ES2356077T3 - Vacuna quimérica para una enfermedad inducida por haemophilus influenzae. - Google Patents

Abstract

Proteína quimérica que comprende una parte de la proteína PilA de H. influenzae no tipificable (NTHi) (SEC ID nº: 2) y una parte del péptido LB1 (SEC ID nº: 53), pudiendo provocar la proteína quimérica una respuesta inmunitaria a las bacterias NTHi.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención descrita en la presente memoria se refiere a una proteína quimérica que comprende la proteína de subunidad principal de pilus contráctil (PilA) de NTHi que presenta una parte de la proteína OMP P5 de NTHi. La invención proporciona composiciones de vacuna que comprenden la proteína quimérica y procedimientos para provocar 5 una respuesta inmunitaria utilizando las proteínas quiméricas de la invención.

ANTECEDENTES

El término clínico para las infecciones del oído medio es otitis media (OM). Según Klein, Vaccine, 19 (Supl. 1): S2-S8, 2000, la OM es el motivo más común para que un niño enfermo reciba atención médica y para que un niño en los Estados Unidos reciba antibióticos o se someta a una anestesia general. Las estadísticas indican que 24,5 millones de 10 visitas a la consulta del médico se realizaron por OM en 1990, lo que representa un aumento superior al 200% con respecto a las notificadas en la década de 1980. Aunque en pocas ocasiones va asociada con mortalidad, la morbilidad asociada con la OM es significativa. La pérdida de audición es un problema común asociado con esta enfermedad, afectando a menudo al comportamiento, a la educación y al desarrollo de las habilidades lingüísticas del niño (Baldwin, Am. J. Otol., 14: 601-604, 1993; Hunter et al., Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. Supl., 163: 59-61, 1994; Teele et al., J. Infect. 15 Dis., 162: 685-694, 1990). El impacto socioeconómico de la OM también es grande, con costes directos e indirectos de diagnóstico y tratamiento de la OM que superan los 5 mil millones de $ anualmente sólo en los US (Kaplan et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 16: S9-11, 1997).

Se cree que la OM es el resultado de factores infecciosos, ambientales y genéticos del huésped. Bacterias tales como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis son los organismos infecciosos más 20 comunes en la OM. La OM aguda es una enfermedad caracterizada por una rápida aparición y una corta duración de signos y síntomas de inflamación en el oído medio, mientras que la OM crónica se refiere a un estado que se define por la presencia relativamente asintomática de líquido (o efusión) en el oído medio. Sin embargo, en la OM crónica, a pesar de la ausencia de ciertos signos de infección aguda (es decir, dolor de oídos o fiebre), estos fluidos anómalos del oído medio pueden persistir durante periodos que superan los tres meses. El tratamiento de la OM aguda mediante terapia 25 con antibióticos es común, pero han surgido múltiples bacterias resistentes a los antibióticos en los tres géneros de bacterias responsables de la OM. El tratamiento quirúrgico de la OM crónica implica la inserción de tubos de timpanostomía a través de la membrana timpánica del oído mientras el niño está bajo anestesia general. Aunque este procedimiento es común (las tasas de prevalencia son de ~1 millón de tubos insertados al año en US Bright et al., Am. J. Public Health, 83(7): 1026-8, 1993) y es sumamente eficaz en cuanto a aliviar los síntomas dolorosos drenando los 30 líquidos acumulados en el oído medio, es invasivo y conlleva riesgos importantes (Berman et al., Pediatrics, 93(3):353-63, 1994; Bright et al., citado anteriormente; Cimons, ASM News, 60: 527-528; Paap, Ann. Pharmacother., 30(11): 1291-7, 1996). Resultan por tanto necesarios otros enfoques para el tratamiento y, preferentemente, la prevención de la OM.

El desarrollo de un vacuna contra la OM está más avanzado para S. pneumoniae, el agente causante principal de la OM aguda (OMA), tal como demuestra la reciente aprobación y autorización de una vacuna de conjugado capsular 35 heptavalente, PREVNAR® (Eskola y Kilpi, Pedriatr. Infect. Dis. J. 16: S72-78, 2000). Aunque PREVNAR® ha sido sumamente eficaz para la enfermedad neumocócica invasiva, la cobertura para la OM ha sido decepcionante (6-8%) con notificaciones de un número aumentado de casos de OM debido a serotipos no incluidos en la vacuna (Black et al., Pedriatr. Infect. Dis J, 19: 187-195, 2000; Eskola et al., Pedriatr. Infect. Dis J., 19: S72-78, 2000; Eskola et al., N. Engl. J. Med., 344: 403-409, 2001; Snow et al., Otol. Neurotol., 23: 1-2, 2002). 40

La H. influenzae es una bacteria gram-negativa que, tal como se indicó anteriormente, desempeña un papel en la OM. Los aislados clínicos de H. infuenzae se clasifican o bien como serotipos “a” a “f” o como no tipificables dependiendo de la presencia o ausencia, respectivamente, de cápsulas de polisacárido específicas del tipo en las bacterias. Se ha desarrollado una vacuna contra H. influenzae tipo b. Como PREVNAR®, las vacunas contra H. influenzae tipo b se dirigen a la cápsula de polisacárido de este organismos y por tanto la vacuna está compuesta por un 45 polisacárido capsular que se ha conjugado con un portador proteico. Ni PREVNAR® ni la vacuna contra H. influenzae tipo b presentan ninguna eficacia para las enfermedades del aparato respiratorio inducidas por NTHI, incluyendo la OM. Se han realizado menos avances para una vacuna contra H. influenzae no tipificable (NTHi) que provoca aproximadamente el 20% de la OM aguda en niños y predomina en la OM crónica con efusión (Coleman et al., Inf and Immunity, 59(5), 1716-1722, 1991; Klein, Pedriatr. Infect. Dis J., 16, S5-8, 1997; Spinola et al., J. Infect. Dis., 154, 100-50 109, 1986). La NTHi también puede provocar neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, infecciones puerperales y neonatales, sepsis puerperal y neonatal, salpingitis aguda y crónica, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de las vías urinarias, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteriemia oculta y exacerbación de enfermedades pulmonares subyacentes tales como bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística. Un aislado de NTHi prototipo 55 es el aislado con número de pases bajo 86-028NP que se recuperó de un niño con OM crónica. Esta cepa se ha caracterizado bien in vitro (Bakaletz et al., Infect. Immun., 53: 331-5, 1988; Holmes et al., Microb. Pathog., 23: 157-66, 1997) así como en modelos de OM de chinchilla (Bakaletz et al., Vaccine, 15: 955-61, 1997; Suzuki et al., Infect. Immun., 62: 1710-8, 1994; DeMaria et al., Infect. Immun., 64: 5187-92, 1996). La cepa 86-026N de NTHi se depositó en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, el 16 de octubre de 2001 y se le 60

asignó el nº de registro PTA-4764. Puede encontrarse un conjunto de secuencias contiguas del genoma de la cepa 86-028NP en la página web del Columbus Children’s Research Institute Center for Microbial Pathogenesis.

La adherencia y colonización se reconocen como las primeras etapas en la patogénesis de enfermedades inducidas por H. influenzae. Como tal, H. influenzae expresa múltiples adhesinas que incluyen adhesinas no fimbriales, fimbrias y pili hemaglutinantes (Gilsdorf et al., Pediatr Res 39, 343-348, 1996; Gilsdorf., Infect. Immun., 65, 2997-3002, 5 1997; y St. Geme III, Cell. Microbiol., 4, 191-200, 2002). Particularmente, ninguna de las adhesinas descritas se ha asociado previamente con una función de motilidad. Además, H. influenzae no expresa flagelos que también están asociados con la motilidad. La motilidad contráctil es una forma independiente de los flagelos de traslocación bacteriana sobre superficies húmedas y se produce mediante extensión, atado y después retracción de estructuras polares conocidas como pili de tipo IV (Bardy, Microbiology, 149, 295-304, 2003; Tonjum y Koomey, Gene, 192, 155-163, 1997; 10 Wolfgang et al., EMBO J., 19; 6408-6418; Mattick, Annu. Rev. Microbiol., 56, 289-314, 2002). Los pili de tipo IV presentan normalmente 5-7 nm de diámetro, varios micrómetros de longitud y están compuestos por una única subunidad de proteína ensamblada en una conformación helicoidal con ~5 subunidades por vuelta (Bardy et al., Microbiology, 149, 295-304, 2003; Wall y Kaiser, Mol. Microbiol., 32, 1-10, 1999). Las subunidades de pilina de tipo IV presentan habitualmente 145-160 aminoácidos de longitud y pueden estar glicosiladas o fosforiladas. Existen dos clases 15 de subunidades de pilina, tipo IVa y tipo IVb, que se distinguen entre sí por la longitud promedio del péptido líder y la subunidad madura, cuyo aminoácido N-metilado ocupa la posición N-terminal de la proteína madura, y la longitud promedio de la región D (para región disulfuro). La mayoría de los patógenos respiratorios expresan pilinas de clase IVa, mientras que los enteropatógenos expresan más normalmente pilinas de clase IVb. Los pili de tipo IVa se distinguen por la presencia de una fenilalanina metilada N-terminal hidrófoba, sumamente conservada. 20

Los pili de tipo IV actúan como medios de traslocación rápida sobre, y colonización de, nuevas superficies. Por tanto la expresión de pilus de tipo IV es importante tanto para la adherencia como para la formación de biopelículas por parte de muchas bacterias (Mattick, Annu. Rev. Microbiol., 56, 289-314 2002; O’Toole y Kolter, Mol. Microbiol., 30, 295-304, 1998; Klausen et al., Mol. Microbiol., 50, 61-68, 2003; Jesaitis et al., J. Immunol., 171, 4329-4339, 2003), así como la virulencia de especies de Neisseria, Moraxella bovis, Vibrio cholerae, Escherichia coli enteropatogénica y 25 Pseudomonas aeruginosa, entre otras (OToole y Kolter, citado anteriormente; Klausen et al., citado anteriormente; Klausen et al., Mol. Microbiol., 48, 1511-1524, 2003; Strom y Lory, Annu. Rev. Microbiol., 47, 565-596, 1993). Una biopelícula es una organización compleja de bacterias que se anclan a una superficie a través de una matriz extruida por bacterias, compuesta por exopolisacárido u otras sustancias. La matriz envuelve las bacterias y las protege frente al sistema inmunitario humano. Ehrlich et al., JAMA, 287(13), 1710-1715 (2002) describen la formación de biopelículas por 30 H. influenzae. Se ha postulado que el bloqueo de la interacción entre pili de tipo IV y el cuerpo humano puede evitar o detener la infección bacteriana (Meyer et al., patente US nº 6.268.171 publicada el 31 de julio de 2001).

