ES2355242T3

ES2355242T3 - Procedimiento de evaluación del riesgo genético relativo al autismo.

Info

Publication number: ES2355242T3
Application number: ES04817937T
Authority: ES
Inventors: Joseph D. Buxbaum; Nicolas Ramoz
Original assignee: BEATRICE AND SAMUEL A SEAVER FOUNDATION
Current assignee: BEATRICE AND SAMUEL A SEAVER FOUNDATION
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2011-03-24
Anticipated expiration: 2024-12-03
Also published as: EP1697533A4; ATE490340T1; ZA200605466B; US20070248956A1; IL176121A0; AU2004296804A1; WO2005055807A3; CA2548590A1; AU2004296804B2; DE602004030372D1; IL176121A; WO2005055807A2; EP1697533B1; EP1697533A2

Abstract

Procedimiento de evaluación de un individuo para el riesgo genético relativo de autismo, comprendiendo el procedimiento determinar el genotipo del individuo en los sitios de polimorfismo rs2056202 y/o rs2292813 del gen SLC25A12, en el que la presencia de G en cualquiera de los dos sitios indica un riesgo incrementado de autismo.

Description

Procedimiento de evaluación del riesgo genético relativo al autismo.

Declaración en relación a investigación o desarrollos con subvención federal

El gobierno de Estados Unidos tiene una licencia pagada en la presente invención y el derecho, en circunstancias limitadas, de requerir al propietario de la patente que dé licencia a otras partes, en términos razonables, a tenor de los términos de la Subvención No. U54 MH066673, concedida por los Institutos nacionales de la Salud (National Institutes of Health).

Antecedentes de la invención (1) Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la evaluación del riesgo de autismo. Más específicamente, se proporcionan procedimientos y composiciones que son útiles para estimar el riesgo de padecer autismo.

(2) Referencias citadas

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El autismo o trastorno autista (MIM Nº 209850) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por un déficit en la comunicación verbal y no verbal, dificultades en las interacciones sociales recíprocas, patrones de intereses y comportamientos repetitivos o estereotipados (1-3). La relación por sexos es de 4:1, varones a hembras, y en la actualidad se cree que la prevalencia de la enfermedad es superior a 1 por cada 1000 personas (4). El autismo parece ser el más altamente genético de los trastornos psiquiátricos, según lo evidencia el alto riesgo de autismo en niños adicionales en familias con un niño autista (que se estima que es entre 50 y 100 veces mayor que el esperado aleatoriamente) y siendo la tasa de concordancia para gemelos monocigóticos mucho más alta que la de los gemelos dicigóticos (5). Las estimaciones de heredabilidad de autismo idiopático son superiores al 90% (6), pudiendo atribuirse dicho porcentaje de enfermedad a una etiología genética. Sin embargo, el autismo no sigue un modo de transmisión Mendeliano simple (es decir, transmisión dominante o recesiva) sino que es claramente una enfermedad poligénica (4). Un modelo genético comúnmente aceptado implica varios genes (entre 5 y 10) que interactúan para producir el trastorno.

Todavía tiene que identificarse inequívocamente una variante o mutación genética que segrega con el autismo. Los genes candidatos para estudios de autismo están entre los genes que se cree que juegan un papel en los caminos del neurodesarrollo, comportamiento o conducta, tales como genes en la vía serotonérgica o reelina (4, 7, 8). Unos pocos polimorfismos en varios genes han sido asociados con el trastorno en ciertos estudios, pero no en otros (4, 9-11).

Varios estudios independientes que implican análisis pangenómicos han sido publicados ahora y apuntan a un ligamiento considerable entre el autismo y las regiones cromosómicas 2q y 7q (4, 12). Los estudios de los presentes inventores definieron la región cromosómica 2q24-q33 como una región de susceptibilidad para el autismo con un pico en D2S335, particularmente evidente en familias con autismo más grave [según se define por el retraso en la aparición (superior a los 36 meses) de la capacidad de construcción de frases (retraso en la capacidad de construcción de frases, PSD) (MIM Nº 606053)] (puntuación NPL de 3,32 y un HLOD de 2,99) (13). Usando una cohorte de 152 familias hijo-pareja con autismo, la mayoría de países europeos, el Consorcio Internacional para el Estudio Genético y Molecular del Autismo (International Molecular Genetic Study of Autism Consortium, IMGSAC) informó su puntuación LOD multipunto más alta (MLS=3,74) en D2D2188, en familias con autismo con retraso en el lenguaje (definido en ese estudio como ninguna palabra antes de los 24 meses y/o sin capacidad de construcción de frases antes de los 33 meses) (14). Cuando se usaron criterios diagnósticos más estrictos, el MLS se incrementó a un valor de 4,8. Finalmente, un estudio del Equipo Colaborativo para el Autismo (Collaborative Autism Team), usando el criterio PSD para ponderar sus datos, mostró también un ligamiento entre el autismo y la región cromosómica 2q33, con un MLS de 2,86 y un HLOD de 2,12 en D2S116 (15).

D2S335, D2S2188 y D2S116 están localizados en el cromosoma 2, a 171 megabases (Mb), 174,4 Mb y 200,5 Mb, respectivamente (Figura 1A). Esto indica que hay una región crítica de susceptibilidad para el autismo cerca de D2S335 y D2S2188 en 2q31. En este intervalo, se han mapeado varios genes y marcadores de secuencia expresada (Figura 1B). Recientemente, el IMGSAC ha informado acerca del análisis de nueve genes candidatos (TBR1, GAD1, DLX1, DLX2, cAMP-GEFII, CHN1, CREB2, HOXD1 y NEUROD1) localizados a lo largo de una región de 30 Mb de 2q, que son expresados en el sistema nervioso central y codifican proteína y que juegan un papel en celulares neuronales o en vías neurobiológicas (16). Se observaron variantes en TBR1, cAMP_GEFII, CHN1, HOXD1 y NEUROD1. Sin embargo, no se encontró ninguna evidencia de que ninguno de los genes candidatos contribuya al autismo. En esta región, el laboratorio de los presentes inventores, junto con el laboratorio de la Dra. Miriam Mesiler, ha investigado previamente los canales neuronales de sodio controlados por voltaje de tipo I, II y III (SCN1A, SCN2A y SCN3A) en 117 familias multiplex con autismo (17). Se identificaron mutaciones raras, cada una en familias únicas, que no se observaron en los controles. Estas mutaciones, aunque de gran interés, es probable que no expliquen la evidencia del ligamiento observada en esta región.

