln-285 y/o Ala-293 a Lys-302.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 3

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con diversas cinasas. El homólogo más cercano es TIF1 de ratón que es una proteína nuclear de ratón. TIF1 potencia RXR y RAR AF-2 en levaduras e interacciona de una manera dependiente de ligando con varios receptores nucleares en células de mamíferos y levaduras, así como in vitro. De manera notable, estas interacciones requieren los aminoácidos que constituyen el dominio de activación AF-2 conservado en todas las NR activas. Además, el antagonista del receptor de estrógenos (ER) AF-2, hidroxitamoxifeno, no puede promover la interacción ER-TIF1. Se propone que TIF1, que contiene varios dominios conservados encontrados en proteínas reguladoras de la transcripción, es un mediador de AF-2 dependiente de ligando. De manera interesante, el resto N-terminal de TIF1 está fusionado con B-raf en la oncoproteína de ratón T18.

Este gen se expresa principalmente en células T y en menor grado en otros diversos tejidos incluyendo testículos y cerebro.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunitarias, SIDA, leucemias y otros diversos cánceres. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, testículos y otro tejido reproductor, y cerebro y otro tejido del sistema nervioso, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:50 como restos: Ala-31 a Glu-36.

La distribución tisular y la homología con TIF indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para la modulación de la interacción de ligandos y receptores nucleares en diversos trastornos inmunitarios.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 4

Este gen se mapea en el cromosoma 11. Por consiguiente, los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden usarse en un análisis de ligamiento como marcador para el cromosoma 11. En realizaciones específicas, los polipéptidos descritos comprenden la secuencia:

MSEIYLRCQDEQQYARWMAGCRLASKGRTMADSSY (SEQ ID NO:95), LVAPRF QRKFKAKQLTPRILEA
HQNVAQLSLAEAQLRFIQAWQSL (SEQ ID NO:96), VGD VVKTWRFSNMRQWNVNWDIR (SEQ ID NO:97), EEIDCTEEEMMVFAALQYH INKLSQS (SEQ ID NO:98) y/o EEIDCTEEEMMVFAALQYHINKLSQS (SEQ ID NO:99). También se dan a conocer polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos.

Este gen se expresa principalmente en varios tipos de glóbulos blancos incluyendo monocitos, células T y neutrófilos y en menor grado en un número limitado de otros tejidos incluyendo vena umbilical e hígado.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, diversas enfermedades del sistema inmunitario incluyendo SIDA, enfermedades de inmunodeficiencia y trastornos autoinmunitarios. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células sanguíneas, hígado y tejido vascular, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:51 como restos: Ser-3 a Pro-9, Leu-17 a Leu-29, Asp-64 a Pro-69, Ile-105 a Gln-110, Thr-183 a Gln-200, Cys-239 a Arg-247, Ser-256 a Met-261, Gln-280 a Ala-296, Arg-310 a Thr-321, Lys-363 a Asp-368, Ser-395 a Trp-400 y/o Thr-443 a Asp-453.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para la terapia de sustitución en una variedad de trastornos del sistema inmunitario.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 5

Este gen se expresa principalmente en cerebro y poco o nada en absoluto en cualquier otro tejido.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos del estado de ánimo, esquizofrenia y enfermedades relacionadas, trastorno bipolar y depresión unipolar. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema nervioso central, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:52 como restos: Met-1 a Gly-8, Pro-10 a Arg-17, Pro-45 a Ser-55 y/o Gly-63 a Tyr-74.

La distribución tisular de este gen principalmente en el cerebro indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para la detección/el tratamiento de estados patológicos neurodegenerativos y trastornos del comportamiento tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastorno obsesivo-compulsivo y trastornos de pánico. También dada la expresión específica de cerebro de este gen, la región promotora de este gen contiene un elemento específico de cerebro que podría usarse para dirigir la expresión de sistemas de vector al cerebro en la terapia de sustitución génica.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 6

Este gen se mapea en el cromosoma 1 y por tanto los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden usarse en un análisis de ligamiento como marcador para el cromosoma 1.

Este gen se expresa de manera abundante en rabdomiosarcoma, se expresa en un alto nivel y en diferentes regiones del cerebro y la hipófisis y en menor grado en una variedad de otros tejidos.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos neurológicos y trastornos musculares. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejidos o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del cerebro, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, músculo liso, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, e hipófisis, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La abundante expresión de este gen en rabdomiosarcoma indica un papel para el producto de proteína o bien en la detección y/o bien el tratamiento de trastornos del músculo esquelético incluyendo degeneración muscular, atrofia muscular y rabdomiolisis. Además, la expresión en el cerebro indica un papel para el producto de proteína de este gen en la detección/el tratamiento de estados patológicos neurodegenerativos y trastornos del comportamiento tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esquizofrenia, manía, demencia, paranoia, trastornos obsesivo-compulsivo y trastorno de pánico.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 7

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con el gen TDAG51 que se piensa que es importante en la mediación de la apoptosis y la muerte celular acoplando la estimulación de TCR con la expresión de Fas. En realizaciones específicas, los polipéptidos de la invención comprenden la secuencia: KELSFARIKAVEC
VESTGRHIYFTLV (SEQ ID NO: 100) y/o GWNAQITLGLVKFKNQQ (SEQ ID NO:101).

Este gen se expresa en diversos tejidos humanos incluyendo macrófagos.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos inmunitarios. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, macrófagos y otras células sanguíneas, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:54 como restos: Met-1 a Pro-9, Gln-43 a Glu-49 y/o Phe-95 a Arg-102.

La distribución tisular y la homología con el gen TDAG51 indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el diagnóstico y la intervención de trastornos inmunitarios, tales como inmunodeficiencia, alergia, infección, inflamación, trasplante de tejidos/órganos.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 8

Este gen se expresa en tejido mamario y células amnióticas, y en menor grado en músculo liso, células T y cerebro de lactante.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, síndrome de sufrimiento fetal y atrofia embrionaria. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema reproductor femenino, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, tejido mamario, células amnióticas, músculo liso, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, y células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 9

En realizaciones específicas, los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden la secuencia: LVL
GLSXLNNSYNFSF (SEQ ID NO:102), HVVIGSQAEEGQYSLNF (SEQ ID NO:103), HNCNNSVPGKEHPFDITV
M (SEQ ID NO:104), FIKYVLSD KEKKVFGIV (SEQ ID NO:105), IPMQVLANVAYII (SEQ ID NO:106), IPMQV
L ANVAYII (SEQ ID NO:107), DGKVAVNLAKLKLFR (SEQ ID NO:108) y/o IREKNPDGFLSAA (SEQ ID NO: 109). También se dan a conocer polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos.

Este gen se expresa principalmente en el hígado, el bazo y la hipófisis fetales, y en menor grado en múltiples tejidos.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos inmunitarios y cáncer. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de los sistemas hepático, inmunitario y hematopoyético, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, hígado, bazo e hipófisis, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:56 como restos: Ser-62 a Cys-71, Thr-78 a Leu-86, Ser-104 a Lys-109, Ser-130 a Ala-135 y/o Gln-168 a Asp-174.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos hepáticos, y trastornos de los sistemas inmunitario y hematopoyético, tales como insuficiencia hepática, hepatitis, enfermedades alcohólicas del hígado, hipertensión portal, lesión tóxica del hígado, trasplante de hígado y neoplasma del hígado. La expresión en el bazo e hígado fetales indica también su función en la hematopoyesis, y por tanto el gen puede ser útil en trastornos hematopoyéticos incluyendo anemia, leucemia o cáncer, radioterapia/quimioterapia. La expresión en la hipófisis puede indicar su uso en trastornos endocrinos con manifestaciones sistémicas o específicas.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 10

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con una proteína de unión a ADN de pollo que se piensa que es importante en la regulación transcripcional de la expresión génica. Los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden la secuencia: MMFGGYETI (SEQ ID NO:110), YRDESSSELSVDSE
VEFQLYSQIH (SEQ ID NO: 111), YAQDLDDVIREEEHEEKNSGNSESSSSKPNQKKLIVLSDSEVIQLSDGSE
VITLSDEDSIYRCKGKNVRVQAQENAHGLSSSLQSNELVDKKCKSDIEKPKSEERSGVIREVMIIEVSSSEEEE
STISEGDNVESW (SEQ ID NO: 112), MLLGCEVDDKDDDILLNLVGCENSVTEGEDGINWSIS (SEQ ID NO:
113), DKDIEAQI ANNRTPGRWT (SEQ ID NO: 114), QRYYSANKNIICRNCDKRGHLSKNCPLP RKV (SEQ ID NO:115) y/o RRCFLCSRRGHLLYSCPAPLCEYCPVPKMLDHSCLFRHSWDKQCDRCHMLGHYTDACTEDNR
QYHLTTKPGPPKKPKTPSRPSALAYCYHCAQKGHYGHECPEREVYDPSPVSPFICYYXDKYEIQEREKRLKQ
KIKV XKKNGVIPEPSKLPYIKAANENPHHDIRKORASWKSNRWPQ (SEQ ID NO:116). También se dan a conocer polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos.

Este gen se expresa en amígdalas y médula ósea.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos de los sistemas inmunitario, hematopoyético y linfático. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de los sistemas inmunitario, hematopoyético y linfático, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, amígdalas y médula ósea, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular y la homología con una proteína de unión a ADN indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el tratamiento y diagnóstico de trastornos en los sistemas inmunitario, hematopoyético y linfático.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 11

Este gen se expresa en células T y dendríticas.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos del sistema inmunitario. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos de células (por ejemplo, células dendríticas, y células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el tratamiento y diagnóstico de trastornos del sistema inmunitario, particularmente los que implican a células T o dendríticas tales como inflamación.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 12

Este gen se expresa en neutrófilos activados, células endoteliales, células T y en menor grado en cerebro y hígado.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, SIDA, trastornos inmunitarios y susceptibilidad a enfermedad infecciosa. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario y la piel, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, neutrófilos y otras células sanguíneas, células endoteliales, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, e hígado, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:59 como restos: Glu-41 a Val-46.

Este producto génico es útil para el diagnóstico y/o el tratamiento de una variedad de trastornos, incluyendo trastornos hematopoyéticos, trastornos neurológicos, enfermedad hepática y trastornos que implican angiogénesis.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 13

Este gen se expresa en queratinocitos y en menor grado en células endoteliales y placenta.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos de la invención son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cicatrización de heridas alterada. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de la piel, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos de células (por ejemplo, queratinocitos y otras células de la piel, células endoteliales y placenta, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:60 como restos: Pro-35 a Trp-42, Ala-53 a Asp-62 y/o Arg-103 a Pro-113.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el tratamiento de la deficiencia de cicatrización de heridas y trastornos de la piel.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 14

Este gen se expresa en riñón y en menor grado en tejidos embrionarios.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, insuficiencia renal. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del riñón, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, riñón, tejido embrionario y otro en desarrollo rápido (por ejemplo, en división), y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 15

Este gen se expresa principalmente en cerebro y en menor grado en hígado.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, depresión, depresión maníaca y otras enfermedades mentales. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema nervioso central, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, y hígado, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso central tales como depresión y otras enfermedades mentales.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 16

Este gen se expresa en cerebro fetal y en menor grado en placenta, células endoteliales, pulmón fetal y células T.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, reestenosis, defectos de nacimiento y trastornos inmunitarios. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema cardiovascular, y el proceso del desarrollo, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, placenta, células endoteliales, pulmón, y células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:63 como restos: Gln-36 a Lys-42 y/o Glu-89 a Arg-104.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el desarrollo de agonistas y/o antagonistas para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso y el desarrollo fetal.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 17

Este gen se expresa en hemangiopericitoma y en menor grado en tejidos fetales.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, hemangiopericitomas y otros cánceres, así como trastornos del desarrollo. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es).
Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, tejido vascular, tejido pericítico y tejido en desarrollo, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:64 como restos: Glu-43 a Pro-51, Gly-71 a Arg-82, Pro-96 a Arg-103 y/o Thr-130 a Gly-140.

Se cree que los polinucleótidos y polipéptidos relacionados con este gen son útiles para el tratamiento y diagnóstico de tumores, particularmente hemangiopericitomas, y para el tratamiento de trastornos del desarrollo.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 18

Este gen se expresa en hígado fetal y en menor grado en cerebro y células T.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos fetales, desarrollo fetal y trastornos inmunitarios. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema hepático, sistema nervioso y sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, hígado, cerebro y otro tejido del sistema nervioso y células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para la identificación de agonistas y/o antagonistas para el tratamiento de enfermedades mentales tales como esquizofrenia y depresión. El producto génico también puede ser útil para monitorizar el desarrollo fetal durante el embarazo.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 19

Este gen se expresa en células T y en menor grado en cerebro.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades nerviosas centrales y trastornos inmunitarios. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema nervioso central y sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y cerebro y otro tejido del sistema nervioso, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:66 como restos: Lys-69 a Leu-74, Ser-92 a Phe-97, Asp-109 a Leu-117, Leu-142 a Ser-159, Thr-166 a Glu-183, Ala-191 a Glu-205 y/o Pro-213 a Glu-220.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el desarrollo de fármacos para el tratamiento de trastornos que afectan al sistema nervioso central y al sistema inmunitario.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 20

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con un ORF de C. elegans que parece ser una proteína transmembrana. (Véase el número de registro de GenBank 790406). Este cóntigo tiene dos posibles desplazamientos del marco entre los marcos +2 y +3 basándose en la homología con el gen de C. elegans. Este desplazamiento del marco puede resolverse fácilmente secuenciando el clon depositado. Además, este gen se mapea en el cromosoma 8, y por tanto puede usarse como marcador en un análisis de ligamiento para el cromosoma
8.

Este gen se expresa de manera ubicua, incluyendo células T y núcleo amigdalino.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cáncer. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario y sistema endocrino, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, núcleo amigdalino y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el
trastorno.

La distribución tisular ubicua y la homología con una proteína de tipo transmembrana de C. elegans indica que el producto de proteína de este gen desempeña un papel importante tanto en vertebrados como invertebrados y es útil para el diagnóstico o tratamiento de trastornos relacionados con este gen.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 21

Este gen se expresa principalmente en tejido embrionario y testículos y en menor grado en ovario, hepatoma, riñón, células endoteliales y de músculo liso.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastorno metabólico, desarrollo embrionario anómalo y tumor. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de los tejidos vascular o embrionario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, ovario y otro tejido reproductor, riñón, células endoteliales, y células de músculo liso, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular y la homología con la NADH deshidrogenasa indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el diagnóstico y/o tratamiento de trastornos metabólicos, particularmente que implican a tejidos embrionario y vascular.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 22

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con el receptor adrenérgico alfa 1C que se piensa que es importante en la transmisión de señales neuronales.

Este gen se expresa principalmente en el ganglio linfático mamario y en menor grado en cáncer uterino y tumor testicular.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos neurológicos. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del neurológico, ganglio linfático mamario, cáncer uterino y testículos, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, tejido mamario, tejido linfático, tejido uterino, y testículos y otro tejido reproductor, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular y la homología con el receptor adrenérgico alfa 1C indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para transmitir señales a las neuronas.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 23

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con un receptor acoplado a proteína G que se piensa que es importante en la mediación de una amplia variedad de funciones fisiológicas y pertenece a una superfamilia génica con miembros que oscilan desde receptor de quimiocinas hasta receptor de bradicinina. Otro grupo ha clonado también recientemente este gen, denominando el gen homólogo del receptor de activación de plaquetas. (Véase el número de registro de GenBank 2580588). Los fragmentos de polipéptido preferidos comprenden la secuencia de aminoácidos: LSIIFLAFVSIDRCLQL (SEQ ID NO:117) y GSCFAIWAFIQENTNHRCVSIY LINLL
TADFLLTLALPVKIVVDLGVAPWKLKIFHCQVTACLIYIN (SEQ ID NO:118). Se prefieren también fragmentos de polinucleótido que codifican para estos fragmentos de polipéptido.

Este gen se expresa principalmente en células inmunitarias, particularmente linfocitos.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos de linfocitos y otras células inmunitarias. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, linfocitos y otras células y tejido del sistema inmunitario, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:70 como restos: Asp-59 a Asn-65, Lys-72 a Trp-79, Tyr-110 a Val-121 y/o Ala-204 a Asn-215.

La distribución tisular y la homología con el receptor acoplado a proteína G indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este son útiles como receptor de quimiocinas en linfocitos que regulan la respuesta inmunitaria.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 24

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con proteína disulfuro isomerasa que se piensa que es importante en el plegamiento de proteínas y la interacción proteína-proteína. Este gen comparte también homología con genes que tienen dominios tiorredoxina. (Véase el número de registro 1943817). Este gen también se mapea en el cromosoma 9, y por tanto puede ser útil en un análisis de ligamiento como marcador para el cromosoma 9.

Este gen se expresa principalmente en tejidos tumorales y en menor grado en una amplia variedad de tejidos normales.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos debidos a una interacción proteína-proteína y un plegamiento de proteínas inapropiados. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del proceso tumorigénico, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Los epítopos preferidos incluyen los que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO:71 como restos: Glu-78 a Asn-83, Asp-91 a Gln-100, Glu-122 a Ser-128, Arg-137 a Pro-143, Asp-157 a Asn-162, Glu-168 a Asn-174, Ser-199 a Gly-206, Pro-213 a Ala-218, Glu-251 a Thr-257, Ser-353 a His-361, Gly-363 a Ala-375, Pro-382 a Phe-387 y/o Arg-401 a
Leu-406.

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La distribución tisular y la homología con proteína disulfuro isomerasa indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para regular el plegamiento de proteínas y la interacción proteína-proteína en tejidos tumorales.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 25

Este gen se expresa principalmente en leucocitos implicados en la defensa inmunitaria, incluyendo células T, macrófagos, neutrófilos y en menor grado en membrana sinovial, tumor de glándulas suprarrenales, tejido adiposo y placenta.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, defectos o trastornos en leucocitos. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de los sistemas inmunitario y de defensa, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, leucocitos y otras células y tejidos del sistema inmunitario, membrana sinovial, glándula suprarrenal, tejido adiposo y placenta, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para regular la función leucocitaria y pueden usarse para el diagnóstico y tratamiento de trastornos en los sistemas inmunitario y de defensa.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 26

Este gen se expresa en una variedad de tejidos y tipos celulares, incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama, neutrófilos, células T, médula espinal, fibroblastos y células endoteliales vasculares.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, trastorno y anomalías en leucocitos y otros tejidos. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente las células implicadas en tumorigénesis y los sistemas de defensa inmunitaria, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, colon, tejido mamario, neutrófilos, células T y otras células sanguíneas, médula espinal y otro tejido del sistema nervioso, células endoteliales, tejido vascular, y fibroblastos, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de cáncer o trastornos del sistema inmunitario.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 27

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con polipéptido pancreático de ratón. (Véase el número de registro de GenBank 200464). Por tanto, es probable que este gen tenga una actividad similar a la del polipéptido pancreático de ratón. Los fragmentos de polipéptido preferidos comprenden la secuencia de aminoácidos: APLETMQNKPRAPQKRALPFPELELRDYASVLTRYSLGLRNKEPSLGHRWGTQKLGRSPC (SEQ ID NO:119). Se prefieren también fragmentos de polinucleótido que codifican para este fragmento de polipéptido.

Este gen se expresa principalmente en neutrófilos y en menor grado en células endoteliales inducidas.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos en la adhesión neutrófilos o leucocitos. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, neutrófilos y otras células sanguíneas, y células endoteliales, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el
trastorno.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para la regulación de la adhesión de neutrófilos o leucocitos a células endoteliales. Pueden usarse para diagnosticar o tratar trastornos asociados con neutrófilos y células endoteliales vasculares.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 28

Este gen se expresa principalmente en BPH prostática.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, hipertrofia benigna de la próstata. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema urogenital masculino, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, próstata, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los polinucleótidos y polipéptidos que corresponden a este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de hipertrofia benigna de la próstata o cáncer de próstata.

Características de la proteína codificada por el gen n.º 29

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con C16C10.7, un gen de C. elegans similar a una proteína con dedos de zinc, una proteína implicada en la unión a ADN. Por tanto, se espera que esta proteína comparta ciertas actividades biológicas con C16C10.7 incluyendo actividades de unión a ADN.

Este gen se expresa principalmente en células T activadas y en menor grado en cerebro fetal, células amnióticas inducidas por TNF y epidídimo.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos inmunitarios o neurodegenerativos. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente de los sistemas nervioso central e inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, cerebro y otro tejido del sistema nervioso, células amnióticas, y epidídimo y otro tejido reproductor, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el
trastorno.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos inmunitarios y/o neurodegenerativos y la promoción de la supervivencia y diferenciación de neu-
ronas.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 30

Este gen se expresa principalmente en células T y en menor grado en médula ósea.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, trastornos inmunológicos incluyendo enfermedad autoinmunitaria. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es).
Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema inmunitario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos y tipos celulares (por ejemplo, células T y otras células y tejido del sistema inmunitario, y médula ósea, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno. Se cree que este gen se mapea en el cromosoma 4: Mapa de transcritos: WI-11395, Chr.4, D4S395-D4S414; mapa Whitehead: WI-11395, Chr.4, 498,0 cR; entradas de dbSTS:
G21269.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados de manera inmunológica ya que se piensa que desempeñan un papel en la proliferación, supervivencia, diferenciación y/o activación de una variedad de células hematopoyéticas, incluyendo células madre hematopoyéticas o progenitoras tempranas.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 31

Este gen se expresa principalmente en piel humana.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cicatrización de heridas y cánceres de piel. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema integumentario, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, piel y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de cánceres de piel y cicatrización de heridas.

Características de la proteína codificada por el gen n.º: 32

El producto de traducción de este gen comparte homología de secuencia con la prealbúmina lacrimal humana (número de registro de GenBank gil307518) y proteína de unión a moléculas de olor de rata (número de registro de GenBank gil207551), ambas de las cuales se piensa que son importantes en el transporte y la unión a moléculas.

Este gen se expresa principalmente en tumor endometrial.

Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos descritos en el presente documento son útiles como reactivos para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es) presente(s) en una muestra biológica y para el diagnóstico de enfermedades y estados que incluyen, pero no se limitan a, cánceres del endometrio, piel y sistema hematopoyético. De manera similar, polipéptidos y anticuerpos dirigidos frente a estos polipéptidos son útiles para proporcionar sondas inmunológicas para la identificación diferencial del/de los tejido(s) o tipo(s) celular(es). Para varios trastornos de los tejidos o células anteriores, particularmente del sistema hematopoyético, la expresión de este gen a niveles significativamente superiores o inferiores puede detectarse de manera rutinaria en ciertos tejidos (por ejemplo, células y tejido del sistema inmunitario, y endometrio y otro tejido del sistema reproductor, y tejidos cancerosos y dañados) o líquidos corporales (por ejemplo, suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) u otra muestra de células o tejidos tomada de un individuo que tiene un trastorno de este tipo, en relación con el nivel de expresión génica convencional, es decir, el nivel de expresión en tejido sano o líquido corporal de un individuo que no tiene el trastorno.

La distribución tisular y la homología con la familia génica de transporte y unión a moléculas indica que los productos de proteína de este gen son útiles para el diagnóstico y tratamiento de cánceres del endometrio y sistema hematopoyético así como para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios tales como inflamación.

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La tabla 1 resume la información correspondiente a cada "gen n.º" descrito anteriormente. La secuencia de nucleótidos identificada como "NT SEQ ID NO:X" se ensambló a partir de secuencias parcialmente homólogas ("solapantes") obtenidas del "ID de clon de ADNc" identificado en la tabla 1 y, en algunos casos, de clones de ADN relacionados adicionales. Las secuencias solapantes se ensamblaron en una única secuencia contigua de alta redundancia (habitualmente de tres a cinco secuencias solapantes en cada posición de nucleótido), dando como resultado una secuencia final identificada como SEQ ID NO:X.

El ID de clon de ADNc se depositó en la fecha y se le dio el correspondiente número de depósito enumerado en "n.º: Z de depósito de la ATCC y fecha". Algunos de los depósitos contienen múltiples clones diferentes correspondientes al mismo gen. "Vector" se refiere al tipo de vector contenido en el ID de clon de ADNc.