La expresión de pilus de tipo IV es una función bacteriana compleja y sumamente regulada. En P. aeruginosa, la biogénesis y la función de los pili de tipo IV están controladas por más de cuarenta genes (Strom y Lory, citado anteriormente). Hasta la fecha, sólo se ha encontrado un subconjunto del amplio número de genes de pilus de tipo IV 35 relacionados (Tonjum y Koomey, citado anteriormente; Darzins y Russell, Gene, 192, 109-115, 1997) en varios miembros de la familia HAP (Haemophilus, Actinobacillus y Pasteurella) (Stevenson et al., Vet. Microbiol., 92, 121-134, 2003; Doughty et al., Vet. Microbiol., 72, 79-90, 2000; Dougherty y Smith, Microbiology, 145, 401-409 1999), pero hasta ahora nunca se ha descrito ni la expresión de pili de tipo IV ni la motilidad por contracción para ningún aislado de H. influenzae. De hecho, H. influenzae se describe tradicionalmente como una bacteria que no expresa estas estructuras 40 (Friedrich et al. Appl. Environ. Microbiol., 69, 3695-3700, 2003; Fussenegger et al., Gene, 192, 125-134, 1997), a pesar de la presencia de una agrupación de genes crípticos dentro del genoma de la cepa Rd (Fleischmann et al., Science, 269, 496-512, 1995). La cepa Rd es un derivado no encapsulado de un organismo de serotipo d de H. influenzae (Zwahlen et al., Infect. Immun., 42, 708-715, 1983; Bendler y Goodgal, J. Microbiol., 70, 411-422, 1972; Risberg et al., Eur. J. Biochem., 261, 171-180, 1999). Aunque la cepa Rd presenta algunas propiedades de virulencia, se considera 45 generalmente que las cepas de serotipo d son comensales; no provocan frecuentemente enfermedad (Daines et al., J. Med. Microbiol., 52, 277-282, 2003). Por tanto es importante distinguir entre cepas de H. influenzae que provocan enfermedad y la cepa Rd.

Las fimbrias, que son apéndices superficiales que se encuentran en Haemophilus influenzae no tipificable, se producen por el 100% de las bacterias recuperadas de los oídos medios y la región nasofaríngea de niños con otitis 50 media crónica. Se desarrolló previamente una vacuna compuesta por fimbrina, una proteína filamentosa derivada de las fimbrias de Haemophilus influenzae no tipificable y es útil para estudiar, prevenir o reducir la gravedad de la otitis media. Sin embargo, las metodologías existentes para aislar proteína fimbrina a partir de la membrana externa bacteriana son tediosas y requieren mucho tiempo. De manera similar, la purificación de fimbrina expresada por el gen de fimbrina en otro vector huésped también es tediosa debido a la homología entre la proteína fimbrina y las proteínas de membrana 55 externa del vector huésped.

El candidato de vacuna quimérica sintético, designado como LB1 y descrito en la patente US nº 5.843.464, ha mostrado una eficacia enorme en múltiples ensayos preclínicos de vacunas en dos huéspedes roedores. Este péptido sintético comprende un epítopo de células B de fimbrina P5 sintetizado de manera colineal con epítopo promiscuo de células T derivado de una proteína de fusión de la vacuna contra el sarampión. Aunque el péptido LB1 ha demostrado 60 ser eficaz en ensayos preclínicos, existe preocupación sobre la capacidad para someter a prueba y comercializar una vacuna que contenga un epítopo promiscuo de células T para una utilización pretendida en niños muy pequeños. Por

tanto, existe la necesidad de desarrollar un candidato de vacuna que provoque una respuesta inmunitaria específica y controlada frente a H. influenzae.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a proteínas quiméricas que comprenden una parte de la proteína de subunidad principal de pilus de tipo IV (PilA) de H. influenzae no tipificable (NTHi) y una parte de la proteína OMP P5 de NTHi 5 (también denominada fimbrina P5, fimbrina o adhesiva homóloga a OMP P5). En particular, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden PilA modificada para presentar el epítopo de células B del péptido LB1. Por tanto, según un aspecto de la presente invención se proporciona una proteína quimérica que comprende una parte de proteína PilA de H. influenzae no tipificable (NTHi) (SEC ID nº: 2) y una parte de los péptidos LB1 (SEC ID nº: 53). La invención proporciona asimismo composiciones que comprenden una o más proteínas quiméricas de la invención y su utilización 10 para provocar una respuesta inmunitaria.

El péptido LB1 es un péptido derivado de fimbrina P5 quimérico sintético de 40 aminoácidos (SEC ID nº: 53) que induce una respuesta inmunogénica frente a NTHi y es ventajoso porque no requiere técnicas de purificación tediosas. El péptido LB1 comprende un péptido de 19 aminoácidos N-terminal que es un epítopo de células B (SEC ID nº: 4). El epítopo de células B se derivó del bucle 3 expuesto en superficie atribuido de una proteína de membrana 15 externa (fimbrina) de NTHi designada como OMP P5 (también denominada fimbrina P5 o adhesina homóloga a OMP P5). El péptido LB1 comprende además un péptido conector 5-mero corto y un epítopo promiscuo de células T de 16 residuos. El epítopo de células T se derivó de una proteína de fusión del virus del sarampión. El epítopo promiscuo de células T induce una respuesta de células T muy intensa en individuos expuestos a este epítopo.

La presente invención comprende insertar una parte o fragmento del péptido LB1 en una proteína portadora 20 más segura y selectiva que no reduzca la eficacia de inducir una respuesta de células B. Preferentemente, la parte del péptido LB1 está insertada en un portador que por sí mismo también confiere protección frente a enfermedades inducidas por NTHi. Un portador de este tipo que puede inducir protección frente a enfermedades inducidas por NTHi es la proteína que comprende la proteína de pilus de tipo IV (pilus contráctil) de NTHi, también conocida como proteína PilA (SEC ID nº: 2). La proteína PilA está codificada por el gen pilA (SEC ID nº: 1). 25

La presente invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden una parte del péptido LB1 con el fin de presentar el péptido para que induzca una respuesta inmunogénica. La invención comprende presentar una parte del péptido LB1 que presente de 12 a 35 aminoácidos, más preferentemente presentar una parte del péptido LB1 que presente de 15 a 30 aminoácidos, y todavía más preferentemente presentar una parte del péptido LB1 que presente de 18 a 19 aminoácidos y sea una subunidad de la proteína fimbrina. Una parte preferida del péptido LB1 es la secuencia 30 de aminoácidos N-terminal RSDYKFYEDANGTRDHKKG (SEC ID nº: 4).

En otra forma de realización, la invención proporciona una proteína quimérica en la que la proteína PilA se modifica para presentar un péptido de 24 aminoácidos. El péptido de 24 aminoácidos puede comprender el epítopo de células B del péptido LB1 modificado como se expone en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 5 (LVRSDYKFYEDANGTRDHKKGRHT) en la que se añaden una leucina y una valina al extremo N-terminal del epítopo 35 de células B de LB1 y una arginina, una histidina y una treonina están en el extremo C-terminal del epítopo de células B de LB1. Estas modificaciones al epítopo de células B se contemplan para ayudar en el plegado de la proteína y/o la presentación de antígenos. La invención comprende además cualquier modificación respecto al epítopo de células B de LB1 que ayude en el plegado de la proteína y/o la presentación de antígenos.

La secuencia de aminoácidos del bucle 3 expuesto en superficie de OMP P5 de NTHi puede variar entre cepas 40 de NTHi. La invención comprende proteínas quiméricas que comprenden una parte de la proteína PilA modificada para presentar el epítopo de células B de cualquier secuencia de aminoácidos variante del bucle 3 de la OMP P5 de NTHi. En particular, la invención proporciona proteínas quiméricas en las que la proteína PilA se modifica para presentar una de las siguientes secuencias de aminoácidos de OMP P5 de NTHi variantes: RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE (SEC ID nº: 6), RSDYKLYNKNSSTLKDLGE (SEC ID nº: 7) y RSDYKFYDNKRID (SEC ID nº: 8). Los péptidos variantes también 45 pueden presentarse con una leucina y una valina añadidas al extremo N-terminal y una arginina, una histidina y una treonina añadidas al extremo C-terminal o cualquier otra modificación para ayudar en el plegado de la proteína y/o la presentación de antígenos.

