ES2355686T3 - Método de fabricación de tagatosa usando isomerización de galactosa de alto rendimiento. - Google Patents
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Abstract
Un método de fabricación de tagatosa por isomerización de galactosa, que incluye la etapa de añadir borato, caracterizado por que el borato se añade de 1 a 80 moles por 100 moles de galactosa.
Description
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un método de fabricación de tagatosa usando isomerización de galactosa de alto rendimiento, más particularmente a un método para potenciar la velocidad de conversión de isomerización drásticamente, añadiendo 1-80 moles de borato, que se unen 5 específicamente a tagatosa, la cetosa, en la solución de reacción con respecto a 100 moles de galactosa en las condiciones óptimas, y a un método de fabricación de tagatosa con alto rendimiento usando la misma.
Técnica Anterior
Hasta la fecha, la tagatosa se ha preparado a partir de galactosa por síntesis química. De 10 acuerdo con el método convencional de síntesis química, la galactosa se isomeriza en presencia de una sal inorgánica, mediada por hidróxido metálico como catalizador, para formar el intermedio del complejo de hidróxido metálico-tagatosa. El intermedio se neutraliza con ácido para producir tagatosa. Sin embargo, este método convencional de síntesis química es muy complicado en su proceso, e ineficaz, y genera residuos industriales, incluso aunque fuera económico y diera el producto con alto rendimiento. 15
Otro método para producir tagatosa es una conversión mediada por enzimas, en la que aldosa o derivados de aldosa se convierten en cetosa o derivados de cetosa, seguido de la conversión de galactosa en tagatosa usando la enzima. Se sabe que la arabinosa isomerasa que se ha usado para la conversión de L-arabinosa en L-ribulosa puede generar tagatosa usando galactosa como un sustrato in vitro. Por consiguiente, se han presentado muchas arabinosas isomerasas que tienen diferentes orígenes 20 y métodos de fabricación de tagatosa a partir de galactosa usando la misma.
Los métodos para la fabricación de tagatosa se describen adicionalmente en los documentos US 4.273.922, WO 2005/047510, and Yoon et. al., World J. of Microbiology and Biotechnology, Vol. 19, 2003, páginas 47-51.
La isomerización de galactosa a tagatosa es una clase de reacción reversible, que sugiere que la 25 concentración del reactante se equilibra con la concentración del producto. Esta reacción enzimática se caracteriza por que la velocidad de conversión aumenta relativamente en proporción a la temperatura de reacción termodinámicamente. Por lo tanto, el desarrollo de una nueva enzima estable a alta temperatura y el proceso de isomerización usando la misma son factores clave para la conversión mediada por encima usando isomerasa para producir tagatosa. 30
La arabinosa isomerasa convencional originada a partir de E. coli presentaba una velocidad de conversión de tagatosa muy baja a partir de galactosa, que era del 25%, cuando la isomerización se realizaba a 30ºC durante 24 horas. La arabinosa isomerasa originada a partir del microorganismo termófilo Geobacillus stearothermophilus presentaba un 46% de velocidad de conversión a 60ºC, que es una condición de reacción estable de la que se ha informado. Cuando se usó arabinosa isomerasa 35 hipertermófila originada a partir de Thermotoga maritima para la reacción de isomerización a 70ºC y 80ºC, la velocidad de conversión a partir de galactosa a tagatosa era del 50% y 56%, respectivamente (Oh, D.K., Kim, H.J., Ryu, S.A., Kim, P., 2001. Development of an immobilization method of l-arabinose isomerase for industrial production of tagatose. Biotechnol. Lett 23, 1859-1862.; Kim, H. J., Oh, D.K., 2005. Purification and charecterization o fan L-arabinose isomerase from an isolated strain of Geobacillus 40 thermodenitrificans producing d-tagatose, J. Biotech. Nov 4; 120 (2):162-73. Epub 2005 Aug 9.; Lee, D.W., Jang, H.J., Choe, E.A., Kim, B.C., Lee, S.J., Kim, S.B., Hong, Y.H., Pyun, Y.R., 2004. Characterization of a thermostable l-arabinose (d-galactose) isomerase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima. Appl. Environ. Microbiol. 70, 1397-1404.).