"Sec. de NT total" se refiere al número total de nucleótidos en el cóntigo identificado por "gen n.º". El clon depositado puede contener todas o la mayoría de estas secuencias, reflejado por la posición de nucleótidos indicada como "NT en 5' de la sec. del clon" y el "NT en 3' de la sec. del clon" de SEQ ID NO:X. La posición de nucleótidos de SEQ ID NO:X del supuesto codón de iniciación (metionina) se identifica como "NT en 5' del codón de iniciación". De manera similar, la posición de nucleótidos de SEQ ID NO:X de la secuencia señal pronosticada se identifica como "NT en 5' de los primeros AA de pép. señal".

La secuencia de aminoácidos traducida, que comienza con la metionina, se identifica como "AA SEQ ID NO:Y", aunque también pueden traducirse fácilmente otros marcos de lectura usando técnicas de biología molecular conocidas.

La primera y última posición de aminoácidos de SEQ ID NO:Y del péptido señal pronosticado se identifica como "primer AA de pép. señal" y "último AA de pép. señal". La primera posición de aminoácidos pronosticada de SEQ ID NO:Y de la parte secretada se identifica como "primer AA pronosticado de la parte secretada". Finalmente, la posición de aminoácidos de SEQ ID NO:Y del último aminoácido en el marco de lectura abierto se identifica como "último AA de ORF".

SEQ ID NO:X y la SEQ ID NO:Y traducida son suficientemente exactas y por lo demás adecuadas para una variedad de usos bien conocidos en la técnica y descritos adicionalmente a continuación. Por ejemplo, SEQ ID NO:X es útil para diseñar sondas de hibridación de ácido nucleico que detectarán secuencias de ácido nucleico contenidas en SEQ ID NO:X o el ADNc contenido en el clon depositado. Estas sondas se hibridarán también con moléculas de ácido nucleico en muestras biológicas, permitiendo de ese modo una variedad de métodos forenses y de diagnóstico de la invención. De manera similar, pueden usarse polipéptidos identificados a partir de SEQ ID NO:Y para generar anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas secretadas codificadas por los clones de ADNc identificados en la tabla 1.

No obstante, las secuencias de ADN generadas mediante reacciones de secuenciación pueden contener errores de secuenciación. Los errores existen como nucleótidos mal identificados, o como inserciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de ADN generada. Los nucleótidos delecionados o insertados erróneamente provocan desplazamientos del marco en los marcos de lectura de la secuencia de aminoácidos pronosticada. En estos casos, la secuencia de aminoácidos pronosticada diverge de la secuencia de aminoácidos real, aún cuando la secuencia de ADN generada puede ser mayor del 99,9% idéntica a la secuencia de ADN real (por ejemplo, inserción o deleción de una base en un marco de lectura abierto de más de 1000 bases).

Por consiguiente, para aquellas aplicaciones que requieren precisión en la secuencia de nucleótidos o la secuencia de aminoácidos, la presente invención proporciona no sólo la secuencia de nucleótidos generada identificada como SEQ ID NO:23 y la secuencia de aminoácidos traducida pronosticada identificada como SEQ ID NO:60, sino también una muestra de ADN de plásmido que contiene un ADNc humano de la invención depositado en la ATCC, tal como se expone en la tabla 1. La secuencia de nucleótidos de cada clon depositado puede determinarse fácilmente secuenciando el clon depositado según métodos conocidos. La secuencia de aminoácidos pronosticada puede verificarse entonces a partir de tales depósitos. Además, la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por un clon particular puede determinarse también directamente secuenciando péptidos o expresando la proteína en una célula huésped adecuada que contiene el ADNc humano depositado, recogiendo la proteína y determinando su secuencia.

La presente invención se refiere también a los genes correspondientes a SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:60, o el clon depositado. El gen correspondiente puede aislarse según métodos conocidos usando la información de secuencia dada a conocer en el presente documento. Tales métodos incluyen preparar sondas o cebadores a partir de la secuencia dada a conocer e identificar o amplificar el gen correspondiente a partir de fuentes apropiadas de material genómico. También se proporcionan en la presente invención homólogos de especie siempre que se encuentren dentro de la reivindicación 1. Pueden aislarse e identificarse homólogos de especie preparando sondas o cebadores adecuados a partir de las secuencias proporcionadas en el presente documento y seleccionando una fuente de ácido nucleico adecuada para el homólogo deseado.

Los polipéptidos de la invención pueden prepararse de cualquier manera adecuada. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos aislados que se producen de manera natural, polipéptidos producidos de manera recombinante, polipéptidos producidos de manera sintética o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos métodos. Se comprenden bien en la técnica medios para preparar tales polipéptidos.

Los polipéptidos pueden estar en forma de la proteína secretada, incluyendo la forma madura, o pueden ser una parte de una proteína mayor, tal como una proteína de fusión (véase a continuación). A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias líder o secretoras, pro-secuencias, secuencias que ayudan en la purificación, tales como múltiples restos de histidina, o una secuencia adicional para lograr estabilidad durante la producción recombinante.

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión producida de manera recombinante de un polipéptido, incluyendo el polipéptido secretado, puede purificarse sustancialmente mediante el método de una etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988). También pueden purificarse polipéptidos de la invención a partir de fuentes naturales o recombinantes usando anticuerpos de la invención generados contra la proteína secretada en métodos que se conocen bien en la técnica.

Secuencias señal

Están disponibles métodos para pronosticar si una proteína tiene una secuencia señal, así como el punto de escisión para esa secuencia. Por ejemplo, el método de McGeoch, Virus Res. 3:271-286 (1985), usa la información de una región cargada N-terminal corta y una región no cargada posterior de la proteína completa (no escindida). El método de von Heinje, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690 (1986) usa la información de los restos que rodean el sitio de escisión, normalmente los restos -13 a +2, en los que +1 indica el extremo amino-terminal de la proteína secretada. La exactitud del pronóstico de los puntos de escisión de proteínas secretoras de mamíferos conocidas para cada uno de estos métodos está en el intervalo del 75-80% (von Heinje, citado anteriormente). Sin embargo, los dos métodos no siempre producen el/los mismo(s) punto(s) de escisión pronosticado(s) para una proteína dada.

En el presente caso, la secuencia de aminoácidos deducida del polipéptido secretado se analizó mediante un programa informático denominado SignalP (Henrik Nielsen et al., Protein Engineering 10:1-6 (1997)), que pronostica la ubicación celular de una proteína basándose en la secuencia de aminoácidos. Como parte de este pronóstico informático de la localización, pueden usarse los métodos de McGeoch y von Heinje. El análisis de la secuencia de aminoácidos de las proteínas secretadas descritas en el presente documento mediante este programa proporcionó los resultados mostrados en la tabla 1.

Sin embargo, tal como apreciaría un experto habitual, los sitios de escisión algunas veces varían de organismo a organismo y no pueden pronosticarse con absoluta seguridad. Por consiguiente, la presente invención proporciona polipéptidos secretados que tienen una secuencia mostrada en SEQ ID NO:60 que tienen un extremo N-terminal que comienza a 5 restos (es decir, + o -5 restos) del punto de escisión pronosticado. De manera similar, se reconoce también que, en algunos casos, la escisión de la secuencia señal de una proteína secretada no es totalmente uniforme, dando como resultado más de una especie secretada. Estos polipéptidos, y los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, se contemplan por la presente invención.

Además, la secuencia señal identificada mediante el análisis anterior puede no pronosticar necesariamente la secuencia señal que se produce de manera natural. Por ejemplo, la secuencia señal que se produce de manera natural puede estar más en el sentido de 5' con respecto a la secuencia señal pronosticada. Sin embargo, es probable que la secuencia señal pronosticada pueda dirigir la proteína secretada al RE. Estos polipéptidos, y los polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, se contemplan por la presente invención.

Variantes de polipéptidos y polinucleótidos

"Variante" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que difiere del polinucleótido o polipéptido de la presente invención, pero que conserva propiedades esenciales de los mismos. Generalmente, las variantes son estrechamente similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas al polinucleótido o polipéptido de la presente invención.

Mediante un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, el 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótidos de referencia de la presente invención, se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto porque la secuencia de polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia pueden insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia problema puede ser una secuencia completa mostrada en la tabla 1, el ORF (marco de lectura abierto) o cualquier fragmento especificado tal como se describe en el presente documento.

Como cuestión práctica, puede determinarse de manera convencional si cualquier polipéptido o molécula de ácido nucleico particular es al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a una secuencia de nucleótidos de la presente invención usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar el mejor apareamiento global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominado alineación de secuencias global, puede determinarse usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencias las secuencias sujeto y problema son ambas secuencias de ADN. Puede compararse una secuencia de ARN convirtiendo U en T. El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Parámetros preferidos usados en una alineación FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son:

Matriz = unitaria, k-tupla = 4, penalización por apareamiento erróneo = 1, penalización por unión = 30, longitud del grupo de aleatorización = 0, puntuación de punto de corte = 1, penalización por hueco = 5, penalización por tamaño de hueco 0,05, tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia de nucleótidos sujeto, la que sea más corta.

Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia problema debido a deleciones en 5' o 3', no debido a deleciones internas, debe hacerse una corrección manual en los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta truncamientos en 5' y 3' de la secuencia sujeto cuando calcula el porcentaje de identidad. Para secuencias sujeto truncadas en los extremos 5' o 3', en relación con la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de bases de la secuencia problema que están en 5' y 3' de la secuencia sujeto, que no están apareadas/alineadas, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un nucleótido está apareado/alineado se determina mediante los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Este porcentaje se resta entonces del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación corregida es la que se usa para los fines de la presente invención. Sólo las bases fuera de las bases en 5' y 3' de la secuencia sujeto, tal como se representa mediante la alineación FASTDB, que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema, se calculan para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 bases se alinea con una secuencia problema de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones se producen en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5' y 3' no apareadas/número total de bases en la secuencia problema) de modo que se resta un 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada mediante el programa FASTDB. Si las 90 bases restantes se apareasen perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 bases con una secuencia problema de 100 bases. Esta vez, las deleciones son deleciones internas de modo que no hay ninguna base en el extremo 5' o 3' de la secuencia sujeto que no esté apareada/alineada con la secuencia problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las bases en 5' y 3' de la secuencia sujeto que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema se corrigen manualmente. No debe hacerse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.

Mediante un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, el 95% "idéntica" a una secuencia de aminoácidos problema de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sujeto sea idéntica a la secuencia problema excepto porque la secuencia de polipéptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos problema. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos problema, hasta el 5% de los restos de aminoácido en la secuencia sujeto pueden insertarse, delecionarse (indels) o sustituirse por otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier sitio entre esas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre restos en la secuencia de referencia o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como cuestión práctica, puede determinarse convencionalmente si cualquier polipéptido particular es al menos el 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1 o a la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de ADN depositado usando programas informáticos conocidos. Un método preferido para determinar el mejor apareamiento global entre una secuencia problema (una secuencia de la presente invención) y una secuencia sujeto, también denominado alineación de secuencias global, puede determinarse usando el programa informático FASTDB basado en el algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237-245). En una alineación de secuencias, las secuencias sujeto y problema son o bien ambas secuencias de nucleótidos o bien ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de dicha alineación de secuencias global es en porcentaje de identidad. Parámetros preferidos usados en una alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz = PAM 0, k-tupla = 2, penalización por apareamiento erróneo = 1, penalización por unión = 20, longitud de grupo de aleatorización = 0, puntuación de punto de corte = 1, tamaño de ventana = longitud de secuencia, penalización por hueco = 5, penalización por tamaño de hueco = 0,05, tamaño de ventana = 500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos sujeto, la que sea más corta.

Si la secuencia sujeto es más corta que la secuencia problema debido a deleciones N- o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe hacerse una corrección manual en los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no tiene en cuenta truncamientos en N- y C-terminales de la secuencia sujeto cuando calcula el porcentaje de identidad global. Para secuencias sujeto truncadas en los extremos N- y C-terminales, en relación con la secuencia problema, el porcentaje de identidad se corrige calculando el número de restos de la secuencia problema que son N- y C-terminales con respecto a la secuencia sujeto, que no están apareados/alineados con un resto sujeto correspondiente, como un porcentaje de las bases totales de la secuencia problema. Si un resto está apareado/alineado se determina mediante los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Este porcentaje se resta entonces del porcentaje de identidad, calculado mediante el programa FASTDB anterior usando los parámetros especificados, para llegar a una puntuación de porcentaje de identidad final. Esta puntuación de porcentaje de identidad final es la que se usa para los fines de la presente invención. Sólo los restos en los extremos N- y C-terminales de la secuencia sujeto, que no están apareados/alineados con la secuencia problema, se consideran para los fines de ajustar manualmente la puntuación de porcentaje de identidad. Es decir, sólo las posiciones de restos problema fuera de los restos N- y C-terminales más lejanos de la secuencia sujeto.

Por ejemplo, una secuencia sujeto de 90 restos de aminoácido se alinea con una secuencia problema de 100 restos para determinar el porcentaje de identidad. La deleción se producen en el extremo N-terminal de la secuencia sujeto y, por tanto, la alineación FASTDB no muestra un apareamiento/alineación de los primeros 10 restos en el extremo N-terminal. Los 10 restos no apareados representan el 10% de la secuencia (número de restos en los extremos N- y C-terminales no apareados/número total de restos en la secuencia problema) de modo que se resta un 10% de la puntuación de porcentaje de identidad calculada mediante el programa FASTDB. Si los 90 restos restantes se apareasen perfectamente, el porcentaje de identidad final sería del 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia sujeto de 90 restos con una secuencia problema de 100 restos. Esta vez, las deleciones son deleciones internas de modo que no hay ningún resto en los extremos N- o C-terminales de la secuencia sujeto que no esté apareado/alineado con la secuencia problema. En este caso, el porcentaje de identidad calculado mediante FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más, sólo las posiciones de restos fuera de los extremos N- y C-terminales de la secuencia sujeto, tal como se representa en la alineación FASTDB, que no están apareadas/alineadas con la secuencia problema se corrigen manualmente. No debe hacerse ninguna otra corrección manual para los fines de la presente invención.

Las variantes pueden contener alteraciones en las regiones codificantes, las regiones no codificantes o ambas. Se prefieren especialmente variantes de polinucleótidos que contienen alteraciones que producen deleciones, adiciones o sustituciones silenciosas, pero que no alteran las propiedades o actividades del polipéptido codificado. Se prefieren variantes de nucleótidos producidas por sustituciones silenciosas debidas a la degeneración del código genético. Además, se prefieren también variantes en las que se sustituyen, delecionan o añaden 5-10, 1-5 ó 1-2 aminoácidos. Pueden producirse variantes de polinucleótidos por una variedad de motivos, por ejemplo, para optimizar la expresión de codones para un huésped particular (cambio de codones en el ARNm humano a los preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli).

Las variantes que se producen de manera natural se denominan "variantes alélicas", y hacen referencia a una de varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nueva York (1985)). Estas variantes alélicas pueden variar o bien al nivel de polinucleótido y/o bien al de polipéptido. Alternativamente, pueden producirse variantes que se producen de manera no natural mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.

Usando métodos conocidos de tecnología de ADN recombinante e ingeniería de proteínas, pueden generarse variantes para mejorar o alterar las características de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, pueden delecionarse uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de la proteína secretada sin pérdida sustancial de la función biológica. Los autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268: 2984-2988 (1993), notificaron proteínas KGF variantes que tenían actividad de unión a heparina incluso tras delecionar 3, 8 ó 27 restos de aminoácido amino-terminales. De manera similar, el interferón gamma presentaba una actividad hasta diez veces superior tras delecionar 8-10 restos de aminoácido del extremo carboxilo-terminal de esta proteína. (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).

Además, numerosas pruebas demuestran que las variantes conservan una actividad biológica similar a la de la proteína que se produce de manera natural. Por ejemplo, Gayle y colaboradores (J. Biol. Chem 268:22105-22111 (1993)) realizaron un análisis mutacional extenso de la citocina humana IL-1a. Usaron mutagénesis al azar para generar más de 3.500 mutantes de IL-1a individuales que promediaban 2,5 cambios de aminoácidos por variante a lo largo de toda la longitud de la molécula. Se examinaron mutaciones múltiples en cada posible posición de aminoácido. Los investigadores encontraron que "la mayor parte de la molécula podría alterarse con poco efecto sobre la actividad o bien biológica o bien de unión". (Véase el resumen). De hecho, sólo 23 secuencias de aminoácidos únicas, de más de 3.500 secuencias de nucleótidos examinadas, produjeron una proteína que difería significativamente en su actividad con respecto al tipo natural.

Además, aunque delecionar uno o más aminoácidos del extremo N-terminal o C-terminal de un polipéptido dé como resultado una modificación o pérdida de una o más funciones biológicas, pueden conservarse todavía otras actividades biológicas. Por ejemplo, la capacidad de una variante de deleción para inducir y/o unirse a anticuerpos que reconocen la forma secretada se conservará probablemente cuando se eliminan menos de la mayoría de los restos de la forma secretada del extremo N-terminal o C-terminal. Puede determinarse fácilmente si un polipéptido particular que carece de restos N-terminales o C-terminales de una proteína conserva tales actividades inmunogénicas mediante métodos de rutina descritos en el presente documento o conocidos de otra forma en la técnica.

Por tanto, la invención incluye además variantes de polipéptidos dentro de los ámbitos de las reivindicaciones que muestran una actividad biológica sustancial. Tales variantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones seleccionadas según normas generales conocidas en la técnica de modo que tengan poco efecto sobre la actividad. Por ejemplo, se proporcionan directrices referentes a cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas en Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-1310 (1990), en el que los autores indican que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a los cambios.

La primera estrategia se aprovecha de la tolerancia de sustituciones de aminoácidos por selección natural durante el proceso de evolución. Comparando secuencias de aminoácidos en diferentes especies, pueden identificarse aminoácidos conservados. Estos aminoácidos conservados probablemente son importantes para la función de la proteína. En cambio, las posiciones de aminoácidos en las que se han tolerado sustituciones por selección natural indican que estas posiciones no son críticas para la función de la proteína. Por tanto, podrían modificarse posiciones que toleran la sustitución de aminoácidos mientras que se mantiene la actividad biológica de la proteína.

La segunda estrategia usa la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar regiones críticas para la función de la proteína. Por ejemplo, pueden usarse mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (introducción de mutaciones de alanina únicas en cada resto de la molécula). (Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Entonces, las moléculas mutantes resultantes pueden someterse a prueba para determinar su actividad biológica.

Tal como establecen los autores, estas dos estrategias han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes de sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además que es probable que los cambios de aminoácidos sean permisivos en ciertas posiciones de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los restos de aminoácido más enterrados (dentro de la estructura terciaria de la proteína) requieren cadenas laterales no polares, mientras que se conservan generalmente pocas características de cadenas laterales de superficie. Además, las sustituciones de aminoácidos conservativas toleradas implican el reemplazo de los aminoácidos alifáticos o hidrófobos Ala, Val, Leu y Ile; el reemplazo de los restos de hidroxilo Ser y Thr; el reemplazo de los restos ácidos Asp y Glu; el reemplazo de los restos de amida Asn y Gln, el reemplazo de los restos básicos Lys, Arg e His; el reemplazo de los restos aromáticos Phe, Tyr y Trp, y el reemplazo de los aminoácidos de pequeño tamaño Ala, Ser, Thr, Met y Gly. Además de la sustitución de aminoácidos conservativa, las variantes de la presente invención tal como se definen en las reivindicaciones incluyen (i) sustituciones por uno o más de los restos de aminoácido no conservados, en las que los restos de aminoácido sustituidos pueden estar codificados o no por el código genético, o (ii) la sustitución por uno o más de restos de aminoácido que tienen un grupo sustituyente, o (iii) la fusión del polipéptido maduro con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la estabilidad y/o solubilidad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) la fusión del polipéptido con aminoácidos adicionales, tales como un péptido de la región de fusión Fc de IgG, o una secuencia líder o secretora, o una secuencia que facilita la purificación. Se considera que tales polipéptidos variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en el presente documento.

Por ejemplo, variantes de polipéptidos que contienen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos cargados por otros aminoácidos cargados o neutros pueden producir proteínas con características mejoradas, tales como menos agregación. La agregación de formulaciones farmacéuticas tanto reduce la actividad como aumenta el aclaramiento debido a la actividad inmunogénica del agregado. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377
(1993)).

Fragmentos de polipéptidos y polinucleótidos

En la presente descripción, un "fragmento de polinucleótido" se refiere a un polinucleótido corto que tiene una secuencia de ácido nucleico contenida en el clon depositado o mostrada en SEQ ID NO:23. Los fragmentos de nucleótidos cortos tienen al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 30 nt, o al menos aproximadamente 40 nt de longitud. Un fragmento de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, pretende incluir 20 o más bases contiguas de la secuencia de ADNc contenida en el clon depositado o la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:23. Estos fragmentos de nucleótidos son útiles como sondas de diagnóstico y cebadores tal como se trata en el presente documento. Fragmentos más grandes (por ejemplo, 150, 500, 600 nucleótidos) son parte de la invención.

Además, los ejemplos representativos de fragmentos de polinucleótidos de la descripción incluyen, por ejemplo, fragmentos que tienen una secuencia de desde aproximadamente el número de nucleótido 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 651-700, 701-750, 751-800, 800-850, 851-900, 901-950 ó 951-1000 de SEQ ID NO:23 o el ADNc contenido en el clon depositado. En este contexto, "aproximadamente" incluye los intervalos particularmente mencionados, más grandes o más pequeños en varios (5, 4, 3, 2 ó 1) nucleótidos, en cualquier extremo terminal o en ambos extremos terminales. Preferiblemente, estos fragmentos codifican para un polipéptido que tiene actividad biológica. Más preferiblemente, estos polinucleótidos pueden usarse como sondas o cebadores tal como se trata en el presente documento.

En la presente descripción, un "fragmento de polipéptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos corta contenida en SEQ ID NO:60 o codificada por el ADNc contenido en el clon depositado. Los fragmentos de proteína pueden ser "independientes", o estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande del que el fragmento forma una parte o región, lo más preferiblemente como una única región continua. Los ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la descripción incluyen, por ejemplo, fragmentos de desde aproximadamente el número de aminoácido 1-20, 21-40, 41-60, 61-80 u 81-100. Además, los fragmentos de polipéptidos de la invención pueden tener aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 aminoácidos de longitud. En este contexto, "aproximadamente" incluye los intervalos particularmente mencionados, más grandes o más pequeños en varios (5, 4, 3, 2 ó 1) aminoácidos, en cualquier extremo o en ambos extremos.

Los fragmentos de polipéptidos preferidos incluyen la proteína secretada así como la forma madura. Los fragmentos de polipéptidos preferidos adicionales incluyen la proteína secretada o la forma madura que tienen una serie continua de restos delecionados de los extremos amino o carboxilo terminales, o ambos. Por ejemplo, puede delecionarse cualquier número de aminoácidos, que oscila desde 1-60, del extremo amino terminal de o bien el polipéptido secretado o bien la forma madura. De manera similar, puede delecionarse cualquier número de aminoácidos, que oscila desde 1-30, del extremo carboxilo terminal de la proteína secretada o la forma madura. Además, se prefiere cualquier combinación de las deleciones en los extremos amino y carboxilo terminales anteriores. De manera similar, se prefieren también fragmentos de polinucleótidos que codifican para estos fragmentos de polipéptidos.

Se prefieren también fragmentos de polinucleótidos y polipéptidos caracterizados por dominios estructurales o funcionales, tales como fragmentos que comprenden hélice alfa y regiones que forman hélice alfa, lámina beta y regiones que forman lámina beta, giros y regiones que forman giros, espirales y regiones que forman espirales, regiones hidrófilas, regiones hidrófobas, regiones alfa anfipáticas, regiones beta anfipáticas, regiones flexibles, regiones que forman superficies, región de unión a sustrato y regiones de alto índice antigénico. Los fragmentos de polipéptidos de SEQ ID NO:60 que se encuentran dentro de dominios conservados se contemplan específicamente por la presente invención. Además, se contemplan también fragmentos de polinucleótidos que codifican para estos dominios.

Otros fragmentos preferidos son fragmentos biológicamente activos. Fragmentos biológicamente activos son los que presentan actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad del polipéptido de la presente invención. La actividad biológica de los fragmentos puede incluir una actividad deseada mejorada, o una actividad no deseada disminuida.

