ES2355559T3 - Procedimiento para la identificación de tumores colorectales. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la determinación de la presencia de tumores colorectales o lesiones pre-cancerosas en un sujeto humano, que comprende: a) extracción de ADN de muestras de cepas: b) amplificación por PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que se extienden en diferentes regiones de genes p53 y APC, usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes, en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores: y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores: c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones); d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones; e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o lesiones colorrectales.
Description
Esta presente invención se refiere en general al diagnóstico de tumores en pacientes humanos y animales. De forma específica proporciona un procedimiento y kit para el diagnóstico precoz de carcinoma colorrectal y determinación de lesiones pre-cancerosas del colon y recto. El procedimiento de la invención se basa en la cuantificación de ADN extraído de cepas y amplificado con técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa). 5
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En los últimos años se ha acumulado una gran cantidad de información sobre las alteraciones moleculares que tienen lugar durante el desarrollo de tumores, tal como mutaciones de genes o redisposiciones genómicas, vislumbrando la posibilidad de detectar alteraciones tumorales en fluidos biológicos y en consecuencia indicando el uso de estos marcadores como un enfoque de diagnóstico no invasivo válido. 10
Un tumor que se ha investigado ampliamente con este enfoque es el cáncer colorrectal, que es una de las formas más comunes de cáncer en todo el mundo, con un resultado clínico que varía considerablemente de acuerdo con el tipo de lesión y fase de enfermedad en el diagnóstico (1-3). Un diagnóstico precoz es fundamental para reducir la morbididad y mortalidad ya que un gran porcentaje de pacientes diagnosticados en las fases previas de la enfermedad sobreviven a largo plazo (4). Además la posibilidad de detectar lesiones pre-cancerosas hace de este 15 tumor una diana ideal para los programas de seguimiento. Sin embargo, si bien se encuentran disponibles diversos procedimientos de seguimiento, un alto porcentaje de individuos no participan en los programas de seguimiento de cáncer colorrectal. Hay muchas razones para esta baja implicación, tal como una falta de conocimiento de los beneficios de los procedimientos de seguimiento disponibles, especialmente colonoscopia, así como también los procedimientos no complacientes y problemáticos (5). 20
Se han investigado repetidamente mutaciones de genes en cepas, especialmente K-ras (6-12) y en una menor extensión p53 (13), gen APC (14, 15) e inestabilidad microsatelital (16). Los resultados han mostrado la presencia de estas alteraciones moleculares en cepas en sólo una fracción de pacientes, debido a la frecuencia relativamente baja de alteraciones de marcador único en cáncer colorrectal. Se han analizado múltiples mutaciones en paralelo a la misma muestra de cepa y este enfoque ha conducido a mejor sensibilidad de la prueba, pero es cara, lleva tiempo y no 25 se puede aplicar fácilmente a programas de seguimiento (17-21).
Se ha considerado recientemente el potencial de diagnóstico de la amplificación de ADN de células exfoliadas en cepa. Evidencias preliminares (19-21) han mostrado que la evaluación semi-cuantitativa de amplificación de ADN (L-ADN) de algunos fragmentos de ADN mayores de 200 bp detecta más del 50% de cánceres colorectales con una especificidad muy alta. 30
La solicitud de EEUU nº 20020004206 divulga un ensayo genético para la identificación de una enfermedad tumoral de muestras que contienen células epiteliales exfoliadas. La solicitud de patente describe un ensayo que comprende una etapa de amplificación por PCR de fragmentos de Kras, APC y p53, seguido de determinación semi-cuantitativa del ADN amplificado basado en tinción con gel.