La aplicación de la enzima termófila y la reacción a alta temperatura pueden aumentar la 45 velocidad de conversión de galactosa a tagatosa gradualmente. Sin embargo, en general, el pardeamiento de la solución de azúcar a la temperatura de reacción de 70ºC, o mayor, aumenta drásticamente en proporción al aumento de temperatura. Además, los subproductos generados por dicha reacción a alta temperatura tienen una mala influencia sobre la pureza del producto final y los costes de purificación. Por lo tanto, el aumento de la temperatura de reacción está limitado. De esta manera, la mejor temperatura de 50 reacción aplicable parece ser 70ºC y la máxima velocidad de conversión de isomerización a esa temperatura es del 56%. Hasta ahora, no se ha obtenido una velocidad de conversión mayor.
Descripción de la invención
De esta manera, los presentes inventores completaron esta invención confirmando que el método de fabricación de tagatosa usando isomerización de galactosa que incluye la etapa de añadir borato, que se une específicamente a la tagatosa, da un mayor rendimiento que el método convencional.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de fabricación de tagatosa, 5 mediante isomerización de galactosa, usando una isomerasa termófila y células hospedadoras que la contienen, más particularmente un método para potenciar la velocidad de conversión de la isomerización añadiendo borato que se une específicamente a tagatosa, y un método de fabricación de tagatosa con alto rendimiento usando la misma.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para potenciar artificialmente la 10 velocidad de conversión de isomerización, añadiendo una cantidad apropiada de borato y realizando la isomerización a alta temperatura en condiciones que inducen la unión selectiva del borato a tagatosa.
Para conseguir los objetos anteriores, los presentes inventores aumentaron la velocidad de conversión drásticamente añadiendo borato, que se une específicamente a tagatosa, para producir tagatosa a partir de galactosa usando arabinosa isomerasa originada de microorganismos termófilos o 15 hipertermófilos, y se confirmó adicionalmente que la tagatosa podía producirse eficazmente a partir de galactosa usando el método con alto rendimiento.
La presente invención se describe en detalle en lo sucesivo en este documento.
La arabinosa isomerasa de este documento puede originarse a partir de diversos microorganismos termófilos, incluyendo microorganismos Geobacillus sp., Thermotoga sp., Thermus sp., 20 etc., aunque no siempre están limitados a éstos. Las arabinosas isomerasas originadas a partir de diferentes cepas pueden aplicarse en diferentes condiciones de reacción, siempre y cuando las condiciones estén dentro de sus condiciones de reacción óptimas propias (temperatura, pH). De esta manera, cada isomerización realizada en dicha condiciones se incluye en los criterios de la invención.
La sal que es capaz de unirse específicamente a la tagatosa en este documento es borato. El 25 borato usado en la presente invención se unió a tagatosa bastante más específicamente que a galactosa (Figura 1). La adición de borato induce la isomerización de galactosa mucho más eficaz que el método convencional sin usar borato y, como resultado, se transfiere el equilibrio de fases entre el sustrato y el reactivo.
El efecto de una sal de la invención no está limitado a borato y puede usarse cualquier otra sal 30 que se una específicamente a tagatosa, es decir, el efecto de la invención puede provocarse por diferentes sales en las diferentes condiciones. Por lo tanto, todos los mecanismos de adición de una sal específica a tagatosa para aumentar la velocidad de conversión se incluyen en los criterios de la presente invención.
Breve Descripción de los Dibujos 35
La aplicación de las realizaciones preferidas de la presente invención se entiende mejor con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es un diagrama que ilustra los resultados de TLC (cromatografía en capa fina) realizada después de la reacción de galactosa y tagatosa con borato en las diversas condiciones.
Carril 1, tagatosa 40
Carril 2, galactosa
Carril 3, galactosa + borato
Carril 4, tagatosa + galactosa + borato
Carril 5, tagatosa + galactosa
La Figura 2 es un gráfico que ilustra la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa 45 dependiente del pH, con y sin adición de borato, en el que la mayor velocidad de conversión se consideró como 100 y los valores relativos se calcularon. • indica el resultado de la relación en presencia de borato 20 mM y O indica el resultado de la reacción en ausencia de borato,
La Figura 3 es un gráfico que ilustra la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa dependiente de la temperatura, con y sin la adición de borato, en la que la mayor velocidad de conversión se consideró como 100 y los valores relativos se calcularon. • indica el resultado de la reacción en presencia de borato 20 mM, y O indica el resultado de la reacción en ausencia de borato.