Epítopos y anticuerpos

En la presente descripción, "epítopos" se refiere a fragmentos de polipéptidos que tienen actividad antigénica o inmunogénica en un animal, especialmente en un ser humano. Una realización preferida de un fragmento de polipéptido de la presente invención se refiere a fragmentos que comprenden un epítopo. En consecuencia, se prefieren asimismo polinucleótidos de la presente invención que codifican para tales fragmentos. Una región de una molécula de proteína a la que un anticuerpo puede unirse se define como "epítopo antigénico". En cambio, un "epítopo inmunogénico" se define como una parte de una proteína que provoca una respuesta de anticuerpos. (Véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 81:3998-4002 (1983)).

Pueden producirse fragmentos que funcionan como epítopos mediante cualquier medio convencional. (Véase, por ejemplo, Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 82:5131-5135 (1985) descrito adicionalmente en la patente estadounidense n.º 4.631.211).

En la presente descripción, los epítopos antigénicos contienen preferiblemente una secuencia de al menos siete, más preferiblemente al menos nueve y lo más preferiblemente entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Los péptidos antigénicos son útiles para generar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al epítopo. (Véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984); Sutcliffe, J. G. et al., Science 219:660-666 (1983)).

De manera similar, pueden usarse epítopos inmunogénicos para inducir anticuerpos según métodos bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., citado anteriormente; Wilson et al., citado anteriormente; Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914; y Bittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)). Un epítopo inmunogénico preferido incluye la proteína secretada. Los epítopos inmunogénicos pueden presentarse junto con una proteína portadora, tal como una albúmina, a un sistema animal (tal como conejo o ratón) o, si son suficientemente largos (al menos aproximadamente 25 aminoácidos), sin un portador. Sin embargo, se ha demostrado que epítopos inmunogénicos que comprenden tan sólo de 8 a 10 aminoácidos son suficientes para generar anticuerpos que pueden unirse a, como mínimo, epítopos lineales en un polipéptido desnaturalizado (por ejemplo, en inmunotransferencias de tipo Western).

Tal como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (AcM) pretende incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que pueden unirse específicamente a una proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto. (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por tanto, se prefieren estos fragmentos, así como los productos de un FAB u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados.

Proteínas de fusión

Cualquier polipéptido de la presente invención puede usarse para generar proteínas de fusión. Por ejemplo, el polipéptido de la presente invención, cuando se fusiona con una segunda proteína, puede usarse como etiqueta antigénica. Pueden usarse anticuerpos generados contra el polipéptido de la presente invención para detectar indirectamente la segunda proteína mediante la unión al polipéptido. Además, debido a que las proteínas secretadas seleccionan como diana ubicaciones celulares basándose en señales de comunicación, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse como moléculas de direccionamiento una vez fusionados con otras proteínas.

Los ejemplos de dominios que pueden fusionarse con polipéptidos de la presente invención incluyen no sólo secuencias señal heterólogas, sino también otras regiones funcionales heterólogas. No se necesita necesariamente que la fusión sea directa, sino que puede producirse a través de secuencias de ligador.

Además, también pueden modificarse por ingeniería genética proteínas de fusión para mejorar características del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, puede añadirse una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia durante la purificación a partir de la célula huésped o el almacenamiento y manejo posterior. Además, pueden añadirse restos peptídicos al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden eliminarse antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos para facilitar el manejo de los polipéptidos son técnicas familiares y de rutina en la técnica.

Además, pueden combinarse polipéptidos de la presente invención, incluyendo fragmentos, y específicamente epítopos, con partes del dominio constante de inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y muestran una semivida aumentada in vivo. Un ejemplo notificado describe proteína quiméricas que consisten en los primeros dos dominios del polipéptido CD4 humano y diversos dominios de las regiones constantes de las cadenas pesada o ligera de inmunoglobulinas de mamífero. (Documento EP A 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Proteínas de fusión que tienen estructuras diméricas unidas por disulfuros (debido a la IgG) pueden ser también más eficaces en la unión a y la neutralización de otras moléculas, que la proteína o el fragmento de proteína secretada monomérica sola. (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

De manera similar, el documento EP-A-O 464 533 (homólogo canadiense 2045869) da a conocer proteínas de fusión que comprenden diversas partes de una región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína humana o parte de la misma. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es beneficiosa en la terapia y el diagnóstico, y por tanto puede dar como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas. (Documento EP-A 0232 262). Alternativamente, se desearía la deleción de la parte Fc tras haberse expresado, detectado y purificado la proteína de fusión. Por ejemplo, la parte Fc puede dificultar la terapia y el diagnóstico si la proteína de fusión se usa como antígeno para inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas, tales como hIL-5, con partes Fc para el fin de realizar ensayos de selección de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. (Véase, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)).

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden fusionarse con secuencias marcadoras, tal como un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Tal como se describe en Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. Otra etiqueta peptídica útil para la purificación, la etiqueta "HA", corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe. (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)).

Por tanto, cualquiera de estas fusiones anteriores puede modificarse por ingeniería genética usando los polinucleótidos o los polipéptidos de la presente invención.

Vectores, células huésped y producción de proteínas

La presente invención se refiere también a vectores que contienen el polinucleótido de la presente invención, a células huésped y a la producción de polipéptidos por técnicas recombinantes. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser de replicación competente o de replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral se producirá generalmente sólo en células huésped de complementación.

Los polinucleótidos pueden unirse a un vector que contiene un marcador seleccionable para su propagación en un huésped. Generalmente, se introduce un vector de plásmido en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, puede empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetamiento apropiada y luego transducirse al interior de células huésped.

El inserto de polinucleótido debe estar operativamente unido a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp, phoA y tac de E. coli, los promotores tardío y temprano de SV40 y promotores de LTR retrovirales, por nombrar unos cuantos. El experto conocerá otros promotores adecuados. Los constructos de expresión contendrán además sitios para la iniciación y terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosomas para la traducción. La parte codificante de los transcritos expresados por los constructos incluirán preferiblemente un codón de iniciación de la traducción al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) apropiadamente colocado al final del polipéptido que va a traducirse.

Tal como se indica, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen dihidrofolato reductasa, G418 o genes de resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas y genes de resistencia a tetraciclina, kanamicina o ampicilina para cultivar en E. coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de huéspedes apropiados incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insecto tales como células S2 de Drosophila y células Sf9 de Spodoptera; células animales tales como células CHO, COS, 293 y de melanoma de Bowes; y células vegetales. Se conocen en la técnica condiciones y medios de cultivo apropiados para las células huésped descritas anteriormente.

Entre los vectores preferidos para su uso en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles de
QIAGEN, Inc.; vectores pBluescript, vectores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene Cloning Systems, Inc.; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia Biotech, Inc. Entre los vectores eucariotas preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el experto en la técnica.

La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986). Se contempla específicamente que los polipéptidos de la presente invención puedan expresarse de hecho por una célula huésped que carece de un vector recombinante.

Un polipéptido de esta invención puede recuperarse y purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía con lectinas. Lo más preferiblemente, se emplea cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") para la purificación.

Los polipéptidos de la presente invención, y preferiblemente la forma secretada, pueden recuperarse también de: productos purificados a partir de fuentes naturales, incluyendo líquidos corporales, tejidos y células, ya estén directamente aislados o cultivados; productos de procedimientos sintéticos químicos; y productos producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota o procariota, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilado o pueden estar no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden incluir también un resto de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por el huésped. Por tanto, se conoce bien en la técnica que la metionina N-terminal codificada por el codón de iniciación de la traducción se elimina generalmente con alta eficacia de cualquier proteína tras su traducción en todas las células eucariotas. Aunque la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también se elimina eficazmente en la mayoría de los procariotas, para algunas proteínas, este proceso de eliminación en procariotas es ineficaz, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que está unida covalentemente la metionina N-terminal.

Usos de los polinucleótidos

Cada uno de los polinucleótidos identificados en el presente documento puede usarse de numerosas formas como reactivo. La siguiente descripción debe considerarse a modo de ejemplo y utiliza técnicas conocidas.

Los polinucleótidos de la presente invención son útiles para la identificación de cromosomas. Existe una necesidad creciente de identificar nuevos marcadores de cromosomas, puesto que están disponibles en la actualidad pocos reactivos de marcaje de cromosomas, basándose en datos de secuencia reales (polimorfismos de repetición). Cada polinucleótido de la presente invención puede usarse como marcador de cromosomas.

En resumen, pueden mapearse secuencias en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir de la secuencia mostrada en SEQ ID NO:23. Pueden seleccionarse cebadores usando análisis informático de modo que los cebadores no abarquen más de un exón pronosticado en el ADN genómico. Estos cebadores se usan entonces para la selección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente a la SEQ ID NO:23 producirán un fragmento amplificado.

De manera similar, híbridos somáticos proporcionan un método rápido de mapeo por PCR de los polinucleótidos en cromosomas particulares. Pueden asignarse tres o más clones al día usando un único termociclador. Además, puede lograrse la sublocalización de los polinucleótidos con paneles de fragmentos de cromosomas específicos. Otras estrategias de mapeo génico que pueden usarse incluyen hibridación in situ, selección previa con cromosomas marcados clasificados por flujo y preselección mediante hibridación para construir bibliotecas de ADNc específico de cromosoma.

Puede lograrse también una ubicación cromosómica precisa de los polinucleótidos usando hibridación por fluorescencia in situ (FISH) de una extensión cromosómica en metafase. Esta técnica usa polinucleótidos de tan sólo 500 ó 600 bases; sin embargo, se prefieren polinucleótidos de 2.000-4.000 pb. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., "Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques", Pergamon Press, Nueva York (1988).

Para el mapeo de cromosomas, los polinucleótidos pueden usarse individualmente (para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma) o en paneles (para marcar múltiples sitios y/o múltiples cromosomas). Polinucleótidos preferidos corresponden a las regiones no codificantes de los ADNc porque es más probable que las secuencias codificantes estén conservadas dentro de las familias génicas, aumentando así la posibilidad de hibridación cruzada durante el mapeo cromosómico.

Una vez que se ha mapeado un polinucleótido en una ubicación cromosómica precisa, puede usarse la posición física del polinucleótido en un análisis de ligamiento. El análisis de ligamiento establece la herencia conjunta entre una ubicación cromosómica y la presentación de una enfermedad particular. (Se encuentran datos de mapeo de enfermedades, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible online a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad Johns Hopkins)). Suponiendo una resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb, un ADNc localizado de manera precisa en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de 50-500 posibles genes causantes.

Por tanto, una vez establecida la herencia conjunta, pueden examinarse diferencias en el polinucleótido y el gen correspondiente entre individuos afectados y no afectados. En primer lugar, se examinan alteraciones estructurales visibles en los cromosomas, tales como deleciones o translocaciones, en extensiones de cromosomas o mediante PCR. Si no existen alteraciones estructurales, se determina la presencia de mutaciones puntuales. Las mutaciones observadas en algunos o todos los individuos afectados, pero no en individuos normales, indica que la mutación puede provocar la enfermedad. Sin embargo, se requiere la secuenciación completa del polipéptido y el gen correspondiente de varios individuos normales para distinguir la mutación de un polimorfismo. Si se identifica un nuevo polimorfismo, puede usarse este polipéptido polimórfico para un análisis de ligamiento adicional.

Además, puede evaluarse la expresión aumentada o disminuida del gen en individuos afectados en comparación con individuos no afectados usando polinucleótidos de la presente invención. Cualquiera de estas alteraciones (expresión alterada, redisposición cromosómica o mutación) puede usarse como marcador de diagnóstico o pronóstico.

Además de lo anterior, puede usarse un polinucleótido puede controlar la expresión génica a través de la formación de triple hélice o ARN o ADN antisentido. Ambos métodos se basan en la unión del polinucleótido a ADN o ARN. Para estas técnicas, polinucleótidos preferidos tienen habitualmente de 20 a 40 bases de longitud y son complementarios a o bien la región del gen implicado en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); y Dervan et al., Science 251:1360 (1991)) o bien al propio ARNm (antisentido - Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); Oligodeoxy-nucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). La formación de triple hélice da como resultado de manera óptima una interrupción de la transcripción de ARN a partir de ADN, mientras que la hibridación con ARN antisentido bloquea la traducción de una molécula de ARNm en un polipéptido. Ambas técnicas son eficaces en sistemas modelo, y la información dada a conocer en el presente documento puede usarse para diseñar polinucleótidos de triple hélice o antisentido en un esfuerzo por tratar la enfermedad.

Los polinucleótidos de la presente invención también son útiles en terapia génica. Un objetivo de la terapia génica es insertar un gen normal en un organismo que tiene un gen defectuoso, en un esfuerzo por corregir el defecto genético. Los polinucleótidos descritos en la presente invención ofrecen un medio para seleccionar como diana tales defectos genéticos de una manera sumamente precisa. Otro objetivo es insertar un nuevo gen que no estaba presente en el genoma del huésped, produciendo de ese modo un nuevo rasgo en la célula huésped.

Los polinucleótidos también son útiles para identificar individuos a partir de muestras biológicas mínimas. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, está considerando el uso del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) para la identificación de su personal. En esta técnica, se digiere el ADN genómico de un individuo con una o más enzimas de restricción, y se estudia con sonda en una transferencia de tipo Southern para producir bandas únicas para identificar al personal. Este método no se ve afectado por las limitaciones actuales de las "placas de identificación" que pueden perderse, cambiarse o robarse, lo que dificulta una identificación positiva. Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de ADN adicionales para
RFLP.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse también como una alternativa a RFLP, determinando la secuencia de ADN base por base real de partes seleccionadas del genoma de un individuo. Estas secuencias pueden usarse para preparar cebadores de PCR para amplificar y aislar tal ADN seleccionado, que puede entonces secuenciarse. Usando esta técnica, pueden identificarse individuos porque cada individuo tendrá un único conjunto de secuencias de ADN. Una vez que se establece una base de datos de ID única para un individuo, puede hacerse una identificación positiva de ese individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.

La biología forense se beneficia también del uso de técnicas de identificación basadas en ADN tal como se da a conocer en el presente documento. Pueden amplificarse secuencias de ADN tomadas de muestras biológicas muy pequeñas tales como tejidos, por ejemplo, cabello o piel, o líquidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva, semen, etc., usando PCR. En una técnica de la técnica anterior, se usan secuencias génicas amplificadas a partir de locus polimórficos, tales como el gen de HLA clase II DQa, en biología forense para identificar individuos. (Erlich, H., PCR Technology, Freeman y Co. (1992)). Una vez amplificados estos locus polimórficos específicos, se digieren con una o más enzimas de restricción, produciendo un conjunto de bandas de identificación en una transferencia de tipo Southern estudiada con sonda con ADN correspondiente al gen de HLA clase II DQa. De manera similar, pueden usarse polinucleótidos de la presente invención como marcadores polimórficos para fines
forenses.

Existe también una necesidad de reactivos que puedan identificar la fuente de un tejido particular. Tal necesidad surge, por ejemplo, en medicina forense cuando se presenta un tejido de origen desconocido. Reactivos apropiados pueden comprender, por ejemplo, sondas o cebadores de ADN específicos para un tejido particular preparado a partir de las secuencias de la presente invención. Paneles de tales reactivos pueden identificar el tejido por la especie y/o por el tipo de órgano. De un modo similar, estos reactivos pueden usarse para investigar cultivos tisulares para detectar contaminación.

Por último, los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de peso molecular en geles de Southern, como sondas de diagnóstico para detectar la presencia de un ARNm específico en un tipo celular particular, como sonda para "restar" secuencias conocidas en el proceso de descubrimiento de polinucleótidos novedosos, para seleccionar y preparar oligómeros para su unión a un "chip génico" u otro soporte, para generar anticuerpos anti-ADN usando técnicas de inmunización con ADN, y como antígeno para provocar una respuesta inmuni-
taria.

Usos de los polipéptidos

Cada uno de los polipéptidos identificados en el presente documento puede usarse de numerosos modos. La siguiente descripción debe considerarse a modo de ejemplo y utiliza técnicas conocidas.

Un polipéptido de la presente invención puede usarse para someter a ensayo los niveles de proteína en una muestra biológica usando técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, puede estudiarse la expresión de proteínas en tejidos con métodos inmunohistológicos clásicos. (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Otros métodos basados en anticuerpos útiles para detectar la expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Se conocen en la técnica marcadores de ensayo de anticuerpos adecuados e incluyen marcadores enzimáticos, tales como, glucosa oxidasa, y radioisótopos, tales como yodo (125I, 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (112In) y tecnecio (99mTc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

Además de someter a ensayo los niveles de proteínas secretadas en una muestra biológica, también pueden detectarse proteínas in vivo mediante obtención de imágenes. Los marcadores de anticuerpos o marcadores para la obtención de imágenes in vivo de proteínas incluyen aquellos detectables mediante radiografía X, RMN o REE. Para la radiografía X, los marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten radiación detectable pero que no son abiertamente perjudiciales para el sujeto. Los marcadores adecuados para RMN y REE incluyen aquellos con un espín detectable característico, tales como deuterio, que puede incorporarse en el anticuerpo mediante marcaje de nutrientes para el hibridoma relevante.

Un fragmento de anticuerpo o anticuerpo específico de proteína que se ha marcado con un resto de obtención de imágenes detectable apropiado, tal como un radioisótopo (por ejemplo, 131I, 112In, 99mTc), una sustancia radioopaca, o un material detectable mediante resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, por vía subcutánea o por vía intraperitoneal) en el mamífero. Se entenderá en la técnica que el tamaño del sujeto y el sistema de obtención de imágenes usado determinarán la cantidad de resto de obtención de imágenes necesario para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de un resto de radioisótopo, para un sujeto humano, la cantidad de radiactividad inyectada oscilará normalmente desde aproximadamente 5 hasta 20 milicuries de 99mTc. El fragmento de anticuerpo o anticuerpo marcado se acumulará entonces preferentemente en la ubicación de células que contienen la proteína específica. La obtención de imágenes de tumores in vivo se describe en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments". (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel y B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

Por tanto, la invención proporciona un método de diagnóstico de un trastorno, que implica (a) someter a ensayo la expresión de un polipéptido de la presente invención en células o líquido corporal de un individuo; (b) comparar el nivel de expresión génica con un nivel de expresión génica convencional, mediante lo cual un aumento o descenso en el nivel de expresión génica del polipéptido sometido a ensayo en comparación con el nivel de expresión convencional es indicativo de un trastorno.

Además, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para tratar una enfermedad. Por ejemplo, puede administrarse a pacientes un polipéptido de la presente invención en un esfuerzo por reemplazar niveles ausentes o disminuidos del polipéptido (por ejemplo, insulina), para complementar niveles ausentes o disminuidos de un polipéptido diferente (por ejemplo, hemoglobina S para hemoglobina B), para inhibir la actividad de un polipéptido (por ejemplo, un oncogén), para activar la actividad de un polipéptido (por ejemplo, mediante unión a un receptor), para reducir la actividad de un receptor unido a membrana compitiendo con el mismo por ligando libre (por ejemplo, receptores de TNF soluble usados para reducir la inflamación), o para provocar una respuesta deseada (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos).

De manera similar, pueden usarse también anticuerpos dirigidos frente a un polipéptido de la presente invención para tratar una enfermedad. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo dirigido frente a un polipéptido de la presente invención puede unirse y reducir la sobreproducción del polipéptido. De manera similar, la administración de un anticuerpo puede activar el polipéptido, tal como mediante unión a un polipéptido unido a una membrana (receptor).

Por último, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE o en columnas de filtración en gel de tamiz molecular usando métodos bien conocidos para los expertos en la técnica. Los polipéptidos pueden usarse también para generar anticuerpos, que a su vez se usan para medir la expresión de proteínas a partir de una célula recombinante, como un modo de evaluar la transformación de la célula huésped. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para someter a prueba las siguientes actividades biológicas.

Actividades biológicas

Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden usarse en ensayos para someter a prueba una o más actividades biológicas. Si estos polinucleótidos y polipéptidos presentan actividad en un ensayo particular, es probable que estas moléculas estén implicadas en las enfermedades asociadas con la actividad biológica. Por tanto, los polinucleótidos y polipéptidos podrían usarse para tratar la enfermedad asociada.

Actividad inmunitaria

Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede ser útil en el tratamiento de deficiencias o trastornos del sistema inmunitario, activando o inhibiendo la proliferación, diferenciación o movilización (quimiotaxis) de células inmunitarias. Las células inmunitarias se desarrollan a través de un proceso denominado hematopoyesis, que produce células mieloides (plaquetas, glóbulos rojos, neutrófilos y macrófagos) y linfoides (linfocitos B y T) a partir de células madre pluripotentes. La etiología de estos trastornos o deficiencias inmunitarios puede ser genética, somática, tal como cáncer o algunos trastornos autoinmunitarios, adquiridos (por ejemplo, por quimioterapia o toxinas) o infecciosos. Además, un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede usarse como marcador o detector de un trastorno o una enfermedad del sistema inmunitario particular.

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede ser útil en el tratamiento o la detección de deficiencias o trastornos de células hematopoyéticas. El polipéptido o polinucleótido podría usarse para aumentar la diferenciación y proliferación de células hematopoyéticas, incluyendo las células madre pluripotentes, en un esfuerzo por tratar aquellos trastornos asociados con una disminución en ciertos (o muchos) tipos de células hematopoyéticas. Los ejemplos de síndromes de deficiencia inmunológica incluyen, pero no se limitan a: trastornos de proteínas sanguíneas (por ejemplo agammaglobulinemia, disgammaglobulinemia), ataxia telangiectasia, inmunodeficiencia variable común, síndrome de Digeorge, infección por VIH, infección por VLTH-VLB, síndrome de deficiencia de adhesión leucocitaria, linfopenia, disfunción de fagocito bactericida, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), trastorno de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia o hemoglobinuria.

Además, un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción podría usarse para modular la actividad hemostática (la detención de la hemorragia) o trombolítica (formación del coágulo). Por ejemplo, aumentando la actividad hemostática o trombolítica, el polinucleótido o polipéptido podría usarse para tratar trastornos de la coagulación sanguínea (por ejemplo, afibrinogenemia, deficiencias de factores), trastornos de plaquetas sanguíneas (por ejemplo tromboctopenia), o heridas que resultan de traumatismos, cirugía u otras causas. Alternativamente, un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción que pueda disminuir la actividad hemostática o trombolítica podría usarse para inhibir o disolver la coagulación. Estas moléculas podrían ser importantes en el tratamiento de ataques al corazón (infarto), accidentes cerebrovasculares o cicatrización.

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede ser útil también en el tratamiento o detección de trastornos autoinmunitarios. Muchos trastornos autoinmunitarios resultan del reconocimiento inapropiado de material propio como foráneo por células inmunitarias. Este reconocimiento inapropiado da como resultado una respuesta inmunitaria que conduce a la destrucción del tejido del huésped. Por tanto, la administración de un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción que inhibe una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación, diferenciación o qumiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención de trastornos autoinmunitarios.

Los ejemplos de trastornos autoinmunitarios que pueden tratarse o detectarse incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Addison, anemia hemolítica, síndrome antifosfolipídico, artritis reumatoide, dermatitis, encefalomielitis alérgica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Graves, esclerosis múltiple, miastenia grave, neuritis, oftalmia, penfigoide ampolloso, pénfigo, poliendocrinopatías, púrpura, enfermedad de Reiter, síndrome de Stiff-Man, tiroiditis autoinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, inflamación pulmonar autoinmunitaria, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus insulinodependiente y enfermedad ocular inflamatoria autoinmunitaria.

De manera similar, también pueden tratarse estados y reacciones alérgicas, tales como asma (particularmente asma alérgico) u otros problemas respiratorios, mediante un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción. Además, estas moléculas pueden usarse para tratar anafilaxia, hipersensibilidad a una molécula antigénica o incompatibilidad de grupos sanguíneos.

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede usarse también para tratar y/o prevenir el rechazo de órganos o la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). El rechazo de órganos se produce mediante la destrucción por células inmunitarias del huésped del tejido trasplantado a través de una respuesta inmunitaria. De manera similar, una respuesta inmunitaria también está implicada en EICH aunque, en este caso, las células inmunitarias trasplantadas foráneas destruyen los tejidos del huésped. La administración de un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción que inhibe una respuesta inmunitaria, particularmente la proliferación, diferenciación o quimiotaxis de células T, puede ser una terapia eficaz en la prevención del rechazo de órganos o EICH.