Las proteínas quiméricas de la invención comprenden los aminoácidos de PilA modificados en las que se han sustituido los aminoácidos de PilA nativos por una parte del péptido LB1. Además, las proteínas quiméricas de la 50 invención comprenden una secuencia de aminoácidos de PilA modificados en cuyo interior está insertada una parte del péptido LB1 y además de los aminoácidos PilA nativos. Las proteínas quiméricas de la invención presentan la capacidad de inducir la formación de anticuerpos dirigidos frente a dos proteínas y por tanto son candidatos de vacuna más eficaces y más específicos.

En una forma de realización, las proteínas quiméricas comprenden la secuencia de aminoácidos madura 55 (residuos 13-149) de la proteína PilA de NTHi (SEC ID nº: 2) en la que una parte del péptido LB1 está insertada entre los residuos de cisteína en las posiciones 62 y 72 de SEC ID nº: 2 y puede sustituir a los aminoácidos nativos, tal como la proteína quimérica que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 54. Esta proteína quimérica comprende los

residuos 40-149 de SEC ID nº: 2 y presenta el epítopo de células B de LB1 (SEC ID nº: 5) insertado entre los residuos 62 y 72 de SEC ID nº: 2. En otra forma de realización, la parte del péptido LB1 está insertada entre los residuos de cisteína en las posiciones 131 y 144 de SEC ID nº: 2 y puede sustituir a los aminoácidos nativos tal como la proteína que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 55. Esta proteína quimérica comprende los residuos 40-149 de SEC ID nº: 2 y presenta el epítopo de células B de LB1 (SEC ID nº: 5) insertado entre los residuos 131 y 144 de SEC ID 5 nº: 2.

En otra forma de realización, las proteínas quiméricas comprenden la secuencia de aminoácidos madura (residuos 13-149) de la proteína PilA de NTHi (SEC ID nº: 2) en la que la parte del péptido LB1 está insertada en el extremo C-terminal de la proteína PilA. Por ejemplo, la proteína quimérica de SEC ID nº: 56 comprende los residuos 40-149 de SEC ID nº: 2 y el epítopo de células B de LB1 (SEC ID nº: 5) está insertado tras el residuo 149 de SEC ID nº: 2. 10

En otra forma de realización, las proteínas quiméricas comprenden la secuencia de aminoácidos madura (residuos 13-149) de la proteína PilA de NTHi (SEC ID nº: 2) en la que la parte del péptido LB1 está insertada en el extremo N-terminal de la proteína PilA. Por ejemplo, la proteína quimérica de SEC ID nº: 57 comprende los residuos 40-149 de SEC ID nº: 2 y el epítopo de células B de LB1 (SEC ID nº: 5) está insertado antes del residuo 40 de SEC ID nº: 2.

En otra forma de realización, la invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden una parte de la 15 proteína PilA de NTHi y uno o más de los péptidos LB1 descritos en la presente memoria. Las proteínas quiméricas de la invención incluyen las que presentan el mismo péptido LB1 más de una vez dentro de una parte de la proteína PilA de NTHi y las que presentan dos o más péptidos LB1 diferentes dentro de una parte de la proteína PilA de NTHi.

Los polipéptidos y polinucleótidos de pilus de tipo IV (PilA) de NTHi de la invención

Las proteínas quiméricas de la invención pueden comprender la longitud completa o una parte de la subunidad 20 principal del pilus de tipo IV de NTHi que se codifica por el gen pilA. La proteína PilA del aislado de 86-028NP de NTHi se codifica por la secuencia de ácido nucleico expuesta como SEC ID nº: 2, que se describe en la publicación de patente US nº US 2005-018335. También se proporcionan polinucleótidos que codifican para polipéptidos PilA a partir de los aislados clínicos de NTHi 1728MEE, 1729MEE, 3224A, 10548MMEE, 1060MEE, 1885MEE, 1714MEE, 1236MEE, 1128MEE y 214NP. Las secuencias de aminoácidos de estos polipéptidos PilA se exponen en las SEC ID nº: 34, 36, 38, 25 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52 respectivamente. La posibilidad de una utilización de codones alternativos se contempla específicamente en polinucleótidos que codifican para los polipéptidos. En una forma de realización, los polipéptidos se codifican respectivamente por las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC ID nº: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51.

La invención proporciona polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con (a) el complemento de 30 las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51; (b) un polinucleótido que es una variante alélica de cualquier polinucleótido mencionado anteriormente; (c) un polinucleótido que codifica para una especie homóloga de cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente; o (d) un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende un dominio o truncamiento específico de los polipéptidos de la presente invención. Están específicamente comprendidos los polinucleótidos PilA de otras cepas de H. influenzae 35 no tipificables y de las cepas de H. influenzae a, b, c, e y f. Estos polinucleótidos pueden identificarse y aislarse mediante técnicas convencionales en la materia tal como hibridación y reacción en cadena de la polimerasa utilizando parte de, o todos, los polinucleótidos de SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51 como sondas o cebadores, respectivamente.

Los polinucleótidos de la invención también incluyen secuencias de nucleótidos que son sustancialmente 40 equivalentes a los polinucleótidos mencionados anteriormente. Los polinucleótidos según la invención pueden presentar, por ejemplo, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, o 89%, más normalmente por lo menos 90%, 91%, 92%, 93% o 94% e incluso más normalmente por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de NTHi mencionados anteriormente. 45

Comprendidos dentro del alcance de las secuencias de ácido nucleico de la invención se encuentran fragmentos de secuencia de ácido nucleico que se hibridan en condiciones restrictivas con las secuencias de nucleótidos de NTHi de SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51, o complementos de las mismas, fragmento que es mayor que aproximadamente 5 nucleótidos, preferentemente 7 nucleótidos, más preferentemente mayor que 9 nucleótidos y todavía más preferentemente mayor que 17 nucleótidos. Se contemplan fragmentos de, por ejemplo, 15, 50 17 ó 20 nucleótidos o más que son selectivos para (es decir, se hibridan específicamente con uno cualquiera de los polinucleótidos PilA de la invención). Estos fragmentos de secuencia de ácido nucleico que pueden hibridarse específicamente con un polinucleótido PilA de NTHi de la invención pueden utilizarse como sondas para detectar polinucleótidos PilA de NTHi de la invención y/o pueden diferenciar los polinucleótidos PilA de NTHi de la invención de otros genes bacterianos, y se basan preferentemente en secuencias de nucleótidos únicas. 55

El término “restrictivo” se utiliza en la presente memoria para hacer referencia a condiciones que se entienden comúnmente en la materia como restrictivas. La restricción de hibridación se determina principalmente por la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de agentes desnaturalizantes tal como la formamida. Los ejemplos de

condiciones restrictivas para la hibridación y el lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68ºC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M, y formamida al 50% a 42ºC. Véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).

También pueden utilizarse condiciones más restrictivas (tales como una mayor temperatura, una menor fuerza iónica, una mayor concentración de formamida, u otro agente desnaturalizante), sin embargo, la tasa de hibridación 5 resultará afectada. En los casos en los que se trata de la hibridación de desoxioligonucleótidos, las condiciones de hibridación restrictivas a título de ejemplo adicionales incluyen lavado en 6X SSC pirofosfato de sodio al 0,05% a 37ºC (para oligonucleótidos de 14 bases), 48ºC (para oligonucleótidos de 17 bases), 55ºC (para oligonucleótidos de 20 bases) y 60ºC (para oligonucleótidos de 23 bases).

Pueden incluirse otros agentes en los tampones de hibridación y lavado con el fin de reducir la hibridación no 10 específica y/o de fondo. Los ejemplos son albúmina sérica bovina al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, dodecilsulfato de sodio al 0,1%, NaDodSO4, (SDS), Ficoll, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (u otro ADN no complementario) y sulfato de dextrano, aunque también pueden utilizarse otros agentes adecuados. La concentración y los tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin afectar sustancialmente a la restricción de las condiciones de hibridación. Los experimentos de hibridación se llevan a cabo habitualmente a pH 6,8-7,4, sin 15 embargo, en condiciones de fuerza iónica típicas, la tasa de hibridación es prácticamente independiente del pH. Véase Anderson et al., Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, Ch. 4, IRL Press Limited (Oxford, Inglaterra). Un experto en la materia puede ajustar las condiciones de hibridación con el fin de dar cabida a estas variables y permitir que ADN de diferente relación de secuencia formen híbridos.

Tal como se indicó anteriormente, los polinucleótidos comprendidos en la presente invención no se limitan a los 20 polinucleótidos PilA específicos de SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51, sino que también incluyen, por ejemplo, variaciones de especie y alélicas de los mismos. Las variaciones de especie y alélicas pueden determinarse de manera rutinaria comparando la secuencia proporcionada en las SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51, preferentemente los marcos de lectura abiertos en las mismas, un fragmento representativo de las mismas, o una secuencia de nucleótidos por lo menos idéntica al 90%, preferentemente idéntica al 95%, con los marcos de lectura 25 abiertos dentro de SEC ID nº: 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 y 51 con una secuencia de otro aislado de la misma especie u otra especia. Los procedimientos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias comprenden de manera no limitativa, el paquete informático GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387, 1984; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990). El programa BLASTX está disponible públicamente 30 en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., citado anteriormente). El bien conocido algoritmo de Smith-Waterman también puede utilizarse para determinar la identidad.