De esta manera, existe una necesidad para localizar con precisión variaciones genéticas asociadas con el autismo, para poder determinar si unos individuos tienen o no un riesgo particular de padecer autismo, y para determinar el riesgo de autismo de la descendencia de dos individuos. La identificación de factores de riesgo genéticos proporcionaría también herramientas e información para dilucidar las causas del autismo. La presente invención aborda esa necesidad.

Resumen de la invención

Consiguientemente, los presentes inventores han descubierto que el riesgo de autismo se incrementa en los individuos que tienen el alelo G en cualquiera o en ambos sitios de polimorfismo rs2056202 y rs2292813 del gen SLC25A12.

De esta manera, en algunas realizaciones, la invención está dirigida a un procedimiento de evaluación de un individuo para el riesgo genético relativo para el autismo. Los procedimientos comprenden determinar el genotipo del individuo en los sitios de polimorfismo rs2056202 y/o rs2292813 del gen SLC25A12. En estas realizaciones, la presencia de un G en cualquiera de los dos sitios indica un riesgo incrementado de autismo, y la presencia de un número creciente de Gs en los sitios indica un riesgo creciente de autismo.

La invención divulga conjuntos de dos cebadores adecuados para su uso en una reacción en cadena de la polimerasa, útil para los procedimientos identificados anteriormente. La invención divulga, además, kits que comprenden los cebadores identificados anteriormente.

En otras realizaciones, la invención divulga polinucleótidos que consisten en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

La invención divulga además procedimientos de identificación de una forma de un polimorfismo genético que tiene un ligamiento con el autismo. Los procedimientos comprenden identificar un polimorfismo en el gen SLC25A12 y determinar si una forma del polimorfismo está presente o no en los individuos autistas más que otra forma. En estas realizaciones, la forma que está presente más frecuentemente en el autismo tiene un ligamiento con el autismo. Los polimorfismos identificados mediante estos procedimientos pueden ser usados también para determinar el riesgo de autismo de un individuo.

En realizaciones adicionales, la invención divulga células eucariotas que comprenden un gen SLC25A12 humano transgénico, y animales no humanos que comprenden esas células.

Además, la invención divulga procedimientos de evaluación de si un compuesto afecta o no al autismo. Los procedimientos comprenden poner en contacto el compuesto con la célula eucariota descrita anteriormente, a continuación, determinar si el compuesto afecta o no a la expresión o a la actividad de un producto del gen SLC25A12. En estas realizaciones, un compuesto que afecta a la expresión o a la actividad del producto del gen SLC25A12 afecta al autismo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 consta de tres gráficos que muestran la organización genómica del locus de susceptibilidad al autismo en la región cromosómica 2q24-q33. El panel A muestra el mapa genético y citogenético. El panel B muestra la organización de los genes candidatos posicionales. La punta de flecha indica la orientación de la transcripción. El panel C muestra la estructura genómica del gen SLC25A12. Se indican las variantes identificadas en el presente estudio (véase el texto), con los dos SNPS en los que se ha enfocado el estudio actual, rs2056202 (I3-21A/G) y rs2292813 (I16+70A/G) subrayados.

La Fig. 2 es una tabla que muestra los resultados de una evaluación de riesgo relativo usando polimorfismos del gen SLC25A12.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento de una asociación entre ciertos polimorfismos en el gen SLC25A12 y el autismo. Este descubrimiento permite varias composiciones y procedimientos para su uso en varios aspectos de la diagnosis, la terapia y la investigación del autismo.

De esta manera, en algunas realizaciones, la invención está dirigida a un procedimiento de evaluación de un individuo para el riesgo genético relativo para el autismo. Los procedimientos comprenden determinar el genotipo del individuo en los sitios de polimorfismo rs2056202 y/o rs2292813 del gen SLC25A12. En estas realizaciones, la presencia de una G en cualquiera de los dos sitios indica un riesgo incrementado de autismo, y la presencia de un número creciente de Gs en los sitios indica un riesgo creciente de autismo.

Cualquier ser humano puede ser ensayado usando estas realizaciones, y estos procedimientos pueden ser usados también para determinar el riesgo potencial de autismo para la descendencia de dos individuos, en base al genotipo identificado de los padres en el polimorfismo relevante.

La invención no está limitada estrechamente a ningún procedimiento particular para la determinación del genotipo del individuo en los sitios de polimorfismo relevantes; la persona con conocimientos en la materia podría elegir y aplicar un procedimiento apropiado para cualquier aplicación particular, sin experimentación excesiva. En algunas realizaciones preferentes, el genotipo es determinado mediante polimorfismo de conformación de cadena única, cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento, ADN Invader y/o amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, seguido por secuenciación. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 1.

En estas realizaciones que emplean reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los cebadores preferentes para amplificar las regiones apropiadas comprenden la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6 (para amplificar la región relevante de rs2056202 [estos cebadores amplifican la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, dependiendo de la forma polimórfica presente] o la SEQ D NO: 7 y la SEQ ID NO: 8 (para amplificar la región relevante de rs2292813 [que amplifica SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4]).

La invención describe conjuntos de dos cebadores adecuados para su uso en una reacción en cadena de la polimerasa, útil para los procedimientos de determinación del riesgo de autismo de un individuo, tal como se ha descrito anteriormente. Los conjuntos de cebadores preferentes son SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; para amplificar la región relevante de rs2056202 y SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, para amplificar la región relevante de rs2292813. Sin embargo, otros cebadores cualesquiera que sean específicos para cualquiera de las regiones relevantes del gen SLC25A12 podrían ser usados también, y pueden ser diseñados sin experimentación excesiva.