El documento US 5723298 divulga un procedimiento para el etiquetado y secuenciación de moléculas de 35 ácido nucleico, de forma particular moléculas de ADN en las que se alarga un cebador etiquetado internamente, extendido parcialmente en una reacción de extensión del cebador ciclado, y un kit para la preparación de muestras para análisis de secuencia de ácido nucleico que comprende un cebador de ácido nucleico no etiquetado, un dNTP etiquetado, tres dNTPs no etiquetados, una polimerasa termoestable y un tampón de reacción de la polimerasa termoestable. 40
El documento WO 01/42502 divulga un procedimiento para la detección de enfermedad que comprende, entre otros, llevar a cabo una amplificación de PCR de ADN purificado en muestras de cepa en pacientes que presentan cáncer colorrectal. Los cebadores usados en dicho procedimiento de amplificación se diseñan para amplificar 5 ó 7 locus diferentes de ADN que permiten la amplificación del fragmento de ADN que presenta una longitud mayor de 200 bp. La cantidad de amplicones se compara luego con un valor de referencia. Se usa tinción con bromuro de etidio para 45 la cuantificación de ADN amplificada.
El documento WO 02/092858 divulga procedimientos para el seguimiento de enfermedades. Uno de los procedimientos descritos en este documento comprende llevar a cabo un procedimiento de diagnóstico para detectar la presencia de una muestra biológica de ácidos nucleicos específicos de especie indicativos de cáncer o pre-cáncer. Dicho procedimiento comprende la amplificación de ácidos nucleicos en una muestra de cepa representativa que usa 50 cebadores específicos de humanos y que detecta amplicones que presentan más de 200 bp mediante tinción con bromuro de etidio, seleccionándose los cebadores de PCR para detectar de forma específica genes que se sabe o se sospecha están asociados con cáncer colorrectal. En dicho procedimiento la amplificación por PCR se diseña para amplificar 7 locus diferentes con una longitud que presenta al menos 200 bp. El resultado de la amplificación se compara luego con un valor de referencia. 55
Rengucci y col., Clinical Cancer Research, 7: 590-593 (2001), divulga la detección de alteraciones genéticas, de forma particular p53 y mutaciones k-ras e instabilidad microsatelital, para el seguimiento de tumores colorectales.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en un enfoque nuevo, exacto y rápido para la detección de cáncer, que permite una mejor discriminación entre individuos afectados y no afectados. 5
De forma específica el objeto de la invención es un procedimiento para la cuantificación de ADN en muestras de cepa, útil para el diagnóstico previo de tumores y lesiones de pre-cancerosas del colon y recto, que comprende las siguientes etapas:
a) extracción de ADN de muestras de cepas:
b) amplificación PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que extiende diferentes regiones de genes p53 y APC, 10 usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes,
en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores:
y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores:
15
c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones);
d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones;
e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o lesiones colorrectales.
La extracción de ADN se puede llevar a cabo mediante técnicas convencionales usando kits comercialmente 20 disponibles. Los fragmentos de ADN amplificados en la etapa (2) puede extenderse en una o más regiones genómicas que no se solapan, incluyendo secuencias de genes y no de codificación, procurando que la longitud del fragmento no supere 100 bp (pares de bases), preferiblemente entre 100 y 1000 bp, y más preferiblemente entre 100 y 500 bp. Los fragmentos se pueden amplificar por separado o simultáneamente; en este último caso los productos de amplificación se deberían distinguir uno del otro mediante etiquetado fluorescentes apropiado. Preferiblemente los oligonucleótidos 25 de cebador o deoxinucleótidotrifosfatos usados en la reacción de amplificación portan las siguientes moléculas fluorescentes (fluorocromos): HEX (Applied Biosystems), 6-FAM (Applied Biosystems) y TAMRA (Applied Biosystems), u otras moléculas tales como fluoresceína, rodamina, Cy3, Cy5, 5-FAM Ned, Vic y Pet. Los marcadores se unen químicamente con uno o más nucleótidos dentro o en los extremos de las secuencias del cebador, preferiblemente en el primer residuo de nucleótido, o con los deoxinucleótidotrifosfatos presentes en la mezcla de reacción de PCR. 30
Se amplifican los siguientes fragmentos de genoma: exones 5 a 8 de p53 (Banco de genes nº X54156, nt. 13042-13253, 13308-13489, 13986-14124, 14404-14603); y regiones genómicas que codifican aminoácidos 862-954, 1035-1130, 1288-1402 y 1421-1515 de APC (exón 15 – Banco de genes AF 127506, M74088).