Los polinucleótidos de la invención pueden aislarse a partir de fuentes naturales o pueden sintetizarse mediante técnicas químicas convencionales, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster descrito en Matteucci et al., J Am Chem 35 Soc., 103: 3185 (1981).

La invención proporciona proteínas quiméricas que comprenden una parte de la proteína PilA de NTHi. En una forma de realización los polipéptidos comprenden las secuencias de aminoácidos de 86-028NP de NTHi expuestas respectivamente en la SEC ID nº: 2. Los polipéptidos de la invención también incluyen los polipéptidos PilA expuestos en las SEC ID nº: 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52. En otras formas de realización, los polipéptidos PilA de la 40 invención son los de otras cepas de H. influenzae no tipificable y de las cepas de H. influenzae a, b, c, e y f.

Los polipéptidos de la invención incluyen específicamente fragmentos peptídicos (es decir, péptidos) o fragmentos del polipéptido PilA que conservan una o más propiedades biológicas o inmunogénicas de un polipéptido de longitud completa de la invención. En una forma de realización, los fragmentos de péptido PilA proporcionados por la invención se designan TfpQ2, TfpQ3, TfpQ4 y OLP3 y comprenden respectivamente los aminoácidos 35 a 68 de SEC ID 45 nº: 2, los aminoácidos 69 a 102 de SEC ID nº: 2, los aminoácidos 103 a 137 de SEC ID nº: 2, y los aminoácidos 21 a 35 de SEC ID nº: 2. Otro fragmento de péptido PilA proporcionado por la invención comprende los aminoácidos 40 a 149 de SEC ID nº: 2.

La invención proporciona asimismo proteínas quiméricas que comprenden una parte de un polipéptido PilA con una o más sustituciones de aminoácidos conservativas que no afectan a la actividad biológica y/o inmunogénica del 50 polipéptido PilA. Alternativamente, se contempla que los polipéptidos PilA de la invención presenten sustituciones de aminoácidos conservativas que pueden alterar o no la actividad biológica. El término “sustitución de aminoácidos conservativa” se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un residuo no nativo, incluyendo los aminoácidos que se producen de manera natural y los que no se producen de manera natural, de modo que hay poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga de los residuos de aminoácido en esa posición. Por ejemplo, una sustitución 55 conservativa resulta del reemplazo de un residuo no polar en un polipéptido por otro residuo no polar. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse por alanina, según los procedimientos de “mutagénesis por barrido con alanina”. Los aminoácidos que se producen de manera natural se caracterizan basándose en sus cadenas laterales tal como sigue: básicos: arginina, lisina, histidina; ácidos: ácido glutámico, ácido aspártico; polares sin carga: glutamina, asparagina, serina, treonina, tirosina; y no polares: fenilalanina, triptófano, cisteína, glicina, alanina, valina, 60

prolina, metionina, leucina, norleucina, isoleucina. A continuación se exponen en la tabla 1 reglas generales para las sustituciones de aminoácidos.

Tabla 1

Sustituciones de aminoácidos

Residuos originales

Sustituciones ejemplificativas Sustituciones preferidas

Ala

Val, Leu, Ile Val

Arg

Lys, Gln, Asn Lys

Asn

Gln Gln

Asp

Glu Glu

Cys

Ser, Ala Ser

Gln

Asn Asn

Glu

Asp Asn

Gly

Pro, Ala Ala

His

Asn, Gln, Lys, Arg Arg

Ile

Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu

Leu

Norleucina, Ile, Val, Met,

Leu

Lys

Arg, ácido 1,4-diaminobutírico Arg

Met

Leu, Phe, Ile Leu

Phe

Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Arg

Pro

Ala Gly

Ser

Thr, Ala, Cys Thr

Thr

Ser Ser

Trp

Tyr, Phe Tyr

Tyr

Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val

Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Leu

La invención proporciona asimismo proteínas quiméricas que comprenden una parte de una variante de los polipéptidos PilA de NTHi de la presente invención (por ejemplo, un polipéptido que presenta por lo menos aproximadamente el 65%, por lo menos aproximadamente el 70%, por lo menos aproximadamente el 75%, por lo menos 5 aproximadamente el 80%, por lo menos aproximadamente el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, por lo menos aproximadamente el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, normalmente por lo menos aproximadamente el 95%, el 96%, el 97%, más normalmente por lo menos aproximadamente el 98%, o lo más normalmente por lo menos aproximadamente el 99% de identidad de aminoácidos con respecto a un polipéptido de SEC ID nº: 2, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50 y 52) que conservan la actividad biológica y/o inmunogénica. 10

La invención contempla que los polinucleótidos PilA de la invención pueden insertarse en un vector para su amplificación o expresión. Para su expresión, los polinucleótidos se conectan funcionalmente a secuencias de control de la expresión apropiadas tales como las secuencias de señal de poliadenilación y promotora. Además se proporcionan células huésped que comprenden polinucleótidos de la invención. Las células huésped procariotas ejemplificativas incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella y Serratia. Se contemplan 15 específicamente procedimientos de producción de polipéptidos de la invención haciendo crecer las células huésped y aislando polipéptidos de las células huésped o medio de crecimiento. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden prepararse mediante síntesis química utilizando medios convencionales. Son particularmente convenientes las técnicas en fase sólida (véase, por ejemplo, Erikson et al., The Proteins (1976) v. 2, Academic Press, Nueva York, pág. 255). Están disponibles comercialmente sintetizadores en fase sólida automáticos. Además, se realizan fácilmente 20 modificaciones en la secuencia mediante sustitución, adición u omisión de residuos apropiados. Por ejemplo, puede añadirse un residuo de cisteína al extremo carboxi-terminal para proporcionar un grupo sulfhidrilo para la unión

conveniente a una proteína portadora, o pueden incorporarse elementos espaciadores, tales como un residuo de glicina adicional, en la secuencia entre el aminoácido de unión en el extremo C-terminal y el resto del péptido.

El término “aislado” se refiere a una sustancia separada de, y esencialmente libre de, los demás componentes del entorno en el que existe de manera natural. Por ejemplo, un polipéptido se separa de otras proteínas celulares o un ADN se separa de otro ADN que lo flanquea en un genoma en el que se produce de manera natural. 5

Una proteína PilA recombinante (rPilA) puede generarse para actuar como un producto más fácilmente renovable. Para hacer esto, se utiliza el protocolo publicado de Keizer et al. (J. Biol. Chem., 276: 24186-14193, 2001), que estudiaron una pilina que también presentaba cuatro residuos de Cys ya que será crítico que la rPilA se pliegue apropiadamente de manera similar para poseer cualidades funcionales de la subunidad de pilina nativa. En resumen, se diseña mediante ingeniería genética una pilina truncada en la que los primeros 28 residuos se retiran del extremo N-10 terminal para impedir la agregación, y esta pilina truncada se modificará adicionalmente mediante ingeniería genética para transportarse al periplasma mediante la incorporación de una secuencia líder OmpA en el constructo. Utilizando esta estrategia Keizer et al. generaron una proteína pilina de P. aeruginosa monomérica soluble recombinante que podía unirse a su receptor (asialo GM1) en ensayos in vitro y disminuir la morbimortalidad en ratones cuando se administraba el péptido 15 minutos antes de la exposición heteróloga. Esta forma truncada, monomérica, soluble de PilA de NTHi será 15 útil en los estudios descritos en la presente memoria.

La invención proporciona asimismo proteínas quiméricas sintéticas. Las proteínas quiméricas pueden sintetizarse, purificarse y secuenciarse utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, las proteínas quiméricas pueden ensamblarse de manera semimanual mediante síntesis en fase sólida con Fmoc-terc-butilo por etapas y purificarse mediante HPLC. La composición y secuencia de aminoácidos de proteínas quiméricas recombinantes y sintéticas 20 pueden confirmarse mediante análisis de aminoácidos y/o análisis de espectrometría de masas.

Anticuerpos

Se describen anticuerpos que se unen a epítopos antigénicos de las proteínas quiméricas de la invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo que conservan su capacidad para unirse a su epítopo único (por ejemplo, fragmentos Fv, Fab y F(ab)2), anticuerpos de cadena única y 25 anticuerpos humanos o humanizados. Los anticuerpos pueden generarse mediante técnicas convencionales en la materia utilizando proteína(s) quimérica(s) de la invención o células huésped que expresan proteína(s) quimérica(s) de la invención como antígenos.

Se describen anticuerpos específicos para las proteínas quiméricas de la presente invención y fragmentos de los mismos, que muestran la capacidad tanto de destruir bacterias H. influenzae como de proteger a los seres humanos 30 frente a una infección. También se describen anticuerpos específicos para las proteínas quiméricas de la invención que reducen la virulencia, inhiben la adherencia, inhiben la formación de biopelículas, inhiben la motilidad contráctil, inhiben la división celular y/o inhiben la penetración en el epitelio de bacterias H. influenzae y/o potencian la fagocitosis de las bacterias H. influenzae.

Pueden utilizarse sistemas de ensayos bactericidas mediados por complemento in vitro (Musher et al., Infect. 35 Immun. 39: 297-304,1983; Anderson et al., J. Clin. Invest. 51: 31-38, 1972) para medir la actividad bactericida de anticuerpos antiproteínas quiméricas.