La Figura 4 es un gráfico que ilustra las velocidades de conversión de acuerdo con las diferentes 5 condiciones, en las que se añade borato a diferentes proporciones molares a sustratos altamente concentrados (100 g/l, 200 g/l y 300 g/l).
La Figura 5 es un gráfico que ilustra los resultados de la reacción de isomerización para producir tagatosa, realizada en solución de sustrato que contenía 300 g/l de galactosa (sustrato:borato = 100:40, proporción molar), en presencia y ausencia de borato. • indica el resultado de la reacción en presencia de 10 borato 640 mM, y O indica el resultado de la reacción en ausencia de borato. ■ y □ indican la galactosa consumida y la tagatosa generada, respectivamente.
Mejor Modo para Realizar la Invención
Las realizaciones prácticas actualmente preferidas de la presente invención son ilustrativas, como se muestra en los siguientes Ejemplos. 15
Sin embargo, se apreciará que los expertos en la materia, al considerar esta descripción, pueden hacer modificaciones y mejoras dentro del espíritu y alcance de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Capacidad de unión de borato a sustrato y producto
Para investigar la interacción de las dos fuentes de azúcar, galactosa y tagatosa, presentes en el 20 producto de isomerización con borato, cada fuente de azúcar se añadió en tampón borato, seguido de comparación. La galactosa, tagatosa y la mezcla de las mismas (1:1) se prepararon a 100 mM cada una. 1 ml de la fuente de azúcar se mezcló con 1 ml de tampón borato 100 mM (pH 9,5), que permaneció a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después se procedió a TLC (cromatografía de capa fina). Se cargaron 50 µl de cada producto de reacción en una placa de TLC, que se secó y desarrolló en una 25 solución de acetonitrilo al 85%. El desarrollo de color se realizó para analizar el resultado y, en ese momento, el agente colorante se preparó con 95% de metano, 5% de ácido sulfúrico y 0,3% de N-1-naftiletilendiamina. Como resultado, se encontró que el borato se unía específicamente a tagatosa y este resultado se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 2: Expresión de arabinosa isomerasa termófila 30
Para realizar la isomerización de galactosa para producir tagatosa a partir de galactosa a alta temperatura, se usó el gen de arabinosa isomerasa originado a partir del microorganismo termófilo Geobacillus thermodenitrificans. Basándose en los datos previos, el gen mutante en el que los aminoácidos 450 (cisteína) y 475 (asparagina) se reemplazan por serina y lisina, se insertó en el vector pTrc99A, que se introdujo en Escherichia coli BL21(DE3, Invitrogen,U.SA.) para la transfección. El 35 transformante se usó como una cepa productora. La cepa recombinante se inoculó en medio LB (Bacto-triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCI 10 g/l) que contenía 50 µg/ml de ampicilina a la concentración primaria de DO600 = 0,1, seguido de cultivo a 37ºC durante 2 horas. Después, se indujo la expresión de la enzima añadiendo IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosidasa) a la concentración final de 1 mM. Para medir la actividad enzimática de la arabinosa isomerasa expresada, las células se recuperaron 40 por centrifugación con la solución de cultivo a 8.000 x g durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,0) y se lisaron por sonificación. El lisado se usó como una solución enzimática bruta para medir la isomerización de galactosa. La actividad de isomerización de galactosa se midió con la mezcla de 100 µl de solución enzimática que contenía galactosa 40 mM como sustrato y 1 ml de tampón de reacción (Tris-HCI 50 mM, pH 7,0). En ese momento, MnCI2 (concentración 45 final: 5 mM) y MgCI2 (concentración final: 1 mM) se añadieron también en la solución de reacción.
Ejemplo 3: Optimización de las condiciones de la reacción enzimática
Para determinar el pH óptimo para la reacción enzimática en presencia de borato, las soluciones de sustrato de reacción se prepararon mezclando galactosa y tampones borato que tenían diferentes pH (pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0). La composición final de la solución madre de sustrato de reacción se equilibró 50 con galactosa 100 mM y borato 20 mM. La enzima purificada se añadió a la solución de sustrato de reacción (4 mg/ml), seguido de reacción a 60ºC que se alcanzó el equilibrio. La velocidad de conversión de sustrato a la que se alcanza el equilibrio se analizó y comparó con el valor relativo (Figura 2).
