ES2355332T3 - Virus de la influencia canina y composiciones relacionadas y métodos de uso. - Google Patents

Abstract

Un virus de la influenza canina aislado del subtipo H3N8 depositado con la American Type Culture Collection como Depósito de Patente No. PTA-7694.

Description

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con los campos de virología, biología molecular, e inmunología. En particular, la presente invención se relaciona con virus de la influenza canina, así como también con composiciones 5 relacionadas y métodos de uso en la inducción de una respuesta inmune en animales.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

El virus de la influenza es un virus de ARN que pertenece a la familia Orthomyxoviridae. El ARN vírico consiste de ocho segmentos independientes, que se recombina fácilmente entre los virus de la para producir nuevos subtipos.

La nucleoproteína (NP), que es el componente primario del nucleocápside, se codifica en el quinto segmento. 10 La NP y la proteína de matriz se utilizan para clasificar el virus de la influenza en el grupo A, B o C. Debido a que la NP es una proteína interna, ésta no se somete a la presión de la selección mediante un sistema inmune del anfitrión. Ésta une el ARN, es parte del complejo de transcriptasa, y se involucra en el transporte citoplasmático nuclear del ARN vírico (vARN).

La neuraminidasa (NM), que divide el enlace α-ceto que une un ácido siálico terminal y el siguiente residuo de 15 azúcar, permite por lo tanto la liberación de la progenie vírica de las células infectadas, se codifica mediante el sexto segmento. Se han identificado los nueve subtipos (N1- N9) de esa enzima. Todos los subtipos tienen dos regiones estructurales – un tallo y una cabeza. Todas las proteínas N8 tienen 470 aminoácidos, los primeros ocho de los cuales se conservan altamente. La siguiente región es rica en aminoácidos hidrófobos y se considera que es el dominio de transmembrana. Los siguientes 51 aminoácidos conforman la región del tallo, y la región de cabeza inicia en Cys91. La 20 última región contiene el sitio catalítico de la enzima. Los residuos de cisteína en la región de cabeza y tallo tienden a ser altamente conservados. Existen 6 a 8 sitios de N-glucosilación putativos.

La hemaglutinina (HA), que es una glucoproteína de membrana responsable de la adsorción del virus en la célula anfitriona, es el principal antígeno al que se dirigen los anticuerpos neutralizantes. Su variación antigénica es la principal causa de las epidemias de la influenza. Esta se codifica por el cuarto segmento. Se han identificado dieciséis 25 subtipos diferentes (H1-H16). La HA tiene un péptido de señal de 16 aminoácidos y dos polipéptidos (HA1 y HA2) unidos mediante puentes de disulfuro. La HA1 tiene el extremo terminal amino, mientras que la HA2 tiene el extremo terminal carboxilo. Una región hidrófoba en HA2 sujeta HA a la membrana vírica. Los residuos de cisteína tienden a ser altamente conservados. Hay seis sitios de glucosilación putativos, que permiten que el virus enmascare sus sitios antigénicos (Skehel et al., PNAS USA 81: 1779 (1984)). 30

Otras proteínas incluyen proteínas de matriz (M o M1 y M2), proteínas no estructurales (NS o NS1 y NS2), PA. PB1, y PB2. La proteína M1 es un componente principal del virión que une a la membrana de plasma de las células infectadas por medio de dos regiones hidrófobas en el terminal N de la proteína, mientras que la M2 es un canal de ión y, por lo tanto, una proteína de membrana integral. La proteína NS1 se encuentra en el núcleo y afecta el transporte de ARN celular, la división, y la traducción. La proteína NS2 se encuentra en el núcleo y el citoplasma y tiene una función 35 no conocida. La proteína PA es una transcriptasa y puede tener actividad de proteasa, mientras que la proteína PB1 funciona en la elongación transcripción y la proteína PB2 funciona en la unión de tapa de transcripción.

Globalmente, la influenza es la enfermedad respiratoria económicamente más significativa en humanos, cerdos, caballos y aves de corral (Wright et al., Orthomyxoviruses. In: Fields Virology. Knipe et al., eds. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001. pp. 1533-1579.). El virus de la influenza es conocido por sus continuos cambios 40 genéticos y antigénicos, que impiden el control efectivo del virus (Wright et al. (2001), supra; Webster et al., Microbiol. Rev. 56:152-179 (1992)). De particular preocupación para la prevención de epidemias y pandemias es la emergencia de un nuevo subtipo del virus mediante re-clasificación genética o transmisión inter-especies (Wright et al. (2001), supra) .

Recientemente, han ocurrido brotes epidémicos de influenza en especies, por ejemplo, felina y canina, que históricamente no tienen el virus de la influenza (Keawcharoen et al., Emerg. Infect. Dis. 10: 2189-2191 (2004); Crawford 45 et al.. Science 310:398-485 (Octubre 21, 2005; publicado en línea en septiembre 29, 2005); Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Greensboro, NC, Octubre 2005. p. 158; and Yoon et al., Emerg. Infect. Dis. 11 (12): 1974-1976 (diciembre 2005)). Por lo tanto, el se expande el rango de anfitrión del virus de la influenza. CRAWFORD P. C. ET AL describe la transmisión del virus de la influenza Equino a perros 50 (SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 310, no. 5747, 21 Octubre 2005 (2005-10-21), páginas 482-485). En la base de datos del EMBL se puede encontrar la secuencia de un virus de Influenza A (A/canina/Texas/1/2004(H3N8)) presentado por CRAWFORD, P.C. ET AL. Que tiene un número de acceso de Base de datos DQ124159.

Han ocurrido brotes epidémicos de la enfermedad respiratoria en galgos de carrera originados por la infección 55 con el virus de la influenza en Florida en el 2004, en el este y el oeste de Iowa en Abril 2005, y en Texas en el 2005. La enfermedad se caracteriza por la aparición rápida de fiebre y tos, respiración rápida, y secreción nasal hemorrágica. La

morbilidad fue casi del 100% en ambos compuestos en el canódromo en Iowa, aunque la mortalidad fue menor del 5%. Aunque se recuperó un gran porcentaje de perros afectados, muchos sucumbieron a neumonía hemorrágica. La administración terapéutica de antibióticos de amplio espectro reduce la severidad de la enfermedad pero no pueden controlarla.

En vista de lo anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar el virus de la influenza que infecta los 5 caninos. Es otro objeto de la presente invención proporcionar materiales y métodos para inducir una respuesta inmune al virus de la influenza en caninos. Estos y otros objetos y ventajas, así como también características inventivas adicionales, serán evidentes a partir de la descripción detallada proporcionada aquí.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención se relaciona con un virus, composición, y use de la misma como se define en las reivindicaciones 10 adjuntas. Se describe un virus de la influenza canina aislado del subtipo H3N8 que comprende una HA que tiene la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 4, con la condición que los aminoácidos en las posiciones 94 y 233 son idénticos a la SEQ ID NO: 4. En particular, la presente invención proporciona un virus de la influenza canina aislado del subtipo H3N8 depositado con the American Type Culture Collection (Manassas, VA) en junio del 29, 2006, como Depósito de Patente No. PTA-7694 De acuerdo con lo anterior, 15 la presente invención también proporciona una composición que comprende virus atenuados así como también una composición que comprende virus inactivos.

Se describen proteínas aisladas o purificadas. Se describe una HA aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 o (ii) se deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 4, con la condición que la secuencia de aminoácido es 20 idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de aminoácido 94 y 233, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 94 o 233 de la SEQ ID NO: 4.

Se describe una NM aislada o purificada, que (i) comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o (ii) se deriva de un virus de la influenza y que comprende una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a 25 la SEQ ID NO: 2, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 2 en las posiciones de aminoácido 68 y 134, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 68 o 134 de la SEQ ID NO: 2.

