ES2355588T3

ES2355588T3 - Composiciones para uso en terapia génica para el tratamiento de hemofilia.

Info

Publication number: ES2355588T3
Application number: ES98910320T
Authority: ES
Inventors: Katherine A. High; Roland W. Herzog
Original assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Current assignee: Childrens Hospital of Philadelphia CHOP
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 2011-03-29
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: AU6458698A; EP1005376A1; AU745386B2; JP2001517221A; DE69841982D1; US20110263690A1; CA2283639A1; US20080213222A1; EP1005376B1; JP4289687B2; US7998734B2; WO1998041240A1; EP1005376A4; US6093392A; ATE486614T1

Abstract

Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón 1 de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de terminación de la transcripción.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención es la terapia génica para el tratamiento de enfermedades que implican una deficiencia de proteínas en la circulación sanguínea. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El proceso de coagulación de la sangre implica una serie de proteínas conocidas como proteínas de la coagulación de la sangre que actúan en un modo de cascada para efectuar la formación de un coágulo de sangre. La hemofilia es una enfermedad de los seres humanos y otros mamíferos en la que un gen que codifica un factor de coagulación de la sangre contiene una mutación de forma que la proteína codificada no funciona normalmente en el 10 proceso en cascada. Específicamente, la enfermedad hereditaria, la hemofilia B, se caracteriza por una mutación en el gen que codifica la proteína de la coagulación de la sangre, el factor IX (F.IX). El F.IX se revisa en High y col. (1995, "Factor IX" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.).

Los vectores adenovíricos son muy conocidos en la terapia génica y se han usado para efectuar la expresión de altos niveles de factor IX canino en ratones inmunodeficientes o en ratones inmunocompetentes cuando el virus se 15 administra conjuntamente con agentes inmunodepresores. Si los vectores adenovíricos se administran a ratones inmunocompetentes en ausencia de agentes inmunodepresores, estos vectores inducen una fuerte respuesta inflamatoria y citotóxica en linfocitos T (CTL) (Dai y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1401-1405) que invalida los efectos beneficiosos de la terapia. Además, hay informes que sugieren que la inyección intramuscular de adenovirus defectuosos en la replicación proporciona expresión a largo plazo de un transgén, siempre que el transgén codifique una 20 autoproteína (es decir, una proteína huésped), de forma que se evita una fuerte respuesta inmunitaria del huésped (Tripathy y col., 1996, Nature Med. 2:545-550; Yang y col., 1996, Hum. Mol. Genet. 5:1703-1712). Por tanto, aunque ha habido un progreso significativo en el área de la terapia génica en la expresión in vivo de un transgén seleccionado tras la inyección directa de un vector adenovírico en músculo esquelético, el uso de vectores adenovíricos puede no ser el procedimiento óptimo para la terapia génica en vista de estas consideraciones inmunológicas. 25

También se han usado experimentalmente vectores retrovíricos como modelo para el tratamiento de hemofilia B. Sin embargo, se informa que los niveles de expresión de F.IX de estos vectores son demasiados bajos para ser de valor terapéutico (Kay y col., 1993, Science 262:117-119).

Se ha demostrado que el ADN de plásmido inyectado en músculo de ratón dirige la expresión de eritropoyetina (Epo) (Tripathy y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10876-10880), pero evidentemente este procedimiento de 30 terapia génica no es suficientemente eficaz para la expresión de un producto génico tal como F.IX, que se necesita a niveles relativamente altos en la circulación (en comparación con Epo) para lograr un efecto terapéutico.

El virus adenoasociado (AAV) es un vehículo alternativo a los adenovirus para la administración de genes al músculo. El AAV recombinante (rAAV) no contiene secuencias que codifiquen proteínas víricas y tiene la posibilidad de integrarse en el ADN cromosómico de la célula huésped (Carter, 1992, Curr. Opin. Biotech. 3:533-539; Skulimowski y 35 col., 1995, Method Mol. Genet. 7:7-12). Ahora están disponibles procedimientos de producción y de purificación que facilitan la generación de rAAV puro que no está significativamente contaminado por AAV natural o adenovirus auxiliar (Skulimowski y col., 1995, anteriormente; Fisher y col., 1996, J. Virol. 70:520-532; Samulski y col., 1989, J. Virol. 63:3822-3828). Como se ha observado en este documento, la administración de adenovirus a mamíferos va acompañada de los problemas inmunológicos anteriormente mencionados. 40

Aunque la eficacia de la transducción in vivo con rAAV en ausencia de virus auxiliar es baja para hepatocitos y células epiteliales de las vías respiratorias (Fisher, 1996, anteriormente), ciertas células posmitóticas tales como neuronas (Kaplitt y col., 1994, Nature Genet. 8:148-154) y fibras de músculo esquelético (Xiao y col., J. Virol. 70:8098-8108) pueden transducirse eficazmente con este vector. Se ha informado de la expresión estable de lacZ durante hasta 1,5 años (Xiao y col., anteriormente). A diferencia de los vectores adenovíricos, la inyección intramuscular con rAAV en 45 animales inmunocompetentes no produce una respuesta de CTL contra fibras de músculo transducido, ni son anticuerpos en circulación contra el producto génico lacZ intracelular presente.

La expresión de la proteína secretada, Epo, tras la inyección intramuscular con rAAV se informa en Kessler y col. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14082-14087). Sin embargo, los niveles de expresión de proteína informada fueron de uno a dos órdenes de magnitud por debajo de los requeridos para un efecto terapéutico mediado por F.IX. 50

La terapia actual para la hemofilia implica la inyección intravenosa de una preparación de concentrados de factores de coagulación siempre que se produzca una hemorragia. Este tratamiento es pesado, inconveniente y muy caro. El paciente promedio paga aproximadamente $100.000 por año sólo por el concentrado. Además, debido a que el concentrado sólo se administra al paciente intermitentemente, los pacientes siguen estando en riesgo de hemorragias potencialmente mortales que son mortales si el tratamiento no se administra oportunamente. 55

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 94, 1426-1431, Feb. 1997 desvela vectores AAV que codifican el factor IX. Se obtuvieron niveles en plasma del factor IX del orden de hasta 1 ng/ml tras la administración in vivo del vector.

Hay una necesidad sentida desde hace tiempo y la grave necesidad de procedimientos de administración de F.IX a mamíferos que tienen hemofilia, en particular a seres humanos que tienen hemofilia, de forma que se logre un efecto terapéutico. La presente invención satisface esta necesidad. 5

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Por tanto, se refiere a los siguientes puntos.

1. Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus 10 adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón I de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de terminación de la transcripción.

2. La composición del punto 1, en la que dicha señal de terminación de la transcripción es la señal de 15 terminación de la transcripción de SV40.

3. La composición del punto 1 ó 2 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. La composición de uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en la que la molécula de ADN que codifica el factor IX tiene aproximadamente el 50% de homología con el factor IX humano.

5. Uso de la composición de uno cualquiera de los puntos 1 a 4 para la preparación de una composición 20 farmacéutica para tratar la hemofilia en un mamífero, en el que la composición está adaptada para administrarse a un tejido muscular de dicho mamífero.

6. El uso del punto 5, en el que dicho vector de virus adenoasociado recombinante se administra inyectando dicha composición a múltiples sitios en dicho tejido muscular.

7. El uso de uno cualquiera de los puntos 5 ó 6, en el que dicho vector de adenovirus recombinante se 25 administra a una dosis de entre aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 5 x 1016 genomas de vector vírico por mamífero.

8. El uso de uno cualquiera de los puntos 5, 6 y 7, en el que dicho mamífero es un ser humano.

9. El uso de uno cualquiera de los puntos 5, 6, 7 y 8 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en el que dicha secuencia promotora/reguladora se selecciona del grupo que está constituido por el 30 promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el promotor/potenciador del virus del sarcoma de Rous y un promotor inducible por esteroides.

10. El uso de uno cualquiera de los puntos 5 a 9 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 9, en el que dicha porción de intrón I de un gen del factor IX tiene aproximadamente 1,4 kb.

11. El uso de uno cualquiera de los puntos 5 a 10 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 35 a 4, 9 ó 10, en el que dicho ADN que codifica el factor IX comprende una mutación que convierte el factor IX así codificado en incapaz de unirse a colágeno IV.

12. El uso o una composición del punto 11, en el que dicha mutación en dicho ADN mutado codifica un resto de alanina en lugar de lisina en la quinta posición de aminoácido desde el principio del factor IX maduro.

13. Un kit que incluye la composición descrita en uno cualquiera de los puntos 1 a 4 ó 9 a 12 e instrucciones 40 para usar dicho kit.

La composición de la invención puede comprender adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La secuencia promotora/reguladora puede seleccionarse del grupo que está constituido por el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el promotor de actina de músculo esquelético y el promotor/potenciador de la creatina cinasa de músculo. Adicionalmente, la señal de terminación de la transcripción 45 puede ser la señal de terminación de la transcripción de SV40.

En la invención también se incluye un kit que comprende un vector de la invención e instrucciones para usar el kit.

En la memoria descriptiva también se describe un procedimiento para tratar la hemofilia en un mamífero. El procedimiento comprende administrar a un tejido muscular del mamífero una composición que comprende un vector de 50

virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón I de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en el que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, ADN aislado que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de terminación de la transcripción, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 5

El vector de virus adenoasociado recombinante de la invención puede administrarse inyectando la composición en al menos dos sitios en el tejido muscular.

El vector de virus adenoasociado recombinante puede administrarse inyectando la composición en al menos seis sitios en el tejido muscular.

El vector de adenovirus recombinante puede administrarse a una dosis de entre aproximadamente 1 x 106 a 10 aproximadamente 5 x 1016 genomas de vector vírico por mamífero.

El mamífero puede ser un ser humano y el factor IX puede ser factor IX humano.

La secuencia promotora/reguladora del vector puede seleccionarse del grupo que está constituido por el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el promotor de actina de músculo esquelético y el promotor/potenciador de la creatina cinasa de músculo. El vector de la invención comprende una porción de intrón I de 15 un gen del factor IX. La porción de intrón I de un gen del factor IX tiene de aproximadamente 1,4 kb a aproximadamente 1,7 kb.

El ADN aislado que codifica el factor IX puede comprender una mutación que convierte el factor IX así codificado en incapaz de unirse a colágeno IV.

La mutación en el ADN mutado puede codificar un resto de alanina en lugar de lisina en la quinta posición de 20 aminoácido desde el principio del F.IX maduro. Además, preferentemente, el mamífero es un ser humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una serie de gráficas que representan un análisis de la concentración de F.IX humano (hF.IX) en plasma en ratones experimentales en función del tiempo tras la inyección intramuscular (IM) de los ratones con AAV-hF.IX. Cada línea representa un animal individual. 25

La Figura 1A representa ratones C57BL/6 tras la inyección IM de 2 x 1011 genomas de vector vírico/animal (n=4).

La Figura 1B representa ratones Rag 1 tras la inyección IM de 2 x 1011 genomas de vector vírico/animal (n=4). El ratón o-o murió 5 semanas después de la inyección tras flebotomía traumática.

La Figura 1C representa ratones Rag 1 tras la inyección IM de 1 x 1010 genomas de vector vírico/animal 30 (n=4).

La Figura 2 es una gráfica que representa un estudio de la evolución del tiempo de la cantidad de anticuerpo dirigido contra hF.IX en circulación (plasma) en ratones C57BL/6 tras la inyección IM de 2 x 1011 genomas de vector vírico AAV-hF.IX/animal (n=3). Los niveles de anticuerpo se midieron en un ensayo de ELISA usando anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra 35 hF.IX (Boehringer Mannheim) como patrón. Cada línea representa un animal individual.

La Figura 3 es una imagen de una transferencia de Western que demuestra la presencia de anticuerpos específicos de hF.IX en el plasma de ratones C57BL/6 tras la inyección IM de diversos vectores víricos. La banda 1 representa un animal inyectado IM con AAV-lacZ, con suero extraído en el día 18 después de la inyección. La banda 2 representa un animal inyectado IM 40 con adenovirus recombinante-hF.IX (Walter y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3056-3061), con suero extraído en el día 20 después de la inyección. Las bandas 3-10 representan animales inyectados IM con AAV-hF.IX. Las bandas 3-7 representan el mismo animal analizado en los días 11, 18, 32, 54 y 60 después de la inyección. Las bandas 8-10 representan diferentes animales analizados en el día 18 después de la inyección. 45

La Figura 4 es una serie de imágenes que representan la tinción por inmunofluorescencia (con anticuerpo contra hF.IX) del músculo tibial anterior de ratones C57BL/6. El panel A representa músculo sin inyectar. Los paneles B, C y D representan músculo teñido tres meses después de la inyección con AAV-hF.IX. Se inocularon 3,3 x 1010 genomas de vector vírico por sitio de inyección. El aumento es 200 x. 50

La Figura 5 es una serie de imágenes que representan la tinción por inmunofluorescencia de secciones de músculo del músculo tibial anterior de ratones C57BL/6 inyectados con AAV-hF.IX. El análisis se realizó tres meses tras la inyección. Las secciones de músculo se tiñeron

simultáneamente con anticuerpo conjugado con FITC específico de hF.IX y un complejo de anticuerpo conjugado con rodamina dirigido contra colágeno IV. El panel A representa la fluorescencia de FITC (verde) que muestra la presencia de hF.IX en fibras de músculo y espacios intersticiales. El panel B representa la fluorescencia de rodamina (rojo) que muestra colágeno IV en la matriz extracelular de fibras de músculo. El panel C representa la 5 excitación simultánea de ambas marcas de fluorescencia. Obsérvese la presencia de una señal amarilla en los espacios intersticiales que indican que hF.IX y el colágeno IV ocupan el mismo espacio en el tejido muscular. El aumento es 400 x.