De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse también para modular la inflamación. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido puede inhibir la proliferación y diferenciación de células implicadas en una respuesta inflamatoria. Estas moléculas pueden usarse para tratar estados inflamatorios, tanto estados crónicos como agudos, incluyendo inflamación asociada con infección (por ejemplo, choque septicémico, septicemia o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)), lesión por isquemia-reperfusión, letalidad por endotoxinas, artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis, lesión pulmonar inducida por citocinas o quimiocinas, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, o que resulta de una sobreproducción de citocinas (por ejemplo, TNF o IL-1).

Trastornos hiperproliferativos

Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse para tratar o detectar trastornos hiperproliferativos, incluyendo neoplasmas. El polipéptido o polinucleótido puede inhibir la proliferación del trastorno a través de interacciones directas o indirectas. Alternativamente, el polipéptido o polinucleótido puede hacer que proliferen otras células que pueden inhibir el trastorno hiperproliferativo.

Por ejemplo, aumentando una respuesta inmunitaria, particularmente aumentando las cualidades antigénicas del trastorno hiperproliferativo o haciendo que proliferen, se diferencien o se movilicen células T, pueden tratarse trastornos hiperproliferativos. Esta respuesta inmunitaria puede aumentarse o bien potenciando una respuesta inmunitaria existente, o bien iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, la disminución de una respuesta inmunitaria puede ser también un método de tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tal como un agente
quimioterápico.

Los ejemplos de trastornos hiperproliferativos que pueden tratarse o detectarse mediante un polinucleótido o polipéptido de la presente invención incluyen, pero no se limitan a neoplasmas ubicados en el: abdomen, hueso, mama, sistema digestivo, hígado, páncreas, peritoneo, glándulas endocrinas (suprarrenal, paratiroidea, hipofisaria, testículos, ovarios, timo, tiroides), ojo, cabeza y cuello, sistema nervioso (central y periférico), sistema linfático, pelvis, piel, tejido blando, bazo, tórax y sistema urogenital.

De manera similar, otros trastornos hiperproliferativos pueden tratarse o detectarse mediante un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción. Los ejemplos de tales trastornos hiperproliferativos incluyen, pero no se limitan a: hipergammaglobulinemia, trastornos linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura, sarcoidosis, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstron, enfermedad de Gaucher, histiocitosis y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, ubicada en un sistema de órganos enumerado anteriormente.

Enfermedades infecciosas

Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse para tratar o detectar agentes infecciosos. Por ejemplo, aumentando la respuesta inmunitaria, particularmente aumentando la proliferación y diferenciación de células B y/o T, pueden tratarse enfermedades infecciosas. La respuesta inmunitaria puede aumentarse o bien potenciando una respuesta inmunitaria existente, o bien iniciando una nueva respuesta inmunitaria. Alternativamente, el polipéptido o polinucleótido puede inhibir también directamente el agente infeccioso, sin provocar necesariamente una respuesta inmunitaria.

Los virus son un ejemplo de un agente infeccioso que puede provocar una enfermedad o síntomas que pueden tratarse o detectarse mediante un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción. Los ejemplos de virus incluyen, pero no se limitan a las siguientes familias de virus de ADN y ARN: Arbovirus, Adenoviridae, Arenaviridae, Arterivirus, Birnaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Circoviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae (hepatitis), Herpesviridae (tal como, citomegalovirus, herpes simple, herpes zóster), Mononegavirus (por ejemplo, Paramyxoviridae, Morbillivirus, Rhabdoviridae), Orthomyxoviridae (por ejemplo, Influenza), Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tal como viruela o Vaccinia), Reoviridae (por ejemplo, Rotavirus), Retroviridae (VLTH-I, VLTH-II, Lentivirus) y Togaviridae (por ejemplo, Rubivirus). Los virus que se encuentran dentro de estas familias pueden provocar una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitarse a: artritis, bronquiolitis, encefalitis, infecciones oculares (por ejemplo, conjuntivitis, queratitis), síndrome de fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, activa crónica, delta), meningitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, SIDA), neumonía, linfoma de Burkitt, varicela, fiebre hemorrágica, sarampión, paperas, parainfluenza, rabia, resfriado común, poliomielitis, leucemia, rubéola, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades cutáneas (por ejemplo, sarcoma de Kaposi, verrugas) y viremia. Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades.

De manera similar, los agentes bacterianos o fúngicos que pueden provocar una enfermedad o síntomas y que pueden tratarse o detectarse mediante un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias bacterianas Gram-negativas y Gram-positivas y hongos: Actinomycetales (por ejemplo, Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia), aspergilosis, Bacillaceae (por ejemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, blastomicosis, Bordetella, Borrelia, brucelosis, candidiasis, Campylobacter, coccidioidomicosis, criptococosis, dermatomicosis, Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella, Serratia, Yersinia), Erysipelothrix, Helicobacter, legionelosis, leptospirosis, Listeria, Mycoplasmatales, Neisseriaceae (por ejemplo, Acinetobacter, Gonorrhea, meningococos), infecciones por Pasteurellacea (por ejemplo, Actinobacillus, Heamophilus, Pasteurella), Pseudomonas, Rickettsiaceae, Chlamydiaceae, sífilis y estafilococos. Estas familias bacterianas o fúngicas pueden provocar las siguientes enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitarse a: bacteremia, endocarditis, infecciones oculares (conjuntivitis, tuberculosis, uveitis), gingivitis, infecciones oportunistas (por ejemplo, infecciones relacionadas con el SIDA), paroniquia, infecciones relacionadas con prótesis, enfermedad de Reiter, infecciones de las vías respiratorias, tales como tos ferina o empiema, septicemia, enfermedad de Lyme, enfermedad por arañazo de gato, disentería, fiebre paratifoidea, envenenamiento alimentario, fiebre tifoidea, neumonía, gonorrea, meningitis, clamidiosis, sífilis, difteria, lepra, paratuberculosis, tuberculosis, lupus, botulismo, gangrena, tétanos, impétigo, fiebre reumática, escarlatina, enfermedades de transmisión sexual, enfermedades cutáneas (por ejemplo, celulitis, dermatomicosis), toxemia, infecciones de las vías urinarias, infecciones de heridas. Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades.

Además, los agentes parasitarios que provocan una enfermedad o síntomas que pueden tratarse o detectarse mediante un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, las siguientes familias: amebiasis, babesiosis, coccidiosis, criptosporidiosis, dientamoebiasis, durina, ectoparasitosis, giardiasis, helmintiasis, leishmaniosis, theileriosis, toxoplasmosis, tripanosomiasis y Trichomonas. Estos parásitos pueden provocar una variedad de enfermedades o síntomas, incluyendo, pero sin limitarse a: sarna, trombiculiasis, infecciones oculares, enfermedad intestinal (por ejemplo, disenteria, giardiasis), enfermedad hepática, enfermedad pulmonar, infecciones oportunistas (por ejemplo, relacionadas con el SIDA), malaria, complicaciones del embarazo y toxoplasmosis. Un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción puede usarse para tratar o detectar cualquiera de estos síntomas o enfermedades.

Preferiblemente, el tratamiento usando un polipéptido o polinucleótido de la presente descripción podría ser o bien administrando una cantidad eficaz del polipéptido al paciente, o bien extrayendo células del paciente, administrando a las células el polinucleótido y devolviendo las células modificadas por ingeniería genética al paciente (terapia ex vivo). Además, el polipéptido o polinucleótido puede usarse como antígeno en una vacuna para generar una respuesta inmunitaria contra una enfermedad infecciosa.

Regeneración

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede usarse para hacer que se diferencien, proliferen o se atraigan células, conduciendo a la regeneración de tejidos. (Véase, Science 276:59-87 (1997)). La regeneración de tejidos podría usarse para reparar, reemplazar o proteger tejido dañado por defectos congénitos, traumatismos (heridas, quemaduras, incisiones o úlceras), la edad, una enfermedad (por ejemplo osteoporosis, artrosis, enfermedad periodontal, insuficiencia hepática), cirugía, incluyendo cirugía plástica cosmética, fibrosis, lesión por reperfusión o daño sistémico por citocinas.

Los tejidos que podrían regenerarse usando la presente invención incluyen órganos (por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), músculo (liso, esquelético o cardiaco), vascular (incluyendo endotelio vascular), tejido nervioso, hematopoyético y esquelético (hueso, cartílago, tendones y ligamentos). Preferiblemente, la regeneración se produce sin cicatrización o con disminución de la cicatrización. La regeneración también puede incluir
angiogénesis.

Además, un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede aumentar la regeneración de tejidos difíciles de curar. Por ejemplo, un aumento de la regeneración de tendones/ligamentos aceleraría el tiempo de recuperación tras el daño. El polinucleótido o polipéptido podría usarse también de manera profiláctica en un esfuerzo por evitar el daño. Las enfermedades específicas que podrían tratarse incluyen tendinitis, síndrome del túnel carpiano y otros defectos de tendones o ligamentos. Un ejemplo adicional de regeneración de tejido de heridas que no cicatrizan incluye úlceras de decúbito, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, quirúrgica y heridas traumáticas.

De manera similar, también podría regenerarse tejido cerebral y nervioso usando un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción para hacer que proliferen y se diferencien células nerviosas. Las enfermedades que podrían tratarse usando este método incluyen enfermedades del sistema nervioso central y periférico, neuropatías, o trastornos traumáticos y mecánicos (por ejemplo, trastornos de la médula espinal, traumatismo craneal, enfermedad cerebrovascular y accidente cerebrovascular). Específicamente, enfermedades asociadas con lesiones de nervios periféricos, neuropatía periférica (por ejemplo, que resulta de quimioterapia u otras terapias médicas), neuropatías localizadas y enfermedades del sistema nervioso central (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager), podrían tratarse todas usando el polinucleótido o polipéptido de la presente descripción.

Quimiotaxis

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede tener actividad de quimiotaxis. Una molécula quimiotáctica atrae o moviliza células (por ejemplo, monocitos, fibroblastos, neutrófilos, células T, mastocitos, eosinófilos, células epiteliales y/o endoteliales) a un sitio particular en el organismo, tal como inflamación, infección o sitio de hiperproliferación. Las células movilizadas pueden entonces combatir y/o curar la anomalía o traumatismo particular.

Un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción puede aumentar la actividad quimiotáctica de células particulares. Estas moléculas quimiotácticas pueden usarse entonces para tratar la inflamación, infección o trastornos hiperproliferativos, o cualquier trastorno del sistema inmunitario aumentando el número de células dirigidas a una ubicación particular en el organismo. Por ejemplo, pueden usarse moléculas quimiotácticas para tratar heridas u otro traumatismo en tejidos atrayendo células inmunitarias a la ubicación lesionada. Las moléculas quimiotácticas de la presente descripción también pueden atraer fibroblastos, que pueden usarse para tratar heridas.

Se contempla también que un polinucleótido o polipéptido de la presente descripción pueda inhibir la actividad quimiotáctica. Estas moléculas podrían usarse también para tratar trastornos. Por tanto, el polinucleótido o polipéptido podría usarse como inhibidor de la qumiotaxis.

Actividad de unión

Un polipéptido de la presente descripción puede usarse para seleccionar moléculas que se unen al polipéptido o moléculas a las que se une el polipéptido. La unión del polipéptido y la molécula puede activar (agonista), aumentar, inhibir (antagonista) o disminuir la actividad del polipéptido o la molécula unida. Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo, receptores) o moléculas pequeñas.

Preferiblemente, la molécula está estrechamente relacionada con el ligando natural del polipéptido, por ejemplo, un fragmento del ligando, o un sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional. (Véase, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): capítulo 5 (1991)). De manera similar, la molécula puede estar estrechamente relacionada con el receptor natural al que se une el polipéptido, o al menos, un fragmento del receptor al que se une el polipéptido (por ejemplo, sitio activo). En cualquier caso, la molécula puede diseñarse racionalmente usando técnicas conocidas.

Preferiblemente, la selección de estas moléculas implica producir células apropiadas que expresan el polipéptido, o bien como una proteína secretada o bien en la membrana celular. Las células preferidas incluyen células de mamíferos, levaduras, Drosophila o E. coli. Las células que expresan el polipéptido (o la membrana celular que contiene el polipéptido expresado) se ponen en contacto entonces preferiblemente con un compuesto de prueba que contiene posiblemente la molécula para observar la unión, estimulación o inhibición de la actividad de o bien el polipéptido o bien la molécula.

El ensayo puede simplemente someter a prueba la unión de un compuesto candidato al polipéptido, en el que se detecta la unión mediante un marcador, o en un ensayo que implica competición con un competidor marcado. Además, el ensayo puede someter a prueba si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la unión al polipéptido.

Alternativamente, el ensayo puede llevarse a cabo usando preparaciones libres de células, polipéptidos/moléculas fijados a un soporte sólido, bibliotecas químicas o mezclas de productos naturales. El ensayo también puede comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una disolución que contiene un polipéptido, medir la actividad o unión del polipéptido/molécula y comparar la actividad o unión del polipéptido/molécula con un patrón.

Preferiblemente, un ensayo ELISA puede medir la actividad o el nivel del polipéptido en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica) usando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir la actividad o el nivel del polipéptido o bien uniéndose, directa o indirectamente, al polipéptido o bien compitiendo con el polipéptido por un sustrato.

Todos estos ensayos anteriores pueden usarse como marcadores de diagnóstico o pronóstico. Las moléculas descubiertas usando estos ensayos pueden usarse para tratar una enfermedad o para ocasionar un resultado particular en un paciente (por ejemplo, crecimiento de vasos sanguíneos) activando o inhibiendo el polipéptido/molécula. Además, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción del polipéptido a partir de tejidos o células adecuadamente manipulados.

Por tanto, la invención incluye un método de identificación de compuestos que se unen a un polipéptido de la invención que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con un polipéptido de la invención; y (b) determinar si se ha producido unión. Además, la descripción incluye un método de identificación de agonistas/antagonistas que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con un polipéptido de la invención, (b) someter a ensayo una actividad biológica, y (b) determinar si se ha alterado una actividad biológica del polipéptido.

Otras actividades

Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede aumentar o disminuir la diferenciación o proliferación de células madre embrionarias, además, tal como se trató anteriormente, del linaje hematopoyético.

Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención pude usarse también para modular características de mamíferos, tales como la altura, el peso corporal, el color del pelo, el color de los ojos, la piel, el porcentaje de tejido adiposo, la pigmentación, el tamaño y la forma (por ejemplo, cirugía cosmética). De manera similar, un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede usarse para modular el metabolismo de mamíferos afectando al catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización y almacenamiento de energía.

Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede usarse para cambiar el estado físico o el estado mental de un mamífero influyendo en los biorritmos, ritmos circadianos, depresión (incluyendo trastornos depresivos), tendencia a la violencia, tolerancia al dolor, capacidades reproductoras (preferiblemente mediante actividad de tipo activina o inhibina), niveles hormonales o endocrinos, apetito, líbido, memoria, estrés u otras cualidades cogni-
tivas.

Un polipéptido o polinucleótido de la presente invención puede usarse también como conservante o aditivo alimentario, tal como para aumentar o disminuir las capacidades de almacenamiento, el contenido en grasa, lípidos, proteínas, hidratos de carbono, vitaminas, minerales, cofactores u otros componentes nutricionales.

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Otras cuestiones

Se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 tal como se define en la tabla 1.

También se describe una molécula de ácido nucleico en la que dicha secuencia de nucleótidos contiguos está incluida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 5' de la secuencia del clon y que acaba con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 3' de la secuencia del clon tal como se define para SEQ ID NO:23 en la tabla 1.

También se describe una molécula de ácido nucleico en la que dicha secuencia de nucleótidos contiguos está incluida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 5' del codón de iniciación y que acaba con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 3' de la secuencia del clon tal como se define para SEQ ID NO:23 en la tabla 1.

De manera similar se describe una molécula de ácido nucleico en la que dicha secuencia de nucleótidos contiguos está incluida en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 en el intervalo de posiciones que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 5' del primer aminoácido del péptido señal y que acaba con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 3' de la secuencia del clon tal como se define para SEQ ID NO:23 en la tabla 1.

Una realización preferida de la presente invención es una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 150 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23.

Se describe además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23.

Se describe además una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 que comienza con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 5' del primer aminoácido del péptido señal y que acaba con el nucleótido en aproximadamente la posición del nucleótido en 3' de la secuencia del clon tal como se define para SEQ ID NO:23 en la tabla 1.

Se describe además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos completa de SEQ ID NO:23.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico, en la que dicha molécula de ácido nucleico que hibrida no hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste sólo en restos de A o sólo en restos de T.

También se prefiere una molécula de ADN que comprende un clon de ADNc humano identificado como el depósito de la ATCC n.º 209075, molécula de ADN que está contenida en el material depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo y al que se le asignó número de depósito de la ATCC mostrado en la tabla 1 para dicho identificador de clon de ADNc.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc humano, molécula de ADN que está contenida en depósito al que se le asignó el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada, estando incluida dicha secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos de la secuencia completa de marco de lectura abierto codificada por dicho clon de ADNc humano.

También se prefiere una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica una secuencia de al menos 150 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos codificada por dicho clon de ADNc humano.

Se describe además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica una secuencia de al menos 500 nucleótidos contiguos en la secuencia de nucleótidos codificada por dicho clon de ADNc humano.

Se describe además una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos completa codificada por dicho clon de ADNc humano.

Se describe además un método para detectar en una muestra biológica una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075; método que comprende una etapa de comparar una secuencia de nucleótidos de al menos una molécula de ácido nucleico en dicha muestra con una secuencia seleccionada de dicho grupo y determinar si la secuencia de dicha molécula de ácido nucleico en dicha muestra es al menos el 95% idéntica a dicha secuencia seleccio-
nada.

También se describe el método anterior en el que dicha etapa de comparar secuencias comprende determinar el grado de hibridación de ácido nucleico entre moléculas de ácido nucleico en dicha muestra y una molécula de ácido nucleico que comprende dicha secuencia seleccionada de dicho grupo. De manera similar, también se describe el método anterior en el que dicha etapa de comparar secuencias se realiza comparando la secuencia de nucleótidos determinada a partir de una molécula de ácido nucleico en dicha muestra con dicha secuencia seleccionada de dicho grupo. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN.

Se describe además un método para identificar la especie, el tejido o el tipo de célula de una muestra biológica, método que comprende una etapa de detectar moléculas de ácido nucleico en dicha muestra, si hay alguna, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

El método para identificar la especie, el tejido o el tipo de célula de una muestra biológica puede comprender una etapa de detectar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos en un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, siendo al menos una secuencia en dicho panel al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada de dicho grupo.

También se prefiere un método para diagnosticar en un sujeto un estado patológico asociado con una expresión o estructura anómala de un gen que codifica una proteína secretada identificada en la tabla 1, método que comprende una etapa de detectar en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto moléculas de ácido nucleico, si hay alguna, que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23; y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

El método para diagnosticar un estado patológico puede comprender una etapa de detectar moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos en un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, siendo al menos una secuencia en dicho panel al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada de dicho grupo.

También se describe una composición de materia que comprende moléculas de ácido nucleico aisladas, comprendiendo las secuencias de nucleótidos de dichas moléculas de ácido nucleico un panel de al menos dos secuencias de nucleótidos, siendo al menos una secuencia en dicho panel al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos 50 nucleótidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:23 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de nucleótidos codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075. Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender moléculas de ADN o moléculas de ARN.

También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1.

También se describe un polipéptido, en el que dicha secuencia de aminoácidos contiguos está incluida en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 en el intervalo de posiciones que comienza con el resto en aproximadamente la posición del primer aminoácido de la parte secretada y que acaba con el resto en aproximadamente el último aminoácido del marco de lectura abierto tal como se expone para SEQ ID NO:60 en la tabla 1.

También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60.

Se describe además un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60.

Se prefiere adicionalmente un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO:60.

Se describe además un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos completa de una proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe un polipéptido en el que dicha secuencia de aminoácidos contiguos está incluida en la secuencia de aminoácidos de una parte secretada de la proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de la parte secretada de la proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a una secuencia de al menos aproximadamente 100 aminoácidos contiguos en la secuencia de aminoácidos de la parte secretada de la proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

Se prefiere un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos el 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la parte secretada de la proteína codificada por el clon de ADNc humano contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

Se describe además un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

Se describe además un método para detectar en una muestra biológica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075; método que comprende una etapa de comparar una secuencia de aminoácidos de al menos una molécula de polipéptido en dicha muestra con una secuencia seleccionada de dicho grupo y determinar si la secuencia de dicha molécula de polipéptido en dicha muestra es al menos el 90% idéntica a dicha secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos.

También se describe el método anterior en el que dicha etapa de comparar una secuencia de aminoácidos de al menos una molécula de polipéptido en dicha muestra con una secuencia seleccionada de dicho grupo comprende determinar el grado de unión específica de polipéptidos en dicha muestra a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe el método anterior en el que dicha etapa de comparar secuencias se realiza comparando la secuencia de aminoácidos determinada a partir de una molécula de polipéptido en dicha muestra con dicha secuencia seleccionada de dicho grupo.

También se describe un método para identificar la especie, el tejido o el tipo de célula de una muestra biológica, método que comprende una etapa de detectar moléculas de polipéptido en dicha muestra, si hay alguna, que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe el método anterior para identificar la especie, el tejido o el tipo de célula de una muestra biológica, método que comprende una etapa de detectar moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de aminoácidos en un panel de al menos dos secuencias de aminoácidos, siendo al menos una secuencia en dicho panel al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo anterior.

También se prefiere un método para diagnosticar en un sujeto un estado patológico asociado con una expresión o estructura anómala de un gen que codifica una proteína secretada identificada en la tabla 1, método que comprende una etapa de detectar en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto moléculas de polipéptido que comprenden una secuencia de aminoácidos en un panel de al menos dos secuencias de aminoácidos, siendo al menos una secuencia en dicho panel al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

En cualquiera de estos métodos, la etapa de detectar dichas moléculas de polipéptido incluye usar un anticuerpo.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos el 95% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90% idéntica a una secuencia de al menos 10 aminoácidos contiguos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada, en la que dicha secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido se ha optimizado para la expresión de dicho polipéptido en un huésped procariota.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada, en la que dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 tal como se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos completa de una proteína secretada codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075.

Se describe además un método de preparación de un vector recombinante que comprende insertar cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas anteriores en un vector. También se prefiere el vector recombinante producido mediante este método. También se prefiere un método de preparación de una célula huésped recombinante que comprende introducir el vector en una célula huésped, así como la célula huésped recombinante producida mediante este método.

También se prefiere un método de preparación de un polipéptido aislado que comprende cultivar esta célula huésped recombinante en condiciones tales que se exprese dicho polipéptido y recuperar dicho polipéptido. También se prefiere este método de preparación de un polipéptido aislado, en el que dicha célula huésped recombinante es una célula eucariota y dicho polipéptido es una parte secretada de una proteína secretada humana que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:60 que comienza con el resto en la posición del primer aminoácido de la parte secretada de SEQ ID NO:60 expuesta en la tabla 1 y dicha posición del primer aminoácido de la parte secretada de SEQ ID NO:60 se define en la tabla 1; y una secuencia de aminoácidos de una parte secretada de una proteína codificada por un clon de ADNc humano identificado por un identificador de clon de ADNc en la tabla 1 y contenido en el depósito con el número de depósito de la ATCC 209075. También se prefiere el polipéptido aislado producido mediante este método.

También se describe un método de tratamiento de un individuo que necesita un nivel aumentado de una actividad de proteína secretada, método que comprende administrar a un individuo de este tipo una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un polipéptido, polinucleótido o anticuerpo aislado de la invención reivindicada eficaz para aumentar el nivel de dicha actividad de proteína en dicho individuo.

Habiendo descrito en general la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitativos.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento de un clon de ADNc seleccionado a partir de la muestra depositada

Cada clon de ADNc en un depósito de ATCC citado está contenido en un vector de plásmido. La tabla 1 identifica los vectores usados para construir la biblioteca de ADNc a partir de la cual se aisló cada clon. En muchos casos, el vector usado para construir la biblioteca es un vector de fago del que se ha escindido un plásmido. La tabla inmediatamente a continuación correlaciona inmediatamente el plásmido relacionado para cada vector de fago usado en la construcción de la biblioteca de ADNc. Por ejemplo, cuando se identifica un clon particular en la tabla 1 como aislado en el vector "Lambda Zap", el clon depositado correspondiente está en "pBluescript".