Se describe una NP aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 6 o (ii) se 30 deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 6, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 6 en la posición de aminoácido 402, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 402 de la SEQ ID NO: 6.

Se describe una M1 aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8 o (ii) se 35 deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 8, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 8 en la posición de aminoácido 111, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 111 de la SEQ ID NO: 8.

También se proporciona una NS1 aislada o purificada, que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 40 10.

Se proporciona adicionalmente una proteína PA aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 o (ii) se deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 98% (o 99%) idéntica a la SEQ IQ NO: 12, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 12 en las posiciones de aminoácido 233, 256, 327, y 561, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el 45 fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 233, 256, 327, y 561, de la SEQ ID NO: 12.

Todavía se proporciona adicionalmente una PB1 aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 14 o (ii) se deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 14, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ 50 ID NO: 14 en las posiciones de aminoácido 200 y 213, o un fragmento de (i) o (ii), en donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 200 o 213 de la SEQ ID NO: 14.

Aún todavía se proporciona adicionalmente una PB2 aislada o purificada, que (i) tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 16 o (ii) se deriva de un virus de la influenza y que tiene una secuencia de aminoácido 55 que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 16, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 16 en las posiciones de aminoácido 107, 221, 292, y 661, o un fragmento de (i) o (ii), en

donde el fragmento comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 107, 221, 292, o 661 de la SEQ ID NO: 16.

Se describe una composición que comprende una proteína descrita anteriormente, tal como HA o NM, o un fragmento de la misma en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en un animal y un portador biológicamente aceptable. 5

Se describe a método para inducir una respuesta inmune al virus de la influenza canina en un animal. El método comprende administrar al animal la composición que comprende una proteína o fragmento de la misma.

También se proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que codifica la proteína mencionada anteriormente o un fragmento de la misma, opcionalmente como parte de un vector, ya que es una composición que comprende el ácido nucleico aislado o purificado, que expresa la proteína, tal como HA o NM, o un fragmento de la 10 misma, en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en un animal y un portador biológicamente aceptable.

Se describe otro método para inducir una respuesta inmune al virus de la influenza canina en un animal. El método comprende administrar al animal la composición que comprende un ácido nucleico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS 15

La Figura 1 es la secuencia de nucleótido parcial (SEQ ID NO: 1; ver también GenBank Acc. No. DQ146420) de la secuencia de dominio codificante (CDS) del gen NM del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina. De acuerdo con la convención, la secuencia se presenta de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.

La Figura 2 es la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 2; ver también GenBank Acc. No. DQ146420) codificada por la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con la convención la secuencia está presente en formato de una sola letra 20 de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.

La Figura 3 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 3; ver también GenBank Acc. No. DQ146419) de la CDS del gen de HA del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

La Figura 4 es la secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 4; ver también GenBank Acc. No. DQ146419) codificada por la SEQ ID NO: 3. 25

La Figura 5 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 5) de la CDS del gen de NP del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

La Figura 6 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 6) codificada por la SEQ ID NO: 5.

La Figura 7 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 7) de la CDS del gen de proteína M1 del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina. 30

La Figura 8 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 8) codificada por la SEQ ID NO: 7.

La Figura 9 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 9) de la CDS del gen de proteína NS1 del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

La Figura 10 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 10) codificada por la SEQ ID NO: 9.

La Figura 11 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 11) de la CDS del gen de proteína PA del 35 subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

La Figura 12 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 12) codificada por la SEQ ID NO: 11.

La Figura 13 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 13) de la CDS del gen de proteína PB1 del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

Fig.14 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 14) codificada por la SEQ ID NO: 13. 40

La Figura 15 es la secuencia de nucleótido completa (SEQ ID NO: 15) de la CDS del gen de proteína PB2 del subtipo H3N8 del virus de la influenza canina.

La Figura 16 es la secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO: 16) codificada por la SEQ ID NO: 15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento de una cepa del virus de la influenza en caninos. La cepa 45 se aísla de galgos de carrera en el este y oeste de Iowa. Se ha clasificado la cepa como un subtipo H3N8, y se ha designado A/canine/Iowa/13628/2005. Se describe un virus que comprende una HA que tiene la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 4, con la condición que los aminoácidos en las posiciones 94 y 233 son idénticos a la SEQ ID NO: 4. El virus puede comprender adicionalmente una NM que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% 50

idéntica a la SEQ ID NO: 2, con la condición que los aminoácidos en las posiciones 68 y 134 son idénticos a la SEQ ID NO: 2. El virus que comprende la HA anteriormente mencionada, sola o en combinación adicional con la NM anteriormente mencionada, puede comprender adicionalmente por lo menos uno de los siguientes: una NP que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 6 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 6, con la condición que el aminoácido 402 es idéntico a aquel de la SEQ ID NO: 6; una M1 que tiene la 5 secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 8, con la condición que el aminoácido 111 es idéntico a aquel de la SEQ ID NO: 8; una NS1 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 10; una proteína PA que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 98% (o 99%) idéntica a la SEQ ID NO: 12, con la condición que los aminoácidos 233, 256, 327, y 561 son idénticos a la SEQ ID NO: 12; una PB1 que tiene la secuencia de 10 aminoácido de la SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 14, con la condición que los aminoácidos 200 y 213 son idénticos a la SEQ ID NO: 14; y/o una PB2 que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 16, con la condición que los aminoácidos 107, 221, 292, y 661 son idénticos a la SEQ ID NO: 16. La presente invención proporciona específicamente el virus de la influenza canina aislado del subtipo H3N8 depositado con the American Type 15 Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, U.S.A., en junio del 29, 2006, como Depósito de Patente No. PTA-7694.

Se puede precipitar el virus de la influenza al someter el virus en medio acuoso a una o más etapas de insolubilización provocadas por la presencia de hasta 5% en peso de polietilenglicol (PEG) que tiene un peso molecular entre 3,000 y 20,000 u otro polímero no cargado filamentoso lineal en una cantidad equivalente a la potencia de 20 solubilización del PEG, que separa una fracción insolubilizada de una fracción no insolubilizada, y que recupera el virus de una de las fracciones (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 3,989,818). Preferiblemente, la temperatura no excede 35° C, el pH está entre 6 y 9, y la resistencia iónica del medio acuoso está por debajo del punto de precipitación por sales para el virus. La concentración del virus en el medio acuoso antes de insolubilización corresponde a un título de hemaglutinación de por lo menos 1 en 32. Se obtienen partículas víricas agregadas, que se considera proporcionan 25 un mejor efecto antigénico debido a la liberación lenta de las partículas víricas después de vacunación. Si, sin embargo, se desean partículas no agregadas o menos agregadas, se pueden disociar utilizando cualquier método adecuado, tal como sonicación.

Se puede atenuar el virus al pasar en un sistema celular hasta que el virus pierda su capacidad de producir enfermedad, aunque retiene completamente su carácter inmunogénico. Por ejemplo, el virus se puede pasar en serie en 30 un cultivo de células que se originan de una especie canina a otras especies adecuadas a una temperatura de aproximadamente 37 ° C. En cada pasaje, se cosecha el virus a partir de un cultivo y se inocula en un medio que contiene un cultivo celular fresco de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede recolectar el virus de fluidos de cultivos celulares de tejido y/o células. Opcionalmente, durante la cosecha, se puede sonicar el cultivo celular para promover la liberación del virus. Ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,698,433 y 35 6,455,298.

Si se desea, se puede pasar una cepa de influenza por lo menos una vez en la cavidad alantoidea de huevos embriónicos, tales como huevos de pollo, en la presencia de suero, para obtener virus resistente a suero (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 3,953,592; Kilbourne et al., J.Exp. Med. 111: 387 (1960); Kilbourne, Science 160: 74-75 (Abril 1968); y Laver et al., Virology 30: 493-501 (1966)). Se puede lograr la vacuna de influenza de alta potencia 40 con baja pirogenicidad y baja endotoxicidad al tratar el fluido alantoideo concentrado que contiene un virus atenuado secuencialmente con acetato de butilo y acetato de etilo, seguido por evaporación flash (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,000,257). Tal virus se puede administrar intranasalmente como una vacuna.