La Figura 6 es un análisis de ADN aislado de músculo inyectado con AAV-hF.IX.

La Figura 6A es un diagrama que representa repeticiones en tándem de cabeza a cola de dos genomas 10 del vector AAV-hF.IX. En la figura se indican secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, promotor/potenciador del CMV (CMV), ADNc de F.IX humano que incluye la secuencia codificante y 228 pb de la región sin traducir de 3', una porción de 1,4 kb del intrón I, señal de poliadenilación del virus simio 40 (SV40) y el sitio de empalme de los dos genomas (J). Se eligió un fragmento EcoRV-EcoRI de 1,2 kb del intrón I y un fragmento BglII 15 de 0,7 kb obtenido del promotor del CMV como sondas para la hibridación por transferencia de Southern. También se muestran las posiciones relativas de los sitios de unión para los cebadores 005 (cebador directo), 013 y 017 (cebadores inversos).

La Figura 6B es una imagen de una análisis de hibridación por transferencia Southern de ADN genómico aislado del músculo de un ratón Rag 1 seis semanas después de la inyección con AAV-20 hF.IX. Un fragmento EcoRV-EcoRI radiactivamente marcado del intrón I de hF.IX sirvió de sonda. La banda 1 representa ADN del plásmido pAAV-FIX. Las bandas 2 y 3 representan ADN aislado de músculo inyectado con AAV-hF.IX. Las bandas 4 y 5 representan ADN aislado de un animal sin inyectar. Las bandas 1, 2 y 4 representan ADN digerido con EcoRV. Las bandas 3 y 5 representan ADN sin digerir. Se añadieron 15 µg de ADN genómico por 25 banda en las bandas 2-5. El ADN se separó sobre un gel de agarosa al 1% antes de transferirlo a una membrana de nailon (Schleicher y Schuell). Los marcadores de tamaño marginal indican fragmentos de escalera de ADN de1 kb.

La Figura 6C es una imagen de hibridación por transferencia Southern de fragmentos de empalme de concatámeros de cabeza a cola de AAV-hF.IX amplificado por PCR. Se muestran productos 30 de PCR amplificados a partir de ADN genómico usando el par de cebadores 005-013 (bandas de número impar) o el par de cebadores 005-017 (bandas de número par). Las bandas 1 y 2 representan un animal sin inyectar. Las bandas 3-6 representan ratones C57BL/6 inyectados IM con AAV-hF.IX. Las bandas 7-10 representan ratones Rag 1 inyectados IM con AAV-hF.IX. Los productos de PCR se obtuvieron a partir de ADN obtenido 35 de ADN de músculo tibial anterior (bandas 3, 4, 7 y 8) o cuádriceps (bandas 5, 6, 9 y 10). Las bandas 11 y 12 representan productos de PCR obtenidos a partir de ADN obtenido de la línea celular, 10-3.AV 5, que contiene al menos dos copias de monómeros de AAV-lacZ integrado dispuesto cabeza a cola. Los productos de PCR se separaron sobre un gel de agarosa al 2% antes de transferirlos a una membrana de nailon. Un fragmento BglII de 0,7 kb 40 obtenido a partir del promotor del CMV sirvió de sonda. El ADN de músculo genómico se aisló seis a ocho semanas después de la inyección.

La Figura 7 es un diagrama de AAV-cF.IX, es decir, F.IX canino en un vector AAV.

La Figura 8 es una serie de gráficas que representan el tiempo de coagulación de la sangre completa (WBCT) en función del tiempo después de la inyección intramuscular de perro B45 con 8 x 45 1011, y perro B46 con 1 x 1013 AAV-cF.IX, respectivamente. Si la muestra de sangre no coaguló completamente dentro de 60 min, el WBCT se indicó como 65 min. Los asteriscos (*) indican coagulación parcial. El WBCT de perros con hemofilia B sin tratar es >60 min (línea de puntos) y de perros normales oscila de 6-8 min (línea discontinua). Las flechas verticales indican tratamiento con plasma normal para episodios de hemorragia. 50

La Figura 9 es una serie de gráficas que representan el tiempo de coagulación por tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) de muestras de plasma obtenido de perros B45 y B46. Perros normales: 13-18 segundos (líneas discontinuas). Perros con hemofilia B sin tratar: 50-80 segundos (líneas de puntos). Las flechas verticales indican tratamiento con plasma normal para la hemorragia. 55

La Figura 10 es una serie de gráficas que representan niveles en plasma de factor IX canino después de la inyección intramuscular de perros B45 y B46 con hemofilia B con 8 x 1011 o 1 x 1013 AAV-cF.IX, respectivamente. Se midieron concentraciones de factor IX canino por ELISA. Las flechas verticales indican tratamiento con plasma normal para la hemorragia. Los elevados

valores en B46 de la semana 9 a la semana 12 son parcialmente debidos a un tratamiento con plasma normal.

La Figura 11 es una serie de imágenes que representan la tinción por inmunofluorescencia para cF.IX en músculo esquelético de perro B45. Panel A: músculo sin inyectar. Paneles B-D: en la semana 7, músculo tibial anterior obtenido de un sitio de inyección de 5 x 1010 AAV-cF.IX. 5

La Figura 12 es un diagrama de AAV-mF.IX, es decir, F.IX de ratón en un vector AAV.

La Figura 13 es una imagen de una transferencia Western para la detección de anticuerpos en plasma de ratón específicos de mF.IX. El mF.IX se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y se incubó en presencia de diversas muestras de plasma de ratón seguido de incubación con anticuerpo dirigido contra IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante y 10 detección por ECL. Banda 1 - Plasma obtenido de ratón con hemofilia B criado en fondo de CD-1 que había desarrollado anticuerpos específicos de hF.IX después de la inyección intravenosa de Ad-hF.IX. Estos anticuerpos reaccionaron de forma cruzada con el factor IX murino. Bandas 2-10 - Plasma obtenido de ratones inyectados intramuscularmente con AAV-mF.IX. Bandas 2-4 - Ratones BALB/c. Bandas 5-7 - Ratones C57BL/6. Bandas 8-10 - 15 Ratones CD-1. Todas las muestras se obtuvieron a partir de ratones en el día 60 después de la inyección.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en el descubrimiento de que la administración de hF.IX al tejido muscular de un mamífero usando un vector rAAV de la invención como vehículo de administración de genes produce expresión a largo plazo de 20 hF.IX a niveles terapéuticos en el tejido muscular. La proteína expresada persiste en el plasma del mamífero durante largos periodos de tiempo y, por tanto, es de enorme beneficio terapéutico para un mamífero que tiene hemofilia B.

La divulgación no se limita únicamente a la administración de F.IX para el tratamiento de hemofilia B. Más bien se describen vectores AAV que codifican otros factores de coagulación de la sangre, factores que pueden administrarse usando los procedimientos que se han desvelado en este documento a las células de un mamífero que tiene hemofilia 25 para el tratamiento de hemofilia. Por tanto, se describe: administración del factor VIII a un mamífero para el tratamiento de hemofilia A (Tuddenham, 1995, "Factor VIII" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.); administración del factor VII para el tratamiento de deficiencia del factor VII (Petersen y col., 1995, "Factor VII" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.); administración del factor X para el tratamiento de deficiencia del factor X (Watzke y col., "Factor X" 1995, en: Molecular 30 Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.); administración del factor XI para el tratamiento de deficiencia del factor XI (Fujikawa y col., 1995, "Factor XI" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.); administración del factor XIII para el tratamiento de deficiencia del factor XIII (Lai y col., 1995, "Factor XIII" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.); y administración de proteína C para el tratamiento de deficiencia de la proteína C (Suzuki, 1995, 35 "Protein C" en: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, High y Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.).

La administración de cada una de las proteínas anteriormente citadas a las células de un mamífero se lleva a cabo generando primero un vector AAV que comprende ADN que codifica la proteína deseada y luego administrar el vector al mamífero. Por tanto, se describen vectores AAV que comprenden ADN que codifica uno cualquier del factor XI, factor VIII, factor X, factor VII, factor XI, factor XIII o la proteína C. La generación de vectores AAV que comprenden ADN 40 que codifica estas proteínas será evidente para el experto.

Además, no sólo se describe un vector rAAV que comprende un ADN aislado que codifica una proteína de la coagulación de la sangre.

Más bien se describen vectores rAAV que comprenden ADN que codifica otras proteínas, ADN que se administra preferentemente al tejido muscular de un mamífero. Por tanto, se describe ADN que codifica productos 45 génicos que son útiles para el tratamiento de otros estados de enfermedad en un mamífero. Tal ADN y estados asociados de enfermedad incluyen, pero no se limitan a: ADN que codifica glucosa-6-fosfatasa asociado a deficiencia del almacenamiento de glucógeno de tipo 1A; ADN que codifica fosfoenolpiruvato-carboxicinasa asociado a deficiencia de Pepck; ADN que codifica galactosa-1 fosfato uridil transferasa asociado a galactosemia; ADN que codifica fenilalanina hidroxilasa asociado a fenilcetonuria; ADN que codifica -cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada asociado a 50 enfermedad de la orina de jarabe de arce; ADN que codifica fumarilacetoacetato hidrolasa asociado a tirosinemia tipo 1; ADN que codifica metilmalonil-CoA mutasa asociado a acidemia metilmalónica; ADN que codifica acil CoA deshidrogenasa de cadena media asociado a deficiencia de acetil CoA de cadena media; ADN que codifica ornitina transcarbamilasa asociado a deficiencia de ornitina transcarbamilasa; ADN que codifica ácido argininosuccínico sintetasa asociado a citrulinemia; ADN que codifica proteína receptora de lipoproteína de baja densidad asociado a 55 hipercolesterolemia familiar; ADN que codifica UDP-glucuronosiltransferasa asociado a enfermedad de Crigler-Najjar; ADN que codifica adenosina desaminasa asociado a enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; ADN que codifica hipoxantina guanina fosforibosil transferasa asociado a síndrome de Gout y Lesch-Nyan; ADN que codifica

biotinidasa asociado a deficiencia de biotinidasa; ADN que codifica -glucocerebrosidasa asociado a enfermedad de Gaucher; ADN que codifica -glucuronidasa asociado a síndrome de Sly; ADN que codifica proteína de la membrana del peroxisoma de 70 kDa asociado a síndrome de Zellweger; ADN que codifica porfobilinógeno desaminasa asociado a porfiria intermitente aguda; ADN que codifica antitripsina 1 para el tratamiento de deficiencia de -1-antitripsina (enfisema); ADN que codifica eritropoyetina para el tratamiento de anemia debido a talasemia o a insuficiencia renal; y 5 ADN que codifica insulina para el tratamiento de diabetes. Tales ADN y sus enfermedades asociadas se revisan en Kay y col. (1994, T.I.G. 10:253-257) y en Parker Ponder (1996, "Gene Therapy for Blood Protein Deficiencies" en: Gene Transfer in Cardiovascular Biology: Experimental Approaches and Therapeutic Implications" Eds. Keith March).

Con los fines de ilustrar la invención, la siguiente discusión se refiere al factor IX como la proteína que va a administrarse al tejido muscular de un mamífero. 10

La invención se basa parcialmente en el descubrimiento de que la inyección del vector rAAV que codifica hF.IX de la invención en múltiples sitios en el tejido muscular de un mamífero produce expresión a largo plazo de alto nivel de hF.IX en el mamífero, proporcionando así un beneficio terapéutico para el mamífero.

La invención se basa parcialmente en el descubrimiento adicional de que hF.IX se une a colágeno IV en los espacios intersticiales en tejido muscular de mamífero. La administración de formas mutantes de hF.IX al tejido muscular 15 de un mamífero mediante el vector rAAV de la invención, cuyas formas mutantes no se unen a colágeno IV, también sirve para proporcionar un beneficio terapéutico a un mamífero que tiene hemofilia.

Se describe un vector rAAV que comprende un ADN aislado que codifica F.IX, o un fragmento biológicamente activo del mismo, para uso en el tratamiento de hemofilia.

