ES2355702T3

ES2355702T3 - Coronavirus canino pantrópico.

Info

Publication number: ES2355702T3
Application number: ES05023371T
Authority: ES
Inventors: Canio Buonavoglia; Nicola Decaro; Vito Martella; Gabriella Elia; Marco Campolo; Costantina Desario; Maria Tempesta
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-10-26
Filing date: 2005-10-26
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2025-10-26
Also published as: EP1780216A1; EP2283859A2; DE602005025649D1; PT1780216E; ATE493430T1; EP1780216B1; EP2283859A3

Abstract

Coronavirus canino aislado, en el que dicho virus: i) es una variante pantrópica de CoVC tipo II y puede detectarse en los pulmones, el bazo, el hígado, los riñones o el cerebro de un perro infectado; ii) tiene como una parte de su genoma la secuencia representada por SEQ ID NO: 1; y iii) contiene las secuencias de polinucleótidos que codifican para la proteína (S) de la espícula (SEQ ID NO: 2), las proteínas no estructurales 3a, 3b, 3c, 7a y 7b (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente), la proteína E de la envuelta (SEQ ID NO: 8), la proteína M de la membrana (SEQ ID NO: 9) y la proteína N de la nucleocápside (SEQ ID NO: 10).

Description

La presente invención se refiere en general a infecciones por coronavirus canino (CoVC), y específicamente a una variante pantrópica altamente patógena de CoVC tipo II que es responsable de enfermedad aguda mortal en perros. La invención también proporciona polinucleótidos y proteínas aislados del coronavirus canino, y su uso en la profilaxis, 5 el tratamiento y el diagnóstico de infecciones caninas.

Antecedentes de la invención

Los coronavirus son virus de ARN de cadena positiva con envoltura grandes (1). Se han identificado tres diferentes coronavirus en perros hasta la fecha (2,3). Los coronavirus caninos (CoVC) tipo I y tipo II se incluyen en el grupo 1 de los coronavirus y su evolución está estrechamente relacionada con la de los coronavirus felinos (CoVF tipo I 10 y tipo II). El CoVF tipo II se ha originado mediante la recombinación heteróloga entre el CoVC tipo II y el CoVF tipo I, aunque el CoVC tipo I es genéticamente más similar al CoVF tipo I que al CoVC tipo II (3). Además, se han observado dos biotipos de CoVF, que difieren en su patogenicidad en gatos y la aparición de formas agudas mortales de enfermedades (denominadas peritonitis infecciosa felina) se explica por la aparición de variantes pantrópicas (que pueden diseminarse por todo el organismo) de CoVF entéricos, que probablemente están relacionadas con 15 deleciones/recombinaciones en los genes 3c y 7b en el extremo 3’ del genoma de CoVF (4). De manera similar, se ha relacionado el desplazamiento drástico de los tropismos tisulares en coronavirus porcinos y murinos (5,6) y la adaptación a seres humanos del coronavirus asociado al SARS (CoV-SARS) reconocido recientemente (7) incluso con deleciones y/o mutaciones de genoma mínimas. Un tercer coronavirus canino, CoVRC, detectado en las vías respiratorias, comparte hasta un 96,0% de conservación de aminoácidos (aa) en la proteína S de la espícula con el 20 coronavirus bovino, dentro del grupo 2 de los coronavirus, proporcionando una fuerte evidencia de un desplazamiento de especies huésped reciente (2).

La infección por coronavirus en perros se limita habitualmente al tracto entérico. La infección es autolimitante y en general produce sólo formas leves o incluso asintomáticas de enteritis (8).

Descripción de la invención 25

Se ha aislado una variante pantrópica altamente patógena del coronavirus canino a partir de perros que presentaban lesiones internas graves. La infección experimental de perros con el aislado viral dio como resultado una enfermedad sistémica grave que imitaba los signos clínicos observados originalmente en los animales. Se determinó la secuencia del extremo 3’ del genoma de la cepa de CoVC pantrópica mediante amplificación por RT-PCR y secuenciación de los fragmentos solapantes. Las proteínas estructurales y no estructurales de la cepa de CoVC recién 30 aislada mostraron una alta identidad de secuencia con las de otros CoVC tipo II, con las excepciones de las proteínas no estructurales (nsp) 3b y 3c, cuyas secuencias resultaron significativamente diferentes en la cepa aislada y en los coronavirus caninos tipo II conocidos, respectivamente.