Una vez inoculado en el anfitrión, el virus se multiplica en cierta medida de tal manera que solo se requiere un pequeño inóculo inicial. El virus debe ser inocuo, y la infección de contactos susceptibles se debe mantener al mínimo. 45

Alternativamente, se puede inactivar el virus al suprimir la replicación y virulencia. Esto se puede hacer mediante medios químicos o físicos. Se puede llevar a cabo la inactivación química mediante el tratamiento del virus con una enzima, formaldehído, β-propiolactona o derivado de los mismos, etileneimina o derivado de la misma, un disolvente orgánico (por ejemplo, hidrocarburo halogenado), y/o un detergente (por ejemplo, Tween®, Triton X®, desoxicolato de sodio, sulfobetaína, o sales de cetiltrimetilamonio). Si es necesario, se pueden neutralizar las 50 composiciones químicamente activas. Por ejemplo, si se utiliza el formaldehído para desactivar la composición, se puede neutralizar la composición con tio sulfato. Si se requiere, el pH posteriormente se puede devolver a un valor de aproximadamente 7. Alternativamente, se puede extraer el virus con una mezcla de éter y etanol, se pueden separar las fases acuosas y orgánicas, y se puede remover el éter residual a partir de la suspensión vírica bajo presión reducida (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,431,633). Se puede llevar a cabo de forma ventajosa la inactivación 55 física al someter el virus a radiación rica en energía, tal como luz ultravioleta, radiación γ, o rayos X. Las formas inactivas requieren una cantidad relativamente alta de inóculo y, por lo tanto, una cantidad proporcionalmente grande de material antigénico, que tiene que ser fabricado, probado y distribuido.

En vista de lo anterior, la presente invención también proporciona una composición que comprende un virus atenuado o inactivo. El virus debe estar presente en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune y, de 60 forma deseable, puede proporcionar protección luego de exposición. De forma general, un adyuvante, tal como Tween®, Span®, adyuvante completo de Freund, saponina, Corynebacterium parvum (Copamax®), fosfato de aluminio,

hidróxido de aluminio, o una mezcla de estos, se agrega a la composición, particularmente si la composición comprende virus inactivos. Se pueden agregar los hidrolisatos de proteína y/o aminoácidos para estabilizar la composición (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,537,769). Alternativamente, la composición se puede formular como una emulsión aceite en agua utilizando aceites tales como Marcol y/o Arlacel.

También se pueden preparar cepas de influenza recombinantes, tales como de la combinación de una cepa 5 progenitora de influenza A “sobre atenuada” (es decir, el número de pasajes para atenuación es sustancialmente mayor que la que se requiere normalmente para remover la patogenicidad) , por ejemplo, A2, con una cepa de influenza virulenta como se proporciona aquí (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 3,991,179; también, ver Patentes Estadounidenses Nos. 4,009,258; 4,278,662; 4,318,903; 4,338,296; y 4,693,893). Una cepa recombinante preferiblemente tiene las características de crecimiento de la cepa sobre atenuada acoplada con las propiedades 10 antigénicas, por ejemplo, las proteínas HA y NM, de la cepa virulenta. La selección de las cepas del virus de la influenza para formulación de vacuna se describe en la Patente Estadounidense No. 5,162,112. Se pueden formular las cepas recombinantes como composiciones para inducir una respuesta inmune.

Se pueden utiliza sacarosa, monoclorhidrato de arginina, el monohidrato de monosodio de ácido glutámico, e hidrolisato de gelatina para estabilizar un virus de la composición de influenza para almacenamiento en un refrigerador. 15 Ver, por ejemplo, la Solicitud de Patente Estadounidense Pub. No. 2006/0110406.

Se describe una HA aislada o purificada. La HA tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 o se deriva de un virus de la influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 4, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 4 en las posiciones de aminoácido 94 y 233. Un fragmento de HA que comprende por lo menos nueve (tal como 9, 12, 15, 18, 21 o 24) 20 aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 94 o 233 de la SEQ ID NO: 4, también se proporciona.

Una NM aislada o purificada también se proporciona. La NM comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o se deriva de un virus de la influenza y comprende una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 2 25 en las posiciones de aminoácido 68 y 134. También se proporciona un fragmento de NM que comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 68 o 134 de la SEQ ID NO: 2.

Se proporciona adicionalmente una NP aislada o purificada. La NP tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 6 o se deriva de un virus de la influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la 30 SEQ ID NO: 6, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 6 en la posición de aminoácido 402. También se proporciona un fragmento de NP que comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 402 de la SEQ ID NO: 6.

Todavía se proporciona adicionalmente una M1 aislada o purificada. La M1 tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ 1D NO: 8 o se deriva de un virus de influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% 35 idéntica a la SEQ ID NO: 8, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 8 en la posición de aminoácido 111. También se proporciona un fragmento de M1 que comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 111 de la SEQ ID NO: 8.

Aún todavía se proporciona adicionalmente una NS1 aislada o purificada, que tiene la secuencia de aminoácido 40 de la SEQ ID NO: 10.

También se proporciona una proteína PA aislada o purificada. La PA tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 12 o se deriva de un virus de la influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 98% (o 99%) idéntica a la SEQ ID NO: 12, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 12 en las posiciones de aminoácido 233, 256, 327, y 561. También se proporciona un fragmento de PA que 45 comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 233, 256, 327, o 561 de la SEQ ID NO: 12.

Se proporciona un PB1 aislada o purificada. La PB1 tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 14 o se deriva de un virus de la influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la SEQ ID NO: 14, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 14 en las posiciones 50 de aminoácido 200 y 213. También se proporciona un fragmento de PB1 que comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 200 o 213 de la SEQ ID NO: 14,

También se proporciona una PB2 aislada o purificada. La PB2 tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 16 o se deriva de un virus de la influenza y tiene una secuencia de aminoácido que es mayor de 99% idéntica a la 55 SEQ ID NO: 16, con la condición que la secuencia de aminoácido es idéntica a aquella de la SEQ ID NO: 16 en las posiciones de aminoácido 107, 221, 292, y 661. También se proporciona un fragmento de PB2 que comprende por lo menos nueve aminoácidos contiguos, por lo menos uno de los cuales es idéntico al aminoácido en la posición 107, 221, 292, o 661 de la SEQ ID NO: 16,.

Las proteínas anteriores y fragmentos de los mismos se pueden purificar (acoplados con fragmentación física o química para generar fragmentos) o sintetizar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides 2: 46, Academic Press, NY (1973), para la síntesis de proteína de fase sólida, y Schroder et al., The Péptidos, vol. 1, Academic Press, NY (1965), para la síntesis de proteína de fase de solución. Se pueden utilizar sistemas automatizados para llevar a cabo tales técnicas de acuerdo con las instrucciones 5 del fabricante. Las cantidades terapéuticas se pueden purificar y producir de forma recombinante.