También se describe en la memoria descriptiva un procedimiento para tratar un mamífero, preferentemente un 20 ser humano, que tiene hemofilia B. El procedimiento comprende administrar al tejido muscular del mamífero el vector rAAV de la invención.

El vector rAAV de la invención comprende varios elementos de ADN esenciales. Estos elementos de ADN incluyen al menos dos copias de una secuencia ITR de AAV, un elemento promotor/potenciador, una señal de terminación de la transcripción, cualquier región sin traducir en 5' o 3' necesaria que flanquea ADN que codifica F.IX o un 25 fragmento biológicamente activo del mismo. El vector rAAV de la invención también incluye una porción de intrón I. Por tanto, opcionalmente, el vector rAAV de la invención comprende ADN que codifica un F.IX que contiene una mutación de forma que la unión del F.IX mutado al colágeno se reduzca sustancialmente o se elimine completamente. Estos elementos se describen ahora en detalle.

El vector puede comprender una secuencia promotora/reguladora que comprende un promotor promiscuo que 30 puede accionar la expresión de un gen heterólogo a altos niveles en muchos tipos de células diferentes. Tales promotores incluyen, pero no se limitan a, las secuencias del promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), las secuencias del promotor/potenciador del virus del sarcoma de Rous y similares. Preferentemente, la secuencia promotora/reguladora en el vector rAAV de la invención es el promotor/potenciador temprano inmediato del CMV. Sin embargo, la secuencia promotora usada para accionar la expresión del gen heterólogo 35 también puede ser un promotor inducible, por ejemplo, pero no se limita a, un promotor inducible por esteroides, o puede ser un promotor específico de tejido tal como, pero no se limita a, el promotor de -actina esquelético que es específico de tejido muscular y el promotor/potenciador de la creatina cinasa de músculo, y similares.

Como se usa en este documento, el término "secuencia promotora/reguladora" significa una secuencia de ADN que se requiere para la expresión de un gen operativamente ligado a la secuencia promotora/reguladora. En algunos 40 casos, esta secuencia puede ser la secuencia promotora núcleo y en otros casos esta secuencia también puede incluir una secuencia potenciadora y otros elementos reguladores que se requieren para la expresión del gen de un modo inducible/represible o específico de tejido.

Describiendo dos ADN como que están "operativamente ligados" como se usa en este documento se indica que un ADN monocatenario o bicatenario comprende cada uno de los dos ADN y que los dos ADN están dispuestos 45 dentro del ADN de tal forma que al menos una de las secuencias del ADN pueda ejercer un efecto fisiológico por el que se caracteriza sobre el otro.

El vector rAAV de la invención también comprende una señal de terminación de la transcripción. Aunque se describe que cualquier señal de terminación de la transcripción puede incluirse en el vector que se describe en este documento, la señal de terminación de la transcripción es preferentemente la señal de terminación de la transcripción de 50 SV40.

El vector también incluye una porción de intrón I. Cuando se hace referencia a la secuencia de hF.IX, el intrón I es un fragmento de ADN que incluye el extremo 5' del intrón hasta el primer sitio PvuII (en el número de nucleótido 1098) y el extremo 3' del intrón empezando en el sitio PvuII en el número de nucleótido 5882 y que se extiende hasta el empalme con el exón 2 (Yoshitake y col., 1985, Biochemistry 24:3736-3750; Kurachi y col., 1995, J. Biol. Chem. 55 270:5276-5281; Jallat y col., 1990, EMBO J. 9:3295-3301).

La inclusión de un elemento de intrón en un plásmido o vector vírico que codifica F.IX puede potenciar la expresión de F.IX 2 a 10 veces en comparación con la expresión de F.IX sobre un molde de plásmido o vírico en ausencia del elemento de intrón (Kurachi y col., 1995, anteriormente). Los vectores AAV normalmente aceptan insertos de ADN que tienen un intervalo de tamaño definido que es generalmente aproximadamente 4 kb a aproximadamente 4,8 kb, y la región codificante del gen F.IX comprende aproximadamente 1,5 kb. Por tanto, es necesario incluir ADN adicional 5 en el fragmento de inserto con el fin de lograr la longitud requerida de ADN que es aceptable para el vector AAV. El fragmento del intrón I de F.IX satisface este requisito, a la vez que también intensifica la expresión de F.IX posicionado en el fondo de un genoma de vector AAV. No sólo se describe en la memoria descriptiva que las secuencias del intrón I están incluidas en el vector rAAV, sino que también se describe la inclusión de otras secuencias de intrón o de otro fragmento de ADN en lugar de porciones del intrón I. 10

Por el término "una porción de intrón I" como se usa en la invención se indica una región de intrón I que tiene una longitud de nucleótido de aproximadamente 1,4 kb a aproximadamente 1,7 kb, región que potencia la expresión de F.IX al menos 1,5 veces en un molde de plásmido o de vector vírico cuando se compara con la expresión de F.IX en ausencia de una porción de intrón I. Preferentemente, la porción de intrón I útil en la presente invención tiene aproximadamente 1,4 kb de longitud. 15

El vector rAAV de la invención también comprende regiones de ADN sin traducir en 5' y 3' que flanquean la secuencia de ADN del hF.IX. En el vector rAAV-hF.IX ejemplificado en la sección de ejemplos experimentales, la región sin traducir en 5' que flanquea las secuencias de hF.IX es del siguiente modo: en el extremo 5' de las secuencias de F.IX, la secuencia potenciadora del promotor del CMV continúa, en su extremo 3', hasta un sitio KpnI que tiene la secuencia GGTACC. Una secuencia de poliligador corta sigue directamente aguas abajo de esta región, que tiene la secuencia 20 AGATCTCCACC [SEQ ID:1], que a su vez es seguida directamente aguas abajo por la secuencia de hF.IX que empieza en el número de aminoácido -46, para el cual el codón es ATG según el sistema de numeración referido en Yoshitake y col. (1985, anteriormente).

En el vector rAAV-hF.IX ejemplificado en la sección de detalles experimentales, la región sin traducir en 3' que flanquea las secuencias de hF.IX es del siguiente modo: al final de la señal de terminación de la traducción están 25 presentes los primeros 228 nucleótidos de la secuencia sin traducir en 3' de hF.IX que se cortan y se empalman a las secuencias señal de poli A de SV40.

Se apreciará que pueden usarse otras regiones sin traducir en 5' y 3' de ADN en lugar de aquellas citadas en el caso de hF.IX, particularmente cuando el ADN que codifica proteínas distintas de hF.IX se usa en el vector rAAV como se describe en este documento. El vector rAAV de la invención comprende ADN aislado que codifica F.IX, o un 30 fragmento biológicamente activo de F.IX. Aunque el ADN que codifica F.IX es preferentemente hF.IX, la invención deberá interpretarse en principio para incluir todas las secuencias de F.IX de mamífero que son tanto conocidas como desconocidas. Ejemplos de secuencias de F.IX se citan en los siguientes artículos: Yoshitake y col., 1985, anteriormente; Kurachi y col., 1995, anteriormente; Jallat y col., 1990, anteriormente; Kurachi y col., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6461-6464; Jaye y col., 1983, Nucl. Acids Res. 11:2325-2335; Anson y col., 1984, EMBO J. 3: 1053-1060; Wu y col., 35 1990, Gene 86:275-278; Evans y col., 1989, Blood 74:207-212; Pendurthi y col., 1992, Thromb. Res. 65:177-186; Sakar y col., 1990, Genomics 1990, 6:133-143; y Katayama y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4990-4994. Por tanto, la invención deberá interpretarse para incluir genes F.IX de mamíferos distintos de seres humanos, F.IX que funcionan de un modo sustancialmente similar a los hF.IX descritos en este documento. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos que comprende el gen que codifica F.IX tiene aproximadamente el 50% de homología, más preferentemente 40 aproximadamente el 70% de homología, incluso más preferentemente aproximadamente el 80% de homología y lo más preferentemente aproximadamente el 90% de homología con el gen que codifica hF.IX descrito en este documento y cuya secuencia se proporciona en Yoshitake y col. (1985, anteriormente).

El uso del término "ADN que codifica" deberá interpretarse para incluir la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada y cualquier región sin traducir en 5' o 3' necesaria que acompaña la secuencia codificante real. 45

Además, la invención deberá interpretarse para incluir variantes que se producen naturalmente o mutantes recombinantemente derivados de secuencias de ADN de hF.IX, variantes o mutantes que convierten la proteína así codificada tanto en hF.IX terapéuticamente eficaz como de longitud completa, o incluso hF.IX más terapéuticamente eficaz que de longitud completa.

Por ejemplo, como será evidente a partir de los experimentos descritos en este documento, el colágeno IV sirve 50 para atrapar hF.IX que se introduce en el tejido muscular de un mamífero mediante un vector rAAV. Por tanto, algo del hF.IX así introducido no está disponible para la participación en la coagulación de la sangre debido a que es retenido en los espacios intersticiales en el tejido muscular por el colágeno IV. Es posible introducir una mutación en la secuencia de ADN del hF.IX de forma que la proteína así codificada no se una a colágeno IV. Tales mutantes son útiles en los procedimientos de terapia génica de la invención para el tratamiento de hemofilia porque codifican una forma de hF.IX 55 que no es atrapada en los espacios intersticiales del tejido muscular. Preferentemente, un gen hF.IX mutante que codifica una proteína hF.IX que comprende el aminoácido alanina en lugar de lisina en la quinta posición de aminoácido desde el principio de la proteína madura es útil en el vector rAAV de la invención para reducir o eliminar la unión de hF.IX a colágeno IV.

También se describe ADN que codifica variantes de hF.IX que retienen la actividad biológica de hF.IX. Tales variantes, es decir, análogos de proteínas o polipéptidos de hF.IX, incluyen proteínas o polipéptidos que han sido modificados o pueden modificarse usando tecnología de ADN recombinante de forma que la proteína o polipéptido posea propiedades adicionales que potencian su idoneidad para uso en los procedimientos descritos en este documento, por ejemplo, pero no se limitan a, variantes que confieren estabilidad potenciada a la proteína en plasma y actividad 5 específica potenciada de la proteína.

Los análogos pueden diferenciarse de las proteínas o péptidos que se producen naturalmente mediante diferencias de secuencias de aminoácidos conservativos o mediante modificaciones que no afectan la secuencia, o por ambos. Por ejemplo, pueden hacerse cambios de aminoácidos conservativos que, aunque alteran la secuencia primaria de la proteína o péptido, normalmente no alteran su función. Las sustituciones de aminoácidos conservativos 10 normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos:

glicina, alanina;

valina, isoleucina, leucina;

ácido aspártico, ácido glutámico;

asparagina, glutamina; 15

serina, treonina;

lisina, arginina;

fenilalanina, tirosina.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de un análogo de hF.IX tiene aproximadamente el 70% de homología, más preferentemente aproximadamente el 80% de homología, incluso más preferentemente 20 aproximadamente el 90% de homología, más preferentemente aproximadamente el 95% de homología y lo más preferentemente al menos aproximadamente el 99% de homología con la secuencia de aminoácidos de hF.IX descrita en Yoshitake y col., 1985, (anteriormente).

"Homólogo" como se usa en este documento se refiere a la similitud de secuencias de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácidos nucleicos, por ejemplo, dos moléculas de ADN o dos 25 moléculas de ARN, o entre dos moléculas de polipéptidos. Si una posición de subunidad en cualquiera de las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de apareamientos o posiciones homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en secuencias de dos 30 compuestos son homólogas, entonces las dos secuencias tienen el 50% de homología, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, están apareadas o son homólogas, las dos secuencias comparten el 90% de homología. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 3' ATTGCC 5' y 3' TATGCG 5' comparten el 50% de homología.

Pueden usarse distintos procedimientos para la generación de formas mutantes o variantes de F.IX. Por ejemplo, la generación de formas mutantes de hF.IX que no se unen a colágeno IV puede llevarse a cabo introduciendo 35 mutaciones por deleción, sustitución o inserción en un gen de F.IX que reside en un molde de plásmido usando metodología de ADN recombinante ordinaria descrita en cualquier manual de biología molecular, por ejemplo, descrita en Sambrook y col. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY). El F.IX mutante así generado se expresa y la proteína resultante se evalúa para su capacidad para unirse a colágeno IV en un ensayo de unión a colágeno IV tal como el descrito, por ejemplo, en Cheung y col. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11068-11073). 40 Entonces, las proteínas mutantes que no se unen a colágeno IV se prueban para la actividad biológica de F.IX como se define en este documento. El ADN que codifica una proteína F.IX mutada que no se une a colágeno IV, pero que retiene la actividad biológica de F.IX, es adecuada para uso en el vector rAAV de la invención.