También es posible conferir protección a corto plazo a un huésped mediante inmunoterapia pasiva mediante la administración de anticuerpo previamente formado frente a una proteína quimérica de la invención. Por tanto, pueden utilizarse anticuerpos descritos en la presente memoria en la inmunoterapia pasiva. Se prefiere la inmunoglobulina 40 humana en la medicina de seres humanos porque una inmunoglobulina heteróloga puede provocar una respuesta inmunitaria frente a sus componentes inmunogénicos foráneos. Tal inmunización pasiva podría utilizare como emergencia para la protección inmediata de individuos no inmunizados sometidos a riesgos especiales.

Pueden utilizarse anticuerpos descritos en la presente memoria en la producción de anticuerpos antiidiotípicos, que a su vez pueden utilizarse como antígeno para estimular una respuesta inmunitaria frente a los epítopos de 45 proteínas quiméricas o epítopos de H. influenzae.

Procedimientos para provocar una respuesta inmunitaria y composiciones de los mismos

La invención contempla la utilización de las proteínas quiméricas de la invención para provocar en un individuo una respuesta inmunitaria frente a H. influenzae en un individuo. Estas utilizaciones provocan una o más respuestas inmunitarias, incluyendo de manera no limitativa respuestas inmunitarias que inhiben la replicación bacteriana, 50 respuestas inmunitarias que bloquean la adherencia de H. influenzae a células, respuestas inmunitarias que impiden la contracción de H. influenzae, respuestas inmunitarias que destruyen bacterias H. influenzae y respuestas inmunitarias que impiden la formación de biopelículas. Se describen procedimientos que comprenden una etapa que consiste en administrar una dosis inmunogénica de una composición que comprende una o más proteínas quiméricas de la invención. También se describen procedimientos que comprenden administrar una dosis inmunogénica de una 55 composición que comprende una célula que expresa una o más proteínas quiméricas de la invención. Además se describen procedimientos que comprenden administrar una dosis inmunogénica de una composición que comprende

uno o más polinucleótidos que codifican para una o más proteínas quiméricas de la invención. El polinucleótido puede ser un polinucleótido desnudo no asociado a ningún otro ácido nucleico o puede estar en un vector tal como un plásmido o vector viral (por ejemplo, vector de virus adenoasociado o vector de adenovirus). Las composiciones pueden utilizarse en combinación en un único individuo. Las composiciones pueden utilizarse antes o después de la infección por H. influenzae de un individuo. Las composiciones de la invención pueden utilizarse para tratar o prevenir cualquier estado 5 patológico que implica H. influenzae (cepas tipificables y no tipificables) tal como OM, neumonía, sinusitis, septicemia; endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, infecciones puerperales y neonatales, sepsis puerperal y neonatal, salpingitis aguda y crónica, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de las vías urinarias, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteriemia oculta, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y exacerbación de enfermedades pulmonares subyacentes 10 tales como bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.

En una forma de realización de la invención, se administra una composición de la invención como dosis de sensibilización seguida por una o más dosis de refuerzo. También se contempla la administración conjunta de proteínas o polipéptidos que potencian beneficiosamente la respuesta inmunitaria tales como citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), moléculas que inducen citocinas (por ejemplo Leaf) o moléculas coestimulantes. 15

Una “dosis inmunogénica” de una composición de la invención es una que genera, tras la administración, una respuesta inmunitaria humoral (anticuerpos) y/o celular (células T) detectable en comparación con la respuesta inmunitaria detectable antes de la administración o en comparación con una respuesta inmunitaria convencional antes de la administración. La invención contempla que la respuesta inmunitaria resultante de los procedimientos puede ser protectora y/o terapéutica. En una forma de realización preferida, la respuesta inmunitaria de anticuerpos y/o células T 20 protege al individuo frente a infección por H. influenzae, particularmente infección del oído medio y/o la nasofaringe o las vías respiratorias bajas. En esta utilización, la dosis precisa depende del estado de salud y del peso del paciente, el modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc., pero generalmente comprendida entre aproximadamente 1,0 μg y aproximadamente 5000 μg por 70 kilogramos de paciente, más comúnmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 μg por 70 kg de peso corporal. 25

La respuesta inmunitaria humoral puede medirse mediante muchos procedimientos bien conocidos, tales como ensayo de inmunodifusión radial simple (SRID), inmunoensayo con enzimas (EIA) y ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI). En particular, SRID utiliza una capa de un gel, tal como agarosa, que contiene el inmunógeno que está sometiéndose a prueba. Se corta un pocillo en el gel y se coloca en el pocillo el suero que está sometiéndose a prueba. La difusión del anticuerpo hacia el gel conduce a la formación de un anillo de precipitación cuya área es 30 proporcional a la concentración del anticuerpo en el suero que está sometiéndose a prueba. EIA, también conocido como ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), se utiliza para determinar los anticuerpos totales en la muestra. Se adsorbe el inmunógeno en la superficie de una placa de microtitulación. Se expone el suero de prueba a la placa seguido por una inmunoglobulina ligada a enzimas, tal como IgG. Se cuantifica la actividad enzimática adherente a la placa mediante cualquier medio convencional tal como espectrofotometría y es proporcional a la concentración de 35 anticuerpo dirigido contra los inmunógenos presentes en la muestra de prueba. HAI utiliza la capacidad de un inmunógeno tal como proteínas virales para aglutinar glóbulos rojos de pollo (o similares). El ensayo detecta anticuerpos neutralizantes, es decir, los anticuerpos que pueden inhibir la hemaglutinación. Se incuban diluciones del suero de prueba con una concentración patrón de inmunógeno, seguido por la adición de glóbulos rojos. La presencia de anticuerpos neutralizantes inhibirá la aglutinación de los glóbulos rojos por el inmunógeno. Las pruebas para medir la 40 respuesta inmunitaria celular incluyen la determinación de hipersensibilidad de tipo retardado o la medición de la respuesta proliferativa de linfocitos frente al inmunógeno diana.

La invención proporciona correspondientemente composiciones adecuadas para provocar una respuesta inmunitaria frente a proteínas quiméricas de la invención. Tal como se indicó anteriormente, las composiciones comprenden una o más proteínas quiméricas, células que expresan una o más proteínas quiméricas, o uno o más 45 polinucleótidos que codifican para una o más proteínas quiméricas. Las composiciones también pueden comprender otros componentes tales como vehículos y adyuvantes.

En composiciones de la invención, una proteína quimérica puede fusionarse con otra proteína cuando se produce mediante procedimientos recombinantes. En una forma de realización, la otra proteína no puede, por sí misma, producir anticuerpos, pero estabiliza a la primera proteína y forma una proteína de fusión que conserva actividad 50 inmunogénica. En otra forma de realización, la proteína de fusión comprende otra proteína que es inmunogénica, tal como glutatión-S-transferasa (GST) o beta-galactosidasa, coproteínas relativamente grandes que solubilizan la proteína de fusión y facilitan la producción y purificación de la misma. La otra proteína puede actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación generalizada del sistema inmunitario. La otra proteína puede fusionarse con el extremo o bien amino-terminal o bien carboxi-terminal de las proteínas quiméricas de la invención. 55

En otras composiciones de la invención, las proteínas quiméricas pueden unirse de otro modo a sustancias portadoras. Puede utilizarse cualquier procedimiento conocido en la materia para crear tales uniones. Pueden formarse uniones mediante agentes hetero-bifuncionales que generan un puente disulfuro en un extremo de grupo funcional y un enlace peptídico en el otro, tal como un agente de formación de amida de disulfuro, por ejemplo, N-succidimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) (véase, por ejemplo, Jansen et al., Immun. Rev. 62:185, 1982) y agentes de acoplamiento 60 bifuncionales que forman un tioéter en vez de un puente disulfuro tales como ésteres reactivos de ácido 6-

maleimidocaproico, ácido 2-bromoacético, ácido 2-yodoacético, ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxílico y similares, y agente de acoplamiento que activa grupos carboxilo combinándolos con succinimida o ácido 1-hidroxi-2-nitro-4-sulfónico, para una sal de sodio tal como 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC).

Las proteínas quiméricas pueden formularse como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente 5 aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino-etanol, histidina y procaína. 10

Las composiciones de la invención pueden comprender además adyuvantes. Los adyuvantes conocidos incluyen, por ejemplo, emulsiones tales como adyuvantes de Freund y otras emulsiones de aceite, Bordetella pertussis, MF59, saponina purificada de Quillaja saponaria (QS21), sales de aluminio tales como hidróxido, fosfato y alumbre, fosfato de calcio (y otras sales metálicas), geles tales como sales de hidróxido de aluminio, productos micobacterianos incluyendo dipéptidos de muramilo, materiales sólidos, partículas tales como liposomas y virosomas. Los ejemplos de 15 productos naturales y bacterianos cuya utilización como adyuvantes resulta conocida incluyen monofosforil-lípido A (MPL), RC-529 (monosacárido acilado similar a MPL sintético), OM-174 que es un lípido A derivado de E. coli, holotoxinas tales como toxina del cólera (CT) o uno de sus derivados, toxina pertussis (PT) y toxina termolábil (LT) de E. coli o uno de sus derivados, y oligonucleótidos de CpG. La actividad del adyuvante puede verse afectada por varios factores, tales como efecto portador, formación de depósitos, recirculación de linfocitos alterada, estimulación de 20 linfocitos T, estimulación directa de linfocitos B y estimulación de macrófagos.