Alternativamente, las proteínas, en particular HA y NM, se pueden aislar mediante solubilización selectiva, aunque las partículas subvíricas residuales salientes que consisten de la membrana de lípido/ proteína intacta encierran todos los otros componentes víricos no esenciales. La diferencia en tamaño/densidad de las proteínas solubilizadas y las partículas subvíricas residuales permite la separación basada en las diferencias en las propiedades físicas mediante 10 centrifugación y fraccionamiento de gradiente, sedimentación, cromatografía de tamiz molecular, o sedimento en una ultracentrífuga. La solubilización selectiva de HA y NM se puede lograr mediante el tratamiento del virus con un detergente catiónico (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,140,762; la patente ’762). El fluido que contiene el virus completo obtenido de cultivo celular se puede tratar con una enzima que digiere ADN seguido por adición de un detergente catiónico y aislamiento de las proteínas de antígeno de superficie (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense 15 No. 5,948,410). El fluido se puede someter a varias etapas de ultracentrifugación, o el virus se puede fragmentar en la presencia de un detergente no iónico anfifílico seguido por filtración para remover las sustancias no deseables (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,048,537). Alternativamente, la filtración de membrana y la descomposición química se puede utilizar para obtener una proteína vírica (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,337,182). Se describen otros procedimientos en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,064,232 y 4,057,626. Preferiblemente, el virus 20 se multiplica antes del tratamiento como se ejemplifica en la patente ’762 (col. 2, ll. 10 et seq).

Se puede conducir mapeo para identificar un epítopo que induce respuesta inmune de una proteína vírica, es decir, “mapeo de epítopo.” Tal mapeo involucra la fragmentación de una proteína en péptidos de superposición (tales como los péptidos que comprenden 9, 12, 15, 18, 21 o 24 aminoácidos). Se puede fragmentar la proteína con una enzima proteolítica. Los péptidos individuales luego se prueba su capacidad de unir un anticuerpo provocado mediante 25 la proteína natural o para inducir la activación de la célula T o la célula B. Alternativamente, se pueden seleccionar las regiones hidrófilas de la proteína, debido a que os residuos hidrófilos están a menudo sobre la superficie de la proteína y, por lo tanto, son accesibles al anticuerpo. También se puede desarrollar el análisis cristalográfico de rayos X del complejo antígeno- anticuerpo. La HLA potencial sujeta los motivos de unión, que son secuencias de péptido que se sabe que es probable que se unan a las moléculas MHC, se puede identificar a partir de la secuencia de aminoácido de 30 una proteína. Preferiblemente, el epítopo se selecciona de uno que comparte poco o nada de la identidad de secuencia con secuencias ampliamente encontradas en el animal al que se administrará una composición que comprende o que expresa un fragmento de proteína.

También se proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que codifica una proteína descrita anteriormente o fragmento de la misma, opcionalmente como parte de un vector. El ácido nucleico que codifica la HA puede 35 comprender la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve (9, 12, 15, 18, 21 o 24) aminoácidos contiguos. Si se desea, se puede preparar una vacuna trivalente basada en HA, en donde una de las HA comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 4 (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,762,939 y 6,245,532; ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,740,325 para una vacuna tetravalente). El ácido nucleico que codifica la NM puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 1 o 40 un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos contiguos (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,605,457 y Pub. de Sol. de Patente Estadounidense No. 2003/0129197), mientras que el ácido nucleico que codifica la NP puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 5 o un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos contiguos, el ácido nucleico que codifica la proteína M1 puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 7 o un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos 45 contiguos, el ácido nucleico que codifica la proteína NS1 puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 9, el ácido nucleico que codifica la PA puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos contiguos, el ácido nucleico que codifica la PB1 puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos contiguos, y el ácido nucleico que codifica la PB2 puede tener la secuencia de nucleótido de la SEQ ID NO: 15 o un 50 fragmento de la misma que codifica por lo menos nueve aminoácidos contiguos. Una persona medianamente experta en la técnica apreciará, sin embargo, que debido a la degeneración del código genético, existen otras numerosas secuencias de nucleótido que pueden codificar tales secuencias de aminoácido.

Se pueden sintetizar los ácido nucleicos anteriores, que pueden ser ADN o ARN, y fragmentos de los mismos (ver, por ejemplo, Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed., 1984). Tales moléculas pueden incluir nucleótidos de ocurrencia 55 no natural/ bases que codifican la secuencia de aminoácido deseada. Por ejemplo, se puede mutilar la base o azúcar. En adición, se puede modificar la cadena principal de la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una cadena principal de fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, y combinaciones de los mismos.

Alternativamente, se puede someter el vARN aislado a transcriptasa inversa para producir un híbrido de ARN/ADN, del cual se digiere el ARN en sentido opuesto y el ADN residual se trata para producir un dsADN que tiene 60 un extremo de horquilla, el cual se trata con una nucleasa específica monocatenaria para producir una copia bicatenaria bimolecular del vARN (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,357,421). Ver, por ejemplo, Pub. de Sol. de

Patente Estadounidense No. 2006/0166321 para el uso de los casetes de trascripción de tándem para la preparación de influenza en ausencia del virus cooperador.

El ácido nucleico es opcionalmente parte de un vector de ADN que comprende por lo menos un promotor, en cuyo caso cada secuencia de nucleótido se liga operablemente a un promotor, que puede ser el mismo o diferente. En adición a los promotores, otras secuencias de control, tal como las señales de terminación y similares, pueden ser parte 5 del vector de ADN.

Por ejemplo, se puede introducir el ácido nucleico en un vector de expresión recombinante adecuado, tal como aquel adaptado para las bacterias, tales como E. coli y Salmonella, typhi, -levadura, tal como Saccharomyces cervisiae o Pichia pastoris, u hongos filamentosos, tales como Aspergillus nidulans. Las bacterias, levadura, u hongos se pueden hacer crecer en cultivos continuos. El polipéptido, que se produce durante el cultivo luego se puede aislar o purificar. 10 Alternativamente, se puede introducir la molécula de ácido nucleico en Poxviridae (por ejemplo, vectores basados en viruela aviar), Herpesviridae (por ejemplo, vectores basado en virus de pseudorrabia, vectores basados en virus herpes de pavo, vectores basados en virus herpes felino, vectores basados en virus de laringotraqueítis infecciosa, y vectores basados en el virus de herpes bovino herpes), Adenoviridae (por ejemplo, adenovirus bovino (por ejemplo, serotipo 3), adenovirus humano (por ejemplo, serotipo 4 o 7), y adenovirus canino (por ejemplo, serotipo 2; CAV2; ver, por ejemplo, 15 Patente Estadounidense No. 6,090,393), o un vector de expresión de virus de insecto, tal como baculovirus recombinante (por ejemplo, virus de la polihidrosis nuclear de la Autographa californica (Ac- NPV)), que, en cambio, se puede utilizar para infectar células SF9 cultivadas susceptibles, que se derivan de del insecto Spodotera frugiperda. Otros vectores víricos incluyen variolovacuna (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,722,848), adenovirus, virus similar a adeno, adenovirus asociado, retrovirus, y viruela (ver, por ejemplo, Hruby, Vet. Parasitol. 29: 281-282 20 (1988); Uiu, “AIDS Research Reviews,” Dekker, Inc., 1991, 1: 403-416), que se puede administrar mediante escarificación de piel o mediante inyección, opcionalmente como una formulación liposómica. Otros vectores incluyen Bacille-Calmette-Guerin (BCG; Stoveret al., Nature 351: 456-460 (1991)), vectores de toxina ántrax desintoxicados, y similares. Las células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO), y aún células de planta se pueden utilizar para expresar el polipéptido de la construcción adecuada. Una persona medianamente experta en la 25 técnica apreciará que la elección de la célula anfitriona afectará la naturaleza del procesamiento post- traduccional (por ejemplo, glucosilación, plegado, y similares), que, en cambio, pueden impactar la inmunogenicidad del polipéptido, y las técnicas de purificación posteriores.

Se puede lograr la expresión en una célula anfitriona apropiada transformada/ transfectada con el vector de expresión. Ejemplos de células anfitrionas apropiadas incluyen, pero no se limitan a, aquellas descritas anteriormente. 30 Así, la presente invención también proporciona una célula anfitriona transformada/ transfectada con un vector de expresión.