Los procedimientos para la introducción de cambios de aminoácidos en una proteína o polipéptido alterando la secuencia de ADN que codifica el polipéptido son muy conocidos en la técnica y también se describen en Sambrook y 45 col. (1989, anteriormente).

Un "ácido nucleico aislado" como se usa en este documento se refiere a una secuencia, segmento o fragmento de ácidos nucleicos que ha sido separado de las secuencias que lo flanquean en un estado que se produce naturalmente, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido eliminado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento, por ejemplo, las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se producen 50 naturalmente. El término también se aplica a ácidos nucleicos que han sido sustancialmente purificados a partir de otros componentes que acompañan naturalmente al ácido nucleico, por ejemplo, ARN o ADN o proteínas que lo acompañan naturalmente en la célula. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que está incorporado en un vector; en un plásmido o virus que se replica autónomamente; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe como una molécula separada (por ejemplo, como un ADNc o un fragmento de ADNc o genómico producido por 55

PCR o digestión por enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia de polipéptidos adicional.

Por "F.IX biológicamente activo" como se usa en este documento se indica una proteína F.IX que puede mediar en la coagulación de la sangre en un ensayo de coagulación de la sangre. Los ensayos de coagulación de la sangre son muy conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Walter y col. (1996, anteriormente) y en Hathaway y 5 Goodnight (1993, Laboratory Measurement of Hemostasis and Thrombosis en: Disorders of Hemostasis and Thrombosis: A Clinical Guide, pág. 21-29).

Por "efecto terapéutico" como se usa en este documento con referencia a F.IX se indica la coagulación de la sangre en el mamífero después de una hemorragia.

La invención no se limita al vector rAAV específico ejemplificado en los ejemplos experimentales que ilustran la 10 invención; más bien, la invención deberá interpretarse para incluir cualquier vector AAV adecuado que incluye, pero no se limita a, vectores basados en AAV-1, AAV-3, AAV-4 y AAV-6, y similares.

En la memoria descriptiva también se describe un procedimiento para tratar un mamífero que tiene hemofilia en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto terapéutico de mediación en la coagulación de la sangre en un ensayo de coagulación de la sangre. El procedimiento comprende administrar al mamífero un vector rAAV que comprende F.IX. 15 Preferentemente, el mamífero es un ser humano y el vector rAAV comprende hF.IX que opcionalmente comprende una mutación de forma que el aminoácido número cinco (numerado desde el principio de la proteína madura) es una alanina en lugar de una lisina.

Por consiguiente, se ha descubierto que hay varios procedimientos para tratar un mamífero que tiene hemofilia. En un procedimiento como se describe en este documento, una preparación de vector rAAV que comprende F.IX se 20 inyecta en el tejido muscular de un animal en un único sitio por dosis y también se describe una preparación de rAAV que se inyecta en el tejido muscular del animal tanto simultáneamente como durante el transcurso de varias horas, en múltiples sitios de tejido muscular. En el último caso, cuando el procedimiento comprende la inyección múltiple simultánea de genomas de vector vírico, se prevé que pueda usarse un dispositivo de inyección de administración múltiple de forma que diferentes áreas de tejido muscular reciban el vector rAAV simultáneamente. 25

Normalmente, el número de genomas de vector vírico/mamífero que se administran en una única inyección oscila de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 5 x 1016. Preferentemente, el número de genomas de vector vírico/mamífero que se administran en una única inyección es de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1015; más preferentemente, el número de genomas de vector vírico/mamífero que se administran en una única inyección es de aproximadamente 5 x 1011 a aproximadamente 5 x 1015; y lo más preferentemente, el número de genomas de 30 vector vírico que se administran al mamífero en una única inyección es de aproximadamente 5 x 1013 a aproximadamente 5 x 1014.

Si el procedimiento que se describe en la memoria descriptiva comprende inyecciones simultáneas a múltiples sitios, o varias inyecciones a múltiples sitios que comprenden inyecciones a diferentes sitios del músculo durante un periodo de varias horas (por ejemplo, de aproximadamente menos de una hora a aproximadamente dos o tres horas), el 35 número total de genomas de vector vírico administrado es idéntico al citado en el procedimiento de inyección de un único sitio.

Se describe que para la administración del vector rAAV en una inyección a un único sitio, una suspensión de virus se inyecta directamente en el músculo.

Para inyección a múltiples sitios, una aguja se inserta en el tejido muscular del mamífero. El vector se inyecta 40 esencialmente continuamente a lo lago de la pista de la aguja de manera que con cada inyección se inyecta una serie de sitios intramusculares, estando por tanto cada sitio en otra posición en el tejido muscular distinta del sitio previo. Cada inyección elegirá como diana de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 sitios a lo lago de la pista de la aguja y los pacientes recibirán aproximadamente 50 inyecciones en conjunto. Por tanto, el procedimiento está relacionado con un procedimiento de acupuntura que se lleva a cabo preferentemente bajo anestesia. 45

La inyección a múltiples sitios de rAAV también puede llevarse a cabo usando un dispositivo de múltiples inyecciones tal como el comúnmente usado para la detección de infección por tuberculosis.

Para la administración al mamífero, el vector rAAV que comprende F.IX se suspende en un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina tamponada con HEPES a un pH de aproximadamente 7,8. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables que son útiles incluyen, pero no se limitan a, glicerina, agua, solución 50 salina, etanol y otras disoluciones de sales farmacéuticamente aceptables tales como fosfatos y sales de ácidos orgánicos. Ejemplos de estos y otros vehículos farmacéuticamente aceptables se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (1991, Mack Publication Co., Nueva Yérsey).

El vector rAAV de la invención puede proporcionarse en forma de un kit, comprendiendo el kit, por ejemplo, una preparación liofilizada de vector en una formulación de sal seca, agua estéril para la suspensión de la composición de 55 vector/sal e instrucciones para la suspensión del vector y administración del mismo al mamífero.

La invención se describe adicionalmente en detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos experimentales, excepto los Ejemplos 2 y 3. Los ejemplos no pretenden ser limitantes.

Ejemplo 1: Transferencia y expresión de genes estables del factor de coagulación de la sangre IX humano después de la inyección intramuscular de virus adenoasociados recombinantes

Los experimentos presentados en este ejemplo pueden resumirse del siguiente modo. Los siguientes 5 experimentos se realizaron para determinar si la inyección intramuscular de un vector AAV recombinante (rAAV) que expresa F.IX humano podría dirigir la expresión de niveles terapéuticos de F.IX humano. Se preparó alto título (1012-1013 genomas de vector/ml) de rAAV que expresaba hF.IX, se purificó y se inyectó en los músculos de las extremidades traseras de ratones C57BL/6 y ratones Rag 1. En los ratones C57B/6 inmunocompetentes, la tinción inmunofluorescente de músculo recogido tres meses después de la inyección demostró la presencia de proteína hF.IX, y el análisis por PCR 10 de ADN de músculo fue positivo para ADN de AAV, pero no se detectó hF.IX en plasma de ratón. Además, se observó que estos ratones desarrollaron anticuerpos en circulación para hF.IX. En experimentos de seguimiento en ratones Rag 1 que tienen una mutación en el gen activador de la recombinasa y, por tanto, carecen de células B y T funcionales, se observaron resultados similares tras el análisis de ADN de músculo, pero estos ratones también demostraron niveles terapéuticos (200-350 ng/ml) de hF.IX en el plasma. El transcurso de tiempo de la expresión de hF.IX demuestra que los 15 niveles aumentan gradualmente durante un periodo de varias semanas antes de alcanzar una meseta que es estable aproximadamente 6 meses después de la inyección inicial. En otros experimentos se observó la colocalización de hF.IX y colágeno IV en espacios intersticiales entre fibras de músculo. El colágeno IV se ha identificado como una proteína de unión a hF.IX. Por tanto, este hallazgo explica el patrón inusual de tinción por inmunofluorescencia para hF.IX. Estos experimentos demuestran que rAAV puede usarse para dirigir la expresión estable de niveles terapéuticos de hF.IX 20 después de la inyección intramuscular y es una estrategia factible para el tratamiento de pacientes que tienen hemofilia B.

Ahora se describen los materiales y procedimientos usados en los experimentos presentados en este ejemplo.

Producción y purificación de rAAV

Se generó AAV recombinante por transfección simultánea de un plásmido cis de F.IX (pAAV-FIX) y el plásmido 25 de acción trans pAAV/Ad (Skulimowski y col., 1995, anteriormente) en células de riñón embrionario humano (293) infectadas con un adenovirus delecionado en E1 como se describe por Fisher y col. (1996, anteriormente). pAAV-FIX se derivó de psub201 (Skulimowski y col., 1995, anteriormente) y contiene el promotor/potenciador del CMV, la secuencia codificante de F.IX humano que incluye el fragmento de 1,4 kb del intrón 1 (Kurachi y col., 1995, anteriormente) y la señal de poliadenilación de SV40 flanqueada por secuencias de ITR de AAV. Las funciones génicas rep y cap de AAV se 30 suministraron en trans por pAAV/Ad. El adenovirus delecionado en E1 contiene un gen indicador lacZ o fosfatasa alcalina para facilitar la identificación de cualquier posible contaminación de cepas de rAAV con virus auxiliar. Las células se lisaron 48 horas después de la transfección por sonicación, y las partículas víricas liberadas se purificaron por cuatro rondas de centrifugación en gradiente de densidad con CsCl como se describe por Fisher y col. (1996, anteriormente).

Las partículas de AAV-hF.IX tenían una densidad de 1,37-1,40 g/ml. El título del AAV-hF.IX purificado se 35 determinó por hibridación por inmunotransferencia en hendidura usando una sonda específica tanto para el promotor del CMV como para las secuencias del intrón I. Los controles comprenden patrones de ADN del plásmido pAAV-hF.IX de concentración conocida. La capacidad de AAV-hF.IX para traducir células in vitro se confirmó transduciendo células HeLa en crecimiento y midiendo la concentración de hF.IX en el sobrenadante de cultivo 36 horas después de la infección con un ELISA específico de hF.IX (Walter y col., 1996, anteriormente). Se almacenó AAV-hF.IX (1012-1013 40 genomas/ml) a -79ºC en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,8, que incluía glicerina al 5%.

El AAV-hF.IX purificado careció rutinariamente de cantidades detectables de adenovirus contaminante cuando se analizó por transducción de células 293 seguido por tinción con fosfatasa alcalina o -galactosidasa como se describe por Fisher y col. (1996, anteriormente). El AAV natural se detectó a < 1 unidad de infección por 109 genomas de AAV-hF.IX. 45

El ensayo para AAV natural fue del siguiente modo: células 293 cultivadas en portaobjetos de cámara se infectaron simultáneamente con adenovirus y con alícuotas de AAV-hF.IX purificado. Las células se fijaron para la tinción por inmunofluorescencia 24 horas después de la infección. Un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra proteínas de la cápside de AAV (American Research Products, Belmont, MA) sirvió de anticuerpo primario, y anticuerpo dirigido contra IgG de ratón (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) en una dilución de 1:40 sirvió de anticuerpo secundario. 50

Experimentos en animales

Las cepas de ratón seleccionadas para la inyección intramuscular con rAAV fueron C57BL/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) y B6, 129 y Rag 1 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Se anestesiaron ratones hembra (4-6 semanas) con una inyección intraperitoneal de ketamina (70 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y se hizo una incisión longitudinal de 1 cm en la extremidad inferior. Se inyectó AAV-hF.IX (2 x 1011 o 1 x 1010 genomas de vector 55 vírico/animal en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,8) en el músculo tibial anterior (25 µl) y el cuádriceps (50 µl) de cada pata usando una jeringuilla de Hamilton. Las incisiones se cerraron con sutura Vicryl 4-0. Se recogieron muestras de sangre a intervalos de siete días del plexo retro-orbital en tubos capilares para microhematocrito y el plasma

se ensayó para hF.IX por ELISA. Para la tinción por inmunofluorescencia y el análisis de ADN los animales se sacrificaron en momentos de tiempo seleccionados y se extirpó tejido muscular inyectado y no inyectado. El tejido se colocó en compuesto de incorporación O.C.T. (Miles Corporation, Elkart, Indiana), se congeló criogénicamente en isopentano enfriado en nitrógeno líquido durante siete segundos e inmediatamente se transfirió a nitrógeno líquido.

Ensayos para hF.IX 5

El antígeno de F.IX humano en plasma de ratón se evaluó por ELISA como se describe por Walter y col. (1996, anteriormente). Este ELISA no reacciona de forma cruzada con F.IX de ratón. Todas las muestras se evaluaron por duplicado. Se prepararon extractos de proteínas obtenidos de músculo de ratón inyectado por maceración de músculo en leupeptina que contenía PBS (0,5 mg/ml) seguido de sonicación. Los residuos celulares se eliminaron por microcentrifugación y se ensayaron diluciones 1:10 de los extractos de proteínas para hF.IX en el ELISA. Los extractos 10 obtenidos de músculo inyectado con AAV-lacZ se usaron como controles negativos. Las concentraciones de proteína se determinaron en un ensayo de proteínas BIORAD (Bio-Rad, Hercules, CA).

Tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejido

Las criosecciones de tejido muscular (6 µg) se fijaron durante 15 minutos en paraformaldehído al 3% en PBS, pH 7,4, se aclararon en PBS durante 5 minutos, se incubaron en metanol durante 10 minutos, se lavaron tres veces en 15 PBS y luego se bloquearon en PBS/BSA al 3% durante 1 hora.

Las secciones de tejido se incubaron durante la noche en presencia de un anticuerpo de cabra dirigido contra F.IX humano purificado por afinidad (Affinity Biologicals, Hamilton, Ontario, Canadá) que se diluyó 1:1000 en PBS/BSA al 1%. Después de tres lavados de 10 minutos cada uno en PBS/BSA al 1%, el anticuerpo secundario se aplicó durante 90 minutos. Esta preparación de anticuerpo comprendía anticuerpo de conejo dirigido contra IgG de cabra conjugada con 20 FITC (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) diluida 1:200 en PBS/BSA al 1%. Después de tres lavados adicionales en PBS/BSA al 1%, las secciones se aclararon en agua destilada, se secaron al aire y se montaron con medio de montaje Fluoromount G (Fisher Scientific). Todas las etapas de incubación se realizaron a temperatura ambiente, excepto la incubación con el anticuerpo primario que se realizó a 4ºC. El mismo protocolo se aplicó cuando las secciones se tiñeron con anticuerpo de conejo dirigido contra colágeno IV humano como anticuerpo primario (Chemicon, Temecula, CA) en 25 una dilución 1:500 y anticuerpo dirigido contra IgG de conejo conjugada con FITC como anticuerpo secundario.

Para los estudios de localización simultánea, un anticuerpo de cabra dirigido contra hF.IX conjugado con FITC (Affinity Biologicals) se aplicó simultáneamente con el anticuerpo dirigido contra colágeno IV. El anticuerpo dirigido contra IgG de conejo conjugada con rodamina (Chemicon) se usó para detectar complejos de colágeno IV-anticuerpo. La microscopía de fluorescencia se realizó con un microscopio Nikon FXA. 30

Pruebas para anticuerpo dirigido contra hF.IX en circulación

Se probaron muestras de plasma de ratones C57BL/6 que se inyectaron IM con AAV-hF.IX para la presencia de anticuerpos contra hF.IX usando un ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación con hF.IX (1 µg/ml en NaHCO3 0,1 M, pH 9,2). Se aplicaron muestras de plasma diluidas (1:16) por duplicado, y los anticuerpos reactivos con hF.IX se detectaron usando anticuerpo dirigido contra IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Zymed, San 35 Francisco, CA) a una dilución de 1:2000. Las condiciones de tampón fueron como se describen (Walter y col., 1996, anteriormente). Los niveles de anticuerpo dirigido contra hF.IX se estimaron comparando los valores de absorbancia del anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra hF.IX (Boehringer Mannheim) diluido a una concentración final de 1 µg/ml.

La presencia de anticuerpo dirigido contra hF.IX también se evaluó por análisis de transferencia Western. Éstos se realizaron como se describe por Dai y col. (1995, anteriormente), excepto que se usó un anticuerpo de cabra dirigido 40 contra IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Boehringer Mannheim) como anticuerpo secundario, facilitándose así la detección de complejos de hF.IX-anticuerpo con reactivo de quimioluminiscencia (ECL) potenciada (Amersham, MA). Las muestras de plasma de ratón se diluyeron 1:500.

Análisis de ADN

Se aisló ADN genómico de tejido muscular inyectado como se describe en Sambrook y col. (1989, 45 anteriormente). Las reacciones de PCR se realizaron con el fin de amplificar los empalmes de cabeza a cola de repeticiones en tándem de rAAV. El cebador directo 005 (5'-ATAAGCTGCAATAAACAAGT-3' [SEQ ID:2]) se hibrida con la señal de poliadenilación de SV40 (posición de pb 8014-8033) y los cebadores inversos 013 (5'-CATGGTAATAGCGATGACTA-3' [SEQ ID:3]) y 017 (5'-GCTCTGCTTATATAGACCTC-3' [SEQ ID:4]) se hibridan con el promotor del CMV (posición de pb 4625-4606 y 4828-4809). Las reacciones de PCR se realizaron usando 100 ng de 50 ADN genómico en un volumen de reacción total de 100 µl que incluye MgCl2 1,5 mM y 0,5 µM del par de cebadores 005/013 ó 005/017. Tras una etapa de desnaturalización inicial (94ºC durante cuatro minutos) se llevaron a cabo 35 ciclos del siguiente perfil: desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 52ºC durante 1 minuto, extensión a 72ºC durante 90 segundos (10 minutos durante el ciclo final). Los productos de PCR se clonaron para el análisis de secuencias de ADN usando el kit de clonación T/A (Invitrogen, San Diego, CA). Las hibridaciones por transferencia de 55 Southern se realizaron usando sondas marcadas cebadas al azar con 32P-dCTP específicas para el promotor del CMV (para la hibridación con fragmentos de PCR) o para el intrón I de hF.IX como se presenta en AAV-hF.IX (para la

hibridación con ADN genómico de ratón).

Ahora se describen los resultados de los experimentos presentados en este ejemplo.

Expresión de hF.IX en ratones inmunocompetentes

El vector AAV recombinante que se eligió para los experimentos in vivo contiene el ADNc del F.IX humano, que incluye una parte del intrón I, bajo el control de la transcripción del promotor/potenciador del gen temprano inmediato del 5 CMV y la señal de terminación de la transcripción de SV40. Este casete de expresión está flanqueado por secuencias de ITR de AAV y carece completamente de secuencias codificantes de proteínas AAV.

Tras la inyección intramuscular de AAV-hF.IX en ratones C57BL/6 inmunocompetentes, el hF.IX se detectó tanto transitoriamente como nada en absoluto en el plasma de animales inyectados (Figura 1 A). Cuando las mismas muestras de plasma se probaron para anticuerpos específicos de hF.IX se observó una fuerte respuesta de anticuerpos 10 en todos los animales inyectados a partir del día 11 después de la inyección (Figuras 2 y 3). Los altos niveles de anticuerpo en circulación persistieron durante la duración del experimento.

Los extractos de proteínas de músculos inyectados (tibial anterior y cuádriceps) de animales sacrificados un mes después de la inyección revelaron la presencia de 1,8-2,1 ng de hF.IX/mg de tejido (40-50 ng de hF.IX/mg de proteína). Este hallazgo, es decir, la presencia de hF.IX en tejidos de músculo como se demuestra por ELISA en 15 extractos de proteína se confirmó por estudios de inmunofluorescencia en secciones de tejido. La Figura 4, paneles B-D, representa la expresión de F.IX humano en las fibras de músculo de ratones C57BL/6 tres meses después de la inyección. Obsérvese que hF.IX está presente no sólo en las propias fibras de músculo, sino que también está presente en los espacios intersticiales entre las fibras en los que parece acumularse.

El patrón de tinción intersticial anteriormente descrito de hF.IX en tejido muscular fue idéntico al observado en el 20 mismo tejido usando un anticuerpo policlonal específico de colágeno IV humano (Figura 5, panel B). La colocalización de la tinción del anticuerpo contra hF.IX y colágeno IV se confirmó en un experimento de tinción simultáneo usando dos marcas de fluorescencia diferentes (Figura 5, panel C). Se ha informado que el colágeno IV se une a hF.IX in vitro (Cheung y col., 1996, anteriormente). El factor IX no se detectó en músculo sin inyectar (Figura 4, panel A), ni se detectó en músculo inyectado con AAV-lacZ. 25

No se observó inflamación ni la lesión de tejido extendida, como se describe para músculo esquelético inyectado con adenovirus recombinante, en ninguna de las secciones de tejido tratadas anteriormente ni en secciones analizadas por tinción con hematoxilina-eosina.

Expresión de hF.IX en ratones inmunodeficientes

El AAV-hF.IX también se administró al tejido muscular de ratones Rag 1 usando los procedimientos descritos 30 anteriormente para los ratones C57BL/6. Estos ratones son homocigóticos para una mutación en el gen 1 activador de recombinasa. Por tanto, los ratones Rag 1 son funcionalmente equivalentes a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y no producen células B ni T maduras.

Una dosis de 2 x 1011 genomas de vector vírico por ratón Rag 1 produjo una expresión estable de hF.IX en plasma de ratón (Figura 1B). El F.IX humano fue primero detectable por ELISA en la segunda semana después de la 35 inyección y aumentó gradualmente después de esto. Los niveles en plasma alcanzaron una meseta cinco a siete semanas después de la inyección a una dosis de 200 a 350 ng de hF.IX/ml de plasma de ratón. Este nivel se mantuvo durante la duración del experimento que se prolongó hasta cuatro meses después de la inyección. Cuando se inyectó un total de 1 x 1010 genomas de vector vírico, la expresión de hF.IX se observó que era tres a cuatro veces inferior a la observada tras la inyección de 2 x 1011 genomas; sin embargo, incluso cuando se usó la menor dosis, los niveles 40 terapéuticos (> 100 ng/ml) se alcanzaron en algunos animales (Figura 1 C). Estos resultados establecen el hecho de que es posible administrar menores dosis de AAV-hF.IX a un animal y lograr un efecto terapéutico. Además, los resultados sugieren que cualquier sitio de inyección dado se satura con virus a una dosis umbral dada de virus; la inyección de una cantidad de virus por encima del nivel umbral no efectúa un aumento proporcional en la cantidad de hF.IX en circulación en el plasma. Por tanto, para aumentar la cantidad de hF.IX en circulación en el plasma se prefieren múltiples dosis de 45 cantidades más pequeñas de virus inyectado en diferentes sitios de músculo.

Análisis de ADN introducido en músculo esquelético

Se aisló ADN genómico obtenido de tejido muscular inyectado seis a ocho semanas después de la inyección. La presencia del ADN de vector introducido en el tejido se demostró por digestión del ADN con EcoRV, que libera un fragmento de 1,8 kb de la construcción de vector que incluye toda la secuencia del intrón I de 1,4 kb. Una sonda 50 específica para el intrón I se hibridó con este fragmento (Figura 6B, bandas 2, 3) y no se hibridó de forma cruzada con ADN de ratón obtenido de un animal sin inyectar (bandas 4, 5). El ADN sin digerir (Figura 6B, banda 3) presentó una señal de hibridación en el ADN de alto peso molecular. Además, los cebadores de PCR diseñados para amplificar secuencias de empalme de concatémeros de cabeza a cola de AAV recombinante presente en células transducidas (Figura 4A) amplificaron satisfactoriamente aquellas secuencias en ADN de músculo aislado de tejido transducido con 55 AAV-hF.IX (tibial anterior y cuádriceps de animales inmunodeficientes e inmunocompetentes).

Los productos de PCR se visualizaron por hibridación por transferencia Southern usando una sonda específica para la secuencia del promotor/potenciador del CMV (Figura 6C, bandas 3-10). El par de cebadores 005-013 amplificó fragmentos que tenían 1,0 kb y más pequeños; el par de cebadores 005-017 amplificó fragmentos que tenían 1,2 kb y más pequeños. Como era de esperar, estas reacciones de PCR no generan distintas bandas de los tamaños observados anteriormente, sino que se generó una serie de productos de amplificación que tenían un tamaño máximo. Este resultado 5 era predecible debido a la unión imprecisa de genomas de AAV presentes en estas repeticiones en tándem (McLaughlin y col., 1988, J. Virol. 62:1963-1973). Esta unión imprecisa resulta de deleciones variables de secuencias de ITR en los sitios de empalme como se confirma por la secuenciación de ADN de productos de PCR clonados.

Los datos presentados en este documento tienen varias implicaciones para el desarrollo de protocolos de terapia génica para pacientes con hemofilia B. Primero, los niveles de expresión de hF.IX obtenidos en los experimentos 10 descritos en este documento son adecuados para lograr un efecto terapéutico en seres humanos y únicamente están limitados por la cantidad de rAAV que puede producirse. Segundo, es evidente de estos datos que los múltiples sitios de inyección intramuscular son preferibles a las inyecciones de sitio único. Como el tejido muscular es abundante, no está presente un obstáculo para el tratamiento de pacientes con hemofilia usando vectores AAV.