En realizaciones adicionales, la invención describe kits que comprenden al menos un conjunto de cebadores adecuados para su uso en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El conjunto de cebadores en estos kits amplifica el sitio de polimorfismo rs2056202 o rs2292813, o ambos del gen SLC25A12. Consistente con la exposición anterior que describe los cebadores relevantes, los conjuntos de cebadores preferentes son SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, para amplificar la región relevante de rs2056202, y SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, para amplificar la región relevante de rs2292813. Sin embargo, podrían usarse también otros cebadores cualesquiera que sean específicos para cualquiera de las regiones relevantes del gen SLC25A12. Estos kits pueden comprender también instrucciones para usar el conjunto o los conjuntos de cebadores para evaluar el riesgo genético relativo de un individuo para el autismo, mediante la determinación del genotipo de los sitios polimórficos re2056202 y/o re2292813 del gen SLC25A12. Los kits pueden comprender también otros ingredientes tales, como tampones, enzimas y similares, para realizar una PCR y/o un análisis del producto o los productos de PCR.

La invención divulga además productos de PCR amplificados usando cualquiera de los conjuntos de cebadores descritos anteriormente. Los ejemplos no limitativos de estos productos de PCR incluyen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.

La invención describe además procedimientos de identificación de un polimorfismo genético que tiene un ligamiento con el autismo. Los procedimientos comprenden identificar un polimorfismo en el gen SLC25A12 y determinar si una forma del polimorfismo está o no presente en los individuos autistas más que otra forma. En estas realizaciones, la forma que está presente más frecuentemente en el autismo tiene ligamiento con el autismo. Los polimorfismos identificados mediante estos procedimientos pueden ser usados también para determinar el riesgo de autismo de un individuo. Ejemplos no limitativos de los procedimientos para conducir estos procedimientos se proporcionan en el Ejemplo 1. Los polimorfismos genéticos identificados mediante el procedimiento anterior, que están asociados con el autismo, pueden ser usados también para evaluar un individuo para el riesgo relativo de autismo.

Debido a que esta invención incluye el descubrimiento de que el gen SLC25A12 está asociado con el autismo, la persona con conocimientos en la materia entenderá que las células y los organismos multicelulares que comprenden el SLC25A12 humano son útiles para la investigación del autismo.

De esta manera, la presente invención divulga también células eucariotas que comprenden un gen SLC25A12 humano transgénico. En algunas realizaciones, estas células eucariotas son particularmente útiles cuando el gen SLC25A12 transgénico comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 4, ya que esas secuencias están dentro de los genes SLC25A12 asociados con el autismo.

En estas realizaciones, la célula es una célula de levadura, o una célula de mamífero, tal como una célula del cerebro. La célula puede estar también dentro de un mamífero vivo, tal como un mamífero transgénico, transfectado con el gen.

De esta manera, en realizaciones relacionadas, la invención divulga animales no humanos que comprenden las células eucariotas descritas anteriormente. Preferentemente, el animal no humano de estas realizaciones es un mamífero.

Debido a que es probable que el producto del gen SLC25A12 esté alterado en el autismo, un portador de aspartato/glutamato mitocondrial (AGC1) (véase Ejemplo 1), sería de esperar que los compuestos químicos que afectan al AGC1 afectasen al autismo.

De esta manera, la invención divulga también procedimientos para evaluar si un compuesto afecta o no al autismo. Los procedimientos comprenden poner en contacto el compuesto con cualquiera de las células eucariotas anteriores y determinar si el compuesto afecta o no a la expresión o a la actividad de un producto del gen SLC25A12. En estas realizaciones, un compuesto que afecta a la expresión o a la actividad del producto del gen SLC25A12 afecta al autismo. Los compuestos útiles para estas realizaciones, pueden ser una pequeña molécula orgánica o inorgánica o una macromolécula, tal como un anticuerpo, un aptámero, un ARNsi, un compuesto antisentido, etc.

Las realizaciones preferentes de la invención se describen en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1

Ligamiento y asociación del portador de aspartato/glutamato mitocrondrial AGC1/gen SLC25A12 con el autismo Resumen del ejemplo

Objetivo: El trastorno de autismo/autista (MIM Nº 209850) es un trastorno psiquiátrico complejo, principalmente genético. Los presentes inventores han mapeado, recientemente, un locus de susceptibilidad para el autismo en una región cromosómica 2q24-q33 (MIM Nº 606053). En el presente estudio, los presentes inventores han analizado genes a lo largo del intervalo 2q24-q33 para identificar un gen con susceptibilidad al autismo en esta región.

Procedimiento: El cribado de mutaciones de genes candidatos posicionales se realizó en dos etapas. La primera etapa implicó identificar variantes genéticas en exones y secuencia flanqueadora dentro de los genes candidatos, en sujetos no relacionados que mostraban ligamiento con 2q24-q33, y comparar la frecuencia de las variantes entre sujetos y controles. Dos polimorfismos de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphisms, SNPs), que mostraron evidencia para distribución divergente entre sujetos y controles, fueron identificados, ambos dentro de SLC25A12, un gen que codifica el portador de aspartato/glutamato mitocondrial (AGC1). En la segunda etapa, los dos SNPs en SLC25A12 fueron genotipados adicionalmente en 411 familias autistas, y se realizaron ensayos de ligamiento y asociación en las 197 familias informativas.