Los sobrenadantes de los sistemas de anfitriona/vector que secretan la proteína o fragmento de la misma en medio de cultivo se puede aplicar a una matriz de purificación, tal como una columna de afinidad o una columna de intercambio de ión. Una o más etapas de HPLC de fase inversa se pueden emplear para purificar adicionalmente la 35 proteína recombinante o fragmento de la misma.

La producción de una proteína o fragmento de la misma como una proteína de fusión puede estabilizar la producción. Esto se puede lograr al ligar las secuencias de nucleótido que codifican dos o más proteínas (o fragmentos de las mismas) en un vector de expresión apropiado con o sin un ligador peptídico. De forma deseable, los marcos de lectura de las secuencias de polinucleótidos están en fase, de tal manera que se produce una proteína de fusión sencilla 40 que retiene la actividad biológica de cada proteína (o fragmento de la misma). Se puede utilizar un ligador de péptido de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos para separar las proteínas resultantes (o fragmentos de las mismas) de tal manera que se asegure que cada proteína (o fragmento de la misma) se pliegue de forma apropiada en sus estructuras natural, secundaria, terciaria y cuaternaria (ver, por ejemplo, Maratea et al., Gene 49: 39-46 (1985); Murphy et al., PNAS USA 83: 8258-8262 (1986); Patente Estadounidense No. 4,935,233; y Patente Estadounidense No. 4,751,180). La 45 capacidad de adoptar una conformación extendida flexible, la capacidad de adoptar una estructura secundaria que puede interactuar con aminoácidos funcionales en ya sea una o ambas de las proteínas, y la carencia de residuos hidrófobos o cargados que pueden reaccionar con una o ambas proteínas son factores, que se toman en consideración en la selección de un ligador de péptido. Los ligadores no se requieren cuando los extremos de las proteínas a ser unidas no contienen regiones esenciales, de tal manera que los extremos se pueden utilizar para separar dominios 50 funcionales y prevenir interferencia estérica. Las secuencias ligadoras de péptido preferidas contienen residuos Gly, Asn, y Ser. También se pueden utilizar otros residuos casi neutros, tales como Thr y Ala.

Se puede selecciona otra secuencia de aminoácido(s) adicional para mejorar la expresión y/o inmunogenicidad de la proteína o fragmento de esta. Por ejemplo, la proteína o fragmento de la misma se puede fusionar a la cadena pesada de la inmunoglobulina G (IgG) o un antígeno que presenta proteína de unión celular (APC) o una proteína de 55 unión celular dendrítica, tal como ligando IL-D, GM-CSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28, o FLT-3. Se pueden utilizar las técnicas, tales como el uso de agentes deshidratantes, por ejemplo, diciclohexilcarbodiimida (DCCI); o la creación de enlaces entre los grupos sulfhidrilo, grupos amino épsilon, grupos carboxilo, y similares. Si se desea, se puede introducir un sitio de división en la proteína de fusión para mejorar la separación de la proteína (o fragmento de la misma) a partir de las secuencias de ocurrencia no natural. Ejemplos de sitios de división incluyen una secuencia 60 objetivo para una enzima proteolítica o, si la metionina no está presente en la proteína (o fragmento de la misma), la metionina a su vez, se divide mediante bromuro de cianógeno. Tales métodos se conocen en la técnica. Se puede

modificar la proteína o fragmento de la misma mediante glucosilación u otra derivación (por ejemplo, acetilación o carboxilación), también de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

La proteína (o fragmento de la misma) se puede expresar in situ a partir de un sistema de expresión adecuado. Cualquier construcción de ADN, que es efectiva en producir la proteína codificada o fragmento de la misma en el ambiente deseado, se puede utilizar para expresar la proteína o fragmento de la misma como se describió 5 anteriormente.

Alternativamente, la molécula de ácido nucleico se puede comportar como un sistema de expresión efectivo in situ cuando se inyecta en un animal como “ADN desnudo” (ver, por ejemplo, Ulmer et al., Science 259: 1745-1749 (1993); y Cohen, Science 259: 1691-1692 (1993)). También se puede facilitar el suministro de ADN a través del uso de bupivicaína, polímeros, y péptidos; alternativamente, se puede utilizar complejos de lípido catiónicos, partículas, o 10 presión (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,922,687).

Ejemplos de secuencias de aminoácido que son por lo menos aproximadamente o mayores de 95% idénticas a, tal como por lo menos aproximadamente o mayores de 96%, 97%, 98%, o 99% idénticas a, la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16 incluyen las secuencias de aminoácido que contienen una o más substituciones, inserciones, adiciones y/o eliminaciones. Se puede determinar la identidad de secuencia al alinear las secuencias de polipéptido y aplicar 15 algoritmos de computador disponibles al público, tales como BLASTP (Pearson et al., PNAS USA 85: 2444-2448 (1988); Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); y Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). El software para BLASTP está disponible en el servidor FTPdel National Center for Biotechnology Information (NCBI) o NCBI, National Library of Medicina, Building 38A, Room 8N8O5, Bethesda, MD 20894. Una vez se alinean las secuencias de polipéptido, se identifica el número de aminoácidos idénticos sobre las porciones alineadas, se divide el número de 20 aminoácidos idénticos por el número total de aminoácidos del polipéptido de interés, y el resultado se multiplica por 100 para determinar el porcentaje de la identidad de secuencia.

A este respecto, una persona medianamente experta en la técnica apreciará que un fragmento de una secuencia de aminoácido dada puede ser por lo menos cerca de o mayor de 95% idéntica a, tal como 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a, la secuencia de aminoácido. Así, se destinan las fragmentos a ser abarcados por “una secuencia de 25 aminoácido que es por lo menos cerca de o mayor de 95% (o 96%, 97%, 98% o 99%) idéntica a la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, o 16.” Tales fragmentos retienen de forma deseable la inmunogenicidad de la proteína de longitud completa. Se pueden generar fragmentos funcionales mediante análisis mutacional del ácido nucleico que codifica la proteína y la expresión posterior de la proteína mutante resultante o mediante digestión química/ enzimática de la proteína, en sí misma. 30

Se pueden introducir modificaciones, tales como sustituciones, inserciones, adiciones y/o eliminaciones, en el ácido nucleico o la proteína (o fragmento de la misma) de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), para mutagenia específica a sitio dirigida a oligonucleótido). De forma deseable, la modificación no disminuye sustancialmente la inmunogenicidad del fragmento de proteína; más bien, se prefiere que la inmunogenicidad permanezca sustancialmente igual o se incremente con relación a la proteína no 35 modificada.

Una “sustitución conservadora” es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, es decir, similar estructura secundaria y naturaleza hidropática. Se pueden hacer las sustituciones de aminoácido sobre la base de similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza antipática de los residuos. Por ejemplo, se pueden intercambiar los aminoácidos cargados negativamente, 40 tales como ácido aspártico y ácido glutámico, mientras que se pueden intercambiar los aminoácidos cargados positivamente, tales como lisina y arginina, y se pueden intercambiar los aminoácidos con grupos principales polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares. A este respecto; se puede intercambiar la leucina, isoleucina y valina, se pueden intercambiar la glicina y alanina, se pueden intercambiar la asparagina y glutamina, y se pueden intercambiar la serina, treonina, fenilalanina, y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que se pueden intercambiar 45 incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser y thr; (2) cys, ser, tyr y thr; (3) val, ile, leu, met, ala y phe; (4) lys, arg y his; y (5) phe, tyr, trp, y his.