El transcurso de tiempo de la expresión de hF.IX documentado en este documento es bastante diferente del 15 observado cuando se usan vectores adenovíricos que expresan hF.IX. En el último caso, los niveles terapéuticos de hF.IX se logran casi inmediatamente (Walter y col., 1996, anteriormente; Kay y col., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2353-2357). Sin embargo, las consecuencias inmunológicas de esta solución son no deseables. En el caso de AAV-hF.IX, el aumento gradual en los niveles de hF.IX en plasma durante un periodo de semanas indica que los pacientes deberán continuar preferentemente el uso de concentrados de hF.IX durante el periodo inicial que rodea inmediatamente 20 el tratamiento con vector AAV intramuscular. Esto no es una barrera para el tratamiento. La t1/2 de hF.IX exógenamente administrado es aproximadamente 12 horas; por tanto, los niveles de hF.IX en plasma pueden volver al nivel inicial antes de subir como resultado de la expresión del transgén. Además, la expresión de transgenes introducidos por rAAV en tejido muscular persiste durante largos periodos si no se sobrepasan límites de especies cruzadas (Kessler y col., 1996, anteriormente). Por todos estos motivos, la administración de vectores rAAV que expresan hF.IX a pacientes que tienen 25 hemofilia B es una estrategia viable para el tratamiento de esta enfermedad.

Además de lo anterior, la observación de que hF.IX se localiza simultáneamente con colágeno IV también tiene importantes implicaciones para el tratamiento de pacientes que tienen hemofilia B. Este hallazgo es de interés no sólo porque se refiere al patrón de tinción observado para F.IX, sino también porque probablemente representa los hallazgos previamente informados de baja eficacia de transferencia de F.IX sintetizado por células de músculo en la circulación. Si 30 el colágeno IV en los espacios intersticiales sirve de sitio de unión de alta afinidad para hF.IX, entonces esta área puede en efecto hacer de "sumidero" para hF.IX sintetizado en músculo. Sin embargo, claramente, el atrapamiento de hF.IX en los espacios intersticiales por el colágeno IV no es un obstáculo insalvable para la terapia génica como lo demuestran los experimentos en ratones Rag 1. Además, como se describe en este documento, es posible generar un vector de hF.IX de AAV que codifica hF.IX que comprende una mutación que hace que hF.IX pueda unirse a colágeno IV, venciéndose 35 así este posible inconveniente.

Ejemplo 2: Estudios en perros que tienen hemofilia B (proporcionado sólo para fines de información).

Los experimentos que se presentan en este ejemplo se resumen del siguiente modo.

Perros que tienen una mutación puntual en el dominio catalítico del gen de F.IX que, basándose en estudios de modelado, parece que convierten la proteína en inestable, padecen hemofilia B grave (Evans y col., 1989, Proc. Natl. 40 Acad. Sci. USA 86:10095-10099). Tres de tales perros se inyectaron intramuscularmente con AAV-cF.IX que contenía el gen de F.IX canino (cF.IX). La administración de 8 x 1011 AAV-cF.IX en perro B45 produjo niveles en plasma de F.IX que estaban justo en el umbral de detección (aproximadamente 1-3 ng de F.IX canino/ml de plasma). El tiempo de coagulación de la sangre completa (WBCT) se acortó transitoriamente en diversos momentos de tiempo tras la administración del vector. Empezando 16 semanas después de la inyección se observó la corrección parcial sostenida 45 del WBCT; se ha observado que niveles muy bajos de cF.IX en plasma persisten durante al menos 6 meses. Se realizó la tinción por inmunofluorescencia de secciones obtenidas de músculo obtenido por biopsia y se observó la expresión de cF.IX en las fibras de músculo transducidas. No se obtuvieron pruebas de la producción de anticuerpos específicos de cF.IX cuando se realizó el análisis de transferencia de Western, ELISA o un cribado con inhibidor de la coagulación. La inyección intramuscular de 1 x 1011 AAV-cF.IX en perro B46 produjo niveles en plasma de cF.IX de hasta 50 aproximadamente 17 ng de cF.IX/ml que se observaron 9 semanas después de la inyección. La corrección parcial del WBCT se observó por primera vez 2 semanas después de la inyección y fue estable después de esto. El WBCT más corto en ausencia de tratamiento con plasma normal (16 minutos) se midió en la semana 8. Las mejoras en el tiempo de coagulación se corroboraron por ensayo de aPTT en el que las disminuciones fueron evidentes en la semana 7 después de la inyección. De nuevo, no hubo pruebas de la producción de anticuerpos específicos para cF.IX. A pesar de las 55 mejoras en los parámetros hemostáticos, los niveles de cF.IX logrados hasta la fecha son <1% del normal y, como es lógico, estos perros tratados han experimentado episodios de hemorragia. Se administrarán dosis aumentadas de F.IX a perros para lograr el beneficio terapéutico. En realidad, el perro B48 se inyectó recientemente intramuscularmente con 7 x 1013 AAV-cF.IX y todavía tiene que alcanzar niveles de meseta. Este perro desarrolló un anticuerpo no inhibidor para cF.IX. El anticuerpo se detectó por primera vez 14 días después de la inyección y desapareció 42 días después de la 60 inyección. Coincidente con la desaparición del anticuerpo, el WBCT se acortó en el intervalo de 15-20 minutos, en el que

ha permanecido durante los 45 días siguientes (es decir, un total de 90 días de observación). Actualmente, todos los perros siguen en estudio.

A. Administración intramuscular de F.IX canino en un vector AAV

Vector vírico 5

Se generó AAV-cF.IX como se establece en el diagrama en la Figura 7. El vector contiene repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV que flanquean el siguiente casete de expresión: potenciador/promotor temprano inmediato del citomegalovirus (P[CMV]), donante de corte y empalme del CMV/aceptor de corte y empalme de -globina (glob), ADNc de cF.IX hasta el sitio EcoRI en la posición de nucleótidos 2565 y señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (hGH). 10

Integridad funcional de cF.IX

Se usó la transfección transitoria de células 293 en presencia de vitamina K (6 µg/ml de medio) para demostrar que la construcción de cF.IX dirigió la expresión y la secreción de cF.IX funcional. La presencia de cF.IX se evaluó en medios 96 horas después de la transfección y también se confirmó por un acortamiento del tiempo de coagulación por aPTT de plasma humano deficiente en F.IX después de la adición de medios acondicionados. Las diferentes 15 preparaciones de AAV-cF.IX se compararon mediante la infección de células 293 con números iguales de vector a diversas multiplicidades de infección en presencia o ausencia de adenovirus delecionado en E1. La cantidad de cF.IX producido fue similar para las diferentes preparaciones probadas. Las células 293 transducidas con AAV-cF.IX a una multiplicidad de infección de 4 x 103 en ausencia de adenovirus produjeron 1,2 µg de cF.IX/ml de medio/24 horas. Los miotubos C2C12 murinos diferenciados en una placa de 24 pocillos transducidos con 9 x 109 AAV-cF.IX por pocillo 20 produjeron 30-80 ng de cF.IX/ml de medio/24 horas cuando se ensayaron 8-15 días después de la infección.

Perros con hemofilia B

Una colonia de perros que tienen hemofilia B grave que comprende machos que son hemicigóticos y hembras que son homocigóticas para una mutación puntual en el dominio catalítico del gen del factor IX canino se ha mantenido durante más de dos décadas en la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill (Evans y col., 1989, Blood 74:207-212). 25 Los parámetros hemostáticos de estos perros se describen muy bien e incluyen la ausencia de antígeno de F.IX en plasma, tiempos de coagulación de la sangre completa de > 60 minutos, mientras que los perros normales tienen 6-8 minutos, y un tiempo de tromboplastina parcial activado prolongado de 50-80 segundos, mientras que los perros normales tienen 13-18 segundos. Estos perros experimentan hemorragias espontáneas recurrentes. Normalmente, los episodios de hemorragia significativos se controlan satisfactoriamente por la infusión intravenosa única de 10 ml/kg de 30 plasma canino normal; ocasionalmente se requieren infusiones repetidas para controlar la hemorragia.

Inyección intramuscular

Bajo anestesia general, perros macho (B45 y B46) con hemofilia B y un perro B48 hembra con hemofilia, todos compañeros de camada, se inyectaron percutáneamente con AAV-cF.IX. A los animales no se les administró plasma canino normal durante el procedimiento. 35

Tabla 1

: Perro B45 Perro B46 Perro B48

Fecha de nacimiento: 04-21-97 04-21-97 04-21-97

Fecha de administración: 06-20-97 08-18-97 12-5-97

Peso en el momento de la administración: 5,68 kg 9,1 kg 20 kg

AAV-cF.IX inyectado total: Aproximadamente 8x1011 inyectado bajo orientación por ultrasonidos Aproximadamente 1x1013 Aproximadamente 7x1013

Número de sitios inyectados: 18 (5 sitios en vasto lateral, 4 sitios en tibial anterior, cada extremidad trasera) 8 sitios (2 sitios en vasto lateral, 2 sitios en tibial anterior, cada extremidad trasera) 60 sitios

: Algunas inyecciones incluyeron partículas de carbono para la posterior visualización y biopsia de sitios de inyección Algunas inyecciones incluyeron partículas de carbono para la posterior visualización y biopsia de sitios de inyección

Concentración de vector por sitio de inyección (aproximada): 5x1010 en 250 µl 1,3x1012 en 375 µl 1,2x1012 en 300 µl

Análisis de muestras de sangre

El tiempo de coagulación de la sangre completa (WBCT) se evaluó como si fuera ELISA para cF.IX en plasma. El ELISA es sensible a 3 ng/ml. Los anticuerpos específicos de cF.IX se ensayaron por ELISA y transferencia Western. Se midió el tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT). También se realizó un cribado de inhibidores de la 5 coagulación. Se mezclaron el plasma obtenido de un perro hemofílico tratado y de un perro normal en volúmenes iguales y se incubaron durante 2 horas a 37ºC. El cribado de inhibidores se puntuó como positivo si el tiempo de coagulación por aPTT era 3 segundos más largo que el de los controles (plasma de perro normal incubado con tampón imidazol y plasma de perro hemofílico con pretratamiento incubado con plasma de perro normal). Se evaluó el título de anticuerpos neutralizantes contra el vector AAV. 10

Tinción por inmunofluorescencia

El músculo obtenido por biopsia obtenido del perro B45 se colocó en Optimal Cutting TemperatureTM (OCT) (Tissue-TeK®) OCT 4583 Compound, Sakura Finetek, Torrance CA) en un criovial, se congeló criogénicamente en 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líquido durante 7-10 segundos y luego se transfirió inmediatamente a nitrógeno líquido y posteriormente se guardó a -80ºC. Las criosecciones de músculo congelado se tiñeron como se describe en este 15 documento usando anticuerpo de conejo dirigido contra cF.IX a una dilución 1:100 (Affinity Biologicals) como anticuerpo primario y anticuerpo de cerdo dirigido contra IgG de conejo conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluida 1:30 (Dako Corp.) como anticuerpo secundario. Las criosecciones también se usaron para tinción con hematoxilina y eosina (H&E).

Diseminación de vectores 20

Se tomaron exudados y las muestras se resuspendieron en medio de cultivo de tejido. Las muestras de exudados fueron: lacrimal, nasal, rectal, saliva y orina. También se extrajo una muestra de suero. Las muestras se concentraron a un volumen final de 200 µl usando viales Centricon-100, y el ADN se extrajo usando el kit de sangre Qiamp (Qiagen). El ADN se eluyó en 200 µl de TE y se usaron 10 µl para la amplificación por PCR usando el kit de PCR AmpliTaq (Perkin Elmer) en un volumen final de 50 µl. Los cebadores de PCR fueron del siguiente modo: cebador en la 25 dirección 5’, 5'-ATA GCA GCT ACA ATC CAG CTA CCA TTC TGC-3' [SEQ ID:5] basado en secuencias en el ADNc de cF.IX, y cebador en la dirección 3’, 5'-TGG TAT CCC GTA GTA CAG GAA CAA ACC ACC-3' [SEQ ID:6] derivado de secuencias del aceptor de corte y empalme de -globina. El producto de PCR amplificado por estos cebadores tenía 698 pb. Después de 2 minutos de desnaturalización a 95ºC se realizaron 40 ciclos de 95ºC/60ºC/72ºC durante 30 segundos/30 segundos/ 1 minuto, respectivamente, y se siguieron de incubación a 72ºC durante 7 minutos. Los 30 productos de PCR se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio.

Ahora se describen los resultados de los experimentos presentados en este documento.