En una realización preferida adicional se cuantifican los productos de amplificación mediante secuenciadores/analizadores de ADN automáticos, preferiblemente usando el 3100 Avant Genetic Analyzer® (Applied 35 Biosystems). Otras técnicas adecuadas para la amplificación del fragmento de acuerdo con la invención incluyen técnicas inmunoenzimáticas, PCR a tiempo real y técnicas de quimioluminiscencia.
La amplificación PCR se lleva a cabo preferiblemente en presencia de un control interno para la detección de
inhibidores de la Taq. Por ejemplo, se puede añadir un plásmido que contiene una secuencia, también no relacionada con humano, que se puede amplificar con el conjunto de cebadores usados en la amplificación del ADN diana, a la mezcla de reacción de PCR. Este control interno permite prevenir resultados negativos falsos debido a la presencia de inhibidores de la Taq.
Con el fin de determinar la cantidad de cada amplicón es necesario preparar una curva de calibración 5 mediante amplificación de diluciones conocidas de ADN genómico o plásmidos que contienen las secuencias de nucleótido de los fragmentos de ADN diana, usando los mismos cebadores y las mismas condiciones de las muestras de ensayo. Por ejemplo, cuando se usa un secuenciador/analizador de fragmento automático los valores de AUC (área bajo la curva) obtenidos de la amplificación de cantidades conocidas de ADN se representan en una curva de calibración; las cantidades de ADN en las muestras de ensayo se interpolan luego en la misma curva. 10
La cantidad total de los productos de amplificación que corresponden a diferentes fragmentos (es decir, la suma de cantidades de amplicón simples), expresadas en unidades de peso, se compara luego con un valor de referencia o de “corte” determinado previamente en base a la serie de casos que comprende sujetos sanos y pacientes en los que se ha establecido la presencia de tumores o lesiones colorectales. Estos casos deben incluir un número suficiente de pacientes y controles para proporcionar un buen intervalo de confianza (IC 95%), preferiblemente al 15 menos 50 pacientes y 50 voluntarios sanos.
La exactitud, sensibilidad y especificidad del procedimiento lo hacen particularmente útil en el diagnóstico precoz de tumores colorectales y en la evaluación del riesgo o probabilidad de desarrollo de tales tumores en personas con lesiones colorectales cancerosas. Son ventajas adicionales del procedimiento su simplicidad, rapidez y bajo coste.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit adecuado para llevar a cabo el procedimiento descrito 20 anteriormente. El kit contendrá los oligonucleótidos etiquetados descritos anteriormente, ADN polimerasa termoestable, soluciones y reactivos para el desarrollo de una reacción de PCR y para un ensayo de cuantificación (p.e. el procedimiento de inmunoenzima o fluorimétrico). El kit también puede contener también instrucciones sobre el correcto procedimiento de operación.
Figuras 1 a 3: ejemplos de análisis de ADN-LF 25
Figuras 1a y 1b: ADN extraído de muestras de cepa. Los niveles de amplificación de cada muestra – expresados en unidades de peso (nanogramos) – se determinan a partir de las curvas de calibración correspondientes (figura 2c). El ADN-LF (ADN de larga duración por fluorescencia) para cada muestra viene dada por la suma de las cantidades (ng) de tres grupos de amplicones: exones 5-8 de p53, fragmentos APC 1-2 y 3-4.
Figuras 2a y 2b: electroferogramas obtenidos por amplificación de cantidades de ADN conocidas. Los valores 30 de AUC se encuentran normalizados (área/100*ng) y se representan frente a la cantidad de ADN (1, 2, 5, 10 y 20 ng).
Figura 3: curva ROC de análisis de ADN-LF de muestras de cepa en pacientes y donadores sanos.