En un aspecto la presente invención proporciona la secuencia genómica parcial de la cepa de coronavirus recién aislada (SEQ ID NO: 1), que puede usarse para preparar herramientas o reactivos de diagnóstico para la 35 detección de virus en perros. Específicamente, pueden usarse los fragmentos de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o secuencias complementarias a la misma, como sondas de diagnóstico o cebadores de PCR en un método de diagnóstico que emplea la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar la presencia del virus en los tejidos o fluidos corporales del animal, por ejemplo para el examen de sueros. En una aplicación típica, se someten muestras de tejido de un perro del que se sospecha que ha entrado en contracto con la cepa de coronavirus a 40 amplificación por PCR usando cebadores específicos de virus. Estos últimos se seleccionan preferiblemente de regiones genómicas específicas de virus que permiten distinguir la cepa de coronavirus dada a conocer en el presente documento. Las regiones genómicas más distintivas y específicas de virus de las que pueden seleccionarse cebadores de PCR adecuados son las que contienen las secuencias que codifican para la proteína (S) de la espícula (SEQ ID NO: 2), las proteínas no estructurales 3a, 3b, 3c, 7a y 7b (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente), la proteína E de la 45 envuelta (SEQ ID NO: 8), la proteína M de la membrana (SEQ ID NO: 9) y la proteína N de la nucleocápside (SEQ ID NO: 10). Se prefieren particularmente las regiones genómicas que contienen la secuencia que codifica para las proteínas no estructurales 3b y 3c, que muestran alteraciones significativas en la cepa de coronavirus aislada en comparación con los virus relacionados filogenéticamente.

En una realización particularmente preferida, se diseñan las sondas o cebadores de diagnóstico para identificar 50 la deleción de 38 nucleótidos en el gen nsp3b.

Pueden usarse proteínas específicas de virus, preferiblemente las proteínas no estructurales nsp3b y nsp3c, y péptidos antigénicos de las mismas para construir inmuno o radioinmunoensayos, tales como ELISA o inmunotransferencia de tipo Western, o para el desarrollo de anticuerpos. Los antígenos preferidos para su uso en inmunoensayos y para desarrollar anticuerpos se seleccionan de las proteínas estructurales y no estructurales 55 proporcionadas en el presente documento, cuyas secuencias se enumeran en la SEQ ID NO: 11 (proteína S de la espícula), SEQ ID NO: 12 (nsp3a), SEQ ID NO: 13 (nsp3b), SEQ ID NO: 14 (nsp3c), SEQ ID NO: 15 (nsp7a), SEQ ID

NO: 16 (nsp7b), SEQ ID NO: 17 (proteína E de la envuelta), SEQ ID NO: 18 (proteína N de la nucleocápside), SEQ ID NO: 19 (proteína M de la membrana). Las secuencias específicas de virus de nsp3b y nsp3c (SEQ ID NO: 13 y 14) identifican los antígenos preferidos para su uso en un método de diagnóstico según la invención.

En un aspecto adicional, la invención proporciona anticuerpos frente a uno o más epítopos en las secuencias de aminoácidos identificadas anteriormente. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o fragmentos tales 5 como Fab, Fv y scFv.

Aún en una realización adicional, la invención proporciona una composición de vacuna que contiene una proteína inmunogénica, que se selecciona preferiblemente de la SEQ ID NO: 11 a la SEQ ID NO: 19, o un producto antigénico avirulento obtenido mediante atenuación o inactivación de la cepa patógena de coronavirus dada a conocer en el presente documento. Este último puede aislarse de órganos o tejidos de animales infectados, propagarse en 10 células de mamífero, recuperarse y concentrarse hasta un título viral apropiado, inactivarse mediante tratamiento químico o atenuarse mediante pases repetidos en células adecuadas, especialmente en células felinas o caninas. Puede identificarse fácilmente la cepa de coronavirus mediante detección de marcadores moleculares específicos, tales como proteínas nsp 3b y 3c (SEQ ID NO: 13 y 14). La preparación de una composición de vacuna que contiene, además del principio activo, vehículos, excipientes o adyuvantes apropiados, está dentro del estado de la técnica. La 15 composición de vacuna puede usarse para la profilaxis o el tratamiento de infecciones provocadas por la cepa de CoVC pantrópica altamente virulenta en perros, particularmente en animales jóvenes y cachorros.

Descripción detallada de la invención

Recientemente se produjo un brote epidémico grave de una enfermedad sistémica mortal en una tienda de mascotas en Bari, Italia. Se observaron signos clínicos inicialmente en tres Pinscher Miniatura y en un Cocker Spaniel, 20 de 45 y 53 días de edad, respectivamente, y consistían en fiebre (39,5-40ºC), letargo, inapetencia, vómitos, diarrea hemorrágica, y signos neurológicos (ataxia, convulsiones) con muerte después de 2 días. Tras algunos días, se observaron los mismos signos en dos Pinscher Miniatura más de 45 días de edad y en un perro pequinés de 56 días de edad. En la necropsia, los perros mostraron enteritis hemorrágica, fluido serosanguíneo abundante en la cavidad abdominal y graves lesiones en los órganos parenquimatosos. Los pulmones tenían múltiples áreas de consolidación, 25 rojas y distribuidas por zonas. El hígado era marrón amarillento y estaba congestionado, con hemorragias en su superficie, mientras que el bazo estaba aumentado de tamaño con hemorragias subcapsulares. Cambios macroscópicos variables en otros órganos incluían infartos corticales renales hemorrágicos multifocales y hemorragias petequiales en la superficie de los ganglios linfáticos.