La inyección intramuscular (IM) del perro B45 con 8x1011 AAV-cF.IX produjo efectos incoherentes con los parámetros hemostáticos. Los tiempos de coagulación de la sangre completa (WBCT) fueron variables, oscilando intermitentemente de aproximadamente 20 minutos a >60 minutos (Figura 8). Los tiempos de tromboplastina parcial activados (aPTT) fueron superiores a 50 segundos, excepto para un único valor a las 3 semanas que era 48 segundos (Figura 9). Los niveles de cF.IX como se evaluaron por ELISA estuvieron en el umbral de detección (1-3 ng/ml) 5 empezando 3 semanas después de la inyección del vector (Figura 10). Se realizó una biopsia de músculo de un sitio de inyección 7 semanas después de la administración y confirmó la producción intramuscular de cF.IX por tinción por inmunofluorescencia específica (Figura 11). La hemorragia precedente a la biopsia se controló satisfactoriamente mediante tratamiento con plasma canino normal administrado en los días 46 y 47. Empezando 16 semanas después de la inyección se observó la corrección parcial sostenida del WBCT. 10

Tras la administración IM de una mayor dosis de AAV-cF.IX (1 x 1013), el perro B46 presentó una mejora significativa en los parámetros hemostáticos que guardaron relación con un aumento sostenido en los niveles en plasma de cF.IX por ELISA. El WBCT fue coherentemente inferior a 20 minutos comenzado 2 semanas tras la administración del vector y alcanzó un punto más bajo de 16 minutos en la semana 12 después de la inyección del vector (Figura 8). El tiempo de tromboplastina parcial activado (aPTT) disminuyó a 43 segundos en la semana 7 y luego aumentó (Figura 9). 15 La concentración de antígeno de cF.IX en plasma evaluada por ELISA aumentó durante las 9 primeras semanas tras la inyección para alcanzar un nivel de aproximadamente 17 ng/ml (Figura 10). Durante la semana 10, este perro tuvo un episodio de hemorragia en la región escapular derecha que se resolvió después de infusiones repetidas de plasma canino normal. Los mayores valores de cF.IX en el periodo de 3 semanas tras la hemorragia son probablemente debidos a las infusiones de plasma (Figura 10). 20

El perro B48 recibió la mayor dosis intramuscular de AAV-cF.IX (7 x 1013). Este perro sangró de un sitio de inyección tras la administración del vector y recibió plasma canino normal en el día 4. Los datos disponibles en la semana 4 tras la inyección (un momento de tiempo no influido por la infusión de plasma) demostraron una disminución de WBCT (21,5 minutos) y el nivel de factor IX canino de 15 ng/ml. Este perro todavía está en estudio y todavía no ha alcanzado niveles de meseta. Como se observa en este documento, este perro sintetizó transitoriamente anticuerpo no inhibidor 25 para cF.IX.

Los perros B45 y B46 no tuvieron anticuerpos neutralizantes medibles específicos de la cápsida de AAV antes del tratamiento. En cada perro se desarrollaron altos títulos de anticuerpos neutralizantes anti-cápsida de AAV (103-104) 7 días después de la administración del vector y persistieron durante todas los periodos de prueba (durante 17 semanas y 8 semanas para B45 y B46, respectivamente). 30

Los análisis para detectar anticuerpos específicos de cF.IX, que incluyen transferencia Western, ensayos de ELISA y cribados de inhibidores de la coagulación, fueron negativos en las semanas 7, 13, 17 y 20 en el perro B45. El perro de mayor dosis, B46, no tuvo anticuerpos detectables específicos de cF.IX como se mide por ELISA durante la semana 9.

La diseminación de virus como se detecta por PCR fue positiva en el día 1 en muestras de suero, rectales y de 35 saliva obtenidas del perro 845, y a partir del día 1 en suero de perro B46. Todas las otras muestras obtenidas antes del tratamiento y > 1 día después de la inyección fueron negativas.

Tabla 2. Resultados obtenidos de perros que recibieron inyecciones intramusculares

: Perro B45 Perro B46

Historia de hemorragia: La hemorragia tras la biopsia de músculo se trató con plasma normal en los días 46 y 47. Durante la ventana de cobertura de plasma administrado para la hemorragia se obtuvo una biopsia de músculo. Hemorragia del hombro tratada con plasma normal en los días 67, 68, 72, 79 y 80.

WBCT (Fig. 8): En la semana 2, coagulación parcial 15-20 min después de empezar del ensayo, pero no se observó coagulación completa. WBCT posteriores incoherentes, con correcciones parciales (18,3 a 28,5 min) en 8 momentos de tiempo y formación de coágulos incompletos en otros 8 momentos. WBCT acortado en 2 de 8 veces (semanas 8 y 9) debido parcialmente al tratamiento con plasma normal tras la biopsia de músculo y hemorragia (días 46 y 47) >60 min durante la primera semana, acortado coherentemente después de la semana 2. El tiempo más corto en ausencia de tratamiento con plasma normal fue 16 min en la semana 8.

aPTT* (Fig. 9): 48 segundos en la semana 3. Todos los otros valores fueron superiores a 50 segundos, La corrección parcial (43 segundos) se observó por primera vez en la semana 7.

Niveles de antígeno del factor IX canino por ELISA (Fig. 10): Detectables en la semana 3. Los posteriores niveles de antígeno variaron entre 1-4 ng/ml. Detectables a bajos niveles empezando en la semana 1 y aumentaron a 17 ng/ml de plasma en la semana 9.

Cribados de anticuerpos: Se probaron por transferencia Western, ELISA y cribado de inhibidores de la coagulación durante la semana 30. No se encontraron pruebas de anticuerpos contra el factor IX canino. Ninguno detectable por ELISA medido durante la semana 26.

Anticuerpo neutralizante para el cápside de AAV: Ninguno detectable antes del tratamiento. Título de 103 - 104 detectado en la semana 1 después de la inyección y persistente durante al menos 17 semanas. Ninguno detectable antes del tratamiento. Alto título (104) detectado en la semana 1 y persistente durante al menos 8 semanas.

Tinción por inmunofluorescencia (Fig. 11).: Producción de factor IX canino observada en fibras del músculo tibial anterior obtenidas como biopsia en la semana 7t. Por hacer

: Los lisados de proteínas de muestra de músculo se probaron por ELISA y mostraron hasta 1,8 ng de factor IX canino/mg de tejido y hasta 25 ug de factor IX canino/mg de proteína.

Diseminación vírica: Las secuencias de AAV-cF.IX se detectaron en suero en el día 1 (señal fuerte) y muestras rectales y de saliva en el día 1 (señales débiles). No se obtuvieron señales en las muestras de pretratamiento y en muestras a partir del día 4 y las semanas 1, 2, 3 y 5. Señal de PCR positiva de la muestra de suero del día 1. Las muestras tomadas antes de la inyección y en el día 4 y en las semanas 1 y 2 fueron negativas

La hemorragia se resolvió siguiendo el tratamiento con plasma canino normal. * Perros normales: 13,5-17 segundos. Perros hemofílicos sin tratar: 50-80 segundos t Se encontraron partículas de carbono coinyectadas con vector AAV en portaobjetos teñidos con H&E de secciones seriadas.

Los datos presentados en este ejemplo demuestran que los perros que tienen hemofilia B pueden sintetizar niveles en plasma sostenidos de cF.IX tras una única administración intramuscular de AAV-cF.IX. Los niveles de cF.IX sistémicos a largo plazo (>4 meses) se asociaron a mejoras moderadas en parámetros hemostáticos. Sin embargo, los

perros tratados experimentaron hemorragias espontáneas que indican que estos niveles fueron subterapéuticos. El transcurso de tiempo prolongado hacia niveles de meseta en el perro B46 y la sugerencia de una respuesta a dosis en estos perros demuestra una similitud entre los modelos caninos y murinos. El F.IX que es secretado por el músculo canino transducido es biológicamente activo basándose en el acortamiento de WBCT y aPTT. En resumen, la administración intramuscular de AAV-cF.IX en estos perros con hemofilia B fue bien tolerada. 5

B. Administración a la vena porta de cF.IX en un vector de AAV

Vector vírico

Se generó AAV-EF1-cF.IX usando tecnología de biología molecular común. El vector contiene un fragmento de 2,5 kb del gen del factor 1 de elongación humana (EF1) que incluye el potenciador, promotor, primer exón y primer 10 intrón, y una porción de la región no codificante del exón 2. El promotor de EF1 se eligió debido a que los vectores que lo contienen presentan un aumento de la expresión transgénica tras la administración a la vena porta. Esta región de EF1 está posicionada en la dirección 5’ del ADNc de cF.IX (hasta el sitio EcoRI en el nt 1731) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (hGH). Todo el casete de expresión está flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV. La integridad funcional de este vector se demostró por análisis de ELISA 15 de F.IX producido en células 293.

Administración a la vena porta

El abdomen del perro B44 hemofílico se abrió asépticamente y quirúrgicamente bajo anestesia general y se administró una única infusión de 3 x 1012 AAV-EF1-cF.IX en la vena porta. Este animal se protegió de hemorragia en el periodo perioperatorio mediante administración intravenosa de plasma canino normal. El perro se sedó, se entubó para 20 inducir anestesia general y el abdomen se afeitó y se preparó quirúrgicamente. Después de abrirse el abdomen, el bazo se movió en el campo operatorio. Se localizó la vena esplénica y se colocó una sutura sin apretar proximal a una pequeña incisión distal en la vena. Rápidamente se introdujo un introductor en la vena, entonces la sutura se aflojó y se enroscó una cánula 5F en una localización intravenosa próxima a la bifurcación de la vena porta. Después de asegurarse la hemostasis e inflarse el globo para catéter se infundieron aproximadamente 5,0 ml de vector diluido en PBS en la vena 25 porta durante un intervalo de 5 minutos. La infusión de vector se siguió de una infusión de 5,0 ml de solución salina. Entonces, el globo se desinfló, la cánula se sacó y se aseguró la hemostasis venosa. Entonces, el bazo se sustituyó, los vasos de la hemorragia se cauterizaron y la herida operatoria se cerró. El animal se extubó habiendo tolerado bien el procedimiento quirúrgico.

Las muestras de sangre se analizaron como se describe en este documento para inyecciones intramusculares. 30

No se detectaron pruebas de F.IX en circulación por ELISA y ningún efecto sobre parámetros hemostáticos fue evidente durante los 4 meses después de la inyección del animal.

No fueron evidentes signos clínicos de toxicidad aguda o crónica tras la administración del vector al animal, que indica que la inyección intravascular de este vector es bien tolerada, y aparentemente no tóxica. No se detectaron 35 inhibidores.

Ejemplo 3: Ausencia de inhibidores en ratones tras la inyección intramuscular de AAV-mF.IX (proporcionado sólo para fines de información).

La administración de AAV-hF.IX intramuscularmente a un mamífero va acompañada del posible riesgo de desarrollo de inhibidores para F.IX en el mamífero. El sitio normal de la síntesis de F.IX es el hígado. Una inquietud válida 40 para cualquier solución basándose en la expresión en un sitio ectópico es si la biosíntesis producirá algún cambio en la proteína que la convertirá en no funcional o inmunogénica, por ejemplo, mediante alteraciones en el procesamiento postraduccional. Para probar esta posibilidad se administró AAV-F.IX de ratón (mF.IX) al músculo de tres cepas de ratones inmunocompetentes, y los ratones se evaluaron para determinar si se generaron anticuerpos para el producto transgénico autólogo. Se usaron dos procedimientos para demostrar que anticuerpos anti-mF.IX (es decir, inhibidores) no 45 se desarrollan en los ratones. La presencia de anticuerpos para AAV-mF.IX se evaluó por transferencia Western. Los anticuerpos dirigidos contra AAV-mF.IX no se detectaron usando este procedimiento. También se usó un cribado de inhibidores de la coagulación para evaluar si se sintetizaron inhibidores en los ratones y, de nuevo, esta prueba estableció que los inhibidores no se sintetizaron en estos animales. La síntesis de mF.IX en músculo de ratón produjo la producción de una proteína que fue visualizada por el sistema inmunitario como que era una autoproteína. Por tanto, el 50 uso de esta solución, es decir, la administración de F.IX a tejido muscular usando un vector AAV, es un procedimiento clínicamente viable para el tratamiento de hemofilia.

Vectores víricos

AAV-mF.IX (Figura 12) contuvo dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV que flanqueaban el siguiente casete de expresión: el potenciador/promotor temprano inmediato del citomegalovirus (P[CMV]), donante de corte y empalme del CMV/aceptor de corte y empalme de -globina (glob), el ADNc del factor IX murino de 2,7 kb y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana (hGH). El ADNc de mF.IX (Wu y col., 1990, Gene 86:275-278) contuvo varios errores que habían sido introducidos por PCR. Se usó la mutagénesis sitio dirigida para restaurar la 5 secuencia natural, que se confirmó por secuenciación de ADN. Se probó la integridad funcional de mF.IX codificado por el vector transduciendo la línea celular 293 84-31 y evaluando los medios acondicionados que contenían vitamina K usando un ensayo de aPTT. La adición de sobrenadantes obtenidos de células transducidas a plasma deficiente en mF.IX produjo un acortamiento del tiempo de coagulación. Esto no fue el caso cuando se usaron sobrenadantes obtenidos de células de control. 10

Procedimientos en animales

En este estudio se usaron ratones CD-1 hembra de 5 meses inmunocompetentes, ratones C57BL/6 hembra de 5 meses (Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA) y ratones BALB/c macho de 5 semanas (The Jackson Laboratory) (n=3 para cada cepa). Los músculos cuádriceps y tibial anterior de ambas extremidades traseras de los ratones se inyectaron con una dosis total de 1 x 1011 AAV-mF.IX como se describe en este documento. Los compañeros 15 de camada se inyectaron por el mismo procedimiento con 2 x 1010 AAV-hF.IX. La hemorragia retro-orbital se usó para recoger muestras de plasma como se describe (Walter y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3056-3061).