Resultados: Se observaron ligamiento y asociación entre trastorno autista y los dos SNPs, rs2056202 y rs2292813, encontrados en SLC25A12. Usando un solo afectado por familia, se encontró evidencia de exceso de transmisión mediante el ensayo de desequilibrio de transmisión (transmission disequilibrium test, TDT) para rs2056202 (\chi^{2}=10,83, df=1, P=0,001), rs2292813 (\chi^{2}=6,23, df=1, P=0,01), y un haplotipo de dos locus G*G (\chi^{2}=22,10, df=1, P=0,000003). El uso de múltiples individuos afectados por familia demostró evidencia de ligamiento mediante el TDT para rs2056202 (\chi^{2}=8,89, df=1, P=0,003) y rs2292813 (\chi^{2}=7,28, df=1, P=0,007), y para el haplotipo de dos locus (\chi^{2}=20,41, df=1, P=0,000006). La evidencia del ligamiento fue apoyada por un análisis de ligamiento con los dos SNPs, con una puntuación NPL multipunto máxima de 1,64 y una puntuación LOD de heterogeneidad multipunto máxima de 2,28.

Conclusiones: Los estudios de los presentes inventores demostraron una fuerte asociación de los SNPs dentro del gen SLC25A12 con el autismo.

Introducción

El propósito del presente estudio era identificar un gen con susceptibilidad al autismo en la región 2q31. Un cribado sistemático para variantes genéticas en individuos afectados identificó un ligamiento y una asociación entre el autismo y polimorfismos de un solo nucleótido en el gen SLC25A12.

Procedimientos

Sujetos: Un total de cuatrocientas once familias fueron reclutadas por el Centro Seaver de Investigación del Autismo (Seaver Autism Research Center, SARC) en Monte Sinai (n=40), co-reclutadas por SARC y el Intercambio de Investigación Genética del Autismo (Autism Genetic Research Exchange, AGRE) (18) (n=127), o reclutadas por el AGRE (n=244). Todos los padres firmaron un consentimiento informado y los individuos potencialmente afectados fueron evaluados mediante la Entrevista Revisada para el Diagnóstico del Autismo (Autism Diagnostic Interview-Revised, ADI-R) (19). Los individuos que cumplían los criterios ADI-R para el autismo (19) o autismo límite (borderline) (13) fueron definidos como afectados. Se han definido la cohorte (18) y las definiciones de diagnosis de investigación usadas en el presente estudio (13). La totalidad de la cohorte de 411 familias incluía muestras de sangre de más de 2000 individuos, incluyendo 720 individuos afectados (671 con autismo y 49 con autismo límite), y padres e hijos disponibles. Las 411 familias incluían 274 múltiplex (típicamente hijos-parejas afectados) y 137 familias trío. El ADN de las muestras de sangre o de células transformadas fue aislado, tal como se detalla en Buxbaum et al., 2001, o fue proporcionado por el depósito AGRE.

Cribado de mutaciones. Para investigar la implicación de los genes candidatos posicionales en el autismo, los presentes inventores realizaron un cribado de dos etapas.

En la primera etapa, el ADN exónico y flanqueador de 35-47 pacientes de 38 familias autistas con ligamiento con la región cromosómica 2q24-q33 fueron cribados para variantes genéticas mediante polimorfismos de conformación de cadena única (SSCP) y cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (HDPLC). La razón para este enfoque era encontrar variantes en individuos afectados, con ligamiento, en vez confiar en variantes en bases de datos públicas identificadas en individuos no afectados. Además, el enfoque era sobre una secuencia exónica y una secuencia intrónica adyacente a los exones, como las regiones más probables para presentar variantes funcionalmente importantes.

Los cebadores para amplificar los exones y las regiones flanqueadoras de los genes candidatos posicionales fueron diseñados usando el software primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) y están disponibles bajo solicitud. Los cebadores directo e inverso fueron seleccionados para producir amplicones de menos de 500 pb. Los exones más grandes, en particular los últimos exones de los genes, fueron divididos en varios amplicones, cada uno con un tamaño menor de 500 pares de bases. Los cebadores dentro de los intrones flanqueadores estaban situados a entre 26 y 186 pb de los exones. Se analizaron un total de 82 exones de 9 genes, usando 93 amplicones con un tamaño medio de aproximadamente 310 nucleótidos.

Para SSCP, los cebadores directos fueron marcados usando 100 \muCi[\gammaP32]-ATP y 10 unidades de polinucleótido quinasa T4, según el protocolo proporcionado por Invitrogen. La amplificación se realizó usando Ampli-Taq Gol Polimerasa (Applied Biosystems) en un volumen final de 10 \mul, que consistía en 10 ng de ADN genómico, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl, 100 \muM dNTPs, 10 \muM de cebador directo marcado radioactivamente y cebador inverso no marcado, y 0,5 unidades de Taq Polimerasa. A continuación, dos \mul de producto de PCR marcado radioactivamente fueron mezclados con 2 \mul de tampón de carga de azul de formamida, fueron desnaturalizados y separados en un gel MDE 0,5X no desnaturalizador (según el protocolo de BioWhittaker). Los SCCP fueron detectados mediante autorradiografía.

Para DHPLC, 8 \mul de producto de PCR fueron cribados en el Sistema de Análisis de Fragmentos de Ácidos Nucleicos WAVE (según los protocolos del fabricante). Los parámetros cromatográficos, las temperaturas de análisis apropiadas y la visualización de los dominios de fusión fueron determinados mediante el software WAVEMAKER. Las muestras usaban al menos dos temperaturas de fase móvil para maximizar las probabilidades de identificar polimorfismos.

Cualquier amplicón en el que se detectaron variantes mediante SSCP o DHPLC fue secuenciado, a continuación, mediante secuenciación fluorescente directa de productos de PCR purificados usando el kit v3.1 dideoxi-terminador BIG-DYE (Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN ABI3100 con Performance Optimized Polymer 6 (Applied Biosystems). A continuación, las variantes fueron genotipadas en 38 casos no relacionados y en 100 controles. Las frecuencias de alelos fueron comparadas para identificar variantes con frecuencias potencialmente alteradas (definidas como P=0,1) entre casos étnicamente coincidentes y los controles (para reducir las probabilidades de falsos positivos debido a una estratificación).