En vista de lo anterior, también se proporciona una composición que comprende la proteína/ácido nucleico aislado o purificado o fragmento de cualquiera de los anteriores y un portador biológicamente aceptable. El ácido nucleico o fragmento del mismo puede ser parte de un vector. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,029,763, 50 que se dirige a una vacuna de influenza que comprende como ingrediente activo, NM, y Patente Estadounidense No. 4,140,762, que se dirige a una vacuna contra influenza que comprende, como ingredientes activos, HA y NM. La Patente Estadounidense No. 4,826,687 describe la adición de dipéptido muramilo a una vacuna que comprende HA y NM. Si se desea, se pueden agregar los polipéptidos que corresponden sustancialmente a los aminoácidos 148-162, 163-166, y/o 215-239 de M1 a una composición de una proteína/ ácido nucleico o fragmento de los mismos (ver, por 55 ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,136,019; 5,616,327; y 5,741,493). Se puede utilizar cualquier portador biológicamente aceptable en la composición. Por ejemplo, la proteína (s)/ ácido nucleico(s)/ fragmentos de los mismos se pueden resuspender en un diluyente, por ejemplo, 0.9% de solución de cloruro de sodio, que se amortigua opcionalmente con, por ejemplo, un amortiguador de fosfato. Se puede reducir cualquier sacarosa que permanece después de la purificación del virus mediante diálisis. Se puede utilizar diálisis o cromatografía de gel para remover 60 cualquier detergente catiónico resultante. Preferiblemente, la proteína o fragmento de esta, está presente en una

cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune (es decir, celular o humoral) en un animal. Un portador seleccionado frecuentemente para productos farmacéuticos y antígenos es poli (d,1-lactida-co-glucolida) (PLGA). El PLGA es un poliéster biodegradable, y se puede utilizar para la liberación controlada de antígeno (Eldridge et al., Curr. Topics Micro. Immuno. 146: 59-66 (1989); ver también Patente Estadounidense No. 6,090,393). Se muestra que la compresión de antígenos en las microesferas de PLGA de 1-10 μ en diámetro tiene un efecto adyuvante notable cuando 5 se administra oralmente.

Si se desea, se puede agregar un agente de conservación o un agente de inactivación, tal como formaldehído. Una cantidad convencional de agente de conservación/ inactivación es 1 parte por 10,000 partes.

Si se desea, una o más proteínas (o fragmentos inmunogénicos de las mismas), tal como la HA descrita anteriormente, se pueden combinar con proteosomas. Ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 6,743,900 y Pub. 10 de Sol. de Patente Estadounidense No. 2004/0156867.

Se puede mejorar la inmunogenicidad mediante la inclusión de adyuvantes inmunológicos convencionales, tales como hidróxido de aluminio (por ejemplo, aproximadamente 0.2%) o fosfato de aluminio, aluminio (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 6,372,223, 6,635,246, 6,861,244 y 7,052,701 y Pub. de Sol. de Patente Estadounidense Nos. 2004/0096464 y 2006/0147468), quitosán (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 15 6,136,606 y 6,534,065), alumbre, tal como en la forma de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio u óxido de aluminio, aceites minerales (por ejemplo, Bayol F® y Marcol 52®), adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, dipéptido muramilo, lípido monofosforilo A, y saponinas, que incluyen el componente Quil A. También se puede mejorar la inmunogenicidad al agregar una citocina, tal como una interleucina, o al conjugar proteínas o fragmentos de las mismas. Preferiblemente, la proteína o fragmento de la misma se conjuga con un portador macromolecular, tal como 20 una proteína (por ejemplo, albúmina de suero, hemocianina de lapa de ojo de cerradura, inmunoglobulina, troglobulina, y ovoalbúmina), polisacárido (por ejemplo, sefarosa funcionalizada con látex, agarosa, glóbulos de celulosa, y similares), fosfolípido, aminoácidos poliméricos (por ejemplo, ácido poliglutámico, polilisina, y similares), o co- polímeros de aminoácido (ver, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 5,136,019 y 5,612,037). Alternativamente, la proteína o fragmento de la misma se puede encapsular con un proteoliposoma o vesícula de lípido. 25

Se puede preparar la composición, que puede inducir una respuesta inmune, en la forma de una suspensión o se puede liofilizar. Si se liofiliza, es preferible agregar uno o más estabilizadores. Los estabilizadores adecuados son, por ejemplo, sacarosa, fosfato, glutamato, y albúmina (SPGA; Bovarnick, J. Bacteriol. 59: 509 (1950)), carbohidratos (por ejemplo, sorbitol, manitol, almidón, dextrano, y glucosa), proteínas (por ejemplo, albúmina y caseína) o productos de degradación de los mismos, agentes que contienen proteína (por ejemplo, suero bovino o leche descremada), y 30 amortiguadores (por ejemplo, fosfatos de metal alcalino).

Alternativamente, se puede formular la composición como una composición de liberación controlada. EL virus atenuado/ inactivo o vector recombinante se puede microencapsular con polímeros, tales como policarbonatos, poliésteres, poliuretanos, poliortoésteres, y poliamidas. El polímero particular seleccionado depende de un número de factores que incluyen reproducibilidad de la síntesis de polímero y microencapsulación, costo del material y proceso, 35 perfil toxicológico, requerimientos para cinéticas de liberación variables, y la compatibilidad fisicoquímica del polímero y el virus/vector.

Se pueden utilizar las composiciones descritas aquí solas o en combinación con otros ingredientes activos /composiciones. Ejemplos incluyen composiciones, que pueden inducir una respuesta inmune de nuevo al moquillo canino, hepatitis canina infecciosa (CAV-1 y CAV-2), rabia, parainfluenza, coronavirus canino, sarampión, leptospirosis, 40 y Bordetella. Se han descrito polifenoles para inhibir la infección por influenza en humanos (ver, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,173,922; la patente ’922). De acuerdo con lo anterior, la adición de un polifenol, tal como galato de epigalocatequina, galaro de epicatequina, epigalocatequina, epicatequina, teaflavina libre, monogalato de teaflavina A; monogalato de teaflavina B, y/o digalato de teaflavina puede ser benéfica (ver la patente ’922).Se describen inhibidores de NM are en la Patente Estadounidense No. 5,453,533. Se describen el uso de citocinas como 45 inmunopotenciadores y encapsulación liposómica en la Patente Estadounidense No. 5,919,480.

La cantidad de ácido nucleico en la composición puede variar ampliamente. Por ejemplo, la concentración puede variar de menos de aproximadamente 0.1% tanto como aproximadamente 20-50% o más en peso, de forma usual por lo menos aproximadamente 2%. La concentración de proteína en la composición también puede variar ampliamente. Por ejemplo, la concentración puede variar de menos de aproximadamente 0.1 % tanto como 50 aproximadamente 20-50% o más en peso, de forma usual por lo menos aproximadamente 2%. El volumen de fluido y la viscosidad se toman en consideración cuando se determina la concentración final.

De acuerdo con lo anterior, también se proporciona un método para inducir una respuesta inmune para el virus de la influenza canina en un animal. Se puede evaluar la susceptibilidad de una animal a infección utilizando la prueba de neutralización de reducción de placa (Patente Estadounidense No. 4,315,073) o la prueba de hemaglutinación. Los 55 métodos comprenden administrar al animal una composición anteriormente descrita que comprende una proteína purificada o aislada /ácido nucleico o fragmento de los mismos. Si la composición comprende un ácido nucleico (o fragmento del mismo) como parte de un vector, preferiblemente la proteína (o fragmento de la misma) se expresa en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune en un animal. Por ejemplo, se puede administrar una dosis única de aproximadamente 9 a aproximadamente 43 unidades internacionales por kg de peso corporal del animal. Para 60

mamíferos mayores, una dosis única puede comprender de aproximadamente 600 a aproximadamente 3,000 unidades internacionales por kg de peso corporal. Para las composiciones de vacuna preparadas al cultivar virus en la cavidad alantoidea de huevos fértiles, cosechar el virus, y, si se desea, estabilizar el virus cosechado con un estabilizador, tal como una peptona o sacarosa, y luego la distribución en frascos de vidrio para secado por congelamiento posterior, una dosificación de vacuna unitaria puede contener por lo menos 107 EID50 (50% de dosis infectiva en huevos) del virus. En 5 la última situación, la vacuna secada por congelamiento se reconstituye mediante adición de agua u otro diluyente farmacéuticamente aceptable antes de la administración, tal como en la forma de un rociador nasal o gotas nasales. Si se desea, se puede administrar la vacuna en dos dosificaciones sucesivas en un intervalo de una semana.