Como resultado, la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa aumentó mediante la adición de borato. La velocidad de conversión aumentó gradualmente en condiciones alcalinas de pH neutro a pH 8,0 y, después, se reguló a pH 8,5 o superior. En general, la síntesis química es dominante sobre la producción enzimática en condiciones de pH 9,0 o superior. De esta manera, el pH 8,5 al que la 5 actividad enzimática era la mayor y la velocidad de conversión aumentaba más se determinó como pH óptimo para la reacción. Se añadieron 4 mg/ml de solución enzimática bruta al sustrato de reacción óptimo (galactosa 100 mM, borato 20 mM, pH 8,5). La velocidad de conversión se midió con la temperatura de reacción. Los valores relativos se obtuvieron considerando el punto donde la tagatosa se produjo en mayor cantidad como 100 (Figura 3). 10
Como resultado, la mayor velocidad de conversión se obtuvo cuando el borato se añadió a 60ºC.
Ejemplo 4: Optimización de la velocidad de conversión a partir del sustrato altamente concentrado de acuerdo con la proporción molar de borato
Para investigar si la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa aumentaba o no mediante la adición de borato al sustrato de alta concentración y optimizar las condiciones para la reacción, se 15 prepararon soluciones de sustrato de galactosa a diferentes concentraciones (100 g/l, 200 g/l y 300 g/l). La proporción molar de galactosa a borato en cada solución de sustrato era, respectivamente, 100:20, 100:40, 100:60 y 100:80, y la reacción se realizó igualmente a 60ºC a pH 8,5 (Figura 4).
Como resultado, se confirmó que la acción del borato en la isomerización de galactosa a tagatosa no estaba relacionada con la concentración de sustrato, galactosa y la velocidad de conversión 20 aumentó en proporción al aumento de la proporción molar de borato. La proporción molar óptima de galactosa a borato se confirmó que era de 100:40.
Ejemplo 5: Producción de tagatosa en condiciones de reacción óptimas
El resultado del experimento realizado con la adición de borato a la proporción molar optimizada en los ejemplos 1 ∼ 4 se comparó con el resultado del experimento realizado sin borato. Más 25 particularmente, se preparó la solución de sustrato que comprendía 300 g/l de galactosa y borato 640 mM (pH 8,5), a la que se añadieron 30 mg/ml de la solución enzimática bruta, seguido de isomerización a 60ºC (Figura 5).
Con la adición de borato, la velocidad de conversión aumentó drásticamente. Se confirmó que el rendimiento de tagatosa dado a partir del sustrato de galactosa de 300 g/l después de 20 horas de 30 reacción era 158 g/l cuando no se añadió borato y 232 g/l cuando se añadió borato, indicando que la velocidad de conversión de cada grupo era del 52,7% y del 77,3% respectivamente.
Aplicabilidad Industrial
Como se ha explicado anteriormente en este documento, cuando el borato se añadía selectivamente a la isomerización de galactosa para producir tagatosa mediada por arabinosa isomerasa 35 sin afectar a la condición de reacción enzimática óptima, la velocidad de conversión aumentaba significativamente. La velocidad de conversión de la isomerización aumenta de acuerdo con el aumento de temperatura, termodinámicamente. De esta manera, la aplicación de una reacción a alta temperatura puede aumentar la velocidad de conversión de galactosa a tagatosa. Sin embargo, en general, el proceso de tratamiento del azúcar tiene un problema en la reacción de 60ºC a 70ºC o superior debido a las 40 características del azúcar, que pardea muy fácilmente a alta temperatura. Por lo tanto, la velocidad de conversión sustancialmente posible de galactosa a tagatosa usando arabinosa isomerasa en la presente invención era del 55% a 70ºC. Sin embargo, de acuerdo el método de la presente invención, caracterizado por la adición de borato, la velocidad de conversión en las mismas condiciones puede aumentarse drásticamente, reduciendo los costes de producción. 45
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Un método de fabricación de tagatosa por isomerización de galactosa, que incluye la etapa de añadir borato, caracterizado por que el borato se añade de 1 a 80 moles por 100 moles de galactosa.
- 2. El método de fabricación de tagatosa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la isomerización se realiza en el intervalo de pH de 8,5 a 9.
- 3. El método de fabricación de tagatosa de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la 5 isomerización se realiza en el intervalo de temperatura de 60ºC a 70ºC.
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