En la segunda etapa, las variantes con frecuencias que estaban potencialmente alteradas entre los casos y los controles fueron analizadas, a continuación, en la totalidad de la cohorte de más de 2000 individuos de las 411 familias autistas. El genotipado fue realizado usando el procedimiento ADN Invader biplex (Third Wave Technologies). El ensayo invasor está basado en la hibridación de una muestra de oligonucleótidos que coincide completamente con un ADN diana y la subsiguiente escisión de la estructura solapada mediante la Cleavase VIII, resultando en un producto específico de diana que es reconocido por un cartucho de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) (20). Las muestras de oligonucleótidos específicas correspondientes al tipo salvaje y a los SNPs mutados son asociadas a fluoróforos específicos, lo que permite una detección simultánea de ambas secuencias de ADN es un único pocillo. Para los estudios de los presentes inventores, alícuotas diluidas de los productos de PCR fueron combinadas con una solución mixta de Invader (Third Wave Technologies), y fueron incubadas en un lector de placas de fluorescencia (CytoFluor Serie 4000, PerSeptive Biosystems) usando los parámetros apropiados de excitación y emisión para cada fluoróforo.

Análisis estadístico. Se usaron ensayos chi-cuadrado de dos colas (\chi^{2}) para las comparaciones de las frecuencias alélicas y las distribuciones de genotipos entre los grupos de control y de autismo. Se realizó un ensayo de exactitud de Fischer cuando el número en un grupo era menor de cinco. Se examinó la distribución Hardy-Weinberg para cada polimorfismo identificado en los grupos de control y de autismo.

Los análisis estadísticos para los ensayos de desequilibrio en la transmisión (TDT) fueron computados con TDT-GENEHUNTER (GENEHUNTER versión 2.1, compilado para ejecutarse en entorno Unix de Mac OS X) y el programa S-TDT (2) (http://genomics.med.upenn.edu/spielman/TDT.htm). Se llevó a cabo un TDT de dos locus con TDT-GENEHUNTER, usando la opción TDT2 y los haplotipos fueron construidos mediante GENEHUNTER y fueron verificados manualmente para garantizar la estructura. Los haplotipos fueron determinados en base a los patrones de transmisión en familias en las que ambos padres fueron genotipados.

Para un análisis de ligamiento, los presentes inventores usaron GENEHUNTER PLUS (compilado para ejecutarse en entorno Unix de Mac OS X). Las puntuaciones de heterogeneidad LOD (HLOD) y ligamiento no paramétrico (nonparametric linkage, NPL) fueron calculadas para ambos análisis único y multipunto. Para HLOD, los datos fueron analizados bajo un modelo tanto dominante como recesivo, usando un 50% de penetración y un valor de 0,001 para la frecuencia de alelo enfermo. Dicho enfoque detecta un ligamiento bajo muchas condiciones diferentes, independientemente del patrón hereditario subyacente "real" (22, 23).

El desequilibrio de ligamiento (linkage disequilibrium, LD) se estimó usando un valor D' calculado con el programa 2LD (24).

Resultados

Los genes a lo largo de la región 2q31 fueron cribados para asociación en dos etapas, según se ha detallado en los Procedimientos. Los genes analizados incluían glutamato descarboxilasa 1 (GAD1) (en colaboración de los Drs. Shigeo Kure, Kiyoshi Kanno y Yoichi Matsubara), cuatro proteínas hipotéticas (FLJ13096, FLJ13984, LOC130672 y FLJ23462, identificada recientemente como citocromo duodenal b) (en colaboración con los Drs. Paolo Gasparini y Massimo Carella), histona acetilasa-1 (HAT-1) (en colaboración con el Dr. Salah Uddin Qureshi), la subunidad DNCl2 de dineína citoplásmica, el portador aspartato/glutamato SLC25A12, y la proteína homebox DLX2 (Figura 1C). Estos genes candidatos fueron elegidos en base a su posición en relación a los resultados de ligamiento positivos de tres estudios (13-15), su expresión en el tejido cerebral, y, en algunos casos, su función conocida, su novedad, o la existencia de genes relacionados dentro de la región del cromosoma 7, que muestran ligamiento con el autismo. Para este último criterio, los presentes inventores hacen notar que la región con ligamiento del cromosoma 7 contiene genes parálogos a DNCl2, SLC25A12, DLX1 y DLX2 (es decir, DNCl1, SLC25A13, DLX5 y
DLX6).

En la primera etapa, todos los exones conocidos (con secuencia intrónica flanqueadora) de estos genes fueron cribados mediante SSCP y DHPLC para variantes en 35 a 47 individuos no relacionados, elegidos de entre familias que mostraron ligamiento con D2S335, tal como se ha descrito en Procedimientos. En los nueve genes, se cribaron 82 exones y se identificaron 29 SNPs. A continuación las frecuencias de cada variante fueron evaluadas en los pacientes autistas (usando solo un individuo afectado por familia, n=38) y en 50 controles étnicamente coincidentes, después de confirmar que la distribución de las frecuencias de alelos estaban en equilibrio Hardy-Weinberg. Solo dos SNPs, ambos dentro del gen SLC25A12, mostraron diferencias considerables en las frecuencias de alelos entre los casos y los controles, usando ensayos basados en alelos (P<0,004) y basados en genotipo (P<0,03).

Dentro del gen SLC25A12, los presentes inventores identificaron un total de cinco variantes en el cribado de la primera etapa (incluyendo los dos criterios a cumplir para un estudio adicional, indicados anteriormente). La Figura 1C presenta las cinco variantes del gen SLC25A12 identificadas en 47 sujetos afectados con ligamiento con la región cromosómica 2q24-q33. Los dos polimorfismos que cumplen los criterios en la primera etapa, rs2056202 (I3-21A/G) y rs2292813 (I16+70A/G), son variantes G/A en la secuencia intrónica flanqueadora localizada 21 pb aguas arriba del exón 4 y 50 pb aguas abajo del exón 16, respectivamente. Dos variantes, C->T en el nucleótido 99 (rs1878583) y G->A en el nucleótido 1418, estaban dentro de las regiones codificantes. G1418A cambia la arginina 473 a glutamina, mientras que la variante C99T es silente. G1418A es un SNP nuevo, no informado en la base de datos dbSNPs NCBI, localizado en una región conservada en las especies mamíferas, pero el aminoácido glutamina se observa en ratones. La variante final aparece en la región 3' no traducida (UTR). Los presentes inventores no encontraron el SNP rs 1059299, informado en la base de datos pública, que cambia el aminoácido 600, en la muestra de los presentes
inventores.