Las composiciones de la invención se formulan normalmente como productos inyectables, o bien como suspensiones o bien como disoluciones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El principio inmunogénico activo se mezcla con frecuencia con excipientes, que son farmacéuticamente aceptables y compatibles 25 con el principio activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, o adyuvantes, que potencian la eficacia de la vacuna. Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, o bien por vía subcutánea o bien por vía intramuscular. 30

Las formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para los supositorios, los vehículos y aglutinantes tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferentemente de 1 a 2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes utilizados normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, 35 estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10% a 95% de principio activo, preferentemente 25 a 70%.

Las composiciones también pueden administrarse mediante vías transdérmicas utilizando inyectores de chorro, microagujas, electroporación, sonoporación, microencapsulación, polímeros o liposomas, vías transmucosas y vías 40 intranasales utilizando pulverizadores, aerosoles y nebulizadores nasales. La microencapsulación utilizando polímeros naturales o sintéticos tales como almidón, alginato y quitosano, D-poli-L-lactato (PLA), microesferas D-poli-DL-lácticas-co-glicólicas, policaprolactonas, poliortoésteres, polianhídridos y polifosfacenos, polifosfatazanos son útiles para la administración tanto transdérmica como transmucosa. Los complejos poliméricos que comprenden péptidos sintéticos de poli-ornitato, poli-lisina y poli-arginina o péptidos anfipáticos son útiles para sistemas de administración transdérmica. 45 Además, debido a su naturaleza anfipática, se contemplan los liposomas para sistemas de administración de vacunas transdérmicos, transmucosos e intranasales. Los lípidos comunes utilizados para la administración de vacunas incluyen sulfato de N-(1)2,3-(dioleil-dihidroxipropil)-N,N,N- trimetilamonio-metilo (DOTAP), cloruro de dioleiloxi-propil-trimetilamonio DOTMA, dimistiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DMRIE), bromuro de dimetildioctadecil-amonio (DDAB) y 9N(N’,N-dimetilaminoetano)carbamoil)colesterol (DC-Chol). La combinación de lípidos auxiliares y liposomas 50 potenciará la captación de los liposomas a través de la piel. Estos lípidos auxiliares incluyen dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), dilauroilfosfatidiletanolamina (DLPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE). Además, se han contemplado glicósidos de triterpenoides o saponinas derivadas del quillay chileno (Quillaja saponaria) y quitosano (quitano desacetilado) como adyuvantes útiles para la administración de vacunas por vía intranasal y transmucosa. 55

Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y quizás almacenados en un estado liofilizado que sólo requiere la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su utilización.

Procedimientos de inhibición de H. influenzae

Alternativamente, la invención incluye procedimientos de inhibición de la función de los pili de tipo IV de H. influenzae en un individuo. Los procedimientos comprenden administrar al individuo, por ejemplo, uno o más anticuerpos de la invención y/o una o más proteínas quiméricas de la invención; en una cantidad que inhibe la función de los pili. Pueden utilizarse ensayos in vitro para demostrar la capacidad para inhibir la función de los pili. Realizaciones de estos 5 procedimientos incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilizan inhibidores de adherencia mediada por pili de tipo IV, inhibidores que alteran biopelículas existentes mediadas por pili de tipo IV, e inhibidores de la contractilidad.

Se contempla la inhibición para cualquier estado patológico que implica H. influenzae, por ejemplo, OM, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, infecciones puerperales y neonatales, sepsis puerperal y neonatal, salpingitis aguda y crónica, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, 10 colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de las vías urinarias, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre purpúrica brasileña, bacteriemia oculta, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y exacerbación de enfermedades pulmonares subyacentes tales como bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.

Se proporcionan composiciones que comprenden inhibidores de la función de los pili de tipo IV de H. influenzae. Las composiciones pueden consistir en únicamente uno de los anteriores principios activos, pueden 15 comprender combinaciones de los anteriores principios activos o pueden comprender principios activos adicionales utilizados para tratar infecciones bacterianas. Tal como se trató anteriormente, las composiciones pueden comprender uno o más componentes adicionales tales como vehículos farmacéuticamente eficaces. También tal como se trató anteriormente, la dosificación y la frecuencia de la administración de las composiciones se determinan mediante técnicas convencionales y dependen, por ejemplo, del peso y la edad del individuo, la vía de administración y la gravedad de los 20 síntomas. La administración de las composiciones farmacéuticas puede realizarse por vías convencionales en la materia, por ejemplo, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal o vaginal.

Modelo animal

Pueden demostrarse los procedimientos de la invención en un modelo de chinchilla ampliamente aceptado como modelo experimental para OM. En particular, se ha caracterizado bien un modelo de chinchilla de OM inducida por 25 NTHi (Bakaletz et al., J. Infect. Dis., 168: 865-872, 1993; Bakaletz y Holmes, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 4: 223-225, 1997; Suzuki y Bakaletz, Infect. Immun., 62: 1710-1718, 1994; Mason et al., Infect. Immun., 71:3454-3462, 2003), y se ha utilizado para determinar la eficacia de protección de varias proteínas de membrana externa de NTHi, combinaciones de proteínas de membrana externa, componentes de vacunas de péptido sintético quimérico y formulaciones de adyuvantes frente a OM (Bakaletz et al., Vaccine, 15: 955-961, 1997; Bakaletz et al., Infect. Immun., 67: 2746-2762, 30 1999; Kennedy et al., Infect. Immun., 68: 2756-2765, 2000; Kyd et al., Infect. Immun., 66:2272-2278, 2003; Novotny y Bakaletz, J. Immunol., 171, 1978-1983, 2003).

En el modelo, un adenovirus predispone a las chinchillas a la OM media inducida por H. influenzae, lo que permitió establecer sistemas de cultivo de células, tejidos y órganos relevantes para la evaluación biológica de NTHi (Bakaletz et al., J. Infect. Dis., 168: 865-72, 1993; Suzuki et al., Infect. Immunity 62: 1710-8, 1994). Se ha utilizado la 35 infección por adenovirus sola para evaluar la transudación de anticuerpos séricos inducidos en el tímpano (Bakaletz et al., Clin. Diagnostic Lab Immunol., 4(2): 223-5, 1997) y se ha utilizado como copatógeno con NTHi, para determinar la eficacia de protección de varios regímenes de inmunización activa y pasiva que seleccionan como diana diversas proteínas de la membrana externa de NTHi, combinaciones de OMP, componentes de vacuna de péptido sintético quimérico y formulaciones de adyuvantes como vacunógenos frente a la otitis media (Bakaletz et al., Infect Immunity, 40 67(6): 2746-62, 1999; Kennedy et al., Infect. Immun., 68(5): 2756-65, 2000; Novotny et al., Infect Immunity 68(4): 2119-28, 2000; Poolman et al., Vaccine 19 (Supl. 1): S108-15, 2000).

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

La figura 1 proporciona la línea temporal del régimen de inmunización, la inoculación viral, la exposición a bacterias y el periodo de evaluación de la enfermedad OM para los experimentos de la eficacia descritos en el ejemplo 45 5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los ejemplos siguientes ilustran la invención, en los que el ejemplo 1 describe la producción recombinante de proteínas quiméricas de la invención, el ejemplo 2 describe ensayos para someter a prueba la inmunogenicidad de las proteínas quiméricas de la invención, el ejemplo 3 describe ensayos para evaluar la inmunización pasiva, el ejemplo 4 50 describe ensayos para evaluar la inmunización activa y el ejemplo 5 describe la evaluación de una proteína quimérica de la invención.

EJEMPLO 1

Síntesis de proteínas quiméricas

Se produjeron las proteínas quiméricas de la invención utilizando procedimientos recombinantes 55

convencionales. Inicialmente, se contrató a una empresa de síntesis génica (Blue Heron Biotechnology Inc.) para preparar el plásmido inicial basándose en las secuencias de aminoácidos de la proteína quimérica descritas en la presente memoria que se optimizaron para la utilización de codones preferidos de E. coli. En resumen, se modificó la secuencia de la proteína pilina de NTHi nativa truncando el extremo N-terminal (residuos 1-39 de SEC ID nº: 2) y añadiendo una secuencia de cola de HIS y un sitio de escisión de trombina tal como se expone en la SEC ID nº: 3. La 5 cola de HIS estuvo precedida por una secuencia (MGSS) para ayudar a la expresión. El sitio de escisión de trombina permitió la liberación de la cola de HIS. Entonces se clonaron estos plásmidos en el vector de expresión de E. coli, vector pET-15b (Novagen). Entonces se transformó el plásmido en la cepa de E. coli “Origami(DE3)” (disponible de Novagen) como huésped para la expresión de proteínas quiméricas con cola de His solubles. Otra cepa de expresión de célula huésped de E. coli que puede utilizarse es Origami B(DE3) (Novagen). 10

Las variantes con cola de His de las proteínas quiméricas se recuperarán mediante cromatografía en columna de níquel, después se utilizan para estudios iniciales para determinar si son reactivas con antisueros dirigidos frente a cualquiera de los siguientes: P5-fimbrina de OMP nativa, LB1 (péptido de 40 aminoácidos de longitud completa), LB1(1) (un péptido sintético que sólo representa el epítopo de células B de 19 aminoácidos de LB1), proteína PilA recombinante o proteína PilA nativa. Una vez retirada la cola de His mediante escisión en el sitio de trombina, se utilizarán las 15 proteínas quiméricas recombinantes como inmunógenos para determinar su inmunogenicidad y capacidad de protección.