5

Vectores Lambda Zap (patentes estadounidenses n.^{os} 5.128.256 y 5.286.636), Uni-Zap XR (patentes estadounidenses n.^{os} 5.128,256 y 5.286.636), Zap Express (patentes estadounidenses n.^{os} 5.128.256 y 5.286.636), pBluescript (pBS) (Short, J. M. et al., Nucleic Acids Res. 16:7583-7600 (1988); Alting-Mees, M. A. y Short, J. M., Nucleic Acids Res. 17:9494 (1989)) y pBK (Alting-Mees, M. A. et al., Strategies 5:58-61 (1992)) están disponibles comercialmente de Stratagene Cloning Systems, Inc., 11011 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037. pBS contiene un gen de resistencia a ampicilina y pBK contiene un gen de resistencia a neomicina. Ambos pueden transformarse en la cepa XL-1 Blue de E. coli, también disponible de Stratagene. pBS viene en 4 formas SK+, SK-, KS+ y KS. S y K se refieren a la orientación del poliligador con respecto a las secuencias de cebador T7 y T3 que flanquean la región de poliligador ("S" representa SacI y "K" representa KpnI que son los primeros sitios en cada extremo respectivo del ligador). "+" o "-" se refieren a la orientación del origen f1 de replicación ("ori"), de manera que en una orientación, el rescate monocatenario iniciado a partir del ori f1 genera ADN de cadena sentido, y en la otra,
antisentido.

Se obtuvieron los vectores pSport1, pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0, de Life Technologies, Inc., P. O. Box 6009, Gaithersburg, MD 20897. Todos los vectores Sport contienen un gen de resistencia a ampicilina y pueden transformarse en la cepa DH10B de E. coli, también disponible de Life Technologies. (Véanse, por ejemplo, Gruber, C. E., et al., Focus 15:59 (1993)). El vector lafmid BA (Bento Soares, Universidad de Columbia, NY) contiene un gen de resistencia a ampicilina y puede transformarse en la cepa XL-1 Blue de E. coli. El vector pCR®2.1, que está disponible de Invitrogen, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, CA 92008, contiene un gen de resistencia a ampicilina y puede transformarse en la cepa DH10B de E. coli, disponible de Life Technologies. (Véanse, por ejemplo, Clark, J. M., Nuc. Acids Res. 16:9677-9686 (1988) y Mead, D. et al., Bio/Technology 9: (1991)). Preferiblemente, un polinucleótido de la presente invención no comprende las secuencias de vector de fago identificadas para el clon particular en la tabla 1, así como las secuencias de vector de plásmido correspondientes designadas anteriormente.

El material depositado en la muestra al que se le asignó el número de depósito de ATCC citado en la tabla 1 para cualquier clon de ADNc dado también puede contener uno o más plásmidos adicionales, comprendiendo cada uno un clon de ADNc diferente de ese clon dado. Por tanto, los depósitos que comparten el mismo número de depósito de ATCC contienen al menos un plásmido para cada clon de ADNc identificado en la tabla 1. Normalmente, cada muestra de depósito de ATCC citada en la tabla 1 comprende una mezcla de cuantidades aproximadamente iguales (en peso) de aproximadamente 50 ADN de plásmido, conteniendo cada una un clon de ADNc diferente; pero una muestra de depósito de este tipo puede incluir plásmidos para más o menos de 50 clones de ADNc, hasta aproximadamente 500 clones de ADNc.

Pueden usarse dos enfoques para aislar un clon particular a partir de la muestra depositada de los ADN de plásmido citada para ese clon en la tabla 1. En primer lugar, se aísla directamente un plásmido seleccionando los clones usando una sonda polinucleotídica correspondiente a la SEQ ID NO:X.

Particularmente, se sintetiza un polinucleótido específico con 30-40 nucleótidos usando un sintetizador de ADN de Applied Biosystems según la secuencia notificada. Se marca el oligonucleótido, por ejemplo, con ^{32}P-\gamma-ATP usando polinucleótido cinasa de T4 y se purifica según métodos habituales. (Por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). Se transforma la mezcla de plásmido en un huésped adecuado, tal como se indicó anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como las proporcionadas por el proveedor del vector o en publicaciones relacionadas o patentes citadas anteriormente. Se siembran en placa los transformantes en placas con agar al 1,5% (que contienen el agente de selección apropiado, por ejemplo, ampicilina) a una densidad de aproximadamente 150 transformantes (colonias) por placa. Se seleccionan estas placas usando membranas de nailon según métodos habituales para la selección de colonias bacterianas (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 1.93 hasta 1.104), u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica.

Alternativamente, se sintetizan dos cebadores de 17-20 nucleótidos derivados de ambos extremos de la SEQ ID NO:X (es decir, dentro de la región de la SEQ ID NO:X unida al NT en 5' y al NT en 3' del clon definido en la tabla 1) y se usan para amplificar el ADNc deseado usando el plásmido de ADNc depositado como molde. Se lleva a cabo la reacción en cadena de la polimerasa en condiciones habituales, por ejemplo, en 25 \mul de mezcla de reacción con 0,5 ug del molde de ADNc anterior. Una mezcla de reacción conveniente es MgCl_{2} 1,5-5 mM, gelatina al 0,01% (p/v), 20 \muM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmoles de cada cebador y 0,25 unidades de Taq polimerasa. Se realizan treinta y cinco ciclos de PCR (desnaturalización a 94ºC durante 1 min.; apareamiento a 55ºC durante 1 min.; alargamiento a 72ºC durante 1 min.) con un ciclador térmico automatizado Cetus de Perkin-Elmer. Se analiza el producto amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa y se corta la banda de ADN con el peso molecular esperado y se purifica. Se verifica que el producto de PCR es la secuencia seleccionada subclonando y secuenciando el producto de ADN.

Se encuentran disponibles varios métodos para la identificación de las partes no codificantes en 5' o 3' de un gen que pueden no estar presentes en el clon depositado. Estos métodos incluyen pero no se limitan a, estudiar con sondas filtro, enriquecimiento de clones usando sondas específicas, y protocolos similares o idénticos a los protocolos de "RACE" en 5' y 3' que se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, un método similar a RACE en 5' está disponible para generar el extremo 5' que falta de un transcrito de longitud completa deseado. (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res. 21(7):1683-1684 (1993)).

En resumen, se liga un oligonucleótido de ARN específico a los extremos 5' de una población de ARN que contiene supuestamente transcritos de ARN de gen de longitud completa. Se usa un conjunto de cebadores que contiene un cebador específico para el oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico para una secuencia conocida del gen de interés para amplificar por PCR la parte en 5' del gen de longitud completa deseado. Entonces este producto amplificado puede secuenciarse y usarse para generar el gen de longitud completa.

Este método anterior empieza con ARN total aislado de la fuente deseada, aunque puede usarse ARN poli-A+. Entonces puede tratarse la preparación de ARN con fosfatasa si es necesario eliminar grupos fosfato en 5' en ARN degradado o dañado que pueden interferir con la etapa de ARN ligasa tardía. Entonces la fosfatasa debe inactivarse y tratarse el ARN con pirofosfatasa ácida del tabaco con el fin de eliminar la estructura de caperuza presente en los extremos 5' de los ARN mensajeros. Esta reacción deja un grupo fosfato en 5' en el extremo 5' del ARN escindido de la caperuza que entonces puede ligarse a un oligonucleótido de ARN usando ARN ligasa de T4.

Se usa esta preparación de ARN modificado como molde para las síntesis de ADNc de la primera cadena usando un oligonucleótido específico de gen. Se usa la reacción de síntesis de la primera cadena como molde para la amplificación por PCR del extremo 5' deseado usando un cebador específico para el oligonucleótido de ARN ligado y un cebador específico para la secuencia conocida del gen de interés. Entonces se secuencia el producto resultante y se analiza para confirmar que la secuencia del extremo 5' pertenece al gen deseado.

Ejemplo 2

Aislamiento de clones genómicos correspondientes a un polinucleótido

Se selecciona una biblioteca P1 genómica humana (Genomic Systems, Inc.) mediante PCR usando cebadores seleccionados para la secuencia de ADNc correspondiente a la SEQ ID NO:X., según el método descrito en el ejemplo 1. (Véase también, Sambrook).

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Ejemplo 3

Distribución tisular de polipéptido

Se determina la distribución tisular de la expresión de ARNm de polinucleótidos de la presente invención usando protocolos para análisis de transferencia de tipo Northern, descrito por, entre otros, Sambrook et al. Por ejemplo, se marca una sonda de ADNc producida mediante el método descrito en el ejemplo 1 con P^{32} usando el sistema de marcaje de ADN rediprime^{TM} (Amersham Life Science), según las instrucciones del fabricante. Tras el marcaje, se purifica la sonda usando una columna CHROMA SPIN-100^{TM} (Clontech Laboratories, Inc.), según el número de protocolo del fabricante PT1200-1. Entonces se usa la sonda marcada purificada para examinar varios tejidos humanos para determinar la expresión de ARNm.

Se examinan las transferencias de tipo Northern de múltiples tejidos (MTN) que contienen varios tejidos humanos (H) o tejidos del sistema inmunitario humano (IM) (Clontech) con la sonda marcada usando disolución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech) según el número de protocolo del fabricante PT1190-1. Tras la hibridación y el lavado, se montan las transferencias y exponen películas a -70ºC durante la noche, y se revelan las películas según procedimientos convencionales.

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Ejemplo 4

Mapeo cromosómico de los polinucleótidos

Se diseña un conjunto de cebadores de oligonucleótido según la secuencia en el extremo 5' de la SEQ ID NO:X. Este cebador preferiblemente abarca aproximadamente 100 nucleótidos. Entonces se usa este conjunto de cebadores en una reacción en cadena de la polimerasa en el siguiente conjunto de condiciones: 30 segundos, 95ºC; 1 minuto, 56ºC; 1 minuto, 70ºC. Se repite este ciclo 32 veces seguido por un ciclo de 5 minutos a 70ºC. Se usa ADN humano, de ratón, y de hámster como molde además de un panel de híbridos de células somáticas que contiene cromosomas individuales o fragmentos de cromosoma (Bios, Inc). Se analizan las reacciones o bien en geles de poliacrilamida al 8% o bien en de geles de agarosa al 3,5%. Se determina el mapeo cromosómico mediante la presencia de un fragmento de PCR de aproximadamente 100 pb en el híbrido de células somáticas particular.

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Ejemplo 5

Expresión bacteriana de un polipéptido

Se amplifica un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención usando cebadores de oligonucleótido de PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADN, tal como se resumió en el ejemplo 1, para sintetizar fragmentos de inserción. Los cebadores usados para amplificar el inserto de ADNc deben contener preferiblemente sitios de restricción, tales como BamHI y XbaI, en el extremo 5' de los cebadores con el fin de clonar el producto amplificado en el vector de expresión. Por ejemplo, BamHI y XbaI corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este vector de plásmido codifica la resistencia a antibiótico (Amp^{r}), un origen bacteriano de replicación (ori), un promotor/operador (P/O) regulable por IPTG, un sitio de unión de ribosoma (RBS), una etiqueta de 6-histidina (6-His), y sitios de clonación de enzima de restricción.

Se digiere el vector pQE-9 con BamHI y XbaI y se liga el fragmento amplificado en el vector pQE-9 manteniendo el marco de lectura iniciado en el RBS bacteriano. Entonces se usa la mezcla de ligación para transformar la cepa M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas con LB y se seleccionan colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla ADN de plásmido y se confirma mediante análisis de restricción.

Se hacen crecer clones que contienen los constructos deseados durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB complementados tanto con Amp (100 ug/ml) como con Kan (25 ug/ml). Se usa el cultivo O/N para inocular un gran cultivo a una razón de 1:100 a 1:250. Se hacen crecer las células hasta una densidad óptica de 600 (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Entonces se añade IPTG (isopropil-B-D-tiogalacto-piranósido) hasta una concentración final de 1 mM. IPTG induce, inactivando el represor lacI, el aclaramiento del P/O llevando a una expresión génica aumentada.

Se hacen crecer las células durante de 3 a 4 horas adicionales. Entonces se recogen las células mediante centrifugación (20 min. a 6000Xg). Se solubiliza el sedimento celular en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar agitando durante 3-4 horas a 4ºC. Se eliminan el resto celular mediante centrifugación, y se carga el sobrenadante que contiene el polipéptido en una columna de resina de afinidad de níquel-nitrilo-ácido tri-acético ("Ni-NTA") (disponible de QIAGEN, Inc., citado anteriormente). Las proteínas con una etiqueta de 6 x His se unen a la resina de Ni-NTA con alta afinidad y pueden purificarse en un procedimiento de una sola etapa sencilla (para más detalles véase: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., citado anteriormente).

En resumen, se carga el sobrenadante en la columna en guanidina-HCl 6 M, pH 8, en primer lugar se lava la columna con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, pH 8, entonces se lava con 10 volúmenes de guanidina-HCl 6 M, pH 6, y finalmente se eluye el polipéptido con guanidina-HCl 6 M, pH 5.

Entonces se renaturaliza la proteína purificada dializándola frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) o acetato de Na 50 mM, tampón de pH 6 más NaCl 200 mM. Alternativamente, la proteína puede volver a plegarse satisfactoriamente mientras está inmovilizada en la columna de Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las siguientes: renaturalización usando un gradiente de urea lineal 6 M - 1 M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl 20 mM pH 7,4, que contenía inhibidores de proteasas. La renaturalización debe realizarse a lo largo de un periodo de 1,5 horas o más. Tras la renaturalización, se eluyen las proteínas mediante la adición de imidazol 250 mM. Se elimina el imidazol mediante una etapa de diálisis final frente a PBS o tampón acetato de sodio 50 mM pH 6 más NaCl 200 mM. Se almacena la proteína purificada a 4ºC o se congela a -80ºC.

Además del vector de expresión anterior, la presente invención incluye además un vector de expresión que comprende elementos promotores y operadores de fagos operativamente unidos a un polinucleótido de la presente invención, denominado pHE4a. (Número de registro de la ATCC 209645, depositado el 25 de febrero de 1998). Este vector contiene: 1) un gen de neomicinfosfotransferasa como marcador de selección, 2) un origen de replicación de E. coli, 3) una secuencia promotora de fago T5, 4) dos secuencias de operador lac, 5) una secuencia Shine-Dalgarno, y 6) el gen represor del operón lactosa (lacIq). El origen de replicación (oriC) se deriva de pUC19 (LTI, Gaithersburg, MD). La secuencia promotora y las secuencias operadoras se preparan de manera sintética.

Puede insertarse ADN en el pHEa mediante restricción del vector con NdeI y XbaI, BamHI, XhoI o Asp718, haciendo pasar el producto sometido a restricción sobre un gel, y aislando el fragmento mayor (el fragmento de relleno debe tener aproximadamente 310 pares de bases). El inserto de ADN se genera según el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 1, usando cebadores de PCR que tienen sitios de restricción para NdeI (cebador en 5') y XbaI, BamHI, XhoI o Asp718 (cebador en 3'). Se purifica en gel el inserto de PCR y se somete a restricción con enzimas compatibles. Se ligan el inserto y el vector según protocolos convencionales.

El vector diseñado mediante ingeniería genética podría sustituirse fácilmente en el protocolo anterior para expresar proteína en un sistema bacteriano.

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Ejemplo 6

Purificación de un polipéptido a partir de un cuerpo de inclusión

El siguiente método alternativo puede usarse para purificar un polipéptido expresado en E. coli cuando está presente en forma de cuerpos de inclusión. A menos que se especifique lo contrario, todas las etapas siguientes se realizan a 4-10ºC.

Tras finalizar la fase de producción de la fermentación con E. coli, se enfría el cultivo celular hasta 4-10ºC y se recogen las células mediante centrifugación continua a 15.000 rpm (Heraeus Sepatech). Basándose en el rendimiento esperado de proteína por unidad de peso de la pasta celular y la cantidad de proteína purificada requerida, se suspende una cantidad apropiada de pasta celular, en peso, en una disolución tampón que contiene Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4. Se dispersan las células para dar una suspensión homogénea una mezcladora de alta cizalla-
dura.

Entonces se lisan las células haciendo pasar la disolución a través de un microfluidizador (Microfuidics, Corp. o APV Gaulin, Inc.) dos veces a 4000-6000 psi. Entonces se mezcla el homogeneizado con disolución de NaCl hasta una concentración final de NaCl 0,5 M, seguido por centrifugación a 7000 xg durante 15 min. Se lava de nuevo el sedimento resultante usando NaCl 0,5 M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4.

Se solubilizan los cuerpos de inclusión lavados resultantes con clorhidrato de guanidina (GuHCl) 1,5 M durante 2-4 horas. Tras la centrifugación a 7000 xg durante 15 min., se desecha el sedimento y se incuba el sobrenadante que contiene el polipéptido a 4ºC durante la noche para permitir una extracción de GuHCl adicional.

Tras la centrifugación a alta velocidad (30.000 xg) para eliminar las partículas insolubles, se vuelve a plegar la proteína solubilizada en GuHCl mezclando rápidamente el extracto de GuHCl con 20 volúmenes de tampón que contiene sodio 50 mM, pH 4,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM con agitación vigorosa. Se mantiene la disolución de proteína diluida replegada a 4ºC sin mezclar durante 12 horas antes de etapas de purificación adicionales.

Para clarificar la disolución de polipéptido replegado, se emplea una unidad de filtración tangencial preparada previamente con un filtro de membrana de 0,16 \mum con un área superficial apropiada (por ejemplo, Filtron), equilibrada con acetato de sodio 40 mM, pH 6,0. Se carga la muestra filtrada en una resina de intercambio catiónico (por ejemplo, Poros HS-50, Perseptive Biosystems). Se lava la columna con acetato de sodio 40 mM, pH 6,0 y se eluye con NaCl 250 mM, 500 mM, 1000 mM y 1500 mM en el mismo tampón, por etapas. Se monitoriza continuamente la absorbancia a 280 nm del efluente. Se recogen fracciones y se analizan adicionalmente mediante SDS-PAGE.

Entonces se reúnen las fracciones que contienen el polipéptido y se mezclan con 4 volúmenes de agua. Entonces se carga la muestra diluida en un conjunto preparado previamente de columnas en serie de resinas de intercambio aniónico fuerte (Poros HQ-50, Perseptive Biosystems) y aniónico débil (Poros CM-20, Perseptive Biosystems). Se equilibran las columnas con acetato de sodio 40 mM, pH 6,0. Se lavan ambas columnas con acetato de sodio 40 mM, pH 6,0, NaCl 200 mM. Entonces se eluye la columna CM-20 usando un gradiente lineal de 10 volúmenes de columna que oscila desde NaCl 0,2 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6,0 hasta NaCl 1,0 M, acetato de sodio 50 mM, pH 6,5. Se recogen fracciones bajo monitorización de la A_{280} constante del efluente. Entonces se reúnen las fracciones que contienen el polipéptido (determinado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE al 16%).

El polipéptido resultante debe presentar una pureza superior al 95% tras las etapas de replegamiento y purificación anteriores. No deben observarse bandas contaminantes importantes procedentes del gel de SDS-PAGE al 16% teñido con azul de coomassie cuando se cargan 5 \mug de proteína purificada. La proteína purificada puede someterse a prueba también para determinar la contaminación por endotoxinas/LPS, y normalmente el contenido en LPS es inferior a 0,1 ng/ml según ensayos LAL.

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Ejemplo 7

Clonación y expresión de un polipéptido en un sistema de expresión de baculovirus

En este ejemplo, se usa el vector pA2 lanzadera de plásmido para insertar un polinucleótido en un baculovirus para expresar un polipéptido. Este vector de expresión contiene el promotor fuerte de polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por sitios de restricción convenientes tales como BamHI, Xba I y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus de simio 40 ("SV40") se usa para lograr una poliadenilación eficaz. Para la fácil selección de virus recombinante, el plásmido contiene el gen de beta-galactosidasa de E. coli bajo el control de un promotor débil de Drosophila en la misma orientación, seguido por la señal de poliadenilación del gen de polihedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homóloga mediada por células con ADN viral de tipo natural para generar un virus viable que exprese el polinucleótido clonado.

Pueden usarse muchos otros vectores de baculovirus en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1, tal como apreciaría fácilmente un experto en la técnica, siempre que el constructo proporcione señales ubicadas correctamente para la transcripción, traducción, secreción y similares, incluyendo un péptido señal y un AUG en marco según se requiera. Tales vectores se describen, por ejemplo, en Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989).

Específicamente, la secuencia de ADNc contenida en el clon depositado, que incluye el codón de iniciación AUG y la secuencia líder asociada de manera natura identificada en la tabla 1, se amplifica usando el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 1. Si se usa la secuencia señal que se produce de manera natural para producir la proteína secretada, el vector pA2 no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, el vector puede modificarse (pA2 GP) para incluir una secuencia líder de baculovirus, usando los métodos convencionales descritos en Summers et al., "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experimental Station Bulletin N.º 1555 (1987).

Se aísla el fragmento amplificado a partir de un gel de agarosa al 1% usando a un kit comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Entonces se digiere el fragmento con enzimas de restricción apropiadas y se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%.

Se digiere el plásmido con las enzimas de restricción correspondientes y, opcionalmente, puede desfosforilarse usando fosfatasa intestinal de ternero, usando procedimientos de rutina conocidos en la técnica. Entonces se aísla el ADN en un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla,
Ca.).

Se ligan entre sí el fragmento y el plásmido desfosforilado con ADN ligasa de T4. Se transforman células HB101 de E. coli u otros huéspedes de E. coli adecuados tales como XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) con la mezcla de ligación y se propagan en placas de cultivo. Se identifican las bacterias que contienen el plásmido digiriendo el ADN de colonias individuales y analizando el producto de digestión mediante electroforesis en gel. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación de ADN.

Se transfectan conjuntamente cinco \mug de un plásmido que contiene el polinucleótido con 1,0 \mug de un ADN de baculovirus linealizado comercialmente disponible (ADN de baculovirus "BaculoGold^{TM}", Pharmingen, San Diego, CA), usando el método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). Se mezclan un \mug de ADN de virus BaculoGold^{TM} y 5 \mug del plásmido en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después de eso, se añadieron 10 \mul de lipofectina más 90 \mul de medio Grace, se mezclaron e incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añadió la mezcla de transfección gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo tisular de 35 mm con 1 ml de medio Grace sin suero. Entonces se incuba la placa durante 5 horas a 27ºC. Se elimina entonces la disolución de transfección de la placa y se añade 1 ml de medio Grace para insectos complementado con suero de ternero fetal al 10%. Entonces se continúa el cultivo a 27ºC durante cuatro días.

Después de cuatro días se recoge el sobrenadante y se realiza un ensayo de placas, tal como describen Summers y Smith, citado anteriormente. Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir una identificación y un aislamiento fáciles de clones que expresan gal, que producen placas teñidas de azul. (Puede encontrarse también una descripción detallada de un "ensayo de placas" de este tipo en la guía del usuario para el cultivo de células de insecto y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10). Tras una incubación apropiada, se recogen las placas teñidas de azul con la punta de una micropipeta automática (por ejemplo, Eppendorf). Entonces se resuspende el agar que contiene los virus recombinantes en tubo de microcentrífuga que contiene 200 \mul de medio Grace y se usa la suspensión que contiene el baculovirus recombinante para infectar células Sf9 sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde se recogen los sobrenadantes de estas placas de cultivo y entonces se almacenan a 4ºC.

Para verificar la expresión del polipéptido, se hacen crecer células Sf9 en medio Grace complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Se infectan las células con el baculovirus recombinante que contiene el polinucleótido a una multiplicidad de infección ("MOI") de aproximadamente 2. Si se desean proteínas radiomarcadas, 6 horas más tarde se retira el medio y se sustituye por medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible de Life Technologies Inc., Rockville, MD). Tras 42 horas, se añaden 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (disponibles de Amersham). Se incuban adicionalmente las células durante 16 horas y entonces se recogen mediante centrifugación. Se analizan las proteínas en el sobrenadante así como las proteínas intracelulares mediante SDS-PAGE seguido por autorradiografía (si estaban radiomarcadas).

Puede usarse microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína purificada para determinar la secuencia amino terminal de la proteína producida.