Detección de anticuerpos murinos por análisis de transferencia Western de muestras de plasma

Se realizaron transferencias Western separando 100 ng de hF.IX (Mononine ** factor IX derivado de plasma, Armour) o mF.IX (purificado de medios de cultivo de tejido obtenidos de células 293 establemente transfectadas) en 20 geles de SDS-PAGE seguido de transferencia de las proteínas sobre membrana de Hybond-ECL (Amersham). El bloqueo se llevó a cabo usando BLOTTO (5% de leche en polvo desnatada, Tris-HCl 10 mM, pH 8, CaCl2 0,2 mM, Tween-20 al 0,05%) durante 2 horas. Las muestras de plasma que se diluyeron 1:200 en BLOTTO se incubaron durante 1 hora con las membranas. La IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante diluida 1:1000 en BLOTTO (Boehringer Mannheim) sirvió de anticuerpo secundario. El anti-factor IX se visualizó por detección por ECL y 25 revelado de películas (Amersham). El plasma de control positivo para esta transferencia Western se obtuvo a partir de un ratón con hemofilia B que desarrolló anticuerpos tanto contra mF.IX como contra hF.IX tras la inyección intravenosa de un vector adenovírico que contenía el gen para el factor IX humano (Kung y col., 1998, Blood 91:784-790).

Ensayo de aPTT

Se recogió plasma de ratón en tampón citrato durante la hemorragia de la vena de la cola. Los tiempos de 30 coagulación en el ensayo de aPTT se realizaron mezclando 50 µl de reactivo de aPTT (Organon Teknika, Durham, NC) con 50 µl de plasma murino. La mezcla se incubó a 37ºC durante 3 minutos, y se añadieron 50 µl de CaCl2 25 mM. El tiempo de coagulación se midió usando un fibrómetro (BBL FibroSystem).

Cribado de inhibidores de la coagulación

El plasma obtenido de un ratón inyectado con vector se mezcló con un volumen igual de plasma de murino 35 combinado normal y se incubó durante 2 horas a 37ºC. Se extrajo una alícuota y se mezcló con un reactivo de aPTT. El cribado de inhibidores se puntuó como positivo si el tiempo de coagulación aPTT fue 3 segundos más largo que el del control (plasma normal incubado con tampón imidazol).

Ninguno de los ratones inyectados con AAV-mF.IX desarrolló anticuerpo específico de mF.IX cuando se ensayó 40 por transferencia Western 18 días y 60 días después de la inyección (Figura 13, bandas 2-10). Los tiempos de coagulación por aPTT en muestras de plasma de todos los ratones inyectados con vector estaban dentro del intervalo normal (aproximadamente 25 segundos) cuando se midieron 60 días después de la inyección. Los ensayos de inhibidor en todos los ratones inyectados también demostraron la ausencia de inhibidores. Todos los ratones de control inyectados con AAV-hF.IX desarrollaron anticuerpos específicos para hF.IX dentro de las 2 primeras semanas de inyección, que 45 demuestra la inmunocompetencia de estos animales.

Estos datos confirman que los ratones que se inyectaron con AAV-F.IX no sintetizaron inhibidores dirigidos contra F.IX.

Ejemplo 4: Análisis bioquímico del factor IX humano producido por músculo esquelético

El sitio natural de síntesis de F.IX es dentro de los hepatocitos. La solución experimental descrita en este 50 documento elige como diana los miotubos de músculo esquelético como sitio de producción de F.IX. El F.IX humano se purifica a partir de medio acondicionado de miotubos humanos que se mantienen en cultivo de tejido tras la transfección de las células con AAV-CMV-hF.IX. Los estudios preliminares realizados hasta la fecha demuestran que el F.IX

sintetizado por miotubos se procesa correctamente en estas células en el extremo N, y está -carboxilado. Además, el medio acondicionado corrige el aPTT cuando se añade a plasma deficiente en F.IX humano.

Ejemplo 5: Resumen del protocolo clínico para administración de AAV-hF.IX a seres humanos

Una generación de investigación clínica en pacientes tratados con concentrado de factor de coagulación ha documentado que las elevaciones mínimas en los niveles de factor de coagulación en circulación son suficientes para 5 evitar gran parte de la morbilidad y mortalidad de la enfermedad. Los datos más completos están contenidos en los estudios de profilaxis suecos (Lofqvist y col., 1997, J. Int. Med. 241:395-400) en los que desde 1958 la mayoría de los pacientes con hemofilia en Suecia han sido mantenidos en un tratamiento en el que el factor de coagulación es infundido regularmente en vez de en respuesta a hemorragias. El fin de la terapia génica es mantener niveles coherentes de F.IX que son superiores al 1% de los normales. Por tanto, la terapia génica descrita en este documento como tratamiento 10 para pacientes que tienen hemofilia grave, particularmente hemofilia B, proporciona los beneficios bien documentados de mantener niveles constantes, todavía terapéuticos, de F.IX en la circulación sanguínea de pacientes.

En un estudio clínico de fase I se propone que el ensayo inicial se limite a pacientes que tienen enfermedad grave (es decir, que tienen menos del 1% de niveles en circulación normales de F.IX) que no tienen historia de desarrollo de inhibidores y cuya esperanza de vida está acortada por la enfermedad. 15

Durante el estudio se monitorizará la seguridad del aumento de la dosis entre pacientes de AAV-F.IX administrado intramuscularmente. Se evaluará la toxicidad relacionada con la administración del vector localmente y sistémicamente. Siguiendo los protocolos descritos en este documento, la posible eficacia de cada grupo de dosis se monitorizará midiendo la actividad biológica y fisiológica del producto transgénico. Se realizarán análisis para detectar la presencia del gen de F.IX y la expresión de proteínas en el sitio de inyección. 20

En el estudio inicial se incluirán al menos doce pacientes. Estos pacientes se asignarán cada uno a grupos de tres pacientes, y cada paciente dentro de cada grupo recibirá la misma dosis de AAV-hF.IX. El primer grupo de pacientes recibirá una total dosis basada en resultados de un estudio para determinar la toxicidad en ratas. El estudio de toxicidad en ratas se realiza según protocolos de estudios de toxicidad en animales aceptados antes de la iniciación del ensayo clínico de fase I (Buenas prácticas de laboratorio de la Agencia estadounidense del medicamento como se encuentran 25 en 21 C.F.R. § 58). La dosis inicial en pacientes será al menos 10 veces inferior por kilogramo a la dosis más baja que produce toxicidad inaceptable tras la administración a ratas. Si no se observa toxicidad a la mayor dosis administrada a ratas, la dosis inicial en pacientes humanos será al menos 10 veces inferior a esta mayor dosis. Si no se observa toxicidad limitante de dosis y no hay pruebas de expresión génica en el primer grupo de pacientes y han pasado al menos ocho semanas desde que se trató el último paciente, se tratará un segundo grupo de pacientes a una dosis de un 30 logaritmo superior a la dosis de pacientes del grupo 1 inicial. Si no se observa toxicidad limitante de dosis o expresión, este programa se repetirá hasta que se observe expresión en ausencia de toxicidad limitante de dosis. Después de esto, la dosis se aumentará en incrementos semilogarítmicos hasta que haya pruebas de eficacia biológica y fisiológica en ausencia de toxicidad inaceptable.

Dentro de las dos horas que preceden a la administración de vector, los pacientes se infundirán con una dosis 35 de concentrado de F.IX de coagulación altamente purificado para aumentar el nivel de F.IX en el paciente al 100%. Las inyecciones intramusculares se llevarán a cabo bajo anestesia en forma de sedación consciente según el protocolo del hospital. Se administrará un volumen de 0,5 ml en cada sitio de inyección; la concentración de vector y el número de sitios de inyección variará en relación con la dosis. En los grupos de baja dosis se inyectarán aproximadamente seis sitios, y en el grupo de mayor dosis se inyectarán aproximadamente veinte sitios. Los pacientes se hospitalizarán durante 40 dos a tres días. Los estudios en perros no indican diseminación del vector pasadas 24 horas tras la inyección. Sin embargo, los procedimientos de aislamiento inverso convencionales serán seguidos durante la hospitalización.

En el tratamiento de seguimiento, los pacientes recibirán concentrados de F.IX para lograr niveles del 50% de los normales aproximadamente doce horas después de la inyección de vector, y cada veinticuatro horas después durante tres a siete días dependiendo de la evaluación clínica. 45

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i) SOLICITANTE: High, Katherine A.

Herzog, Roland

(ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA USO EN TERAPIA GÉNICA 50 PARA EL TRATAMIENTO DE HEMOFILIA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

(iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A) DESTINATARIO: PANITCH SCHWARZE JACOBS & NADEL, P.C.

(B) CALLE: ONE COMMERCE SQUARE, 2005 MARKET STREET, 22ND FLOOR

(C) CIUDAD: FILADELFIA

(D) ESTADO: PA

(E) PAÍS: EE.UU.

(F) CÓDIGO POSTAL: 19103-7086 5

(v) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A) TIPO DE MEDIO: Disquete

(B) ORDENADOR: IBM PC compatible

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 10

(vi) DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: todavía no está asignado

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: en la fecha de la presente

(C) CLASIFICACIÓN:

(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: 15

(A) NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/040.711

(B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-MAR-1997

(viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:

(A) NOMBRE: Doyle Leary Ph.D., Kathryn

(B) NÚMERO DE REGISTRO: 36.317 20

(C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 7600-11PC

(ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

(A) TELÉFONO: 215-965-1284

(B) TELEFAX: 215-567-2991

(C) TÉLEX: 831-494 25

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS:

(A) LONGITUD: 11 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: DOBLE 30

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:1:

AGATCTCCAC C

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2: 35

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:2: 5

ATAAGCTGCA ATAAACAAGT

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico 10

(C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:3:

CATGGTAATA GCGATGACTA 15

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS:

(A) LONGITUD: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única 20

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:4:

GCTCTGCTTA TATAGACCTC

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5: 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS:

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal 30

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:5:

ATAGCAGCTA CAATCCAGCT ACCATTCTGC

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIAS: 35

(A) LONGITUD: 30 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucleico

(C) TIPO DE CADENA: única

(D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID NO:6:

TGGTATCCCG TAGTACAGGA ACAAACCACC 5

Claims

REIVIDICACIONES

1. Una composición que comprende una partícula vírica, comprendiendo dicha partícula vírica un vector de virus adenoasociado recombinante que comprende al menos dos repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados, una secuencia promotora/reguladora, una porción de intrón 1 de un gen del factor IX que tiene una longitud de aproximadamente 1,4 a aproximadamente 1,7 kb, en la que dicha región de intrón potencia la expresión del factor IX al menos 1,5 veces, una molécula de ADN que codifica el factor IX y regiones sin traducir en 5' y 3' adjuntas y una señal de 5 terminación de la transcripción.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que dicha señal de terminación de la transcripción es la señal de terminación de la transcripción de SV40.
3. La composición de la reivindicación 1 ó 2 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la molécula de ADN que codifica el 10 factor IX tiene aproximadamente el 50% de homología con el factor IX humano.
5. Uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar la hemofilia en un mamífero en el que la composición está adaptada para administrarse a un tejido muscular de dicho mamífero.
6. El uso de la reivindicación 5, en el que dicho vector de virus adenoasociado recombinante se administra 15 inyectando dicha composición a múltiples sitios en dicho tejido muscular.
7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que dicho vector de adenovirus recombinante se administra a una dosis de entre aproximadamente 1 x 108 y aproximadamente 5 x 1016 genomas de vector vírico por mamífero.
8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 7, en el que dicho mamífero es un ser humano. 20
9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 7 y 8 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en el que dicha secuencia promotora/reguladora se selecciona del grupo que está constituido por el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus, el promotor/potenciador del virus del sarcoma de Rous y un promotor inducible por esteroides.
10. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o la composición de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 4 ó 9, en el que dicha porción de intrón I de un gen del factor IX tiene aproximadamente 1,4 kb.
11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 9 ó 10, en el que dicho ADN que codifica el factor IX comprende una mutación que convierte el factor IX así codificado en incapaz de unirse a colágeno IV.
12. El uso o una composición de la reivindicación 11, en el que dicha mutación en dicho ADN mutado codifica un 30 resto de alanina en lugar de lisina en la quinta posición de aminoácido desde el principio del factor IX maduro.
13. Un kit que incluye la composición descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 9 a 12 e instrucciones para usar dicho kit.