Las proteínas quiméricas ejemplificativas de la invención presentan las secuencias expuestas en la tabla 2 a continuación. Las proteínas quiméricas que presentan las secuencias de aminoácidos de SEC ID nº: 10, 12 y 14 se han expresado mediante E. coli tal como se describió anteriormente. 20

Tabla 2

SEC ID nº:

Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica

9

10

11

Tabla 2 (continuación)

SEC ID nº:

Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

Tabla 2 (continuación)

SEC ID nº:

Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica

25

26

27

28

29

30

31

32

Las proteínas quiméricas ejemplificativas adicionales de la invención presentan las secuencias de aminoácidos expuestas en la tabla 3 a continuación. Estas proteínas quiméricas se han expresado mediante E. coli y se han purificado utilizando una cola de HIS, tal como se describió anteriormente. Las proteínas quiméricas expuestas en la tabla 3 presentan la secuencia de cola de His retirada para su utilización como inmunógeno. La proteína quimérica que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 56 se utilizó en los estudios descritos en el ejemplo 5. 5

Tabla 3

SEC ID nº:

Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica

54

55

Tabla 3 (continuación)

SEC ID nº:

Secuencia de aminoácidos de la proteína quimérica

56

57

EJEMPLO 2

Inmunogenicidad de las proteínas quiméricas

Se inmunizan conejos o chinchillas con las proteínas quiméricas. Los conejos reciben una dosis de inmunización inicial de 500 μg de una proteína quimérica en adyuvante completo de Freund. Los conejos reciben una segunda dosis de 400 μg de la proteína quimérica 21 días después. Los conejos reciben una tercera dosis de proteína 5 quimérica en adyuvante completo de Freund 42 días tras la dosis de inmunización inicial con 400 μg del mismo péptido o bien en IFA o bien en PBS (un conejo por diluyente). Se obtienen sueros 3 semanas tras cada dosis. Las chinchillas reciben una dosis de inmunización inicial de 10 μg de la proteína quimérica en el adyuvante monofosforil-lípido A (MPL). Un mes (~30 días) después, las chinchillas reciben una segunda dosis idéntica. La tercera y última dosis se administra ~30 días tras la segunda dosis. Se obtienen sueros ~10-14 días tras cada dosis. Se evalúan los sueros de todos los 10 animales para determinar el título y la especificidad frente al péptido LB1 (40-mero), LB1(1), proteína PilA y las proteínas quiméricas, mediante ELISA, inmunotransferencia tipo Western y biosensor. También se someten a prueba antisueros frente a bacterias completas mediante análisis por citometría de flujo (FACS).

EJEMPLO 3

Evaluación de la inmunización pasiva 15

La protección conferida por la respuesta inmunitaria de un animal dirigida frente a las proteínas quiméricas de la invención se determina en un modelo de chinchilla de otitis media experimental. Se inmunizan pasivamente chinchillas con 5 ml/kg de suero hiperinmunitario de chinchilla o humano dirigido frente a una proteína quimérica de la invención. Las chinchillas control reciben suero de chinchilla normal o suero humano normal. A continuación, las chinchillas reciben un primer copatógeno viral por vía intranasal, después, una semana más tarde, una exposición intranasal a la bacteria 20 NTHi. Se examinan las chinchillas y se clasifican diariamente o cada 2 días durante hasta 35 días tras la exposición bacteriana. Las chinchillas inmunizadas que reciben suero inmunitario de chinchilla o humano muestran una patología de membrana timpánica reducida y una reducción o ausencia de signos de infección del espacio del oído medio según se determina tanto mediante videootoscopía como mediante timpanometría. En este ensayo, se reduce la presencia de fluidos del oído medio en chinchillas que reciben suero de chinchilla o humano antiproteína quimérica en comparación 25 con los controles.

EJEMPLO 4

Evaluación de la inmunización activa

Se inmunizan activamente cohortes de 5-10 chinchillas cada una con preparación de control de solución salina, una preparación sólo con adyuvante o una de las proteínas quiméricas de la invención que se ha mezclado con un 30 adyuvante apropiado. Se evalúan los inmunógenos para determinar el contenido en endotoxinas antes de su utilización como inmunógeno mediante un ensayo de lisado de amebocitos cromogénico que está comercialmente disponible de Whittaker Bioproducts con la denominación QCL-1000. Entonces se les inyecta por vía subcutánea a las chinchillas 10 μg de inmunógeno en el adyuvante MPL (u otro adyuvante apropiado). Entonces, 30 días más tarde reciben 10 μg del mismo inmunógeno en MPL. Treinta días tras la segunda inmunización, estos animales reciben la dosis de 35 inmunización final. Aproximadamente 10-14 días tras administrar la dosis de inmunización final, se exponen las chinchillas tanto por vía transbular como por vía intranasal a una cepa de NTHi. Se evalúan las chinchillas a lo largo de un periodo de 35 días para determinar: patología de la membrana timpánica mediante examen videootoscópico y timpanometría; semicuantificación de NTHi recuperados mediante punción epitimpánica de la bula inferior y lavado pasivo de la nasofaringe; y examen mediante microscopio óptico de epitelio mucoso del oído medio fijado y membrana 40 timpánica para determinar la histopatología. Por ejemplo, las chinchillas inmunizadas con las proteínas quiméricas de la invención presentarán una patología reducida de la membrana timpánica, estarán libres de efusiones del oído medio o contendrán efusiones que son negativas para el cultivo, presentarán reducción o ausencia de biopelícula presente en el tímpano y existirá un espesamiento mínimo de la mucosa del oído medio, osteoneogénesis mínima y presencia reducida tanto de glóbulos rojos como de células inflamatorias en el espacio subepitelial. 45

EJEMPLO 5

Evaluación de proteínas quiméricas

Se evaluó la eficacia de protección de la proteína quimérica que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 56 (denominada “chim-V3” en la presente memoria) utilizando el modelo de OM de superinfección, transferencia pasiva de chinchillas. Este péptido quimérico comprendía el epítopo de células B del péptido LB1 (SEC ID nº: 5) 50 expresado tras el residuo de glutamina C-terminal de PilA recombinante (residuos 40-149 de SEC ID nº: 2). Para generar antisuero policlonal para su utilización en estudios de eficacia de la transferencia pasiva, se administró la proteína chim-V3 a una cohorte de chinchillas adultas con el adyuvante, monofosforil-lípido A (MPL) más dimicolato de trehalosa (Corixa). En la figura 1 se expone una línea temporal que representa el régimen de inmunización. Para generar combinaciones de sueros inmunitarios, se inmunizaron chinchillas propensas a un estado de alerta por vía subcutánea 3 55 veces con 30 μg de chim-V3 más 10 μg de MPL o 10 μg MPL solo cada 21 días. En el día 56, se recogió una extracción

de sangre terminal de los animales inoculados y se combinó el suero para su transferencia a animales jóvenes no tratados previamente. Para estudiar la eficacia, en primer lugar se expuso una cohorte separada de chinchillas jóvenes a adenovirus en el día -7. Seis días después (día -1), se transfirió de manera pasiva el suero inmunitario antichim-V3 combinado a esos animales comprometidos mediante adenovirus. Al día siguiente (día 0), se expusieron los animales que recibieron suero antichim-V3 mediante transferencia pasiva a la bacteria, Haemmophilus influenzae no tipificable. 5 Entonces se monitorizaron estos animales para determinar la incidencia y gravedad de la enfermedad a lo largo de un transcurso de tiempo de 26 días (con respecto a la exposición bacteriana) mediante videootoscopía y timpanometría diarias así como obtención de imágenes de Xenogen in vivo cada dos días.

Se midió el título de anticuerpo antichim-V3 en el suero inmunitario recogido de los animales inoculados utilizando ELISA. Este análisis demostró que el antisuero recogido contenía anticuerpos específicos para la proteína 10 chim-V3. La presencia de anticuerpos antichim-V3 en el antisuero recogido también se confirmó utilizando análisis mediante inmunotransferencia tipo Western.

Se utilizó análisis de FACS para medir la capacidad de inmunoglobulinas séricas de animales inmunizados para reconocer estructuras nativas expuestas en superficie expresadas por 86-028NP de NTHi. Se incubaron bacterias NTHi con antisuero frente a chim-V3, se lavaron, después se incubaron con FITC-proteína A no tratada previamente o 15 inmunitaria, se lavaron y se analizaron mediante análisis de FACS. La inoculación con la proteína chim-V3 indujo un aumento significativo de anticuerpos que podían reconocer las proteínas de superficie de NTHi o proteína chim-V3. Los datos obtenidos dependían tanto del título y avidez de anticuerpo así como de la expresión relativa tanto de los pili de tipo IV como de la adhesión de homólogo de OMP P5 mediante NTHi cuando se hacía crecer in vitro.