Material y procedimientos
Purificación de ADN
Se descongelaron aproximadamente 4 g de cepa a temperatura ambiente. Se extrajo el ADN después de una 35 homogenización de 15 minutos con 16 ml de tampón TE-9 a pH 9 (Tris-HCl 0,5 M, EDTA 20 mM y NaCl 10 mM) con ULTRA-Turrax T25 (Janke & Kunkel GmbH & Co. KG IKA-Labortechnik, Staufen, Alemania). Después de la centrifugación a 5.000 g durante 15 minutos se transfirió el sobrenadante a un tubo que contiene 5 ml de acetato de amonio 7,5 M (M-Medical, Florencia, Italia) y 300 ml de etanol al 100% (Carlo Erba, Milán, Italia). Se recuperó el ADN mediante centrifugación a 5.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se suspendieron muestras de cepa en 40 1,6 ml de tampón ASL y se extrajo el ADN usando el kit QIAamp DNA Stool (QUIAGEN, Hilden, Alemania).
Análisis de ADN-LF
Se llevaron a cabo amplificaciones de exones 5-8 de p53 y fragmentos 1-4 de exón APC 15 en 2 μl de ADN de cepa en un volumen total de 25 μl que contiene 0,4 μM de cada cebador, 200 μM de deoxinucleótidotrifosfatos, 1 x tampón de reacción con MgCl2 3,5 mM y 1 unidad de Taq polimerasa (QIAGEN). Se sometió la mezcla de reacción a 45 32 ciclos: 60 s a 94º C y luego 60 s a 60º C para exones de p53, y a 58º C para fragmentos de APC, seguido de incubación a 72º C durante 60 s.
Los exones de p53 se amplificaron simultáneamente en una única mezcla de reacción y se amplificaron los 4 fragmentos de APC en dos mezclas diferentes (mezcla 1 – fragmentos 1 y 2; mezcla 2 – fragmentos 3 y 4). Para este fin los cebadores usados para análisis de ADN-L se etiquetaron en el extremo con fluorocromos suministrados por 50 Applied Biosystems (Foster City, CA).
Amplificación 1: exones de 5 a 8 de gen p53 (Banco de genes nº X54156, nt. 13042-13253, 13308-13489, 13986-14124, 14404-14603). Amplificación 1 y 2: fragmentos que corresponden a aminoácidos 682-954 y 1035-1130 de exón 15 de gen de APC (Banco de genes AF127506, M74088). Amplificación 3 y 4: fragmentos que corresponden a aminoácidos 1288-1402 y 1421-1515 de exón 15 de gen de APC (Banco de genes AF127506, M74088).
- Exones de P53
- Nombre del cebador Etiquetado en 5’ Secuencia
- 5
- 5-F 5-R 6-FAM- ctcttcctgcagtactcccctgc gccccagctgctcaccatcgcta
- 6
- 6-F 6-R HEX gattgctcttaggtctggcccctc ggccactgacaaccacccttaacc
- 7
- 7-F 7-R 6-FAM gcgttgtctcctaggttggctctg caagtggctcctgacctggagtc
- 8
- 8-F 8-R HEX acctgatttccttactgcctctggc gtcctgcttgcttacctcgcttagt
- Fragmento de APC
- Nombre del cebador Etiquetado en 5’ Secuencia
- 1
- 1BF 1BR HEX aactaccatccagcaacaga taatttggcataaggcatag
- 2
- 2F 2R 6-FAM cagttgaactctggaaggca tgacacaaagactggcttac
- 3
- 3F 3R HEX gatgtaatcagacgacacag ggcaatcgaacgactctcaa
- 4
- 4F 4R 6-faze cagtgatcttccagatagcc aaatggctcatcgaggctca
Se llevó a cabo la electroforesis usando un 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) equipado con 5 GenScan Analysis 3.7.
Se llevó a cabo ADN-LF analizando la intensidad de fluorescencia de cada producto de PCR específico de la muestra (figura 1ab). La cuantificación de cada muestra se calculó por referencia a una curva patrón (1, 2, 5, 10 y 20 ng) de ADN genómico y se expresa como nanogramos (figura 2abc). Para verificar la presencia o ausencia de inhibidores de la Taq, se llevó a cabo una amplificación en todas las muestras con una mezcla que contiene 2 μl de 10 ADN extraído de cepa y 25 atogramos [ag] de un plásmido con una secuencia de control. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por duplicado y se repitieron en aproximadamente el 20% de las muestras en las que la variación era > 20%.