Las investigaciones virológicas y bacteriológicas de los órganos parenquimatosos no pudieron detectar 30 patógenos caninos comunes, concretamente el parvovirus canino tipo 2, el virus del moquillo canino, el adenovirus canino tipo 1 y tipo 2, mientras que se identificaron el CoVC tipo I y tipo II en el contenido intestinal de todos los cachorros mediante ensayos de RT-PCR en tiempo real específicos del genotipo (9). Inesperadamente, también se detectó ARN de CoVC tipo II en los pulmones (mediana de los títulos de 1,08 x 106 copias de ARN/l de molde), bazo (mediana de los títulos de 4,46 x 106 copias de ARN/l de molde), hígado (mediana de los títulos de 9,02 x 104 copias 35 de ARN/l de molde), riñón (mediana de los títulos de 7,54 x 104 copias de ARN/l de molde) y cerebro (mediana de los títulos de 5,23 x 103 copias de ARN/l de molde). Se observó un efecto citopático inducido por virus en células A-72 y se aisló la cepa de CoVC tipo II (CB/05) de todos los tejidos examinados excepto del cerebro.

La inmunohistoquímica usando un anticuerpo monoclonal específico de CoVC detectó el antígeno de CoVC en los órganos con lesiones macroscópicas que se examinaron (pulmones, riñones, hígado, bazo, intestino y ganglios 40 linfáticos (figura 1)).

La secuencia del extremo 3’ del genoma (8,8 kb) de la cepa de CoVC pantrópico se determinó mediante amplificación por RT-PCR y secuenciación de los fragmentos solapantes. Las proteínas estructurales S, E, M, N presentaron un alto grado de identidad de aa con los ORF relacionados de CoVC tipo II. La proteína S de la cepa CB/05 presentó la mayor identidad con la cepa de CoVF tipo II 79-1146 (figura 2). Debido a la falta de datos del extremo 3’ del 45 genoma de CoVC en los genes que codifican para proteínas no estructurales (3a, 3b, 3c, 7a y 7b), sólo fue posible la comparación de la cepa CB/05 con las cepas de CoVC tipo II Insavc-1 (10) y BGF (11) y con las cepas de CoVC tipo I Elmo/02 y 23/03 (3,12). Las proteínas no estructurales (nsp) 3a, 7a y 7b presentaron ligeras alteraciones de secuencia. La nsp3b era 49 aa más corta (22 aa) de lo esperado debido a la presencia de una deleción de 38 nt y a un desplazamiento del marco en la secuencia en el sentido 3’ de la deleción que introdujo un codón de terminación 50 temprano. La nsp3c (244 aa) era 6 aa más corta y 79 aa más larga que las proteínas relacionadas de la cepa enteropatógena BGF y de la cepa atenuada Insavc-1a, respectivamente.

Para confirmar el potencial patógeno de la cepa CB/05, se infectaron dos perros de 6 meses de edad de manera experimental (n.º de autorización 67/2002-C emitida por el Ministerio de Sanidad de Italia). Se administraron 2 ml del criolisado de un 1er pase viral derivado de pulmón en células A-72 por vía intranasal a los perros. El criolisado 55 celular dio negativo en la prueba para otros patógenos caninos comunes y presentó una dosis de infectividad de 105,50 DICT50/50 l con células A-72, y un título de 1,18 x 107 copias de ARN/l de molde mediante RT-PCR en tiempo real. Se aisló de nuevo el virus de los perros infectados de manera experimental. Se observaron signos clínicos graves,

caracterizados por pirexia (39,8-40,1ºC), anorexia, depresión, vómitos, diarrea y leucopenia, que persistieron 8-10 días. A pesar de los graves síntomas, los perros se recuperaron lentamente de la enfermedad.

Descripción de las figuras

Figura 1. Inmunohistoquímica con una sección de tejido pulmonar. Detección del antígeno de CoVC (tinción marrón) mediante el anticuerpo monoclonal. 400X. 5

Figura 2. Árbol de vecinos más cercanos de la proteína S de coronavirus canino y felino. Para el análisis filogenético se usaron las siguientes cepas de referencia: cepas de CoVC tipo I Elmo/02 (n.º de registro AY307020) y 23/03 (AY307021); cepas de CoVC tipo II Insavc-1 (D13096) y K378 (X77047); cepas de CoVF tipo I KU-2 (D32044), Black (AB088223) y UCD-1 (AB088222); cepas de CoVF tipo II 79-1146 (X06170) y 79-1683 (X80799); cepa de coronavirus bovino (CoVB) ENT (NC_003045). El árbol se enraíza en CoVB-ENT y se dibuja a escala. Se proporcionó 10 un apoyo estadístico mediante muestreo repetitivo (bootstrapping) con más de 100 replicados.