Se utilizó el indicador luminiscente pKMLN-1 de 86-028NP de NTHi para detectar la infección por NTHi en los 20 animales en los que se inyectó proteína chim-V3 utilizando la obtención de imágenes en tiempo real de Xenogen in vivo. Las curvas de crecimiento de la cepa luminiscente pKMLN-1 de 86-028NP de NTHi y la cepa original 86-028 de NTHi demostraron que el crecimiento de la cepa de NTHi luminiscente era comparable a la cepa original. La obtención de imágenes luminiscentes de NTHi que se encontraban en la nasofaringe de los animales inoculados se lograba fácilmente sin embargo, debido a la naturaleza microaerófila del oído medio enfermado, la luminiscencia de NTHi 25 presentes en el oído medio no pudo monitorizarse a lo largo de todo el transcurso de la enfermedad porque la luminiscencia depende de la disponibilidad de oxígeno. Se monitorizaron los animales cada dos días para determinar la presencia de bacterias luminiscentes, y si se detectaban bacterias, se registraba como acontecimiento luminiscente. Se detectó infección luminiscente por lo menos seis días tras la exposición en los animales inoculados. El número total de acontecimientos luminiscentes en los animales en los que se inoculó chim-V3 fue inferior al número total de 30 acontecimientos luminiscentes en los animales de control (en los que sólo se inoculó MPL).

A lo largo del transcurso del estudio, se utilizaron videootoscopía y timpanometría diarias para determinar el porcentaje de oídos medios de chinchillas con OM. La inoculación de chim-V3 provocó una reducción del 53% en el número de animales en los que los oídos medios presentaban OM en comparación con los animales de control (en los que sólo se inoculó MPL). 35

Todos estos estudios demuestran que la proteína chim-V3 era inmunogénica y los anticuerpos antichim-V3 eran protectores en el modelo de superinfección-transferencia pasiva de chinchilla de OM.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Children’s Hospital Inc.

<120> VACUNA QUIMÉRICA PARA UNA ENFERMEDAD INDUCIDA POR HAEMOPHILUS INFLUENZAE 40

<130> P032165EP

<140> 06800001.7

<141> 05/07/2006

<150> documento US 60/801.835

<151> 19/05/2006 45

<150> documento US 60/697.642

<151> 08/07/2005

<160> 57

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 50

<211> 4345

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS 5

<222> (403)..(849)

<400> 1

<210> 2

<211> 149 5

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 2

<210> 3

<211> 131

<212> PRT 5

<213> Haemophilus influenzae

<400> 3

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 4

<210> 5 10

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 5

<210> 6

<211> 22

<212> PRT 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 7

<210> 8 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 8

<210> 9

<211> 139

<212> PRT 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 9

<210> 10

<211> 143

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 10

<210> 11 10

<211> 136

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 11 5

<210> 12

<211> 141 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 12 15

<210> 13

<211> 148

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 13

<210> 14 10

<211> 153

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 5

<400> 14

<210> 15 10

<211> 142

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 15

<400> 15

<210> 16

<211> 147

<212> PRT 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 16

<210> 17

<211> 139

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 17

<210> 18 10

<211> 144

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 18

5

<210> 19

<211> 151

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10

<223> Proteína quimérica

<400> 19

<210> 20

<211> 156

<212> PRT 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 20

<210> 21 10

<211> 139

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 5

<400> 21

<210> 22

<211> 145 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 22 15

<210> 23

<211> 136

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 23

<210> 24 10

<211> 141

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 5

<400> 24

<210> 25

<211> 148 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 25 15

<210> 26

<211> 153 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 26 10

<210> 27

<211> 133

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 27

<210> 28 10

<211> 138

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 28

<210> 29 5

<211> 130

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 10

<400> 29

<210> 30

<211> 135

<212> PRT 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 30

<210> 31 10

<211> 142

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 31 5

<210> 32

<211> 147

<212> PRT 10

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 32

<210> 33

<211> 447

<212> ADN 5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 33 10

<210> 34

<211> 149

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 34 5

<210> 35

<211> 447

<212> ADN 10

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 35 15

<210> 36

<211> 149

<212> PRT 5

<213> Haemophilus influenzae

<400> 36

<210> 37

<211> 447

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 37

<210> 38 10

<211> 149

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 38

<210> 39 5

<211> 447

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS 10

<222> (1)..(447)

<400> 39

<210> 40

<211> 149 5

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 40

<210> 41

<211> 447

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 41

<210> 42

<211> 149

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 42 5

<210> 43

<211> 447

<212> ADN 10

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 43 15

<210> 44

<211> 149

<212> PRT 5

<213> Haemophilus influenzae

<400> 44

<210> 45

<211> 447

<212> ADN 5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 45 10

<210> 46

<211> 149

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 46 5

<210> 47

<211> 447 10

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447) 15

<400> 47

<210> 48

<211> 149 5

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 48

<210> 49

<211> 447

<212> ADN 5

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(447)

<400> 49 10

<210> 50

<211> 149

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae

<400> 50

<210> 51 5

<211> 447

<212> ADN

<213> Haemophilus influenzae

<220>

<221> CDS 10

<222> (1)..(447)

<400> 51

<210> 52

<211> 149

<212> PRT 5

<213> Haemophilus influenzae

<400> 52

<210> 53

<211> 40

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 5

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 53

<210> 54 10

<211> 129

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica 15

<400> 54

<210> 55

<211> 126

<212> PRT 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 55

10

<210> 56

<211> 138

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15

<223> Proteína quimérica

<400> 56

<210> 57

<211> 144

<212> PRT 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica

<400> 57

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Proteína quimérica que comprende una parte de la proteína PilA de H. influenzae no tipificable (NTHi) (SEC ID nº: 2) y una parte del péptido LB1 (SEC ID nº: 53), pudiendo provocar la proteína quimérica una respuesta inmunitaria a las bacterias NTHi.
2. 2. Proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la parte del péptido LB1 comprende el epítopo de 5 células B del péptido LB1.
3. 3. Proteína quimérica según la reivindicación 2, en la que la parte del péptido LB1 comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 4, SEC ID nº: 5, SEC ID nº: 6, SEC ID nº: 7 o SEC ID nº: 8.
4. 4. Proteína quimérica según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 9, SEC ID nº: 10, SEC ID nº: 11, SEC ID nº: 12, SEC ID nº: 13, SEC ID nº: 14, SEC ID nº: 15, SEC ID nº: 16, SEC ID nº: 10 17, SEC ID nº: 18, SEC ID nº: 19, SEC ID nº: 20, SEC ID nº: 21, SEC ID nº: 22, SEC ID nº: 23, SEC ID nº: 24, SEC ID nº: 25, SEC ID nº: 26, SEC ID nº: 27, SEC ID nº:28, SEC ID nº: 29, SEC ID nº: 30, SEC ID nº: 31, SEC ID nº: 32, SEC ID nº: 54, SEC ID nº: 55, SEC ID nº: 56 o SEC ID nº: 57.
5. 5. Proteína quimérica según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 57. 15
6. 6. Proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la parte de la proteína PilA de NTHi comprende los residuos 40-149 de SEC ID nº: 2.
7. 7. Proteína quimérica según la reivindicación 6, en la que el epítopo de células B de LB1 está insertado antes del residuo 40 de SEC ID nº: 2.
8. 8. Proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 6 ó 7, en la que el epítopo de células B 20 de LB1 comprende SEC ID nº: 5.
9. 9. Polinucleótido que codifica para la proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. 10. Vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 9.
11. 11. Composición que comprende una proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25
12. 12. Composición según la reivindicación 11, en la que la composición está formulada para una vía de administración seleccionada de entre el grupo constituido por administración parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal, transdérmica, subcutánea, intramuscular o vaginal.
13. 13. Utilización de una o más proteínas quiméricas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de un medicamento en un paciente en riesgo de padecer una infección por bacterias NTHi para provocar 30 una respuesta inmunitaria a las bacterias NTHi.
14. 14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la infección por NTHi es en el oído medio, la nasofaringe o las vías respiratorias inferiores.
15. 15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en la que el medicamento está formulado para una vía de administración seleccionada entre el grupo constituido por administración parenteral, intravenosa, oral, 35 bucal, nasal, pulmonar, rectal, intranasal, transdérmica, subcutánea, intramuscular o vaginal.
16. 16. Utilización según la reivindicación 13 ó 14, en la que la infección por bacterias NTHi implica un estado patológico seleccionado de entre el grupo constituido por otitis media, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, sepsis, salpingitis, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de las vías urinarias, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre 40 purpúrica brasileña, bacteriemia oculta, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.
17. 17. Proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en la provocación de una respuesta inmunitaria a las bacterias NTHi en un paciente en riesgo de padecer una infección por bacterias NTHi.
18. 18. Proteína quimérica según la reivindicación 17, en la que la infección por NTHi se encuentra en el oído 45 medio, la nasofaringe o las vías respiratorias inferiores.
19. 19. Proteína quimérica según la reivindicación 17, en la que la infección por bacterias NTHi implica un estado patológico seleccionado de entre el grupo constituido por otitis media, neumonía, sinusitis, septicemia, endocarditis, epiglotitis, artritis séptica, meningitis, sepsis, salpingitis, pericarditis, celulitis, osteomielitis, endocarditis, colecistitis, infecciones intraabdominales, infección de las vías urinarias, mastoiditis, infección de injerto aórtico, conjuntivitis, fiebre 50

    purpúrica brasileña, bacteriemia oculta, enfermedad pulmonar obstructiva crónica ,bronquitis crónica, bronquiectasia y fibrosis quística.
20. 20. Proteína quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en el tratamiento o la prevención de la infección por bacterias NTHi en un paciente que lo necesite.
21. 21. Proteína quimérica según la reivindicación 20, en la que la infección por NTHi se encuentra en el oído 5 medio, la nasofaringe o las vías respiratorias inferiores.