Series de casos
Se recogieron muestras de cepa en 86 pacientes con cáncer colorrectal primario en la Unidad de 15 Gastroenterología y Dept. de Cirugía I, Morgagni Hospital, Forli y en los Departamentos de Oncología y Cirugía General, Infermi Hospital, Rimini. Se recogieron muestras de 62 individuos que dieron negativo en cáncer o lesiones benignas tras colonoscopia, y del personal del laboratorio.
Se obtuvieron muestras de cepa al menos tres días después de la administración de tratamientos laxativos en la preparación de colonoscopia para permitir la recuperación de funcionalidad normal del intestino. Se congelaron 20 inmediatamente especímenes fecales y se conservaron a -70º C durante un máximo de dos meses.
Se confirmó histológicamente el diagnóstico de cáncer y se definió la fase patológica de acuerdo con la clasificación de Duke: se clasificaron 8 tumores como fase A, 30 como fase B, 37 como fase C y 9 como fase D.
Además se localizaron 19 cánceres en colon ascendente, 30 en colon descendente, 2 en colon transverso y 35 en el tracto rectal. Sólo para dos únicos casos no se disponía de información de la fase.
De los 86 pacientes 42 eran hombres y 44 eran mujeres y la edad media era de 72 años (intervalo de 36 a 90). De los 62 controles, 29 eran hombres y 33 mujeres y la edad media era de 51 años (intervalo de 21 a 87).
Resultados 5
Las señales de fluorescencia variaban de 0 a 283 ng (mediana 47 ng) en cepa de paciente y de 0 a 87 ng (mediana de 4 ng) en cepa de donador sano. No se observaron diferencias en valores de la mediana respecto a la edad de pacientes y tamaño, lugar y fase del tumor.
Cuando los resultados de los dos enfoques se compararon se observó una relación directa, pero con una amplia variabilidad de niveles de ADN-LF dentro de los subgrupos definidos de acuerdo con el número de 10 amplificaciones de alto ADN-L. Además se detectó fluorescencia por procedimiento de ADN-LF en 33 de los 47 individuos que no mostraron amplificación elevada por ensayo de ADN-L. Estos resultados eran claramente indicativos de una mayor sensibilidad del procedimiento de fluorescencia frente al enfoque convencional.
El análisis de la curva ROC de niveles de ADN-LF (figura 3) muestra una buena exactitud de diagnóstico de este enfoque. De forma particular se observaron especificidad muy alta que varía de 83% a 95% y alta sensibilidad que 15 varía de 82% a 72% para los cortes más discriminatorios de 15, 20, 25 y 30 ng de ADN (tabla 1). Cuando el corte de 25 ng, que proporciona la mejor exactitud global, se analizó en relación a las diferentes características del tumor, la sensibilidad se mantuvo alta en pacientes con tumores pequeños (70%) en comparación con tumores grandes (82%) y era similar para los diferentes tumores en fase de Dukes (tabla 2). Aún más importante, se observó una sensibilidad similar en la detección de tumores localizados en tractos de colon ascendentes y descendentes. 20
Tabla 1. Sensibilidad y especificidad de análisis de ADN-LF
- Niveles de ADN
- DONADORES SANOS PACIENTES
- Corte (ng)
- Positivo Negativo Positivo Negativo Sensibilidad % I.C. 95% Especificidad % I.C. 95%
- 15
- 10 49 70 15 82 (74-90) 83 (73-93)
- 20
- 7 52 70 15 82 (74-90) 88 (80-96)
- 25
- 4 55 65 20 76 (67-85) 93 (86-100)
- 30
- 3 56 61 24 72 (62-82) 95 (89-100)
Tabla 2. Sensibilidad* como una función de diferentes características en cáncer colorrectal
- Categoría
- Nº pacientes POSITIVO NEGATIVO SENSIBILIDAD %
- Tamaño (cm) 0,1 - 4,0 ≥ 4,1 Fase de Duke A B C
- 40 38 8 29 37 28 31 7 25 25 12 7 1 4 12 70 82 88 86 68
- D LOCALIZACIÓN Ascendente Transverso Descendente Recto
- 9 18 2 30 35 8 13 2 22 28 1 5 0 8 7 89 72 100 73 80
- * Valor de corte 25 ng
REFERENCIAS
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> ISTITUTO ONCOLOGICO RAMAGNOLO COOPERATIVA SOCIALE A R.L.