Dada la evidencia de la asociación de rs2056202 y rs2292813 en un pequeño número de casos y controles, toda la muestra fue genotipada en estos SNPs para un análisis mediante el Ensayo de Desequilibrio en la Transmisión (TDT), que hace uso de controles basados en familias. De las 411 familias estudiadas, 197 tenían al menos un padre heterocigótico para al menos un SNP. Estas familias incluían 140 familias multiplex y 57 familias con un afectado. Para ensayar para la asociación mediante la TDT, se analizó la transmisión de padres heterocigóticos a un niño afectado (Tabla 1). El análisis TDT demostró una asociación para rs2056202 (\chi^{2}=10,83, df=1, P=0,001) y para rs2292813 (\chi^{2}=6,23, df=1, P=0,01). En ambos casos, el alelo G pareció ser el alelo con riesgo (o el alelo A pareció ser el alelo protector) (por simplicidad, las Tablas 1 y 2 muestran datos de transmisión solo para el alelo G, para ambos
SNPs).

1

Se realizó también un análisis TDT usando múltiples individuos afectados por familia (Tabla 2). Dicho análisis es, más propiamente, una medida del ligamiento en vez de la asociación. Se observó un desequilibrio en la transmisión tanto para rs2056202 (\chi^{2}=8,89, df=1, P=0,003) como para rs2292813 (\chi^{2}=7,28, df=1, P=0,007).

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TABLA 2 TDT con todos afectados por familia

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Observando los haplotipos, había una transmisión incrementada del haplotipo G*G es el autismo cuando se analizó un afectado por familia (\chi^{2}=22,10, df=1, P=0,000003) o todos afectados (\chi^{2}=20,41, df=1, P=0,0000006). Usando un análisis global, un TDT de dos locus mostró un desequilibrio de transmisión de los cuatro haplotipos observados tanto para un afectado por familia (\chi^{2}=32,31, df=3, P=5X10^{-7}) como para todos afectados (\chi^{2}=28,76, df=3,
P=0,000003).

Un análisis de ligamiento de dos puntos usando análisis de puntuación LOD no paramétrico (NPL), indicó cierta evidencia de ligamiento entre autismo y rs2056202 (NPL=1,26, P=0,07) o rs2292813 (NPL=1,1, P=0,09) (Tabla 3). Un LOD de heterogeneidad (HLOD) de dos puntos apoyó este ligamiento, con puntuaciones HLOD máximas de 2,11 (P=0,03) y 1,15 (P=0,1) para rs2056202 y rs2292813, respectivamente. Sin embargo, la información era poca en estos SNPs (estimada como 0,23 y 0,34 para rs2056202 y rs2292813, respectivamente). Para incrementar la información, los presentes inventores usaron un análisis de ligamiento multipunto con estos dos SNPs. Bajo estas condiciones, se observaron puntuaciones NPL multipunto máximas de 1,57 y puntuaciones HLOD multipunto máximas de 2.11 (la información se incrementó a aproximadamente 0,51). Los dos marcadores mostraron un desequilibrio de ligamiento entre unos y otros, tal como se determina analizando el desequilibrio de ligamiento en pacientes no relacionados (D'=0.79, SD=0.06).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3 Análisis de ligamiento de SNPs en SLC25A12

3

Se estimó también un riesgo genotípico relativo para individuos que presentaban una o dos copias de los alelos de riesgo (los alelos G en ambos casos) para cualquiera de rs2056202 o rs2292813. Los resultados se proporcionan en la Fig. 2. Estos resultados muestran que el riesgo relativo se incrementa con alelos G crecientes en cualquiera de los sitios polimórficos. También debe notarse que las estimaciones de riesgo genotípico relativo en estudios TDT, tales como éste, subestiman el riesgo genotípico relativo real. Véase Risch, Theoret. Pop. Biol. 60, 215-220 (2001). Por lo tanto, el riesgo de autismo real para los genotipos indicados en la Fig. 2 es probable que sea considerablemente mayor que el indicado.

Discusión

El objetivo del presente trabajo era identificar un gen de susceptibilidad para el autismo en la región cromosómica 2q24-q33. Los presentes inventores identificaron dos SNPs, rs2056202 y rs2292813, en SLC25A12, que demostraron una asociación con el autismo usando el TDT. La transmisión preferente del alelo G para ambos SNPs se encontró en 197 familias informativas. Además, se encontró un ligamiento entre autismo y los SNPs mediante TDT y mediante análisis paramétricos y no paramétricos.

El gen SLC25A12 contiene 18 exones esparcidos sobre aproximadamente 110 kilobases (kb) y es expresado principalmente como especies de ARNm de 2,9 y 3,2 kb, predominantemente en músculo esquelético, corazón y cerebro (25). El ADNc de SLC25A12 tiene un marco de lectura abierto de 2037 pb que codifica una proteína de 678 aminoácidos, que es un portador de aspartato/glutamato (AGC 1) mitrocondrial dependiente de calcio. La localización subcelular de la proteína es exclusivamente mitrocondrial. La mitad amino-terminal de AGC1 contiene cinco manos EF putativas con capacidad de unión a Ca2+, mientras que la mitad carboxi-terminal presenta la función intercambiador de aspartato/glutamato. AGC1 está críticamente implicada en la actividad de la lanzadera de malato/aspartato NADH, catalizando el intercambio electrogénico de aspartato para glutamato y un protón, así como en el ciclo de urea (26). Recientemente, se ha mostrado que el gen SLC25A12, así como AGC1, es la única forma de portador de aspartato/glutamato mitocondrial expresada en neuronas y células madre neuronales (27). Los niveles de proteínas se incrementaron durante la diferenciación neuronal y están correlacionados con un incremento en la actividad lanzadera de malato/aspartato NADH.