Bibliografía

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12. Pratelli A, Decaro N, Tinelli A, Martella V, Elia G, Tempesta M, et al, Two genotypes of canine coronavirus simultaneously detected in fecal samples of dogs with diarrhea. J Clin Microbiol. 2004;42:1797-9.

13. Jonassen CM, Kofstad T, Larsen IL, Lovland A, Handeland K, Follestad A, et al, Molecular identification and characterization of novel coronaviruses infecting graylag geese (Anser anser), feral pigeons (Columbia livia) and mallards (Anas platyrhynchos). J Gen Virol. 2005;86:1597-607 40

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Buonavoglia, Canio

<120> coronavirus canino pantrópico

<130> 1577 EUR

<160> 19 5

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 8745

<212> ADN

<213> Desconocido 10

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 1

<210> 2

<211> 4365

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino 5

<400> 2

<210> 3

<211> 216

<212> ADN

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 3

<210> 4 10

<211> 69

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 4

<210> 5

<211> 735 5

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 5 10

<210> 6

<211> 306

<212> ADN

<213> Desconocido 15

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 6

<210> 7

<211> 642

<212> ADN

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 7

<210> 8 10

<211> 249

<212> ADN

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino 15

<400> 8

<210> 9

<211> 789

<212> ADN

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 9

10

<210> 10

<211> 1149

<212> ADN

<213> Desconocido

<220> 15

<223> coronavirus canino

<400> 10

<210> 11

<211> 1454

<212> PRT 5

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 11

<210> 12

<211> 71

<212> PRT

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 12

<210> 13 10

<211> 22

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino 15

<400> 13

<210> 14

<211> 244

<212> PRT

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 14

<210> 15

<211> 101

<212> PRT

<213> desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 15

<210> 16 10

<211> 213

<212> PRT

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino 15

<400> 16

<210> 17

<211> 82

<212> PRT 5

<213> Desconocido

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 17

5

<210> 18

<211> 382

<212> PRT

<213> Desconocido

<220> 10

<223> coronavirus canino

<400> 18

<210> 19

<211> 262

<212> PRT

<213> Desconocido 5

<220>

<223> coronavirus canino

<400> 19

Claims

REIVINDICACIONES

1. Coronavirus canino aislado, en el que dicho virus:

i) es una variante pantrópica de CoVC tipo II y puede detectarse en los pulmones, el bazo, el hígado, los riñones o el cerebro de un perro infectado;

ii) tiene como una parte de su genoma la secuencia representada por SEQ ID NO: 1; y 5

iii) contiene las secuencias de polinucleótidos que codifican para la proteína (S) de la espícula (SEQ ID NO: 2), las proteínas no estructurales 3a, 3b, 3c, 7a y 7b (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente), la proteína E de la envuelta (SEQ ID NO: 8), la proteína M de la membrana (SEQ ID NO: 9) y la proteína N de la nucleocápside (SEQ ID NO: 10).
2. Coronavirus según la reivindicación 1, que está inactivado o atenuado. 10
3. Polinucleótido aislado del virus según las reivindicaciones 1-2, consistiendo dicho polinucleótido en la SEQ ID NO: 4.
4. Polinucleótido aislado del virus según las reivindicaciones 1-2, consistiendo que dicho polinucleótido en la SEQ ID NO: 5.
5. Proteína de CoVC aislada que consiste en el polipéptido codificado por el polinucleótido según la reivindicación 15 3 ó 4.
6. Proteína de CoVC según la reivindicación 5, seleccionándose dicha proteína del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14.
7. Uso de un polinucleótido según las reivindicaciones 3-4 o de una proteína según las reivindicaciones 5-6 en un ensayo biológico in vitro para la detección de CoVC en una muestra de tejido o fluido de perro. 20
8. Uso según la reivindicación 7, en el que el ensayo biológico in vitro es uno de los siguientes: ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, (RT)-PCR.
9. Uso de una proteína de CoVC según la reivindicación 5 ó 6, para preparar una composición inmunogénica para su uso en la generación de anticuerpos en animales.
10. Composición de vacuna que contiene, como componente inmunogénico, un coronavirus inactivado o atenuado 25 según la reivindicación 2, junto con vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables.
11. Composición de vacuna según la reivindicación 10, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de infecciones provocadas por CoVC virulento pantrópico en perros.