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE TUMORES COLORECTALES
<130> 6988MEUR 15
<160> 16
<170> Patentin versión 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> ADN 20
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 1
ctcttcctgc agtactcccc tgc 23 25
<210> 2
<211> 23
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 30
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 2
gccccagctg ctcaccatcg cta 23
<210> 3
<211> 24 35
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 3 40
gattgctctt aggtctggcc cctc 24
<210> 4
<211> 24
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 4 5
ggccactgac aaccaccctt aacc 24
<210> 5
<211> 24
<212> ADN
<213> Desconocido 10
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 5
gcgttgtctc ctaggttggc tctg 24
<210> 6 15
<211> 23
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético 20
<400> 6
caagtggctc ctgacctgga gtc 23
<210> 7
<211> 25
<212> ADN 25
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 7
acctgatttc cttactgcct ctggc 25 30
<210> 8
<211> 25
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 35
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 8
gtcctgcttg cttacctcgc ttagt 25
<210> 9
<211> 20 40
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 9
aactaccatc cagcaacaga 20
<210> 10 5
<211> 20
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético 10
<400> 10
taatttggca taaggcatag 20
<210> 11
<211> 20
<212> ADN 15
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 11
cagttgaact ctggaaggca 20 20
<210> 12
<211> 20
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 25
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 12
tgacacaag actggcttac 20
<210> 13
<211> 20 30
<212> ADN
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 13 35
gatgtaatca gacgacacag 20
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Desconocido 40
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 14
ggcaatcgaa cgactctcaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> ADN 5
<213> Desconocido
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 15
cagtgatctt ccagatagcc 20 10
<210> 16
<211> 20
<212> ADN
<213> Desconocido
<220> 15
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 16
aaatggctca tcgaggctca 20
Claims (5)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para la determinación de la presencia de tumores colorectales o lesiones pre-cancerosas en un sujeto humano, que comprende:a) extracción de ADN de muestras de cepas:b) amplificación por PCR de 8 fragmentos de ADN diferentes que se extienden en diferentes regiones de 5 genes p53 y APC, usando deoxinucleótidotrifosfatos o cebadores etiquetados con moléculas fluorescentes,en la que se amplifican fragmentos de p53 que corresponden a exones 5-8 usando los siguientes pares de cebadores:y se amplifican fragmentos APC usando los siguientes pares de cebadores: 10c) cuantificación de los fragmentos amplificados (amplicones);d) cálculo de la cantidad total de diferentes amplicones;e) comparación de los valores obtenidos en (d) con un valor de referencia, en el que el valor de referencia se determina en base a series de casos que comprenden sujetos sanos y pacientes afectados por tumor o 15 lesiones colorrectales.
- 2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dichas moléculas fluorescentes se seleccionan de HEX, 6-FAM y TAMRA.
- 3. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que las cantidades de amplicón se interpolan en una curva de calibración obtenida de cantidades de ADN conocidas. 20
- 4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los amplicones se cuantifican con un secuenciador/analizador automático o usando sistemas de detección fluorimétricos, colorimétricos, radioactivos o espectrofotométricos.
- 5. Un kit que contiene los cebadores de la reivindicación 1 marcados con moléculas fluorescentes de acuerdo con la reivindicación 2, un ADN polimerasa termoestable e instrucciones para el usuario para llevar a cabo el 25 procedimiento de las reivindicaciones 1-4.
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| ITMI03A0434 | 2003-03-07 | ||
| IT000434A ITMI20030434A1 (it) | 2003-03-07 | 2003-03-07 | Metodo per l'individuazione di tumori del colon-retto. |
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|---|---|
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