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Ejemplo 8

Expresión de un polipéptido en células de mamífero

El polipéptido de la presente invención puede expresarse en una célula de mamífero. Un vector de expresión de mamífero típico contiene un elemento promotor, que media la iniciación de la transcripción de ARNm, una secuencia que codifica proteína y señales requeridas para la terminación de transcripción y poliadenilación del transcrito. Los elementos adicionales incluyen potenciadores, secuencias Kozak y secuencias intercaladas flanqueadas por sitios donadores y aceptores para el corte y empalme del ARN. Se consigue una transcripción altamente eficaz con los promotores temprano y tardío de SV40, las repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, por ejemplo, VSR, VLTHI, VIHI y el promotor temprano del citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, el promotor de actina humano).

Los vectores de expresión adecuados para su uso para poner en práctica la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), pBC12MI (ATCC 67109), pCMVSport 2.0 y pCMVSport 3.0. Células huésped de mamífero que pueden usarse incluyen, células Hela, 293, H9 y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C127 de ratón, Cos 1, Cos 7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino (CHO).

Alternativamente, el polipéptido puede expresarse en líneas celulares estables que contienen el polinucleótido integrado en un cromosoma. La transfección conjunta con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado puede amplificarse también para expresar grandes cantidades de la proteína codificada. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para desarrollar líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. (Véase, por ejemplo, Alt, F. W., et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hamlin, J. L. y Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta, 1097:107-143 (1990); Page, M. J. y Sydenham, M. A., Biotechnology 9:64-68 (1991)). Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992). Usando estos marcadores, se hacen crecer las células de mamífero en medio selectivo y se seleccionan las células con la mayor resistencia. Estas líneas celulares contienen el/los gen(es) amplificado(s) integrado(s) en un cromosoma. A menudo se usan células de ovario de hámster chino (CHO) y NSO para la producción de proteínas.

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Los derivados del plásmido pSV2-dhfr (número de registro de la ATCC 37146), los vectores de expresión pC4 (número de registro de la ATCC 209646) y pC6 (número de registro de la ATCC 209647) contienen el promotor fuerte (LTR) del virus del sarcoma de Rous (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (marzo de 1985)) más un fragmento del potenciador de CMV (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985)). Múltiples sitios de clonación, por ejemplo, con los sitios de escisión de enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Los vectores también contienen el intrón en 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de preproinsulina de rata y el gen de DHFR de ratón bajo el control del promotor temprano de
SV40.

Específicamente, el plásmido pC6, por ejemplo, se digiere con enzimas de restricción apropiadas y entonces se desfosforila usando fosfatos intestinales de ternero mediante procedimientos conocidos en la técnica. Entonces se aísla el vector a partir de un gel de agarosa al 1%.

Se amplifica un polinucleótido de la presente invención según el protocolo resumido en el ejemplo 1. Si se usa la secuencia señal que se produce de manera natural para producir la proteína secretada, el vector no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, si no se usa la secuencia señal que se produce de manera natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, el documento WO 96/34891).

Se aísla el fragmento amplificado a partir de un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Entonces se digiere el fragmento con enzimas de restricción apropiadas y se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%.

Entonces se digiere el fragmento amplificado con la misma enzima de restricción y se purifica en un gel de agarosa al 1%. Entonces se ligan el fragmento aislado y el vector desfosforilado con ADN ligasa de T4. Se transforman entonces células XL-1 Blue o HB 101 de E. coli y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC6 usando, por ejemplo, análisis de enzimas de restricción.

Se usan para la transfección células de ovario de hámster chino que carecen de DHFR activa. Se transfectan conjuntamente cinco \mug del plásmido de expresión pC6 con 0,5 \mug del plásmido pSVneo usando lipofectina (Felgner et al., citado anteriormente). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Se siembran las células en medio alfa menos MEM complementado con G418 1 mg/ml. Tras 2 días, se tripsinizan las células y se siembran en placas de clonación de hibridomas (Greiner, Alemania) en medio alfa menos MEM complementado con 10, 25 ó 50 ng/ml de metotrexato más G418 1 mg/ml. Después de aproximadamente 10-14 días, se tripsinizan clones individuales y entonces se siembran en placas Petri de 6 pocillos o frascos de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Entonces se transfieren los clones que crecen a las mayores concentraciones de metotrexato a nuevas placas de 6 pocillos que contienen concentraciones incluso mayores de metotrexato (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración de 100 - 200 \muM. Se analiza la expresión del producto génico deseado, por ejemplo, mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western o mediante análisis por HPLC en fase
inversa.

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Ejemplo 9

Fusiones de proteínas

Los polipéptidos de la presente invención se fusionan preferiblemente con otras proteínas. Estas proteínas de fusión pueden usarse para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, la fusión de los presentes polipéptidos con etiqueta de His, etiqueta de HA, proteína A, dominios de IgG, y proteína de unión a maltosa facilita la purificación. (Véase el ejemplo 5; véase también el documento EP A 394.827; Traunecker, et al., Nature 331:84-86 (1988)). De manera similar, la fusión con IgG-1, IgG-3 y albúmina aumenta el tiempo de semivida in vivo. Señales de localización nuclear fusionadas con los polipéptidos de la presente invención pueden dirigir la proteína a una localización subcelular específica, mientras que homodímeros o heterodímeros covalentes pueden aumentar o reducir la actividad de una proteína de fusión. Las proteínas de fusión pueden crear también moléculas quiméricas que tienen más de una función. Finalmente, las proteínas de fusión pueden aumentar la solubilidad y/o la estabilidad de la proteína fusionada en comparación con la proteína no fusionada. Todos los tipos de proteínas de fusión descritos anteriormente pueden prepararse modificando el siguiente protocolo, que resume la fusión de un polipéptido con una molécula de IgG, o el protocolo descrito en el ejemplo 5.

En resumen, la parte Fc humana de la molécula de IgG puede amplificarse mediante PCR, usando cebadores que abarcan los extremos 5' y 3' de la secuencia descrita más adelante. Estos cebadores deben tener también sitios de enzimas de restricción convenientes que facilitarán la clonación en un vector de expresión, preferiblemente un vector de expresión de mamífero.

Por ejemplo, si se usa pC4 (número de registro 209646), la parte Fc humana puede ligarse en el sitio de clonación BamHI. Obsérvese que el sitio BamHI en 3' debe destruirse. A continuación, se vuelve a someter a restricción con BamHI el vector que contiene la parte Fc humana, linealizando el vector, y se liga en este sitio BamHI un polinucleótido de la presente invención, aislado mediante el protocolo de PCR descrito en el ejemplo 1. Obsérvese que el polinucleótido se clona sin un codón de parada, de lo contrario no se producirá una proteína de fusión.

Si se usa la secuencia señal que se produce de manera natural para producir la proteína secretada, pC4 no necesita un segundo péptido señal. Alternativamente, si no se usa la secuencia señal que se produce de manera natural, el vector puede modificarse para incluir una secuencia señal heteróloga. (Véase, por ejemplo, el documento WO
96/34891).

Región Fc de IgG humana:

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Ejemplo 10

Producción de un anticuerpo a partir de un polipéptido

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos. (Véase, Current Protocols, capítulo 2). Por ejemplo, se administran células que expresan un polipéptido de la presente invención a un animal para inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En un método preferido, se prepara una preparación de la proteína secretada y se purifica para hacer que esté sustancialmente libre de contaminantes naturales. Entonces se introduce una preparación de este tipo en un animal con el fin de producir antisueros policlonales de mayor actividad específica.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o fragmentos de unión a proteína de los mismos). Tales anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando tecnología de hibridomas. (Köhler et al., Nature 256:495 (1975); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Köhler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibody and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., págs. 563-681 (1981)). En general, tales procedimientos implican inmunizar a un animal (preferiblemente un ratón) con polipéptido o, más preferiblemente, con una célula que expresa polipéptido secretado. Tales células pueden cultivarse en cualquier medio de cultivo tisular adecuado; sin embargo, es preferible cultivar las células en un medio de Eagle modificado por Earle complementado con suero bovino fetal al 10% (inactivado a aproximadamente 56ºC), y complementado con aproximadamente 10 g/l de aminoácidos no esenciales, aproximadamente 1.000 U/ml de penicilina y aproximadamente 100 \mug/ml de estreptomicina.

Se extraen los esplenocitos de tales ratones y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Puede emplearse cualquier línea celular de mieloma adecuada según la presente invención; sin embargo, es preferible emplear la línea celular de mieloma original (SP2O), disponible de la ATCC. Tras la fusión, se mantienen en medio HAT de manera selectiva las células de hibridoma resultantes, y entonces se clonan mediante dilución limitante tal como describen Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de una selección de este tipo se someten entonces a ensayo para identificar clones que secretan anticuerpos que pueden unirse al polipéptido.

Alternativamente, pueden producirse en un procedimiento de dos etapas anticuerpos adicionales que pueden unirse al polipéptido usando anticuerpos anti-idiotípicos. Un método de este tipo utiliza el hecho de que los anticuerpos son por sí mismos antígenos y, por tanto, es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo. Según este método, se usan anticuerpos específicos de proteína para inmunizar a un animal, preferiblemente un ratón. Los esplenocitos de un animal de este tipo se usan entonces para producir células de hibridoma, y se seleccionan las células de hibridoma para identificar clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico de proteína puede bloquearse mediante el polipéptido. Tales anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotípicos frente al anticuerpo específico de proteína y pueden usarse para inmunizar a un animal para inducir la formación de anticuerpos específicos de proteína adicionales.

Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención pueden usarse según los métodos descritos en el presente documento. Tales fragmentos se producen normalmente mediante escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Alternativamente, pueden producirse fragmentos de unión a proteína secretada a través de la aplicación de tecnología de ADN recombinante o a través de química sintética.

Para el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos, puede ser preferible usar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Tales anticuerpos pueden producirse usando constructos genéticos derivados de células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente. En la técnica se conocen métodos para producir anticuerpos quiméricos. (Véase, para revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al., patente estadounidense n.º 4.816.567; Taniguchi et al., documento EP 171496; Morrison et al., documento EP 173494; Neuberger et al., documento WO 8601533; Robinson et al., documento WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)).

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Ejemplo 11

Producción de proteína secretada para ensayos de selección de alto rendimiento

El siguiente protocolo produce un sobrenadante que contiene un polipéptido que va a someterse a prueba. Este sobrenadante puede usarse entonces en los ensayos de selección descritos en los ejemplos 13-20.

En primer lugar, diluir disolución madre de poli-D-lisina (644 587 Boehringer-Mannheim) (1 mg/ml en PBS) 1:20 en PBS (sin calcio o magnesio 17-516F Biowhittaker) para una disolución de trabajo de 50 ug/ml. Añadir 200 ul de esta disolución a cada pocillo (placas de 24 pocillos) e incubar a TA durante 20 minutos. Garantizar que la disolución se distribuye por cada pocillo (nota: puede usarse una pipeta automática de 12 canales con puntas en canales alternos). Eliminar mediante aspiración la disolución de poli-D-lisina y enjuagar con 1 ml de PBS (solución salina tamponada con fosfato). La PBS debe permanecer en el pocillo hasta justo antes de sembrar en placa las células y las placas pueden cubrirse con poli-lisina de antemano durante hasta dos semanas.

Sembrar en placa células 293T (no portar células más allá de P+20) a 2 x 10^{5} células/pocillo en 5 ml de medio DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) (con 4,5 g/l de glucosa y L-glutamina (12-604F Biowhittaker))/FBS inactivado por calor al 10% (14-503F Biowhittaker)/1x Penstrep (17-602E Biowhittaker). Dejar crecer las células durante la noche.

Al día siguiente, mezclar entre sí en un recipiente en un recipiente de disolución estéril: 300 ul de Lipofectamine (18324-012 Gibco/BRL) y 5 ml de Optimem I (31985070 Gibco/BRL)/placa de 96 pocillos. Con una pipeta multicanal de volúmenes pequeños, colocar alícuotas de aproximadamente 2 ug de un vector de expresión que contiene un inserto de polinucleótido, producido mediante los métodos descritos en los ejemplos 8 ó 9, en una placa de fondo redondo de 96 pocillos marcada de manera apropiada. Con una pipeta multicanal, añadir 50 ul de la mezcla Lipofectamine/Optimem I a cada pocillo. Pipetear suavemente de arriba abajo para mezclar. Incubar a TA durante 15-45 minutos. Tras aproximadamente 20 minutos, usar una pipeta multicanal para añadir 150 ul de Optimem I a cada pocillo. Como control debe transfectarse una placa de ADN de vector que carece de un inserto con cada conjunto de transfecciones.

Preferiblemente, la transfección debe realizarse trabajando en equipo las siguientes tareas. Trabajando en equipo, el tiempo de trabajo experimental se reduce a la mitad, y las células no pasan demasiado tiempo en PBS. En primer lugar, la persona A elimina por aspiración los medios de cuatro placas de 24 pocillos de células, y luego la persona B enjuaga cada pocillo con 0,5-1 ml de PBS. La persona A elimina entonces por aspiración el enjuague de PBS, y la persona B, usando una pipeta de 12 canales con puntas en canales alternos, añade los 200 ul del complejo de ADN/Lipofectamine/Optimem I en primer lugar a los pocillos impares, luego a los pocillos pares, en cada fila de las placas de 24 pocillos. Incubar a 37ºC durante 6 horas.

Mientras se están incubando las células, preparar medios apropiados, o bien BSA al 1% en DMEM con 1x penstrep, o bien medios CHO-5 (116,6 mg/l de CaCl_{2} (anhid.); CuSO_{4}-5H_{2}O 0,00130 mg/l; 0,050 mg/l de Fe(NO_{3})_{3}-9H_{2}O; 0,417 mg/l de FeSO_{4}-7H_{2}O; 311,80 mg/l de KCl; 28,64 mg/l de MgCl_{2}; 48,84 mg/l de MgSO_{4}; 6995,50 mg/l de NaCl; 2400,0 mg/l de NaHCO_{3}; 62,50 mg/l de NaH_{2}PO_{4}-H_{2}O; 71,02 mg/l de Na_{2}HPO_{4}; 0,4320 mg/l de ZnSO_{4}-7H_{2}O; 0,002 mg/l de ácido araquidónico; 1,022 mg/l de colesterol; 0,070 mg/l de acetato de DL-alfa-tocoferol; 0,0520 mg/l de ácido linoleico; 0,010 mg/l de ácido linolénico; 0,010 mg/l de ácido mirístico; 0,010 mg/l de ácido oleico; 0,010 mg/l de ácido palmítrico; 0,010 mg/l de ácido palmítico; 100 mg/l de Pluronic F-68; 0,010 mg/l de ácido esteárico; 2,20 mg/l de Tween 80; 4551 mg/l de D-glucosa; 130,85 mg/ml de L-alanina; 147,50 mg/ml de L-arginina-HCl; 7,50 mg/ml de L-asparagina-H_{2}O; 6,65 mg/ml de L-ácido aspártico; 29,56 mg/ml de L-cistina-2HCl-H_{2}O; 31,29 mg/ml de L-cistina-2HCl; 7,35 mg/ml de L-ácido glutámico; 365,0 mg/ml de L-glutamina; 18,75 mg/ml de glicina; 52,48 mg/ml de L-histidina-HCl-H_{2}O; 106,97 mg/ml de L-isoleucina; 111,45 mg/ml de L-leucina; 163,75 mg/ml de L-lisina HCl; 32,34 mg/ml de L-metionina; 68,48 mg/ml de L-fenilalainina; 40,0 mg/ml de L-prolina; 26,25 mg/ml de L-serina; 101,05 mg/ml de L-treonina; 19,22 mg/ml de L-triptófano; 91,79 mg/ml de L-trirosina-2Na-2H_{2}O; 99,65 mg/ml de L-valina; 0,0035 mg/l de biotina; 3,24 mg/l de D-pantotenato de Ca; 11,78 mg/l de cloruro de colina; 4,65 mg/l de ácido fólico; 15,60 mg/l de i-inositol; 3,02 mg/l de niacinamida; 3,00 mg/l de piridoxal HCl; 0,031 mg/l de piridoxina HCl; 0,319 mg/l de riboflavina; 3,17 mg/l de tiamina HCl; 0,365 mg/l de timidina; y 0,680 mg/l de vitamina B_{12}; 25 mM de tampón HEPES; 2,39 mg/l de hipoxantina de Na; 0,105 mg/l de ácido lipoico; 0,081 mg/l de putrescina de sodio-2HCl; 55,0 mg/l de piruvato de sodio; 0,0067 mg/l de selenito de sodio; 20 uM de etanolamina; 0,122 mg/l de citrato férrico; 41,70 mg/l de metil-B-ciclodextrina complejada con ácido linoleico; 33,33 mg/l de metil-B-ciclodextrina complejada con ácido oleico; y 10 mg/l de metil-B-ciclodextrina complejada con Retinal) con 2 mm de glutamina y 1x penstrep. (100 g de BSA (81-068-3 Bayer) disueltos en 1 l de DMEM para una disolución madre de BSA al 10%). Filtrar los medios y recoger 50 ul para el ensayo de endotoxinas en un tubo cónico de poliestireno de
15 ml.

Se termina la reacción de transfección, preferiblemente trabajando en equipo, al final del periodo de incubación. La persona A elimina por aspiración los medios de transfección, mientras que la persona B añade 1,5 ml de los medios apropiados a cada pocillo. Incubar a 37ºC durante 45 ó 72 horas dependiendo de los medios usados: BSA al 1% durante 45 horas o CHO-5 durante 72 horas.

En el día cuatro, usando una pipeta multicanal de 300 ul, colocar alícuotas de 600 ul en una placa de pocillos de 1 ml de profundidad y el sobrenadante restante en un pocillo de 2 ml de profundidad. Los sobrenadantes de cada pocillo pueden usarse entonces en los ensayos descritos en los ejemplos 13-20.

Se entiende específicamente que cuando se obtiene actividad en cualquiera de los ensayos descritos a continuación usando un sobrenadante, la actividad se origina o bien a partir del polipéptido directamente (por ejemplo, como una proteína secretada) o bien por el polipéptido que induce la expresión de otras proteínas, que entonces se secretan en el sobrenadante. Por tanto, la invención proporciona además un método de identificación de la proteína en el sobrenadante caracterizado por una actividad en un ensayo particular.

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Ejemplo 12

Construcción del constructo indicador de GAS

Una ruta de transducción de señales implicada en la diferenciación y proliferación de células se denomina la ruta Jak-STAT. Las proteínas activadas en la ruta Jak-STAT se unen a elementos del sitio de activación gamma "GAS" o elemento de respuesta sensible a interferón ("ISRE"), localizados en el promotor de muchos genes. La unión de una proteína a estos elementos altera la expresión del gen asociado.

Los elementos GAS e ISRE se reconocen por una clase de factores de transcripción denominados transductores de señales y activadores de la transcripción, o "STAT". Existen seis miembros de la familia de los STAT. Stat1 y Stat3 están presentes en muchos tipos de células, al igual que Stat2 (puesto que la respuesta a IFN-alfa está extendida). Stat4 está más restringido y no se encuentra en muchos tipos de células, aunque se ha encontrado en células T auxiliares de clase I tras tratamiento con IL-12. Stat5 de denominó originalmente factor de crecimiento mamario, pero se ha encontrado a mayores concentraciones en otras células incluyendo células mieloides. Puede activarse en células de cultivo tisular por muchas citocinas.

Los STAT se activan para translocarse desde el citoplasma hasta el núcleo tras la fosforilación de tirosinas mediante un conjunto de cinasas conocido como la familia de cinasas Janus ("Jak"). Jak representa una familia diferenciada de tirosina cinasas solubles e incluye Tyk2, Jak1, Jak2 y Jak3. Estas cinasas presentan una similitud de secuencia significativa y generalmente son catalíticamente inactivas en células en reposo.

Las Jak se activan mediante una amplia variedad de receptores que se recogen en la tabla a continuación. (Adaptado de la revisión de Schidler y Darnell, Ann. Rev. Biochem. 64:621-51 (1995)). Una familia de receptores de citocinas, que puede activar Jak, se divide en dos grupos: (a) la clase 1 incluye receptores para IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, Epo, PRL, GH, G-CSF, GM-CSF, LIF, CNTF y trombopoyetina; y (b) la clase 2 incluye IFN-a, IFN-g e IL-10. Los receptores de clase 1 comparten un motivo de cisteína conservado (un conjunto de cuatro cisteínas conservadas y un triptófano) y un motivo WSXWS (una región proximal de membrana que codifica Trp-Ser-Xxx-Trp-Ser (SEQ ID NO:2)).

Por tanto, con la unión de un ligando a un receptor, se activan Jak, que a su vez activan STAT, que entonces se translocan y se unen a elementos de GAS. Este proceso completo está englobado en la ruta de transducción de señales Jak-STAT.

\newpage

Por tanto, la activación de la ruta Jak-STAT, reflejada mediante la unión del elemento GAS o el elemento ISRE, puede usarse para indicar proteínas implicadas en la proliferación y la diferenciación de células. Por ejemplo, se sabe que factores de crecimiento y citocinas activan la ruta Jak-STAT. (Véase la tabla a continuación). Por tanto, usando elementos GAS unidos a moléculas indicadoras, pueden identificarse activadores de la ruta Jak-STAT.

7

8

Para construir un elemento promotor que contiene GAS sintético, que se usa en los ensayos biológicos descritos en los ejemplos 13-14, se emplea una estrategia basada en PCR para generar una secuencia promotora de GAS-SV40. El cebador en 5' contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión de GAS encontrado en el promotor IRF1 y previamente se demostró que se unía a STAT tras la inducción con una variedad de citocinas (Rothman et al., Immunity 1:457-468 (1994)), aunque pueden usarse en su lugar otros elementos GAS o ISRE. El cebador en 5' también contiene 18 pb de secuencia complementaria a la secuencia de promotor temprano de SV40 y está flanqueado con un sitio XhoI. La secuencia del cebador en 5' es:

800

El cebador en el sentido de 3' es complementario al promotor de SV40 y está flanqueado con un sitio Hind III:

5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3'

(SEQ ID NO:4).

La amplificación por PCR se realiza usando el molde de promotor de SV40 presente en plásmido B-gal:promotor obtenido de Clontech. Se digiere el fragmento de PCR resultante con XhoI/Hind III y se subclona en BLSK2-. (Stratagene). La secuenciación con cebadores directos e inversos confirma que el inserto contiene la siguiente secuencia:

9

Con este elemento promotor GAS ligado al promotor de SV40, se diseña a continuación mediante ingeniería genética un constructo indicador GAS:SEAP2. En este caso, la molécula indicadora es una fosfatasa alcalina secretada, o "SEAP". Claramente, sin embargo, puede insertarse cualquier molécula indicadora en lugar de SEAP, en este o en cualquiera de los demás ejemplos. Las moléculas indicadoras bien conocidas que pueden usarse en lugar de SEAP incluyen cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa, fosfatasa alcalina, B-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP), o cualquier proteína detectable por un anticuerpo.

La secuencia anterior confirmaba que el elemento promotor GAS-SV40 sintético se subclona en el vector pSEAP-promotor obtenido de Clontech usando HindIII y XhoI, sustituyendo eficazmente el promotor de SV40 por el elemento promotor GAS:SV40 amplificado, para crear el vector GAS-SEAP. Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por tanto, no se prefiere para sistemas de expresión de mamífero.

Por tanto, con el fin de generar líneas celulares estables de mamífero que expresan el indicador de GAS-SEAP, se elimina el casete de GAS-SEAP del vector GAS-SEAP usando SalI y NotI, y se inserta en un vector de estructura principal que contiene el gen de resistencia a neomicina, tal como pGFP-1 (Clontech), usando estos sitios de restricción en el sitio de clonación múltiple, para crear el vector GAS-SEAP/Neo. Una vez que se transfecta este vector en células de mamífero, puede usarse entonces este vector como molécula indicadora para la unión a GAS tal como se describe en los ejemplos 13-14.

Pueden prepararse otros constructos usando la descripción anterior y sustituyendo GAS por una secuencia promotora diferente. Por ejemplo, la construcción de moléculas indicadoras que contienen secuencias promotoras de NFK-B y EGR se describen en los ejemplos 15 y 16. Sin embargo, pueden sustituirse muchos otros promotores usando los protocolos descritos en estos ejemplos. Por ejemplo, pueden sustituirse promotores de SRE, IL-2, NFAT u osteocalcina, solos o en combinación (por ejemplo, GAS/NF-KB/EGR, GAS/NF-KB, IL-2/NFAT, o NF-KB/GAS). De manera similar, pueden usarse otras líneas celulares para someter a prueba la actividad de constructos indicadores, tales como HELA (epitelial), HUVEC (endotelial), Reh (célula B), Saos-2 (osteoblasto), HUVAC (aórtica), o cardiomiocito.