Se puede administrar la composición a los cachorros como una dosis única en la edad de 12 semanas, o de forma repetida partiendo de la edad de 6 semanas (por ejemplo, a 6, 9 y 12 semanas), o semanales de 4 semanas. La 10 dosificación efectiva y la ruta de administración se determinan mediante la misma naturaleza de la composición, la naturaleza del producto de expresión, LD50, y, si se utiliza el vector recombinante, el nivel de expresión del vector, así como también la raza del perro y su edad, sexo, peso, y condición. Las dosificaciones del producto expresado pueden variar de unos pocos a unos pocos cientos de microgramos, por ejemplo, 5-500 μg. Las dosificaciones preferidas del virus o vector recombinante pueden variar de aproximadamente 103 a aproximadamente 106 pfu. La dosis para la cepa 15 atenuada viva puede ser por lo menos aproximadamente 103 TCID50.

Se pueden administrar las composiciones parenteralmente (es decir, mediante inyección (por ejemplo, intradérmica, subcutánea, o intramuscular) o mediante la ruta de infección, tal como nasalmente) o enteralmente (es decir, mediante administración oral). El uso de un agente de gelificación y un muco- o bioadhesivo para mejorar la respuesta inmune contra una composición inhmunogénica administrada intradérmicamente se describe en la Pub. de 20 Sol. de Patente Estadounidense No. 2005/0255121. Si se desea, la composición para inducir una respuesta inmune se puede administrar a través de agua potable o jarabe de acuerdo con Chu et al. (Pub. de Sol. de Patente Estadounidense No. 2006/0171960, que se publicó en agosto 3, 2006). La administración oral es ventajosa en la medida en que evita el consumo de tiempo y la mano de obra intensa de la inyección intramuscular, que, en cambio, puede crear tensión e incomodidad al animal. La incomodidad, a su vez, puede afectar el desarrollo de perros de raza. Alternativamente, la 25 composición que comprende un vector recombinante que expresa por lo menos un epítopo que induce respuesta inmune se puede aplicar directamente a la piel para expresión localizada e inducción de una respuesta inmune.

Se puede demostrar la eficacia de la composición, que puede inducir una respuesta inmune, al exponer los cachorros a una cepa virulenta del virus de la influenza canina. Los perros no tratados pueden desarrollar signos clínicos característicos de la infección vírica de influenza canina, mientras que los tratados no lo pueden hacer. 30

Se pueden utilizar los vectores recombinantes y los productos expresados de los mismos para producir anticuerpos, tales como anticuerpos policlonales (pAb) y anticuerpos monoclonales (mAb), de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Shepherd y Dean, Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford 35 University Press, U.S.A. (2000)); y Harris y Adair, Antibody Therapeutics, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)). Se pueden utilizar los anticuerpos, en particular mAbs,en ensayos de unión y equipos/ pruebas diagnósticas para determinar la presencia/ ausencia de un antígeno del virus de la influenza canina o si o no se ha estimulado una respuesta inmune al virus. También se pueden utilizar los anticuerpos para recuperar material mediante cromatografía de inmuno- absorción. 40

Los anticuerpos también pueden proporcionar inmunización pasiva. Por ejemplo, suero inmune parcialmente purificado de animales anfitriones o de estirpes celulares de hibridoma se pueden inyectar en un animal. Los anticuerpos proporcionan un efecto terapéutico al unirse a y neutralizar un virus infeccioso de influenza.

También se proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-idiotípico que tiene una imagen interna de un epítopo de una proteína descrita anteriormente, tal como una proteína que consiste de la secuencia de 45 aminoácido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

Una persona medianamente experta en la técnica apreciará que se puede preparar un anticuerpo anti-idiotípico, que lleva una imagen interna de un epítopo , tal como aquella descrita aquí . Ver, por ejemplo, Herlyn et al., Science 232: 100-102 (1986)). Los métodos para preparar anticuerpos anti- idiotípicos monoclonales y policlonales, que llevan la imagen interna del polipéptido; se describen en la Patente Estadounidense No. 5,053,224, por ejemplo. 50 Brevemente, los anticuerpos anti- idiotípicos policlonales se pueden producir al inmunizar los animales con anticuerpos idiotípicos monoclonales formulados contra el polipéptido y detectados para la reactividad con el polipéptido y detección de antisueros, que reaccionan con anticuerpos idiotípicos al polipéptido. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) también se pueden preparar a partir de tales animales utilizando técnicas estándar para inmortalizar células que secretan anticuerpo del animal y cultivos de detección con anticuerpos idiotípicos en competición con el polipéptido. Aunque se 55 prefieren los mAb también se pueden utilizar los anticuerpos policlonales (pAbs), que se preparan en una variedad de sistemas de mamíferos.

También se proporciona otro método para inducir una respuesta inmune a CIV en un canino. Este método comprende administrar al canino una cantidad efectiva de una composición que comprende un anticuerpo anti-idiotípico como se describió anteriormente. 60

Se pueden utilizar las moléculas de ácido nucleico aislado o purificado o vectores que los comprenden para generar ADN para sondas/ cebadores, que se pueden utilizar para detectar la presencia o ausencia de ADN hibridable o para amplificar ADN, tal como cADN.

Se pueden utilizar las proteínas etiquetadas o fragmentos de las mismas, así como también ácido nucleicos etiquetados o fragmentos de los mismos en ensayos. Los métodos de ensayo incluyen fluoroinmunoensayos (Smith et 5 al., Ann. Clin. Biochem. 18: 253-275 (1981)), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), y técnica de inmunoensayo multiplicado a enzima (EM1T; ver Enzyme Immunoassay, Maggio, ed., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1980. pp. 141-150; 234-235, y 242-243). Se pueden utilizar tales métodos para detectar la presencia del virus y para diagnosticar el estado de la infección.

El virus, en sí mismo, se puede utilizar como un vector. El uso de virus como vectores está dentro de la 10 experticia en la técnica.

EJEMPLO

El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la presente invención. El ejemplo no está destinado a limitar el alcance de la invención en ninguna forma. El ejemplo describe la identificación y caracterización parcial de un virus de la influenza canina. 15

Los brotes epidémicos de la enfermedad respiratoria aguda, caracterizados por toz, fiebre, respiración rápida, y descarga nasal hemorrágica, ocurrieron entre los galgos en dos canódromos compuestos localizados en el este y oeste de Iowa en Abril 2005. Aunque se recuperó un gran porcentaje de perros afectados, muchos sucumbieron a neumonía hemorrágica.