El ARNm de SLC25A12 y la proteína AGC1 se expresan ampliamente en ratones CNS adultos, particularmente en los núcleos neuronales en el tallo cerebral (27). Se ha sugerido que los enriquecimientos de AGC1 en neuronas específicas podría reflejar una actividad tónica de estas neuronas. La disfunción de esta proteína, o la expresión alterada de esta proteína, puede conducir a una alteración en la función mitocondrial y en la síntesis de ATP. Debido a que las neuronas son importantes usuarios de energía, incluso cambios modestos en la función mitocondrial y en la síntesis de ATP pueden conducir a cambios selectivos en las neuronas. El apoyo para un papel para la disfunción mitocondrial en el autismo viene de un estudio reciente que demuestra hiperproliferación mitocondrial y bloqueo parcial de cadena respiratoria en dos pacientes con autismo y una duplicación 15q invertida (28).

Tal como se ha indicado anteriormente, se ha mostrado en múltiples estudios (29) que una región del cromosoma 7 tiene ligamiento con el autismo. Es interesante que un parálogo de SLC25A12, concretamente SLC25A13 (CITRIC1 o AGC2), esté localizado en esta región del cromosoma 7. Estos dos genes comparten aproximadamente una identidad del 97%, codificando ambos formas de portadores de aspartato/glutamato, con identidades del 71% en los dominios mano-EF y del 84% dentro del dominio intercambiador. Las mutaciones en el gen SLC25A13 confieren citrulinemia de tipo II de aparición adulta (CTLN2, MIM Nº 603471), una enfermedad recesiva autosómica causada por una deficiencia de argino-succinato sintetasa con características clínicas que incluyen enuresis, diarrea, temblores, letargo, retraso mental y trastornos psiquiátricos. Aunque se requiere una confirmación de la asociación entre autismo y SC25A12, es tentador especular que SLC25A13 podría ser un gen de susceptibilidad al autismo en el cromosoma
7.

Para ambos SNPs, el alelo asociado con el autismo corresponde a un alelo común. Debe considerarse que en trastornos complejos con múltiples genes interactuando, la prevalencia de los alelos de susceptibilidad puede ser bastante alta. Ejemplos recientes de esto incluyen el alelo e4 de la apoliproteína E en la enfermedad de Alzheimer, cambios en el gen NOD-2 en la enfermedad de Crohn, y cambios en el gen capaína-10 en diabetes mellitus de tipo 2 (30-32). En el caso del autismo, con la evidencia más fuerte de numerosos genes interactuando, se esperaría que las variantes de susceptibilidad para al menos algunos sitios fuese bastante común, y podría incluso contribuir a la variabilidad en el comportamiento de individuos sanos. Sin embargo, en cualquiera de estos estudios, el locus de susceptibilidad real o el polimorfismo funcional puede que no se haya identificado, sino que, por el contrario, están en desequilibrio de ligamiento con las variantes estudiadas. El locus de susceptibilidad real puede estar incluso en genes vecinos. Los presentes inventores, en sus estudios, han examinado ambos genes flanqueadores. Para HAT1, los presentes inventores no encontraron ningún polimorfismo útil. Para DNCl2, los presentes inventores encontraron 8 polimorfismos que eran negativos respecto a asociación en los análisis de la primera
etapa.

Los presentes inventores, en sus estudios, identificaron polimorfismos intrónicos asociados con la enfermedad. La relevancia funcional de dichas variantes permanece oscura en la mayoría de los estudios. Sin embargo, cada vez más es más obvio que la expresión de un considerable número de genes es regulada por elementos que actúan en cis y que la variación heredada en la expresión génica puede contribuir a la enfermedad (33, 34). La regulación de la expresión génica afectaría a la función celular, sin requerir una modificación en la secuencia de código, si los niveles del producto génico fueran limitativos. Se ha demostrado recientemente que una sobre-expresión de AGC1 puede conducir a una producción incrementada de ATP mitocondrial (35), de manera que se predice que las variaciones genéticas que cambian la expresión de AGC1 afectarían a la producción de ATP. Necesita determinarse si los polimorfismos identificados por los presentes inventores (o polimorfismos adicionales en desequilibrio de ligamiento con el polimorfismo identificado por los presentes inventores) afectan a la expresión génica.

Con todos los estudios de asociación, especialmente en trastornos complejos que se cree que son debidos a la interacción de múltiples genes de efecto débil, los presentes inventores deben esperar a la replicación en muestras independientes antes de que los resultados puedan ser aceptados. Sin embargo, dada la evidencia del estudio de los presentes inventores, sería poco realista esperar que el descubrimiento sea replicado con facilidad mediante TDT en una muestra típica inferior a 200 tríos. El TDT permite un análisis estadístico robusto sin sesgo de una mezcla de poblaciones. Sin embargo, carece de potencia, especialmente en sitios tales como el de los presentes inventores, donde muchos de los padres eran homocigóticos en los dos sitios. Un estudio de control de casos diseñado cuidadosamente, con controles cumplidos para etnicidad, género y edad, puede tener más potencia para detectar una asociación de estos dos sitios. Como alternativa, sería deseable el genotipado de varios cientos de tríos para TDT, para un estudio de replicación.

Suponiendo que los resultados de los presentes inventores reflejan una asociación real de SLC25A12 con el autismo, los datos indican un riesgo genotípico relativo para los dos sitios de entre 2 y 5 (Fig. 2). Esto, aunque considerable, debe tomarse en el contexto de la observación de que las variantes de susceptibilidad (o las variantes en desequilibrio de ligamiento con las variantes de susceptibilidad real) son alelos comunes. Esto es consistente con la idea de que este locus juega un papel importante en la epidemiología del trastorno, pero no sería inmediatamente útil para asesoramiento genético, hasta que pueda ser considerado conjuntamente con sitios adicionales.