Ejemplo 13

Ensayo de selección de alto rendimiento para determinar la actividad de las células T

Se usa el siguiente protocolo para evaluar la actividad de las células T mediante la identificación de factores, tales como factores de crecimiento y citocinas, que pueden hacer proliferar o diferenciar células T. La actividad de las células T se evalúa usando el constructo GAS/SEAP/Neo producido en el ejemplo 12. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la ruta de transducción de señales Jak-STAT. Las células T usadas en este ensayo son células T Jurkat (número de registro de la ATCC TIB-152), aunque también pueden usarse células

\hbox{Molt-3 (número de registro de la ATCC
CRL-1552) y células Molt-4 (número
de registro  de la ATCC CRL-1582).}

Las células T Jurkat son células auxiliares CD4+ Th1 linfoblásticas. Con el fin de generar líneas celulares estables, se transfectan aproximadamente 2 millones de células Jurkat con el vector GAS-SEAP/neo usando DMRIE-C (Life Technologies) (procedimiento de transfección descrito más adelante). Se siembran las células transfectadas hasta una densidad de aproximadamente 20.000 células por pocillo y se seleccionan los transfectantes resistentes a genticina 1 mg/ml. Se expanden las colonias resistentes y luego se someten a prueba para determinar su respuesta a concentraciones crecientes de interferón gamma. Se demuestra la respuesta a la dosis de un clon seleccionado.

Específicamente, el siguiente protocolo producirá células suficientes para 75 pocillos que contienen 200 ul de células. Por tanto, o bien se amplía a escala, o bien se realiza múltiples veces para generar células suficientes para múltiples placas de 96 pocillos. Las células Jurkat se mantienen en RPMI + 10% de suero con 1% de Pen-Strep (penicilina-estreptomicina). Combinar 2,5 ml de OPTI-MEM (Life Technologies) con 10 ug de ADN de plásmido en un frasco T25. Añadir 2,5 ml de OPTI-MEM que contiene

\hbox{50 ul de
DMRIE-C e incubar a temperatura ambiente  durante
15-45 min.}

Durante el periodo de incubación, determinar la concentración de células, centrifugar el número de células requerido (10^{7} por transfección) y resuspender en OPTI-MEM hasta una concentración final de 10^{7} células/ml. Entonces añadir 1 ml de 1 x 10^{7} células en OPTI-MEM a un frasco T25 e incubar a 37ºC durante 6 h. Tras la incubación, añadir 10 ml de RPMI + 15% de suero.

Las líneas indicadoras estables Jurkat:GAS-SEAP se mantienen en RPMI + 10% de suero, 1 mg/ml de genticina, y 1% de Pen-Strep. Estas células se tratan con sobrenadantes que contienen un polipéptido producido por el protocolo descrito en el ejemplo 11.

En el día del tratamiento con el sobrenadante, las células deben lavarse y resuspenderse en RPMI + 10% de suero nuevo hasta una densidad de 500.000 células por ml. El número exacto de células requerido dependerá del número de sobrenadantes que se está seleccionando. Para una placa de 96 pocillos se requieren aproximadamente 10 millones de células (para 10 placas, 100 millones de células).

Transferir las células a una navecilla de depósito triangular, con el fin de dispensar las células a una placa de 96 pocillos, usando una pipeta de 12 canales. Usando una pipeta de 12 canales, transferir 200 ul de células a cada pocillo (por tanto añadiendo 100.000 células por pocillo).

Una vez sembradas todas las placas, se transfieren 50 ul de los sobrenadantes directamente desde la placa de 96 pocillos que contiene los sobrenadantes a cada pocillo usando una pipeta de 12 canales. Además, se añade una dosis de interferón gamma exógeno (0,1, 1,0, 10 ng) a los pocillos H9, H10 y H11 para servir como controles positivos adicionales para el ensayo.

Las placas de 96 pocillos que contienen células Jurkat tratadas con sobrenadantes se colocan en un incubador durante 48 h (nota: este tiempo es variable entre 48-72 h). Entonces se transfieren muestras de 35 ul de cada pocillo a una placa de 96 pocillos opaca usando una pipeta de 12 canales. Las placas opacas deben cubrirse (usando cubiertas de Sellophene) y almacenarse a -20ºC hasta que se realizan los ensayos de SEAP según el ejemplo 17. Las placas que contienen las células tratadas restantes se colocan a 4ºC y sirven como una fuente de material para repetir el ensayo en un pocillo especifico si se desea.

Como control positivo, pueden usarse 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activa las células T Jurkat. Normalmente se observa una inducción de más de 30 veces en los pocillos de control positivo.

Ejemplo 14

Ensayo de selección de alto rendimiento que identifica la actividad mieloide

Se usa el siguiente protocolo para evaluar la actividad mieloide mediante la identificación de factores, tales como factores de crecimiento y citocinas, que pueden hacer proliferar o diferenciar células mieloides. La actividad de las células mieloides se evalúa usando el constructo GAS/SEAP/Neo producido en el ejemplo 12. Por tanto, los factores que aumentan la actividad de SEAP indican la capacidad para activar la ruta de transducción de señales Jak-STAT. La célula mieloide usada en este ensayo es

\hbox{U937, una línea celular
premonocítica, aunque  puede usarse TF-1, HL60 o
KG1.}

Para transfectar de manera transitoria células U937 con el constructo GAS/SEAP/Neo producido en el ejemplo 12, se usa un método de DEAE-dextrano (Kharbanda et. al., 1994, Cell Growth & Differentiation, 5:259-265). En primer lugar, recoger 2 x 10e^{7} células U937 y lavar con PBS. Las células U937 se hacen crecer habitualmente en medio RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) complementado con 100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina.

A continuación, suspender las células en 1 ml de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) que contiene 0,5 mg/ml de DEAE-dextrano, 8 ug de ADN de plásmido GAS-SEAP2, NaCl 140 mM, KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4}.7H_{2}O 375 uM, MgCl_{2} 1 mM y CaCl_{2} 675 uM. Incubar a 37ºC durante 45 min.

Lavar las células con medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y luego resuspender en 10 ml de medio completo e incubar a 37ºC durante 36 h.

Las células estables GAS-SEAP/U937 se obtienen haciendo crecer las células en G418 400 ug/ml. Se usa el medio libre de G418 para el crecimiento de rutina, pero cada uno a dos meses las células deben hacerse crecer de nuevo en G418 400 ug/ml en un par de pases.

Estas células se someten a prueba recogiendo 1 x 10^{8} células (esto es suficiente para un ensayo de diez placas de 96 pocillos) y se lavan con PBS. Suspender las células en 200 ml del medio de crecimiento descrito anteriormente, con una densidad final de 5 x 10^{5} células/ml. Sembrar en placa 200 ul de células por pocillo en la placa de 96 pocillos (o 1 x 10^{5} células/pocillo).

Añadir 50 ul del sobrenadante preparado mediante el protocolo descrito en el ejemplo 11. Incubar a 37ºC durante de 48 a 72 h. Como control positivo, pueden usarse 100 unidades/ml de interferón gamma que se sabe que activa las células U937. Normalmente se observa una inducción de más de 30 veces en los pocillos de control positivo. Someter el sobrenadante al ensayo de SEAP según el protocolo descrito en el ejemplo 17.

Ejemplo 15

Ensayo de selección de alto rendimiento que identifica la actividad neuronal

Cuando las células experimentan diferenciación y proliferación, se activa un grupo de genes a través de muchas rutas de transducción de señales diferentes. Uno de estos genes, EGR1 (gen de respuesta temprana de crecimiento 1), se induce en diversos tejidos y tipos celulares con la activación. El promotor de EGR1 es responsable de tal inducción. Usando el promotor de EGR1 unido a moléculas indicadoras, puede evaluarse la activación de las células.

Particularmente, se usa el siguiente protocolo para evaluar la actividad neuronal en líneas celulares PC12. Se sabe que las células PC12 (células de feocromocitoma de rata) proliferan y/o se diferencian mediante la activación con varios mitógenos, tales como TPA (acetato de tetradecanoilforbol), NGF (factor de crecimiento nervioso) y EGF (factor de crecimiento epidérmico). La expresión del gen EGR1 se activa durante este tratamiento. Por tanto, transfectando de manera estable células PC12 con un constructo que contiene un promotor de EGR unido al indicador de SEAP, puede evaluarse la activación de las células PC12.

El constructo indicador EGR/SEAP puede ensamblarse mediante el siguiente protocolo. La secuencia del promotor de EGR-1 (de -633 a +1) (Sakamoto K et al., Oncogene 6:867-871 (1991)) puede amplificarse mediante PCR a partir de ADN genómico humano usando los siguientes cebadores:

5' GCGCTCGAGGGATGACAGCGATAGAACCCCGG-3'

(SEQ ID NO: 6)

5' GCGAAGCTTCGCGACTCCCCGGATCCGCCTC-3'

(SEQ ID NO: 7)

Usando el vector GAS:SEAP/Neo producido en el ejemplo 12, puede insertarse entonces el producto amplificado de EGR1 en este vector. Linealizar el vector GAS:SEAP/Neo usando las enzimas de restricción XhoI/HindIII, eliminando el fragmento de relleno GAS/SV40. Someter a restricción el producto amplificado de EGR1 con estas mismas enzimas. Ligar el vector y el promotor de EGR1.

Para preparar placas de 96 pocillos para el cultivo celular, se añaden dos ml de una disolución de recubrimiento (dilución de colágeno tipo I 1:30 (Upstate Biotech Inc. n.º de catálogo 08-115) en etanol al 30% (filtro esterilizado) por una placa de 10 cm o 50 ml por pocillo de la placa de 96 pocillos, y se deja secar al aire durante 2 h.

Las células PC12 se hacen crecer rutinariamente en medio RPMI-1640 (Bio Whittaker) que contiene de suero de caballo al 10% (JRH BIOSCIENCES, n.º de catálogo 12449-78P), suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) al 5% complementado con penicilina 100 unidades/ml y estreptomicina 100 ug/ml en una placa de cultivo tisular de 10 cm previamente recubierta. Se realizan de una a cuatro divisiones cada tres a cuatro días. Se extraen las células de las placas mediante raspado y se resuspenden pipeteando de arriba abajo más de 15 veces.

\newpage

\global\parskip0.900000\baselineskip

Transfectar el constructo EGR/SEAP/Neo en las células PC12 usando el protocolo de Lipofectamine descrito en el ejemplo 11. Se obtienen células estables EGR-SEAP/PC12 haciendo crecer las células en G418 300 ug/ml. Se usa el medio libre de G418 para el crecimiento de rutina, pero cada uno a dos meses las células deben hacerse crecer de nuevo en G418 300 ug/ml en un par de pases.

Para evaluar la actividad neuronal, se selecciona una placa de 10 cm con células confluentes en aproximadamente del 70 al 80% eliminando el medio antiguo. Lavar las células una vez con PBS (solución salina tamponada con fosfato). Luego, privar las células de nutrientes en medio bajo en suero (RPMI-1640 que contiene suero de caballo al 1% y FBS al 0,5% con antibióticos) durante la noche.

A la mañana siguiente, extraer el medio y lavar las células con PBS. Extraer por raspado las células de la placa, suspender las células bien en 2 ml de medio bajo en suero. Contar el número de células y añadir más medio bajo en suero hasta alcanzar la densidad de células final de 5 x 10^{5} células/ml.

Añadir 200 ul de la suspensión celular a cada pocillo de la placa de 96 pocillos (equivalente a 1 x 10^{5} células/pocillo). Añadir 50 ul de sobrenadante producido por el ejemplo 11, a 37ºC durante de 48 a 72 h. Como control positivo, puede usarse un factor de crecimiento que se sabe que activa las células PC12 a través de EGR, tal como 50 ng/ul de factor de crecimiento neuronal (NGF). Normalmente se observa una inducción de más de cincuenta veces de SEAP en los pocillos de control positivo. Someter el sobrenadante al ensayo de SEAP según el ejemplo 17.

Ejemplo 16

Ensayo de selección de alto rendimiento para determinar la actividad de las células T

NF-\kappaB (factor nuclear \kappaB) es un factor de transcripción activado por una amplia variedad de agentes, incluyendo las citocinas inflamatorias IL-1 y TNF, CD30 y CD40, linfotoxina-alfa y linfotoxina-beta, mediante la exposición a LPS o trombina, y mediante la expresión de ciertos productos génicos virales. Como factor de transcripción, NF-\kappaB regula la expresión de genes implicados en la activación de las células inmunitarias, en el control de la apoptosis (NF-\kappaB parece proteger a las células de la apoptosis), en el desarrollo de las células B y T, en las respuestas antivirales y antimicrobianas y en múltiples respuestas de estrés.

En condiciones no estimuladas, NF-\kappaB queda retenido en el citoplasma con I-\kappaB (inhibidor de \kappaB). Sin embargo, con estimulación, I-\kappaB se fosforila y se degrada, haciendo que NF-\kappaB se transporte al núcleo, activando así la transcripción de genes diana. Los genes diana

\hbox{activados por NF- \kappa B 
incluyen IL-2, IL-6,
GM-CSF, ICAM-1 y MHC de clase
1.}

Debido a su papel fundamental y a su capacidad para responder a una variedad de estímulos, se usan constructos indicadores que utilizan el elemento promotor de NF-\kappaB para seleccionar los sobrenadantes producidos en el ejemplo 11. Activadores o inhibidores de NF-\kappaB serían útiles en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, podrían usarse inhibidores de NF-\kappaB para tratar aquellas enfermedades relacionadas con la activación aguda o crónica de NF-\kappaB, tales como la artritis reumatoide.

Para construir un vector que contenga el elemento promotor de NF-\kappaB, se emplea una estrategia basada en PCR. El cebador en el sentido de 5' contiene cuatro copias en tándem del sitio de unión a NF-\kappaB (GGGGACTTTCCC) (SEQ ID NO: 8), 18 pb de secuencia complementaria al extremo 5' de la secuencia del promotor temprano de SV40, y está flanqueado con un sitio XhoI:

900

El cebador en el sentido de 3' es complementario al extremo 3' del promotor de SV40 y está flanqueado con un sitio HindIII:

5':GCGGCAAGCTTTTTGCAAAGCCTAGGC:3'

(SEQ ID NO: 4)

Se lleva a cabo la amplificación por PCR usando el molde del promotor de SV40 presente en el plásmido pB-gal:promotor obtenido de Clontech. El fragmento de PCR resultante se digiere con XhoI e HindIII y se subclona en BLSK2- (Stratagene). La secuenciación con los cebadores de T7 y T3 confirma que el inserto contiene la siguiente secuencia:

10

\newpage

\global\parskip1.000000\baselineskip

A continuación, reemplazar el elemento promotor mínimo de SV40 presente en el plásmido pSEAP2-promotor (Clontech) por este fragmento NF-\kappaB/SV40 usando XhoI y HindIII. Sin embargo, este vector no contiene un gen de resistencia a neomicina, y por tanto, no se prefiere para sistemas de expresión en mamíferos.

Con el fin de generar líneas celulares de mamífero estables, se elimina el casete NF-\kappaB/SV40/SEAP del vector NF-\kappaB/SEAP anterior usando las enzimas de restricción SalI y NotI, y se inserta en un vector que contiene resistencia a neomicina. Particularmente, se insertó el casete NF-\kappaB/SV40/SEAP en pGFP-1 (Clontech), reemplazando el gen GFP, tras la restricción de pGFP-1 con SalI y NotI.

Una vez que se crea el vector NF-\kappaB/SV40/SEAP/Neo, se crean células T Jurkat estables y se mantienen según el protocolo descrito en el ejemplo 13. De manera similar, el método para someter a ensayo sobrenadantes con estas células T Jurkat estables también se describe en el ejemplo 13. Como control positivo, se añade TNF alfa exógeno (0,1, 1, 10 ng) a los pocillos H9, H10 y H11, observándose normalmente una activación de 5-10 veces.

Ejemplo 17

Ensayo para determinar la actividad de SEAP

Como molécula indicadora para los ensayos descritos en los ejemplos 13-16, se somete a ensayo la actividad de SEAP usando el kit Phospho-light de Tropix (n.º de catálogo BP-400) según el siguiente procedimiento general. El kit Phospho-light de Tropix suministra los tampones de dilución, ensayo y reacción usados más adelante.

Cebar un dispensador con el tampón de dilución 2,5x y dispensar 15 \mul de tampón de dilución 2,5x en placas Optiplate que contienen 35 \mul de un sobrenadante. Sellar las placas con un sellador de plástico e incubar a 65ºC durante 30 min. Separar las placas Optiplate para evitar el calentamiento desigual.

Enfriar las muestras hasta temperatura ambiente durante 15 minutos. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de ensayo. Añadir 50 \mul de tampón de ensayo e incubar a temperatura ambiente 5 min. Vaciar el dispensador y cebar con el tampón de reacción (véase la tabla a continuación). Añadir 50 \mul de tampón de reacción e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Puesto que la intensidad de la señal quimioluminiscente depende del tiempo y se tarda aproximadamente 10 minutos en leer 5 placas en el luminómetro, deben tratarse 5 placas cada vez y comenzar con el segundo juego 10 minutos más tarde.

Leer la unidad relativa de luz en el luminómetro. Fijar H12 como blanco e imprimir los resultados. Un aumento en la quimioluminiscencia indica actividad indicadora.

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Formulación del tampón de reacción

11

12

Ejemplo 18

Ensayo de selección de alto rendimiento que identifica cambios en la concentración de moléculas pequeñas y en la permeabilidad de la membrana

Se sabe que la unión de un ligando a un receptor altera los niveles intracelulares de moléculas pequeñas, tales como calcio, potasio, sodio, y el pH, así como que altera el potencial de membrana. Estas alteraciones pueden medirse en un ensayo para identificar sobrenadantes que se unen a receptores de una célula particular. Aunque el siguiente protocolo describe un ensayo para el calcio, este protocolo puede modificarse fácilmente para detectar cambios en potasio, sodio, pH, potencial de membrana o cualquier otra molécula pequeña que pueda detectarse mediante una sonda
fluorescente.

El siguiente ensayo usa un lector de placas fluorométrico de obtención de imágenes ("FLIPR") para medir cambios en moléculas fluorescentes (Molecular Probes) que se unen a moléculas pequeñas. Claramente, puede usarse cualquier molécula fluorescente que detecte una molécula pequeña en lugar de la molécula fluorescente de calcio, fluo-3, usada en este caso.

Para las células adherentes, sembrar las células a 10.000 - 20.000 células/pocillo en una placa negra Co-star de 96 pocillos con fondo transparente. La placa se incuba en un incubador de CO_{2} durante 20 horas. Las células adherentes se lavan dos veces en el lavador Biotek con 200 ul de HBSS (solución salina equilibrada de Hank) dejando 100 ul de tampón tras el lavado final.

Se prepara una disolución madre de 1 mg/ml de fluo-3 en 10% de ácido plurónico - DMSO. Para cargar las células con fluo-3, se añaden 50 ul de fluo-3 12 ug/ml a cada pocillo. La placa se incuba a 37ºC en un incubador de CO_{2} durante 60 min. La placa se lava cuatro veces en el lavador Biotek con HBSS dejando 100 ul de tampón.

Para las células no adherentes, se centrifugan las células a partir de los medios de cultivo. Se resuspenden las células hasta 2-5 x 10^{6} células/ml con HBSS en un tubo cónico de 50 ml. Se añaden 4 ul de una disolución de fluo-3 1 mg/ml en 10% de ácido plurónico - DMSO a cada ml de suspensión celular. Entonces de coloca el tubo en un baño de agua a 37ºC durante 30-60 min. Se lavan las células dos veces con HBSS, se resuspenden hasta 1 x 10^{6} células/ml, y se dispensan en una microplaca, 100 ul/pocillo. Se centrifuga la placa a 1000 rpm durante 5 min. Entonces se lava la placa una vez en Denley CellWash (sistema de lavado celular Denley) con 200 ul, seguido por una etapa de aspiración hasta 100 ul de volumen final.

Para un ensayo sin células, cada pocillo contiene una molécula fluorescente, tal como fluo-3. Se añade el sobrenadante al pocillo y se detecta un cambio en la fluorescencia.

Para medir la fluorescencia del calcio intracelular, se fija el FLIPR para los siguientes parámetros: (1) la ganancia del sistema es 300-800 mW; (2) el tiempo de exposición es de 0,4 segundos; (3) F/stop (apertura relativa) de la cámara es F/2; (4) la excitación es de 488 nm; (5) la emisión es de 530 nm; y (6) la adición de la muestra es de 50 ul. El aumento de la emisión a 530 nm indica un acontecimiento de señalización extracelular que ha dado como resultado un aumento en la concentración intracelular de Ca^{++}.

Ejemplo 19

Ensayo de selección de alto rendimiento que identifica la actividad de la tirosina cinasa

Las proteínas tirosina cinasa (PTK) representan un grupo diverso de cinasas transmembrana y citoplasmáticas. Dentro del grupo de receptores de proteína tirosina cinasa (RPTK) hay receptores para una variedad de factores de crecimiento mitogénicos y metabólicos incluyendo las subfamilias de receptores de PDGF, FGF, EGF, NGF, HGF e insulina. Además, hay una gran familia de RPTK para la que se desconoce el ligando correspondiente. Los ligandos para los RPTK incluyen principalmente proteínas pequeñas secretadas, pero también proteínas unidas a la membrana y de la matriz extracelular.

La activación de RPTK por ligandos implica la dimerización del receptor mediada por ligando, dando como resultado la transfosforilación de las subunidades del receptor y la activación de las tirosina cinasas citoplasmáticas. Las tirosina cinasas citoplasmáticas incluyen tirosina cinasas asociadas a receptor de la familia src (por ejemplo, src, yes, lck, lyn, fyn) y proteínas tirosina cinasas no unidas a receptor y citosólicas, tales como la familia Jak, cuyos miembros median la transducción de señales desencadenada por la superfamila de receptores de citocina (por ejemplo, las interleucinas, interferones, GM-CSF y leptina).

Debido a la amplia variedad de factores conocidos que pueden estimular la actividad de la tirosina cinasa, es de interés la identificación de proteínas secretadas humanas novedosas que puedan activar rutas de transducción de señales de la tirosina cinasa. Por tanto, el siguiente protocolo está diseñado para identificar esas proteínas secretadas humanas novedosas que pueden activar las rutas de transducción de señales de la tirosina cinasa.

Sembrar las células diana (por ejemplo, queratinocitos primarios) a una densidad de aproximadamente 25.000 células por pocillo en una placa de selección silenciosa Loprodyne de 96 pocillos adquirida de Nalge Nunc (Naperville, IL). Se esterilizan las placas con dos enjuagues de 30 minutos con etanol al 100%, se enjuagan con agua y se secan durante la noche. Se recubren algunas placas durante 2 h con 100 ml de colágeno de tipo I de calidad para cultivo celular (50 mg/ml), gelatina (2%) o polilisina (50 mg/ml), pudiendo adquirirse todo ello de Sigma Chemicals (St. Louis, MO) o Matrigel al 10% adquirido de Becton Dickinson (Bedford, MA), o suero de ternero, enjuagado con PBS y almacenado a 4ºC. Se somete a ensayo el crecimiento celular en estas placas sembrando 5.000 células/pocillo en medio de crecimiento y la cuantificación indirecta del número de células a través del uso de alamarBlue, tal como describe el fabricante Alamar Biosciences, Inc. (Sacramento, CA) tras 48 h. Se usan cubiertas de placa Falcon n.º 3071 de Becton Dickinson (Bedford, MA) para cubrir las placas de selección silenciosa Loprodyne. También pueden usarse placas de cultivo celular Falcon Microtest III en algunos experimentos de proliferación.