Los pulmones de los perros afectados exhiben decoloración roja a roja-negra con firmeza palpable moderada a 20 marcada y pleuritis fibrinosa leve. Las secciones de pulmón se caracterizan por neumonía intersticial a broncointersticial hemorrágica severa. Son evidentes el cambio intersticial irregular con engrosamiento séptico alveolar, los coágulos de residuos en los alvéolos, la atelectasia asociada. Se observa neumonía broncointersticial piogranulomatosa focalmente extensa con dilatación de las vías respiratorias mediante células degeneradas y residuos. Son evidentes la vasculitis aislada y los trombos vasculares. 25

La prueba microbiológica para agentes víricos y bacterianos convencionales no revela patógenos significativos excepto Streptococcus equi subsp. zooepidemicus, que está presente en el tejido pulmonar de todos los animales examinados. Dos de cuatro muestras de pulmón probadas dan positivo para el virus de la influenza utilizando reacción de cadena de transcriptasa- polimerasa inversa en tiempo real (RT-PCR; Harmon et al., Development of a PCR-based differential test for H1N1 and H3N2 swine influenza viruses. In: Proceedings of the 42nd Annual Meeting of America 30 Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. San Diego, CA. Octubre 1999. p. 44.). La inmunohistoquímica utilizando anticuerpo monoclonal (mAb) específico para la NP del virus de la influenza (Vincent et al., J. Vet. Diagn. Invest. 9: 191-195 (1997)) también es positivo dentro de las lesiones neumónicas víricas de ambos pulmones como es la prueba ELISA que captura antígeno (Directgen™ Flu A, Becton/Dickinson, Sparks, MD) en las muestras. Las muestras de lavado bronquialveolar de los dos pulmones positivos resultan positivas para el virus de la influenza 35 mediante PCR.

Se intenta el aislamiento del virus ya que la detección del virus de la influenza en pulmones de caninos es una observación inesperada, ya que solo existe un único informe de la infección del virus de la influenza en perros (Dubovi et al., Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. In: Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. Greensboro, NC. Octubre 40 2004. p. 158.). Un virus que es capaz de aglutinar glóbulos rojos de gallo se aísla en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) a partir de fluido de lavado pulmonar y bronquioalveolar de uno de los dos animales en los que se detecta el virus de la influenza mediante ensayo inmunohistoquímico (IHC) y PCR. Se determina el virus aislado mediante PCR por ser el virus de la influenza de subtipo H3. El virus aislado es subtipo como el H3N8 utilizando ensayos de inhibición HA e inhibición NM. El virus aislado se reconoce mediante antisuero formulado contra varios virus 45 de influenza equina H3 , que incluyen Miami ((A/Eq/MI/1/63-H3N8) 640-1280), AK((A/Eq/AK129759/91- H3N8) 320-640), y Kentucky ((A/Eq/Kentucky/81-H3N8) 160-320).

La secuenciación de los genes HA y NA de ambos aislados revelan 100% y 99.8% de identidad, respectivamente, entre los dos aislados. Filogenéticamente, el gen de Ha de los aislados está genéticamente cercano (96-98% de homología de nucleótido) al gen de HA de los virus de influenza equina H3N8 recientes (Macken et al., The 50 value of a database in surveillance and vaccine selection. In: Options for the Control of Influenza IV. Osterhaus et al., eds. Elsevier Science, Amsterdam. 2001. pp. 103-106.). El gen de NA de los aislados también muestra 96-98% de homología con el gen NA de los virus de influenza equina H3N8 recientes. Debido a que los galgos en dos pistas de carrera diferentes, que son geográficamente remotas en Iowa, sucumben simultáneamente a la enfermedad sin la participación de los caballos enfermos indica que el virus de la influenza aislado es una cepa adaptada a caninos que se 55 puede perpetuar en y propagar entre los perros. El S. zooepidemicus, que se ha implicado en la enfermedad respiratoria y problemas asociados con septicemia en muchas diferentes especies de animales (Wood et al., J. Clin. Microbiol. 43: 120-126 (2005); y Gillespie et al., The General Staphylococcus and Streptococcus. In: Hagan and Bruner’s Infectious Diseases of Domestic Animals. 7th ed. Comstock/Cornell University Press. Ithaca, NY. 1981. pp. 164-180)), probablemente contribuyen a la severidad de la enfermedad. 60

El uso de los términos “un” “una” “el” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se construyen para cubrir el singular y el plural, a menos que se indique de otra forma aquí o se contradiga claramente por el contexto. La enumeración de los rangos de valores aquí se destina solamente para servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor por separado que cae dentro del rango, a menos que se indique de otra forma aquí, y cada valor separado se incorpora en 5 la especificación como si se enumeraran individualmente aquí. Todos los métodos descritos aquí se pueden desarrollar en cualquier orden a menos que se indique de otra forma aquí o de otra forma se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado aquí, se destina solamente a ilustrar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de otra forma. Ningún lenguaje en la especificación se debe interpretar como indicación de que cualquier 10 elemento no es esencial en la práctica de la invención.

Se describen las realizaciones preferidas de la invención aquí, que incluyen el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Iowa State University Research Foundación, Inc. 15

<120> VIRUS DE LA INFLUENZA CANINA y COMPOSICIONES RELACIONADAS y MÉTODOS DE USO

<130> 42885-104201

<150> US 60/727,808

<151> 2005-10-18

<150> US 11/539,123 20

<151> 2006-10-05

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1450 25

<212> ADN

<213> Virus de la influenza A

<220>

<221> CDS

<222> (9)..(1418) 30

<400> 1

<210> 2

<211> 470

<212> PRT 5

<213> Virus de la influenza A

<400> 2

<210> 3

<211> 1762

<212> ADN

<213> Virus de la influenza A 5

<220>

<221> CDS

<222> (30)..(1724)

<400> 3

10

<210> 4

<211> 565

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A 5

<400> 4

<210> 5

<211> 1585

<212> ADN

<213> Virus de la influenza A 5

<220>

<221> CDS

<222> (51)..(1544)

<400> 5

10

<210> 6

<211> 498

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A 5

<400> 6

<210> 7

<211> 1056

<212> ADN

<213> Virus de la influenza A 5

<220>

<221> CDS

<222> (40)..(795)

<400> 7

<210> 8 5

<211> 252

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A

<400> 8

<210> 9

<211> 870

<212> ADN 5

<213> Virus de la influenza A

<220>

<221> CDS

<222> (29)..(718)

<400> 9 10

<210> 10

<211> 230

<212> PRT 5

<213> Virus de la influenza A

<400> 10

<210> 11

<211> 2191

<212> ADN 5

<213> Virus de la influenza A

<220>

<221> CDS

<222> (4)..(2151)

<400> 11 10

<210> 12

<211> 716

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A 5

<400> 12

<210> 13

<211> 2299

<212> ADN 5

<213> Virus de la influenza A

<220>

<221> CDS

<222> (22)..(2292)

<220> 10

<221> misc_feature

<222> (547)..(547)

<223> Xaa significa Ala o Val

<400> 13

<210> 14

<211> 757

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A 5

<220>

<221> misc_feature

<222> (547)..(547)

<223> El ’Xaa’ en la ubicación 547 significa Ala, o val.

<400> 14 10

<210> 15

<211> 2370

<212> ADN 5

<213> Virus de la influenza A

<220>

<221> CDS

<222> (42)..(2318)

<400> 15 10

<210> 16

<211> 759

<212> PRT

<213> Virus de la influenza A 5

<400> 16

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un virus de la influenza canina aislado del subtipo H3N8 depositado con la American Type Culture Collection como Depósito de Patente No. PTA-7694.
2. 2. El virus de la influenza canina aislado de la reivindicación 1, que es inactivo.
3. 3. El virus de la influenza canina aislado de la reivindicación 1, que es atenuado. 5
4. 4. Una composición que comprende el virus de la influenza canina de las reivindicaciones 1, 2 o 3.
5. 5. La composición de la reivindicación 4, en donde el virus de la influenza canina está presente en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune.
6. 6. La composición de la reivindicación 4, en donde el virus de la influenza canina está presente en una cantidad de 103 a 106 pfu por dosis. 10
7. 7. La composición de la reivindicación 4, donde la cepa atenuada es por lo menos 103 TCID50 por dosis.
8. 8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende adicionalmente un portador biológicamente aceptable.
9. 9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la composición se formula como una composición de liberación controlada. 15
10. 10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende adicionalmente otros ingredientes activos o composiciones.
11. 11. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 para preparar un medicamento para inducir una respuesta inmune al virus de la influenza canina o el tratamiento de una infección vírica de influenza canina. 20