Para investigar adicionalmente el locus SLC25A12 como un gen de susceptibilidad para el autismo, los presentes inventores están investigando, en la actualidad, para marcadores genéticos adicionales en la región de 110 kb que contiene este gen, usando tanto bases de datos existentes como secuenciando en pacientes que están siendo estudiados, particularmente regiones no codificadoras conservadas. Hasta la fecha, más de 90 SNPs, que comprenden el gen SLC25A12, han sido identificados en las bases de datos públicas, presentando al menos 20 SNPs una tasa de heterocigosidad superior a 0,1. Ninguno de estos aparece en regiones no codificadoras conservadas. Los presentes inventores están realizando también estudios de expresión de AGC1.

Ejemplo 2

Asociación adicional de AGC1/SLC25A12 con el autismo

En el Ejemplo 1, los presentes inventores informaron acerca del ligamiento y asociación entre el autismo y la presencia de dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), ambos dentro del mismo gen, SLC25A12/AGC1, un intercambiador de aspartato/glutamato. Los presentes inventores han cribado 12 SNPs adicionales, cubriendo la totalidad de los 110 kbps del gen SLC25A12/AGC1, en 360 familias. Todos estos SNPs presentan valores p significativos para análisis de puntuación lod multipunto, no paramétricos. Esta observación confirma el ligamiento entre el autismo y el gen SLC25A12/AGC1. En esta muestra, tal como se ha informado anteriormente, los ensayos de asociación (GH-TDT: Ensayo de Desequilibrio de Transmisión mediante Genehunter para todos afectados, y Transmisión para todos afectados o un afectado aleatorio) son positivos para rs2292813 (GH-TDT: Chi2=4,79, p=0,03; Transmisión-todos: Chi2=4,27, p=0,04) y rs2056202 (GH-TDT: Chi2=8,5, p=0,004; Transmisión-todos: Chi2=8,73, p=0,003; Transmisión uno: Chi2=7,16, p=0,014; TDT-Transmisión uno: Chi2=7,29, p=0,01).

En los SNPs adicionales cribados, los presentes inventores observaron también una asociación entre el autismo y hCV1735157 (Transmisión uno: Chi2=5,3, p=0,018; TDT-Transmisión uno: Chi2=5,43, p=0,02).

Las combinaciones de dos SNPs, o haplotipos, proporcionan también asociaciones positivas. Los presentes inventores han notado que un haplotipo G*rs2292813-T*hCV1735157 está asociado en las familias (1). De manera similar, los haplotipos de dos locus eran positivos para T*rs925881-G*rs2056202 (2) y G*rs2056202-C*rs1996425 (3). Los valores p positivos para los ensayos globales apoyan fuertemente una asociación entre el autismo y varios
haplotipos.

En conclusión, entre los 12 SNPs adicionales genotipados en 360 familias, los presentes inventores tienen evidencias, además de rs2292813 y rs2056202, de ligamiento y asociaciones entre el autismo y hCV1735157, rs925881 y rs1996425, que son todos SNPs en el gen SLC25A12/AGC1.

(1): GH-TDT: Transmitido=95, No Transmitido=69, Chi2=4,12, p=0,04; Ensayo global para todos los haplotipos: Chi2=8,81, p=0,032.

(2): GH-TDT: Transmitido=142, No Transmitido=101, Chi2=6,92, p=0,009; Ensayo global para todos los haplotipos: Chi2=16,01, p=0,001; Transmisión-todos: Chi2=4,04, p=0,044.

(3): GH-TDT: Transmitido=139, No Transmitido=100, Chi2=6,36, p=0.01; Ensayo global para todos los haplotipos: Chi2=16,19, p=0.001; Transmisión-todos: Chi2=4,23, p=0,04; TDT-Transmisión uno: Ensayo global para todos los haplotipos: Chi2=8,4, p=0,038.

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La discusión de las referencias en la presente memoria pretende solamente resumir las afirmaciones realizadas por los presentes autores y no se admite que ninguna de las referencias constituya una técnica anterior. Los solicitantes se reservan el derecho a rebatir la exactitud y la pertinencia de las referencias citadas.

Apéndice - SEQ ID Nos

SEQ ID NO: 1 región alrededor de rs2056262 que es amplificada con la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, con forma A; la A en el sitio polimórfico está subrayada.

4

SEQ ID NO: 2 región alrededor de rs2056262 que es amplificada con la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 6, con forma G; la G en el sitio polimórfico está subrayada

5

SEQ ID NO: 3 región alrededor de rs2292813 que es amplificada con la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, con forma A; la A en el sitio polimórfico está subrayada

6

SEQ ID NO: 4 región alrededor de rs2292813 que es amplificada con la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, con forma G; la G en el sitio polimórfico está subrayada

7

SEQ ID NO: 5 cebador directo para amplificar rs2056202

GTTACCCTGAGCTACAGTT

SEQ ID NO: 6 cebador inverso para amplificar rs2056202

TCAGATCCCAAATAAGCAG

SEQ ID NO: 7 cebador directo para amplificar rs2292813

CCGCTCAAGTGGTTGAAGTT

SEQ ID NO: 8 cebador inverso para amplificar rs2292813

GCATTGGTCTTAAAGGTTCTGTCT.

Claims

1. Procedimiento de evaluación de un individuo para el riesgo genético relativo de autismo, comprendiendo el procedimiento determinar el genotipo del individuo en los sitios de polimorfismo rs2056202 y/o rs2292813 del gen SLC25A12, en el que la presencia de G en cualquiera de los dos sitios indica un riesgo incrementado de autismo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el genotipo es determinado mediante uno o más procedimientos seleccionados entre el grupo constituido por polimorfismo de conformación de cadena única, cromatografía líquida desnaturalizadora de alto rendimiento, ADN Invader y amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, seguido por secuenciación.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, que usa una amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa, comprendiendo al menos un cebador una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.