Para preparar los extractos, se siembran células A431 en las membranas de nailon de las placas Loprodyne (20.000/200 ml/pocillo) y se cultivan durante la noche en medio completo. Las células se hacen quiescentes mediante la incubación en medio basal libre de suero durante 24 h. Tras de 5-20 minutos de tratamiento con EGF (60 ng/ml) o 50 ul del sobrenadante producido en el ejemplo 11, se extrajo el medio y se añaden a cada pocillo 100 ml de tampón de extracción (HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 0,15 M, Triton X-100 al 1%, SDS al 0,1%, Na_{3}VO_{4} 2 mM, Na_{4}P_{2}O_{7} 2 mM y un cóctel de inhibidores de proteasa (n.º 1836170) obtenido de Boeheringer Mannheim (Indianápolis, IN) y se agita la placa en un agitador rotatorio durante 5 minutos a 4ºC. Entonces se coloca la placa en un colector de transferencia de vacío y se filtra el extracto a través de los fondos de membrana de 0,45 mm de cada pocillo usando una aspiradora doméstica. Se recogen los extractos en una placa de captura/ensayo de 96 pocillos en el fondo del colector de vacío y se colocan inmediatamente en hielo. Para obtener los extractos clarificados mediante centrifugación, se extrae el contenido de cada pocillo, tras solubilización con detergente durante 5 minutos, y se centrifuga durante 15 minutos a 4ºC a 16.000 x g.

Someter a prueba los extractos filtrados para determinar los niveles de actividad de la tirosina cinasa. Aunque se conocen muchos métodos de detección de la actividad de la tirosina cinasa, en el presente documento se describe un método.

Generalmente, se evalúa la actividad de la tirosina cinasa de un sobrenadante determinando su capacidad para fosforilar un resto de tirosina en un sustrato específico (un péptido biotinilado). Los péptidos biotinilados que pueden usarse para este fin incluyen PSK1 (que corresponde a los aminoácidos 6-20 de la cinasa de la división celular cdc2-p34) y PSK2 (que corresponde a los aminoácidos 1-17 de la gastrina). Ambos péptidos son sustratos de una variedad de tirosina cinasas y están disponibles de Boehringer Mannheim.

Se establece la reacción de la tirosina cinasa añadiendo los siguientes componentes en orden. En primer lugar, añadir 10 ul de péptido biotinilado 5 uM, luego 10 ul de ATP/Mg_{2+} (ATP 5 mM/MgCl_{2} 50 mM), luego 10 ul de 5x tampón de ensayo (clorhidrato de imidazol 40 mM, pH 7,3, beta-glicerofosfato 40 mM, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 100 mM, MnCl_{2} 5 mM, BSA 0,5 mg/ml), luego 5 ul de vanadato de sodio (1 mM), y luego 5 ul de agua. Mezclar los componentes suavemente y preincubar la mezcla de reacción a 30ºC durante 2 min. Iniciar la reacción añadiendo 10 ul de enzima control o el sobrenadante filtrado.

Entonces se termina la reacción de ensayo de la tirosina cinasa añadiendo 10 ul de EDTA 120 mM y se colocan las reacciones en hielo.

Se determina la actividad de la tirosina cinasa transfiriendo una alícuota de 50 ul de mezcla de reacción a un módulo de placas de microtitulación (MTP) e incubando a 37ºC durante 20 min. Esto permite que la placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina se asocie con el péptido biotinilado. Lavar el módulo de MTP con 300 ul/pocillo de PBS cuatro veces. A continuación añadir 75 ul de anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa del rábano picante (anti-P-Tyr-POD (0,5 u/ml)) a cada pocillo e incubar a 37ºC durante una hora. Lavar el pocillo como anteriormente.

A continuación añadir 100 ul de disolución de sustrato de peroxidase (Boehringer Mannheim) e incubar a temperatura ambiente durante al menos 5 min. (hasta 30 min.). Medir la absorbancia de la muestra a 405 nm usando un lector de ELISA. Se cuantifica el nivel de actividad de la peroxidasa unida usando un lector de ELISA y refleja el nivel de actividad de la tirosina cinasa.

Ejemplo 20

Ensayo de selección de alto rendimiento que identifica la actividad de fosforilación

Como posible alternativa y/o complemento al ensayo de la actividad de la proteína tirosina cinasa descrito en el ejemplo 19, también puede usarse un ensayo que detecte la activación (fosforilación) de productos intermedios de la transducción de señales intracelulares principales. Por ejemplo, tal como se describe más adelante, un ensayo particular puede detectar la fosforilación de la tirosina de las Erk-1 y Erk-2 cinasas. Sin embargo, la fosforilación de otras moléculas, tales como Raf, JNK, p38 MAP, Map cinasa (MEK), MEK cinasa, Src, cinasa específica del músculo (MuSK), IRAK, Tec y Janus, así como cualquier otra molécula de fosfoserina, fosfotirosina o fosfotreonina, puede detectarse sustituyendo estas moléculas por Erk-1 o Erk-2 en el siguiente ensayo.

Específicamente, se preparan placas de ensayo recubriendo los pocillos de una placa de ELISA de 96 pocillos con 0,1 ml de proteína G (1 ug/ml) durante 2 h a temperatura ambiente (TA). Entonces se enjuagan las placas con PBS y se bloquean con 3% de BSA/PBS durante 1 h a TA. Se tratan entonces las placas con proteína G con 2 anticuerpos monoclonales comerciales (100 ng/pocillo) frente a Erk-1 y Erk-2 (1 h a TA) (Santa Cruz Biotechnology). (Para detectar otras moléculas, puede modificarse fácilmente esta etapa sustituyendo por un anticuerpo monoclonal que detecte cualquiera de las moléculas descritas anteriormente). Tras 3-5 enjuagues con PBS, se almacenan las placas a 4ºC hasta su uso.

Se siembran células A431 a 20.000/pocillo en una placa de filtro de 96 pocillos Loprodyne y se cultivan durante la noche en medio de crecimiento. Entonces se privan las células de nutrientes durante 48 h en medio basal (DMEM) y luego se tratan con EGF (6 ng/pocillo) o 50 ul de los sobrenadantes obtenidos en el ejemplo 11 durante 5-20 minutos. Entonces se solubilizan las células y se filtran los extractos directamente en la placa de ensayo.

Tras la incubación con el extracto durante 1 h a TA, se enjuagan de nuevo los pocillos. Como control positivo, se usa una preparación comercial de MAP cinasa (10 ng/pocillo) en lugar del extracto de A431. Entonces se tratan las placas con un anticuerpo policlonal comercial (de conejo) (1 ug/ml) que reconoce específicamente el epítopo fosforilado de las Erk-1 y Erk-2 cinasas (1 h a TA). Se biotiniliza este anticuerpo mediante procedimientos convencionales. Entonces se cuantifica el anticuerpo policlonal unido mediante incubaciones sucesivas con europio-estreptavidina y reactivo que mejora la fluorescencia del europio en el instrumento DELFIA de Wallac (fluorescencia de resolución temporal). Una señal fluorescente aumentada con respecto al nivel inicial indica una fosforilación.

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Ejemplo 21

Método de determinación de alteraciones en un gen que corresponde a un polinucleótido

Ha de aislarse ARN aislado de familias enteras o pacientes individuales que se presentan un fenotipo de interés (tal como una enfermedad). Entonces se genera ADNc a partir de estas muestras de ARN usando protocolos conocidos en la técnica. (Véase, Sambrook). Entonces se usa el ADNc como molde para PCR, empleando cebadores que rodean las regiones de interés en la SEQ ID NO: X. Las condiciones de PCR sugeridas consisten en 35 ciclos a 95ºC durante 30 segundos; 60-120 segundos a 52-58ºC; y 60-120 segundos a 70ºC, usando disoluciones tampón descritas en Sidransky, D., et al., Science 252:706 (1991).

Entonces se secuencian los productos de la PCR usando cebadores marcados en su extremo 5' con polinucleótido cinasa de T4, empleando la polimerasa SequiTherm. (Epicentre Technologies). También se determinan los límites intrón-exón de exones seleccionados y se analizan los productos genómicos de la PCR para confirmar los resultados. Entonces se clonan los productos de la PCR que albergan mutaciones sospechadas y se secuencian para validar los resultados de la secuenciación directa.

Los productos de la PCR se clonan en vectores de cola de T tal como se describe en Holton, T.A. y Graham, M.W., Nucleic Acids Research, 19:1156 (1991) y se secuencian con polimerasa de T7 (United States Biochemical). Se identifican los individuos afectados por las mutaciones no presentes en los individuos no afectados.

También se observan transposiciones genómicas como método de determinación de alteraciones en un gen que corresponde a un polinucleótido. Clones genómicos aislados según el ejemplo 2 se someten a traslado de mella con digoxigenin deoxiuridina 5'-trifosfato (Boehringer Manheim), y FISH realizada tal como se describe en Johnson, Cg. et al., Methods Cell Biol. 35: 73-99 (1991). Se lleva a cabo la hibridación con la sonda marcada usando un enorme exceso de ADN cot-1 humano para la hibridación específica en el locus genómico correspondiente.

Se contratiñen cromosomas con 4,6-diamino-2-fenilidol y yoduro de propidio, produciendo una combinación de bandas C y R. Se obtienen imágenes alineadas para el mapeo preciso usando un equipo de filtro de triple banda (Chroma Technology, Brattleboro, VT) en combinación con una cámara con dispositivo de carga acoplada con enfriamiento (Photometrics, Tucson, AZ) y filtros de longitud de onda de excitación variable. (Johnson, Cv. et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 8:75 (1991)). La recogida de imágenes, el análisis y las mediciones de la longitud fraccional cromosómica se realizan usando el sistema ISee Graphical Program. (Inovision Corporation, Durham, NC). Las alteraciones cromosómicas de la región genómica hibridada por la sonda se identifican como inserciones, deleciones y translocaciones. Estas alteraciones se usan como marcador de diagnóstico para una enfermedad asociada.

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Ejemplo 22

Método de detección de niveles anómalos de un polipéptido en una muestra biológica

Puede detectarse un polipéptido de la presente invención en una muestra biológica, y si se detecta un nivel aumentado o disminuido del polipéptido, este polipéptido es un marcador para un fenotipo particular. Los métodos de detección son numerosos, y por tanto, se entiende que un experto en la técnica puede modificar el siguiente ensayo para adaptarlo a sus necesidades particulares.

Por ejemplo, se usan ELISA sándwich con anticuerpos para detectar polipéptidos en una muestra, preferiblemente una muestra biológica. Se recubren los pocillos de una placa de microtitulación con anticuerpos específicos, a una concentración final de 0,2 a 10 ug/ml. Los anticuerpos son o bien monoclonales o bien policlonales y se producen mediante el método descrito en el ejemplo 10. Se bloquean los pocillos de modo que se reduzca la unión no específica del polipéptido al pocillo.

Entonces se incuban los pocillos recubiertos durante > 2 horas a TA con una muestra que contiene el polipéptido. Preferiblemente, deben usarse diluciones en serie de la muestra para validar los resultados. Entonces se lavan las placas tres veces con agua desionizada o destilada para eliminar el polipéptido no unido.

A continuación, se añaden 50 ul de conjugado de anticuerpo específico-fosfatasa alcalina, a una concentración de 25-400 ng, y se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo tres veces con agua desionizada o destilada para eliminar el conjugado no unido.

Añadir 75 ul de disolución de sustrato de 4-metilumbeliferil fosfato (MUP) o p-nitrofenil fosfato (NPP) a cada pocillo e incubar 1 hora a temperatura ambiente. Medir la reacción mediante un lector de placas de microtitulación. Preparar una curva patrón, usando diluciones en serie de una muestra control, y representar gráficamente la concentración de polipéptido en el eje X (escala logarítmica) y la fluorescencia o la absorbancia en el eje Y (escala lineal). Interpolar la concentración del polipéptido en la muestra usando la curva patrón.

Ejemplo 23

Formulación de un polipéptido

Se formulará y se dosificará la composición de polipéptido secretada de una manera consecuente con la práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con el polipéptido secretado solo), el sitio de administración, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los médicos. Por tanto, se determina la "cantidad eficaz" para los fines del presente documento según tales consideraciones.

Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de polipéptido secretado administrada por vía parenteral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, tal como se observó anteriormente, esto se someterá al criterio terapéutico. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mg/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos entre aproximadamente 0,01 y 1 mg/kg/día para la hormona. Si se administra de manera continua, el polipéptido secretado normalmente se administra a una tasa de dosis de aproximadamente 1 \mug/kg/hora a aproximadamente 50 \mug/kg/hora, o bien mediante 1-4 inyecciones al día o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También puede emplearse una disolución en bolsa intravenosa. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas que contienen la proteína secretada de la invención se administran por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (tal como mediante polvos, pomadas, geles, gotas o parche transdérmico), bucal, o como un aerosol oral o nasal. "Vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a una formulación auxiliar, carga líquida, semisólida o sólida, diluyente, material de encapsulación de cualquier tipo, no tóxicos. El término "parenteral", tal como se usa en el presente documento, se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

El polipéptido secretado también se administra de manera adecuada mediante sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (patente estadounidense n.º 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (R. Langer et al.) o poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen polipéptidos atrapados en liposomas. Los liposomas que contienen el polipéptido secretado se preparan mediante métodos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses n.^{os} 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Habitualmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Ángstroms) en el que el contenido en lípidos es superior a aproximadamente 30 por ciento en moles de colesterol, ajustándose

\hbox{la  proporción
seleccionada para la terapia óptima con el polipéptido
secretado.}

Para la administración parenteral, en una realización, el polipéptido secretado se formula generalmente mezclándolo con el grado de pureza deseado, en una forma farmacéutica unitaria inyectable (disolución, suspensión o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no sea tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que sea compatible con otros componentes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son perjudiciales para los polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el polipéptido de manera uniforme e íntima con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos. Luego, si es necesario, se da forma al producto en la formulación deseada. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente una disolución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de tales vehículos incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y solución de dextrosa. También son útiles en este caso vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo, así como liposomas.

El vehículo contiene de manera adecuada cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente diez restos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

El polipéptido secretado normalmente se formula en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferiblemente 1-10 mg/ml, a un pH de aproximadamente 3 a 8. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, vehículos o estabilizadores anteriores dará como resultado la formación de sales de polipéptido.

Cualquier polipéptido que va a usarse para la administración terapéutica puede hacerse estéril. La esterilidad se obtiene fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micras). Las composiciones de polipéptido terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de disolución intravenosa que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Los polipéptidos se almacenarán habitualmente en recipientes de dosis unitaria o múltiple, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como disolución acuosa o como formulación liofilizada para su reconstitución. Como ejemplo de formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de disolución acuosa de polipéptido al 1% (p/v) esterilizada mediante filtración, y se liofiliza la mezcla resultante. La disolución de infusión se prepara reconstituyendo el polipéptido liofilizado usando agua para inyección bacteriostática.

La invención también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con tal(es) recipiente(s)
puede haber un aviso en la forma recomendada por el organismo que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, aviso que refleja la aprobación por el organismo de la fabricación, el uso o la venta para la administración en seres humanos. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse conjuntamente con otros compuestos terapéuticos.

Ejemplo 24

Método de tratamiento de niveles disminuidos del polipéptido

Se apreciará que los estados producidos por una disminución en el nivel de expresión convencional o normal de una proteína secretada en un individuo pueden tratarse mediante la administración del polipéptido de la presente invención, preferiblemente en la forma secretada. Por tanto, la invención también proporciona un método de tratamiento de un individuo que necesita un nivel aumentado del polipéptido que comprende administrar a tal individuo una composición farmacéutica que comprende una cantidad del polipéptido para aumentar el nivel de actividad del polipéptido en tal individuo.

Por ejemplo, un paciente con niveles disminuidos de un polipéptido recibe una dosis diaria de 0,1-100 ug/kg del polipéptido durante seis días consecutivos. Preferiblemente, el polipéptido está en la forma secretada. Los detalles exactos del esquema de dosificación, basado en la administración y la formulación, se facilitan en el ejemplo 23.

Ejemplo 25

Método de tratamiento de niveles aumentados del polipéptido

Se usa la tecnología antisentido para inhibir la producción de un polipéptido de la presente invención. Esta tecnología es un ejemplo de un método de disminución de los niveles de un polipéptido, preferiblemente una forma secretada, debido a una variedad de etiologías, tales como cáncer.

Por ejemplo, a un paciente al que se ha diagnosticado niveles anómalamente aumentados de un polipéptido, se le administran por vía intravenosa polinucleótidos antisentido a 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 y 3,0 mg/kg al día durante 21 días. Este tratamiento se repite tras un periodo de descanso de 7 días si el tratamiento se toleró bien. La formulación del polinucleótido antisentido se proporciona en el ejemplo 23.

Ejemplo 26

Método de tratamiento usando terapia génica

Un método de terapia génica es mediante el trasplante de fibroblastos, que pueden expresar un polipéptido, en un paciente. Generalmente, los fibroblastos se obtienen de un sujeto mediante biopsia cutánea. El tejido resultante se coloca en un medio de cultivo tisular y se separa en pequeñas porciones. Los pequeños trozos de tejido se colocan sobre una superficie húmeda de un frasco de cultivo tisular, aproximadamente se colocan diez porciones en cada matraz. El matraz se coloca del revés, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente durante la noche. Tras 24 horas a temperatura ambiente, se invierte el matraz y los trozos de tejido se quedan fijados en el fondo del matraz y se añaden medios nuevos (por ejemplo, medios F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina). Entonces se incuban los frascos a 37ºC durante aproximadamente una semana.

En este momento, se añaden medios nuevos y posteriormente se cambian cada varios días. Tras dos semanas adicionales en cultivo, aparece una monocapa de fibroblastos. La monocapa se trata con tripsina y amplía a escala en frascos más grandes.

Se digiere con EcoRI y HindIII el vector pMV-7 (Kirschmeier, P.T. et al., DNA, 7:219-25 (1988)), flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney y posteriormente se trata con fosfatasa intestinal de ternero. El vector lineal se fracciona en gel de agarosa y se purifica, usando perlas de vidrio.

El ADNc que codifica un polipéptido de la presente invención puede amplificarse usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias de los extremos 5' y 3', respectivamente, tal como se expone en el ejemplo 1. Preferiblemente, el cebador en 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador en 3' incluye un sitio HindIII. Se añaden juntas cantidades iguales de la estructura principal lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento amplificado con EcoRI e HindIII, en presencia de ADN ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. Entonces se usa la mezcla de ligación para transformar bacterias HB101, que luego se siembran en placa sobre agar que contiene kanamicina para confirmar que el vector tiene el gen de interés insertado correctamente.

Se hacen crecer las células de empaquetamiento GP+am12 o pA317 anfotróficas en cultivo tisular hasta la densidad confluente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de ternero (ST), penicilina y estreptomicina. Entonces se añade el vector del VSM que contiene el gen a los medios y se transducen las células de empaquetamiento con el vector. Las células de empaquetamiento producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células de empaquetamiento se denominan ahora células productoras).

Se añaden medios nuevos a las células productoras transducidas y posteriormente se recogen los medios de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. Se filtran los medios gastados, que contienen las partículas virales infecciosas, a través de un filtro Millipore para eliminar las células productoras separadas y estos medios se usan luego para infectar fibroblastos. Se eliminan los medios de una placa subconfluente de fibroblastos y se sustituyen rápidamente por los medios de las células productoras. Estos medios se eliminan y se sustituyen por medios nuevos. Si el título de virus es alto, entonces prácticamente todos los fibroblastos resultarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces es necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his. Una vez que los fibroblastos se han infectado eficazmente, se analizan los fibroblastos para determinar si produce proteína.

Entonces se trasplantan los fibroblastos modificados por ingeniería genética en el huésped, o bien solos o bien tras haberse hecho crecer hasta la confluencia en perlas de microsoporte Cytodex 3.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Human Genome Sciences, Inc., et al.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: 32 Proteínas humanas secretadas

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 120

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Human Genome Sciences, Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 9410 Key West Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rockville

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Maryland

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE. UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20850

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,50 pulgadas, almacenamiento de 1,4 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: HP Vectra 486/33

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MSDOS versión 6.2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Texto ASCII

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 27 de mayo de 1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: A. Anders Brookes

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.373

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: PZ006PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (301) 309-8504

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (301) 309-8439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 733 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCAAGCT TTTTGCAAAG CCTAGGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 271 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCTCGAGG GATGACAGCG ATAGAACCCC GG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGAAGCTTC GCGACTCCCC GGATCCGCCT C

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGACTTTC CC

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 73 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 256 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1169 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1310 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1139 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2271 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 626 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2118 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1076 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1379 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1337 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1390 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1431 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2539 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1041 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1962 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1228 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1340 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 806 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 696 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1007 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2017 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 699 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1264 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 997 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1914 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1020 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 781 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 966 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 416 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1114 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 602 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 970 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1002 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2581 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1764 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 796 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 981 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 312 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

78

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 467 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 83 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 180 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 287 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 47 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 114 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 81 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 260 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 216 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 407 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 173 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 208 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

118

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

121

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

135

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

144

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:

145

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 136 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 112:

146

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 113:

\vskip1.000000\baselineskip

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:

\vskip1.000000\baselineskip

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 179 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

150

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:

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152

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 118:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 67 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:

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153

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 60 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:

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154

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 166 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:

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155

Claims (18)

1. Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23;

(b)

un polinucleótido que tiene toda la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(c)

un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 23;

(d)

un fragmento de polinucleótido que comprende 150 nucleótidos de la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(e)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud de SEQ ID NO: 60;

(f)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de SEQ ID NO:60;

(g)

un polinucleótido que codifica un fragmento de polipéptido de SEQ ID NO: 60 o un fragmento de polipéptido del mismo codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, en el que dicho fragmento de polipéptido comprende 40 ó 50 restos de aminoácido contiguos de longitud y tiene actividad biológica;

(h)

un polinucleótido que codifica un polipéptido de longitud completa de SEQ ID NO: 60 o que está codificado por la secuencia de ADNc incluida en el depósito de la ATCC n.º 209075, que puede hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO: 23;

(i)

un polinucleótido que es al menos el 95% idéntico a al menos 150 nucleótidos contiguos de un polinucleótido como el definido en uno cualquiera de (a) a (h); y

(j)

un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (i);

o la hebra complementaria del polinucleótido (a) a (j).

2. Polinucleótido de la reivindicación 1, que es ADN o ARN.

3. El gen correspondiente a la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 23 o que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60.

4. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

5. Un método de preparación de una célula huésped recombinante que comprende introducir el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el vector de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped recombinante que contiene el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el vector de la reivindicación 4 o producido mediante el método de la reivindicación 5.

7. Célula huésped recombinante de la reivindicación 6, que expresa un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.

8. Un método de preparación de un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, que comprende;

(a)

cultivar la célula huésped recombinante de la reivindicación 7 en condiciones tales que se exprese dicho polipéptido; y

(b)

recuperar dicho polipéptido.

9. Un polipéptido codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o que puede obtenerse mediante el método de la reivindicación 8.

10. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de la reivindicación 9.

11. Un antagonista que comprende un polinucleótido antisentido con respecto al polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 que puede unirse a dicho polinucleótido y bloquear su traducción en el polipéptido codificado.

12. Un método para identificar antagonistas o agonistas del polipéptido de la reivindicación 9 que comprende:

(a)

producir células que expresan el polipéptido de la reivindicación 9;

(b)

poner en contacto el polipéptido producido en la etapa (a) con una muestra de prueba que contiene potencialmente un antagonista o agonista; e

(c)

identificar un antagonista o agonista observando la unión y la inhibición o estimulación de la actividad de dicho polipéptido.

13. Un método in vitro de diagnóstico de un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico en un sujeto que comprende:

(a)

determinar la presencia o ausencia de una mutación en el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el gen de la reivindicación 3; y

(b)

diagnosticar un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico basado en la presencia o ausencia de dicha mutación.

14. Un método in vitro de diagnóstico de un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico en un sujeto que comprende:

(a)

determinar la presencia o cantidad de expresión del polipéptido de la reivindicación 9 en una muestra biológica; y

(b)

diagnosticar un estado patológico o una susceptibilidad a un estado patológico basado en la presencia o cantidad de expresión del polipéptido.

15. Un método para identificar una pareja de unión al polipéptido de la reivindicación 9 que comprende:

(a)

poner en contacto el polipéptido de la reivindicación 9 con una pareja de unión; y

(b)

determinar si la pareja de unión efectúa una actividad del polipéptido.

16. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el polipéptido de la reivindicación 9, un ADNc que codifica y puede expresar dicho polipéptido in vivo, el anticuerpo de la reivindicación 10, o el antagonista de la reivindicación 11, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el anticuerpo de la reivindicación 10.

18. Un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas del método de la reivindicación 12 y (d) formular el compuesto identificado en la etapa (c) en una forma farmacéuticamente aceptable.